Способ снижения содержания холестерина, и/или улучшения консистенции, и/или повышения стабильности жира в пищевом продукте, применение липид-ацетилтрансферазы для получения пищевого продукта, пищевой продукт

СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА, И/ИЛИ УЛУЧШЕНИЯ КОНСИСТЕНЦИИ, И/ИЛИ ПОВЫШЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ЖИРА В ПИЩЕВОМ ПРОДУКТЕ, ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПИД-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА, ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ В изобретении описан способ снижения содержания холестерина, и/или улучшения консистенции,и/или снижения потери массы, и/или повышения стабильности жира в пищевом продукте на основе мяса, заключающийся в том, что а) приводят в контакт мясо с липид-ацилтрансферазой; б) инкубируют мясо, приведенное в контакт с липид-ацилтрансферазой, при температуре от примерно 1 до примерно 70 С; в) получают пищевой продукт из мяса; при этом стадию б) осуществляют до,одновременно или после стадии в). В изобретении описано применение липид-ацилтрансферазы для снижения содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЮПОН НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АПС (DK) Ссылка на родственные заявки В настоящем описании сделаны ссылки на следующие родственные заявки: US 2002-0009518,US 2004-0091574, WO 2004/064537, WO 2004/064987, WO 2005/066347, WO 2005/066351, заявка на патент США, сер.60/764430, зарегистрированная 2 февраля 2006 г., WO 2006/008508, международная заявка на патент PCT/IB2007/000558, заявка на патент США, сер.11/67953, GB 0716126.8,GB 0725035.0, заявка на патент США, сер.11/852274, и PCT/GB2008/000676. Каждая из указанных заявок и каждый из документов, которые процитированы в каждой из этих заявок ("документы, процитированные в заявке"), и каждый документ, на который сделана ссылка или который процитирован в документах, процитированных в заявке, либо в тексте, либо при рассмотрении дела по указанным заявкам, а также все аргументы, выдвинутые в поддержку повышения патентоспособности при таком рассмотрении, включены в настоящее описание в качестве ссылки. В настоящем описании процитированы также различные документы ("документы, процитированные в настоящем описании"). Каждый из документов,процитированных в настоящем описании, и каждый документ, который процитирован или на который сделана ссылка в документах, процитированных в настоящем описании, включен в настоящее описание в качестве ссылки. Область техники, к которой относится настоящее изобретение Настоящее изобретение относится к способам снижения содержания холестерина и/или улучшения свойств пищевого продукта на основе мяса с использованием липид-ацилтрансферазы и к полученным с их помощью пищевым продуктам на основе мяса. Предпосылки создания настоящего изобретения При производстве мясных продуктов и колбасных изделий основными задачами являются эмульгирование добавленного жира и связывание или иммобилизация добавленной воды с активированным белком из мясной основы (структурная матрица мясной эмульсии). Например, технология изготовления вареных колбас включает применение механической энергии и добавок, таких как фосфаты и соль, которые активируют высвободившийся белок. Конечным результатом процесса должен быть гомогенный,тонкоизмельченный, имеющий мягкую консистенцию продукт, который может выдерживать обработку без отделения жира или воды, характеризуясь плотной консистенцией и хорошим привкусом (Feiner,Meat products handbook, изд-во CRC Press, 2006, c. 239-312). Если технологические параметры, от которых зависит формирование и стабилизация эмульсии мясного продукта, т.е. флуктуации качества сырьевого материала (например, экссудативное мясо (бледное, мягкое, водянистое) (PSE-мясо) и темное, плотное, сухое (DFD-мясо, рецептура, условия обработки, такие как продолжительность и температура, не соблюдаются требуемым образом, то можно получать нестабильные продукты, которые более не удовлетворяют требованиям потребителей (Fischer и др.,Finely comminuted liver sausage - How the normal commercial emulsifiers work, Fleischwirtsch 71, 1991,c. 780-783). Эмульгаторы применяют в процессе обработки мяса и изготовления колбасных изделий для компенсации указанных флуктуаций качества сырьевого мясного материала для обеспечения соответствующего качества конечного продукта и облегчения технологических процессов промышленного производства (Nau и Adams, Emulsifiers for use in sausage and meat products, Food marketingtechnology, июнь 1992 г., c. 13-20). Для эмульгированных мясных продуктов со значительным содержанием жира, например для колбас из тонкоизмельченного фарша и паштетов, желательно наличие стабильности жира, позволяющей минимизировать потерю жира, и пониженное количество видимого жира. Кроме того, желательно, чтобы потеря мясного сока была низкой и чтобы вкус, консистенция и внешний вид были приемлемыми. Для достижения этих эффектов можно добавлять эмульгаторы, и некоторые из наиболее широко известных эмульгаторов представляют собой выделенный белок или белковые концентраты типа соевого белка илиNa-казеината. Однако эти белки характеризуются относительно высокой стоимостью, и их количество,допустимое в мясных продуктах, ограничено. В качестве эмульгаторов можно применять такие добавки,как моно- и диглицериды и эфиры лимонной кислоты (Varnam и Sutherland, Meat and meat products,Technology, chemistry and microbiology, изд-во ChapmanHall, т. 3, 1995, c. 244-250), но их применение часто нежелательно из-за стоимости продукта или его этикетирования (т.е. из-за необходимости указывать добавки на этикетке на мясной продукт). Известно, что в пище полезно использовать ферменты. Например, установлено, что липидацилтрансферазы обладают выраженной ацилтрансферазной активностью в пищевых продуктах. Неожиданно было установлено, что эта активность является благоприятной при осуществлении методов получения пищевых продуктов (см., например, WO 2004/064537). При приготовлении пищевых продуктов на основе мяса применение некоторых ферментов может оказаться невыгодным, поскольку обработку ферментом следует осуществлять при температуре от примерно 10 до примерно 55 С, в противном случае фермент может деактивироваться или не проявлять оптимальной активности. Однако при этих температурах может происходить размножение вызывающих порчу бактерий, патогенов и грибов. Таким образом, может требоваться найти решение проблем, ассоциированных со вкусом, консистенцией и внешним видом, с помощью которого можно снижать размно-1 021283 жение вызывающих порчу бактерий, патогенов и грибов в процессе производства пищевых продуктов на основе мяса. На основе данных о потреблении мяса и содержании холестерина установлено, что от одной трети до половины суточной рекомендованной дозы потребления холестерина обеспечивается за счет мясаin food science and technology, 10, 1999, c. 119-128). Одной из задач настоящего изобретения является снижение содержания холестерина в пищевых продуктах на основе мяса. Альтернативно или в дополнение к снижению содержания холестерина желательным является поддержание и/или улучшение одной или нескольких из следующих характеристик: стабильность жира, при которой потери жира минимизированы, и количество видимого жира понижено в пищевых продуктах на основе мяса; вкус, консистенция, снижение массы и внешний вид. Другой задачей является получение пищевых продуктов на основе мяса, в которых понижена потенциальная способность к размножению вызывающих порчу бактерий, патогенов и грибов. Краткое изложение сущности настоящего изобретения Объекты настоящего изобретения представлены в формуле изобретения и в приведенном ниже комментарии. При создании изобретения неожиданно было установлено, что путем добавления липидацилтрансферазы к мясу при изготовлении пищевого продукта на основе мяса можно достигать существенного снижения содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что снижение содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса можно достигать без какого-либо вредного воздействия на одни или несколько из следующих характеристик: консистенция, снижение массы, стабильность жира (включая сальность и/или снижение отделения жира в процессе тепловой обработки), вкус и внешний вид. Еще более неожиданно при создании изобретения было установлено, что путем добавления липидацилтрансферазы к мясу, предназначенному для изготовления пищевого продукта на основе мяса, можно достигать существенного снижения содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса, а также достигать одного или нескольких из следующих результатов: улучшение консистенции; уменьшение потери массы, повышение стабильности жира (включая снижение сальности и/или снижение отделения жира в процессе тепловой обработки), вкус и внешний вид. Еще более неожиданно при создании изобретения было установлено, что путем добавления липидацилтрансферазы к мясу, предназначенному для изготовления пищевого продукта на основе мяса, мясо можно обрабатывать при низкой температуре (например, ниже чем 10 С) или при более высоких температурах (например, свыше 65 С), т.е. при температурах, которые с меньшей долей вероятности могут приводить к размножению вызывающих порчу бактерий, патогенов и грибов. В результате это может приводить к снижению уровня вызывающих порчу бактерий, патогенов и/или грибов в конечном пищевом продукте на основе мяса. Одним из вариантов настоящего изобретения является способ изготовления пищевого продукта на основе мяса, заключающийся в том, что: а) приводят в контакт мясо с липид-ацилтрансферазой; б) инкубируют мясо, приведенное в контакт с липид-ацилтрансферазой, при температуре от примерно 1 до примерно 75 С; в) получают пищевой продукт из мяса; где стадию б) осуществляют до, одновременно или после стадии в). Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ снижения содержания холестерина и/или улучшения одной или нескольких характеристик (например, одной или нескольких из следующих характеристик: улучшение консистенции, и/или уменьшение потери массы, и/или повышение стабильности жира, и/или улучшение вкуса, и/или улучшение внешнего вида) пищевого продукта на основе мяса, заключающийся в том, что: а) приводят в контакт мясо с липид-ацилтрансферазой; б) инкубируют мясо, приведенное в контакт с липид-ацилтрансферазой, при температуре от примерно 1 до примерно 75 С; в) получают пищевой продукт из мяса; где стадию б) осуществляют до, одновременно или после стадии в). Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение липидацилтрансферазы для изготовления пищевого продукта на основе мяса. И еще одним объектом настоящего изобретения является применение липид-ацилтрансферазы для изготовления пищевого продукта на основе мяса, при этом технический эффект состоит в снижении содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса по сравнению с сопоставимым пищевым продуктом на основе мяса, для изготовления которого использовали мясо, не обработанное липидацилтрансферазой. И еще одним объектом настоящего изобретения является применение липид-ацилтрансферазы для изготовления пищевого продукта на основе мяса, при этом технический эффект состоит в снижении со-2 021283 держания холестерина в пищевом продукте на основе мяса по сравнению с сопоставимым пищевым продуктом на основе мяса, для изготовления которого использовали мясо, не обработанное липидацилтрансферазой, и/или состоит в достижении одного или нескольких из следующих результатов: улучшение консистенции, и/или уменьшение потери массы, и/или повышение стабильности жира, и/или улучшение вкуса, и/или улучшение внешнего вида пищевого продукта на основе мяса, по сравнению с сопоставимым пищевым продуктом на основе мяса, для изготовления которого использовали мясо, не обработанное липид-ацилтрансферазой. И еще одним объектом настоящего изобретения является пищевой продукт на основе мяса с пониженным содержанием холестерина или не содержащий холестерина, который содержит по меньшей мере 30% мяса и инактивированную липид-ацилтрансферазу. Настоящее изобретение относится также к пищевому продукту на основе мяса, который можно получать (например, к полученному) с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Подробное описание настоящего изобретения Согласно одному из вариантов осуществления изобретения предпочтительно мясо можно инкубировать с липид-ацилтрансферазой в течение промежутка времени, составляющего от примерно 30 мин до 24 ч, предпочтительно от примерно 1 до 21 ч. Согласно другому варианту осуществления изобретения мясо можно инкубировать с липидацилтрансферазой при температуре ниже чем примерно 10 С, например от примерно 1 до примерно 9 С,предпочтительно от примерно 1 до примерно 6 С, предпочтительно от примерно 2 до примерно 6 С, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 5 С. Когда мясо инкубируют с липид-ацилтрансферазой при температуре ниже чем примерно 10 С, например от примерно 1 до примерно 9 С, предпочтительно от примерно 1 до примерно 6 С, предпочтительно от примерно 2 до примерно 6 С, предпочтительно от примерно 2 до примерно 5 С, то предпочтительно инкубацию с липид-ацилтрансферазой осуществляют в течение промежутка времени, составляющего от примерно 10 до примерно 24 ч. Согласно следующему варианту осуществления изобретения мясо можно инкубировать с липидацилтрансферазой при температуре от примерно 60 до примерно 75 С, предпочтительно от примерно 62 до примерно 70 С, предпочтительно от примерно 60 до примерно 78 С, предпочтительно от примерно 65 до примерно 70 С. Когда мясо инкубируют с липид-ацилтрансферазой при температуре от примерно 60 до примерно 75 С, предпочтительно от примерно 62 до примерно 70 С, предпочтительно от примерно 60 до примерно 78 С, предпочтительно от примерно 65 до примерно 70 С, то мясо, находящееся в контакте с липидацилтрансферазой, инкубируют в течение промежутка времени, составляющего от примерно 30 мин до примерно 2 ч, предпочтительно от примерно 1 до 1,5 ч. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения мясо, находящееся в контакте с липидацилтрансферазой, и/или полученный из него пищевой продукт дополнительно нагревают до определенной температуры и в течение промежутка времени, достаточного для того, чтобы инактивировать фермент, например, до температуры, составляющей от примерно 80 до примерно 140 С, предпочтительно от 90 до примерно 120 С. Понятие "инкубировать" или "инкубация" в контексте настоящего описания означает выдерживание мяса и липид-ацилтрансферазы в условиях, при которых фермент является активным, т.е. обладает способностью осуществлять реакцию, катализируемую липид-ацилтрансферазой (в частности, обладает способностью переносить жирные кислоты от фосфолипида, являющегося донором, на холестерин, являющийся акцептором). Понятие "инкубировать" или "инкубация" в контексте настоящего описания не подразумевает выдерживание мяса и фермента в условиях, при которых фермент является неактивным; фермент деактивируется и/или фермент в процессе становится деактивированным или денатурированным. В некоторых объектах настоящего изобретения понятия "повышенный" или "пониженный", или"улучшенный" (или другие относительные понятия, применяемые в контексте настоящего описания) применяют для сравнения мяса или пищевого продукта на основе мяса, обработанного липидацилтрансферазой согласно настоящему изобретению, и сопоставимого мяса или сопоставимого пищевого продукта на основе мяса (т.е. изготовленного из таких же ингредиентов и таким же образом), который не был обработан липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения понятие "пониженное содержание холестерина" или "пониженный холестерин" означает, что содержание холестерина в обработанном липид-ацилтрансферазой мясе или пищевом продукте на основе мяса, понижено или является более низким по сравнению с таким же мясом или пищевым продуктом на основе мяса (т.е. изготовленного из таких же ингредиентов и таким же образом), но к которому не добавляли липид-ацилтрансферазу согласно настоящему изобретению. Предпочтительно содержание холестерина снижают по меньшей мере примерно на 15%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%,предпочтительно по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 60% в пищевом продукте на основе мяса по сравнению с сопоставимым пищевым продуктом на основе мяса, который не обрабатывали липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание холестерина в пищевом продукте на основе мяса можно снижать от примерно на 40 до примерно на 70%. При ссылке на "холестерин" подразумевается "свободный, не этерифицированный до сложного эфира холестерин". Таким образом, в контексте настоящего описания при упоминании пониженного содержания холестерина подразумевается снижение содержания свободного, не этерифицированного до сложного эфира холестерина. В некоторых вариантах осуществления изобретения пищевой продукт на основе мяса, предлагаемый в настоящем изобретении, может рассматриваться как "не содержащий холестерина (свободный от холестерина)". Под понятием "не содержащий холестерина" подразумевается, что весь или практически весть холестерин в мясе или пищевом продукте на основе мяса превращен в сложный эфир холестерина. В некоторых вариантах осуществления изобретения более 80%, предпочтительно более 90% свободного,не этерифицированного до сложного эфира холестерина может быть превращено в сложный эфир холестерина. В одном из вариантов изобретения "не содержащий холестерина" продукт может представлять собой продукт, в котором по меньшей мере 90% свободного, не этерифицированного до сложного эфира холестерина превращено в сложный эфир холестерина. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфолипид (такой как фосфолипид из сои и/или яиц) можно добавлять к мясу или пищевому продукту на основе мяса. Фосфолипид(ы) можно добавлять до, одновременно или после обработки липид-ацилтрансферазой. Предпочтительно добавление фосфолипида(ов) может приводить к еще большему снижению содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса. В некоторых вариантах осуществления изобретения относительные понятия, применяемые в контексте настоящего описания, применяют для сравнения мяса или пищевого продукта на основе мяса, обработанного липид-ацилтрансферазой согласно настоящему изобретению, и сопоставимого мяса или сопоставимого пищевого продукта на основе мяса, обработанного ферментом, отличным от липидацилтрансферазы, например, для сравнения с сопоставимым мясом или сопоставимым пищевым продуктом на основе мяса, обработанным общепринятым ферментом фосфолипазой, например, лецитазой (Lecitase Ultra) (фирма Novozymes A/S, Дания) или Lipomod 699L, фирма Biocatalyst, Великобритания. Для облегчения ссылки эти и другие объекты настоящего изобретения обсуждены ниже в разделах под соответствующими заголовками. Однако идеи каждого раздела не обязательно ограничены теми,которые описаны в каждом конкретном разделе. Анализ трансферазы (холестерин:фосфолипид) для определения трансферазной активности (TrU). Субстрат: 50 мг холестерина (фирма Sigma, C8503) и 450 мг соевого фосфатидилхолина (ФХ), фирма Avanti,441601, растворяют в хлороформе и хлороформ выпаривают при 40 С в вакууме. 300 мг смеси ФХ:холестерин (9:1) диспергируют при 40 С в 10 мл 50 мМ HEPES-буфера, рН 7. Процесс ферментации: 250 мкл субстрата добавляют при 40 С в химический стакан с крышкой. Добавляют 25 мкл раствора фермента и инкубируют при перемешивании в течение 10 мин при 40 С. В этом анализе добавленный фермент должен этерифицировать до сложного эфира 2-5% холестерина. Анализируют также контрольную пробу, в которую добавляют 25 мкл воды вместо раствора фермента. Через 10 мин добавляют 5 мл смеси гексан:изопропанол (3:2). Количество сложного эфира холестерина анализируют с помощью ВЭТСХ (высокоэффективная тонкослойная хроматография), используя холестерилстеарат (фирма Sigma, C3549) в качестве стандарта для калибровки. Трансферазную активность рассчитывают в виде количества сложного эфира холестерина, образовавшегося в течение 1 мин в условиях анализа. За одну единицу трансферазной активности (трансферазная единица, TrU) принимают количество сложного эфира холестерина (выраженное в мкмолях), образовавшееся в течение 1 мин при 40 С и рН 7 в условиях проведения описанного выше анализа трансферазы. Предпочтительно липид-ацилтрансфераза, применяемая в способе и вариантах применения согласно настоящему изобретению, должна иметь удельную трансферазную активность, выраженную в трансферазных единицах (TrU) на 1 мг фермента, которая составляет по меньшей мере 25 TrU/мг белка фермента. Предпочтительно липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вносить в количестве от 0,05 до 50 TrU на 1 г пищевого продукта на основе мяса,предпочтительно в количестве от 0,5 до 5 TrU на 1 г пищевого продукта на основе мяса. Предпочтительно продолжительность инкубации должна быть эффективной для гарантии присутствия по меньшей мере 5%-ной трансферазной активности, предпочтительно по меньшей мере 10%-ной трансферазной активности, предпочтительно по меньшей мере 15, 20, 25 26, 28, 30, 40 50, 60 или 75%ной трансферазной активности. Трансферазную активность (в %) (т.е. трансферазную активность, выраженную в процентах от общей ферментативной активности) можно определять согласно следующему протоколу. Протокол определения трансферазной активности (в %). Образцы мяса лиофилизируют и безводный образец измельчают в кофемолке. 0,5 г безводного мясного порошка экстрагируют смесью хлороформ:метанол (2:1) в течение 30 мин. Органическую фазу выделяют и анализируют с помощью ГЖХ. ГЖХ-анализ. Используют хроматограф для капиллярной газовой хроматографии типа Perkin Elmer Autosystem 9000, снабженный открытой (полой) колонкой со стенками, покрытыми жидкой фазой (WCOT-колонка),из кварцевого стекла размером 12,5 м 0,25 мм ID, толщина пленки, содержащей 5% фенилметилсиликона, 0,1 мкм (тип СР Sil 8 СВ, фирма Chrompack). Газ-носитель: гелий. Инжектор. Режим инъекции с делением потока с "холодным" вводом в колонку с использованием Приготовление образцов. Липиды, экстрагируемые из образцов мяса, растворяют в 0,5 мл смеси гептан:пиридин (2:1), содержащий применяемый в качестве внутреннего стандарта гептадекан, 0,5 мг/мл. 300 мкл раствора образца переносят во флакон с завинчивающейся крышкой, добавляют 300 мкл MSTFA(N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид) и осуществляют реакцию в течение 20 мин при 60 С. Расчет. Определяют коэффициенты отклика для свободных жирных кислот (FFA), холестерина, холестерилпальмитата и холестерилстеарата с использованием чистого эталонного вещества. На основе коэффициентов отклика для свободных жирных кислот, холестерина и сложных эфиров холестерина рассчитывают количество указанных компонентов (в %) в образцах мяса. Трансферазную активность (в %) липид-ацилтрансферазы в мясном продукте рассчитывают в виде снижения количества холестерина (в %) в обработанном ферментом мясе относительно количества холестерина в таком же мясном продукте, не подвергнутом обработке ферментом. Пример. Контрольный мясной продукт: 0,075% холестерина. Обработанный липид-ацилтрансферазой мясной продукт: 0,030% холестерина. Трансферазная активность=(0,075-0,030)100/0,075=60%-ная трансферазная активность. Пищевой продукт на основе мяса. Пищевой продукт на основе мяса согласно настоящему изобретению представляет собой любой продукт на основе мяса. Пищевой продукт на основе мяса пригоден для потребления человеком и/или животным в качестве пищи и/или корма. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения пищевой продукт на основе мяса представляет собой кормовой продукт для выкармливания животных, такой, например, как пищевой продукт для комнатных животных. Согласно другому варианту осуществления изобретения пищевой продукт на основе мяса представляет собой пищевой продукт, предназначенный для человека. Пищевой продукт на основе мяса может содержать не относящиеся к мясу ингредиенты, такие, например, как вода, соль, мука, молочный белок, белок из овощей, крахмал, гидролизованный белок, фосфат, кислота, пряности, красители и/или улучшители консистенции. Пищевой продукт на основе мяса согласно настоящему изобретению содержит мясо в количестве от 5 до 90 мас.%. В некоторых вариантах осуществления изобретения пищевой продукт на основе мяса может содержать мясо в количестве по меньшей мере 30 мас.%, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% мяса. В некоторых вариантах осуществления изобретения мясной продукт на основе мяса представляет собой мясо, прошедшее тепловую обработку, такое, например, как ветчина, корейка, передний свиной окорок (пикник), бекон и/или грудинная свинина. Пищевой продукт на основе мяса может представлять собой один или несколько из следующих продуктов: мясные продукты сухого или полусухого посола - например продукты ферментации, сухого посола и ферментированные с помощью стартер-культур, например сухие колбасы, салями, пепперони (некопченая сухая колбаса) и сухая ветчина; эмульгированные мясные продукты (например, предназначенные для потребления в холодном или горячем виде), такие как мортаделла (сухая копченая колбаса), (франкфуртская) сосиска, мясо для завтрака (закусочное мясо) и паштет; рыба и морепродукты, такие как креветки, лосось, переработанные рыбные продукты, замороженная рыба холодной упаковки; свежее (парное) мышечное мясо, такое как полностью шприцованное мышечное мясо, например корейка, передний окорок, маринованное мясо; мясной фарш и/или реструктурированное свежее мясо или переработанное мясо, такое как обрезанное для повышения сорта мясо с использованием закрепляющего геля или связывания, например сырые,непрошедшие тепловую обработку отбивные из корейки, бифштексы, мясо для жаркого, сырой колбасный фарш, говяжьи бургеры, мясные фрикадельки, пельмени; продукты из мяса (домашней) птицы - такие как куриные или индюшачьи грудки (грудинки) или переработанного мясо птицы, например куриные нугаты и/или куриные колбасы; стерилизованные автоклавированием продукты - автоклавированные мясные продукты, например передний свиной окорок (пикник), мясо для завтрака, эмульгированные продукты. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пищевой продукт на основе мяса представляет собой продукт переработки мяса, такой, например, как колбаса, болонская колбаса, мясной хлеб, измельченный мясной продукт, мясной фарш, бекон, польская колбаса, салями или паштет. Продукт переработки мяса может представлять собой, например, эмульгированный мясной продукт, изготовленный из мясной эмульсии, такой, например, как мортаделла, болонская колбаса, пепперони, ливерная колбаса, куриная колбаса, сосиска, франкфуртская сосиска, мясо для завтрака, мясной паштет. Мясная эмульсия может представлять собой прошедшую тепловую обработку, стерилизованную или запеченную мясную эмульсию, например, в запеченной форме или после помещения ее в оболочку,например пластиковую, коллагеновую, целлюлозную или натуральную оболочку. Продукт переработки мяса может представлять собой также реструктурированный мясной продукт, например реструктурированную ветчину. Мясной продукт, предлагаемый в изобретении, можно подвергать стадиям переработки,таким, например, как посол, например сухой посол; засол, например обработка рассолом; сушка; копчение; ферментация; варка; консервирование в герметичной таре; стерилизация автоклавированием; нарезание ломтиками и/или шинкование. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения мясо, подлежащее контакту с липидацилтрансферазой, может представлять собой рубленое мясо. В другом варианте осуществления изобретения пищевой продукт может представлять собой эмульгированный мясной продукт. Мясо. Понятие "мясо" в контексте настоящего описания относится к любому типу ткани, полученной из любого вида животного. Понятие "мясо" в контексте настоящего описания может относиться к ткани, содержащей мышечные волокна животного. Мясо может означать мышцу животного, например целую мышцу животного или куски, отрезанные от мышцы животного. В другом варианте осуществления изобретения мясо может представлять собой внутренние органы животного, такие, например, как сердце, печень, почка, селезенка, тимус и головной мозг. Понятие "мясо" включает мясной фарш, рубленое мясо или мясо, нарезанное на более мелкие куски, с помощью любого приемлемого метода, известного в данной области. Мясо можно получать из любого вида животного, такого, например, как корова, свинья, ягненок,овца, коза, курица, индюшка, страус, фазан, олень, лось, северный олень, (азиатский) буйвол, бизон, антилопа, верблюд, кенгуру; рыб любого вида, такого, например, как шпроты, треска, пикша, тунец, морской угорь, лосось, сельдь, сардина, скумбрия, каранг, макрелещука, сельдь-круглобрюшка, сайда, камбала, анчоус, европейская сардина, путассу, мерлуза тихоокеанская, радужная форель, полосатая зубатка,окунь, мойва, марлин, красный луциан, тресочка Эсмарка и/или мерлуза; имеющего панцирь водного животного любого вида, такого, например, как двустворчатый моллюск, мидия, гребешок, сердцевидка,береговая улитка, улитка, устрица, креветка, омар, лангуст, краб, речной рак, каракатица, кальмар и/или осьминог. В одном из вариантов осуществления изобретения мясо обозначает говядину, свинину, курятину,ягнятину и/или индюшатину. Липид-ацилтрансфераза. Согласно некоторым объектам изобретения липид-ацилтрансфераза, применяемая в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может содержать мотивGDSX и/или мотив GANDY. Предпочтительно фермент, представляющий собой липид-ацилтрансферазу, отличается тем, что фермент обладает ацилтрансферазной активностью и содержит в аминокислотной последовательностиGDSX, где X обозначает один или несколько следующих аминокислотных остатков: L, А, V, I, F, Y, H, Q,T, N, М или S. Предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую липид-ацилтрансферазу, или липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получать, предпочтительно получать, из организма или из нескольких организмов, относящихся к следующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida. Предпочтительно липид-ацилтрансферазу можно получать,предпочтительно получать, из организма рода Aeromonas. Согласно некоторым объектам настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, кодирует липид-ацилтрансферазу, которая содержит остаток аспарагиновой кислоты в положении, соответствующем N-80 в аминокислотной последовательности липид-ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida, которая представлена в SEQ ID No. 20. Согласно некоторым объектам настоящего изобретения липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит остаток аспарагиновой кислоты в положении, соответствующем N-80 в аминокислотной последовательности липид-ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida, которая представлена в SEQ ID No. 20. Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой полипептид, обладающий активностью липид-ацилтрансферазы, при этом полипептид содержит одну или несколько аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID No. 37, 15, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 41, 11, 12,13, 14, 42, 19, 20, или аминокислотных последовательностей, идентичных им на 75% или более. В дополнительном или альтернативном варианте нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, кодирует липид-ацилтрансферазу, которая может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 37, или аминокислотную последовательность, которая гомологична ей на 75% или более. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, кодирует липид-ацилтрансферазу, которая может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 37. В дополнительном или альтернативном варианте нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, кодирует липид-ацилтрансферазу, которая может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 15, или аминокислотную последовательность, которая гомологична ей на 75% или более. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, кодирует липид-ацилтрансферазу, которая может содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 15. В одном из вариантов осуществления изобретения липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 37 или 15, или имеет аминокислотную последовательность, которая идентична одной из них по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98%. В одном из вариантов осуществления изобретения липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,кодируется нуклеотидной последовательностью, которая представлена в SEQ ID No. 26, или кодируется нуклеотидной последовательностью, которая идентична ей по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98%. Нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,может кодировать встречающуюся в естественных условиях липид-ацилтрансферазу или вариант липидацилтрансферазы. Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой встречающуюся в естественных условиях липид-ацилтрансферазу или вариант липид-ацилтрансферазы. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой фермент, описанный в WO 2004/064537, WO 2004/064987, WO 2005/066347 или WO 2006/008508. Эти документы включены в настоящее описание в качестве ссылки. Понятие "липид-ацилтрансфераза" в контексте настоящего описания означает фермент, который обладает ацилтрансферазной активностью (обычно классифицируемый как К.Ф. 2.3.1.x, например 2.3.1.43), этот фермент обладает способностью переносить ацильную группу от липида на стерин, такой как холестерин. Предпочтительно липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липидацилтрансферазу, которая обладает способностью переносить ацильную группу от фосфолипида (как он определен в настоящем описании) на стерин (например, холестерин). В другом объекте изобретения липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может наряду со способностью переносить ацильную группу от липида на стерин (например, холестерин), может также обладать способностью переносить ацильную группу от липида на один или несколько следующих субстратов: углевод, белок, белковая субъединица, глицерин. Предпочтительно липидный субстрат, являющийся источником ацильной группы липида, представляет собой один или несколько следующих липидов: фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин и/или фосфатидилэтаноламин. Указанный липидный субстрат в контексте настоящего описания можно обозначать как "донор ацильной группы липида". Понятие "лецитин" в контексте настоящего описания относится к фосфатидилхолину, фосфатидилэтаноламину, фосфатидилинозиту, фосфатидилсерину и фосфатидилглицерину. Как подробно описано выше, другие ацилтрансферазы, которые можно применять в способах,предлагаемых в изобретении, можно идентифицировать по присутствию блоков GDSX, GANDY и НРТ либо путем сравнительного анализа (выравнивания) с консенсусной последовательностью pFam00657(SEQ ID No. 1) и/или сравнительного анализа с ацилтрансферазой GDSx, например, имеющей последовательность SEQ ID No. 28. Для оценки возможности их применения согласно настоящему изобретению,т.е. для идентификации тех ферментов, которые обладают трансферазной активностью, составляющей по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%,более предпочтительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90% и более предпочтительно по меньшей мере 98% от общей ферментативной активности, указанные ацилтрансферазы оценивают, используя"Протокол определения ацилтрансферазной активности (в %)", подробно описанный выше. Согласно некоторым объектам изобретения предпочтительно липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая не обладает способностью или практически не обладает способностью оказывать воздействие на триглицерид и/или 1-моноглицерид, и/или 2-моноглицерид. Согласно некоторым объектам изобретения предпочтительно липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая не обладает активностью триацилглицерол-липазы (К.Ф. 3.1.1.3) или не обладает выраженной активностью триацилглицерол-липазы (К.Ф. 3.1.1.3). Способность осуществлять гидролиз триглицеридов (активность, соответствующая ферменту К.Ф. 3.1.1.3) можно определять с помощью метода оценки липазной активности согласно Пищевому Химическому кодексу (3-е изд., 1981, c. 492-493), модифицированному для подсолнечного масла вместо оливкового масла и при использовании значения рН 5,5 вместо рН 6,5. Липазную активность оценивают в единицах LUS (липазные единицы подсолнечного масла), где 1 LUS определяют как количество фермента,которое может производить 1 мкмоль жирных кислот за 1 мин из подсолнечного масла в условиях указанного выше анализа. В другом варианте можно использовать анализ липазной активности в единицахLUT (липазные единицы трибутирина), описанный в WO 98/45453. Этот документ включен в настоящее описание в качестве ссылки. Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая практически не обладает способностью оказывать воздействие на триглицерид, может обладать активностью, выраженной в виде LUS/мг, которая составляет менее 1000, например менее 500, например менее 300, предпочтительно менее 200, более предпочтительно менее 100, более предпочтительно менее 50, более предпочтительно менее 20, более предпочтительно менее 10, например менее 5, менее 2, более предпочтительно менее 1 LUS/мг. В альтернативном варианте активность, выраженная в виде LUT/мг, составляет менее 500, например менее 300, предпочтительно менее 200, более предпочтительно менее 100, более предпочтительно менее 50, более предпочтительно менее 20, более предпочтительно менее 10, например менее 5, менее 2, более предпочтительно менее 1 LUT/мг. Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая практически не обладает способностью оказывать воздействие на моноглице-8 021283 рид. Это можно определять, используя моноолеат (М 77651-олеоил-рац-глицерин, 99%) вместо подсолнечного масла при осуществлении анализа LUS. 1 MGHU определяют как количество фермента, которое может производить 1 мкмоль жирных кислот в 1 мин из моноглицерида в условиях указанного выше анализа. Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая предпочтительно практически не обладает способностью оказывать воздействие на триглицерид,которая может обладать активностью, выраженной в виде MGHU/мг, составляющей менее 5000, например менее 1000, например менее 500, например менее 300, предпочтительно менее 200, более предпочтительно менее 100, более предпочтительно менее 50, более предпочтительно менее 20, более предпочтительно менее 10, например менее 5, менее 2, более предпочтительно менее 1 MGHU/мг. Предпочтительно липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липидацилтрансферазу, которая может обладать активностью, характерной для одной или нескольких следующих фосфолипаз: активность фосфолипазы А 2 (К.Ф. 3.1.1.4) и/или активность фосфолипазы А 1(К.Ф. 3.1.1.32). Липид-ацилтрансфераза может обладать также активностью фосфолипазы В (К.Ф. 3.1.1.5). Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения "акцептор ацильной группы" согласно настоящему изобретению может представлять собой растительный стерин/станол, предпочтительно холестерин. Предпочтительно фермент, представляющий собой липид-ацилтрансферазу, можно характеризовать с использованием следующих критериев: фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно оценивать по способности к переносу сложного эфира, при этом ацильная группа исходного сложного эфира, связанная с донором ацильной группы липида, переносится на акцептор ацильной группы с образованием нового сложного эфира; и фермент содержит в аминокислотной последовательности мотив GDSX, где X обозначает один или несколько следующих аминокислотных остатков: L, А, V, I, F, Y, H, Q, Т, N, М или S. Мотив GDSX состоит из четырех консервативных аминокислот. Предпочтительно серин, входящий в мотив, представляет собой "каталитический" серин фермента ацилтрансферазы. Предпочтительно серин, входящий в мотив GDSX, может находиться в положении, которое соответствует Ser-16 в ферменте,представляющем собой липид-ацилтрансферазу Aeromonas hydrophila, которая описана у Brumlik и Buckley, Journal of Bacteriology, т. 178,7, апрель 1996 г., c. 2060-2064. Для решения вопроса о том, имеет ли белок мотив GDSX, предлагаемый в настоящем изобретении,последовательность предпочтительно сравнивают с профилями скрытой марковской модели (НММпрофили) в базе данных pfam согласно процедурам, изложенным в WO 2004/064537 или WO 2004/064987, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансферазу можно сравнивать с консенсусной последовательностью Pfam00657 (более детальное описание см. в WO 2004/064537 или WO 2004/064987). Предпочтительно положительное совпадение с профилем скрытой марковской модели (НММпрофиль) доменов семейства pfam00657 свидетельствует о присутствии GDSL- или GDSX-домена, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно при сравнительном анализе (выравнивании) с консенсусной последовательностьюPfam00657 липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в способах или в вариантах применения, предлагаемых в изобретении, может иметь по меньшей мере один, предпочтительно более одного,предпочтительно более двух следующих мотивов: GDSX-блок, GANDY-блок, НРТ-блок. Предпочтительно липид-ацилтрансфераза может иметь GDSX-блок и GANDY-блок. В альтернативном варианте фермент может иметь GDSX-блок и НРТ-блок. Предпочтительно фермент содержит, по меньшей мере,GDSX-блок (дополнительные детали см. в WO 2004/064537 или WO 2004/064987). Предпочтительно остатки мотива GANDY выбирают из GANDY, GGNDA, GGNDL, наиболее предпочтительно GANDY. Домен GDSX pfam00657 является уникальным идентификатором, который позволяет отличать белки, несущие этот домен, от других ферментов. Консенсусная последовательность pfam00657 представлена на фиг. 3 в виде SEQ ID No. 2. Ее получают в результате идентификации базы данных семейства pfam00657, версия 6, и ее можно обозначать также в контексте настоящего описания как pfam00657.6. Консенсусную последовательность можно модифицировать, используя дополнительные версии базы данных pfam (см., например, WO 2004/064537 или WO 2004/064987). В одном из вариантов осуществления изобретения фермент липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, можно характеризовать с использованием следующих критериев:(I) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно оценивать по способности к переносу сложного эфира, при этом ацильная группа исходного сложного эфира, связанная с донором ацильной группы липида, переносится на акцептор ацильной группы с образованием нового сложного эфира;(II) фермент содержит в аминокислотной последовательности мотив GDSX, где X обозначает один или несколько следующих аминокислотных остатков: L, А, V, I, F, Y, H, Q, T, N, М или S;(III) фермент содержит His-309 или содержит остаток гистидина в положении, соответствующемHis-309 в ферменте, представляющем собой липид-ацилтрансферазу Aeromonas hydrophila, который представлен на фиг. 2 и 4 (SEQ ID No. 1 или SEQ ID No. 3). Предпочтительно аминокислотный остаток в мотиве GDSX представляет собой L. В SEQ ID No. 3 или SEQ ID No. 1 первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. His-309 полноразмерной последовательности, представляющей собой белок, который содержит сигнальную последовательность, соответствует His-291 зрелой части белка, т.е. последовательности без сигнальной последовательности. В одном из вариантов осуществления изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит следующую каталитическую триаду:Ser-34, Asp-306 и His-309 или содержит остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина соответственно в положениях, которые соответствуют Ser-34, Asp-306 и His-309 в ферменте, представляющем собой липид-ацилтрансферазу Aeromonas hydrophila, который представлен на фиг. 4 (SEQNo. 3 или SEQ ID No. 1, первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность.Ser-34, Asp-306 и His-309 полноразмерной последовательности, представляющей собой белок, который содержит сигнальную последовательность, соответствуют Ser-16, Asp-288 и His-291 зрелой части белка,т.е. последовательности без сигнальной последовательности. В консенсусной последовательностиpfam00657, представленной на фиг. 3 (SEQ ID No. 2), остатки активного сайта соответствуют Ser-7, Asp345 и His-348. В одном из вариантов осуществления изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которую можно характеризовать с использованием следующих критериев: фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно оценивать по способности к переносу сложного эфира, при этом ацильная группа исходного сложного эфира, связанная с донором ацильной группы липида, переносится на акцептор ацильной группы с образованием нового сложного эфира; и фермент содержит по меньшей мере Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 или содержит остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 и His-309 соответственно в ферменте, представляющем собой липид-ацилтрансферазу Aeromonas hydrophila, который представлен в SEQ ID No. 3 или SEQ ID No. 1. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой полипептид, обладающий активностью липид-ацилтрансферазы, при этом полипептид получают путем экспрессии одной из нуклеотидных последовательностей, которые представлены в SEQ ID No. 21, 47, 25,48, 50, 51, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 29, 30, 31, 52, 32, 33, 34, 35 или 36, или нуклеотидных последовательностей, которые идентичны им на 75% или более. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может кодироваться одной из следующих нуклеотидных последовательностей:(ц) нуклеотидная последовательность, идентичная на 70% или более, предпочтительно на 75% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 38, 39, 40, 47, 48, 50, 51 или 52; или(ч) нуклеотидная последовательность, которая из-за вырожденности генетического кода идентична одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 38, 39, 40, 47, 48, 50, 51 или 52. Предпочтительно нуклеотидная последовательность может быть идентична на 80% или более,предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более и еще более предпочтительно на 95% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 21, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 47, 48, 50, 51 или 52. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, которая кодирует фермент липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая идентична на 70% или более, предпочтительно на 75% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 26, 27, 28, 35 и 36. Предпочтительно нуклеотидная последовательность может быть идентична на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более и еще более предпочтительно на 95% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 26, 27, 28, 35 и 36. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, которая кодирует фермент липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая идентична на 70% или более, на 75% или более, на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более и еще более предпочтительно на 95% или более последовательности, представленной в SEQ ID No. 26. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит одну или несколько из следующих аминокислотных последовательностей:(XXIV) аминокислотная последовательность, которая идентична на 75, 80, 85, 90, 95, 98% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 37, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 41. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит либо аминокислотную последовательность, представленную вSEQ ID No. 37, или 3, или 4, или 1, или 14, или 15, или 19, или 20, либо содержит аминокислотную последовательность, которая идентична на 75% или более, предпочтительно на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, предпочтительно на 95% или более аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 37, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 3, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ IDNo. 4, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 1, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 14, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 15, или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 19,или аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No. 20. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит аминокислотную последовательности, которая идентична на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более и еще более предпочтительно на 95% или более одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No. 37,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 41, 11, 12, 13, 1, 14, 15, 19 или 20. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит одну или несколько следующих аминокислотных последовательностей:(а) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 1-100 SEQ ID(б) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 101-200 SEQ(в) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 201-300 SEQ(г) аминокислотная последовательность, идентичная на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более одной из аминокислотных последовательностей, указанных выше в (а)-(в). Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может содержать одну или несколько следующих аминокислотных последовательностей:(а) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 28-39 SEQ ID(б) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 77-88 SEQ ID(в) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 126-136 SEQ(г) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 163-175 SEQ(д) аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 304-311 SEQ(е) аминокислотная последовательность, идентичная на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более одной из аминокислотных последовательностей, указанных выше в (а)-(д). Согласно одному из объектов изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая может представлять собой липид-ацилтрансферазу из Candida parapsilosis, описанную в ЕР 1275711. Таким образом, согласно одному из объектов изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в способе и вариантах применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 42. Более предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQID No. 15 или SEQ ID No. 37, или аминокислотную последовательность, идентичную на 75% или более,предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более или еще более предпочтительно на 99% или более SEQ ID No. 15 или SEQ ID No. 37. Этот фермент можно рассматривать как вариант фермента. Согласно одному из объектов изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,- 12021283 является липид-ацилтрансферазой, которая может представлять собой лецитин:холестеринацилтрансферазу (LCAT) или ее вариант (например, вариант, созданный на основе молекулярной эволюции). Приемлемые LCAT известны в данной области и их можно получать из одного или нескольких следующих организмов, таких, например, как млекопитающие, крысы, мыши, цыплята, Drosophila melanogaster, растения, включая Arabidopsis и Oryza sativa, нематоды, грибы и дрожжи. Согласно одному из объектов изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении,является липид-ацилтрансферазой, которая может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которую можно получать, предпочтительно получают, из штаммов Е.coli TOP 10, несущих pPetl2aAhydro иpPetl2aASalmo, которые депонированы в коллекции штаммов фирмы Danisco A/S Langebrogade l, DK1001 Copenhagen К, Denmark согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Национальной коллекции промышленных,пищевых и морских бактерий (National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB, 23 St.Machar Street, Aberdeen Scotland, GB, 22 декабря 2003 г. под регистрационными номерами NCIMB 41204 и NCIMB 41205 соответственно. Фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой фосфолипидглицерин-ацилтрансферазу. К фосфолипид-глицерин-ацилтрансферазам относятся ферменты, выделенные из Aeromonas spp., предпочтительно Aeromonas hydrophila или A. salmonicida, наиболее предпочтительно A. salmonicida, или их варианты. Липид-ацилтрансферазы, которые применяют согласно настоящему изобретению, могут кодироваться SEQ ID No. 1, 3, 4, 14, 19 и 20. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, предпочтительно, чтобы сигнальные пептиды ацилтрансферазы отщеплялись в процессе экспрессии трансферазы. Сигнальный пептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID No. 1, 3, 4 и 14, состоит из аминокислот 1-18. Таким образом, наиболее предпочтительными областями являются аминокислоты 19-335 в SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 3 (A. hydrophilia) и аминокислоты 19-336 в SEQ ID No. 4 иSEQ ID No. 14 (A. salmonicida). При применении с целью определения гомологии или идентичности аминокислотных последовательностей предпочтительно для сравнительного анализа первичной структуры,который представлен в настоящем описании, использовать зрелую последовательность. Таким образом, наиболее предпочтительными областями для определения гомологии (идентичности) являются аминокислоты 19-335 в SEQ ID No. 1 и 3 (А. hydrophilia) и аминокислоты 19-336 в SEQ IDNo. 4 и 14 (A. salmonicida). SEQ ID No. 19 и 20 представляют собой зрелые белковые последовательности липид-ацилтрансфераза из A. hydrophilia и A. salmonicida соответственно, которые могут быть подвергнуты дополнительной посттрансляционной модификации, но могут и не быть подвергнуты указанной модификации. Фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которую можно выделять также из Thermobifida, предпочтительно Т. fusca, наиболее предпочтительно кодируемую SEQ ID No. 43. Предпочтительные липид-ацилтрансферазы, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению и/или в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, могут содержать одну из следующих аминокислотных последовательностей и/или кодироваться следующими нуклеотидными последовательностями: а) нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий активностью липид-ацилтрансферазы, и идентичный по меньшей мере на 70% (предпочтительно идентичный по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%) полипептидной последовательности,которая представлена в SEQ ID No. 15, или полипептиду, представленному в SEQ ID No. 37; б) (выделенный) полипептид, содержащий (или состоящий из) аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID No. 15 или SEQ ID No. 37, или аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 70% (предпочтительно идентичный по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%) SEQ ID No. 15 или SEQ ID No. 37; в) нуклеотидная последовательность, которая кодирует липид-ацилтрансферазу, где нуклеотидная последовательность содержит (или состоит из) нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID No. 26, или нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 70%(предпочтительно идентична по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%) нуклеотидной последовательности, которая представлена в SEQ ID No. 26; г) нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в условиях средней или повышенной жесткости с нуклеотидным зондом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID No. 26, и кодирует полипептид, обладающий активностью липид-ацилтрансферазы; д) нуклеиновая кислота, которая представляет собой фрагмент нуклеотидных последовательностей,описанных в а), в) или г); или е) полипептид, который представляет собой фрагмент полипептида, описанного в б). Фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которую можно также выделять из Streptomyces, предпочтительно S. avermitis, наиболее предпочтительно которая кодируется SEQ ID No. 32. Другие ферменты из Streptomyces, которые можно применять согласно настоящему изобретению, представляют собой ферменты, кодируемые SEQID No. 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 31, 33 и 41. Фермент, предназначенный для применения согласно изобретению, можно выделять также из Corynebacterium, предпочтительно С. efficiens, наиболее предпочтительно который кодируется SEQ ID No. 18. Предпочтительно фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID No. 22, 23, 24, 48, 44, 50 или 53, или аминокислотных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%, или может кодироваться одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID No. 36, 39, 42, 44, 46 или 48, или нуклеотидных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97 или 98%. Согласно другому варианту осуществления изобретения фермент липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которая содержит одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID No. 22, 23, 24, 43, 45, 49 или 53, или аминокислотных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%, или может кодироваться одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ IDNo. 25, 47, 48, 50 или 51, или нуклеотидных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%. Согласно другому варианту осуществления изобретения применяют согласно настоящему описанию фермент липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, которая может представлять собой липидацилтрансферазу, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ IDNo. 23, 24, 45, 49 или 53, или аминокислотных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%. Согласно другому варианту осуществления изобретения применяют согласно настоящему описанию липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, которая может представлять собой липидацилтрансферазу, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ IDNo. 23, 45 или 53, или аминокислотных последовательностей, которые идентичны им по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%. Более предпочтительно согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 45, или аминокислотную последовательность, которая идентична ей по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 или 98%. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения липид-ацилтрансфераза, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой липид-ацилтрансферазу, которую можно получать,предпочтительно получают, из штаммов Streptomyces L130 или L131, которые депонированы в коллекции штаммов фирмы Danisco A/S, Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Denmark согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB), 23 St.Machar Street, Aberdeen Scotland, GB, 25 июня 2004 г. под регистрационными номерами NCIMB 41226 иNCIMB 41227 соответственно. Приемлемые липид-ацилтрансферазы, предназначенные для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, могут иметь аминокислотную последовательность, которую можно идентифицировать с помощью выравнивания с последовательностью L131(SEQ ID No. 22), используя программу Align X, включающую модуль алгоритма попарного выравниваяClustal W, который входит в пакет программ VectorNTI, с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Выравнивание L131 и гомологов из S. avermitilis и T.fusca иллюстрирует наличие консервативного мотива GDSX (GDSY в L131 и S. avermitilis, и Т. fusca), бокса GANDY, который представляет собой либо GGNDA, либо GGNDL, и бокса НРТ (который рассматривается в качестве консервативного "каталитического" гистидина). Указанные три консервативных блока проиллюстрированы на фиг. 26. При выравнивании или с консенсусной последовательностью pfam Pfam00657 (описанной в WO 04/064987), и/или с последовательностью L131, представленной в настоящем описании (SEQ ID No. 22),- 14021283 можно идентифицировать три консервативные области, такие как блок GDSX, блок GANDY и блок НТР(более подробное описание см. в WO 04/064987). При выравнивании или с консенсусной последовательностью pfam Pfam00657 (описанной в WO 04/064987), и/или с последовательностью L131, представленной в настоящем описании (SEQ ID No. 22),установлено, что:I) липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая имеет мотив GDSX, более предпочтительно мотив GDSX, выбранный из мотива GDSL или GDSY; и/илиII) липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая имеет блок GANDY, более предпочтительно блок GANDY, содержащийIII) липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая предпочтительно имеет блок НТР; и предпочтительноIV) липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой липидацилтрансферазу, которая имеет мотив GDSx или GDSY и блок GANDY, содержащий амино-GGNDx,предпочтительно GGNDA или GGNDL, и блок НТР (консервативный гистидин). В одном из вариантов осуществления изобретения фермент, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно может не представлять собой фермент фосфолипазу, такую как фосфолипаза А 1,классифицированная как К.Ф. 3.1.1.32, или фосфолипаза А 2, классифицированная как К.Ф. 3.1.1.4. Преимущества изобретения Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что применение липидацилтрансферазы, предлагаемой в настоящем изобретении, приводит к снижению содержания холестерина в пищевых продуктах на основе мяса. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является снижение содержания холестерина в пищевом продукте на основе мяса, при сохранении и/или улучшении одной или нескольких из следующих характеристик: стабильность жира (это означает, что потери жира минимизируются и количество видимого жира снижается в пищевых продуктах на основе мяса); вкус, консистенция, потеря массы и внешний вид. Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что оно позволяет изготавливать пищевой продукт на основе мяса, обладающий повышенной стабильностью жира (т.е. достигается снижение количества видимого жира и/или снижение сальности, и/или снижение отделения жира в процессе тепловой обработки), и/или улучшенной консистенцией, и/или пониженной потерей массы. Другим преимуществом настоящего изобретения является такой способ, при использовании которого размножение вызывающих порчу бактерий, патогенов и грибов в мясе и/или пищевом продукте на основе мяса в процессе обработки снижается или сохраняется на минимальном уровне. Еще одним преимуществом настоящего изобретения (например, в случае применения для продуктов на основе эмульгированного мяса со значительным содержанием жира, например, колбас из тонкоизмельченного фарша и паштетов), является то, что стабильность жира повышается, при этом потери жира минимизируются и количество видимого жира снижается. Кроме того, можно сохранять на низком уровне потерю мясного сока и/или при этом вкус, консистенция и/или внешний вид являются приемлемыми. Липид-ацилтрансферазы переносят сложноэфирную связь sn-2 с фосфолипидов и/или триглицеридов, и/или галактолипидов, на акцептор ацильной группы, такой как холестерин; что приводит к образованию лизофосфолипидов и/или моно- и/или диглицеридов, и/или лизогалактолипидов соответственно и сложного эфира холестерина (на фиг. 67 это проиллюстрировано с использованием в качестве примера фосфолипазы). Трансферазы приводят к высвобождению менее гидрофобных и поэтому более растворимых в воде лизофосфолипидов (когда субстратом является фосфолипид), которые имеют более высокую динамическую поверхностную активность из-за более высокой концентрации мономера в водной фазе. Помимо эмульгирующих свойств, липид-ацилтрансферазы обладают также способностью снижать уровни холестерина в мясе в результате образования сложных эфиров холестерина (т.е. они используют холестерин в качестве акцептора ацильных групп с образованием сложного эфира холестерина и снижают количество "свободного" холестерина). Полиненасыщенные жирные кислоты и холестерин могут подвергаться окислению в процессе изготовления и пролонгированного хранения мясных продуктов. В результате такого окисления образуются различные соединения (гидропероксиды, альдегиды, кетоны,оксиды холестерина, такие как оксистерины, и т.д.), некоторые из которых, вероятно, обладают мутагенными и онкогенными действиями и цитотоксическими свойствами (Jimenez-Colmenero и др., Healthiermeat and meat products: their role as functional foods, Meat science 59, 2001, c. 5-13). Таким образом, снижение холестерина является преимуществом, поскольку может приводить к снижению количества потенци- 15021283 ально опасных соединений, образующихся при окислении. Кроме того, пищевой продукт на основе мяса можно использовать в качестве компонента диеты, направленной на снижение холестерина, поскольку он относится к продуктам с пониженным уровнем холестерина, которые часто рекомендованы для здорового питания. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что оно позволяет получать мясо или пищевой продукт на основе мяса с улучшенной (повышенной) термостойкостью. Клетка-хозяин. Липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению,можно получать методом рекомбинации в клетке-хозяине или организме-хозяине. Организм-хозяин может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липид-ацилтрансферазу, предлагаемую в настоящем изобретении, экпрессируют в клетке-хозяине, например в бактериальной клетке, такой как клетка-хозяин Bacillus spp., например Bacillus licheniformis. В альтернативном варианте клетки-хозяева могут представлять собой, например, клетки грибов,дрожжей или растений. Было установлено, что применение в качестве клетки-хозяина Bacillus licheniformis приводит к повышенному уровню экспрессии липид-ацилтрансферазы по сравнению с другими организмами, такими как Bacillus subtilis. Липид-ацилтрансферазу из Aeromonas salmonicida встраивали в различные общепринятые экспрессионные векторы, созданные таким образом, что они являлись оптимальными для экспрессии в Bacillussubtilis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe и Aspergillus tubigensis соответственно. Однако в Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe и Aspergillus tubigensis обнаружены лишь очень низкие уровни. Уровни экспрессии были ниже 1 мкг/мл, вследствие чего оказалось невозможно отбирать клетки, которые продуцировали бы белок в количестве, достаточном для начала промышленного производства (результаты не представлены). В противоположность этому уровни белка, которые удалось получать в Bacillus licheniformiss, оказались пригодными для приемлемого с экономической точки зрения производства. В частности, было установлено, что уровень экспрессии в В. licheniformis примерно в 100 раз выше,чем уровень экспрессии в В. subtilis под контролем промотора aprE или примерно в 100 раз выше, чем уровень экспрессии в S. lividans под контролем промотора А 4 и при слиянии с целлюлозой (результаты не представлены в настоящем описании). В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку представителей p. Bacillus, отличных от В. subtilis. Предпочтительно указанная клетка-хозяин, относящаяся к p. Bacillus, представляет собой клетку одного из следующих видов: Bacillus licheniformis; В. alkalophilus; В. amyloliquefaciens; В. circulans; В. clausii; В. coagulans; В. firmus; В. lautus; В. lentus; В. megaterium; В. pumilus или В. stearothermophilus. Понятие "клетка-хозяин" в контексте настоящего изобретения относится к любой клетке, которая содержит либо нуклеотидную последовательность, кодирующую липид-ацилтрансферазу, представленную в настоящем описании, либо экспрессионный вектор, представленный в настоящем описании, и которую используют для рекомбинантного получения липид-ацилтрансферазы, которая обладает конкретными свойствами, представленными в настоящем описании. Предпочтительно клетка-хозяин может представлять собой клетку штамма с дефицитом протеазы или минус-штамм, в котором отсутствует протеаза, и/или клетку штамма с дефицитом -амилазы или минус-штамм, в котором отсутствует -амилаза. Понятие "гетерологичный" в контексте настоящего описания относится к последовательности, выведенной из другого генетического источника или других видов. Гетерологичная последовательность представляет собой нехозяйскую последовательность, модифицированную последовательность, последовательность из другого штамма клетки-хозяина или гетерологичную последовательность из клеткихозяина с другой хромосомальной локализацией."Гомологичная" последовательность представляет собой последовательность, которая присутствует в том же генетическом источнике или тех же видах, т.е. которая встречается в естественных условиях в соответствующих видах клеток-хозяев. Понятие "рекомбинантная липид-ацилтрансфераза" в контексте настоящего описания относится к липид-ацилтрансферазе, полученной с помощью генетической рекомбинации. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую липид-ацилтрансферазу, встраивали в клонирующий вектор с получением клетки В. licheniformis, отличающейся присутствием гетерологичной липид-ацилтрансферазы. Регуляторные последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность липид-ацилтрансферазы,предназначенной для применения в способах и/или вариантах применения, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получать, осуществляя функциональную связь кодирующей ее нуклеотидной последовательности с регуляторной последовательностью, которая обладает способностью обеспечивать экс- 16021283licheniformis). Например, можно использовать вектор, который содержит нуклеотидную последовательность,предлагаемую в настоящем изобретении, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор, который представляет собой экспрессионный вектор. Понятие "функционально связанный" относится к расположению, при котором компоненты, представленные в настоящем описании, находятся во взаимодействии, которое позволяет им функционировать требуемым образом. Регуляторную последовательность, "функционально связанную" с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, чтобы достигать экспрессии кодирующей последовательности в условиях, приемлемых для контролирующих последовательностей. Понятие "регуляторные последовательности" относится к промоторам и энхансерам и другим регуляторным сигналам экспрессии. Понятие "промотор" в контексте настоящего описания используют в общепринятом в данной области смысле, например, как сайт связывания РНК-полимеразы. Для достижения повышенного уровня экспрессии нуклеотидной последовательности, которая кодирует фермент, обладающий специфическими свойствами, указанными в настоящем описании, можно использовать также селекцию регуляторных областей, например областей промотора, секреторной лидерной и терминирующей последовательностей, которые не являются регуляторными областями для нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент в естественных условиях. Предпочтительно нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении,можно функционально связывать, по меньшей мере, с промотором. Предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую липид-ацилтрансферазу, можно функционально связывать с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует терминирующую последовательность. Примерами приемлемых терминирующих последовательностей, которые можно использовать в любом из векторов, клеток-хозяев, способах и/или вариантов применения настоящего изобретения, являются: терминирующая последовательность -амилазы (например,CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA - SEQ ID No. 57), терминирующая последовательность щелочной протеазы (например,CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA - SEQ IDNo. 58), специфическая для глутаминовой кислоты терминирующая последовательность (например,ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT - SEQID No. 59), терминирующая последовательность леваназы (например,TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT - SEQ ID No. 60) и терминирующая последовательность субтилизина Е (например,GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG - SEQ ID No. 61). Предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую липид-ацилтрансферазу, можно функционально связывать с терминатором -амилазы, таким как терминатор -амилазы В. licheniformis. Промотор. Промоторная последовательность, которую можно применять согласно настоящему изобретению,может быть гетерологичной или гомологичной относительно последовательности, которая кодирует липид-ацилтрансферазу. Промоторная последовательность может представлять собой любую промоторную последовательность, которая может обеспечивать экспрессию липид-ацилтрансферазы в выбранной клетке-хозяине. Предпочтительно промоторная последовательность может представлять собой гомологичную последовательность для видов p. Bacillus, например В. licheniformis. Предпочтительно промоторная последовательность является гомологичной для выбранной клетки-хозяина. Предпочтительно промоторная последовательность может быть гомологичной для выбранной клетки-хозяина. "Гомологичная для выбранной клетки-хозяина" означает имеющая происхождение из организма-хозяина; т.е. означает, что промоторная последовательность встречается в естественных условиях в организме-хозяине. Предпочтительно промоторную последовательность можно выбирать из группы, включающей нуклеотидную последовательность, которая кодирует промотор -амилазы, промотор протеазы, промотор субтилизина, промотор специфической для глутаминовой кислоты протеазы и промотор левансахаразы. Предпочтительно промоторная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует: LAT (например, промотор альфа-амилазы из В. licheniformis, известный также как AmyL), AprL (например, промотор субтилизина Карлсберга), EndoGluC (промотор,специфический для глутаминовой кислоты из В. licheniformis), AmyQ (например, промотор альфаамилизы из В. Amyloliquefaciens, промотор альфа-амилазы) и SacB (например, промотор левансахаразы из В. subtilis). Другими примерами промоторов, пригодных для обеспечения транскрипции нуклеотидной после- 17021283 довательности, которую применяют в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, являются промотор гена щелочной протеазы Bacillus lentus (aprH); промотор гена альфа-амилазы Bacillus subtilis(amyE); промотор гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM); промотор гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP); промотор генов xylA и xylB Bacillus subtilis и/или промотор генаCryIIIA Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. В предпочтительном варианте осуществления изобретения промоторная последовательность представляет собой промотор -амилазы (например, промотор -амилазы Bacillus licheniformis). Предпочтительно промоторная последовательность содержит последовательность, которая простирается от положения -35 до положения -10 последовательности промотора -амилазы В. licheniformis (см. фиг. 53 и 55). Понятие "последовательность, простирающаяся от положения -35 до положения -10" описывает положение последовательности относительно сайта инициации транскрипции. И "-35", и "-10" обозначают боксы, т.е. несколько нуклеотидов, каждый из которых содержит 6 нуклеотидов, и эти боксы отделены друг от друга 17 нуклеотидами. Эти 17 нуклеотидов часто обозначают как "спейсер". Это проиллюстрировано на фиг. 55, на которой боксы -35 и -10 подчеркнуты. С целью устранения сомнений следует указать, что при упоминании в контексте настоящего описания "последовательности, простирающейся от положения -35 до положения -10" подразумевается последовательность, которая начинается на боксе -35 и заканчивается на боксе -10, т.е. включает бокс -35, спейсер, состоящий из 17 нуклеотидов, и бокс -10. Сигнальный пептид. Липид-ацилтрансфераза, продуцируемая в результате экспрессии в клетке-хозяине нуклеотидной последовательности, которая кодирует липид-ацилтрансферазу, может секретироваться или может оставаться внутри клетки в зависимости от применяемой/применяемого последовательности и/или вектора. Для непосредственной секреции кодирующих последовательностей через конкретную клеточную мембрану можно применять сигнальную последовательность. Сигнальные последовательности могут встречаться в естественных условиях в сочетании с кодирующей последовательностью липидацилтрансферазы, или могут представлять собой чужеродные последовательности. Например, кодирующую последовательность сигнального пептида можно получать из гена амилазы или протеазы видов p.Bacillus, предпочтительно Bacillus licheniformis. Предпочтительно кодирующую последовательность сигнального пептида можно получать из одного или нескольких следующих генов: ген мальтогенной -амилазы, ген субтилизина, ген бета-лактамазы,ген нейтральной протеазы, ген prsA и/или ген ацилтрансферазы. Предпочтительно сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид из -амилазы В, licheniformis, ацилтрансферазы Aeromonas (например, mkkwfvcllglialtvqa - SEQ ID No. 54), субтилизина В.subtilis (например, mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa - SEQ ID No. 55) или субтилизина В. licheniformis (например, mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa - SEQ ID No. 56). Предпочтительно сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид -амилазы В. licheniformis. Однако можно применять любую кодирующую последовательность сигнального пептида, которая может обеспечивать участие экспрессирумой липид-ацилтрансферазы в секреторном пути выбранной клетки-хозяина р. Bacillus (предпочтительно клетки-хозяина В. licheniformis). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидную последовательность,кодирующую сигнальный пептид, можно функционально связывать с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует выбранную липид-ацилтрансферазу. Выбранную липид-ацилтрансферазу можно экспрессировать в клетке-хозяине, указанном в настоящем описании, в виде слитого белка. Экспрессионный вектор. Понятие "экспрессионный вектор" относится к конструкции, обладающей способностью к экспрессии in vivo или in vitro. Предпочтительно экспрессионный вектор встраивают в геном организма, такого как хозяин вида В.licheniformis. Понятие "встроенный" предпочтительно подразумевает стабильное включение в геном. Нуклеотидная последовательность, кодирующая липид-ацилтрансферазу, представленную в настоящем описании, может присутствовать в векторе, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями таким образом, что регуляторные последовательности могут обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности приемлемым организмомхозяином (таким как В. licheniformis), т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор. Векторами, предлагаемыми в настоящем изобретении, можно трансформировать указанную выше пригодную клетку-хозяина, что приводит к экспрессии полипептида, обладающего липидацилтрансферазной активностью, указанной в настоящем описании. Выбор вектора, например плазмиды, космиды, вирусного или фагового вектора, геномной вставки,часто должен зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен быть интродуцирован. Под объем настоящего изобретения могут подпадать другие формы экспрессионных векторов, которые обладают эквивалентными функциями и которые уже известны или будут известны в данной области. После трансформации им выбранной клетки-хозяина вектор может реплицироваться и функциони- 18021283 ровать независимо от генома клетки-хозяина или может интегрироваться в ее геном. Векторы могут содержать один или несколько генов селектируемых маркеров, таких, например, как ген, обусловливающий устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. В альтернативном варианте селекцию можно осуществлять путем котрансформации (согласно методу, описанному в WO 91/17243). Векторы можно применять in vitro, например, для получения РНК, или применять для трансфекции или трансформации клетки-хозяина. Вектор может содержать также нуклеотидную последовательность, способствующую репликации вектора в представляющей интерес клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются сайты инициации репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, рЕ 194, pAMB1 и pIJ702. Вариант липид-ацилтрансферазы. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, которая кодирует липид-ацилтрансферазу, или липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может кодировать или может представлять собой вариант липид-ацилтрансферазы. Можно применять варианты, обладающие повышенной активностью в отношении фосфолипидов,например повышенной трансферазной активностью в отношении фосфолипидов. Приемлемые методы модификации липид-ацилтрансфераз с получением вариантов липидацилтрансфераз изложены в WO 2005/066347 (которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Одной из предпочтительных модификаций является N80D. Это наиболее важно при использовании последовательности SEQ ID No. 20 в качестве каркаса. Так, последовательность может представлять собой SEQ ID No. 15 или SEQ ID No. 37. Эту модификацию можно объединять с одной или несколькими другими модификациями. Как отмечалось выше, при ссылке в контексте настоящего описания на конкретные аминокислотные остатки нумерация соответствует нумерации, полученной при сравнительном анализе (выравнивании) варианта последовательности и референс-последовательности, представленной в SEQ ID No. 19 илиSEQ ID No. 20. Еще более предпочтительно нуклеотидная последовательность, которая кодирует липидацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может кодировать липид-ацилтрансферазу, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID No. 15, или аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID No. 37, или аминокислотная последовательность которой идентична на 70% или более, предпочтительно на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более, еще более предпочтительно на 99% или более последовательности, представленной в SEQ ID No. 16 или SEQ ID No. 68. Этот фермент может рассматриваться как вариант фермента. Определения. Понятие "трансфераза" в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо с понятием"липид-ацилтрансфераза". Предпочтительно липид-ацилтрансфераза, как она определена в настоящем описании, каталилизирует одну или несколько следующих реакций: переэтерификацию, трансэтерификацию, алгоголиз, гидролиз. Понятие "переэтерификация" относится к катализируемому ферментом переносу ацильных групп между липидом-донором и липидом-акцептором, где липид-донор не содержит свободную ацильную группу. Понятие "трансэтерификация" в контексте настоящего описания означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы от липида-донора (отличного от свободной жирной кислоты) на акцептор ацильной группы (отличный от воды). Липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в способах и/или вариантах применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой фермент, который предпочтительно катализирует реакцию трансэтерификации между липидом (предпочтительно фосфолипидом) и стерином (предпочтительно холестерином). Понятие "алгоголиз" в контексте настоящего описания означает ферментативное расщепление ковалентной связи кислотного производного путем взаимодействия спирта ROH, в результате которого один из продуктов приобретает Н спирта, а другой продукт приобретает OR-группу спирта. Понятие "гидролиз" в контексте настоящего описания означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы от липида на ОН-группу молекулы воды. Комбинация с другими ферментами. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения липидацилтрансферазу применяют в сочетании с липазой, обладающей одним или несколькими следующими видами ферментативной активности: активность гликолипазы (К.Ф. 3.1.1.26, активность фосфолипазы А 2 (К.Ф. 3.1.1.4) или активность фосфолипазы А 1 (К.Ф. 3.1.1.32). Предпочтительно липазы представля- 19021283 ют собой ферменты, хорошо известные в данной области, и к ним относятся, например, следующие липазы: фосфолипаза A1 LECITASE ULTRA (фирма Novozymes A/S, Дания), фосфолипаза А 2 (например,фосфолипаза А 2 LIPOMOD 22L фирмы Biocatalysts, ПРОМАХ и LysoMax PLA2 фирмы Genecor),LIPOLASE (фирма Novozymes A/S, Дания). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения может оказаться полезным совместно применять липид-ацилтрансферазу и фосфолипазы, такие как фосфолипаза А 1, фосфолипаза А 2, фосфолипаза В, фосфолипаза С и/или фосфолипаза D. Совместное применение может включать последовательное или одновременное применение, например обработку липид-ацилтрансферазой можно осуществлять до обработки или одновременно с обработкой другим ферментом. В альтернативном варианте обработку другим ферментом можно осуществлять до или одновременно с обработкой липид-ацилтрансферазой. В случае последовательной обработки ферментами в некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться целесообразным удалять применяемый первым фермент, например, путем тепловой деактивации или посредством применения иммобилизованного фермента, перед обработкой вторым(и/или третьим и т.д.) ферментом. Посттранскрипционные и посттрансляционные модификации. Предпочтительно липид-ацилтрансфераза, предлагаемая в настоящем изобретении, может кодироваться любой из нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении. Посттранскрипционные и/или посттрансляционные модификации можно осуществлять в зависимости от клетки-хозяина. Предусматривается, что липид-ацилтрансфераза, предназначенная для применения в способах и/или вариантах применения, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой липид-ацилтрансферазы, подвергнутые посттранскрипционным и/или посттрансляционным модификациям. В качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, экспрессия нуклеотидной последовательности, которая в настоящем описании представлена в SEQ ID No. 26 (см. фиг. 39), в клетке-хозяине(такой, например, как клетка Bacillus licheniformis) приводит к посттранскрипционным и/или посттрансляционным модификациям, в результате которых получают аминокислотную последовательность, которая в настоящем описании представлена в SEQ ID No. 37 (см. фиг. 50). В SEQ ID No. 37 представлена последовательность, такая же, как последовательность, представленная в SEQ ID No. 15 (см. фиг. 1, представленный в настоящем описании), за исключением того, что последовательность, представленная в SEQ ID No. 37, подвергнута посттранскрипционной и/или посттрансляционной модификации, приводящей к удалению 38 аминокислот. Выделение. Согласно одному из объектов изобретения липид-ацилтрансфераза представляет собой очищенную/выделенную липид-ацилтрансферазу. Таким образом, полученная липид-ацилтрансфераза может находиться в выделенной форме. Согласно другому объекту изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, может находиться в выделенной форме. Понятие "выделенная" означает, что последовательность или белок находятся в форме, практически свободной по меньшей мере от одного другого компонента, с которым последовательность или белок ассоциированы в естественных условиях в природе или обнаружены в природе. Очистка. Согласно одному из объектов изобретения липид-ацилтрансфераза может находиться в очищенной форме. Согласно другому объекту изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая липидацилтрансферазу, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, может находиться в очищенной форме. Понятие "очищенная" означает, что последовательность находится в практически очищенном состоянии - например, ее чистота составляет по меньшей мере примерно 51%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 98%. Клонирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении. Нуклеотидную последовательность, кодирующую либо полипептид, который обладает конкретными свойствами, указанными в настоящем описании, либо полипептид, который можно модифицировать,можно выделять из любой клетки или организма, продуцирующей/продуцирующего указанный полипептид. В данной области хорошо известны различные методы выделения нуклеотидных последовательностей. Например, можно конструировать библиотеку геномной ДНК и/или кДНК с использованием хро- 20021283 мосомальной ДНК или матричной РНК из организма, продуцирующего полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида является известной, то можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и применять их для идентификации кодирующих полипептид клонов из геномной библиотеки, полученной из организма. В альтернативном варианте меченый олигонуклеотидный зонд, содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену полипептида, можно применять для идентификации кодирующих полипептид клонов. В последнем случае используют менее строгие условия гибридизации и отмывки. В альтернативном варианте кодирующие полипептид клоны можно идентифицировать путем встраивания фрагментов геномной ДНК в экспрессионный вектор, такой как плазмида, трансформировать негативные в отношении фермента бактерии полученной библиотекой геномной ДНК и затем высевать трансформированные бактерии на агар, содержащий фермент, ингибируемый полипептидом, идентифицируя тем самым предназначенные для идентификации клоны, которые экспрессируют полипептид. В другом альтернативном варианте нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид,можно получать с помощью синтеза, используя общепринятые методы, например фосфороамидитный метод, который описан у Beucage S.L. и др., Tetrahedron Letters 22, 1981, c. 1859-1869, или метод, который описан у Matthes и др., EMBO J. 3, 1984, c. 801-805. При применении фосфороамидитного метода олигонуклеотиды синтезируют, например, с помощью автоматического синтезатора ДНК, очищают,"отжигают", встраивают путем лигирования и клонируют в соответствующих векторах. Нуклеотидная последовательность может представлять собой ДНК смешанного геномного или синтетического происхождения, смешанную ДНК, полученную из синтетической ДНК и из кДНК, или смешанную геномную ДНК и кДНК, созданную в результате лигирования фрагментов ДНК синтетического,геномного происхождения или полученных из кДНК (при необходимости), которую создают с использованиемстандартных методов. Каждый лигированный фрагмент соответствует различным областям полной нуклеотидной последовательности. Последовательность ДНК можно создавать также с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров, например, описанных в US 4683202 или у Saiki R.K. и др., Science, 239, 1988, c. 487-491. Нуклеотидные последовательности. Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды, которые обладают конкретными свойствами, указанными в настоящем описании. Понятие"нуклеотидная последовательность" в контексте настоящего описания относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и их вариантам, гомологам, фрагментам и производным (таким как их участки). Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, синтетическое или рекомбинантное происхождение, она может быть двухцепочечной или одноцепочечной,имеющей смысловую или антисмысловую цепь. Понятие "нуклеотидная последовательность" в контексте настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК, предпочтительно означает ДНК, более предпочтительно кДНК кодирующей последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, которая per se кодирует полипептид, обладающий конкретными свойствами, указанными в настоящем описании, не охватывает нативную нуклеотидную последовательность в ее встречающемся в естественных условиях окружении, в котором она сцеплена с встречающейся(имися) в естественных условиях ассоциированной(ами) последовательностью(ями), которая(ые) присутствует(ют) также в ее естественном окружении. Для простоты обозначения в контексте настоящего описания этот предпочтительный вариант осуществления изобретения обозначен как "ненативная нуклеотидная последовательность". В этой связи понятие "нативная нуклеотидная последовательность" относится к полной нуклеотидной последовательности, которая находится в ее нативном окружении и функционально связна с полным промотором, с которым она ассоциирована в естественных условиях, при этом промотор находится также в ее нативном окружении. Таким образом, полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, может экспрессироваться нуклеотидной последовательностью, которая находится в нативном для нее организме,но при этом нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она ассоциирована в естественных условиях в указанном организме. Предпочтительно полипептид не представляет собой нативный полипептид. В этой связи понятие"нативный полипептид" относится к полному полипептиду, который находится в нативном для него окружении и который экспрессируется его нативной нуклеотидной последовательностью. Как правило, нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептиды, которые обладают конкретными свойствами, указанными в настоящем описании, получают с помощью методов рекомбинантной ДНК (т.е. на основе рекомбинантной ДНК). Однако в другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность может быть полностью или частично получена путем синтеза с использованием химических методов, которые хорошо известны в данной области (см. Молекулярная эволюция. После выделения кодирующей фермент нуклеотидной последовательности или после идентификации предполагаемой кодирующей фермент нуклеотидной последовательности может оказаться желательным модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например может оказаться желательным подвергнуть мутации последовательность с целью получения фермента, предлагаемого в настоящем изобретении. Мутации можно интродуцировать с использованием синтетических олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, которые фланкируют требуемые сайты мутации. Приемлемым является метод, описанный у Morinaga и др., Biotechnology, 2, 1984, c. 646-649. Другой метод интродукции мутаций в кодирующие фермент нуклеотидные последовательности описан уNelson и Long, Analytical Biochemistry, 180, 199, c. 147-151. Вместо описанного выше сайт-направленного мутагенеза можно произвольно интродуцировать мутации, например, с использованием поступающего в продажу набора, такого как набор для ПЦРмутагенеза GeneMorph фирмы Stratagene, или набор для произвольного диверсифицированного ПЦРмутагенеза (Diversify PCR random mutagenesis) фирмы Clontech. В ЕР 0583265 описаны методы оптимизации мутагеназа на основе ПЦР, которые можно объединять с применением мутагенных аналогов ДНК,которые описаны в ЕР 0866796. Для получения вариантов липид-ацилтрансфераз, обладающих предпочтительными характеристиками, можно применять методы ошибочно-направленной ПЦР (ПЦР пониженной точности). В WO 02/06457 описан метод молекулярной эволюции липаз. Третий метод, который можно применять для получения новых последовательностей, относится к получению фрагмента неидентичных нуклеотидных последовательностей либо с использованием любых из многочисленных рестриктаз, либо такого фермента как ДНКаза I, и повторной сборки полных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют функциональные белки. В альтернативном варианте можно применять одну или несколько неидентичных нуклеотидных последовательностей и интродуцировать мутации в процессе повторной сборки полноразмерной нуклеотидной последовательности. Для получения вариантов липид-ацилтрансфераз, обладающих предпочтительными характеристиками, можно применять методы перестановки ДНК и семейной перестановки. Приемлемые методы осуществления"перестановки" описаны в ЕР 0752008, ЕР 1138763, ЕР 1103606. Перестановку можно объединять также с другими формами мутагенеза ДНК, что описано в US 6180406 и WO 01/34835. Так, в нуклеотидную последовательность можно интродуцировать многочисленные мутации с помощью сайт-направленного или случайного мутагенеза либо in vivo, либо in vitro, и затем осуществлять скрининг различными методами в отношении улучшенной функциональной способности кодируемого полипептида. С использованием, например, основанных на компьютерном моделировании и на участии гена ехо методов рекомбинации (см. WO 00/58517, US 6344328, US 6361974), можно осуществлять молекулярную эволюцию, при использовании которой полученные варианты сохраняют очень низкий уровень гомологии с известными ферментами или белкам. Полученные таким образом варианты могут обладать значительной структурной гомологией с известными трансферазами, но обладать очень низкой гомологией на уровне аминокислотной последовательности. В качестве одного не ограничивающего объем изобретения примера мутации или встречающихся в естественных условиях вариантов полинуклеотидной последовательности можно дополнительно рекомбинировать либо с вариантами дикого типа или другими мутантными вариантами, либо с встречающимися в естественных условиях вариантами с получением новых вариантов. Указанные новые варианты можно также подвергать скринингу в отношении улучшенной функциональной способности кодируемого полипептида. Применение описанных выше и аналогичных методов молекулярной эволюции позволяет выявлять и отбирать варианты ферментов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют предпочтительные характеристики, без каких-либо предварительных данных о структуре или функции белка, и позволяют получать заранее не предсказанные, но ценные мутации или варианты. В данной области известны многочисленные примеры применения молекулярной эволюции для оптимизации или изменения ферментативной активности, такие примеры включают (но, не ограничиваясь только ими) один или несколько следующих вариантов: оптимизация экспрессии и/или активности в клетке-хозяине или in vitro,повышение ферментативной активности, изменение специфичности в отношении субстрата и/или продукта, повышение или понижение ферментативной или структурной стабильности, изменение ферментативной активности/специфичности в предпочтительных условиях окружающей среды, таких, например,как температура, значение рН, субстрат. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что с использованием инструментов молекулярной эволюции можно изменять фермент, улучшая функциональную способность фермента. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, которая кодирует липид-ацилтрансферазу,применяемую согласно изобретению, может кодировать вариант липид-ацилтрансферазы, т.е. липидацилтрансферазу, которая может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену, делецию или добавление по сравнению с родительским ферментом. Варианты ферментов сохраняют гомологию с родительским ферментом на уровне по меньшей мере 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 95, 97,99%. Приемлемыми родительскими ферментами могут являться любые из ферментов, обладающих эстеразной или липазной активностью. Предпочтительно родительский фермент выравнивают относительно консенсусной последовательности pfam00657. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент липид-ацилтрансфераза сохраняет или включает по меньшей мере один или несколько аминокислотных остатков консенсусной последовательности pfam00657, которые присутствуют в блоках GDSX, GANDY и НРТ. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, которая кодирует липид-ацилтрансферазу,предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении, может кодировать липид-ацилтрансферазу, которая может представлять собой вариант, обладающий повышенной ферментативной активностью в отношении полярных липидов, предпочтительно фосфолипидов и/или гликолипидов, по сравнению с родительским ферментом. Предпочтительно указанные варианты могут обладать также низкой активностью или не обладать активностью в отношении полярных лизолипидов. Вариант липид-ацилтрансфераз может обладать пониженной активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов по сравнению с родительским ферментом. Предпочтительно вариант фермента может не обладать активностью в отношении триглицеридов,и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов. В альтернативном варианте вариант фермента может обладать повышенной термостабильностью. Вариант фермента может обладать повышенной активностью в отношении одного или нескольких следующих соединений: полярные липиды, фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин, гликолипиды,дигалактозилмоноглицерид, моногалактозилмоноглицерид. Варианты липид-ацилтрансфераз являются известными, и один или несколько указанных вариантов можно применять в способе и вариантах применения, предлагаемых в настоящем изобретении, и/или в композициях ферментов, предлагаемых в настоящем изобретении. Можно применять согласно настоящему изобретению приведенные в качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, варианты липид-ацилтрансфераз, которые указаны в следующих ссылках: Hilton и Buckley J Biol. Chem., 266 (2), 15 января 1991 г., c. 997-1000; Robertson и др., J. Biol. Chem. 269(3), 21 января 1994 г., c. 2146-2150; Brumlik и др., J. Bacteriol, 178(7), апрель 1996 г., c. 2060-2064; Peelman и др., Protein Sci., 73(3), март 1998 г., c. 587-599. Аминокислотные последовательности. Настоящее изобретение относится также к применению аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидной последовательностью, которая кодирует липид-ацилтрансферазу, предназначенную для применения в одном из способов и/или вариантов применения, предлагаемых в настоящем изобретении. В контексте настоящего описания понятие "аминокислотная последовательность" является синонимом понятия "полипептид" и/или понятия "белок". В некоторых случаях понятие "аминокислотная последовательность" является синонимом понятия "пептид". Аминокислотную последовательность можно получать/выделять из приемлемого источника или ее можно создавать путем синтеза, или можно получать с помощью методов рекомбинантной ДНК. Предпочтительно аминокислотные последовательности можно получать из выделенных полипептидов, представленных в настоящем описании, с помощью стандартных методов. Один из приемлемых методов определения аминокислотных последовательностей из выделенных полипептидов заключается в следующем. Очищенный полипептид может представлять собой высушенный вымораживанием полипептид и 100 мкг высушенного вымораживанием продукта можно растворять в 50 мкл смеси, содержащей 8 М мочевину и 0,4 М бикарбонат аммония, рН 8,4. Растворенный белок можно денатурировать и восстанавливать в течение 15 мин при 50 С, затем помещать в атмосферу азота и добавлять 5 мкл 45 мМ дитиотреитола. После охлаждения до комнатной температуры можно добавлять 5 мкл 100 мМ йодацетамида для дериватизации остатков цистеина в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте в атмосфере азота. К указанной выше реакционной смеси можно добавлять 135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы LysC в 5 мкл воды и расщепление можно осуществлять при 37 С в атмосфере азота в течение 24 ч. Образовавшиеся пептиды можно разделять с помощью ЖХВР с обращенной фазой на колонке VYDAC C18 (0,4615 см; 10 мкм; фирма The Separation Group, шт. Калифорния, США), используя растворитель А: 0,1% ТФК в воде и растворитель Б: 0,1% ТФК в ацетонитриле. Отобранные пептиды можно повторно хроматографировать на колонке Develosil C18, используя такую же систему растворителей, перед осуществлением N-концевого секвенирования. Секвенирование можно осуществлять с помощью секвенатора Applied Biosystems 476A, используя быстрые циклы запускаемой жидкости согласно инструкциям производителя (фирма Applied Biosystems, Калифорния, США). Идентичность последовательностей или гомология последовательностей. В контексте настоящего описания понятие "гомолог" обозначает последовательность, обладающую определенной степенью гомологии с рассматриваемыми аминокислотными последовательностями и рассматриваемыми нуклеотидными последовательностями. В контексте настоящего описания понятие "гомология" может быть эквивалентно понятию "идентичность". Гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должна представлять собой последовательность полипептида и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность и/или повышает активность фермента. В контексте настоящего описания считается, что последовательность является гомологичной, если она включает аминокислотную последовательность, которая может быть идентичной по меньшей мере на 75, 85 или 90%, предпочтительно идентичной по меньшей мере на 95 или 98% рассматриваемой последовательности. Как правило, гомологи должны содержать те же самые активные сайты и т.д., что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию можно рассматривать также с позиций сходства (т.е. с позиций аминокислотных остатков, обладающих сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения гомология предпочтительно рассматривается с позиций идентичности последовательности. В контексте настоящего описания считается, что последовательность является гомологичной, если она включает нуклеотидную последовательность, которая может быть идентичной по меньшей мере на 75, 85 или 90%, предпочтительно идентичной по меньшей мере на 95 или 98% нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении (рассматриваемая последовательность). Как правило, гомологи должны содержать те же самые последовательности, которые кодируют активные сайты и т.д., что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию можно рассматривать также с позиций сходства (т.е. с позиций аминокислотных остатков, обладающих сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения гомология предпочтительно рассматривается с позиций идентичности последовательности. Гомологию можно оценивать на основе визуального сравнения или, что является более общепринятым, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Такие поступающие в продажу компьютерные программы позволяют рассчитывать % гомологии между двумя или большим количеством последовательностей. Процент гомологии можно рассчитывать для смежных последовательностей, т.е. когда одну последовательность выравнивают с другой последовательностью и проводят прямое сравнение каждой аминокислоты в одной последовательности с соответствующей аминокислотой в другой последовательности,каждый раз по одному остатку. Такое выравнивание называют выравниванием "без брешей". Как правило, такие выравнивания без брешей осуществляют только на небольшом количестве остатков. Хотя этот метод является простым и логичным, в нем не учитывается, например, то, что в случае пары идентичных в целом последовательностей одна вставка или делеция может приводить к тому, что последующие аминокислотные остатки должны быть исключены из выравнивания, что потенциально приводит к большому снижению % гомологии при осуществлении глобального выравнивания. Поэтому большинство методов сравнения последовательностей разрабатывают таким образом, чтобы достигать оптимальных выравниваний с учетом возможных вставок и делеций, не накладывая при этом чрезмерные штрафы, влияющие на общую балльную оценку гомологии. Это достигают путем встраивания "брешей" в выравниваемые последовательности с целью максимизации локальной гомологии. Однако в таких более сложных методах для каждой бреши, вводимой при осуществлении выравнивания, устанавливают "штрафы за брешь" таким образом, что для одного и того же количества идентичных аминокислот вариант выравнивания последовательностей с минимальным количеством брешей, что отражает более высокую степень родства между двумя сравниваемыми последовательностями, должен получить более высокий балл, чем вариант с большим количеством брешей. Как правило, используют"аффинные стоимости бреши", при этом устанавливают относительно высокую стоимость за наличие бреши и более низкий штраф за каждый последующий добавленный остаток в бреши. Такая система представляет собой наиболее широко применяемую систему балльной оценки брешей. Естественно, что высокие штрафы за брешь должны приводить к получению оптимизированных выравниваний с меньшим количеством брешей. В большинстве программ выравнивания предусмотрена возможность модификации штрафов за брешь. Однако при применении таких программ для сравнений последовательностей предпочтительно использовать задаваемые по умолчанию параметры. Таким образом, для расчета максимального % гомологии прежде всего требуется осуществить оптимальное выравнивание с учетом штрафов за брешь. Для осуществления такого выравнивания можно использовать такую компьютерную программу, как Vector NTI (фирма Invitrogen Corp.). Примерами других программ, с помощью которых можно осуществлять сравнение последовательностей являются (но,не ограничиваясь только ими) пакет программ BLAST (см. Ausubel и др., Short Protocols in Molecular Biology, 4-e изд., 1999, глава 18,) и FASTA (Altschul и др., J. Mol. Biol., 1990, c. 403-410). И BLAST иFASTA доступны для проведения поиска в автономном и в онлайновом режиме (см. Ausubel и др., 1999,с. с 7-58 по 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительно использовать программу VectorNTI. Для сравнения белковых и нуклеотидных последовательности можно применять также новый инструмент под названием BLAST 2 Sequences (см. FEMS Microbiol Lett, 174(2), 1999, c. 247-250; FEMS Microbiol Lett, 177(1), 1999, c. 187-188 и tatianancbi.nlm.nih.gov). Хотя конечный % гомологии можно определять с позиций идентичности, сам по себе процесс выравнивания, как правило, не основан на попарном сравнении по типу "все или ничего". Вместо этого обычно используют матрицу масштабных балльных оценок подобия, с помощью которой каждому парному сравнению приписывают баллы на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой матрицы может служить нашедшая широкое применение матрица BLOSUM62 - задаваемая по умолчанию матрица для пакета программ BLAST. В программах Vector NTI, как правило, используются либо общепринятые задаваемые по умолчанию величины, либо специально созданную таблицу сравнения символов, если она поставляется вместе с пакетом (более подробно см. руководство для пользователя). Для некоторых применений предпочтительно использовать задаваемые по умолчанию величины для пакета программ Vector NTI. В альтернативном варианте процент гомологии можно рассчитывать с помощью блока множественного выравнивания, входящего в пакет программ Vector NTI (фирма Invitrogen Corp.), основанного на алгоритме, аналогичном алгоритму, применяемому в CLUSTAL (Higgins DG и Sharp PM, Gene 73(1),1988, c. 237-244). После того, как с помощью программы произведено оптимальное выравнивание, можно рассчитать% гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Как правило, программа выполняет этот расчет в качестве определенного этапа процедуры сравнения последовательностей и выдает численный результат. В том случае, когда при определении идентичности последовательностей требуется вводить штрафы за брешь, то для попарного выравнивания предпочтительно используют следующие параметры: В одном из вариантов осуществления изобретения идентичность последовательностей для нуклеотидных последовательностей предпочтительно определяют с помощью CLUSTAL с использованием указанного выше набора штрафов за брешь и за удлинение бреши. Соответственно, применительно к нуклеотидной последовательности степень идентичности определяют на участке, включающем по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 смежных нуклеотидов. Соответственно, применительно к нуклеотидной последовательности степень идентичности можно определять по всей длине последовательности. В одном из вариантов осуществления изобретения степень идентичности аминокислотных последовательностей согласно настоящему изобретению можно определять соответственно с помощью известных в данной области компьютерных программ, таких как Vector NTI 10 (фирма Invitrogen Corp.). В качестве матрицы для осуществления попарного выравнивания предпочтительно используют BLOSUM62 со штрафом за открытие бреши, равным 10,0, и штрафом за удлинение бреши, равным 0,1. Соответственно, применительно к аминокислотной последовательности степень идентичности определяют на участке, включающем по меньшей мере 20 смежных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 30 смежных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 40 смежных аминокислот,предпочтительно по меньшей мере 50 смежных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 60 смежных аминокислот. Соответственно, применительно к аминокислотной последовательности степень идентичности можно определять по всей длине последовательности. Последовательности могут иметь также делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков,приводящие к молчащей мутации и к получению функционально эквивалентной субстанции. Преднамеренные аминокислотные замены можно осуществлять на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гиброфильности и/или амфипатической природы остатков, если при этом сохраняется вторичная связывающая способность субстанции. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные ами- 25021283 нокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие сходный уровень гидрофобности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин,аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Консервативные замены можно осуществлять, например, согласно представленной ниже таблице. Можно заменять друг на друга аминокислоты, находящиеся в одном и том же блоке во второй колонке и предпочтительно на одной и той же линии в третьей колонке: Под объем настоящего изобретения подпадает также гомологичная замена (понятия замена и замещение применяют в контексте настоящего описания для обозначения замены существующего аминокислотного остатка на другой остаток), которая может представлять собой замену типа подобного на подобное, такую, например, как основный остаток на основный, кислотный остаток на кислотный, полярный остаток на полярный и т.д. Может иметь место также негомологичная замена, т.е. замена остатка одного класса на другой или в альтернативной варианте предусматривающая включение невстречающихся в естественных условиях аминокислот, таких как орнитин (обозначен далее в контексте настоящего описания как Z), орнитиндиаминомасляная кислота (обозначена далее в контексте настоящего описания как В), норлейцинорнитин (обозначен далее в контексте настоящего описания как О), пиридилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин. Можно осуществлять также замены на невстречающиеся в естественных условиях аминокислоты. Варианты аминокислотных последовательностей могут включать приемлемые спейсерные группы,которые могут быть встроены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, в том числе алкильные группы, такие как метильные, этильные или пропильные группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или -аланина. Следующая форма вариации включает присутствие одного или нескольких аминокислотных остатков в пептоидной форме, что должно быть очевидно специалистам в данной области. Во избежание сомнений понятие "пептоидная форма" использовано для обозначения варианта аминокислотных остатков, в котором группа-заместитель углерода находится на атоме азота остатка, а не на -углероде. Методы получения пептидов в пептоидной форме известны в данной области, например, описаны у Simon R.J. и др., PNAS, 89(20),1992, c. 93679371 и Horwell D.C., Trends Biotechnol., 13(4), 1995, c. 132-134. Нуклеотидные последовательности, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению или кодирующие полипептид, который обладает конкретными свойствами, указанными в настоящем описании, могут включать синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известно несколько различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонатные и фосфортиоатные скелеты и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей к 3'- и/или 5'-концам молекулы. Для целей настоящего изобретения должно быть очевидно, что приведенные в настоящем описании нуклеотидные последовательности можно модифицировать любым методом, известным в данной области. Такие модификации можно осуществлять для того, чтобы повышать активностьin vivo или продолжительность жизни нуклеотидных последовательностей. Настоящее изобретение относится также к применению нуклеотидных последовательностей, комплементарных последовательностям, которые представлены в настоящем изобретения, или любые производные, фрагменты или их производные. Если последовательность комплементарна ее фрагменту, то такую последовательность можно применять в качестве зонда для идентификации сходных кодирующих последовательностей в других организмах и т.д. Полинуклеотиды, которые не гомологичны на 100% последовательностям, предлагаемым в настоящем изобретении, но подпадающие под объем настоящего изобретения, можно получать различными путями. Другие варианты последовательностей, представленных в настоящем описании, можно получать, например, путем зондирования библиотек ДНК, созданных из ДНК различных индивидуумов, например индивидуумов из различных популяций. Кроме того, можно получать другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, прежде всего клеточные гомологи, присутствующие в клетках млекопитающих (например, клетках крыс, мышей, быков и приматов), и такие гомологи и их фрагменты в целом должны обладать способностью к избирательной гибридизации с последовательностями, представленными в прилагаемом перечне последовательностей. Указанные последовательности можно получать путем зондирования библиотек кДНК, созданных из библиотек геномных ДНК, или библиотек геномных ДНК из других видов животных, и зондированием указанных библиотек зондами,которые содержат всю или часть любой из последовательностей, представленных в прилагаемом перечне последовательностей, в условиях от умеренной до высокой строгости. Аналогичные соображения применимы к получению видовых гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных по- 26021283 следовательностей, предлагаемых в изобретении. Варианты и гомологи из штаммов/видов можно получать также с использованием вырожденной ПЦР, в которой используют праймеры, созданные для последовательностей-мишеней, присутствующие в вариантах и гомологах, которые кодируют консервативные аминокислотные последовательности из числа последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении. Консервативные последовательности можно предсказывать, например, выравниванием аминокислотных последовательностей из нескольких вариантов/гомологов. Выравнивание последовательностей можно осуществлять с использованием компьютерных программ, известных в этой области. Например, широко используется программа GCG Wisconsin PileUp. Праймеры, которые применяют при осуществлении вырожденной ПЦР, должны содержать одно или несколько вырожденных положений и их следует использовать в более расслабленных условиях, чем условия, применяемые для клонирования последовательностей под контролем имеющих уникальную последовательность праймеров, применяемых для известных последовательностей. В альтернативном варианте указанные полинуклеотиды можно получать с помощью сайтнаправленного мутагенеза последовательностей с известными характеристиками. Это может быть ценным, когда, например, требуется осуществить изменения последовательности молчащих кодонов с целью оптимизации кодонов, предпочтительных для конкретной клетки-хозяина, в которой должна происходить экспрессия полинуклеотидных последовательностей. Другие изменения последовательности могут требоваться для интродукции сайтов распознавания рестриктазами, используемых для получения в результате рестрикции полипептида, или для изменения свойства или функции полипептидов, кодируемых полинуклеотидами. Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности), предлагаемые в изобретении, можно применять для получения праймера, например ПЦР-праймера, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного обнаруживаемой меткой общепринятыми средствами с использованием радиоактивных и нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды можно клонировать в векторах. Указанные праймеры, зонды и другие фрагменты могут состоять по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 20, например, по меньшей мере из 25, 30 или 40 нуклеотидов, и в контексте настоящего описания они подпадают также под понятие полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении. Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды в виде ДНК и ДНК-зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать рекомбинантно, с помощью синтеза или любыми методами, которые доступны специалистам в данной области. Их можно также клонировать стандартными методами. В целом, праймеры можно получать путем синтеза, включающего ступенчатое получение требуемой нуклеотидной последовательности, к которой каждый раз добавляют по одному нуклеотиду. Методики осуществления этого с использованием автоматизированных технологий хорошо известны в данной области. Более длинные полинуклеотиды, как правило, можно получать с помощью методов рекомбинации,например методов клонирования с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция). Это предусматривает создание пары праймеров (например, состоящий примерно из 15-30 нуклеотидов), фланкирующих область последовательности, мишенью которой являются липиды, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученной из клетки животного или человека, осуществление полимеразной цепной реакции в условиях, при которых происходит амплификация требуемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и получение амплифицированной ДНК. Можно создавать праймеры, которые содержат сайты, распознаваемые соответствующими рестриктазами, что позволяет клонировать ДНК в приемлемом клонирующем векторе. Гибридизация. Настоящее изобретение относится также к применению последовательностей, комплементарных последовательностям, предлагаемым в настоящем изобретении, или последовательностей, которые могут гибридизоваться или с последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении, или с последовательностями, которые комплементарны им. Понятие "гибридизация" в контексте настоящего описания относится к "процессу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты соединяют с комплементарной цепью посредством спаривания оснований", а также к процессу амплификации, который осуществляют с помощью методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Настоящее изобретение относится также к применению нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с последовательностями, которые комплементарны рассматриваемым в настоящем описании последовательностям, или любыми производными, фрагментами или их производными. Настоящее изобретение относится также к последовательностям, комплементарным последовательностям, которые могу гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании. Условия гибридизации определяются температурой плавления (Тпл) нуклеотидсвязывающего ком- 27021283 плекса, как описано у Berger и Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, т. 152, 1987, изд-во Academic Press, San Diego CA), и характеризуются определенной "строгостью (жесткостью)", что будет объяснено ниже. Максимально строгие условия, как правило, включают температуру, составляющую примерно Тпл-5C (на 5 С ниже Тпл зонда); строгие условия включают температуру примерно на 5-10 С ниже Тпл; условия средней жесткости включают температуру примерно на 10-20 С ниже Тпл; и условия пониженной жесткости включают температуру примерно на 20-25 С ниже Тпл. Как должно быть очевидно специалистам в данной области, максимально строгие условия гибридизации можно применять для идентификации или выявления идентичных нуклеотидных последовательностей, а гибридизацию в условиях средней жесткости (или пониженной жесткости) можно применять для идентификации или выявления сходных или родственных полинуклеотидных последовательностей. Предпочтительно настоящее изобретение относится к применению последовательностей, комплементарных последовательностям, которые могут гибридизоваться в строгих условиях или условиях средней жесткости с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептиды, обладающие конкретными, указанными в настоящем описании свойствами. Более предпочтительно настоящее изобретение относится к применению последовательностей,комплементарных последовательностям, которые могут гибридизоваться в строгих условиях (например,65 С и 0,1SSC 1SSC=0,15 М NaCl, 0,015 М Na-цитрат, рН 7,0) с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептиды, обладающие конкретными, указанными в настоящем описании свойствами. Настоящее изобретение относится также к применению нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании(включая последовательности, комплементарные последовательностям, указанным в настоящем описании). Настоящее изобретение относится также к применению нуклеотидных последовательностей, комплементарных последовательностям, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании (включая последовательности, комплементарные последовательностям, указанным в настоящем описании). Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение полинуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании, в условиях от средней до максимальной строгости. Предпочтительным объектом настоящего изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании, или с комплементарными им последовательностями, в строгих условиях (например, 50C и 0,2SSC). Более предпочтительным объектом настоящего изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, которые могут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, указанными в настоящем описании, или с комплементарными им последовательностями, в условиях повышенной строгости (например, 65 С и 0,1SSC). Экспрессия полипептидов. Нуклеотидную последовательность, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению или для кодирования полипептида, обладающего конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, можно встраивать в рекомбинантный, обладающий способностью к репликации вектор. Вектор можно применять для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме полипептида в совместимой с ней клетке-хозяине и/или из указанной клетки. Экспрессию можно регулировать с помощью контролирующих последовательностей, представляющих собой промоторы/энхансеры, и других регуляторных сигналов экспрессии. Можно применять промоторы, функционирующие в прокаритических организмах, и промоторы, функционирующие в эукариотических клетках. Можно применять тканеспецифические и специфические для стимулов промоторы. Можно применять также химерные промоторы, которые содержат элементы последовательностей из двух или большего количества различных описанных выше промоторов. Полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином в результате экспрессии нуклеотидной последовательности, может представлять собой секретируемый полипептид или может сохраняться внутри клетки в зависимости от применяемых последовательности и/или вектора. Кодирующие последовательности можно создавать с сигнальной последовательностью, которая обеспечивает секрецию субстанции, образовавшейся с помощью кодирующих последовательностей, через мембрану конкретных прокариотических или эукариотических клеток. Конструкции. Понятие "конструкция", являющееся синонимом таких понятий, как "конъюгат", "кассета" и "гибрид", относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, которая предназначена для применения со- 28021283 гласно настоящему изобретению, которая непосредственно или косвенно присоединена к промотору. Например, для обеспечения косвенного присоединения требуется наличие приемлемой спейсерной группы, такой как интронная последовательность, например, интрон Sh1 или интрон ADH, между промотором и нуклеотидной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении. Аналогичным образом согласно настоящему изобретению используют понятие "слитый", которое относится к непосредственному или косвенному присоединению. В некоторых случаях эти понятия не относятся к встречающейся в естественных условиях комбинации нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок,обычно ассоциированный с промотором гена дикого типа, и в случае, когда они оба находятся в естественной для них окружающей среде. Конструкция может содержать или экспрессировать маркер, который позволяет осуществлять селекцию генетической конструкции. Для некоторых вариантов применения конструкция предпочтительно содержит по меньшей мере нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, функционально связанную с промотором. Организм. Понятие "организм" в контексте настоящего описания включает любой организм, который может содержать нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, или нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными указанными в настоящем описании свойствами, и/или образовавшиеся из них продукты. Понятие "трансгенный организм" в контексте настоящего описания включает любой организм, который содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, и/или образовавшиеся из них продукты, и/или промотор, который может обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, внутри организма. Предпочтительно нуклеотидную последовательность встраивают в геном организма. Понятие "трансгенный организм" не относится к нативным нуклеотидным кодирующим последовательностям в естественной для них окружающей среде, когда они находятся под контролем нативного для них промотора, который находится также в естественной для него окружающей среде. Таким образом, к трансгенному организму, предлагаемому в настоящем изобретении, относится организм, который содержит любую одну (или их комбинацию) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами,конструкции, указанные в настоящем описании, векторы, указанные в настоящем описании, плазмиды,указанные в настоящем описании, клетки, указанные в настоящем описании, или их продукты. Например, трансгенный организм может содержать также нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий конкретными, указанными в настоящем описании свойствами, под контролем промотора, который не ассоциирован с последовательностью, кодирующей липид-ацилтрансферазу в естественных условиях. Трансформация клеток-/организмов-хозяев. Организм-хозяин может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. Примерами приемлемых прокариотических хозяев являются бактерии, такие как Е.coli и Bacillus licheniformis, предпочтительно В. licheniformis. Методики трансформации прокариотических хозяев подробно описаны в данной области (см., например, Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое изд. 1989, изд-во Cold Spring HarborLaboratory Press). При применении прокариотического хозяина перед трансформацией может требоваться модификация нуклеотидной последовательности - такая как удаление интронов. В другом варианте осуществления изобретения трансгенный организм может представлять собой дрожжи. Клетки нитчатых грибов (гифомицеты) можно трансформировать с использованием различных методов, известных в данной области, таких как метод, включающий образование протопласта и трансформацию протопластов с последующей регенерацией клеточной оболочки известным методом. Применение в качестве микроорганизма-хозяина Aspergillus описано в ЕР 0238023. Другим примером организма-хозяина может являться растение. Обзор общих методик, применяемых для трансформации растений, представлен в статьях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,42, 1991, c. 205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, март/апрель 1994 г., c. 17-27). Дополнительные данные о трансформации растений представлены в ЕР-А-0449375. Общие методики трансформации грибов, дрожжей и растений описаны в представленных ниже разделах. Трансформация грибов. Организм-хозяин может представлять собой гриб, такой как нитчатый гриб. Примерами приемлемых указанных хозяев являются любые представители, принадлежащие к роду Thermomyces, Acremo- 29