Способ получения пищевого продукта и пищевой продукт

011582 Настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, обладающего повышенной белизной, а также к пищевому продукту, полученному этим способом. В пищевых продуктах некоторых типов белый цвет по меньшей мере части продукта рассматривается как желательный, например в молочных продуктах, таких как сыры, молочная сыворотка, масло и сухое молоко, а также в мучных изделиях, например в хлебе и лапше. Однако исходное сырье или промежуточные продукты таких пищевых продуктов могут включать пигменты, которые способны вызывать окрашивание пищевого продукта в цвет от не совсем белого до желтого. Примерами таких пигментов являются каротиноиды (каротины и ксантофиллы) и флавоны. Например, белизна мякиша хлеба из пшеничной муки высшего или первого сорта рассматривается как желательное качество. Высокая белизна хлебного мякиша может быть достигнута с использованием ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, липаза и/или липоксигеназа (см., например, публикацию Р.Glinas et al., Oxido-reductases and Lipases as Dough-Bleaching Agent, Cereal Chem., 75(6), 810-814 (1998. Все упомянутые ферменты оказывают отбеливающее действие на хлебный мякиш. В настоящее время в хлебопекарной промышленности используется, главным образом, ферментно активная соевая мука, которая содержит липоксигеназы. Способность липоксигеназ соевой муки отбеливать пигменты пшеничной муки обусловлена действием свободных радикалов, а также других форм активного кислорода, которые образуются в процессе окисления жирных кислот липоксигеназой. Эта реакция названа соокислением. В соевой муке присутствуют три липоксигеназы: L1, L2 и L3, при этом наилучшей отбеливающей активностью обладают L2 и L3 (W. Grosch, G. Laskawy and F. Weber, J. Agric. Food Chem. 24 (1976) 456). Соевая мука содержит не только липоксигеназы, но и жирные кислоты, которые необходимы для отбеливающего действия, что приводит к улучшенному отбеливающему действию. Недостатком, связанным с применением сои в качестве источника липоксигеназ, является тот факт,что в настоящее время большинство видов сои являются генномодифицированными (GMO). Поскольку потребители во всем мире предпочитают применение негенномодифицированных улучшителей качества хлеба, существует высокая потребность в добавках, альтернативных соевым липоксигеназам. Недостатком известных ферментов, отличных от соевых L2 и L3 липоксигеназ, является то, что их эффективность не так высока, как эффективность липоксигеназ сои. На практике для достижения желаемой белизны хлебного мякиша эти ферменты необходимо объединять с кофакторами или другими ферментами. Пероксидазы неферментативно катализируют окисление ненасыщенных соединений, например ненасыщенных жирных кислот, молекулярным кислородом. (С.Е. Eriksson et. al. JAOS 48 (1971) 442). Окисленные жирные кислоты генерируют радикалы, которые, вероятно, реагируют с пигментами муки, приводя к получению менее окрашенных продуктов способом, аналогичным способу действия продуктов реакции липоксигеназ. Предметом настоящего изобретения является предоставление нового пищевого продукта, в котором по меньшей мере часть продукта обладает повышенной белизной. Данный предмет достигнут с помощью нового способа получения пищевого продукта, промежуточная форма которого включает пигмент, указанный способ включает добавление по меньшей мере одного фермента, который является эффективным в непосредственном превращении указанного пигмента в форму, которая приводит к повышению белизны по меньшей мере части пищевого продукта, по сравнению с пищевым продуктом, в который при его получении указанный фермент не добавлялся. Ферменты, способные непосредственно превращать пигмент в форму, которая приводит к повышению белизны, здесь и далее в описании определены как отбеливающие ферменты. Направленное отбеливающее действие на пигменты такие ферменты могут осуществлять различным образом. Например, они могут непосредственно трансформировать пигменты посредством насыщения ненасыщенных связей в пигменте, например, гидрированием, или они могут непосредственно расщеплять пигменты с образованием продуктов расщепления. Предполагается, что термин непосредственно означает, что указанные ферменты воздействуют на пигмент как субстрат. Применение кофакторов для достижения конверсии конкретно не исключено. Ферменты, способные непосредственно расщеплять пигменты, будут здесь и далее в описании определяться как расщепляющие ферменты. Подходящими расщепляющими ферментами согласно изобретению являются ферменты, которые способны расщеплять каротиноиды (каротины и ксантофиллы) и флавоны. Каротиноиды могут подвергаться расщеплению двумя различными способами центральным и эксцентрическим. Центральное расщепление приводит к образованию ретиноидов (С 20-соединений). Эксцентрическое расщепление может приводить к получению группы более разнородных соединений, таких как, например, абсцизовая кислота. Ферментом, способным подвергать каротиноиды центральному расщеплению, является, например, -каротин-15,15'-монооксигеназа (ЕР 1.14.99.36), как описано, например,в публикациях ЕР-А-1031623 и J. Lintig, K. Vogt (2000), J. Biol. Chem. 275, 11915. Этот фермент прежде был известен как -каротин-15,15'-диоксигеназа=ЕР 1.13.11.21. Дополнительным преимуществом применения ферментов, способных к центральному расщеплению, является образование ретиноидов. Они являются жизненно важными компонентами для зрения. каротин расщепляется на две молекулы ретиналя. Ретиналь может далее превращаться в ретинол, извест-1 011582 ный также как витамин А. Примерами ферментов, способных подвергать каротиноиды эксцентрическому расщеплению, являются 9-цис-эпоксикаротиноиддиоксигеназа (см., например, X. Qin и J.A.D.al. (2001), J. Biol. Chem. 287, 14110). Термин промежуточная форма пищевого продукта в данном описании относится к любой форме,которая встречается во время технологического процесса до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма может включать отдельные исходные вещества, и/или смесь отдельных исходных веществ, и/или смеси с добавками, и/или технологическими добавками, или их последовательно технологически обработанную форму. Фермент добавляется в эффективных количествах. Квалифицированный в данной области техники специалист может легко определить такое эффективное количество, изменяя дозировку фермента и количественно определяя степень деградации пигментов и/или степень повышения белизны конечного пищевого продукта. В случае, когда фермент обладает способностью трансформировать -каротин, эффективное количество фермента может быть выражено из расчета на единицы деградации -каротина (например, единицы Азиза (Aziz) или Цорна (Zorn), см. раздел Материалы и способы). Пищевой продукт может изготавливаться по меньшей мере из одного сырья растительного происхождения, такого как пшеничная мука. Последняя, как известно, содержит пигменты, такие как каротиноиды (каротины и ксантофиллы) и флавоны, которые ответственны, например, за цвет мякиша выпеченного хлеба. Альтернативно, эти пигменты могут происходить из источников, отличных от растительного сырья, например из молока. Примерами каротиноидов являются другие вещества с каротиновой основой, в особенности, аналоги -каротина или капсантина, точнее, - и -каротин, лютеин, ликопен,антераксантин, капсантин, зеаксантин, виолаксантин, астаксантин, кантаксантин, лутеоксантин, неоксантин и соответствующие апокаротиноиды. Предпочтительным пищевым продуктом способа согласно настоящему изобретению является печеный хлеб и другие хлебобулочные изделия из пшеничной муки и/или муки другого хлебного злака. Например, для пищевого продукта, который представляет собой хлеб, промежуточные формы включают, например, пшеничную муку, ее исходную смесь с другими ингредиентами хлеба, такими как,например, вода, соль, дрожжи и композиции, улучшающие вкус хлеба, смесь компонентов теста, вымешанное тесто, дрожжевое тесто и частично выпеченное тесто. В случае, когда фермент обладает способностью трансформировать -каротин, он добавляется к пшеничной муке и/или муке другого хлебного злака, или к любой исходной смеси муки с другими компонентами хлеба в таком количестве, чтобы обеспечить количество в интервале от 1 до 5000 ед. Цорна на кг муки, предпочтительно в интервале от 5 до 1000 ед. Цорна на кг муки, более предпочтительно в интервале от 10 до 500 ед. Цорна на кг муки и наиболее предпочтительно в интервале от 25 до 250 ед. Цорна на кг муки. Фермент может также добавляться вместе со смесью или как часть смеси, улучшающей вкус хлеба, с другим тестом и/или добавками, улучшающими технологические характеристики хлеба, известными в данной области техники, такими как один или несколько ферментов, известных в данной области техники (например, амилолитические ферменты, такие как -амилаза, -амилаза, амилоглюкозидаза, мальтогенная -амилаза, препятствующая очерствению хлеба, липолитические ферменты, такие как липаза, фосфолипаза, галактолипаза,окисляющие ферменты, такие как глюкозоксидаза, гексозоксидаза, лакказа, пиранозоксидаза, карбогидратоксидаза, ферменты, разлагающие гемицеллюлозу, такие как ксиланаза, арабинофуранозидаза, ферменты, разлагающие клетчатку, такие как эндоглюканазы (например, целлюлазы), целлобиогидролазы,протеазы и/или химические добавки, способствующие технологической обработке хлеба, известные в данной области техники, такие как окислители (например, аскорбиновая кислота, глютатион), эмульгаторы (например, DATEM) и т.д. Для некоторых типов лапши продукт белого цвета рассматривается как желательный. Промежуточные формы различных видов лапши включают, например, пшеничную муку, исходную смесь муки с водой, солью и другими компонентами лапши, вымешанное тесто и конечное макаронное изделие, которое может быть свежим, высушенным, отваренными, обработанным водяным паром и/или жареным. Пищевой продукт может также представлять собой молочный продукт. Термин молочные продукты означает продукты, которые содержат из расчета на сухое вещество по меньшей мере 10 вес.%,предпочтительно по меньшей мере 30 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 50 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70 вес.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 80 вес.% компонентов молочного происхождения, предпочтительно коровье молоко. Компонентами молочного происхождения являются, например, жиры, белки, например творог сывороточно-альбуминного сыра и казеин и т.д. Молоко, особенно коровье молоко, может содержать природные окрашивающие соединения, такие как каротиноиды, например -каротин. Белизна является важным качественным показателем, например, сыра, сливочного масла, сухого молока или продуктов из молочной сыворотки. Например, в сырах, подобных сыру фета (Feta), сыру моццарелла, сыру рикотта и синему сыру, например датскому голубому сыру, сыру рокфор или сыру-2 011582 горгонзола, белизна рассматривается как желательный показатель качества. В сырах, в которых по меньшей мере часть козьего или овечьего молока заменена коровьем молоком, белизна сыра может быть проблематичной ввиду присутствия в коровьем молоке -каротина. В некоторых сырах в качестве пищевых красителей используются природные красители, такие как аннатто или -каротин. Однако этот краситель будет также присутствовать и в сыворотке. При дальнейшей технологической обработке сыворотки, например, с получением продукта для детского питания, окраска продукта из молочной сыворотки может быть нежелательной. Для пищевого продукта, который представляет собой мягкий сыр, промежуточные продукты включают, например, молоко и сырную массу. Фермент может добавляться в виде ферментного препарата или может продуцироваться in situ ("на месте") микроорганизмом, способным продуцировать указанный фермент. Ферментный препарат может быть получен из различных источников, например, из растений, животных и микроорганизмов. Предпочтительно, ферментный препарат является препаратом, полученным из микроорганизма, так как микроорганизмы дают возможность получать фермент в промышленном масштабе контролируемым способом. Ферментный препарат, полученный с помощью микроорганизма, может быть получен классическими способами ферментации выбранной линии микроорганизмов или ферментацией микроорганизма, который сверхэкспрессирует фермент. Микроорганизм может представлять собой бактерию, гриб или дрожжи. Примерами подходящих микроорганизмов являются Microcystis, Lepista, например L. irina, Cyathus,например С. pallidus, Ganoderma, например G. applanatum, Ischnoderma, например I. benzoinum, Marasmius, например М. scorodonius, Trametes, например T. suaveoluens Т. versicolour, Cryptococcus, например С. laurentii, Hypomyces, например H. odoratus или Phaffia, например P. rhodozyma, Phanerochaete, например P. chrysosporium, Lentinula, например L. edodes, Coprinus, например С. cinereus, Gloeophyllum, например G. trabeum, Ophiostoma, например О. piliferum, Aspergillus, например A. niger, A. oryzae, A. nidulans, Thermomyces, например Т. lanuginosa, Sporotrichum, например S. thermophile, Aureobasidium, например A. pullulans, Amorphotheca, например А. resinae, Leucosporidium, например L. scottii, Cunninghamella,например С. elegans. Измерение белизны продукта можно осуществлять визуально или измерением отражения, например сканированием. При измерении отражения для цвета количественно определяют три параметра: Lфактор (цвет от черного=0 до белого=100), а-фактор (цвет от зеленого=-60 до красного=+60) и b-фактор(цвет от голубого=-60 до желтого=+60). В случае каротиноидов b-фактор полученного продукта предпочтительно стремится к 0, предпочтительно находится в интервале от 10 до 0, более предпочтительно в интервале от 5 до 0, еще более предпочтительно составляет менее 1, наиболее предпочтительно составляет менее 0,5. В соответствии со вторым аспектом изобретение предоставляет пищевой продукт, который может быть получен способом согласно изобретению, как описано выше. Такие пищевые продукты, отличаются тем, что по меньшей мере части таких продуктов обладают значительно большей белизной по сравнению с пищевыми продуктами, полученными способами, которые не включают добавление в промежуточные продукты одного или нескольких ферментов, обладающих способностью трансформировать пигменты. В соответствии с еще одним аспектом, изобретение предоставляет применение ферментов, способных трансформировать пигменты с целью отбеливания пищевых продуктов, например хлебобулочных изделий или продуктов, произведенных из молока. Неожиданно было установлено, что эти ферменты могут полезно использоваться в качестве пятновыводителя в хозяйственных моющих средствах. В частности, доказано, что указанные ферменты очень эффективны в удалении цветных красителей, например травяных пятен, пятен кофе и чая, как с хлопковых, так и с синтетических (например, полиэфирных) тканей. Кроме того, указанные ферменты могли бы также применяться в способах ферментативного отбеливания минеральных красителей, например, для отбеливания индиго-красителя синей джинсовой ткани до желательного уровня. Материалы и методы Измерение конверсии -каротина Измерение деградации -каротина в соответствии со способом Азиза Ферментативная активность может быть определена как активность конверсии -каротина в соответствии с публикацией A. Ben Aziz (1971), Phytochemistry 10, 1445. Одна единица активности фермента в указанной публикации определена как количество фермента, который трансформирует 1 мкг каротина в минуту (называемая далее единица Азиза). Измерение деградации -каротина в соответствии со способом Цорна Ферментативная активность может также быть определена как активность конверсии -каротина в соответствии с публикацией Zorn et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:331-336. Одна единица активности фермента определена здесь как количество фермента, который трансформирует 1 мкмоль каротина в минуту (называемая далее единицей Цорна). Определение активности проводят следующим образом: 1,5 мл образца, содержащего фермент, выдерживают в кювете при 27 С в течение 5 мин, после чего добавляют исходный раствор -каротина (см. ниже). При необходимости концентрированный супернатант культуры разбавляют буфером лимонная кислота/фосфат с рН 5,5 (буфер получают смешени-3 011582 ем 43 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты с 56 мл 2 М раствора Na2PO4). Снижение поглощения света контролируют в течение 15 мин при 450 нм и 27 С с использованием спектрофотометра при температуре, контролируемой держателем элемента. Кривая сверяется с линейным графиком и активность фермента вычисляется для линейной части кривой в соответствии со следующим уравнением: Ферментативная активность [мU/мл] = (EVt)106/(Vsd),где U - единица ферментативной активности, определенная выше; Е - снижение абсорбционной способности при 450 нм в минуту;d - толщина кюветы, см. Активность фермента, выраженная в единицах Азиза, может быть переведена в единицы Цорна делением единиц Азиза на молекулярную массу -каротина, которая равна 536,85. Получение исходного раствора -каротина Исходный раствор -каротина получают следующим образом: 5 мг -каротина и 500 мг Tween-80 растворяют в дихлорметане 50 мл. Дихлорметан испаряют при 40 С и 800 мбар в роторном испарителе. Когда почти весь дихлорметан испаряется, добавляют 30 мл воды, оставшийся дихлорметан испаряют в роторном испарителе и затем в потоке азота. Полученный раствор фильтруют и его объем доводят до 50 мл добавлением воды в мерной колбе. Раствор при хранении в холодильнике стабилен в течение нескольких дней. Отбеливание пищевых продуктов Измерение отбеливания проводят после экстракции каротиноидов из мякиша или теста, как описано в публикации Gelinas, Cereal Chem. 75, 810-184 (1998). Измерение каротиноидов проводят посредством общей экстракции липидов из хлебного мякиша, как описано в указанной выше публикации (Gelinas(1998. Белизна продовольственного продукта может быть определена как визуально, так и с помощью количественного определения. Визуальный контроль может выполняться сравнением пищевых продуктов,к которым добавлен отбеливающий фермент, с контрольными пищевыми продуктами, не содержащими отбеливающего фермента. Измерение отражения может проводиться сканированием пищевого продукта на цветовом сканере (Hewlett Packard ScanJet ADF). Полученные данные могут анализироваться с использованием программного обеспечения LabSMART (LabSMART, LLC, Logan Utah, США). Пример 1. Культивирование и определение активности фермента, полученного из Marasmius scorodonius, в отношении конверсии -каротина. Культивирование и измерение активности -каротин-трансформирующего фермента, полученного из Marasmius scorodonius, проводят в соответствии с описанием, приведенным в публикации Zorn et al.(2003). Кроме того, для инокулирования пластин агара, снабженных эмульгированным -каротином, используют мицелий культуры Marasmius scorodonius (доступной от Centraal Bureau voor Schimmelcultures Utrecht, Нидерланды, депозитарный номер CBS 850.87). Инкубацию пластин проводят при 24 С в течение 14 дней. В колбы шейкера объемом 300 мл, содержащие 100 мл стандартного питательного раствораCuSO45H2O, 80 мг/л FeCl36H2O, 90 мг/л ZnSO47H2O, 30 мг/л MnSO4lH2O и 40 мг/л EDTA; значение рН доводят до 6,0 добавлением 1N NaOH перед стерилизацией) инокулируют мицелием и инкубируют при 24 С в течение 7 дней в инкубаторе при встряхивании со скоростью вращения 150 об./мин. Предварительно полученные культуры проверяют на отсутствие бактериальных загрязнений, гомогенизируют с помощью Ultra Turrax и используют для инокулирования основных культур (250 мл в Колбах Эрленмейера объемом 500 мл). Начиная со второго дня, ежедневно производят отбор образцов объемом 2 мл, центрифугируют их для удаления мицелии, и измерение активности проводят спектрофотометрическим способом. После культивирования в течение 4 дней активность деградации составляет около 0,3 ед. Цорна на литр не содержащего клеток супернатанта. Пример 2 и сравнительные примеры А, В и С. Опыт с использованием булочек. Небольшие булочки выпекают стандартным способом, для чего 200 г пшеничной муки (смесь 160 г пшеничной муки (Kolibri - Meneba, Нидерланды) и 40 г пшеничной муки (Ibis - Meneba, Нидерланды,1,4 г сухих дрожжей Fermipan (DSM Bakery Ingredients, Delff, Нидерланды), 4 г соли, 50 м.д. аскорбиновой кислоты, 4 м.д. грибной a-amylase Bakezyme P500 (DSM Food Specialties, Delff, Нидерланды), 60 м.д. грибной гемицеллюлазы Bakezyme HS2000 (DSM Food Specialties, Delff, Нидерланды), фермент,разлагающий -каротин, количества которого приведены в табл. 1, и 116 мл воды смешивают в миксере в течение 6 мин и 15 с. Температура теста равна 28 С. Сразу после вымешивания тесто делят на две части по 150 г каждая, округляют и расстаивают в течение 45 мин в расстойном шкафу при 30 С, формуют и укладывают на противни. После конечной расстойки в течение 70 мин при 30 С тесто выпекают в тече-4 011582 ние 20 мин при 225 С. После хранения в течение 24 ч в закрытой коробке при комнатной температуре качество хлебного мякиша и цвет выпеченного хлеба оценивает пекарь; количество каротиноидов определяют после экстракции хлебного мякиша, как представлено в табл. 2. Таблица 1 Дозировка фермента (выраженная в ед. Цорна на 200 г муки) Данные, представленные в табл. 2, позволяют сделать вывод, что добавление в тесто отбеливающих ферментов согласно настоящему изобретению приводит к разложению каротиноидов и получению более белого хлебного мякиша. Эффективность способа согласно настоящему изобретению выше, чем эффективность применения соевого фермента липоксигеназы 2 и по меньшей мере равна или выше эффективности применения ферментно активной соевой муки. Получение мини-сыров. Мини-сыры получают в соответствии с методикой, описанной в публикации Shakeel-Ur-Rehman etal., Protocol for the manufacture of miniature cheeses in Lait, 78 (1998), 607-620). Сырое коровье молоко пастеризуют, нагревая до 68 С и выдерживая при этой температуре в течение 30 мин. Пастеризованное молоко переносят в широкогорлые пластиковые центрифужные бутылки (по 200 мл в каждую) и охлаждают до 31 С. Затем в каждую бутылку к 200 мл пастеризованного молока добавляют по 0,72 мл закваскиDS 5LT1 (DSM Gist B.V., Delf, Нидерланды) и молоко оставляют на 20 мин для вызревания. После этого добавляют CaCl2 (132 мкл 1 мольл-1 раствора на 200 мл вызревшего молока) с последующим добавлением коагулянта (0,04 IMCU на мл). В случае, когда эксперимент включает применение отбеливающего фермента I или II, этот фермент добавляют вместе с коагулянтом. Молочные растворы выдерживают в течение 40-50 мин при 31 С до тех пор, пока не образуется сгусток. Сгусток разрезают вручную проволочными ножами, расположенными с интервалом 1 см на корпусе. Массу оставляют для заживления в течение 2 мин, после чего осторожно перемешивают в течение 10 мин. После этого температуру постепенно повышают до 39 С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании смесей творог/сыворотка. После достижения значения рН, равного 6,2, смеси творог/сыворотка центрифугируют при комнатной температуре в течение 60 мин при 1700 G. Сыворотку декантируют и творог выдерживают на водяной бане при 36 С. Сыры откидывают каждые 15 мин со снижением значения рН до 5,2-5,3 и затем центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1700 G. После дополнительного удаления сыворотки отбеливание сыров определяют сканированием. Применение отбеливающих ферментов I и II приводит к получению более белого сыра. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения пищевого продукта, промежуточная форма (полуфабрикат) которого содержит пигмент, предусматривающий добавление по меньшей мере одного фермента, эффективного в непосред-5 011582 ственном превращении указанного пигмента в форму, которая приводит к повышению белизны по меньшей мере части пищевого продукта по сравнению с пищевым продуктом, к которому в процессе его получения указанный фермент не добавлялся; и в котором пищевой продукт изготовлен из муки, предпочтительно пшеничной муки, или в котором пищевой продукт представляет собой молочный продукт, в котором пигмент представляет собой каротиноид. 2. Способ по п.1, в котором фермент добавлен в виде ферментного препарата, который получен из микроорганизма или произведен in situ микроорганизмом, способным продуцировать указанный фермент. 3. Способ по п.2, в котором фермент, добавляемый в качестве ферментного препарата, происходит из бактерий, грибов или дрожжей или продуцируется ими in situ. 4. Способ по п.3, в котором гриб принадлежит к семейству Marasmius, предпочтительно Marasmiusscorodonius. 5. Пищевой продукт, полученный способом по любому из пп.1-4. 6. Применение конвертирующего бета-каротин фермента для повышения белизны по меньшей мере части мучного или молочного пищевого продукта.