Способы производства творога и сыра, творог, сыр и молочный продукт

012373 Область техники Изобретение относится к пищевой промышленности и, в частности, касается способа производства сыра. Предшествующий уровень техники Коагуляция - существенный шаг в традиционном производстве сыра из молочного источника, такого как коровье молоко. Коагуляция может быть начата скисанием и/или добавлением фермента (коагулянта), такого как химозин. После коагуляции молоко разделяют на творог и сыворотку. Творог перерабатывают далее в сыр. Казеины формируют главный белковый компонент творога, и так как сыр - более ценный продукт,чем сыворотка, есть желание максимизировать количество белка, включенного в творог. Включение сывороточных белков в творог должно было бы привести к увеличению количества произведенного сыра(=кг сыра, произведенного из 1 л сырного молока), которое желательно. Способы производства сыра из различных молочных источников были давно известны и были подробно описаны для многих различных типов вариантов сыра, (смотри например, Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol 12, 1999, Ed. Fox, Aspen Publications, Gaithersburg, Maryland; Encyclopedia ofDairy Sciences Vol 1-4, 2003, Academic Press, London). Решающим моментом в изготовлении сыра является процесс коагуляции, в котором растворимость мицелл и субмицелл казеина уменьшена. Обычно используют фермент, вызывающий коагуляцию. Были описаны ферменты подобно телячьему химозину,микробным эквивалентам химозина и других ферментов из других источников, и некоторые доступны под различными торговыми марками. Все из них могут быть использованы, чтобы начать процесс коагуляции. Первичным шагом в коагуляции является разрыв связи Phe105-Met106 в -казеине. Это ведет к удалению С-конечной части -казеина: гликомакропептида (ГМП). Удаление ГМП ведет к ассоциации мицелл казеина, то есть коагуляции казеина. Коагуляция казеина ведет к формированию геля, и время, требуемое, что бы получить загустевание в специфической молочной смеси непосредственно связано с активностью коагулянта. Время, которое проходит между добавлением коагулянта и появлением начального образования сгустков казеина, определено как время коагуляции (свертывания). Скорость, при которой формируют гель в сырном молоке и густота геля зависят непосредственно от количества добавленного фермента,концентрации ионов кальция, фосфора, температуры и рН. После начальной коагуляции формируют гель, и связанность геля увеличивается вслед за увеличением межмицеллярных связей. Мицеллы, двигающиеся вместе, и коагулят связываются, таким образом удаляя сыворотку. Это явление известно как синерезис и ускоряется разрезанием творога, увеличением температуры и увеличением кислотности,производимой развивающимися молочно кислыми бактериями. Для микробиологической безопасности сырное молоко подвергают термической обработке до использования. Для этого применяют различные способы термической обработки для молока, такие как термизация (65 С, несколько секунд), низкая пастеризация (72 С, 15 с), высокая пастеризация (85 С, 20 с) и сверхвысокотемпературная (СВТ) обработка (например, 1 с, 145 С). Термическая обработка увеличивает качество хранения молока и уничтожает микроорганизмы. Кроме того, для определенных молочных применений специфическая термическая обработка может быть необходима, чтобы получить желательные характеристики конечного продукта, например в производстве йогурта. Термическая обработка может приводить к ухудшению свойств молока для целей производства сыра (смотри например, SinghWaungana, Int Dairy J (2001), 11, 543-551). Термические обработки, приводящие к ухудшенным свойствам свертывания молока, таким как увеличенное время коагуляции, уменьшенная скорость уплотнения творога или уменьшенная плотность творога, будут в остальном тексте именоваться высокая термическая обработка; получающееся молоко будет именоваться высоко нагретое молоко во всем тексте. Существенные изменения, происходящие при нагревании молока свыше 60 С, включают денатурацию белков сыворотки, взаимодействия между денатурированными белками сыворотки и мицеллами казеина и преобразование растворимого кальция, магния и фосфата в коллоидное состояние. Мицеллы казеина очень стабильны при высоких температурах, хотя изменяются в дзета-потенциале, размерная гидратация мицелл, так же как некоторые реакции ассоциации-диссоциации, происходит при температурах сильного нагревания (SinghWaungana, Int Dairy J (2001) 11, 543-551; и ссылки, приведенные там). При нагревании молока свыше 65 С белки сыворотки являются денатурированными из-за разворачивания своих пептидных остатков. Развернутые белки затем взаимодействуют с мицеллами казеина или просто сами агрегируют, включая реакции тиол-дисульфидного обмена, гидрофобные взаимодействия и ионные связи. Ионная сила, рН и концентрация кальция и белка влияет на степень денатурации белков сыворотки. Высокотемпературная денатурация белков также находится под влиянием присутствия лактозы и других сахаров, многоатомных спиртов и модификаторов белка. Показано, что денатурированные белки сыворотки связываются с -казеином на поверхности мицелл казеина. Полагают, что существует элементарное взаимодействие между -лактоглобулином и казеином и включает как дисульфидные, так и гидрофобные взаимодействия (Singh and Fox, J Dairy Res(1987) 54, 509-521). Часть денатурированных белков сыворотки не образуют комплекс с мицеллами ка-1 012373 зеина, но формирует агрегаты с другими белками сыворотки. Степень ассоциации денатурированных белков сыворотки с мицеллами казеина заметно зависит от рН молока до нагревания, уровней кальция и фосфата, концентрации сухих веществ молока и типа нагревающей системы (водяная баня, косвенная или прямая). Сообщают, что косвенное нагревание имеет следствием большие размеры лактоглобулина и -лактальбумина, связанных с мицеллами по сравнению с ситуацией, где используют прямое нагревание (например, нагнетание пара). Нагревание при значениях рН меньше чем 6,7 имеет следствием большое количество денатурированных белков сыворотки, связывающихся с мицеллами,тогда как при более высоких значениях рН комплексы белок/-казеин сыворотки диссоциируют с поверхности мицеллы (SinghWaunanga, Int Dairy J (2001) 11, 543-551). Термическая обработка приводит к различным изменениям в молоке. Самое явное изменение - частичная или полная денатурация белков сыворотки. Степень денатурации зависит от термической обработки и условий в молоке, таких как рН и присутствие добавок подобно углеводам. Термическая обработка молока имеет следствием формирование агрегатов белка сыворотки, содержащих как лактальбумин, так и -лактоглобулин (SinghWaungana, Int Dairy J (2001), 11, 543-551; Vasbinder, Casein-whey protein interactions in heated milk, Thesis, ISBN 90-393-3194-4). Фракцию мицелл казеина не значительно затрагивают в температурном диапазоне 70-100 С. Фосфат кальция, который также присутствует в мицеллах казеина, осаждается при термической обработке и, тем не менее, медленно повторно растворяется после охлаждения. Термическая обработка молока также приводит к взаимодействию денатурированных белков сыворотки с мицеллами казеина. Взаимодействие может быть ковалентным через образование дисульфидной связи между например -лактоглобулином и -казеином, и эти взаимодействия стабилизируют мицеллы казеина. Конечный состав термически обработанного молока зависит от рН молока и применяемой температуры. Свойства нагретого молока определяют в соответствии с конечным составом молока. Показано, что высоко нагретое молоко ухудшает режим свертывания. Время свертывания увеличивается, что приводит к формированию более слабого, более тонкого творога, который сохраняет больше воды, чем нормальный. В литературе есть противоречие о причине увеличения времени свертывания. Общепринятым объяснением является то, что половина ГМП -казеина реагирует с -лактоглобулином,и что это служит причиной стерического препятствия для коагулирующего фермента, ведущего к ингибированию разложения -казеина (см. например, Singh et al (1988) J Dairy Res. 55, 205). Образование более слабого творога объясняется несколькими способами. Одним объяснением более слабого творога является то, что -казеин недостаточно разорван (см.: WalstraJermes, (1984) Dairy Chemistry and Physics, John Wiley and sons Inc, USA). Другим объяснением является стимулированное высокой температурой осаждение фосфата кальция (см. например Schreiber (2001) Int. Dairy J. 11, 553). Третьим объяснением является то, что белки сыворотки денатурируют в течение термической обработки и связываются с мицеллами казеина, таким образом, влияют на взаимодействия казеина мицелла-мицелла (Vasbinder, Casein-whey protein interactions in heated milk, Thesis, ISBN 90-393-3194-4). Неясно, какое из этих объяснений является самым значимым. Известно, что неблагоприятные эффекты термической обработки на сычужную коагуляцию могут быть преодолены до некоторой степени или а), уменьшением рН приблизительно до 6,2, b) подкислением молока ниже 5,5 с последующей нейтрализацией до 6,6 или с), добавлением хлорида кальция (LuceyFederaton). Однако, этих средств недостаточно для решения проблемы, так как первоначальная плотность творога и время свертывания не удается восстановить. Кроме того, требуется дополнительная обработка сырного молока в случае рН регуляторов. Возможность использования высоко нагретого молока для получения сыра была бы желательна. С одной стороны термическая обработка увеличивает срок годности молока, позволяя длительные транспортировки и сроки хранения. С другой стороны это ведет к существенному увеличению количества произведенного сыра. Было сообщено об увеличениях до 10% или более. Однако факторы, препятствующие использованию высоко нагретого молока - увеличенное время свертывания и увеличенная слабость творога (тонкий творог, который сохраняет больше воды, чем нормальный). Коррелированная слабость творога увеличивает потери сырного творога в течение соления и прессования сыра. Таким образом существует промышленная необходимость устранить недостатки высоко нагретого молока в производстве сыра. Краткое описание сущности изобретения Неожиданно обнаружили, что добавление гидролизата белка, пептида или смеси пептидов к нагретому молоку в процессе производства сыра имеет в результате сокращение или устранение увеличения времени свертывания молока. Кроме того, добавление гидролизата белка, пептида или смеси пептидов уменьшает или устраняет увеличенную слабость творога, которая обычно происходит в таких случаях. Настоящее изобретение касается способа производства творога или сыра из молочного источника, включающего следующие шаги: нагревание молока,-2 012373 добавление к термически обработанному молоку гидролизата белка, и/или пептида, и/или смеси пептидов,добавление к термически обработанному молоку коагулянта, формирующего гель, и переработка образованного геля в сырный творог и отделение сыворотки от творога. Поэтому, изобретение касается способа производства сыра, включающего технологическую обработку сырного молока при повышенной температуре в течение достаточного периода времени, предпочтительно чтобы служить причиной ухудшения режима свертывания молока в течение этапа коагуляции,добавление к термически обработанному сырному молоку гидролизата белка и/или пептида и/или смеси пептидов, добавление к термически обработанному молоку коагулянта, чтобы сформировать гель, и обработку сформированного геля в сырный творог и отделение сыворотки от творога. Согласно настоящему технологическому процессу получен творог, который включает гидролизат и который предпочтительно имеет время свертывания (r) 20 мм или меньше (соответствующий 10 мин или менее), более предпочтительно 18 мм или менее (соответствующий 9 мин или менее) и предпочтительно сила творога(k20) 100 мм или менее, более предпочтительно 90 мм или менее. Время свертывания измерено согласно методу примера 2. Изобретение также описывает использование гидролизата и/или пептида и/или смеси пептидов, чтобы уменьшить время свертывания в процессе производства сыра, посредством использования термически обработанного молока, и использование гидролизата, чтобы увеличить плотность творога в процессе производства сыра, в соответствии с чем использовали термически обработанное молоко. Предпочтительно пептид содержит от 2 до 5 аминокислот. Смесь пептида содержит по меньшей мере один пептид, который включает от 2 до 5 аминокислот. Гидролизат содержит по меньшей мере один пептид, который включает от 2 до 5 аминокислот. Преимущественно по меньшей мере одной из аминокислот пептида является остаток Glu или Asp, или пептид содержит остаток Lys-Lys, или пептид является дипептидом Lys-Lys. В этом тексте термины молочная композиция и молоко будут использоваться взаимозаменяемо; молоко здесь рассматривают как пример молочной композиции. Другой аспект изобретения относится к способу производства сыра, включающему 1) обработку сырного молока посредством термической обработки, 2) добавление к охлажденному сырному молоку гидролизата белка, и/или пептида, и/или смеси пептида и 3) производство сыра из вышеуказанной молочной композиции. Дальнейший аспект изобретения касается сыра, произведенного способом изобретения. Подробное описание изобретения Сыр В настоящем контексте термин сыр относится к любому виду сыра, такому как, например, натуральный сыр, аналоги сыра и плавленый сыр. Сыр может быть получен любым подходящим способом,известным в данной области техники, таким как, например, ферментативной коагуляцией молочной композиции с сычугом, или кислой коагуляцией молочной композиции с пищевой кислотой или кислотой,продуцируемой ростом молочно кислых бактерий. В одном воплощении сыр, произведенный способом изобретения, является сычужно-твороженный сыр. Молочная композиция может быть подвергнута традиционному процессу сыроделия. Плавленый сыр предпочтительно изготавливают из натурального сыра или аналогов сыра, готовя и эмульгируя сыр, например, с эмульгирующими солями (например, фосфатами и солями лимонной кислоты). Процесс может сверх того включать добавление специй/приправ. Термин аналоги сыра относится к сыроподобным продуктам, которые содержат жир (такой как,например, молочный жир (например, сливки) как часть композиции и который более того содержит, как часть состава, немолочный компонент, такой как, например, растительное масло). Сыр, произведенный способом настоящего изобретения, включает все разновидности сыра, такие как мягкий сыр, полутвердый сыр и твердый сыр. В изготовлении сыра коагуляцию молочной композиции предпочтительно выполняют или сычугом или окислением, имеющем в результате сычужнотвороженный и кисло-твороженный сыр, соответственно. Свежие кисло-твороженные сыры относятся к тем разновидностям сыра, изготовленным коагуляцией молока, сливок или сыворотки через скисание или комбинацию кислоты и высокой температуры, и которые готовы к потреблению, как только завершат производство без созревания. Свежие кисло-твороженные сыры вообще отличаются от разновидностей сычужно-твороженного сыра (например, Камемберт, Чеддер, Эмментал), где коагуляцию обычно вызывают действием сычуга при значениях рН 6,4-6,6, в которых коагуляция обычно происходит близко к изоэлектрической точке казеина, то есть, например при рН 4,6 или при более высоких значениях, когда используют повышенные температуры, например в Рикотта при рН типично около 6,0 и температуре типично около 80 С. В предпочтительном воплощении изобретения сыр принадлежит к классу сычужнотвороженных сыров. Моццарелла - представитель так называемой пасты филата filata или эластичного stretched творога,сыр, который обычно отличает уникальная пластифицирующая и смешивающая обработка свежего творога в горячей воде, которая придает конечному сыру его характерную волокнистую структуру и тающие и растягивающие свойства. В одном воплощении изобретение далее включает обработку высокотемпера-3 012373 турным растяжением как для сыров пасты филата, таких как для производства Моццарелла. Молочная композиция Молочная композиция согласно изобретению может быть любой композицией, включающей молочные компоненты. Молочные компоненты могут быть любым компонентом молока, таким как молочный жир, молочный белок, казеин, сывороточный белок и лактоза. Молочной фракцией может быть любая фракция молока, такая как, например, снятое молоко, масляное молоко, сыворотка, сливки, молочный порошок, порошок цельного молока, порошок снятого молока. В предпочтительном воплощении изобретения молочная композиция включает молоко, снятое молоко, масляное молоко, цельное молоко,сыворотку, сливки, или любое их сочетание. В более предпочтительном воплощении молочная композиция состоит из молока, такого как снятое молоко, цельное молоко, сливки или любое их сочетание. В дальнейших воплощениях изобретения молочную композицию готовят полностью или частично из сухих молочных фракций, таких как, например, порошок цельного молока, порошок снятого молока,казеин, казеинат, общий молочный белок или порошок пахты buttermilk или любое их сочетание. Согласно изобретению молочная композиция включает коровье молоко или одну или более фракции коровьего молока. Фракции коровьего молока могут быть от любой породы коровы (Bos Taurus (Bostaurus taurus), Bos indicus (Bos indicus taurus) и их гибридов. В одном воплощении молочная композиция включает коровье молоко и/или фракции коровьего молока, возникающие из двух или более пород коров. Молочная композиция также включает молоко от других млекопитающих, которые используют для приготовления сыра, например молоко, полученное от козы, буйвола или верблюда. Вообще сыр будет изготовлен из термически обработанного молока согласно настоящему изобретению. Также молоко, которое содержит по меньшей мере 20 вес.%, предпочтительно по меньшей мере 30 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 70 вес.% термически обработанного молока и остаток молока, которое не является термически обработанным согласно настоящему замыслу. Молочная композиция для производства сыра может быть стандартизирована к заданной композиции удалением всего или части любой из компонентов сырого молока и/или добавлением к той дополнительных количеств таких компонентов. Это может быть сделано, например, разделением молока на сливки и молоко при поступлении в сыроварню. Таким образом, молочная композиция может быть приготовлена, как выполняется традиционно, фракционированием молока и рекомбинированием фракций, чтобы получить заданный конечный состав молочной композиции. Разделение может быть выполнено в непрерывных центрифугах, ведущих к фракции снятого молока с очень низким содержанием жира (то есть 0,5%) и сливок, например, с 35 %-м жиром. Молочная композиция может быть приготовлена смешиванием сливок и снятого молоко. В другом воплощении содержание белка и/или казеина могут быть стандартизированы использованием ультрафильтрации. Молочная композиция может иметь любое общее содержание жира, которое считают подходящим для сыра, который будет произведен способом изобретения. В одном воплощении изобретения кальций добавляют к молочной композиции. Кальций может быть добавлен к молочной композиции в любом подходящем этапе до и/или в течение производства сыра, например до, одновременно с, или после добавления заквашивающей культуры. В предпочтительном воплощении кальций добавляют либо до, либо после термической обработки. Кальций может быть добавлен в любой подходящей форме. В предпочтительном воплощении кальций добавляют как соль кальция, например как CaCl2. Любое подходящее количество кальция может быть добавлено к молочной композиции. Концентрация добавленного кальция обычно будет 0,1-5,0 мМ, например между 1 и 3 мМ. Если CaCl2 добавляют к молочной композиции, количество обычно составляет 1-50 г на 100-литровую молочную композицию, например 5-30 г на 1000-литровую молочную композицию, предпочтительно 1020 г на 100-литровую молочную композицию. Содержание бактерий снятого молока может быть понижено стандартными этапами. В воплощении изобретения, молочная композиция может быть подвергнута процессу гомогенизации перед производством сыра, например в производстве датского синего сыра. Термическая обработка Известно, что термическая обработка молока в течение операций промышленной обработки приводит к некоторым физико-химическим изменениям в молочных компонентах. Тип изменений и степень этих изменений определяются температурой обработки, время термической обработки и составом молока, таким как его рН, концентрация белка и жира и наличие катионов подобных, например кальцию и магнию. Иногда, различная комбинация параметров может приводить к тому же самому или похожему конечному результату. Например, короткая термическая обработка при высокой температуре может иметь похожие эффекты, как и более длительная термическая обработка при низкой температуре. Это известно эксперту в области, как экспериментальные параметры должны быть изменены, чтобы получить подобные конечные результаты для различных маршрутов обработки, или как такие маршруты должны быть установлены. Согласно изобретению молочную композицию термически обрабатывают при повышенной температуре в течение времени, которое является предпочтительно достаточным, чтобы служить причиной-4 012373 ухудшенной коагуляции молока на этапе коагуляции. Под термически обработанным молоком подразумевают молоко, которое обрабатывают при температуре по меньшей мере 75 С в течение по меньшей мере 1 с, предпочтительно по меньшей мере 1 мин, более предпочтительно по меньшей мере 10 мин. Термическая обработка может быть выполнена при температуре по меньшей мере 75 С, предпочтительно по меньшей мере 80 С. В одном воплощении термическую обработку проводят при температуре между 75 и 145 С, в предпочтительном воплощении термическую обработку проводят при температуре между 75 и 120 С, в более предпочтительном воплощении термическую обработку проводят при температуре между 75 и 100 С, в еще более предпочтительном воплощении термическую обработку выполняют между 80 и 90 С. Продолжительностью термической обработки может быть любое время, подходящее,чтобы достигнуть ухудшенного режима свертывания молока. В одном воплощении продолжительность термической обработки между 1 с и 30 мин. В одном воплощении термическую обработку проводят при 75-90 С в течение 5 с до 30 мин, в другом воплощении термическую обработку проводят при 80-90 С в течение 2 с до 30 мин, в еще дополнительном воплощении термическую обработку проводят при 80145 С в течение 1 с до 20 мин. Термическую обработку могут проводить любым методом, известным в данной области техники, таким как, например, в пластинчатом теплообменнике, нагреванием объемным способом молока в резервуаре или контейнере или нагнетанием пара. Термическая обработка сывороточных белков, каждого отдельно, в смеси или в молоке, является хорошо известным явлением и было описано в литературе (например, MulvihillDonovan (1987) Ir. J. Food Sci. Techn. 11, 43-75). Количественный анализ денатурации сывороточных белков может быть измерен определением утраты растворимости в изоэлектрическом диапазоне рН или на насыщении NaCl. Другое проявление денатурации сывороточных белков - повышенная реакционная способность боковых групп, особенно сульфгидрильных группы -лактоглобулина (MulvihillDonovan (1987) Ir. J. Food Sci. Techn. 11, 43-75 и ссылки расположенные там). Пастеризация молока перед производством сыра имеет в результате очень ограниченную денатурацию сывороточных белков, меньше чем 20% и предпочтительно меньше чем 10% денатурации. Когда термическая обработка более серьезна, степень денатурации будет увеличиваться, как описано в литературе (например, LawLeaver (1997) J Agric Food Chem 45, 4255-4261; LawLeaver (2000) J AgricFood Chem 48, 672-679). В отличие от пастеризации термическая обработка будет иметь в результате намного более высокую степень денатурации сыворотки - по меньшей мере 30% или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70% или даже по меньшей мере 80%. Эффект термической обработки очень чувствителен ко времени нагревания и точной температуре. Небольшие изменения во времени нагревания имеет следствием изменением свойств нагретого молока. В производственной среде, процессы нагревания очень хорошо управляемы и стандартизированы. Лабораторные процессы более трудны, чтобы управлять, и маленькие изменения, например, времени нагревания могут иметь следствием небольшие изменения свойств нагретого молока. Следствием этого являются различия 10-20%) между отдельными объемами нагретого молока, зависящими от свойства, которое измеряют. Гидролизаты белка Под гидролизатом белка подразумевают продукт, который образуется гидролизом белка (или кратко гидролизат белка или гидролизованный белок), или фракция этого гидролизата белка, например фракция, которая содержит растворимые пептиды, или смесь гидролизата белка и фракции гидролизата белка. Гидролизаты белка могут быть приготовлены инкубацией источника белка с одной протеазой или комбинацией протеаз. Такими протеазами могут быть любого типа протеазы, включая, но не ограниченные эндопротеазы, аминопептидазы, карбоксипептидазы или ди- и триаминопептидазы. Также гидролизаты, произведенные без ферментов или произведенные частично ферментативно являются частью настоящего изобретения, например гидролизаты могут быть произведены, используя кислоты или комбинацию кислотной обработки и ферментативной обработки. Источник белка может в принципе быть любым источником белка. Предпочтительным источником является белок сыворотки, белок казеина или смесь этого, более предпочтителен белок сыворотки. Композиция, включающая белок сыворотки, согласно изобретению может быть любой композиции, включающая белок сыворотки, например молоко, сливки и сырная сыворотка. Сыворотка, полученная из любого источника сыра, может быть использована, включая сыр чеддер, швейцарский сыр, сыр моццарелла и т.п. Композиция, включающая белок сыворотки, может быть любым водным раствором, содержащим белок сыворотки. Белок сыворотки может быть получен любым способом, известным в данной области техники. Заготовки белка сыворотки коммерчески доступны в нескольких формах, таких как концентраты сывороточного белка (WPC) и выделения сывороточного белка (WPI). Примеры таких коммерчески доступных заготовок - BiPro (от Davisco, США), и Lacprodan MFGM-10 или Lacprodan Alpha-10 (от ArlaFoods, Дания). Подходящие субстраты белка для гидролиза также включают цельное молоко, снятое молоко, кислый казеин, сычужный казеин, продукты кислой сыворотки или продукты сырной сыворотки. Кроме того, растительные субстраты подобно клейковине пшеницы, молотому ячменю и фракциям белка, полученным из, например, сои, риса или зерна являются подходящими субстратами. Пример подходящей коммерчески доступной заготовки клейковины пшеницы является SWP-500 (TateLyle, Бель-5 012373 гия). Также в способе изобретения преимущественно используют гидролизаты дезамидированной клейковины. Гидролизаты белка могут быть приготовлены контактированием субстрата белка с одним протеолитическим ферментом или комбинацией протеолитических ферментов. Предпочтительно используют по меньшей мере одну эндопротеазу, более предпочтительно по меньшей мере две или более эндопротеаз. Особенно подходящими являются широкий спектр эндопротеаз таких как алкалаза и коллупулин. Под широким спектром эндопротеаз подразумевают эндопротеазы, который имеют по меньшей мере три предпочтительных участка расщепления. Примеры - папаин, субтилизин, панкреатин, щелочная сирин протеаза (например, эспераза). Может быть использована также смесь множества ферментов, особенно смесь содержащая эндопротеазы, такие как препараты, полученные из Aspergillus orzae или Aspergillusniger. В случае если используют больше чем одну протеазу, эти протеазы могут быть добавлены к субстрату белка одновременно. Альтернативно, протеазы можно добавить к белку в предписанной последовательности. По выбору добавление следующей протеазы начинают с инактивации протеаз, которые были использованы ранее в процессе гидролиза. Такая инактивация может быть достигнута различными способами, и метод выбора зависит от протеазы, которая должна быть инактивирована. Инактивационные обработки включают, но не ограничены термической обработкой и изменением рН. По выбору могут быть использованы коммерчески доступные гидролизаты. Степень гидролиза (СГ) субстрата белка - важный параметр. СГ, которая может быть достигнута для гидролизата белка и зависит от большого количества параметров, которые включают, но не ограничены выбором для специфической протеазы, время, которое разрешено для продолжения гидролиза, условия реакции (рН, температура, концентрация соли и т.д.) и предварительная обработка субстрата белка прежде, чем его подвергнут гидролизу протеазой. СГ гидролизата, подходящего для процесса согласно изобретению может колебаться от 5-60, предпочтительно от 10-45, более предпочтительно от 15-40. Гидролизат может содержать свободные аминокислоты. Методы, чтобы определять СГ известны экспертам в области техники, например ОРА-метод OPA-method, описанный Dambmann, С. Improved method fordetermining food protein degree of hydrolysis Journal of Food Science 2001, 66, 642-646. Гидролизаты могут быть далее обработаны различными способами, методами, включая, но, не ограничивая, распылительную сушку, ультрафильтрацию, лиофилизацию, вакуумную сушку. После высыхания сухой материал может быть измельчен и/или просеян, для того чтобы получить фракции особого диапазона размера частицы. Соединения могут быть добавлены к гидролизату, чтобы облегчить высыхание или влиять на конечные характеристики высушенного гидролизата, такие как его тенденцию формировать комки или его смачиваемость. Пептиды"Пептид" или "олигопептид" определяют здесь как цепь по меньшей мере двух аминокислот, которые связаны через пептидные связи. Термины "пептид" и "олигопептид" считают синонимичными (как обычно признают), и каждый термин может быть использован попеременно, как требует контекст. "Полипептид" определяют здесь как цепь, содержащую более чем 30 остатков аминокислоты. Все формулы(олиго)пептида и полипептида или последовательности здесь написаны слева направо в направлении отN-конца к С-концу, в соответствии с общей практикой. Пептид, состоящий из 2-5 аминокислот предпочтителен. Преимущественно пептиды, имеющие общий отрицательный заряд при рН 6,5, используют в способе изобретения. Этот общий отрицательный заряд опосредован наличием одной или более отрицательно заряженных боковых цепей аминокислот. Так что также аминокислоты, которые отрицательно заряжены, например, из-за гликозилирования и/или фосфорилирования, являются очень полезными в процессе настоящего изобретения. Предпочтительно по меньшей мере одна из аминокислот пептида - Glu (Глутамат) или Asp (Аспартат). Пептиды, которые содержат Lys (лизин), Arg (аргинин) или His (гистидин), являются менее подходящими. Однако пептиды,которые содержат остаток Lys-Lys, неожиданно показали хорошие результаты в настоящем способе. Особенно дипептид Lys-Lys преимущественно используют. В случае, когда используют смесь пептидов,предпочтительно по меньшей мере 20 мол.% пептидов содержат Glu и/или Asp. Последовательность аминокислот пептида предпочтительно также присутствует в белке молока,предпочтительно в казеине. Так что пептид может быть получен, гидролизуя казеин, чтобы образовать пептид. Пептид может также быть получен искусственно. Также может быть использована смесь пептидов или смесь гидролизата и один или более пептидов могут быть использованы. Вообще по меньшей мере 0,3 мМ и предпочтительно по меньшей мере 0,6 мМ пептида присутствуют в молоке в способе настоящего изобретения. Предпочтительно по меньшей мере 0,3 мМ и предпочтительно по меньшей мере 0,6 мМ пептида, состоящего из 2-5 аминокислот присутствуют в молоке в способе настоящего изобретения. В случае если добавляют больше чем один пептид, количество пептидов в молоке вообще должно присутствовать по меньшей мере 0,3 мМ и предпочтительно по меньшей мере 0,6 мМ пептидов. Также гидролизаты, добавленные к молоку в количестве по меньшей мере 0,3 мМ пептидов, предпочтительно по меньшей мере 0,3 мМ пептидов, состоящих из 2-5 аминокислот, предпочтительны.-6 012373 Протеолитические ферменты Белки могут быть рассмотрены как гетерополимеры, которые состоят из стандартных блоков аминокислот, соединенных пептидной связью. Повторяющейся единицей в белках является центральный альфа углеродный атом с аминогруппой и карбоксильной группой. За исключением глицина так называемая боковая цепь аминокислоты заменяет один из двух оставшихся атомов водорода альфа углерода. Боковая цепь аминокислоты отдает центральный альфа асимметричный углерод. Вообще в белках обнаружены L-энантиомер аминокислоты. Следующие термины описывают различные типы полимеризированных аминокислот. Пептиды - короткие цепи остатков аминокислот с определенной последовательностью. Хотя нет действительно максимума числа остатков, термин обычно означает цепь, свойства которой главным образом определены в соответствии с составом ее аминокислот и которая не имеет постоянной трехмерной структуры. Термин полипептид обычно используется для более длинных цепей,обычно определенной последовательности и длины и в принципе соответствующей длине, чтобы сворачиваться в трехмерную структуру. Белок используют для полипептидов, которые встречаются в природе и показывают определенную трехмерную структуру. В случае если главной функцией белков является катализ химической реакции, его обычно называют ферментом. Протеазы - ферменты, которые катализируют гидролиз пептидной связи в (поли)пептидах и белках. При физиологических условиях протеазы катализируют гидролиз пептидной связи. Международный Союз Биохимии и Молекулярной Биологии (1984) рекомендовал использовать термин пептидаза для подмножества гидролаз пептидной связи (Подкласс Е.С 3.4.). Термины протеаза и гидролаза пептида синонимичны с пептидазой и могут также использоваться здесь. Протеазы включают два класса ферментов: эндо-пептидазы и экзо-пептидазы, которые разрезают пептидные связи в точках белка и удаляют аминокислоты последовательно или от N или от С-конца соответственно. Протеиназу используют как синоним для эндо-пептидазы. Пептидная связь может встречаться в контексте ди-, три-, тетра-пептиды,пептиды, полипептиды или белки. Вообще аминокислотный состав природных пептидов и полипептидов включает 20 различных аминокислот, которые показывают L-конфигурацию (кроме глицина, который не имеет хирального центра). Однако протеолитическая активность протеаз не ограничена пептидами, которые содержат только 20 природных аминокислот. Пептидная связь между так называемыми искусственными аминокислотами могут быть также расщеплены, а также пептидные связи между модифицированными аминокислотами или аналогами аминокислот. Некоторые протеазы допускают наличие D энантиомеров аминокислот в определенных положениях. Вообще замечательная стереоселективность протеаз делает их очень полезными в процессе химического растворения. Многие протеазы показывают интересные дополнительные активности, такие как эстеразная активность, тиол эстеразная активность и(дез)амидазную активность. Эти дополнительные активности обычно не ограничиваются только аминокислотами и могли бы оказаться очень полезными в биоконверсиях в области химических продуктов тонкого органического синтеза. Эукариотические микробные протеазы были рассмотрены Норсом (North) (1982). Позже, Суарез Рендуелес (Suarez Rendueles) и Вульф (Wolf) (1988) рассмотрели протеазы S. cerevisiae и их функцию. Кроме гидролитического разрыва связей протеазы могут также быть применены в формировании связей. Связи в этом аспекте включают не только пептидные и амидные связи, но также и сложноэфирные связи. Катализирует ли протеаза разрыв или формирование специфической связи действительно, в первую очередь зависит от термодинамики реакции. Фермент, такой как протеаза, не затрагивает равновесие реакции. Равновесие зависит от специфических условий, при которых происходит реакция. При физиологических условиях термодинамика реакций происходит в пользу гидролиза пептида из-за термодинамически очень устойчивой структуры цвиттерионного продукта. Применение физико-химических принципов, чтобы влиять на равновесие, или управляя концентрациями или природой реагентов и продуктов, или используя кинетические параметры ферментативной реакции можно применять протеазы с целью синтеза пептидных связей. Добавление водных смешиваемых органических растворителей уменьшает степень ионизации карбоксильного компонента, таким образом, увеличивая концентрацию субстрата, доступного для реакции. Чтобы способствовать осаждению продуктов, часто используют двухфазные системы, водоподобные, обратные мицеллы, безводная среда, или модифицированные амино и карбоксильные группы, чтобы улучшить выход. Когда доступны протеазы с правильными свойствами, применение протеаз для синтеза предполагает существенные преимущества. Поскольку протеазы являются стереоселективными, так же как и региоселективными, чувствительные группы на реагенты обычно не нуждаются в защите, и реагенты не должны быть оптически чистым. Поскольку условия ферментативного синтеза умеренны, рацемизация и разложение неустойчивых реагентов, или изделия могут быть предотвращены. Кроме связей между аминокислотами, также другие соединения, содержащие первичную аминогруппу, тиольную группу или карбоксильную группу могут быть соединены должным образом селективными протеазами. Кроме того, эфиры, тиоловые эфиры и амиды могут быть синтезированы определенными протеазами. Показано, что протеаза проявляет региоселективность в ацилировании моно, ди- и три-сахаридов, нуклеозидов, и рибофлавине. Проблемы со стабильностью при иногда жестких реакционных условиях могут быть предотвращены надлежащей формулировкой. Инкапсуляция и иммобилизация делают не только стабильные ферменты, но также делает возможным легкое восстанов-7 012373 ление и разделение от реакционной среды. Пространственное структурирование, обработка альдегидами или покрытием поверхности определенными полимерами, такими как декстраны, полиэтиленгликоль,полиимины могут существенно продлить время жизни биокатализатора. Кажется, что селективность ограниченного протеолиза свойственна более непосредственно взаимодействию протеиназа-субстрат. Специфика может быть получена из протеолитического фермента, который распознает только определенные аминокислотные целевые последовательности. С другой стороны,это может также быть результатом селективного подвергания участка обработки при определенных условиях, таких как рН, ионная сила или вторичная модификация, таким образом, позволяющие иначе неспецифической протеазе катализировать весьма специфичный случай. Активация вакуолярных зимогенов ограниченным протеолизом дает пример последнего вида. Известны четыре главных класса протеаз и определяются основными функциональными группами в их активном сайте: серии, тиол или цистеин, аспарагиновая или карбоксил и метало протеазы. Детальное современное положение обзора этих главных классов протеаз, второстепенных классов и неклассифицированных протеаз могут быть найдены в Методах в Энзимологии части 244 и 248(A.J.Barrett ed, 1994 and 1995). Кроме каталитического механизма протеаз другим важным аспектом протеолитических ферментов является специфичность протеаз. Специфичность протеазы указывает, какие субстраты протеаза, вероятно, будет гидролизировать. Двадцать природных аминокислот предлагают большое количество возможностей, чтобы составить пептиды. Например, с двадцатью аминокислотами могут составлять уже 400 дипептидов и 800 различных трипептидов, и так далее. С более длинными пептидами число возможностей станет почти неограниченным. Определенные протеазы гидролизуют только специфические последовательности в очень специфическом положении. Взаимодействие протеазы с пептидным субстратом может охватить от одного до десяти остатков аминокислот пептидного субстрата. С большим белковым субстратом могут быть даже больше остатков субстрата, которые взаимодействуют с протеазами. Однако это вероятно вызывает менее специфичные взаимодействия с остатками протеазы вне расселины закрепления активного сайта. Вообще специфическое узнавание ограничивают линейным пептидом, который связан в активном сайте протеазы. Номенклатура, чтобы описать взаимодействие субстрата с протеазой была введена в 1967 Щечтером (Schechter) и Бергером (Berger) (Biochem. Biophys. Res. Com., 1967, 27, 157-162) и теперь широко используется в литературе. В этой системе, полагают, что остатки аминокислот полипептидного субстрата связываются с так называемыми подсайтами в активном сайте. В соответствии с соглашением эти подсайты на протеазе называют S (для подсайтов), и соответствующие остатки аминокислоты называют Р (для пептида). Остатки аминокислоты N-конца неустойчивой химической связи нумеруют P3, Р 2, Р 1 и те остатки С-конца нумеруют P1', Р 2', P3'. Р 1 или P1' остатки - остатки аминокислоты, расположенные около неустойчивой химической связи. Остатки субстрата вокруг сайта разрыва могут тогда быть пронумерованы до Р 8. Соответствующие подсайты на протеазе, которые комплементарны остаткам связывания субстрата нумеруют S3, S2, S1, S1', S2', S3', и т.д, и т.д. Преимущества подсайтов в сайте пептидной связи определяют преимущество протеазы для разрывания определенных специфических последовательностей аминокислот в специфическом месте. Последовательность аминокислот субстрата должна соответствовать преимуществам, проявленным подсайтами. Специфичность по отношению к определенному субстрату, очевидно, обусловлена как сродством связи для субстрата, так и скоростью, при которой впоследствии неустойчивую химическую связь гидролизуют. Поэтому специфичность протеазы для определенного субстрата обычно указывается его kcat/Km отношением, лучше известным как константа специфичности. В этой константе специфичности kcat представляет скорость оборота, и Km - константа диссоциации. Кроме остатков аминокислот, вовлеченных в катализ и связывание, протеазы содержат много других важнейших остатков аминокислот. Некоторые остатки являются необходимыми в сворачивании, некоторые остатки поддерживают полную пространственную структуру протеазы, некоторые остатки могут быть вовлечены в регулирование протеолитической активности, и некоторые остатки могут нацеливать (target) протеазу для специфического местоположения. Много протеаз содержат снаружи один активный сайт или более сайтов связывания для металлических ионов. Эти металлические ионы часто играют роль в стабилизации структуры. Кроме того, выделенные эукариотические микробные протеазы могут быть в значительной степени гликозилированы. Происходит как N-, так и О-связанное гликозилирование. Гликозилирование может помочь сворачиванию белка, может увеличить растворимость, предотвратить агрегацию и, по существу, стабилизировать сформировавшийся белок. Кроме того, степень гликозилирования может влиять на секрецию, так же как связывание воды белком. В принципе модулярная организация больших белков - огромная область в природе. В особенности больших мультимодульных структур типичные протеолитические модули показывают размеры 100-400 аминокислот в среднем. Это соответствует среднему размеру большинства глобулярных протеолитических ферментов, которые выделены в среду. Как обсуждено выше полипептидные модули являются полипептидными фрагментами, которые могут закрыться и функционировать как независимые объекты. Другой термин для таких модулей - домены. Однако домен используют в более широком контексте, чем-8 012373 модуль. Термин домен, как используют здесь, относится обычно к части полипептидной цепи, которая изображает в трехмерной структуре типичную топологию сворачивания. В белке домены взаимодействуют в переменных степенях, но менее сильно, чем делают структурные элементы домена. Другие термины, такие как субдомен и единица сворачивания также используют в литературе. По существу замечено, что много белков, которые разделяют специфические функциональные возможности, могут разделить те же самые домены. Такие домены могут быть признаны от первичной структуры, которая может представлять образцы определенной последовательности, которые являются типичными для специфического домена. Типичными примерами являются мононуклеотид связывающий сгиб, домены, связывающие целлюлозу, спираль-петля-спираль ДНК связывающий мотив binding motif, zinc fingers, EF hands,мембранные якоря. Модули относятся к тем доменам, которые, как ожидается, могут закрыться и функционировать автономно. Специалист в данной области техники знает, как идентифицировать специфические домены в первичной структуре, применяя обычно доступное программное обеспечение к упомянутой структуре и соответственным последовательностям от других организмов или видов. Хотя многомодульные или многодоменные белки могут иметь вид как нитка бус, собрания существенно более сложной структуры наблюдали. В случае если различные бусинки находятся на той же самой полипептидной цепи, бусинки вообще называют модулями или доменами. Когда бусинки не находятся на одной и той же полипептидной цепи, но формируют собрания через нековалентные взаимодействия, тогда используют термин субъединица, чтобы обозначить бусинку. Субъединицы могут быть транскрибированы одним и тем же геном или различными генами. Многомодульный белок может стать протеолитически обработанным после транскрипции, ведущей к многочисленным субъединицам. Отдельные субъединицы могут состоять из многочисленных доменов. Типично меньшие глобулярные белки 100-300 аминокислот обычно состоят только из одного домена. Вообще протеазы классифицируют согласно их молекулярным свойствам или согласно их функциональным свойствам. Молекулярная классификация основана на первичной структуре протеазы. Первичная структура белка представляет его аминокислотную последовательность, которая может быть получена из последовательности нуклеотида соответствующего гена. Прослеживаемые в значительной степени подобия в первичных структурах могут предусматривать уведомление о сходствах в каталитическом механизме и других свойствах, которые даже могут распространяться на функциональные свойства. Термин семейство используют, чтобы описать группу протеаз, которые показывают эволюционное родство, основанное на подобии между их первичными структурами. Члены такого семейства, как полагают,возникли благодаря дивергентной эволюции от того же самого предка. В пределах семейства, далее подклассификация первичных структур, основанная на более детальной обработке сравнений последовательности, кончается подсемействами. Классификация по трехмерному сгибу протеаз может включать вторичную структуру, третичную структуру и четвертичную структуру. Вообще классификация на вторичной структуре ограничена величиной и явной ориентацией элементов вторичных структур. Подобия в третичной структуре вели к представлению суперсемейств или кланов. Суперсемейство или клан - группа семейств, которые, как полагают, имеют общую родословную, поскольку они показывают общий 3 мерный сгиб. Вообще третичная структура является более сохраненной, чем первичная структура. Поскольку значимое подобие первичной структуры не всегда отражает подобные функциональные свойства. Фактически функциональные свойства могут отклоняться существенно, имея результатом интересные новые свойства. В настоящее время четвертичная структура не применялась, чтобы классифицировать различные протеазы. Это могло бы произойти вследствие некоторого пристрастия структурных баз данных по отношению к простым глобулярным протеазам. Многие протеолитические системы, которые подвергают активации, регулированию, или каскадам сложных реакций, вероятно, будут состоять из многочисленных доменов или субъединиц. Общие темы в структурной организации таких систем протеаз могут приводить к новым типам классификации. В отсутствии информации о последовательности протеазы подвергают различному типу функциональной классификации. Классификация и обозначение ферментов по отношению к реакциям, которые катализируют, является общим принципом в номенклатуре ферментов. Этот подход является также основным принципом ЕС нумерации ферментов (Номенклатура Ферментов 1992 Академическое издание,Орландо). Два типа протеаз (ЕС 3.4) могут быть признаны в рамках Номенклатуры Ферментов 1992, экзо-пептидазы (ЕС 3.4.11-19) и эндо-пептидазы (ЕС 3.4.21-24, 3.4.99). Эндопептидазы разрывают пептидные связи во внутренних областях пептидной цепи, далеко от концов. Экзопептидазы разрывают только остатки от концов пептидной цепи. Экзопептидазы, действующие при свободных N-концах, могут освободить один остаток аминокислоты, дипептид или трипептид и называются соответственно аминопептидазами (ЕС 3.4.11), дипептидил пептидазы (ЕС 3.4.14) и трипептидил пептидазы (ЕС 3.3.14). Протеазы,начинающие обработку пептида от карбоксильного конца, освобождающие отдельную аминокислоту,называют карбокси пептидазой (ЕС 3.4.16-18). Пептидил дипептидазы (ЕС 3.4.15) удаляют дипептид от карбоксильного конца. Экзо- и эндопептидаза в одной являются дипептидазами (ЕС 3.4.13), которые разрывают специфично только дипептиды в их двух аминокислотных половинах. Омега пептидазы (ЕС 3.4.19) удаляют концевые остатки, которые являются или замещенными, циклическим, или связанными изопептидными связями.-9 012373 Кроме положения, где протеаза разрывает пептидную цепь, для каждого типа протеазы, дальнейшее разделение возможно основано на природе предпочтительных аминокислотных остатков в субстрате. Вообще можно отличить протеазы с широкой, средней и узкой специфичностью. Некоторые протеазы просто названы в честь определенных белков или полипептидов, которые они гидролизуют, например кератиназа, коллагеназа, эластаза. Узкая специфичность может быть связана с одной отдельной аминокислотой или одной отдельной последовательностью, которая удалена или которая разорвана соответственно. Когда протеаза проявляет специфическое предпочтение к одной аминокислоте в позиции Р 1 илиP1' название этой аминокислоты может быть определителем. Например, пролил амино пептидаза удаляет пролин от аминоконца пептида (пролин является остатком Р 1). Х-Pro или пролин используют, когда связь на аминостороне пролина разорвана (пролин является остатком P1'), например пролин скарбоксипептидаза удаляет пролин из карбоксильного конца. Пролил эндопептидаза (или Pro-Х) разрывает позади пролина, в то время как пролин эндопептидаза (Х-Pro) разрывает перед пролином. Остаток аминокислоты перед неустойчивой химической пептидной связью относится к остатку аминокислоты, который вносит карбоксильную группу в пептидную связь. Остаток аминокислот позади неустойчивой химической пептидной связи к остатку аминокислоты, который вносит аминогруппу в пептидную связь. Согласно общему соглашению цепь аминокислот следует от аминоконца (начало) к карбоксильному концу (конец) и перечисляется соответственно. Эндопротеазы могут также проявлять абсолютное предпочтение специфической аминокислоте в положении Р 1 или P1', например глицил эндопептидаза, пептидил-лизин эндопептидаза, глутамил эндопептидаза. Кроме того протеазы могут проявлять предпочтение определенной группе аминокислот, которые имеют определенное сходство. Такая группа предпочтительных аминокислот может включать гидрофобные аминокислоты, только большие гидрофобные аминокислоты, маленькие гидрофобные, или только маленькие аминокислоты, большие положительно заряженные аминокислоты, и т.д., и т.д. Кроме предпочтения остатков Р 1 и P1', также специфическое предпочтение или исключения могут существовать для остатков, предпочтительных другими подсайтами на протеазе. Такое многократное предпочтение может кончиться протеазами, которые являются очень специфичными только для тех последовательностей, которые удовлетворяют обязательные многократные требования в то же самое время. Вообще должно быть понято, что протеазы являются довольно разнородным ферментами. Даже очень специфическая протеаза может разрывать пептиды, которые не соблюдают вообще наблюдаемое предпочтение протеазы. Кроме того, должно быть понято, что внешние условия, такие как рН,температура, ионная сила, водная активность, присутствие растворителей, присутствие конкурирующих субстратов или ингибиторов могут влиять на предпочтение протеаз. Внешние условия могут не только влиять на протеазу, но также и влиять на способ, которым белковый субстрат представлен протеазе. Протеазы могут быть подразделены на основе их каталитического механизма. Необходимо понимать, что для каждого каталитического механизма вышеупомянутая классификация, основанная на специфичности, ведет к дальнейшему подразделению для каждого типа механизма. Четыре главных класса протеаз известны и определены основной функциональной группой в активном сайте: серинпротеазы(ЕС 3.4.21 эндопептидаза, ЕС 3.4.16 карбоксипептидаза), тиол или цистеинпротеазы (ЕС 3.4.22 эндопептидаза, ЕС 3.4.18 карбоксипептидаза), карбоксил или аспарагинпротеазы (ЕС 3.4.23 эндопептидаза) и металлопротеазы (ЕС 3.4.24 эндопептидазы, ЕС 3.4.18 карбоксипептидаза). Есть характерные ингибиторы членов каждого каталитического типа протеазы. Эти маленькие ингибиторы безвозвратно изменяют аминокислотный остаток активного сайта протеазы. Например, серинпротеазу инактивируют фенилметансульфонилфторидом (PMSF) и диизопропилфторофосфатом (DFP), которые реагируют с активным серином, тогда как производные хлорометилкетона реагируют с гистидином каталитической триады. Фосфорамидон и 1,10 фенантролин типично ингибируют металлопротеазы. Ингибирование пепстатином вообще указывает аспарагинпротеазу. Е 64 ингибирует особенно тиолпротеазу. Амастатин и бестатин ингибируют различные аминопептидазы. Существенные варьирования в восприимчивости протеаз к ингибиторам наблюдали даже в одном каталитическом классе. До некоторой степени это могло бы быть связано со специфичностью протеазы. В случае если структура сайта связывания препятствует механизму основного ингибитора, для того чтобы приблизиться к каталитическому сайту, тогда такая протеаза избегает ингибирования и препятствует идентификации типа механизма, основанного на ингибировании. Химосташн (Chymostation), например, - мощный ингибитор для серинпротеазы со специфичностью подобно химотрипсину, Эластатинал ингибирует серинпротеазы подобно эластазе и не реагирует с трипсином или химотрипсином, 4 амидо PMSF (APMSF) ингибирует только серии протеазы со специфичностью подобно трипсину. Обзоры по использованию ингибиторов в классификации протеаз включаютBarret and Salvesen, Proteinase Inhibitors, Elsevier Amstardam, 1986; Bond and Beynon (eds), Proteolytic Enzymes, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989; Methods in Enzymology, eds E.J.Barret, volume 244,1994 and volume 248, 1995; E.Shaw, Cysteinyl proteinases and their selective inactivation, Adv Enzymol. 63:271-347 (1990). Каталитический механизм протеаз и требования для его конформационной целостности определяют главным образом условия, при которых протеаза может использована. Обнаружение протеазы, оптимальной в условиях применения, является главной проблемой. Часто условия, при которых протеазы должны быть использованы, не оптимальны и действительно представляют компромисс между опти- 10012373 мальными условиями для специфического применения и условий, которые оптимальны для протеазы. Кроме специфических свойств протеазы, должно быть понятно, что также представление белковых субстратов является зависимыми от условий, и, по существу, определяют также, какие условия являются наиболее эффективными для протеолиза. Технические требования для фермента, которые являются существенными для применения, включают например рН зависимость, температурную зависимость, чувствительность для или зависимость от ионов металлов, ионной силы, концентрации солей, совместимости растворителя. Другой фактор значительной важности - специфическая активность протеазы. Чем выше специфическая активность фермента, тем меньше требуется фермента для специфического преобразования. Более простые требования к ферменту подразумевают более низкие затраты и более низкие уровни загрязнения белка. рН - главный параметр, который определяет действие протеазы в применении. Поэтому рН зависимость - важный параметр, чтобы распределять по группам протеазы. Главными группами, которые являются общепризнанными, являются кислые протеазы, нейтральные протеазы, щелочные протеазы и высоко щелочные протеазы. Оптимум рН до некоторой степени соответствует протеолитическому механизму,например, протеаза аспарагиновой кислоты имеет часто оптимум в кислом рН, металлопротеазы и тиол протеазы часто представляют оптимальный вблизи нейтрального рН немного к щелочному, серинпептидазы главным образом активны в щелочной и высоко щелочной области. Для каждого класса известны исключения. Кроме того, играет роль общая активность воды системы. Оптимум рН протеазы определен как диапазон рН, при котором протеаза обеспечивает оптимальную скорость гидролиза для большинства ее субстратов в определенной окружающей среде при определенных условиях. Этот диапазон может быть узким, например одна единица рН, так же как весьма широким, 3-4 единицы рН. Вообще оптимум рН - также зависит от природы белкового субстрата. Обе скорости оборачиваемости так же как специфичность могут изменяться как функция рН. Для определенной эффективности можно желательно использовать протеазу, далекую от ее рН оптимума, потому что избегают производства менее желательных пептидов. Менее желательные пептиды могли бы быть, например, очень короткими пептидами или пептидами, служащими причиной горького вкуса. Кроме того, более узкая специфичность может быть причиной, чтобы выбрать условия, которые отклоняются от оптимальных условий относительно скорости оборачиваемости. Зависящая от рН специфичность может быть узкой, например, только разрывает пептидную цепь в одном специфическом положении или до или после одной специфической аминокислоты,или более широкой, например разрывает цепь в многочисленных положениях или разрывает до или после более различных типов аминокислот. Фактически рН зависимость могла бы быть важным инструментом, чтобы регулировать протеолитическую активность в применении. В случае изменения рН в течение процесса протеолиз мог бы прекращаться спонтанно без необходимости в дальнейшей обработке,чтобы инактивировать протеазу. В некоторых случаях сам протеолиз может управлять изменением рН. В применениях, где необходимы низкие температуры, протеаза может быть отобрана с учетом высокой свойственной активности при низких температурах, чтобы уменьшить (применяемую) температуру. Поскольку при таких условиях инактивация является относительно медленной, при этих условиях активность может в значительной степени определять производительность. В процессах, где требуется активность протеазы только в течение короткого периода, стабильность протеазы могла бы использоваться как выключатель, чтобы выключить протеазу. В таком случае более неустойчивая, вместо очень термоустойчивой, протеаза могла бы быть предпочтительна. Другими относящимися к окружающей среде параметрами, которые могут игратьроль в отборе соответствующей протеазы, может быть ее чувствительность к солям. Совместимость с металлическими ионами, которые обнаруживают часто в низких концентрациях в различных природных материалах, может быть решающей для некоторых применений. В особенности с металлопротеазами некоторые ионы могут заменить каталитический ион металла и уменьшить или даже аннулировать активность полностью. В некоторых применениях ионы металлов нужно добавить специально, чтобы предотвратить выведение ионов металла, скоординированных в протеазе. Известно, что для стабильности фермента и времени жизни, ионы кальция должны добавляться, чтобы предотвратить диссоциацию связанного белком кальция. Всесторонний обзор биологических свойств и развития протеаз был дан в van den Hombergh: ThesisLandbouwuniversiteit Wageningen: Анализ протеолитической системы в Aspergillus, чтобы улучшить производство белка ISBN 90-5485-545-2, который таким образом включен здесь ссылкой. Гидролизаты белка и влияние на режим свертывания высоко нагретого молока В примерах, описанных ниже, белок сыворотки растворен с различными протеазами, и полученные гидролизаты проверены на их способность улучшить замедленный режим свертывания высоко нагретого молока, чтобы образовать сыр. Данные иллюстрируют, что некоторые гидролизаты способны значительно улучшить режим свертывания, тогда как другие не имеют или имеют небольшой эффект. Примеры служат в целях иллюстрации. Подход, описанный в этом применении, позволяет идентификацию других гидролизатов белка, которые имеют те же самые или подобные эффекты, такие как эффективные гидролизаты белка, описанные в примерах. Такие гидролизаты могут быть приготовлены из белка сыворотки,но могли альтернативно быть приготовлены из других материалов белка, извлеченных из источников,- 11012373 таких как, но не ограниченных молоком коров, соей, пшеницей, зерном, горохом, картофелем и яйцом. Примеры описывают определенные протеазы, которые предназначены, чтобы иллюстрировать подход,но не ограничивают использование альтернативных протеаз, чтобы приготовить гидролизаты белка с желательными свойствами. Желательными свойствами гидролизатов являются способность уменьшить время свертывания высоко нагретого молока и увеличивать плотность полученного творога. Формаграф Формаграф - инструмент, разработанный, чтобы записывать свойства коагуляции сырного молока. Его использование как инструмента для сравнения сычужных растворов было описано (MacMahonBrown, J Dairy Sci (1982) 65, 1639-1642). Измерения формаграфа делают возможным определение трех параметров в течение производства сыра, как детально описано McMahonBrown. Это - r - время коагуляции молока, время, требуемое, чтобы начать формирование геля, k20 - время уплотнения творога,время между началом формирования геля до достижения ширины 20 мм и a30 - твердость творога, ширина графа 30 мин после добавления фермента, k20 приравнивает к твердости творога, соответствующей для нарезания сырного творога. Формаграф модель 11700 (Foss Electric, Бенилюкс) использовался в примерах, описанных ниже, используя 87%-ный глицерин как увлажняющую жидкость. Времена r и k20 выражены в мм, так как измерены на бумаге регистратора. Расстояние 1 мм соответствует периоду времени 30 с. Пример 1. Гидролиз сывороточного белка. Белок сыворотки (Bipro от Davisco) растворяли в воде (10% вес./вес.) и доводили до требуемого рН,используя HCl или NaOH. pH выбирали в зависимости от протеазы, которая использовалась. Раствор белка подвергали воздействию протеазы при 60 С в течение 4 ч без контроля рН. Каждую протеазу добавляли 5% об./вес. на белковую основу (например: 5 мл раствора протеазы на 100 г белка). В случае если использовали две протеазы, обе добавляли в 5% об./вес. на протеазу. В обоих случаях ПСЭ добавлялся как второй фермент спустя 2,5 ч после добавления первой протеазы (субтилизин (Алкалаза) или папаин (Коллупулин и инкубации при 60 С, следовавшей за другой 1,5 часовой инкубацией. Протеазы были впоследствии инактивированы термической обработкой (85 С, 10 мин). рН был затем доведен до рН 5,0 используя NaOH или HCl. Растворимое и нерастворимое белковое вещество было разделено центрифугированием, и супернатант был сублимирован (4 ч, 60 С). Высушенный белок растолкли до тонкого порошка и использовали для последующих экспериментов. В некоторых случаях, шаг центрифугирования был опущен, и полный гидролизат был сублимирован и раздроблен до тонкого порошка. Протеазы, описанные в табл. 1, использовались, чтобы гидролизовать сывороточный белок по указанным значениям рН, используя описанную процедуру. Таблица 1. ПСЭ был получен из культуральной жидкости Apergillus niger как протеазы, используемые для гидролиза сывороточного белка. А:ПСЭ = жидкость пролин специфической эндопептидазы, содержащая 10 Ед/мл протеазы. ПСЕ был получен из культуральной жидкости Apergillus niger как описано в WO 02/45524 и единицы описаны в WO 02/45524. Пример 2. Влияние гидролизатов сывороточного белка на свертывание высоко нагретого молока. Низко нагретое снятое молоко приготовили растворением 11 граммов порошка молока (Nilac, NIZOfood research) в 100 г дистиллированной воды при умеренном помешивании. Это молоко нагревали в течение 10 мин при 80 С и охладили до 31 С. Ненагретое молоко использовали как эталон. Образцы молока переместили в формаграф. Гидролизат сывороточного белка добавляли (10% на белковую основу: 10 г гидролизат сывороточного белка в 100 г белка молока) и свертывание молока начинали добавлением коагулянта (0,08 IMCU в мл, Maxiren от DSM). Были определены время свертывания (r) и плотность творога (k20). Результаты для нескольких гидролизатов приведены в табл. 2.- 12012373 Таблица 2. Влияние гидролизатов сывороточных белков на времена свертывания и плотность творога высоко нагретого молока. В контролях не добавляли гидролизат сывороточного белка. 1 мм соответствует 30 с. Данные в таблице ясно демонстрируют, что влияние гидролизата сывороточного белка на время свертывания и плотность творога зависит от протеазы, используемой для гидролиза сыворотки. Особенно подходящими являются эндопротеазы широкого спектра, такие как субтилизин серии протеазы (Алкалаза) и папаин (Коллупулин), либо один либо в комбинации с ПСЭ. Они способны уменьшить времена свертывания высоко нагретого молока ко времени ненагретого молока или даже сверх того (для коллупулина). Также, плотность творога высоко нагретого молока значительно улучшена в этих случаях. Высоко специфические протеазы SP446, Фромаза L2000 и ПСЭ, при используемых условиях, не имеют в результате сильное снижение времен свертывания или плотностей творога, таким образом означая, что рН используемого гидролизата является важным параметром. Пример 3. Дозозависимость влияния гидролизатов сывороточных белков на гелеобразующие характеристики высоко нагретого молока. Высоко нагретое молоко было подвергнуто свертыванию, как описано в примере 2, используя различные дозы Коллупулина, разлагающего гидролизат сывороточного белка. Экспериментальные условия и контроли были как описаны в примере 2. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3. Дозозависимость влияния коллупулинразлагаемого гидролизата сывороточного белка на характеристики свертывания высоко нагретого молока. 1 мм соответствует 30 с. Результаты демонстрируют, что увеличение доз гидролизата сывороточного белка ведет к улучшенным r-значениям и k20-значениям по сравнению с высоко нагретым молоком без добавленного гидролизата. Пример 4. Способ приготовления миниатюрных сыров. Миниатюрные сыры были изготовлены, как описано Шакел-Ур-Рехман (Shakeel-Ur-Rehman) и другие (Протокол для изготовления миниатюрных сыров в Lait, 78 (1998), 607-620). Использовали высоко нагретое (80 С, 10 мин) коровье молоко. В некотором случае пастеризованное цельное жирное гомогенизированое молоко использовали непосредственно вместо сырого коровьего молока. Термически обработанное молоко помещали в широкогорлые пластиковые центрифужные бутылки (200 мл в бутылку) и охлаждали до 31 С. Впоследствии 1,8 Ед начальной культуры DS 5LT1 (DSM Gist В.V., Delft, Нидерланды) добавлялся к каждому из 200 мл пастеризованного молока в центрифужные бутылки, и молоко выдерживали в течение 20 мин. Затем CaCl2 (132 л 1 мольл-1 решение в 200 мл выдерживаемого молока) добавляли, сопровождая добавлением гидролизата белка. Наконец добавляли коагулянт (0,04 IMCU в мл). Растворы молока выдерживали в течение 40-50 мин при 31 С, пока коагулят не был сформирован. Коагулят был разрезан вручную резаками натянутой проволоки, расположенной на расстоянии 1 см на рамке. Восстановление предусматривали в течение 2 мин, сопровождаемых мягким перемешиванием в течение 10 мин. После того температура была постепенно увеличена до 39 С за 30 мин под непрерывным перемешиванием смеси творог/сыворотка. После достижения рН 6,2 смесь творог/сыворотка центрифугировали при комнатной температуре в течение 60 мин при 1,700g. Сыворотка была высушена и творог был выдержан на водяной бане при 36 С. Сыры переворачивали каждые 15 мин, пока рН не уменьши- 13012373 лось до 5,2-5,3 и были затем центрифугированы при комнатной температуре при 1,700g в течение 20 мин. После производства сыры были взвешены. Пример 5. Влияние добавления дипептидов на характеристики гелеобразования высоко нагретого молока. Несколько дипептидов были протестированы на их способность улучшить свойства свертывания высоко нагретого молока (80 С, 10 мин). Эксперименты свертывания молока были выполнены, как описано в примере 1, используя цельное жирное молоко (Campina, Нидерланды), к которому добавляли 1,8 мМ CaCl2. Результаты приведены в табл. 4. Таблица 4. Влияние нескольких пептидов на режим свертывания высоко нагретого молока. 1 мм соответствует 30 с. Результаты в табл. 4 указывают, что Glu-Glu-пептиды, которые содержат отрицательно заряженные боковые цепи аминокислот при рН молока (рН 6,5-6,7), дают наиболее улучшенные значения r и k20, по сравнению с ситуацией, где пептиды не добавляются. Добавление свободного глутамата не имеет никакого эффекта. Улучшения являются явно дозозависимыми, как может быть заключено для ряда концентрации. Lys-Lys-пептид, которые содержат положительно заряженные боковые цепи при рН молока (рН 6,5-6,7), также показывают уменьшенные r и k20 значения, но улучшение меньше по сравнению с glu-glu пептидами в подобной концентрации. Leu-Leu и Ala-Ala-пептиды, которые не содержат никаких заряженных боковых цепей, не показывают никакого эффекта на значения k20 и r. Ясно, что пептиды должны содержать заряженные боковые цепи аминокислот, предпочтительно отрицательный заряд, чтобы получить улучшение в характеристиках свертывания. Пример 6. Улучшение выхода сыра с высоко нагретого молока в комбинации с гидрализатами или пептидами. Миниатюрный сыр был приготовлен, как описано в примере 4, используя цельное жирное коровье молоко, нагретое при 80 С в течение 10 мин. Гидролизат ГМП, приготовленный как описано в примере 7, добавляли до 0,2% (вес./об.), чтобы улучшить характеристики свертывания. В отдельном эксперименте, пептид Glu-Glu, описанный в примере 5, добавляли до 0,05% вместо гидролизата. В первом контрольном эксперименте высоко нагретое молоко использовалось без добавления гидролизата пептида. Во втором контрольном эксперименте сыры были приготовлены из пастеризованного цельного жирного молока вместо высоко нагретого молока. Гидролизат или пептид добавлялись в этот контрольный эксперимент в тех же самых концентрациях как применяли для высоко нагретого молока. Сыры, приготовленные из высоко нагретого молока, показали нормальный режим свертывания в присутствии гидролизата или пептида, и были получены твердые миниатюрные сыры. В контрольном эксперименте, в котором никакой гидролизат или пептид не добавляли к высоко нагретому молоку, режим свертывания был плохой и очень слабый, был сформирован творог, который имел плохую консистенцию. Сыры, приготовленные из высоко нагретого молока с добавлением гидролизата или пептида, показали улучшенный выход сыра, по сравнению с соответствующим контрольным экспериментом с пастеризованным молоком. В случае ГМП-гидролизата было получено увеличение выхода 22% на влажном весе; увеличение на сухом весе было 7%. В случае добавления Glu-Glu пептида увеличение во влажном весе было 16% и соответствующее увеличением в сухом весе было 2%. Результаты показывают, что добавление Glu-Glu пептида или ГМП к высоко нагретому молоку имеет результатом формирование твердого сырного творога с существенным увеличением выхода сыра. Пример 7. Влияние ГМП-гидролизата на характеристики гелеобразования высоко нагретого молока. Лакпродан СГМР-10 (Arla Foods, Дания) растворяли в воде (10% вес./вес.) и нагревали до 55 С. рН настраивали яблочной кислотой до рН 4,5, и добавляли ПСЭ (4 % на белок). Раствор содержали при 55 С и перемешивали в течение 3 ч. Жидкость была затем высоко нагрета (7 с, 130 С), сконцентрированна в 10 kDa отсекающих мембранах и распылительной сушилки. Гидролизат имеет СГ 12%. Гидролизат был проверен на его способность улучшить характеристики свертывания высоко нагретого молока, используя процедуру, описанную в примере 2. В этом эксперименте использовали цельное жирное молоко- 14012373 Таблица 5. Дозозависимое влияние ГМП-гидролизата на характеристики свертывания высоко нагретого молока. 1 мм соответствует 30 с. Данные в табл. 5 ясно демонстрируют положительный эффект гидролизата на свойства свертывания высоко нагретого молока. Добавление гидролизата имеет в результате уменьшенные значения r и k20 по сравнению с ситуацией, в которой никакой гидролизат не добавлялся. Влияние гидролизата является,несомненно, дозозависимым. Пример 8. Влияние гидролизата клейковины на характеристики гелеобразования термически обработанного молока. Дезамидированый белок клейковины (SWP полученный от Tate и Lyle, Бельгия) был выпарен с Флаворзимом Flavourzyme (полученный из Новозимов, Дания) или Ацелерзим (Accellerzyme) NP50000(oDSM, Нидерланды), преимущественно используя процедуру как описано в примере 1. Дезамидированая клейковина содержит высокий мольный процент от остатков глутамата. Гидролизаты были протестированы на их возможность улучшить характеристики свертывания термически обработанного (80 С,10 мин) цельного жирного молока после добавления CaCl2 до 1,8 мМ в Формаграфический эксперимент. В контрольном эксперименте, никакие добавления не были сделаны к термически обработанному молоку. Результаты приведены в табл. 6. Таблица 6. Влияние добавления SWP- гидролизатов на свойства свертывания термически обработанного молока. 1 мм соответствует 30 с. Ясно, что добавление обоих гидролизатов имеет в результате уменьшенные значения r и k20, как продемонстрировано числами в табл. 6. Ясно, что гидролизат с более высоким СГ (SWP-Flavourzyme: СГ: 31 %) дает лучшее усовершенствование. Пример 9. Идентификация пептидов, которые улучшают свойства гелеобразования термически обработанного молока. ГМП-гидролизат (750 мг), приготовленный как описано в примере 7, был суспендирован в 25 мл 0,1 М NH4 Асетат (pH 5,0) и центрифугирован (12000 об/мин, Sorvall, ротор SA600). Чистый супернатант был отфильтрован через 0,22 л мелкопористый фильтр. Объем 3 мл этого раствора был загружен on aHiload 26/60 Superdex peptide 30pg (Pharmacia), уравновешен в 0,1 М NH4 Ацетат (рН 5,0) и хроматографирован в 2,5 мл/мин; элюент был проверен при 280 нм. Фракции по 10 мл были собраны и лиофильно высушены. Лиофильно высушенные фракции были снова растворены в первоначальном объеме образца и протестированы на их способность улучшить режим сычужного свртывания термически обработанного молока (80 С, 10 мин). Термически обработанное молоко было коагулировано следующей процедурой, которая описана в примере 2, за исключением того, что коагуляция была выполнена в 96 - ячеечных микротитрационных планшетах с объемами 200 л. рН молока проверили после всех добавлений, чтобы идентифицировать возможные отклонения от первоначального рН молока. В случае отклонений, эксперимент был повторен. После добавления пептидов и сычуга, планшеты инкубировали в течение 2 ч при 30 С, после которого планшеты перевернули вверх дном и сильно встряхивали, чтобы удалить не свернувшееся молоко. Свернутое молоко остается в ячейках, тогда как несвернутое молоко или плохо свернутое молоко удалили из ячеек. Фракции, которые были положительными в этом испытании, были объединены и после лиофильно высушены и подвергнуты вторичному фракционированию на 3 мл ResourceRPC колонке, уравновешивали в растворителе А (MilliQ вода + 2% ацетонитрил + 0,065% Ttrufluoroacetic кислота. После применения образца колонка была промыта (3 мл/минуты) объемом растворителя А,равным объему 4 колонок, элюцию проводили линейным градиентом 0-50% В в А. (В: 20% MilliQ, 80% ацетонитрил, 0,05% TFA). Фракции по 1 мл были собраны, лиофильно высушены и повторно растворены в их первоначальном объеме. Повторно растворенные фракции были проверены на их способность улучшить режим свертывания термически обработанного молока методом титрационного микропланшета, описанным выше. Самые активные фракции подверглись массспектрометрическому анализу, чтобы идентифицировать наличие пептидов. Были идентифицированы следующие пептиды.- 15012373 Таблица 7. Пептиды, идентифицированные в ГМП гидролизате после фракционирования Все идентифицированные пептиды возникают из глико-макро-пептида (ГМП), часть -казеина, который освобождают из мицелл казеина в молоке химозином в течение производства сыра. Так как ГМП являются частью сырной сыворотки, предполагают, что те же самые пептиды могут также быть произведены из препаратов белка сырной сыворотки. Чтобы подтвердить, что идентифицированные пептиды ответственны за наблюдаемые эффекты, они были синтезированы и очищены (Pepscan, Lelystad, Нидерланды), имея результатом препараты 90% чистоты. Пептиды были протестированы в свертывании термически обработанного молока, используя МТР-процедуру, описанную выше. Использовали несколько концентраций пептида. Результаты приведены в табл. 8. Таблица 8. Влияние синтетических пептидов на режим свертывания термически обработанного молока Результаты ясно подтверждают, что идентифицированные пептиды ответственны за улучшенный режим свертывания термически обработанного молока. Концентрации 0,62 мМ достаточны, чтобы оказывать усовершенствование, концентрация 0,25 мМ не достаточна, чтобы получить устойчивый гель. Пептиды все характеризованы присутствием остатка глутамата, обеспечивая конечный отрицательный заряд пептидам при рН молока в ранних стадиях производства сыра (рН 6,5-6,9). Пример 10. Влияние различных синтетических пептидов на режим свертывания термически обработанного молока. Результаты, описанные в примере 9, означают, что пептиды, содержащие отрицательный конечный заряд, приводят к улучшенному режиму свертывания термически обработанного молока. Несколько пептидов были приготовлены, чтобы проверить эту гипотезу. Они были протестированы в МТР-испытании,описанном в примере 9, их улучшенный режим. Результаты приведены в табл. 9. Таблица 9. Влияние различных синтетических пептидов на режим свертывания термически обработанного молока Результаты подтверждают концепцию, полученную из примера 9, что пептиды, содержащие отрицательный результирующий заряд, способны обеспечить улучшенный режим свертывания. Пептид pheleu-glu-pro и phe-leu-gln-pro отличается только в одном положении: отрицательно заряженный глутамат(glu) заменен гомологическим, но незаряженным глутамином (gln). Эта замена имеет в результате исчезновение улучшающего эффекта в свертывании термически обработанного молока. Это ясно демонстрирует, что отрицательный заряд, опосредованный глутаматом, является необходимым, чтобы получить улучшенный режим свертывания термически обработанного молока. Это подтверждено результатами,полученными с другими пептидами: замена глутамата (glu) в val-pro-glu незаряженными аминокислота- 16012373 ми аланином (ala) или цистеином (cys) устраняет эффект на свертывание молока. Данные ясно демонстрируют, что маленькие пептиды, содержащие глутамат или аспартат, способны улучшить режим свертывания термически обработанного молока. Пептиды являются все отрицательно заряженными при рН молока в течение производства сыра (рН 6,5-6,9). Пептиды, которые показывают положительный эффект на режим свертывания молока, имеют в своем составе содержание отрицательно заряженных аминокислот(glu, asp) 25-33 мол.% в отсутствии положительно заряженных аминокислот (arg, lys, his). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ производства творога, включающий следующие стадии: нагревание молока, приводящее к степени денатурирования сыворотки по меньшей мере 30%,добавление к термически обработанному молоку гидролизата белка, имеющего степень гидролиза от 5 до 60,добавление к термически обработанному молоку коагулянта, чтобы сформировать гель, и обработка сформированного геля и отделение сыворотки с последующим получением творога. 2. Способ по п.1, согласно которому гидролизат белка получают из сывороточного белка, казеина или казеината или их смеси, предпочтительно из сывороточного белка. 3. Способ по п.1 или 2, согласно которому используют гидролизат белка, имеющий степень гидролиза от 10 до 45, предпочтительно от 15 до 40. 4. Способ по п.1, согласно которому гидролизат белка включает пептиды, содержащие от 2 до 5 аминокислот. 5. Творог, полученный способом по любому из пп.1-4, время свертывания (r) которого составляет 20 мм (соответствующее 10 мин) или менее и/или плотность которого составляет (k20) 100 мм или менее. 6. Способ производства сыра, включающий переработку творога по п.5 в сыр. 7. Сыр, полученный способом по п.6. 8. Молочный продукт, включающий творог по п.5 или сыр по п.7.