Димерные и/или олигомерные формы мутеина белка apoa-1 человека, полученные в семенах растений, и их применение

ДИМЕРНЫЕ И/ИЛИ ОЛИГОМЕРНЫЕ ФОРМЫ МУТЕИНА БЕЛКА ApoA-1 ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫЕ В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение включает в себя способ получения мутеинов белка АроА-1 человека в димерной и/или олигомерной формах (содержащих три или более единиц) в семенах растений, причем новые варианты этих белков имеют увеличенные стабильность и способность транспортировать холестерин в сравнении с природным белком АроА-1. Изобретение также относится к системе экспрессии указанного мутеина, трансформированным растениям, способным продуцировать указанный мутеин в семенах в димерной и/или олигомерной форме, и нутрицевтическим средствам, содержащим указанный мутеин. Область техники Данное изобретение включает в себя способ получения аполипопротеинов в димерной и/или олигомерной формах (содержащих три или более единиц) мутеинов белка АроА-1 в семенах растений, причем новые варианты этих белков имеют увеличенные стабильность и способность транспортировать холестерин в сравнении с природным белком АроА-1, системы экспрессии для этого получения, трансформированные растения, способные продуцировать указанные белки в семенах в димерных и/или олигомерных формах, и нутрицевтические производные этих растений. Уровень техники Жиры или липиды присутствуют в теле в больших количествах в формах холестерина, триглицеридов, фосфолипидов и жирных кислот. Липиды участвуют в образовании клеточных мембран, в желчных кислотах и некоторых гормонах, а также представляют важный запас энергии. Холестерин, как и другие жиры, является нерастворимым в воде и перемещается в крови в сферических частицах, называемых липопротеинами, которые состоят из некоторых белков, а также жиров. Многочисленные исследования популяций людей продемонстрировали, что повышенные уровни холестерина (гиперхолестеринемия) ассоциированы с высоким риском сердечно-сосудистого заболевания (инфаркта, стенокардии, инсульта),гиперхолестеринемия благоприятствует также развитию атеросклероза, характеризуемого присутствием бляшек, содержащих холестерин, которые могут блокировать артерии. Белковые компоненты липопротеинов человека (аполипопротеины) делают возможным перераспределение холестерина из стенок артерий в другие ткани, оказывающее благоприятные действия в предотвращении сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из главных причин болезни и смерти в промышленных странах. В развитии этих заболеваний участвуют несколько факторов, в том числе наследственное предрасположение, старение, курение, режим питания, гипертензия и гиперлипидемия, в частности гиперхолестеринемия. На общую концентрацию холестерина в крови влияют абсорбция холестерина в пищеварительном тракте, синтез холестерина из компонентов пищевого рациона и удаление холестерина из крови, вызываемое тканями, особенно печенью; и последующее превращение в желчные кислоты,стероидные гормоны и холестерин желчи. На поддержание концентрации холестерина крови влияют различные факторы, как генетические,так и факторы окружающей среды. Генетические факторы включают в себя концентрацию синтезирующих холестерин ферментов, концентрацию рецепторов для липопротеинов в печени, концентрацию ферментов, которые превращают холестерин в желчные кислоты, скорость синтеза и секреции липопротеинов и т.д. Факторы окружающей среды включают в себя состав пищевого рациона, курение, физическую активность и применение фармацевтических веществ. В вариантах пищевых рационов наиболее важными факторами являются концентрация и типы волокон, количество холестерина и количество и тип волокон. В определении возникновения сердечно-сосудистых заболеваний важным является отношение между холестерином LDL (липопротеином низкой плотности, который считают "плохим холестерином") иLDL, действительно, транспортируют холестерин из печени (где он продуцируется) в периферические ткани, в то время как липопротеины HDL транспортируют холестерин из периферических тканей в печень, где он затем элиминируется или рециркулируется. Аполипопротеин А-1 человека (SEQ ID No: 56) (АроА-1, номер доступа Х 00566) был объектом интенсивного исследования вследствие его антиатерогенных свойств. Этот белок обнаруживается тесно ассоциированным с фосфолипидом для образования комплексов и стимуляции выхода холестерина из богатых холестерином клеток. Поддержание адекватного уровня АроА-1 в плазме крови для смягчения или для предотвращения симптомов атеросклероза не является простым. Подтвержденная обратная корреляция между повышенным уровнем холестерина HDL в крови и сердечно-сосудистыми заболеваниями приписывается роли, которую этот HDL и его главный компонент,белок АроА-1, играют в обратном (инвертированном) транспорте холестерина (RST). ЭффективностьRST зависит от способности белка АроА-1 стимулировать выход холестерина из клеток, связывание липидов, активацию лецитин-холестерол-ацетилтрансферазы (LCAT) и образование зрелого HDL, который взаимодействует со специфическими рецепторами и переносит белки, которые элиминируют холестерин посредством плазматического протекания через печень. Было показано, что инфузии белков, таких как АроА-1 или АроЕ, как рекомбинантных, так и экстрагированных, определяют уменьшение атеросклеротической нагрузки в экспериментальных животных. Более недавние исследования (Nissen et al. 2003. Effect of recombinant Apo A-l Milano on coronaryAtherosclerosis in patients with acute coronary syndromes. JAMA 290:2292-2300) показывают, что "HDLтерапия" с использованием инфузий препарата (ЕТС-216: синтетического комплекса фосфолипидовHDL) ApoA-1 Milano, спонтанного варианта с увеличенной липидсвязывающей способностью, в его димерной форме, значимо уменьшает коронарные атеросклеротические бляшки. Вариант ApoA-1 Milano способен образовывать димеры, которые собираются, для образованияHDL-частиц, с той же самой эффективностью, что и ApoA-1 (Calabresi et al. 1997. Biochemistry 36:12428-1 021282 33). Однако димеры ApoA-1 Milano, которые стимулируют выход холестерина более эффективным образом, чем HDL-содержащий АроА-1, являются менее реакционноспособными в качестве субстрата для фермента LCAT, элиминируются из круговорота при более низкой скорости и способны ингибировать этерификацию холестерина (Sirtori et al. 1999. Atherosclerosis 142:29-40). Белок ApoA-1 также ассоциируется и в норме образует умеренные количества димеров, тримеров и квадримеров, которые продуцируют частицы HDL в вариабельных размерах. Присутствие остатка цистеина в положении 173 (ApoA-1 Milano) позволяет образование димеров вследствие образования дисульфидных связей, которые определяют увеличение стабильности белка(Franceschini et al. 1990. J. Biol. Chem. 265:12224-12231) и более высокое взаимодействие с липидами и с ферментом LCAT, увеличивая посредством этого терапевтическое действие этого белка (Chiesa et al. 2002. Circ. Res. 90:974-980). Хотя терапевтические действия аполипопротеинов были доказаны, имеются многочисленные трудности в получении фармацевтических средств, которые их содержат. Эти проблемы могут влиять на тип фармацевтического средства и фактическую применимую дозу. Одной из таких проблем является то, что получение рекомбинантных аполипопротеинов является чрезвычайно дорогостоящим. Получение димеров аполипопротеинов, которые являются более эффективными с терапевтической точки зрения, достигается в данной области либо очисткой этих димеров из плазмы со всеми присущими этому риском и проблемами, которые включает в себя очистка крови человека, либо очисткой мономеров из Е.coli, как описано в патенте США 6617134, и последующей их димеризацией, которая является продолжительной,дорогостоящей процедурой, которая не исключает риска, как объясняется ниже. В целом, существующие гетерологичные системы получения для аполипопротеинов являются не только чрезвычайно дорогими,но, действительно, не позволяют даже использовать прямой синтез димерной формы этого белка, который, как упоминалось ранее, является более эффективным, чем мономер. Этот димер синтезируют из очищенных мономеров. Эта проблема отражается с практической точки зрения в том факте, что единственными применимыми фармацевтическими средствами являются средства, которые позволяют применять ограниченное количество дозы и вводятся инфузией. Причина, по которой пока могут использоваться только вводимые инфузией фармацевтические средства, связана со стоимостью получения, и, следовательно, выбор введения инфузией обусловлен тем фактом, что необходимо максимизировать, с теми же самыми расходами производства, концентрацию продукта в кровотоке. Было показано, что введение аполипопротеина инфузией является очень эффективным (Nissan et al. 2003. JAMA 290:2292-2300), но такие протоколы терапии трудно применять на протяжении продолжительных периодов времени по причинам, указанным выше. Пероральное введение потребовало бы количеств этого белка, которые не являются экономичными и осуществимыми с существующими способами получения АроА-1. Однако этот тип введения является, по-видимому, вдвойне интересным, так как показано, что присутствие и связывание аполипопротеинов на краю мембран каемчатых клеток ингибирует опосредованное белком поглощение свободного и эстерифицированного холестерина (Boffelli et al. 1997.FEBS Letters 411:7-11). Одной возможной альтернативой, предлагаемой существующим уровнем техники, является пероральное введение синтетических пептидов, которые имитируют активность целого белка (патент США 6933279), однако в данной области было продемонстрировано, что целый белок имеет большее действие, чем синтезированные пептиды. Таким образом, терапевтическое применение аполипопротеинов ограничено отсутствием получения этого белка в достаточном количестве и в форме, пригодной для введения. В частности, было показано, что получение АроА-1 рекомбинантными способами является очень трудным вследствие его амфифильного характера, из-за его аутоагрегации и деградации (Schmidt, H.H. et al. 1997, Protein Expr. Purif. 10:226-236). В настоящее время АроА-1 человека был экспрессирован наряду с Е.coli в трех эукариотических системах: трансформированных бакуловирусом клетках Spodoptera frugiperda, стабильно трансформированных клетках яичника китайского хомячка (СНО) и в дрожжах Pichia pastoris. Первые две системы требуют продолжительного процесса скрининга для получения и поддержания клеточных линий, тогда как получение в Pichia приводит к секреции измененного белка с меньшей молекулярной массой. Хотя патент США 20050172359 заявляет получение аполипопротеинов в растениях и в семенах в общем виде, он описывает способ получения указанных белков, в котором продуцирование в семенах происходит в основном в масляных тельцах и в мономерной форме, как описано в основной части этих примеров. Описанный способ получения предполагает, следовательно, что полученный мономерный белок очищают из масляных телец семян, где он накапливался специфическим образом, для получения его в чистом виде. Однако с учетом признаков указанного белка, его очистка из масляных телец может быть трудной и неэффективной. Хотя получение в бактериальных системах представляет интерес вследствие их способности продуцировать высокие количества рекомбинантных белков, согласно сообщениям в данной области, оно представляет проблемы, заключающиеся в присутствии нежелательных сигналов аффинности для целей очистки. Известно также, что эндотоксины Е.coli образуют прочные комплексы с аполипопротеинами. Элиминирование этих токсинов для фармацевтических продуктов является важным и технически возможным, но требует сложных и дорогостоящих способов (патент США 6506879), не исключающих полностью риска связывания с указанными эндотоксинами. Таким образом, система получения при низкой стоимости в экспрессионных системах, неопасных для людей, которая легко продуцирует эти белки в димерной и мультимерной формах (с учетом преимуществ этих форм, перечисленных выше), могла бы позволить получение указанных белков в более эффективной терапевтической форме для увеличения дозы очищенного продукта, вводимого классическим образом, посредством инфузии, или для проведения других терапевтических подходов, направленных на увеличение уровня холестерина HDL в плазме, например посредством перорального введения аполипопротеинов, также введенных в пищевой матрикс и в конечном счете защищенных от деградации в пищеварительном тракте. Сущность изобретения Генерирование рекомбинантных растений, содержащих представляющий интерес гетерологичный ген, и их применение в процедурах получения в промышленном масштабе преодолевает ряд трудностей,которые характеризуют существующие системы получения, в частности системы на основе культур клеток. Технология рекомбинантных ДНК позволила генерировать трансгенные клетки, которые могут быть использованы для получения представляющих интерес гетерологичных белков. В частности, культуры клеток животных, в частности млекопитающих, позволяют получать представляющие интерес белки, но связанная с ними процедура является чрезвычайно дорогой, и получение достаточных количеств для фармацевтического применения может быть настолько неэкономичной, чтобы, следовательно, ограничивать, как это имеет место в настоящее время, возможные типы введения. Решение этой проблемы искали в трансформации сложных эукариотических систем для гарантии получения активных белков экономичными процедурами. Растения, в частности, имеют необходимый потенциал и способность функционировать в качестве биореакторов для продуцирования белков экономичным образом, и с высоким выходом, как было научно продемонстрировано много раз, среди прочих, авторами этого патента. Накапливание терапевтического белка в годной в пищу части растения позволяет прямое введение этого продукта, что заметно снижает стоимость терапии и позволяет использование более высоких доз этого белка. Присутствие аполипопротеинов в пищевом рационе также облегчает взаимодействие их с холестерином, присутствующим в пище, уменьшая таким образом абсорбцию холестерина. В данном изобретении было неожиданно обнаружено, что при управлении экспрессией аполипопротеинов, способных образовывать димеры или мультимеры в семеноспецифических тканях с использованием подходящих промоторов, и конструировании подходящих векторов, указанные аполипопротеины экспрессируются в семенах в высоких количествах, равных 0,5% или больших чем 0,5% запасных белков семян, и преимущественно в димерной или олигомерной форме (85%). В известном уровне техники получение димерной формы АроА-1 Milano (SEQ ID No: 2) в листьях или семенах растений никогда не демонстрировались. В данном изобретении было также обнаружено, что введение мутаций в специфические сайты аполипопротеина А-1 человека позволяет получить молекулы, способные образовывать димеры, олигомеры или даже полимеры. Неожиданно было обнаружено, что полученные мутеины могли быть даже лучшими, чем мутеин АроА-1 Milano, с терапевтической точки зрения, так как некоторые мутации, которые продуцировали белки, способные димеризоваться или даже олигомеризоваться, придают этим олигомерам или димерам выгодные характеристики, также в сравнении с аполипопротеином А-1 Milano, который является уже терапевтически более ценным в сравнении с природной формой аполипопротеина А-1. Указанные мутеины обнаруживают способность обратного транспорта холестерина и полупериод существования в сыворотке, сходные или даже более высокие, относительно этих параметров димера АроА-1Milano. Таким образом, были отобраны мутеины белка АроА-1 человека, способные образовывать димеры или олигомеры, обнаруживающие способность обратного транспорта холестерина и полупериод существования в сыворотке, сравнимые или даже более высокие, чем эти параметры мутеина АроА-1 Milano в его димерной форме. Мутеины этого изобретения включают в себя новые мутеины аполипопротеина АроА-1 человека,способные образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности,равные или более высокие, чем 10, или 30, или 50, или 100, или 200% активностей аполипопротеина АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano. Таким образом, объектами данного изобретения являются семеноспецифические экспрессионные кассеты для экспрессии мутеинов аполипопротеина А-1 человека, способных образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем 10, или 30, или 50, или 100, или 200% активностей, обнаруживаемых аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano,причем указанные кассеты содержат в направлении от 5' к 3' семеноспецифический промотор, сигнальную последовательность растения для направления указанного белка, через эндоплазматический ретикулум в запасающие ткани семян, последовательность, кодирующую один из указанного мутеина аполипопротеина человека и сигнал полиаденилирования; векторы для экспрессии in planta, содержащие указанную экспрессионную кассету; растение и клетки растений, генетически трансформированные указанными векторами, способ получения указанного растения трансформацией клеток растения указанными векторами и регенерированием растений из указанных трансформированных клеток, семена, продуцируемые указанным растением, способ получения указанных семян, способ очистки димерного белка из указанных семян, нутрицевтики и/или пищевые продукты, содержащие указанные димеры или мультимеры, применение указанных семян для очистки белков для применения в качестве лекарственного средства для инфузий или для приготовления нутрицевтиков и/или пищевого продукта, содержащих указанные димеры и мультимеры, и применение указанных семян в качестве средства хранения и консервирования аполипопротеинов в димерной или мультимерной формах. Описание фигур Фиг. 1 показывает карту плазмиды pGEM-APO, полученной инсертированием последовательностиSEQ ID No: 1, обратно-транскрибированной из мРНК, очищенной из печени человека и амплифицированной с использованием прямого праймера PLT1002 (5'-GGATCCGATGAACCCCCCCAGAGCC-3') и обратного праймера PLT1003 (5'-GATATCTCACTGGGTGTTGAGCTTGTAG-3'). Фиг. 2 показывает карту плазмиды pPLT501, полученной клонированием в вектор pPLT500 мутеина 1 белка АроА-1, соответствующего АроА-1 Milano. Фиг. 3 показывает карту плазмиды pPLT502, полученной клонированием в вектор pPLT500 мутеина 2 белка АроА-1. Фиг. 4 показывает карту плазмиды pPLT502, полученной клонированием в вектор pPLT503 мутеина 3. Фиг. 5 показывает карту плазмиды pPLT504, полученной клонированием в вектор pPLT500 мутеина 4 белка АроА-1. Фиг. 6 показывает карту плазмиды pPLT505, полученной клонированием в вектор pPLT500 мутеина 5 белка АроА-1. Фиг. 7 показывает карту плазмиды pPLT601, полученной клонированием в вектор pPLT600 мутеина 1 белка АроА-1. Фиг. 8 показывает карту плазмиды pPLT602, полученной клонированием в вектор pPLT600 мутеина 2 белка АроА-1. Фиг. 9 показывает карту плазмиды pPLT603, полученной клонированием в вектор pPLT600 мутеина 3 белка АроА-1. Фиг. 10 показывает карту плазмиды pPLT604, полученной клонированием в вектор pPLT600 мутеина 4 белка АроА-1. Фиг. 11 показывает карту плазмиды pPLT605, полученной клонированием в вектор pPLT600 мутеина 5 белка АроА-1. Фиг. 12 показывает карту плазмиды pPLT701, полученной клонированием в вектор pPLT700 мутеина 1 белка АроА-1. Фиг. 13 показывает карту плазмиды pPLT702, полученной клонированием в вектор pPLT700 мутеина 2 белка АроА-1. Фиг. 14 показывает карту плазмиды pPLT703, полученной клонированием в вектор pPLT700 мутеина 3 белка АроА-1. Фиг. 15 показывает карту плазмиды pPLT704, полученной клонированием в вектор pPLT700 мутеина 4 белка АроА-1. Фиг. 16 показывает карту плазмиды pPLT705, полученной клонированием в вектор pPLT700 мутеина 5 белка АроА-1. Фиг. 17 показывает результат молекулярного теста, использующего ПЦР-способ с использованием праймеров PLT1002 и PLT1003 и в качестве матрицы ДНК, экстрагированной из листьев растений Т 0,-4 021282 для подтверждения присутствия гена мутеина АроА-1. М: молекулярный маркер; 1-12: различные линии трансгенных растений, трансформированных плазмидами из фиг. 2-16; С-: отрицательный контроль, использующий сорт риса Ariete; C+: положительный контроль, плазмида pGEM-APO. Амплифицированная полоса положительных растений (1-9 и 11-12) соответствует ожидаемым размерам 732 п.н. Фиг. 18 показывает результат молекулярного теста, использующего способ Саузерна на растениях Т 0, для подтверждения количества копий гена мутеинов АроА-1, присутствующих в различных трансгенных линиях. Растения, которые имеют единственную копию этого гена, узнаются по присутствию единственной полосы (например, растения с номерами 35.1-6 и 22.1). Фиг. 19 показывает результат молекулярного теста, использующего способ Саузерна на растениях Т 0, для подтверждения количества копий гена мутеинов АроА-1, присутствующих в различных трансгенных линиях, в дополнение к результату, полученному на фиг. 18. Растения, которые имеют единственную копию этого гена, узнаются по присутствию единственной полосы (например, растения с номерами 12.5, 12.6, 12.9 и 22.2). Фиг. 20 показывает результат Вестерн-анализа на общих белках, экстрагированных из семян риса, с использованием буфера, содержащего бета-меркаптоэтанол, после электрофореза в ДСН-РААГ, электроблоттинга и использования в качестве первичного антитела анти-АроА-1, полученного из козы (R1029P,Acris Antibodies, Germany), и в качестве вторичного антитела анти-IgG козы, конъюгированного с пероксидазой (Sigma), и детектирования с использованием набора ECL (Amersham). +: белки из сыворотки человека; WT: белки из риса дикого типа; 38, 23, 35, 19, 4: различные трансгенные линии риса, трансформированного одной из этих плазмид из ряда pPLT500, pPLT600 или pPLT700. Нижняя полоса в положительном контроле (+) соответствует мономеру АроА-1 приблизительно 28000 Да. Фиг. 21 показывает результат Вестерн-анализа на общем белке, экстрагированном из семян риса, с использованием буфера без восстанавливающего агента (бета-меркаптоэтанола), после электрофореза в ДСН-РААГ, электроблоттинга и затем использования в качестве первичного антитела анти-АроА-1, полученного из козы, и в качестве вторичного антитела анти-IgG козы, конъюгированного с пероксидазой,с анализом с использованием набора ECL. +: белки из сыворотки человека, из субъекта без мутаций гена АроА-1; -: белки из риса дикого типа; 12, 18, 19, 22, 35: различные трансгенные линии риса, трансформированные одной из плазмид из ряда pPLT500, pPLT600 или pPLT700. Нижняя полоса в положительном контроле (+) соответствует мономеру АроА-1 приблизительно 28000 Да, тогда как верхняя полоса,присутствующая в некоторых из линий риса, соответствует димеру приблизительно 56000 Да. Фиг. 22 показывает результат Вестерн-анализа на общем белке, экстрагированном из семян риса и сыворотки человека, с использованием буфера без восстанавливающего агента (бета-меркаптоэтанола),после электрофореза в ДСН-РААГ, электроблоттинга и использования в качестве первичного антитела анти-АроА-1, полученного из козы, и в качестве вторичного антитела анти-IgG козы, конъюгированного с пероксидазой, с анализом с использованием набора ECL. 1: белки из сыворотки человека, из субъекта с мутацией гена АроА-1 Milano; 2: белки из сыворотки человека из субъекта без мутации гена АроА-1; 3-7: некоторые линии трансгенного риса, трансформированные одной из плазмид серии pPLT500; 8: белки из риса дикого типа. Нижняя полоса в положительном контроле п.2 соответствует мономеру АроА-1 приблизительно 28000 Да, тогда как средняя полоса в контроле п.1 соответствует димеру приблизительно 56000 Да. Трансгенные линии риса 3, 6 и 7 содержат белок АроА-1 Milano первично в димерной форме. Фиг. 23 показывает результаты Вестерн-блоттинга, использующего общие белки, экстрагированные из рисового молока, полученного с использованием процедуры из примера 7, где 1: проба белков, экстрагированных при времени 0; 2: проба белков, экстрагированных при времени 1; 3: проба белков, экстрагированных при времени 2; 4: проба белков, экстрагированных при времени 3; 5: проба белков, экстрагированных при времени 4; 6: проба белков, экстрагированных при времени 5; 7: проба белков, экстрагированных при времени 6; 8: проба белков, экстрагированных при времени 7; 9: проба белков, экстрагированных при времени 8; 10: проба белков, экстрагированных при времени 9. Наблюдаемая полоса, полученная по способу, описанному на фиг. 21, соответствует белку АроА-1 Milano в димерной форме. Подробное описание изобретения Таким образом, данное изобретение относится к экспрессионным кассетам, способным управлять в семенах растений синтезом гетерологичных аполипопротеинов, причем указанные аполипопротеины накапливаются главным образом в димерной и/или мультимерной формах. Эта экспрессионная кассета согласно данному изобретению содержит промотор гена растения, специфический в отношении экспрессии в запасающих органах в семенах. Подходящим промотором, для проведения данного изобретения, является промотор проламина риса, pPROL (номер доступа AF156714),описанный в патенте PCT/ITB2003/05092, или промотор глутелина риса pGluB-1 (номер доступаAY427569), или pGluB-4 (номер доступа AY427571), описанные в Quing и Takawa 2004, Plant Biotech. J. 2:113-115, для экспрессии в злаках, или промотор основного глобулина 7S сои или промотор конглицинина сои, описанные в патенте WO 00/04146, для экспрессии в растениях, принадлежащих к семействам бобовых и пасленовых (Solanaceae). Промоторы глутелина, описанные выше, являются особенно предпочтительными для экспрессии во всех этих семенах, таких как семена риса, ячменя, спельты (пшеницы) и т.д., которые подвергаются промышленному вылущиванию семян, так как они управляют экспрессией белка диффузным образом во всем эндосперме семени. Таким образом, процедуры вылущивания и последующего отбеливания (шлифования) семян, которые элиминируют алейроновую часть и часть наружного эндосперма, не приводят в значимой потере рекомбинантного белка, экспрессируемого в этих семенах. Кроме того, накопление в эндосперме семян, вследствие использования указанных промоторов,определяет упрощенную процедуру очистки этого белка, так как с использованием процедуры отбеливания несколько белковых загрязнителей, которые находятся в семенах, элиминируются. Экспрессионная кассета согласно данному изобретению также содержит ДНК-последовательность,кодирующую сигнальную последовательность белка растения, которая направляет представляющий интерес белок в запасающие органы семени и гарантирует, как следствие прохождения белка через эндоплазматический ретикулум и вследствие окислительных (окислительно-восстановительных) условий этого компартмента вместе с присутствием фермента дисульфидизомеразы, накопление этого белка в димерной, мультимерной или высшей олигомерной форме, в зависимости от количества цистеинов, присутствующих в мутированном белке. Сигнальной последовательностью, подходящей для проведения данного изобретения, является сигнальная последовательность гена проламина риса (номер доступа AF156714) или генов глутелина из риса(номер доступа AY427569 или AY427571) или генов глобулина и бета-конглицинина сои (патент WO 00/04146). Экспрессионная кассета согласно данному изобретению также содержит ДНК-последовательность,кодирующую ген аполипопротеина А-1, способного образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем 10, или 30, или 50, или 100, или 200% активностей, обнаруживаемых аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano. Для проведения этого изобретения кассета этого изобретения может содержать, например, последовательность, выбранную из группы последовательностей, кодирующих мутеины, имеющие SEQ ID No: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38. Вышеуказанные мутеины удовлетворяют этим характеристикам и пригодны для проведения этого изобретения. Указанные мутеины могут быть получены с использованием всех стандартных способов, известных квалифицированным в данной области специалистам. Согласно данному изобретению можно проводить замену аминокислот в определенных положениях сайт-направленным мутагенезом. Примерами мутеинов, подходящих для проведения этого изобретения, являются сообщенные выше мутеины, однако это изобретение не ограничивается ими и включает в себя также другие мутеины аполипопротеина А-1 человека, не приведенные в примерах, которые, однако, удовлетворяют селективным параметрам, указанным в данном описании. Функциональная эквивалентность или превосходство димеров и/или олигомеров, экспрессируемых в семенах растений данного изобретения, в сравнении с АроА-1 Milano, могут быть подходящим образом измерены тестом связывания с липидами или в лабораторных животных. Способность этого димера и/или олигомера улучшать обратный транспорт холестерина в млекопитающем может быть измерена для подтверждения способности связывания липидов, тогда как полупериод существования в плазме может быть измерен в тест-животных, таких как кролик или мышь. Согласно данному изобретению эти свойства могут быть измерены с использованием следующих тестов: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano. Что касается измерения по пункту а'), т.е. проверки величин-показателей способности обратного транспорта холестерина, они могут оцениваться посредством расчета кинетики ассоциации олигомера этого изобретения с димиристоилфосфатидилхолином (DMPC) (Bergeron J. et al. 1997. Biochem. Biophys.Acta 1344:139). DMPC ресуспендируют в 100 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0 и 0,25 мМ ЭДТА при температуре, превышающей его температуру фазового перехода, при концентрации 0,5 мг/мл. Димер или олигомер этого изобретения, буфер, содержащий 2 мМ 5'-5' дитиобиснитробезоат (NbS), и эту суспензиюDMPC 0,4 мг/мл и концентрации белка 5,2 мМ. Уменьшение мутности этой смеси (оптической плотности), которое отражает увеличение ассоциации липид-белок, прослеживают, измеряя оптическую плотность при 325 нм. Тот же самый тест выполняют параллельно с равной молярностью димера АроА-1 Milano. В качестве контроля те же самые тесты повторяют с использованием восстанавливающего буфера,содержащего 20 мМ 2-меркаптоэтанол или 10 мМ дитиотреитол (ДТТ). Что касается измерения по пункту b'), т.е. проверки величин-показателей полупериода существования в плазме указанного мутеина, они могут оцениваться в лабораторных животных, например, в мыши. В одном варианте осуществления этот тест состоит из инъекции 1 мг представляющего интерес очищенного мутеина, солюбилизированного в 2 мл 1 ЗФР-буфера, рН 7,4, содержащего дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) при 8 мг/мл. Пробы крови, взятые после инъекции (время 0), после 6 ч (время 1),после 12 ч (время 2), после 24 ч (время 3), после 48 ч (время 4) и после 72 ч (время 5), оценивали на концентрацию в плазме этого мутеина при помощи количественного ELISA, с использованием, например,набора, разработанного фирмой, специализированной в отношении систем ELISA (InCura). Этот способ использует конкурентный метод ELISA с поликлональным антителом, полученным в кролике и специфическим в отношении АроА-1 человека, и следующий протокол является классическим протоколом, используемым для этого типа ELISA. Калибровочную кривую, для расчета концентрации антигена в плазме, строят с использованием очищенного димера АроА-1 Milano в концентрациях 0, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мг/мл. В данном изобретении три или более мономеров обозначают триммеры, тетрамеры, пентамеры,гексамеры и до сложных олигомеров или полимеров. Возможность образования димеров обусловлена мутациями, которые приводят к присутствию по меньшей мере одного цистеина (1 С) в цепи мутеина аполипопротеина АроА-1. Присутствие одного цистеина позволяет образование дисульфидного мостика и, следовательно, димеризацию этой молекулы даже в другой точке, чем это имеет место в АроА-1 Milano. Возможность образования тримеров обусловлена мутациями, которые определяют присутствие по меньшей мере двух цистеинов (2 С) в цепи мутеина аполипопротеина АроА-1. Для образования тримеров будет необходимо объединение молекул 1 С и 2 С в адекватном стехиометрическом соотношении. Например, в случае присутствия двух цистеинов на мономер можно будет иметь различные комбинации,позволяющие образование олигомеров, начинающихся от тетрамеров и достигающих образования полимеров. Основным условием для проведения этого изобретения является то, что эти мутеины отбирают а) на их способность образовывать по меньшей мере димеры, b) по факту, что димеры и олигомеры, образованные из мутеинов этого изобретения, сохраняют вышеуказанные фундаментальные свойства димерного аполипопротеина А-1 Milano. Олигомеры этого изобретения должны иметь способность обратного транспорта холестерина, сравнимую или более высокую в сравнении с этой способностью мутеина АроА-1 Milano в его димерной форме. Способность обратного транспорта холестерина, сравнимая или более высокая относительно этой способности одного из мутеинов АроА-1 Milano в его димерной форме,означает способность связывания липидов, равную или более высокую, чем 10, или 30, или 50, или 100,или 200% способности димера АроА-1 Milano в тех же самых условиях теста; очевидно, что в это изобретение включены все промежуточные величины между указанными выше, а не только точные вышеупомянутые величины. Полупериоды существования в плазме, сравнимые или более высокие, чем полупериод существования в плазме мутеина АроА-1 Milano в его димерной форме, означает, что полупериод существования в плазме олигомеров этого изобретения является по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза или даже в 10 раз или более высоким в сравнении с димером АроА-1 Milano в тех же самых условиях теста. Оба параметра, выбранные в данном изобретении, являются важными; действительно, в данном изобретении наблюдали, что даже в случае, в котором способность связывания липидов молекул этого изобретения является немного превышающей эту способность АроА-1 Milano, клинический эффект может быть превосходящим вследствие увеличенного полупериода существования в плазме. Таким образом, для цели этого изобретения, наряду с описанными мутеинами, другие мутеины АроА-1 могут быть использованы, при условии, что они, как уже было сказано, сохраняют вышеупомянутые свойства, и их экспрессия в форме димера и/или олигомера является более высокой или равной 85% экспрессированного мутеина Аро, предпочтительно равной или более высокой чем 90%, даже более предпочтительно равной или более высокой чем 95%. Для цели данного изобретения любая дегенерация генетического кода, приводящая к экспрессии кодируемых белков в SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 38, включена в данное изобретение. Мутации, такие как нуклеотидные или аминокислотные замены, в которых эта замена является консервативной, т.е. при замене аминокислотного остатка другой химически сходной аминокислотой, также включены в это изобретение. Неограничивающими примерами этих консервативных аминокислотных замен (известных квалифицированному в данной области специалисту) являются замена гидрофобного остатка (изолейцина, лейцина, валина или метионина) другим гидрофобным остатком, замена полярного остатка другим полярным остатком, имеющим тот же самый заряд (например,аргинина лизином; глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой) и т.д. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти мутеины, имеющие SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 38, могут быть расшифрованы непосредственно из указан-7 021282 ных аминокислотных последовательностей. При соответствии каждого кодона конкретному аминокислотному остатку, достаточно иметь аминокислотную последовательность для перехода обратно к любой нуклеотидной последовательности, кодирующей ее. Таким образом, нуклеотидные последовательности данного изобретения считаются описанными посредством описания аминокислотной последовательности, кодируемой ими. Несомненно, аминокислотная последовательность per se дает всю необходимую информацию для знания любой кодирующей ее нуклеотидной последовательности. Во всяком случае в качестве примера в данном изобретении дается нуклеотидная последовательность для каждой аминокислотной последовательности, т.е. SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 и 37, кодирующая соответственно SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 38. Например, в SEQ ID No: 1 первый кодон, gat, кодирующий аминокислоту Asp, может быть явно заменен кодоном gac, второй кодон, gaa, кодирующий аминокислоту Glu, может быть заменен кодономgag, и т.д., так как любой генетик может делать соответствующее заключение из простого считывания генетического кода, доступного во всех руководствах по генетике. Таким образом, описанные здесь нуклеотидные последовательности представляют одну из многих возможных последовательностей, кодирующих мутеины этого изобретения. Согласно этому изобретению, ген для АроА-1 и его мутеинов может быть получен с использованием всех из известных процедур или процедур, известных квалифицированным в данной области специалистам. Одна применимая процедура для проведения этого изобретения включает в себя клонирование гена аполипопротеина АроА-1 в виде кДНК из ткани человека (например, из печени человека) с последующими модификациями через сайт-направленный мутагенез. Для получения мутеинов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 38, этот мутагенез может проводиться в плазмиде, например, pGEM-APO (фиг. 1), в соответствии с указаниями, сообщенными в наборе QuikChangePLT1005 для мутеина 1 (SEQ ID No: 2),соответствующего конструкции самопроизвольной мутации Milano, например плазмиды pGEM-APO-M 1; PLT1006 и PLT1007(SEQ ID No: 38) с получением, например, плазмиды pGEM-APO-М 19. Наконец, экспрессионная кассета данного изобретения содержит сигнал полиаденилирования, который может происходить из вышеупомянутых генов проламина, глутелинов или глобулинов или из терминатора гена NOS Agrobacterium. Элементы, которые составляют вышеописанную экспрессионную кассету, должны быть соединены функционально в вышеуказанном порядке, в направлении 5'3'. Нуклеотидная последовательность, кодирующая эти промоторы, эти сигнальные последовательности и эти последовательности полиаденилирования, могут быть объединены в кассете этого изобретения"смешанным" образом, т.е. промотор, сигнальная последовательность и последовательность полиаденилирования, принадлежащие к разным генам (например, промотор проламина, лидер глутелина и последовательность полиаденилирования глобулина и т.д.), или в этой кассете могут быть инсертированы вышеупомянутые регуляторные элементы, принадлежащие одному и тому же гену (например, все из гена проламина, все из гена глутелина, все из гена глобулина и т.д.). Необязательно, нуклеотидной последовательности, кодирующей этот белок, может предшествовать короткая последовательность, подходящая для облегчения очистки этого димерного белка при помощи аффинной колонки, например, метка his 6X, FLAG (Sigma) или GST (Amersham). Такая экспрессионная кассета позволяет выгодным образом экспрессировать желаемый аполипопротеин в запасающих компартментах семян, где он синтезируется в основном в димерной и/или мультимерной форме и в высоких количествах. Что касается в основном димерных и/или олигомерных форм, имеется в виду, что продуцированный аполипопротеин будет локализован в запасающих тканях семян в димерной и/или олигомерной (из трех или более мономеров) форме, благодаря образованию дисульфидных связей между двумя цистеинами, присутствующими в этих мономерах в различающихся положениях в зависимости от используемого мутеина, в виде процента, находящегося в диапазоне процента, большего или равного 85%, предпочтительно большего или равного 90% и более предпочтительно большего или равного 95% и даже более предпочтительно большего или равного 98%. Это означает, что общий продуцируемый аполипопротеин,количество аполипопротеина, обнаруживаемое в семенах этого изобретения в димерной и/или олигомерной форме, будет находиться в пределах указанных выше процентов или в любом из возможных процентов, включенных в диапазоне процентов между 85 и 100%, включающих в себя и десятые части процентов. Трансформирующим вектором растений для данного изобретения может быть любой известный вектор, подходящий для трансформации клеток растений, в том числе способа Agrobacterium или физических способов, и для экспрессии продукта-белка в клетках растений. Указанный вектор может разрезаться в более подходящих сайтах рестрикции, и экспрессионная кассета данного изобретения может быть инсертирована в него. Векторы, подходящие для трансформации растений в соответствии с данным изобретением, включают в себя, но не ограничиваются ими, Ti-плазмиды из Agrobacterium и их производные, включающие в себя бинарные и интеграционные векторы, плазмиды pBIB-KAN, pGA471, pEND4K, pGV3850,pMON505, pBI101, а также вектор pPLT2100, описанный в патенте WO 00/04146, или вектор pPLTl00 или pPROL, описанные в патенте РСТ/IB2003/05092, для трансформации физическими способами. Применимые в данном изобретении векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, векторы pPLT 500,pPLT 600 и pPLT 700. Эти векторы получены из плазмиды pPZP (Hajdukiewicz et al. 1994. Plant Mol. Biol. 25:989-994), pBR322 (Bolivar et al. 1977. Gene 2:95-113), pVSl (Itoh et al. 1984. Plasmid 11:206-220), puC18(Yanisch-Perron et al. 1985. Gene 33:103-119) и pBIB-HYG (Becker 1990. Nucl. Acid Res. 18:203), которые уже содержат промотор с лидером и терминатором, легко применимыми для образования вышеописанных экспрессионных кассет, с инсертированием структурной части представляющего интерес гена АроА-1 в два уникальных сайта BamHI и SacI, которые локализованы между промотором и терминатором. Плазмида pPLT500 содержит в качестве промотора промотор проламина, pPROL с лидером указанного гена и в качестве терминатора - терминатор гена NOS. Плазмида pPLT600 содержит в качестве промотора промотор глутелина GluB-1 с лидером указанного гена и в качестве терминатора - терминатор гена NOS. Плазмида pPLT700 содержит в качестве промотора промотор глутелина GluB-4 с лидером указанного гена и в качестве терминатора - терминатор гена NOS. Как указано ранее, объектом этого изобретения является растение, генетически трансформированное вектором этого изобретения, способным продуцировать в семенах описанный аполипопротеин в основном в димерной и/или олигомерной формах, в количествах по меньшей мере 0,5% запасных белков семян, предпочтительно 1% запасных белков семян. Согласно данному изобретению аполипопротеин в семени будет находиться в димерной и/или олигомерной форме, по меньшей мере в количестве 85%, предпочтительно большем или равном 90% или более предпочтительно большем или равном 95% и/или более предпочтительно большем или равном 95% и даже более предпочтительно большем или равном 98% аполипопротеинов присутствующих в этом семени. Для проведения данного изобретения пригодны растения с семенами, которые имеют повышенное содержание белка. Среди них бобовые, такие как соя, и другие бобовые со сходными характеристиками,известные всем специалистам, злаки, такие как рис, овес, ячмень, спельта, мягкая пшеница, твердая пшеница, кукуруза и другие злаки, имеют семена с высоким содержанием белка, а также табак, являются особенно предпочтительными. В этих растениях действительно содержание белка в семенах равно приблизительно 25-35% в семенах бобовых, 10-15% в злаках и приблизительно 20% в табаке. Особенно важным является также содержание липидов, которое должно быть минимизировано для упрощения очистки аполипопротеинов, когда такая очистка является желательной. В одном варианте осуществления данного изобретения трансгенное растение трансформируют вектором, содержащим экспрессионную кассету по данному изобретению, в которой по меньшей мере промотор и лидерная последовательность происходят из глутелинов, как описано выше. Как указывалось выше, применение промоторов глутелинов позволяет накапливание во внутренней ткани семени, что уменьшает потерю рекомбинантного белка в фазе приготовления семени для очистки. Их утилизация представляет особенный интерес во всех растениях со съедобными семенами, таких как рис, ячмень,пшеница (спельта) и другие злаки, которые подвергаются процессам вылущивания и шлифования (отбеливания), так как накапливание этого белка в эндосперме позволяет большей части этого димерного и/или олигомерного продукта оставаться интактной после таких процедур обработки, делая эти семена особенно подходящими для приготовления пищи, содержащей аполипопротеин, или для прямого потребления в качестве нутрицевтика или для облегчения процесса очистки этого белка для последующего внутривенного введения. Другим объектом данного изобретения являются клетки растений, трансформированные вектором этого изобретения, в качестве предшественников растений, имеющих описанные выше характеристики. Согласно этому изобретению способ получения генетически трансформированного растения, способного экспрессировать в основном в димерной и/или олигомерной форме мутеины аполипопротеина А-1 человека, способные образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров,отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; предусматривает следующие стадии:i) трансформация клеток растений с использованием штамма Agrobacterium, который трансформирован экспрессирующим вектором, содержащим:a) промотор гена растения, специфического для экспрессии в запасающих органах семенах;b) ДНК-последовательность, кодирующую сигнальную последовательность белка растения, способную направлять указанный белок в запасающие органы семян посредством переноса в эндоплазматический ретикулум;c) ДНК-последовательность, кодирующую мутеин аполипопротеина АроА-1, способный образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano;d) специфическую для растений последовательность полиаденилирования;ii) отбор клеток, которые были успешно трансформированы указанным экспрессирующим вектором, иiii) применение указанных клеток для регенерации трансформированных растений. Трансформация клеток растений, из которых регенерируют растения, согласно данному изобрете- 10021282 нию может выполняться с использованием любого из способов, известных квалифицированным в данной области специалистам, таких как трансформация зрелых зародышей или других тканей растений, опосредованная Agrobacterium, микроинъекция ДНК в клетки растений, электропорация ДНК в протопласты клеток растений, слияние липосом или сферопластов, бомбардировка микроснарядами или трансфекция клеток или тканей растений модифицированными подходящим образом вирусами растений. Это изобретение может также проводиться трансформацией или трансфекцией клеток растений,модифицированных с использованием рекомбинантных векторов, содержащих экспрессионную кассету по данному изобретению, и отбором трансформированных или трансфицированных клеток, которые экспрессируют этот белок. Эти трансформированные клетки могут быть отобраны при помощи селектируемых маркеров, обычно известных в существующем уровне техники. Трансформированные клетки растений отбирают и индуцируют для регенерации целых, фертильных растений, которые способны продуцировать семена, экспрессирующие представляющий интерес аполипопротеин в основном в димерной или олигомерной активной форме, в соответствии со стандартными сельскохозяйственными способами, известными в конкретном секторе сельского хозяйства. В одном варианте осуществления данного изобретения, трансформацию клеток растений, из которых регенерируют растение, проводят с клетками Agrobacterium, содержащими экспрессирующий вектор, введенный после придания им компетентности с использованием электропорации. Этот штамм с вектором используют для трансформации каллусов, продуцируемых зрелыми зародышами или семядолями. Каллусы, образующиеся в присутствии антибиотика,использованного для отбора, индуцируют для образования сначала побегов и затем корней. Генетически трансформированное растение согласно данному изобретению является стабильным трансгенным растением, генетическая информация которого, введенная посредством трансформации, возможно, содержит единственную копию гена и экспрессирует ее, не обнаруживая феномена сайленсинга гена в последующих генерациях. Таким образом, объектом этого изобретения являются семена, продуцируемые растениями этого изобретения, которые, как уже указывалось, могут быть бобовыми, злаками или табаком. Способ изобретения фактически не ограничивается этими типами растений, но эти растения имеют, как уже было сказано, высокое продуцирование запасных белков семян и, следовательно, допускают высокие уровни экспрессии, представляющие особенный интерес для объема этого изобретения. Кроме того, в большинстве случаев, эти семена являются годными в пищу и, следовательно, могут быть использованы непосредственно в качестве нутрицевтических веществ или для приготовления пищевых продуктов, подходящих для препятствования накоплению холестерина и всем вредным последствиям накопления холестерина в теле человека. Таким образом, другим объектом этого изобретения является способ получения семян, которые накапливают в их запасающих органах один или несколько мутеинов этого изобретения в основном в димерной и/или олигомерной форме, предусматривающий следующие стадии:i) трансформация клеток растений с использованием одного или нескольких экспрессирующих векторов, каждый из которых содержит:a) промотор гена растения, специфического для экспрессии в запасающих органах семенах;b) ДНК-последовательность, кодирующую сигнальную последовательность белка растения, способную направлять указанный белок в запасающие органы семян посредством переноса в эндоплазматический ретикулум;c) ДНК-последовательность, кодирующую мутеин аполипопротеина АроА-1, способный образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; без природной сигнальной последовательности и без природного сигнала полиаденилирования;d) специфическую для растений последовательность полиаденилирования;ii) отбор клеток, которые были успешно трансформированы указанным экспрессирующим вектором, иiii) применение указанных клеток для регенерации трансформированных растений. Другим объектом этого изобретения является способ экстракции и очистки этого аполипопротеина в основном в димерной и/или олигомерной форме, содержащегося в семенах этого изобретения, предусматривающий следующие стадии: а) измельчение указанных семян в жидком азоте в присутствии подходящего буфера для экстракции;b) центрифугирование полученного таким образом раствора при 14000 g в течение 15 мин при 4 С;c) подвергание супернатанта нескольким хроматографическим стадиям, включающим в себя вытеснительную хроматографию и ионообменную хроматографию;d) дополнительная очистка частично очищенного димера и/или олигомера высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ). Объектами этого изобретения являются также продукты, получаемые вышеописанным способом экстракции с исключением димера АроА-1 Milano. Подходящим буфером для экстракции для проведения этого изобретения может быть один из любых буферов, пригодных для экстракции белков из семян, известных квалифицированным в данной области специалистам и легкодоступных в лабораторных справочниках, описывающих экстракцию белков из тканей растений. В качестве не ограничивающего примера такой буфер для экстракции может состоять из: 50 мМ Трис-HCl рН 7,0, 6 мМ ЭДТА, 200 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100. Димер или олигомер этого изобретения может быть образован большим числом единиц (или мономеров) одного и того же мутеина или единицами различных мутеинов с образованием, следовательно,гетеромера. Таким образом, вышеописанный способ очистки может включать в себя дополнительные стадии,подходящие для мономеризации мутеина этого изобретения и присоединения полученных мономеров к другим мономерам этого изобретения для создания гетеромеров. Таким образом, олигомер этого изобретения может быть очищен как таковой, следовательно, в олигомерной форме, или, если желательным является получение гетеромера, мономеры мутеинов этого изобретения могут быть очищены добавлением в буфер для экстракции восстанавливающих агентов, таких как меркаптоэтанол или дитиотреитол, или трискарбоксиэтилфосфина (ТСЕР) и ЭДТА при рН 7,2 (присутствие восстанавливающей среды позволит разделить полученные олигомеры на мономеры), так что указанные мономеры могут быть использованы в виде единиц для конструирования гетеромеров, содержащих два или более различных мутеинов этого изобретения. Таким образом, мутеины, продуцируемые растениями этого изобретения, могут быть получены по отдельности и затем смешаны в стехиометрическом соотношении, выбранном для получения гомомерного или гетеромерного олигомера. Может быть также сконструирован гетеромер этого изобретения, продуцирующий одновременно в одном и том же рекомбинантном организме более чем один мутеин этого изобретения, котрансформацией двух или более векторов, описанных выше, или с использованием химерных конструкций, содержащих кодирующие последовательности для двух или более мутеинов этого изобретения или, наипростейшим способом в растении, получением клеток, экспрессирующих более чем один мутеин, посредством скрещивания. Можно скрещивать гомозиготные линии растений в отношении одного мутеина в способе для получения потомков, экспрессирующих более одного мутеина этого изобретения и, следовательно, продуцирования гетеромеров выбранных мутеинов. Таким образом, эти скрещивания могут выполняться объединением трансгенных линий, содержащих разные мутеины, во всех из возможных комбинаций и фиксированием этих линий в гомозиготности самоопылением или диплоидизацией гаплоида, полученного с использованием культуры пыльников. Полученные линии могут быть дополнительно подвергнуты кроссбридингу. Линии растений, гомозиготные в отношении одного мутеина, могут быть подвергнуты кроссбридингу для получения потомков, экспрессирующих более одного мутеина этого изобретения, которые могут, следовательно, экспрессировать гетеромеры выбранных белков. Эти кроссбридинги могут выполняться объединением трансгенных линий, содержащих разные мутеины, во всех из возможных комбинаций и фиксированием этих гомозиготных линий самоопылением или диплоидизацией гаплоидов, полученных с использованием культуры пыльников. Полученные таким образом линии могут быть дополнительно подвергнуты кроссбридингу. В том случае, когда получение гетеромера проводят смешиванием мономеров мутеинов данного изобретения, необходимой будет очистка мутеинов этого изобретения в мономерной форме и использование этих очищенных мономеров для конструирования гетеромера в присутствии окисляющих агентов,таких как, например, пероксид водорода или дитиобиснитробензоат, и/или фермента дисульфидизомеразы. Неограничивающий пример способа для очистки мономеров мутеинов этого изобретения включает в себя следующие стадии:a) измельчение семян этого изобретения в жидком азоте в присутствии подходящего буфера для экстракции;b) центрифугирование полученного таким образом раствора при 14000 g в течение 15 мин при 4 С;c) подвергание супернатанта нескольким хроматографическим стадиям, включающим в себя вытеснительную хроматографию и ионообменную хроматографию;d) дополнительная очистка частично очищенного димера и/или олигомера высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ);h) смешивание различных мономеров, полученных в стадиях а)-f), в точном стехиометрическом соотношении в окисляющих условиях и/или в присутствии фермента дисульфидизомеразы;i) извлечение гетеромеров, полученных в стадии h). Мономеры очищенного белка в восстанавливающих условиях могут быть мультимеризованы изменением условий окисления, которые делают возможным образование цистина посредством образования дисульфидного мостика между двумя цистеинами. Образование дисульфидных мостиков может стимулироваться добавлением окисляющих агентов, таких как, например, пероксид водорода или дитиобиснитробензоат, и/или фермента дисульфидизомеразы. В этом способе мультимеризации можно использовать отдельные очищенные мутеины или их смеси, начиная от мутеинов с одним цистеином (1 С) и с двумя цистеинами (2 С). В случае смесей 1 С и 2 С, изменение стехиометрического соотношения этих двух компонентов возможно для получения главным образом смеси димеров-тримеров вместо олигомеров более высоких рангов. Молекулярная масса этих мультимеров может быть приближенно определена при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с концентрацией полиакриламида в диапазоне 8-16%. Во время процесса полимеризации может добавляться адъювант, например липид. Димер и/или олигомер мутеина АроА-1 человека этого изобретения, экстрагированный из этих семян, может быть использован для приготовления лекарственных средств, подходящих для терапии HDL. Предпочтительно, чтобы указанный белок имел высокую концентрацию в семенах, т.е. 0,5-1%, предпочтительно 0,8-1% запасных белков семян. При условии эффективности димера и/или олигомера этого изобретения в уменьшении атеросклеротических бляшек, семена этого изобретения могут быть использованы для приготовления лекарственных средств для терапии HDL или в качестве лекарственного средства для атеросклероза. Это лекарственное средство может быть приготовлено экстракцией димера и/или мультимера из семян этого изобретения и затем смешиванием его с подходящим носителем в соответствии с введением, для которого оно предназначено. Для перорального введения это лекарственное средство может быть также приготовлено с использованием муки, порошков или молока из семян этого изобретения без необходимости дополнительной очистки. Это лекарственное средство, приготовленное с использованием семян этого изобретения, может быть в форме жидкости, порошка, твердого вещества,суспензии, эмульсии и может быть также приготовлено для перорального введения или для введения инфузией. Поскольку фармацевтические вещества, содержащие аполипопротеины, уже известны, специалисту с квалификацией в данной области будет известно, какие формы и дозы могли бы быть пригодными для приготовления лекарственных средств с использованием семян этого изобретения. Согласно этому изобретению, фармацевтические композиции будут содержать один или несколько димеров и/или олигомеров этого изобретения в фармацевтически эффективных концентрациях, таких как, например, 10 или 50 мг/кг массы тела, и фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как адъюванты и добавки, такие как фосфолипиды, холестерин или триглицерид. Указанные фармацевтические композиции могут быть приготовлены в форме растворов для внутривенной, внутримышечной, подкожной инъекции или в виде композиции для перорального введения,следовательно, в виде суспензии, в виде капсулы, в виде таблетки, в виде пилюли, в виде сиропа или других подходящих пероральных форм введения, или могут быть реализованы для ректального введения или в виде распыляемого раствора или аэрозоля. Приготовление таких фармацевтических композиций известно лицу с квалификацией в данной области, и дополнительные указания не требуются. Семена этого изобретения могут быть также использованы как таковые для цели уменьшения атеросклеротических бляшек и для предотвращения их образования, и для цели увеличения уровней холестерина HDL в плазме крови, введением пищевых продуктов, содержащих их производные, таких как соевое молоко, рисовое молоко, или других подходящих семян, блюд из зернового продукта, типов муки,фруктов, пищевых продуктов, содержащих указанные типы муки, либо переработанные, либо полученные после концентрирования активного ингредиента. Семена этого изобретения являются семенами из видов растений, уже используемых обычно в больших количествах в пищевой промышленности, и, следовательно, не требуется дальнейшее описание в отношении того, как использовать семена этого изобретения для получения пищевых продуктов или нутрицевтических веществ, содержащих в основном в димерной и/или олигомерной форме мутеины АроА-1 человека, способные образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; указанные нутрицевтические вещества могут быть затем использованы для увеличения уровней холестерина HDL в плазме и для уменьшения абсорбции холестерина в кишечнике для борьбы с атеросклерозом, как для лечения, так и для предупреждения атеросклероза или для того и другого применения. Нутрицевтические вещества этого изобретения, содержащие в основном в димерной и/или олигомерной формах мутеины АроА-1 человека, способные образовывать димеры и/или олигомеры, отличающиеся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; будут содержать продукты, произведенные из семян этого изобретения, или могут состоять непосредственно из указанных семян для потребления непосредственно в качестве пищи, таких как семена бобовых, риса, или другие семена. Нутрицевтические вещества этого изобретения могут также находиться в форме зерновых блюд,высушенных или воздушных (взорванных) зерен (или также зерновых мюсли (дробленых зерен с сухофруктами и орехами, могут быть пищевыми продуктами, приготовленными из муки или молока, произведенных из указанных семян, в форме "немолочного" молока (из растительных источников), или их производных, таких как напитки, мороженое, пудинги, немолочный сыр (из растительных источников) или другие продукты, в форме порошка или разновидностей муки, мучные кондитерские изделия или макаронные изделия, или могут быть в форме свежих овощей или произведенных из них продуктов. Квалифицированному в данной области специалисту будут не нужны дополнительные инструкции вне пределов обычной переработки пищевых продуктов для разработки нутрицевтических веществ на основе этого изобретения. Семена этого изобретения могут быть также использованы в средства хранения для мутеинов аполипопротеина А-1 человека, способных образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, отличающихся тем, что они обнаруживают в их димерной и/или олигомерной формах биологические активности, равные или более высокие, чем активности, обнаруживаемые аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; в основном в димерной и/или мультимерной форме. Следующие примеры предназначены для предоставления более подробного описания этого изобретения без связывания с теми же самыми заявленными объектами. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Клонирование гена, кодирующего белок АроА-1 человека. Ген, кодирующий белок АроА-1 человека, клонируют с использованием ОТ-ПЦР из тотальной РНК, выделенной из печени человека в соответствии с информацией о последовательности, сообщенной в SEQ ID No: 1. Ген, выделенный в виде его зрелого белка без сигнального пептида и сайта полиаденилирования, клонировали в pGEM-T (Promega) с получением плазмиды pGEM-APO (фиг. 1). Праймеры для амплификации (прямой праймер PLT1002 и обратный праймер PLT1003) вводили сайт BamHI на 5'конце и сайт EcoRV на 3'-конце для облегчения последующего переноса в векторы pPLT500, pPLT600 иpPLT700. Пример 2. Получение мутеинов. Природный ген, полученный, как описано в примере 1, после проверки, что его последовательность идентична опубликованной последовательности, мутагенизируют с использованием способов сайтнаправленного мутагенеза для изменения аминокислот в определенных положениях в соответствии с аминокислотами, сообщенными в SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38. Мутагенез плазмиды pGEM-APO выполняли в соответствии с инструкциями в наборе QuikChangePLT1004-PLT1005 для мутеина 19 (pGEM-APO-M19). Для подтверждения инсерции желаемой мутации у полученных мутантов определяли первичную последовательность (SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38). Пример 3. Получение векторов трансформации растений. Различные генетические формы, соответствующие представляющим интерес мутеинам, извлекали из плазмид удалением АРО-фрагмента ферментами BamHI-EcoRV и инсертированием его в сайты рестрикции BamHI и SacI векторов pPLT500, pPLT600 и pPLT700, линеаризованных теми же самыми ферментами. После клонирования, полученные гены АРО получают под контролем промотора и лидера pPROL, номер доступа AF156714 (pPLT500), или GluB-1, номер доступа AY427569 (pPLT600), или GluB-4, номер доступа сообщенных в качестве примера на фиг. 2-16, плюс плазмид Затем все из полученных плазмид переносили в клетки штамма ЕНА 105 (Hood et al. 1993. Transgenic Res. 2:208-218) A. tumefaciens, который был сделан компетентным посредством электропорации. Штаммы, содержащие эти различные плазмиды, использовали для генетической трансформации риса. Пример 4. Генетическая трансформация риса. Опосредованную Agrobacterium генетическую трансформацию риса выполняли в соответствии с протоколом Hiei et al. 1994. Plant J. 6:271-282 с небольшими модификациями с использованием зрелых зародышей из сорта Ariete. Стадии трансформации включают в себя следующие стадии. 1. Индукция каллуса. После ручного вылущивания семена стерилизуют в течение 1 мин в 70% этаноле и 30 мин в растворе коммерческого отбеливателя и затем промывают 6 раз в течение 15 мин стерильной дистиллированной водой. Использовали сто семян, из которых зародыши извлекали для каждой трансформации, 10 зародышей помещали в чашки Петри с диаметром 100 мм, содержащие 25 мл среды для индукции каллуса с агарозой. Чашки, закрытые парафильмом, выдерживают в темноте при 28 С в течение 3 недель. В этом периоде времени зародыш прорастает и образует эмбриогенную каллусную ткань на щитке (скутеллуме). Этот каллус собирают и узелки приблизительно 1 мм переносят в свежую среду NB на 1-2 недели. 2. Сокультивирование с Agrobacterium.Agrobacterium культивируют на чашках со средой АВ, содержащей подходящие антибиотики в соответствии со штаммом. Штамм культивируют в течение 3 дней при 28 С. Бактерии собирают шпателем и ресуспендируют в жидкой среде при плотности 3-5109 клеток/мл (OD600 1) и переносят на чашку Петри. Каллус риса погружают в бактериальную суспензию на 10-15 мин, затем сушат на стерильной фильтровальной бумаге и затем переносят на чашку с агарозной средой для культивирования. Эти чашки закрывают парафильмом и оставляют для инкубации в течение 3 дней при 25 С в темноте. 3. Отбор на устойчивые к гигромицину каллусы. Каллусы берут из чашки для сокультивирования и переносят в чашки, содержащие селективную среду I (R2). После 2 недель на селективной среде, эти каллусы переносят на селективную среду II, и после одной недели появляются несколько устойчивых каллусов, белых и шарообразных, на поверхности основного каллусного скопления. Эти устойчивые каллусы удаляют шпателем и переносят на свежую селективную среду II, где эти устойчивые каллусы продолжают расти. 4. Регенерация растений. Устойчивые к гигромицину эмбриогенные каллусы отбирают и переносят на среду для предварительной регенерации, инкубируют в течение одной недели в темноте при 28 С и затем повторно отбирают из среды для предварительной регенерации, максимально 4-6 раз на чашку. Затем их инкубируют на свету (флуоресцентном, 4000 люкс) при 28 С в течение 3-4 недель. Когда эти растения достигают 3 см,их переносят индивидуально в пробирки (20030 мм), содержащие 25 мл среды для укоренения, и выдерживают на свету в течение 3 недель при 28 С. Когда листья начинают загибаться через верхнюю часть тест-пробирки, эти растения переносят вечером в почву в контейнере, которая поддерживает высокую влажность (85%). Эти контейнеры постепенно открывают на протяжении времени для акклиматизации растения к условиям оранжереи. Семена этих растений Т 0 собирают спустя 5 месяцев. Пример 5. Молекулярная и биохимическая характеристика трансгенных линий риса. Во время периода перед цветением растения Т 0 проверяли с использованием ПЦР (фиг. 17) для подтверждения присутствия трансгена. ПЦР выполняли с использованием в качестве матрицы ДНК, экстрагированной из листьев линий риса, устойчивых к гигромицину, с применением праймеров PLT1002 иPLT1003, которые амплифицируют полный ген АроА-1, визуализируемый, в случае успешной трансформации, фрагментом 932 п.н. Затем растения Т 0 проверяли анализом по Саузерну для подтверждения копийности отдельных представляющих трансген линий, трансформированных с использованием независимых событий трансформации (фиг. 18 и 19). Общую ДНК, экстрагированную из листьев трансгенного риса, разрезали с использованием фермента XbaI и разделяли при помощи электрофореза на 1,8% агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем гибридизовали с использованием зонда, состоящего из гена АРО, помеченного DIG, с использованием набора PCRDIG Probe Synthesis (Boehringer) и детектирования CDPstar (Boehringer). Результаты из гибридизационных растений с единственной копией этого гена обнаруживают единственную полосу вариабельной длины, варьирующейся в зависимости от сайта интеграции гена в геном риса. Семена, собранные из растений Т 0, положительные при тестировании на трансген, использовали затем для подтверждения экспрессии этого трансгена с использованием Вестерн-анализа (фиг. 20). Общие белки АроА-1 Milano из семян риса экстрагировали из этих семян с использованием буфера для экстракции, содержащего 50 мМ ТРис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА, 200 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100,после разделения электрофорезом в акриламидном геле, который требует смешивания с буфером для нанесения, содержащим 60 мМ Трис рН 6,8, 25% глицерин, 2% ДСН и 14,4 мМ Р-меркаптоэтанол (последний добавляют только, когда желательно подтверждение структуры этого мономера), переносили при помощи электроблоттинга (раствор 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, 30 В при 4 С в течение ночи) на нитроцеллюлозную мембрану, hybond ECL (Amersham). Эту мембрану с иммобилизованным белком помещали в раствор TBS-T и 5% сепарированного молока и перемешивали в течение 60 мин и затем после нескольких промывок эту мембрану помещали в тот же самый раствор, который, однако, содержит дополнительно первичное антитело, в соотношении 1:5000 (козье анти-АроА-1). После реакции с этим первичным антителом мембрану промывали и затем подвергали действию вторичного антитела (конъюгата антитело против козьего иммуноглобулина - пероксидаза) всегда в растворе TBS-T - сепарированное молоко, в соотношении 1:12000. После реакции с вторичным антителом эту мембрану промывали несколько раз и затем помещали в раствор из набора ECL для хемилюминесценции из Amersham. Затем эту мембрану помещали в контакт с фотографической пленкой (Hyperfllm МР, Amersham) в темной комнате на варьируемые периоды времени. Наиболее продуктивные растения брали заблаговременно для генераций Т 2 и Т 3 для идентификации индивидуальных гомозиготных растений в отношении присутствия гена аполипопротеина и для подтверждения отсутствия феномена сайленсинга. Вестерн-анализ проводили на большинстве представляющих интерес линий, на присутствие трансгена в единственной копии и на его высокую экспрессию,повторяли на семенах Т 3 в невосстанавливающих условиях для подтверждения присутствия этого белка в димерной или мультимерной форме (фиг. 21). Все растения риса с геном аполипопротеина под контролем промоторов pPROL, GluB-1, GluB-4 и Глобулина 7S приводят к накапливанию белка, реагирующего с антителами, специфическими для АроА 1 (фигура 20), имеющего молекулярный размер 28 кДа, в мономерной форме в присутствии восстанавливающего агента в буфере для экстракции, соответствующего зрелому белку человека, и в димерной форме, приблизительно 56 кДа в отсутствие восстанавливающего агента (фигуры 21 и 22). Присутствие этого рекомбинантного белка только в семенах, но не в листьях подтверждали во всех испытанных трансгенных растениях. Пример 6. Очистка белка АроА-1 Milano из семян риса и ее подтверждение масс-спектрометрией. Экстракцию всех белков из семян риса выполняли измельчением вылущенных и отшлифованных(отбеленных) семян в жидком азоте в присутствии буфера для экстракции (0,5 М сахароза, 0,1% аскорбиновая кислота, 0,1% cys-HCl, 0,01 М Трис-HCl, 0,05 М ЭДТА рН 6). Этот раствор центрифугировали в течение 30 мин при 14000 g при 4 С и супернатант лиофилизировали. Для проверки молекулярной массы этой димерной формы при помощи электрофореза в ДСНПААГ, пробу экстракта белка (20 мкл), перед лиофилизацией или в других фазах очистки, смешивали с красителем (буфер для нанесения с ДСН, без восстановителя) и наносили с этой пробой в мини-гель 10% полиакриламида. Рабочими условиями были первоначально 10 мА и затем 20 мА для остального прохождения, в буфере IX Трис-глицин. Затем этот гель окрашивали красителем Кумасси синим или, для идентификации конкретного рекомбинантного белка, обрабатывали антителом анти-АроА-1 и молекулярную массу рассчитывали со ссылкой на стандарты молекулярных масс. Общие лиофилизированные белки делипидизировали смесью диэтиловый эфир/этанол (3/1, об./об.) и солюбилизировали в 0,1 М Трис-НС 1, 0,04% ЭДТА, 0,01% NaN3, 6 М гуанидин-HCl, рН 7,4 и пропускали через колонку Sephacryl S-300 HR (Amersham), уравновешенную буфером 0,1 М Трис-НС 1, 0,04% ЭДТА, 0,01% NaN3, рН 7,4, содержащим 4 М гуанидин-HCl. Фракции, соответствующие димеру мутеина АроА-1, концентрировали и пропускали через ту же самую колонку второй раз. Очищенный белок диализовали в 5 мМ NH4HCO3, 0,01% Na2-ЭДТА, рН 7,4, и лиофилизировали. Чистоту (95%) определяли с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания серебром. Одну пробу очищенного белка ресуспендировали в растворителе, состоящем из 50% ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты. После центрифугирования при 13000 об/мин эту пробу инъецировали в капилляр и определяли масс-спектр (АроА-1 Perkin Elmer), который подтверждает молекулярный фингерпринт белка АроА-1. Пример 7. Получение рисового молока и проверка стабильности АроА-1 Milano, продуцируемого в растениях. Рисовое молоко получали из семян генерации Т 3 из трансгенных линий риса, выращенных в оранжереях. В стадии зрелости эти семена собирали, вылущивали и шлифовали с использованием зерноочистительной машины лабораторного масштаба (G150/R, Colombini). Очищенные семена измельчали при помощи размалывающей машины с использованием жернового камня для получения муки с частицами,имеющими диаметр приблизительно 40 мкм, способными образовывать суспензию в воде. Готовили 20% суспензию этой муки в воде и эту суспензию нагревали до 40 С в течение разных периодов времени,благоприятных для осахаривания. В конце осахаривания рисовое молоко выдерживали при 4 С и стабильность белка АроА-1 Milano оценивали с интервалами одна неделя в течение времени от 0 (конец приготовления) до времени 9 (63 дня). Для всех испытанных периодов времени было показано, что этот белок является стабильным, как показано присутствием самой большой полосы при 56000 Да из Вестерн-блоттов после электрофореза в ДСН-ПААГ на общих белках, экстрагированных из молока. Оценка концентрации АроА-1 Milano в рисовом молоке может варьироваться между 89 и 178 мг/л молока, при- 17021282 готовленного, как описано выше, и зависит от уровней экспрессии трансгена. Концентрация аполипопротеина может увеличиваться значительно использованием вместо рисовой муки общего экстракта белков риса, например от 40, 50, 60 или 70% белка. В случае соевого молока концентрация муки в суспензии может быть равна 9%. В качестве замены муки сои можно использовать изолят белка сои, который имеет такое высокое содержание белка, как 90%, на сырую массу, и можно получить более высокую концентрацию рекомбинантного белка на 1 л молока. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Специфическая для семян экспрессионная кассета для обеспечения экспрессии в запасающих органах семян мутеина аполипопротеина АроА-1 человека, способного образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или более мономеров, в основном в их димерной и/или олигомерной форме, причем указанный мутеин отличается тем, что он обнаруживает в димерной и/или олигомерной формах биологическую активность, равную или более высокую, чем активность, обнаруживаемую аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме, в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano; причем указанная кассета содержит в направлении от 5' к 3' нуклеотидную последовательность, кодирующую промотор гена растения, специфический для экспрессии в запасающих тканях семян, выбранный из группы, состоящей из промотора проламина риса pPROL, промотора глутелина риса pGluB1, промотора глутелина риса pGluB-4, промотора основного 7S глобулина сои pGLQB, промотора бетаконглицинина сои; нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность белка растения, способную направлять указанный мутеин в запасающие ткани семян, выбранную из группы, состоящей из лидерной последовательности проламина риса pPRQL, лидерной последовательности глутелина риса pGluB-1, лидерной последовательности глутелина риса pGluB-4, лидерной последовательности основного 7S глобулина сои pGLQB, лидерной последовательности бета-конглицинина сои pCQNG; нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный мутеин без этой сигнальной последовательности и без сигнала полиаденилирования природного аполипопротеина А-1, и сигнал полиаденилирования, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный мутеин, выбрана из группы, включающей SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 38. 2. Экспрессионная кассета по п.1, где указанная биологическая активность указанного мутеина является равной или превышает на 10, или на 30, или на 50, или на 100, или на 200% биологическую активность, обнаруживаемую аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в указанных тестах. 3. Экспрессионная кассета по любому из предыдущих пунктов, при использовании которой указанный мутеин продуцируется в запасающих органах семян в димерной или олигомерной формах в количестве, большем или равном 85% от всего указанного мутеина, продуцируемого в указанных семенах. 4. Экспрессионная кассета по любому из предыдущих пунктов, содержащая слева от последовательности, кодирующей указанный мутеин, последовательность, способную облегчать очистку димера и/или олигомера данного мутеина на аффинной колонке. 5. Специфический для экспрессии в запасающих тканях семян вектор, содержащий экспрессионную кассету по пп.1-4. 6. Растение, трансформированное одним или несколькими векторами по п.5, способное экспрессировать в запасающей ткани семян по меньшей мере один или несколько мутеинов аполипопротеина А-1 человека, способных образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или несколько мономеров,в основном в димерной и/или олигомерной форме, причем указанный мутеин отличается тем, что он обнаруживает в димерной и/или олигомерной формах биологическую активность, равную или более высокую, чем активность, обнаруживаемую аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano. 7. Растение по п.6, где указанный экспрессирующий вектор является плазмидой. 8. Растение по п.6 или 7, где указанное растение является бобовым растением, злаком или табаком. 9. Растение по п.8, где указанное растение выбрано из группы, содержащей рис, кукурузу, твердую или мягкую пшеницу, овес, спельту, ячмень, сою, горох, фасоль, табак. 10. Семена растения, трансформированного одним или несколькими векторами по п.5, содержащего в его запасающих органах один или несколько мутеинов аполипопротеина А-1 человека, способных образовывать димеры и/или олигомеры, содержащие три или несколько мономеров, в основном в димерной и/или олигомерной форме, причем указанный мутеин отличается тем, что он обнаруживает в димерной и/или олигомерной формах биологическую активность, равную или более высокую, чем активность, обнаруживаемую аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milano. 11. Семена по п.10, в которых указанный мутеин содержится в димерной или олигомерной форме в количестве, большем или равном 85%, от всего указанного мутеина в указанных семенах. 12. Семена по п.11, в которых указанный мутеин составляет от 0,5-1% от запасных белков этих семян. 13. Семена по п.11, которые являются семенами бобового растения, злаков или табака. 14. Семена по п.13, которые являются семенами риса, кукурузы, твердой или мягкой пшеницы, овса, спельты, ячменя, сои, гороха, фасоли, табака. 15. Способ получения генетически трансформированного растения по любому из пп.7-9, предусматривающий следующие стадии:i) трансформация клеток растений с использованием штамма Agrobacterium, который трансформирован одним или несколькими экспрессирующими векторами по п.5;ii) отбор клеток, в которых была осуществлена успешная трансформация указанным экспрессирующим вектором (указанными экспрессирующими векторами);iii) регенерация трансформированного растения, способного продуцировать семена из указанных вii) клеток. 16. Способ получения семян по любому из пп.10-14, предусматривающий следующие стадии:i) трансформация клеток растений с использованием штамма Agrobacterium, который трансформирован одним или несколькими экспрессирующими векторами по п.5;ii) отбор клеток, в которых была осуществлена успешная трансформация указанным экспрессирующим вектором (указанными экспрессирующими векторами);iii) регенерация трансформированного растения, способного продуцировать указанные семена, из указанных в ii) клеток. 17. Способ по п.16, где указанные семена являются семенами бобового растения, злаков или табака. 18. Способ экстракции и очистки из семян по пп.10-14 мутеина белка АроА-1 человека в основном в димерной и/или олигомерной форме, содержащей три или более мономеров, причем указанный мутеин отличается тем, что он обнаруживает в димерной и/или олигомерной формах биологическую активность,равную или более высокую, чем активность, обнаруживаемую аполипопротеином АроА-1 Milano в его димерной форме в следующих тестах: а') измерение способности обратного транспорта холестерина, оцениваемой расчетом кинетики ассоциации равных количеств указанного димера или указанного олигомера и указанного димера АроА-1b') измерение полупериода существования в плазме указанного димера или указанного олигомера при помощи теста полупериода существования в плазме в сравнении с калибровочной кривой, полученной выполнением того же самого теста с очищенным димером АроА-1 Milan; предусматривающий следующие стадии:a) измельчение указанных семян в жидком азоте в присутствии подходящего буфера для экстракции;b) центрифугирование полученного на стадии а) раствора при 14000 g в течение 15 мин при 4 С;c) подвергание супернатанта нескольким хроматографическим стадиям, включающим в себя вытеснительную хроматографию и ионообменную хроматографию;d) дополнительная очистка частично очищенного димерного и/или олигомерного мутеина высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). 19. Способ по п.18, дополнительно предусматривающий следующие стадии:e) разведение димерного и/или олигомерного мутеина, полученного на стадии с) или d), в буфере с восстанавливающим агентом;f) гель-фильтрация суспензии, полученной на стадии е), и извлечение мономеров;g) повторение стадий а)-f) для других семян, продуцирующих мутеины белка Аро-1 человека, мономеры которых отличаются от уже полученных мономеров;h) смешивание различных мономеров, полученных в разных семенах на стадиях а)-f), в точных сте- 19021282i) извлечение гетеромеров, полученных на стадии h). 20. Мутеин белка Аро-1 человека в основном в димерной и/или олигомерной форме, полученный в соответствии со способом по п.18. 21. Гетеромеры мутеина Аро-1 человека, полученные способом по п.19. 22. Применение мутеина Аро-1 человека в основном в димерной и/или олигомерной форме, полученного из семян по пп.10-14, для приготовления лекарственного средства для увеличения уровней холестерина HDL в плазме и для лечения и предотвращения атеросклероза. 23. Применение семян по пп.10-14 для приготовления лекарственного средства для увеличения уровня холестерина HDL в плазме крови и для лечения и предотвращения атеросклероза. 24. Применение семян по пп.10-14 для получения пищевых продуктов или нутрицевтических средств. 25. Нутрицевтическое средство, содержащее мутеин белка Аро-1 человека по п.20. 26. Нутрицевтическое средство по п.25, которое входит в состав зерновых блюд, высушенных или воздушных (взорванных) зерен, пищевых продуктов, разновидностей молока из растительных источников или их производных, разновидностей муки, мучных кондитерских изделий, макаронных изделий, в форме свежих овощей или произведенных из них продуктов. 27. Способ получения гетеромеров мутеина белка АроА-1 человека по п.20, содержащего три или более мономеров, включающий следующие стадии:a) кроссбридинг один или несколько раз растений по пп.6-9, где указанный продуцируемый мутеин отличается от растения к растению;b) отбор растений, экспрессирующих по меньшей мере два различных мутеина;c) экстрагирование указанных гетеромеров мутеина белка АроА-1 человека из семян указанных растений.