Аспарагиназа, полученная из aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин, способ получения пищевого продукта и пищевой продукт.

011438 Настоящая группа изобретений относится к биотехнологическим объектам, используемым в пищевой промышленности для предотвращения образования акриламида в пищевых продуктах. Конкретно,настоящее изобретение относится к новому ферменту, способу его получения, к новой полинуклеотидной последовательности, содержащей ген, кодирующий новый фермент, способу наработки полинуклеотида, вектору, клетке-хозяину, способу производства пищевого продукта с новым ферментом и соответствующим пищевым продуктам. Коммерческое производство акриламида для различных технических применений существует уже в течение длительного времени, поэтому его токсическое воздействие хорошо изучено. Акриламид используется для получения полиакриламида, который используется при получении питьевой воды, для стабилизации почвы, для обработки промышленных сточных вод, для добычи нефти и используется в лаборатории. Считается, что акриламид является канцерогеном для человека и животных. В 1991 году Научный Комитет по пищевым продуктам исследовал мономерный акриламид в контактных пищевых материалах и в его оценке был сделан вывод, что акриламид является генотоксичным канцерогеном. Bergmark et al.(Chem. Res. Toxicol., 10, 78-84 (1997 показал, что акриламид также является компонентом табачного дыма и это была первая связь между образованием акриламида и нагреванием биологических материалов. Недавно было опубликовано, что акриламид встречается в ряде пищевых и выпечных продуктов(Tareke et al. Chem. Res. Toxicol. 13, 517-522 (2000, что вызвало всеобщее беспокойство. Дальнейшие исследования показали, что значительное количество акриламида обнаруживается в различных выпечных, жареных и приготовленных в духовке обычных продуктах, и было показано, что акриламид в продуктах появился в результате процесса выпекания. Официальное ограничение в Соединенном Королевстве на примеси акриламида в пищевых продуктах составляет 10 ppb (10 млрд. долей или 10 мкг на 1 кг), но указанные значения значительно превысили эту величину у множества продуктов, особенно зерновых закусок, выпечных продуктов и картофельных чипсов. Зависимость между введенной дозой акриламида и частотой возникновения опухолей изучалась в тестах на животных, в которых крысы пили воду, содержащую акриламид, и погибали в течение двух летPharmacol. 85:154-168 (1986. Хроническая токсичность и онкогенность изучалась на 344 крысах Фишера, в питьевую воду которым был введен акриламид. Когда эти данные были объединены с результатами, собранными Takere et al., в которых акриламид,связанный с гемоглобином (N-(2-карбамоилэтил)валин) был изучен как функция от акриламидсодержащего питания крыс, было рассчитано, что дневное потребление акриламида, составляющее 1,6 мкг акриламида/кг, соответствует риску возникновения рака 710-3 для людей в течение длительного времени воздействия. Путь образования акриламида из аминокислот и восстанавливающих сахаров в результате реакции Майяра был предложен Mottram et al. Nature 419-448 (2002). В соответствии с этой гипотезой акриламид может образоваться в ходе реакции Майяра. В ходе выпекания и поджаривания реакция Майяра главным образом ответственна за цвет, запах и вкус. Был предложен путь образования акриламида в ходе реакции Штреккера деградации аминокислот, ассоциированной с реакцией Майяра. Образование акриламида становилось обнаружимым, когда температура превышает 120 С, а наибольшая скорость образования наблюдалась около 170 С. Наибольший уровень акриламида можно было наблюдать в присутствии аспарагина и глюкозы, тогда как глутаминовая и аспарагиновая кислота приводили только к следовым количествам. Тот факт, что акриламид образуется главным образом из аспарагина и глюкозы, может объяснить высокое содержание акриламида в приготовленных в духовке или поджаренных растительных продуктах. Известно, что некоторые сырые растительные материалы содержат значительный уровень аспарагина. В картофеле аспарагин является доминирующей свободной аминокислотой (940 мг/кг соответствует 40% от общего количества аминокислот) и в пшеничной муке содержание аспарагина на уровне около 167 мг аспарагина/кг муки соответствует 14% от общего содержания свободных аминокислот(Belitz и Grosch in Food Chemistry - Springer New York, 1999). Поэтому в интересах общественного здоровья существует насущная потребность в пищевых продуктах, которые имеют значительно более низкое содержание акриламида или, что предпочтительнее, не содержат его совсем. В первом случае исследования были начаты с целью определения механизма образования акриламида в пищевых продуктах. Эти результаты пока еще не привели к удовлетворительному решению этой проблемы. Во-вторых, пищевые компании исследуют возможность избежать образования акриламида посредством снижения температуры в печи и в процессе обжаривания. Конечно, эти адаптации неизбежно приведут к пищевым продуктам с измененными вкусовыми свойствами (меньше продуктов реакции Майяра), и эти адаптации повысят риск микробного загрязнения, например сальмонеллой. Настоящее изобретение предлагает решение этой проблемы путем введения в пищевой продукт нового фермента - выделенной из Aspergillus niger аспарагиназы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или аспарагиназы, последовательность которой гомологична указанной по-1 011438 меньшей мере на 80%. Следующими объектами изобретения являются выделенные полинуклеотиды, кодирующие указанную аспарагиназу. Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. Выделенный полинуклеотид получают из нитчатых грибов, в частности из Aspergillus niger. Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. Выделенный полинуклеотид, кодирующий указанную аспарагиназу, может иметь последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. Выделенный полинуклеотид может кодировать по меньшей мере один функциональный домен указанной аспарагиназы. Следующим объектом изобретения является вектор, содержащий любой из указанных полинуклеотидов. В этом векторе указанный полинуклеотид может быть оперативно соединен с регуляторными последовательностями, пригодными для экспрессии указанного полинуклеотида в подходящей клеткехозяине. В этом векторе, в частности, подходящая клетка-хозяин может быть нитчатым грибом, а именноAspergillus niger. Одним из объектов является аспарагиназа, полученная путем экспрессии вышеперечисленных полинуклеотидов и вектора в подходящей клетке-хозяине, например Aspergillus niger. Другим из объектов является рекомбинантная аспарагиназа, содержащая функциональный домен вышеупомянутой аспарагиназы. Способ получения заявленной аспарагиназы предусматривает стадии трансформации подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом или вектором; культивирования указанной клетки в условиях, позволяющих экспрессию указанных полинуклеотидов; и, возможно, очистки кодируемых полипептидов из указанной клетки или культуральной среды. Способ наработки вышеупомянутого полинуклеотида или вектора предусматривает стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором,и выделения указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина. Следующими объектами являются рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вышеупомянутый полинуклеотид или вектор, и рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид, представляющий собой указанную аспарагиназу. Следующими объектами являются способ производства пищевого продукта и пищевой продукт,полученный по этому способу. Способ производства пищевого продукта включает по меньшей мере одну стадию нагревания, предусматривающий добавление указанной аспарагиназы к полуфабрикату указанного пищевого продукта,причем аспарагиназу добавляют до указанной стадии нагревания в количестве, эффективном для снижения содержания аминокислот, присутствующих в указанном полуфабрикате пищевого продукта и вовлеченных в образование акриламида в течение указанной стадии нагревания. Пищевой продукт получают по меньшей мере из одного сырьевого растительного материала. Таким сырьевым растительным материалом является зерновая мука, предпочтительно пшеничная мука, альтернативно картофель. Промежуточная форма пищевого продукта означает здесь любую форму, встречающуюся в процессе производства до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма или полуфабрикат может включать отдельное используемое сырье, и/или их смесь, и/или смеси с добавками,и/или вспомогательные добавки, или их впоследствии обработанную форму. Например, для приготовления хлеба промежуточные формы включают, например, пшеницу, пшеничную муку, их первоначальную смесь с другими хлебными ингредиентами, такими как, например, вода, соль, дрожжи и добавки, улучшающие хлеб, смесь для теста, замешанное тесто, заквашенное тесто и частично выпеченное тесто. Пищевой продукт может быть выполнен по меньшей мере из одного сырого растительного материала, например картофеля, табака, какао, риса; из зерновых, например пшеницы, ржи, кукурузы, маиса,ячменя, овсяной крупы, гречихи и овса. Пшеница здесь и ниже охватывает все известные сортаTriticum genus, например aestivum, durum и/или spelta. Пищевые продукты более чем из одного сырьевого материала также включены в объем этого изобретения, например пищевые продукты, содержащие как пшеницу (муку), так и картофель. Примерами пищевых продуктов, для которых пригоден способ по изобретению, являются любые мучные продукты, например хлеб, кондитерские изделия, торты, крендели, бублики; голландские медовые пирожки, булочки, имбирные пряники и хрустящие хлебцы, а также любые продукты на основе картофеля, например французский картофель, пом-фрит, картофельные чипсы, крокеты. Сырьевые материалы, описанные выше, содержат значительные количества аминокислот, вовлеченных в образование акриламида во время стадии нагревания в процессе получения продукта. Альтернативно, эти аминокислоты могут происходить из других источников, чем исходное сырье, например из белковых гидролизатов, таких как дрожжевой экстракт, соевые гидролизаты, казеиновые гидролизаты и т.п., которые используют в качестве добавок в процессе получения пищи. Предпочтительным производ-2 011438 ственным процессом является выпекание хлеба и других хлебобулочных изделий из пшеничной муки и/или из муки, полученной из других зерновых культур. Другим предпочтительным производственным способом является обжаривание во фритюре картофельных чипсов из ломтиков картофеля. Предпочтительная стадия нагревания предусматривает, что по меньшей мере на часть промежуточного пищевого продукта, например на его поверхность, воздействует температура, которая способствует образованию акриламида, например, 110 С или выше, 120 С или выше. Стадия нагревания в способе по изобретению может быть проведена в печи, например, при температуре 180-220 С для выпекания хлеба и других мучных продуктов или в масле для поджаривания картофельных чипсов, например, при 160-190 С. Ферменты, используемые в способе по изобретению, предпочтительно являются ферментами, которые модифицируют боковые цепи аминокислот, участвующих в образовании акриламида во время термообработки в процессе производства, при этом продукты деградации указанных соединений не приводят или, по крайней мере, в меньшей степени приводят к образованию акриламида по сравнению с исходными формами аминокислот. Предпочтительно фермент модифицирует боковую цепь по меньшей мере одной из аминокислот: аспарагина, глутамина, цистеина, метионина, пролина, серина, фенилаланина, тирозина и/или триптофана. Фермент может быть добавлен в виде препарата фермента или может продуцироваться на месте микроорганизмами, способными продуцировать указанный фермент. Предпочтительно ферментативный препарат выделяют из микроорганизмов и получают в процессе ферментации. Микроорганизмом могут быть бактерии, грибы или дрожжи. В предпочтительном варианте изобретения способ предусматривает добавление аспарагиназы (ЕС 3.5.1.1) или глутаминазы (ЕС 3.5.1.2). Аспарагиназа может быть получена из различных источников, таких как, например, растения, животные или микроорганизмы, например Escherichia, Erwinia, Streptomyces, Pseudomonas, Aspergillus иBaccillus. Примером подходящего вида Escherichia является Escherichia coli. Примером подходящего вида Erwinia является Erwinia chrysanthemi. Примером подходящего вида Streptomyces является Streptomyces lividans или Streptomyces murinus. Примерами подходящих видов Aspergillus являются Aspergillusoryzae, Aspergillus nidulans или Aspergillus niger. Примерами подходящих видов Bacillus являются Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megateruim, Bacillus stearothemophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis. Примеры подходящих способов получения аспарагиназы из штаммов Bacillus,Streptomyces, Escheria или Pseudomonas описаны в WO 03/083043. Однако в WO 03/083043 не показано использование аспарагиназы для уменьшения количества акриламида в пище, как описано в настоящем изобретении. Предпочтительно использовать пищевые организмы, например Aspergillus niger или Bacillus subtilis. Согласно второму объекту изобретение предлагает новые полинуклеотидные последовательности,содержащие гены, которые кодируют новую аспарагиназу, которая, например, может быть получена изAspergillus niger. Новая аспарагиназа может быть использована в способе производства пищевых продуктов по изобретению, например, для получения выпечного продукта из теста. Полинуклеотиды. Изобретение также обеспечивает новые полинуклеотиды, кодирующие новые аспарагиназные ферменты. Настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие аспарагиназу, предварительно названную ASPA01, имеющую аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO:3 или ее функциональные эквиваленты. Последовательность гена, кодирующего ASPA01, была определена путем секвенирования геномного клона, полученного из Aspergillus niger. Изобретение обеспечивает полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий ASPA01 аспарагиназу, а также полную последовательность ее кДНК и кодирующую ее последовательность. Соответственно, изобретение касается выделенного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность согласноSEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или ее функциональные эквиваленты. В частности, изобретение касается выделенного полинуклеотида, спообного гибридизироваться в строгих условиях, предпочтительно в очень строгих условиях с полинуклеотидом согласно SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Предпочтительно такие полинуклеотиды могут быть получены из нитчатого гриба, в частности из Aspergillus niger. Конкретнее, изобретение относится к выделенному полинуклеотиду,имеющему нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Изобретение также касается выделенного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно SEQ ID NO:3 или его функциональный эквивалент. Как использовано здесь, термин ген и рекомбинантный ген означает молекулы нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которая включает открытую рамку считывания, кодирующую белок, например аспарагиназу A.niger. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Кроме того, ген означает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, как она определена здесь.-3 011438 Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, например молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или ее функциональный эквивалент, может быть выделена с использованием стандартной технологии молекулярной биологии и представленной здесь информации о последовательности. Например, используя всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 или нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 в качестве зонда для гибридизации, молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут быть выделены с использованием стандартной технологии гибридизации и клонирования (например, как описано вLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая всю или часть последовательностиSEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, может быть выделена с использованием полимеразной цепной реакции(ПЦР) с использованием синтетических праймеров, сконструированных на основе последовательностей,содержащихся в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК,мРНК или, с другой стороны, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартной технологией ПЦР-амплификации. Амплифицированная нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована с помощью анализа ДНК-последовательности. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизирующиеся с нуклеотидной последовательностью по изобретению, могут быть получены с использованием стандартной технологии синтеза,например с использованием автоматического ДНК синтезатора. В предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2. Последовательность SEQ ID NO:2 соответствует кодирующей области ASPA01 кДНК A.niger. Эта кДНК содержит последовательность, кодирующуюASPA01 полипептида A.niger согласно SEQ ID NO:3. В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательностиSEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или функциональным эквивалентам этих нуклеотидных последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная другой нуклеотидной последовательности, - это молекула, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности для ее гибридизации с этой другой нуклеотидной последовательностью, образуя таким образом стабильный дуплекс. Один объект изобретения касается выделенных молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также молекулы нуклеиновой кислоты, достаточные для использования в качестве гибридизационных проб для нахождения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептиды по изобретению, и фрагменты таких молекул нуклеиновой кислоты, пригодные для использования в качестве праймеров для ПЦР-амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты. Выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота - это ДНК или РНК, которая не граничит непосредственно с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она может быть непосредственно смежной (одна на 5' конце и одна на 3' конце) в природном геноме организма, из которого она была выделена. Таким образом, в одном варианте выделенная нуклеиновая кислота включает все или некоторые 5'-некодирующие (например, промоторные) последовательности, которые непосредственно граничат с кодирующей последовательностью. Поэтому термин включает, например, встроенную в вектор рекомбинантную ДНК в автономно реплицирующейся плазмиде или вирусе, или в геномную ДНК прокариотов или эукариотов, или которые существуют как отдельные молекулы (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный с помощью ПЦР или после обработки рестрикционными эндонуклеазами), независимо от других последовательностей. Этот термин также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который в значительной степени свободен от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (когда его получают с использованием технологии рекомбинатной ДНК) или химических предшественников или других реагентов (когда его синтезируют химически). Кроме того, выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты - это фрагмент нуклеиновой кислоты, который не встречается в естественных условиях в качестве фрагмента и не может быть обнаружен в естественном состоянии. Термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты означают здесь, что они включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, созданные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием нуклеотидных аналогов или производных(например, инозина или фосфорно-тиолатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют основания с измененными свойствами образования пар или повышенной устойчивостью к нуклеазам.-4 011438 Другой вариант изобретения обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой к молекуле нуклеиновой кислоты ASPA01, например к кодирующей цепи молекулы нуклеиновой кислоты ASPA01. В объем изобретения также включены комплементарные цепочки молекул нуклеиновых кислот, указанных здесь. Ошибки секвенирования. Информацию о последовательностях, приведенную здесь, не следует понимать в узком смысле изза возможного наличия ошибочно определенных оснований. Конкретные последовательности, раскрытые здесь, могут быть легко использованы для выделения полного гена из нитчатого гриба, в особенности из A.niger, который может быть подвергнут дальнейшему анализу последовательности, с определением при этом ошибок секвенирования. Если не указано другое, то все нуклеотидные последовательности, определенные путем секвенирования ДНК, получены с использованием автоматического ДНК-секвенатора и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые ДНК молекулами, определенными здесь, предсказаны путем транслирования последовательности ДНК, определенной, как указано выше. Как известно, в любой последовательности ДНК, определенной с помощью автоматического ДНК-секвенатора, может содержаться некоторое количество ошибок. Нуклеотидные последовательности, определенные с помощью автомата, обычно являются по меньшей мере примерно на 90%, чаще от по меньшей мере около 95% до по меньшей мере около 99,9% идентичными действительной нуклеотидной последовательности секвенируемой молекулы ДНК. Исходная последовательность может быть более точно определена с использованием других методов, включая хорошо известное в данной области ручное секвенирование. Как также известно, единственная вставка (инсерт) или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с исходной последовательностью приведет к сдвигу рамки считывания нуклеотидной последовательности таким образом, что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет совершенно отличаться от аминокислотной последовательности, в действительности кодируемой секвенируемой молекулой ДНК, начиная от инсерта или делеции. Специалист способен выявить такие ошибочно определенные основания и знает, как исправить такие ошибки. Фрагменты нуклеиновых кислот, зонды и праймеры. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, например фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка ASPA01. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонированного гена ASPA01 и кДНК, позволяет создать зонды и праймеры для использования при определении или/и клонировании других членов семейства ASPA01, а также гомологов ASPA01 из других видов. Зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид, обычно содержащий область нуклеотидной последовательности, которая хорошо гибридизируется в строгих условиях к по меньшей мере около 12 или 15,предпочтительно около 18 или 20, предпочтительно около 22 или 25, еще предпочтительнее около 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или более последовательным нуклеотидам нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или их функциональных эквивалентов. Зонды, основанные на нуклеотидных последовательностях ASPA01, могут быть использованы для определения транскриптов или геномных последовательностей ASPA01, кодирующих те же или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительном варианте эти зонды содержат меченые группы, прикрепленные к ним, например меченая группа может быть меченым изотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или ферментативным кофактором. Такие зонды могут быть использованы в качестве составной части диагностического набора для идентификации клеток, которые экспрессируют белок ASPA01. Идентичность и гомология. Термин гомология или процент идентичности используется здесь взаимозаменяемо. Для целей этого изобретения здесь считается, что для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей эти последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в первую нуклеотидную или аминокислотную последовательность могут быть введены пробелы для оптимального выравнивания второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как и соответствующая позиция во второй последовательности, тогда в этой позиции молекулы идентичны. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных позиций в обеих последовательностях (например,% идентичности = количество идентичных позиций/общее количество позиций (например, перекрывающихся позиций)100). Предпочтительно последовательности имеют одинаковую длину. Специалисту известно несколько различных компьютерных программ, способных определить степень гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и опре-5 011438 деление степени идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математических алгоритмов. В предпочтительном варианте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman и Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970, включенного в программу GAP в программном пакете GCG (доступен на http://www.gcg.com), использующий матрицу Blossom 62 или матрицу РАМ 250, и с размером пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и размером отрезка 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалист поймет, что все эти различные параметры приведут к слегка различным результатам, но общий процент идентичности двух последовательностей не будет значительно отличаться при использовании различных алгоритмов. В еще одном варианте процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в программном пакете GCG (доступен наhttp://www.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и с размером пробела 40, 50, 60, 70 или 80 и размером отрезка 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Meyers иhttp://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) с использованием весовой таблицы остатков РАМ 120, штрафная длина пробела 12 и штрафной пробел 4. Последовательности белков и нуклеиновых кислот по изобретению также могут использоваться в качестве запрашиваемой последовательности при поиске по открытым базам данных, например для поиска других членов семейства или сходных последовательностей. Такие поиски могут быть осуществлены с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10. Поиск по нуклеотидам BLAST может быть осуществлен программой NBLAST, коэффициент = 100, длина слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты ASPA01 по изобретению. Белковый поиск BLAST может быть осуществлен с программой XBLAST, коэффициент = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам ASPA01 по изобретению. Для выравнивания молекул с использованием пробелов с целью сравнения может быть использован Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. При использовании программ BLAST иGapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http:/www.ncbi.nlm.nih.gov. Гибридизация. Как здесь используется, термин гибридизация подразумевает описание условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности, имеющие по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 70%, более предпочтительно по меньшей мере около 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере около от 85 до 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% гомологии по отношению друг к другу, обычно остаются гибридизированными друг к другу. Предпочтительным, но не ограничивающим примером такой гибридизации является гибридизация в 6 хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при около 45 С с последующей промывкой один или более раз в 1 SSC, 0,1% SDS при 50 С, предпочтительно при 55 С, предпочтительно при 60 С, еще предпочтительнее при 65 С. Очень строгие условия включают, например, гибридизацию при 68 С в 5 SSC/5 растворе Денхардта/1,0% SDS и промывку в 0,2 SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. Альтернативно,промывка может быть проведена при 42 С. Специалисту также известно, какие условия нужно использовать для гибридизации в жестких и очень жестких условиях. Дополнительные указания в отношении таких условий легко доступны, например, из Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. иAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотиды, которые гибридизуются только к поли-А последовательности (такой как 3'-концевая поли-(А) последовательность мРНК) или к комплементарным отрезкам Т (или U) остатков,не могут быть включены в полинуклеотиды по изобретению, используемые для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, поскольку такие полинуклеотиды могут гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли-(А) хвост или его комплемент (например, практически любой двухцепочечный клон кДНК). Выделение ДНК полной длины из других организмов. При обычном подходе может быть проведен скрининг библиотек кДНК других организмов, например нитчатого гриба, в частности, рода Aspergillus. Например, с помощью Нозерн-блоттинга можно провести поиск гомологов полинуклеотидаASPA01 в штамме Aspergillus. При обнаружении транскриптов, гомологичных полинуклеотидам по изобретению, библиотеки кДНК могут быть созданы из РНК, выделенной из подходящего штамма, используя стандартные технологии, известные специалисту. Альтернативно, можно провести скрининг всей геномной библиотеки ДНК с использованием зонда, способного гибридизироваться к полинуклеотидуASPA01 по изобретению. Гомологичные генные последовательности могут быть выделены, например, с использованием ПЦР и двух пулов праймеров вырожденных олигонуклеотидов, последовательность которых основана на нуклеотидных последовательностях, приведенных здесь. Шаблоном для реакции может служить кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, которые, как известно или предположительно, экспрессируют полинуклеотиды по изобретению. ПЦР-фрагмент может затем быть клонирован и секвенирован для подтверждения, что амплифицированная последовательность представляет собой новую нуклеотидную последовательностьASPA01 или его функциональный эквивалент. ПЦР-фрагмент может затем использоваться для выделения клона полных последовательностей кДНК с использованием различных известных методов. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофагов или космид. Альтернативно, меченый фрагмент может использоваться для скрининга геномной библиотеки. Технология ПЦР может использоваться для выделения полной последовательности кДНК из других организмов. Например, РНК может быть выделена с использованием стандартных процедур, из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть осуществлена на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного к большей части 5' конца амплифицированного фрагмента для начала синтеза первой цепи. Образовавшийся в результате гибрид РНК/ДНК может быть достроен (например, гуанинами) с использованием стандартной концевой трансферазной реакции, гибрид может быть расщеплен с использованием РНазы Н, а затем может быть инициирован синтез второй цепи (например, поли-С праймером). Таким образом, кДНК последовательности, расположенные перед амплифицированным фрагментом,могут быть легко получены. Для обзора полезных стратегий клонирования, см. выше, например,Sambrook et al. и Ausubel et al. Кодирует ли гомологичный фрагмент ДНК или нет функциональный белок ASPA01, может быть легко установлено известными в данной области методами. Векторы. Еще один объект изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессионным векторам,содержащим нуклеотидную кислоту, кодирующую белок ASPA01 или его функциональный эквивалент. Как использовано здесь, термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она была присоединена. Одним типом вектора является плазмида, которая означает кольцевую замкнутую двухцепочечную ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, когда добавочная ДНК лигирована в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клеток-хозяев после введения в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с клеточным геномом. Кроме того, некоторые векторы способны экспрессировать гены, к которым они лигированы. Такие векторы называются здесь экспрессионными векторами. Наиболее часто в технологии рекомбинантной ДНК экспрессионные векторы используют в виде плазмид. Термины плазмида и вектор могут быть использованы здесь взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее используемой формой вектора. Однако подразумевается, что изобретение включает другие формы экспрессионных векторов, такие как вирусные векторы (например, реплицирующиеся измененные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые служат для тех же целей. Рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению содержат нуклеиновую кислоту изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, это означает, что рекомбинантный экспрессионный вектор включает одну или более регуляторных последовательностей,выбранных на основе клетки-хозяина, используемой для экспрессии, которые оперативно присоединяются к экспрессируемой последовательности нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессионном векторе оперативное присоединение означает, что требуемая нуклеотидная последовательность присоединяется к регуляторным(ому) элементам(у) таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе транскрипции/трансляции, или в клеткехозяине, когда вектор вводят в клетку-хозяина). Термин регуляторная последовательность охватывает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene ExpressionTechnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и те, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалисту будет понятно, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и-7 011438 т.д. Экспрессионные векторы по изобретению могут вводиться в клетки-хозяева для получения белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, как описано здесь (например, белка ASPA01, мутантных форм белка ASPA01, фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов и т.д.). Рекомбинантный экспрессионный вектор по изобретению может быть сконструирован для экспрессии белков ASPA01 в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок ASPA01 может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как E.coli, клетках насекомых (с использованием экспрессионных векторов на основе бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева подробно описаны в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). С другой стороны, рекомбинантный экспрессионный вектор может быть подвергнут транскрипции и трансляции in vitro, например, с использованием Т 7 промотора и Т 7 полимеразы. Экспрессионные векторы, полезные в настоящем изобретении, включают хромосомальные, эписомальные или вирусные векторы, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы вакцинии, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы,и векторы, полученные из их комбинаций, такие как космиды и фагемиды, полученные из комбинации генетических элементов плазмид и бактериофагов. ДНК-инсерт должен быть оперативно соединен с подходящим промотором, таким как промотор PL фага лямда, lac, trp, tac промоторы E.coli, ранние и поздние промоторы SV40 и некоторое количество ретровирусных LTR промоторов. Другие подходящие промоторы известны специалисту. Особенно предпочтительны промоторы, которые позволяют обеспечить высокий уровень экспрессии аспарагиназы в нитчатых грибах. Такие промоторы известны. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелого транскрипта, экспрессируемого этой конструкцией, будет включать инициатор трансляции AUG в начале и терминирующий кодон в конце транслируемого полипептида. Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычной технологии трансформации и трансфекции. Предполагается, что используемые здесь термины трансформация и трансфекция относятся к различным методам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая кальций-фосфатное и кальций-хлоридное совместное осаждение, трансфекция с помощью ДЭАЭ-декстрана, трансдукция, инфицирование, липофекция,катионно-липидная трансфекция или электропорация. Подходящие методы для трансформирования или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и в других лабораторных руководствах. Известно, что при стабильной трансфекции клеток млекопитающих в зависимости от экспрессионного вектора и метода трансфекции, чужеродная ДНК может встроиться в геном только небольшого количества клеток. Чтобы определить и выделить эти встроенные элементы, ген, кодирующий селективный маркер (например, устойчивость к антибиотикам), обычно вводят в клетку-хозяина наряду с интересующим геном. Предпочтительными селекционными маркерами являются те, которые кодируют устойчивость к лекарствам, такие как G418, гидромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селективные маркеры, может быть введена в клетку-хозяина в том же векторе, который кодирует белокASPA01, или может быть введена в отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть отобраны по устойчивости к лекарствам (например, клетки, в которые встроен ген селективного маркера, выживут, тогда как другие клетки погибнут). Экспрессию белков в прокариотах зачастую осуществляют в клетках Е.coli с помощью векторов,содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, контролирующие экспрессию белков. Как уже сказано, предпочтительно, чтобы экспрессионные векторы содержали селективные маркеры. Для культуры эукариотических клеток такими маркерами являются дегидрофолат редуктаза или устойчивость к неомицину и тетрациклиновая или ампицилиновая устойчивость для Е.coli и других бактерий. Характерными примерами подходящих хозяев являются бактериальные клетки, такие как Е.coli,Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие какDrosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, таких как СНО, COS и меланома Бовеса; и клетки растений. Подходящая культуральная среда и условия культивирования для вышеупомянутых клеток-хозяев известны. Предпочтительными векторами для использования в бактериях являются pQE70, pQE60 и PQE-9,доступные от Qiagen; pBS векторы, Phagescript векторы, Bluescript векторы, pNH8A, pNH16A, pNH18A,pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 доступные отPharmacia. Предпочтительными эукариотическими векторами являются PWLNEO, pSV2CAT, pOG44,pZT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы могут быть легко оценены специалистом.-8 011438 Среди известных бактериальных промоторов для использования в настоящем изобретении подходят lacI и lacZ промоторы Е.coli, Т 3 и Т 7 промоторы, gpt промотор, лямбда промоторы PR, PL и trp промотор, промотор тимидинкиназы HSV, ранние и поздние промоторы SV40, LTR промоторы ретровирусов, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и металлотионеиновые промоторы, такие как металлотионеиновый промотор-I мыши. Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды по изобретению в высших эукариотах, может быть усилена за счет вставки энхансерных последовательностей в вектор. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, действующими в пределах от 10 до 300 bp (пар оснований) для усиления транскрипционной активности промотора данного типа клетки-хозяина. Примеры энхансеров включают SV40 энхансер, который расположен в поздней области инициации репликации между 100 и 270 bp(пар оснований), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы из поздней области инициатора репликации, энхансеры аденовирусов. Для секреции транслируемых белков в люмен эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение подходящий секреторный сигнал может быть вставлен в экспрессируемый полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерогенными. Полипептиды могут быть экспрессированы в модифицированной форме и могут включать не только секреторный сигнал, но и также добавочные функциональные гетерологичные области. Такие как,например, область добавочных аминокислот, особенно заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для увеличения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующих манипуляций и хранения. Также фрагменты пептидов могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки. Полипептиды по изобретению. Изобретение предлагает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO:3, аминокислотную последовательность, полученную экспрессией полинуклеотидаSEQ ID NO:3 в подходящем хозяине, а также аминокислотную последовательность, полученную экспрессией полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 в подходящем хозяине. Также пептиды или полипептиды, содержащие функциональные эквиваленты вышеприведенных полипептидов, включены в настоящее изобретение. Вышеприведенные полипептиды охвачены выражением полипептиды по изобретению. Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (что общепризнано) и каждый из них может использоваться взаимозаменяемо, в зависимости от контекста, для указания цепи по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидной связью. Слово полипептид используется здесь для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы олигопептидов, или полипептидов, или последовательности написаны здесь справа налево в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Однобуквенное обозначение аминокислот, используемое здесь, широко известно и может быть найдено в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Подразумевается, что выделенный полипептид или белок является полипептидом или белком,выделенным из природного источника. Например, рекомбинантно полученные полипептиды и белки,экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для целей изобретения как природные или рекомбинантные полипептиды, по существу, очищенные с использованием любой подходящей технологии, такой как, например, одностадийный метод очистки, описанный Smith и Johnson, Gene, 67:31-40(1988). Аспарагиназа ASPA01 по изобретению может быть получена и очищена из культуры рекомбинантных клеток хорошо известными методами, включающими осаждением сульфатом аммония или этанолом, кислая экстракция, анионно- или катионнообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография, хроматография на гидроксиапатите и хроматография с использованием лектина. Наиболее предпочтительной для выделения является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Полипептиды по изобретению включают естественно очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантной технологией из прокариотических или эукариотических хозяев, включающих, например, бактерии, дрожжи, высшие растения, насекомые и клетки млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого для получения рекомбинантных продуктов, полипептиды по изобретению могут быть либо гликозилированы, либо нет. Помимо этого, в некоторых случаях в результате процессов в клетке-хозяине полипептиды по изобретению могут включать инициирующий модифицированный остаток метионина. Фрагменты белков. Изобретение также касается биологически активных фрагментов полипептидов по изобретению. Биологически активные фрагменты полипептида по изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или полученные из аминокислотной последовательности белка ASPA01 (например, аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3),-9 011438 которые включают меньше аминокислот, чем белок полной длины, и обладают по меньшей мере одной биологической активностью соответствующего белка полной длины. В основном биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка ASPA01. Биологически активный фрагмент белка по изобретению может быть полипептидом, который содержит, например, 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот. Кроме того, другие биологически активные части, в которых удалены другие области белка, могут быть получены с помощью рекомбинантной техники и оценены на наличие одной или нескольких биологических активностей исходной формы полипептида по изобретению. Изобретение также включает фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные выше активные фрагменты белка ASPA01. Функциональные эквиваленты. Термин функциональные эквиваленты и функциональные варианты используются здесь взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК ASPA01 являются выделенными фрагментами ДНК,которые кодируют полипептиды, которые проявляют специфическую активность аспарагиназы ASPA01A.niger, как описано здесь. Функциональные эквиваленты полипептида ASPA01 по изобретению являются полипептидами, которые обладают по меньшей мере одной функцией аспарагиназы A.niger, как описано здесь. Функциональные эквиваленты также включают биологически активные фрагменты. Эквиваленты функциональных белков или полипептидов могут содержать только консервативные замены одной или более аминокислот SEQ ID NO:3 или замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Следовательно, несущественными аминокислотами являются остатки, которые могут быть изменены в SEQ ID NO:3 без значительного изменения биологической активности. Например, остатки аминокислот, которые консервативны среди белков ASPA01 настоящего изобретения, по-видимому, не подвержены изменениям. Более того, аминокислоты, консервативные среди белков ASPA01 в соответствии с настоящим изобретением и других аспарагиназ, вероятно, не подвержены изменениям. Подразумевается, что термин консервативная замена обозначает замену, в которой остаток аминокислоты заменен остатком аминокислоты, обладающим сходной боковой цепью. Эти семейства известны и включают аминокислоты с основной боковой цепью (например, лизин, аргинин и гистидин),кислой боковой цепью (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярной боковой цепью (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин,триптофан), бета-разветвленной боковой цепью (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматической боковой цепью (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты могут обычно содержать молчащие мутации или мутации, которые не влияют на биологическую активность кодируемых полипептидов. Таким образом, изобретение предоставляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки ASPA01, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, не существенные для целевой биологической активности. Такие ASPA01-белки по своей аминокислотной последовательности отличаются от SEQ ID NO:3,однако все еще сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в которой белок содержит в значительной степени гомологичную аминокислотную последовательность с, по меньшей мере около, 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:3. Например, указания относительно выполнения фенотипически незаметной аминокислотной замены есть в Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990), в котором автор указывает, что существует два подхода для изучения толерантности аминокислотных последовательностей к изменению. Первый метод основан на процессе эволюции, при котором мутации либо сохраняются, либо удаляются в процессе естественного отбора. Второй подход использует генную инженерию для введения аминокислотных изменений в нужную позицию клонированного гена и селекции или поиска для нахождения последовательностей, которые сохраняют функциональность. Как утверждают авторы, эти исследования показали, что белки удивительно толерантны к аминокислотным заменам. Авторы, кроме того, указывают, какие изменения в определенной позиции белка, вероятно, будут допустимы. Например, большинство углубленных аминокислотных остатков требует неполярных боковых цепей, тогда как лишь немногие признаки боковых цепей на поверхности являются консервативными. Другие такие фенотипически незаметные мутации описаны выше в Bowie et al. и в ссылках, цитируемых в этой публикации. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ASPA01-белок, гомологичный белку согласно SEQ ID NO:3, может быть получена с помощью введения одной или нескольких нуклеотидных замен, вставок или делеций в кодирующую нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, так что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводятся в кодирующий полипептид. Такие мутации могут быть введены с использованием стандартных методов,таких как сайт-направленный мутагенез и мутагенез с использованием ПЦР. Термин функциональные эквиваленты включает также ортологи белка ASPA01 A.niger. Ортологами белка A.niger ASPA01 являются белки, которые могут быть выделены из других штаммов или ви- 10011438 дов и обладающие сходной или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть легко определены по аминокислотной последовательности, в значительной степени гомологичнойSEQ ID NO:3. Как определено здесь, термин значительная гомология относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов по отношению ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности таким образом, что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности обладают общим доменом. Например,аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, обладают около 40%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, еще более предпочтительно 75, 80, 85, 90,95, 96, 97, 98 или 99% идентичности или более, как определено здесь как достаточная идентичность. Нуклеиновые кислоты, кодирующие других членов семейства ASPA01, которые обладают нуклеотидной последовательностью, отличающейся от SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, также входят в объем изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ASPA01 из различных видов, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, также входят в объем изобретения. Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологичные ДНК ASPA01 по изобретению, могут быть выделены на основании их гомологии к нуклеиновой кислоте ASPA01, описанной здесь, с использованием кДНК, описанных здесь, или ее подходящего фрагмента в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартной технологией гибридизации, предпочтительно в очень жестких гибридизационных условиях. В дополнение к встречающимся в природе аллельным вариантам последовательности ASPA01, как известно специалисту, изменения могут быть введены в нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 путем мутации, обеспечивая изменения в аминокислотной последовательности белкаASPA01 без существенного изменения функции белка ASPA01. Еще один объект изобретения касается улучшенного белка ASPA01. Улучшенными белкамиASPA01 являются такие белки, в которых по меньшей мере одна биологическая активность улучшена. Такие белки могут быть получены с помощью статистических (неупорядоченных) мутаций на протяжении всей или только части кодирующей последовательности ASPA01, например с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты можно рекомбинантно экспрессировать и проверить на биологическую активность. Например, есть стандартные процедуры для измерения ферментативной активности аспарагиназы и, таким образом, улучшенные белки могут быть легко обнаружены. В предпочтительном варианте белок ASPA01 обладает аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO:3. В другом варианте ASPA01 полипептид в значительной степени гомологичен аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO:3 и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида согласно SEQ ID NO:3, но отличается по аминокислотной последовательности вследствие природных вариаций или мутагенеза, как описано выше. В дополнительном предпочтительном варианте белок ASPA01, обладающий аминокислотной последовательностью, кодируемой выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты, способным гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, предпочтительно в жестких гибридизационных условиях. Таким образом, белком ASPA01 является белок, который содержит аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:3, примерно на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида SEQ ID NO:3. Функциональные эквиваленты белка по изобретению могут также быть обнаружены, например, с помощью скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например усеченных мутантов, белка по изобретению на наличие аспарагиназной активности. В одном варианте разнообразная библиотека вариантов получается с использованием комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Различная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов с последовательностью генов. Полученный таким образом вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей экспрессируется в виде отдельных полипептидов. Существуют различные методы, которые могут быть использованы для получения библиотеки возможных вариантов полипептидов по изобретению из вырожденных нуклеотидных последовательностей. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны (см., например, Narang (1983), Tetrahedron 39:3;Itakura et al. (1984), Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984), Science 198:1056; Ike et al. (1983),Nucleic Acid Res. 11:477). Кроме того, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей полипептида по изобретению может быть использована для получения разнообразной популяции полипептидов для последующего поиска вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующих последовательностей может быть получена обработкой двухцепочечных ПЦР-фрагментов интересующих кодирующих последовательностей нуклеазой в условиях, при которых за 1 мин происходит образование только одного ника примерно- 11011438 на одну молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией ДНК для образования двухцепочечных ДНК, которые могут включать смысловые/антисмысловые пары из различных никированных продуктов, удалением одноцепочечных частей в образовавшихся дуплексах обработкой нуклезой S1 и встраиванием образовавшихся фрагментов библиотеки в экспрессионный вектор. Таким образом может быть получена экспрессионная библиотека, кодирующая N-концевые и внутренние фрагменты различных размеров интересующего белка. Известно несколько методов скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных с помощью точечных мутаций усечения и для поиска генных продуктов, обладающих выбранными свойствами в библиотеке кДНК. Наиболее широко используемые технологии, которые подходят для проведения большого количества анализов, для скрининга больших генных библиотек, обычно включают клонирование генных библиотек в реплицирующиеся экспрессионные векторы, трансформирование подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых определение желаемой активности облегчает выделение векторов, кодирующих гены, продукт которых был обнаружен. Рекурсивный множественный мутагенез - метод, увеличивающий частоту функциональных мутантов в библиотеке, может быть использован вместе со скринингом для идентификации вариантов белка по изобретению (Arkin и Yourvan (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7811-7815; Delgraveet al. (1993), Protein Engineering, 6 (3):327-331). Помимо последовательности гена ASPA01, указанной в SEQ ID NO:1, специалисту понятно, что полиморфизм последовательности ДНК, который может приводить к изменениям аминокислотной последовательности белка ASPA01, может существовать в данной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из различных популяций, или внутри одной популяции из-за естественных аллельных вариантов. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты. Фрагменты полинуклеотида по изобретению могут также содержать полинуклеотиды, которые не кодируют функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут использоваться в качестве зондов или праймеров для ПЦР-реакции. Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве гибридизационных зондов или в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использование молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, которые не кодируют полипептиды, обладающие активностью ASPA01, включает,среди прочего, (1) выделение генов, кодирующих белок ASPA01 или его аллельные варианты, из библиотеки кДНК, например, из другого организма, чем A.niger; (2) гибридизацию на месте (например,FISH) с веретенами метафазной хромосомы для нахождения точного местоположения гена ASPA01 на хромосоме, как описано в Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, PergamonPress, New York (1988); (3) Нозерн-блоттинг для определения экспрессии мРНК ASPA01 в отдельной ткани и/или клетке и (4) зонды и праймеры, которые могут быть использованы в качестве диагностических инструментов для анализа присутствия нуклеиновых кислот, гибридизируемых к зонду ASPA01 в данном биологическом образце (например, ткани). Изобретение также охватывает способ получения функциональных эквивалентов гена ASPA01 или кДНК. Этот способ предусматривает получение меченых зондов, которые включают выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или только часть последовательности SEQ ID NO:3 или ее вариант; скрининг меченым зондом библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты в условиях, позволяющих гибридизацию зонда к фрагменту нуклеиновой кислоты библиотеки с образованием нуклеотидного дуплекса, и получение последовательности полноразмерного гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченом дуплексе для получения генов, относящихся к гену ASPA01. В одном варианте нуклеиновая кислота ASPA01 по изобретению гомологична последовательности нуклеиновой кислоты, приведенной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или их комплементам по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. В другом предпочтительном варианте полипептид ASPA01 по изобретению по меньшей мере на 40,65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:3. Клетки-хозяева. В другом варианте изобретение характеризует клетки, например трансформированные клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, охватываемую изобретением. Трансформированная клетка или рекомбинантная клетка является клеткой, в которую(или в предшественник которой) была введена, с использованием технологии рекомбинантной ДНК,нуклеиновая кислота по изобретению. Эта клетка охватывает как прокариоты, так и эукариоты, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., но особенно предпочтительны клетки нитчатых грибов, в частностиAspergillus niger. Может быть выбрана клетка-хозяин, которая модулирует экспрессию вставленной последовательности или модифицирует и обрабатывает генный продукт специфичным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (процессинг) (например, усечение) белкового- 12011438 продукта могут способствовать оптимальному функционированию белка. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и генетических продуктов. Подходящие клеточные линии или клеточные системы известны специалисту в молекулярной биологии и/или микробиологии и могут быть выбраны для получения желаемой и корректной модификации и процессинга экспрессируемых чужеродных белков. С этой целью могут использоваться эукариотические клетки-хозяева, которые содержат клеточный инструментарий для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генетического продукта. Такие клетки хорошо известны. Клетки-хозяева также включают, но без ограничения этим, клеточные линии млекопитающих, такие как CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, W138 клеточная линия хориоидального сплетения. Если требуется, полипептиды по изобретению могут быть получены с использованием стабильно трансфецированных клеточных линий. Векторы, подходящие для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, доступны, а методы получения таких клеточных линий также известны, например, изAusubel et al. (см. выше). Еще один объект изобретения касается пищевых продуктов, полученных способом по изобретению,как описано выше, или с использованием новой аспарагиназы, как описано выше, для производства пищевых продуктов. Эти пищевые продукты характеризуются значительно пониженным содержанием акриламида по сравнению с пищевыми продуктами, полученными с помощью способов, которые не предусматривают добавления одного или больше ферментов в количестве, эффективном для значительного снижения содержания аминокислот, вовлеченных в образование акриламида во время указанной стадии нагревания. Способ по изобретению может быть использован для получения пищевых продуктов, содержащих меньше акриламида, предпочтительно более чем на 50%, предпочтительнее более чем на 20%,еще предпочтительнее более чем на 10% и наиболее предпочтительно более чем на 5% по сравнению с пищевыми продуктами, полученными с использованием традиционного способа. Материалы и методы. Измерение акриламида. Предварительная обработка образцов. 600 мг высушенного и гомогенизированного образца экстрагируют 5 мл воды milliQ. 1 мкг внутреннего стандарта 13 С 3 акриламида в растворе (CIL) добавляют к экстракту. После 10 мин центрифугирования (6000 об/мин) 3 мл верхнего слоя переносят в колонку Extreluut-3 ВТ (Merck). Акриламид элюируют из колонки 15 мл этилацетата. Этилацетат упаривают под слабым потоком азота приблизительно до 0,5 мл. Условия хроматографирования. Раствор этилацетата анализируют с использованием газовой хроматографии. Разделение осуществляют на колонке CP-Wax 57 (Varian) (длина 25 м, внутренний диаметр 0,32 мм, пленка 1,2 мкм). В качестве газа-носителя используют гелий с постоянным потоком 5,4 мл/мин. Инжекцию пробы 3 мкл осуществляют без расщепления. Температуру в камере поддерживают 50 С в течение 1 мин, затем температуру повышают со скоростью 30 С/мин до 220 С. После поддержания температуры 220 С в течение 12 мин камеру охлаждают и стабилизируют до следующей инжекции. Детектирование осуществляют поточной масс-спектрометрией химической ионизации с регистрацией положительных ионов, используя метан в качестве ионизирующего газа. Характерные ионы м/з 72 (акриламид) и м/з 75 (13 С 3 акриламид) отслеживают для количественного определения. Использованное оборудование. ГХHP5973 (Hewlet Packard) Измерение аспарагиназной активности. Аспарагиназную активность измеряли в соответствии с Shirfrin et al. (Shirfrin, S., Parrott, C.L.,Luborsky, S.W. (1974), Journal of Biological Chemistry 249, 1445-1340). В основу определения ферментативной активности было положено измерение NH3, высвобождаемого аспарагиназной активностью. Для измерения выделившегося NH3 использовали следующий список реактивов. Раствор A 0,1 М лимонная кислота + 0,2 М Na2HPO4 2H2O рН 5,5 Раствор B 0,189 М L-аспарагин (Sigma) Раствор C 0,006 М (NH4)2SO4 (Merck) Раствор D 25% (v/v) трихлоруксусная кислота (Merck) Раствор E Цветной реагент на аммоний (Aldrich) Для измерения аспарагиназной активности растворы должны быть свежими. В табл. 1 суммированы растворы, используемые для калибровочной кривой (ТК = точка калибровки). Растворы в соответствии с табл. 1 немедленно инвертировали и инкубировали при 37 С инвертированными. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 0,1 мл раствора D. Для эталонного ферментативного анализа затем добавляли 0,1 мл раствора фермента. Раствор немедленно перемешивали и центрифугировали для удаления любого осадка. 0,2 мл надосадочной жидкости отбирали в пробирку, содержащую 4,3 мл деионизированной воды и 0,5 мл раствора Е. Эту смесь немедленно перемешивали и после 1 мин измеряли при А 436 нм для калибровки образцов, эталонов и тестов. Калибровочную кривую строили следующим образом: А 436 нм точка калибровки = А 436 точка калибровки - А 436 точка калибровки 1. Стандартную кривую строили из зависимости А 436 нм стандарта от концентрации аммония (NH3). Ферментативную активность рассчитывали следующим образом: А 436 нм ферментативного теста = А 436 нм тест - А 436 нм эталонного теста. Определение мкмоль высвобождаемого NH3 с использованием стандартной кривой: где Vs = объем реакционного раствора (по графику + 0,1 мл раствора D), 2,2 мл;Vt = объем реакционного раствора, используемого во второй реакции для определения NH3, 0,2 мл;Ve = объем образца фермента, используемого для тестирования, 0,1 мл. Удельная ферментативная активность = (единиц/мл фермента)/(мг белка/мл фермента). Одна единица аспарагиназной активности определялась как 1 мкмоль NH3, высвобождаемого изL-аспарагина за 1 мин при рН 5,5 при 37 С, если не указано иное. рН хлебного теста составляет около 5,5, поэтому это рН является предпочтительным для измерения. Однако для других субстратов с различными уровнями рН предпочтительно использовать эти уровни рН для определения аспарагиназной активности. Количество в миллионных долях (ppm) указано из расчета на количество муки, если не указано иное. Материалы. Аспарагиназа была получена из Escherichia coli (Sigma, удельная активность 285 ед./мг), Erwiniachrysanthemi (Sigma, удельная активность 100 ед./мг), Bacillus subtilis или Aspergillus niger (см. примеры условий ферментации). Среда CSL содержала (в количестве на 1 л): 100 г Corn Steep Solids (Roquette),1 г NaH2PO4H2O,0,5 г MgSO47H2O,10 г глюкозыH2O и 0,25 г Basildon (противопенный агент). Компоненты растворяли в деминерализованной воде и доводили рН до 5,8 с помощью NaOH илиH2SO4; в 100 мл колбы с экраном и поплавком для пены разливали 20 мл ферментативного бульона и стерилизовали при 120 С 20 мин, затем после охлаждения до комнатной температуры в каждую колбу было добавлено 200 мкл раствора, содержащего 5000 IU/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина.- 14011438 Среда CSM содержала (в количестве на 1 л): 150 г мальтозыH2O,60 г Soytone (пептон),1 г NaH2PO4H2O,15 г MgSO47H2O,0,08 г Tween 80,0,02 г Basildon (противопенный агент),20 г MES,1 г L-аргинина. Компоненты растворяли в деминерализованной воде и доводили рН до 6,2 с помощью NaOH илиH2SO4; в 500 мл колбы с экраном и поплавком для пены разливали по 100 мл ферментативного бульона и стерилизовали при 120 С в течение 20 мин, затем после охлаждения до комнатной температуры в каждую колбу было добавлено 200 мкл раствора, содержащего 5000 IU/мл пенициллина и 5000 IU/мл стрептомицина. Пример 1. Ферментация Aspergillus niger. Аспарагиназа, кодируемая приведенной здесь нуклеотидной последовательностью, была получена путем конструирования экспрессионной плазмиды, содержащей последовательность ДНК, трансформированием этой плазмидой штамма A.niger и выращиванием штамма Aspergillus niger в следующих условиях. Свежими спорами (108-107) штамма A.niger инокулировали 20 мл среды CSL (100 мл колба с экраном) и рост в течение 20-24 ч при 34 С и 170 об/мин. После инокуляции 5-10 мл CSL предкультуры в 100 мл среды CSM (500 мл колба с экраном) штаммы ферментировали при 34 С и 170 об/мин в течение 3-5 дней. С помощью центрифугирования в 50 мл пробирках Greiner (30 мин, 5000 об/мин, 4 С) получали свободную от клеток надосадочную жидкость и все последующие шаги проводили во льду. Надосадочную жидкость предварительно фильтровали на фильтре GF/A Whatman Glass microfiber filter ( 150 мм) для удаления крупных частиц, рН доводили до 5 с помощью 4 N KOH (если требуется) и стерилизовали фильтрат 0,2 мкм (на верху колбы) фильтром под вакуумом для удаления частиц гриба. Надосадочную жидкость хранили при 4 С (или -20 С). Измерение содержания аспарагиназы Aspergillus niger и аспарагиназной активности в ультрафильтрате. Стадия 1. Получение ультрафильтратов. Культуральную надосадочную жидкость, полученную как описано в примере 1, ультрафильтровали для повышения концентрации фермента и для удаления низкомолекулярных примесей, которые могут помешать определению ферментативной активности и тестированию при выпекании. Ультрафильтрация 300 мл надосадочной жидкости проводилась в системе Millipore Labscale TFF, содержащей фильтр с порогом отсечения 10 кДа по молекулярной массе. В зависимости от цвета и объема образцы промывали 3-5 раз 10-30 мл холодной деминерализованной водой и в дальнейшем называли ультрафильтратами. Стадия 2. Определение концентрации аспарагиназы с помощью А 280 и HPSEC. Концентрацию аспарагиназы Aspergillus niger в ультрафильтратах вычисляли по экстинкции при 280 нм (А 280), характерной для аспарагиназы, и вычисленного молярного коэффициента экстинкции аспарагиназы. Измерение при А 280 осуществляли с помощью спектрофотометра Uvikom XL Secomam(Beun de Ronde, Abcoude, The Netherlands). Коэффициент молярной экстинкции фермента может быть вычислен по количеству остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу фермента (S.С. Gill и P.H. Von Hippel, Anal. Biochem. 182,319-236 (1989. Молярные коэффициенты экстинкции этих аминокислот составляют 1280, 5690 и 120 М-1 см-1 соответственно. Количество остатков тирозина, триптофана и цистеина в аспарагиназеAspergillus niger по изобретению может быть вычислено из белковой последовательности данной вSEQ ID NO:3. Вычисленный коэффициент экстинкции аспарагиназы Aspergillus niger по изобретению представлен в табл. 2. Таблица 2 Коэффициент экстинкции аспарагиназы Aspergillus niger Экстинкция ультрафильтрата при 280 нм (А 280), свойственная аспарагиназе, зависит от чистоты ферментативного образца. Эту чистоту определяли с использованием ВЭЭХ (высокоэффективная экс- 15011438 клюзионная хроматография) на колонке TSK SW-XL (3007,8 мм; разброс М.в. 10-300 кДа). Буфер для элюирования содержал 25 мМ фосфата натрия рН 6,0, скорость потока 1 мл/мин. На колонку наносилось 5-100 мкл образца. Поглощение измерялось при 280 нм. А 280 в ультрафильтрате, соответствующую аспарагиназе по изобретению, вычисляли из отношения площадей пиков, соответствующих аспарагиназе на хроматограмме, и общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Концентрацию аспарагиназы в ультрафильтрате вычисляли умножением А 280 ультрафильтрата на отношение, описанное выше и деленное на 0,3 (вычисленный коэффициент экстинкции) для каждой аспарагиназы. Раствор содержал 40 мг белка/мл. Стадия 3. Определение аспарагиназной активности. Активность аспарагиназы Aspergillus niger в растворе составила 40000 U/мл при рН 5,5. Поэтому,учитывая, что концентрация белка в растворе была 40 мг/мл, удельная активность составила 1000 ед./мг белка. Пример 2. рН-оптимум аспарагиназы Aspergillus niger. В этом примере активность измеряли при различных значениях рН. Для поддержания постоянного рН и минимизирования влияния буфера измерение активности аспарагиназы осуществляли в различных буферах при одном значении рН. Для измерения активности аспарагиназы в интервале рН 5-9 использовали три различных буфера: 1) лимонная кислота/фосфатный буфер (рН 5,0-6,2); 2) фосфатный буфер (рН 8,5-7,6) и 3) трис-буфер (рН 7,2-8,9). Содержание аспарагина составляло 17,2 мМ. В табл. 3 показана зависимость активности аспарагиназы из A.niger от рН. Таблица 3 Активность аспарагиназы Aspergillus niger при различных рН, измеренная в подходящем буфере. Конечные концентрации в ферментативном анализе цитратного, фосфатного и трис(гидроксиметил)аминометанового буферах составили 0,05, 0,1 и 0,025 М соответственно Как видно из этих данных, аспарагиназа Aspergillus niger очень хорошо подходит для использования в выпекании, поскольку фермент проявляет относительно высокую ферментативную активность при рН теста около 5,5. Пример 3. Значения KM и Vmax аспарагиназ Escherichia coli и Aspergillus niger. Определения KM и Vmax проводили при рН 5,5 и 37 С, измеряя аспарагиназную активность аспарагиназ Escherichia coli и Aspergillus niger, соотвественно. В табл. 4 суммированы результаты этих исследований.niger на содержание акриламида в корке и мякише. Тесто приготавливали из 2000 г муки (100%), 1040 мл воды (57%), 44 г свежих дрожжей Конинга,40 г соли (5%), 136 г аскорбиновой кислоты (68 ppm) и указанных количеств аспарагиназы из Erwinia(Sigma) или Aspergillus niger по изобретению. Ингредиенты перемешивали до образования теста с помощью спирального миксера Diosna SP 12 (2 мин при скорости 1, затем смешивание проводили при скорости 2, пока затраты энергии не достигали 85 Вт). После этого для поднятия полученное тесто было оставлено на 15 мин при 32 С. Затем из 350 г кусочков теста руками были вылеплены круглые булочки и оставлены на 15 мин при 32 С. После этого кусочки теста были скруглены и отформованы с последующей последней выдержкой в течение 75 мин. После выдержки по длине верхней поверхности кусочков теста был сделаны разрезы глубиной 1 см. Образцы теста для определения уровня акриламида брали перед выпеканием. Кусочки теста выпекали в духовке при температуре 240 С 30 мин. Затем были взяты образцы корки (наружные 2 мм), в которых было определено содержание акриламида, как описано выше. Корка была взята с верхней стороны хлеба Batard и была выбрана та часть корки, которая обладала средним коричневым цветом, не слишком темным и не слишком белым. Для определения акриламида среднее из двух образцов одной буханки и двух буханок для одних и тех же условий показаны в табл. 5-7. Таблица 5 Влияние некоторых типов аспарагиназы на образование акриламида в хлебе Из приведенной выше таблицы можно сделать вывод, что использование нескольких различных типов аспарагиназ, включая новую ASPA01, уменьшает количество образующего акриламида в корке. Таблица 6 Влияние количества аспарагиназы Erwinia на образование акриламида Из приведенной выше таблицы видно, что увеличение количества аспарагиназы уменьшает количество образовавшегося акриламида в корке. Пример 5. Влияние аспарагиназы на содержание акриламида в хлебе Batard с добавленным аспарагином. Тесто, буханки и образцы приготавливали по примеру 4, поэтому L-аспарагин был добавлен в муку на той же стадии, когда была добавлена аспарагиназа, в количествах, которые указаны в табл. 7. В полученных образцах определяли акриламид, результаты определения приведены ниже.- 17011438 Таблица 7 Влияние добавленного аспарагина на уровень акриламида в корке Из табл. 7 видно, что добавление аспарагина в хлеб значительно повышает содержание акриламида в корке хлеба. Однако использование аспарагиназы позволяет понизить содержание акриламида. Пример 6. Влияние различных параметров на уровень акриламида в корке. Тесто было получено из 2000 г непросеянной муки (100%) (Linde - Meneba, Holland) или нормальной пшеничной муки (Kolibri - Meneba, Holland), 1140 мл воды (57%), 47 г свежих дрожжейKoningsgist, 40 г соли (1,75%), 136 мг аскорбиновой кислоты (34 ppm) и указанных количествL-аспарагина (Sigma) и аспарагиназы ASPA01, полученной из Aspergillus niger. Ингредиенты перемешивали до образования теста с помощью спирального миксера Diosna SP 12 (2 мин при скорости 1, затем смешивание проводили при скорости 2, пока затраты энергии не достигали 85 Вт). После этого для поднятия полученное тесто оставляли на 15 мин при 32 С. Затем из 350 г кусочков теста руками были вылеплены круглые булочки и оставлены на 15 мин при 32 С. После этого кусочки теста были скруглены и отформованы с последующей последней выдержкой в течение 75 мин. После выдержки по длине верхней поверхности кусочков теста были сделаны разрезы глубиной 1 см. Кусочки теста выпекали в печи. Использовали три способа выпекания: 1) 30 мин при 240 С; 2) 20 мин при 300 С; 3) 20 мин при 320 С. После выпекания брали образцы хлебной корки, как указано в примере 4. Результаты акриламидного анализа образцов приведены ниже. Количество акриламида в тесте было измерено перед самым выпеканием. Каждое значение является средним из двух измерений одной буханки для каждого условия. Таблица 8 Влияние способа выпекания на количество акриламида, образовавшегося в корке хлеба на основе нормальной муки, ни аспарагин, ни аспарагиназа не были добавлены Из табл. 8 можно сделать вывод, что образование акриламида зависит от применяемого способа выпекания. В горячем и коротком способе выпекания образование акриламида в корке значительно выше, чем при пониженной температуре. В результате процесса выпекания 3 образуется очень темная буханка, поэтому дальнейшие эксперименты в этих условиях выпекания не проводились.- 18011438 Таблица 9 Влияние типа муки на уровень акриламида в корке хлеба для способа выпекания 1,ни аспарагиназы, ни аспарагина добавлено не было Из табл. 9 видно, что тип муки влияет на содержание образующегося акриламида. Таблица 10 Влияние сахара на содержание акриламида в корке хлеба, полученного из нормальной муки,и влияние увеличенного количества акриламида на эффективность аспарагиназы A.niger Присутствие сахарозы стимулировало образование акриламида. В случае добавления аспарагина этот эффект был еще больше. Когда аспарагиназу Aspergillus niger добавляли к тесту, обогащенному сахаром, содержание акриламида в корке хлеба было значительно снижено. Удивительным оказался тот факт, что для буханок, содержащих значительные количества акриламида, наблюдалось и гораздо более значительное уменьшение содержания акриламида, в то время как количество использованной аспарагиназы из Aspergillus niger было тем же. Пример 7. Получение Голландского медового пирога. Голландский медовый пирог получали в две стадии. На первой стадии предварительное жидкое тесто приготавливали следующим образом: 4 кг Koekzoet (Atlanta Dethmers B.V., Groningen-Holland) и 500 г смеси для Голландского медового пирога добавляли к 2 л воды и нагревали до температуры 116 С. Добавляли 5 кг ржаной муки и смешивали, пока тесто не становилось однородным. Затем тесто охлаждали и хранили при комнатной температуре 1-2 дня. На 2750 г этого предварительного теста добавляли следующие ингредиенты: 500 г Koekzoet,27,5 г просеянных приправ для Голландского медового пирога, 22 г просеянного Пекарского порошкаKaram, 16,5 г Пекарского порошка Vulkaan (все Atlanta Dethmers). Кроме того, добавляли различные количества аспарагиназы Aspergillus niger, ферментативная активность которых составляла 40000 U/мл(ферментативную активность измеряли в соответствии с примером 1 при рН 5,5). Эту смесь перемешивали при 104 об/мин в течение 6 мин в миксере Diosna SD 12 (Diosna, DierksShne, Osnabrck-Germany). Взвешивали 3250 г теста, смачивали снаружи и укладывали в формочки на поднос. Затем тесто инкубировали при 30 С 105 мин. После этого тесто выпекали при 180 С 60 мин. Образцы наружного слоя и внутреннего содержимого (корки) Голландского медового пирога анализировали на присутствие акриламида. После выпекания брали образцы из корки (наружные 2 мм) и из мякиша (из середины булочки) и анализировали на акриламид, как описано выше. Для образца корку брали с верхней стороны булочки,выбирая такую часть корки, которая имела средний цвет.- 19011438 Таблица 11 Содержание акриламида и влияние различных доз Aspergillus niger в корке и мякише Голландского медового пирога Уменьшение содержания акриламида вычисляли по следующей формуле: Уменьшение акриламида=Содержание акриламида в пироге, обработанном аспарагиназой)/Содержание акриламида в контрольном образце)100% Как показано в этом примере, добавление аспарагиназы Aspergillus niger уменьшает содержание акриламида до 5% по сравнению с необработанным Голландским медовым пирогом. Кроме того, в необработанном Голландском медовом пироге было неожиданно обнаружено высокое содержание акриламида в мякише. Во всех экспериментах с хлебом количество акриламида в мякише было ниже предела обнаружения (30 ppb) даже в случае добавления аспарагина или сахара.- 20011438 Перечень последовательностей 120 Аспарагиназа, полученная из Aspergillus niger, полинуклеотид, вектор, клетка-хозяин,способ получения пищевого продукта и пищевой продуктSEQ ID NO:3, или аспарагиназа, последовательность которой гомологична указанной по меньшей мере на 80%. 2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1, имеющий последовательностьSEQ ID NO:1 или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. 3. Выделенный полинуклеотид по п.2, полученный из нитчатых грибов. 4. Выделенный полинуклеотид по п.3, полученный из Aspergillus niger. 5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1. 6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен аспарагиназы по п.1. 7. Выделенный полинуклеотид, кодирующий аспарагиназу по п.1, имеющий последовательностьSEQ ID NO:2, или последовательность, гомологичную указанной по меньшей мере на 80%. 8. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.2-7. 9. Вектор по п.8, в котором указанный полинуклеотид оперативно соединен с регуляторными последовательностями, пригодными для экспрессии указанного полинуклеотида в подходящей клеткехозяине. 10. Вектор по п.9, в котором подходящая клетка-хозяин является нитчатым грибом. 11. Вектор по п.10, в котором указанная подходящая клетка-хозяин является Aspergillus niger. 12. Аспарагиназа, полученная путем экспрессии полинуклеотида по любому из пп.2-7 и вектора по любому из пп.8-11 в подходящей клетке-хозяине, например Aspergillus niger.- 24011438 13. Рекомбинантная аспарагиназа, содержащая функциональный домен аспарагиназы по п.1. 14. Способ получения аспарагиназы по любому из пп.1, 12 или 13, предусматривающий стадии трансформации подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом по любому из пп.2-7 или вектором по любому из пп.9-10, культивирования указанной клетки в условиях, позволяющих экспрессию указанных полинуклеотидов и, возможно, очистки кодируемых полипептидов из указанной клетки или культуральной среды. 15. Способ наработки полинуклеотида по любому из пп.2-7 или вектора по любому из пп.8-11, предусматривающий стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором и выделения указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина. 16. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пп.2-7 или вектор по любому из пп.8-11. 17. Рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид по любому из пп.1, 12 или 13. 18. Способ производства пищевого продукта, включающий по меньшей мере одну стадию нагревания, предусматривающий добавление аспарагиназы по любому из пп.1, 12 или 13 к полуфабрикату указанного пищевого продукта, причем аспарагиназу добавляют до указанной стадии нагревания в количестве, эффективном для снижения содержания аминокислот, присутствующих в указанном полуфабрикате пищевого продукта и вовлеченных в образование акриламида в течение указанной стадии нагревания. 19. Способ по п.18, в котором пищевой продукт получают по меньшей мере из одного сырьевого растительного материала. 20. Способ по п.19, в котором сырьевым растительным материалом является зерновая мука, предпочтительно пшеничная мука. 21. Способ по п.19, в котором сырьевым растительным материалом является картофель. 22. Пищевой продукт, полученный способом по любому из пп.18-21.