Микробное масло, способ его получения и пищевой или кормовой продукт, содержащий его

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки МИКРОБНОЕ МАСЛО, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПИЩЕВОЙ ИЛИ КОРМОВОЙ ПРОДУКТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО Раскрывается усовершенствованный способ пастеризации микробных клеток. Способ включает три стадии, первую стадию нагревания, вторую стадию плато, на которой клетки выдерживают при максимальной и постоянной температуре, и третью стадию охлаждения. Скорость нагревания составляет по меньшей мере 0,5C/мин, а скорость охлаждения по меньшей мере -0,5C/мин. Максимальная температура на стадии плато составляет от 70 до 85C. При представлении протокола пастеризации в виде графика зависимости времени (t, мин) от температуры (T, C) получают трапецию, имеющую площадь менее 13000Cмин. Указанный способ приводит к получению менее окисленного масла, имеющего значение перекисного числа (POV) менее 1,5 и значение анизидинового числа (AnV) менее 1,0.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи ЭССЕТС Б.В. (NL) 015509 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способу пастеризации микробных клеток, который включает нагревание клеток при температуре в пределах от 40 до 70C, не более чем в течение 30 мин. Скорость нагревания во время проведения способа пастеризации может составлять по меньшей мере 0,5C/мин. Способ пастеризации может включать три стадии, а именно стадию нагревания, стадию плато (где клетки выдерживают при постоянной температуре) и стадию охлаждения. Если представить протокол пастеризации графически, то площадь под кривой зависимости времени (в минутах) от температуры (C) составляет меньше 13000Cмин. После пастеризации можно экстрагировать полиненасыщенную жирную кислоту (PUFA), такую как арахидоновая кислота, или масло из микробных клеток. Масло может иметь низкое значение перекисного числа (POV) и/или низкое значение анизидинового числа (AnV). Введение Полиненасыщенные жирные кислоты, или PUFA, распространены в природе, и самые разнообразные PUFA продуцируются различными одноклеточными микроорганизмами (водорослями, грибами и т.д.). Одной особенно важной PUFA является арахидоновая кислота (ARA), которая представляет одну из ряда полиненасыщенных кислот с длинной цепью (LC-PUFA). В химическом отношении арахидоновая кислота представляет собой цис-5,8,11,14-эйкозатетраеновую кислоту (20:4) и относится к семейству (n6) LC-PUFA. Арахидоновая кислота является одним из основных предшественников самых разнообразных биологически активных веществ, известных под общим названием эйкозаноиды, группы, включающей простагландины, тромбоксаны и лейкотриены. Также арахидоновая кислота является одним из компонентов липидной фракции женского молока, и полагают, что она является необходимой для оптимального развития нервной системы младенцев. Арахидоновая кислота имеет широкий ряд различных применений,включая применение в детских молочных смесях, продуктах питания и кормах для животных. Заявка WO-A-97/37032 (Gist-Brocades) относится к получению PUFA-содержащего масла из пастеризованной биомассы микробных клеток. Однако не раскрывается быстрое нагревание до, или охлаждение от, температуры, при которой проводят пастеризацию. Кроме того, не придается значения общему количеству энергии, используемой во время проведения способа пастеризации. Обе заявки WO-A-00/15045 и WO-A-01/67886 относятся к применению грибов Mucorales при получении продуктов питания. Первый из данных документов относится к необходимости снижения содержания РНК перед включением клеток в продукты питания, и предлагается использовать стадию нагревания. Можно провести одну пастеризацию или тепловой шок. Во втором документе предлагается исключить проведение стадии нагревания в целях снижения содержания РНК и заменить на выдерживание клеток грибов в ферментере и созревание. Международная заявка на патентPCT/EP01/08 902 относится к способу получения масляных смесей объединением неочищенного 6 и неочищенного 3, содержащего PUFA масла, с получением масляной смеси и затем очисткой неочищенной смеси масел. Известны способы, включающие нагревание биомассы или микробных клеток. Также известно из заявкиWO-A-97/37032, что микробные клетки можно пастеризовать перед экстракцией из них PUFA в виде масла. Однако авторы настоящего изобретения установили, что с помощью нового способа пастеризации можно улучшить качество масла, которое экстрагируют из пастеризованных клеток. В частности, полученное масло в меньшей степени окисляет или окисляется и имеет низкие значения перекисного числа (POV) и/или анизидинового числа (AnV). Кроме того, заявители установили, что данный новый способ пастеризации является более эффективным, поскольку для его проведения требуется меньше энергии. Следовательно, способ является преимущественным, поскольку с его помощью можно не только улучшить качество масла, но и снизить его стоимость, поскольку требуются меньшие затраты энергии. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет график зависимости температуры (C) от времени (мин) для трех протоколов проведения пастеризации (A и C по изобретению, B представлен для сравнения). Фиг. 2 - график зависимости температуры (C) от времени (мин) для пастеризации при трех различных температурных плато (40, 70 и 85C). Фиг. 2 и 4 - графики зависимости значения AnV (и POV для фиг. 3) от времени (час). Фиг. 5 - график зависимости POV (мэкв/кг) и AnV от температуры (C) для пастеризации при двух значениях времени (выдерживания/плато) (8 и 300 с). Фиг. 6 и 7 - графики зависимости температуры (C) от времени (мин) при двух значениях времени(выдерживания/плато) (8 с - для фиг. 6, 5 мин - для фиг. 7) при пяти различных значениях температуры(60, 80, 100, 120 и 140C). Описание изобретения Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает усовершенствованный способ пастеризации микробных клеток. Помимо меньших затрат энергии способ пастеризации по изобретению позволяет получать продукт лучшего качества.-1 015509 Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу пастеризации микробных клеток, где способ включает нагревание клеток при температуре (включающей) в пределах от 40 до(60 или) 70C в течение не более 30 мин или нагревание клеток со скоростью по меньшей мере 0,5C/мин. Следовательно, данный аспект обеспечивает быстрое нагревание микробных клеток во время пастеризации, и подобная высокая скорость нагревания ранее не была раскрыта в данной области. Несмотря на то, что в данной области представлены значения температуры пастеризации, не оценивается или не обсуждается скорость нагревания или тот факт, что данный параметр является важным, и относительно высокая скорость пастеризации может обеспечить преимущества. Фактически высокие значения скорости нагревания являются противоинтуитивными, поскольку можно ожидать, что они приводят к окислению или разрушению иным путем PUVA или масла, которое можно экстрагировать из клеток. Второй аспект настоящего изобретения относится к способу пастеризации микробных клеток, где способ включает протокол пастеризации, включающий (по меньшей мере) три стадии. Они представляют собой: (первую) стадию нагревания, (вторую) стадию плато (при которой микробные клетки выдерживают при желаемой температуре, или где клетки выдерживают при постоянной и/или максимальной температуре) и (третью) стадию охлаждения. Данный аспект изобретения относится к протоколу трехстадийной пастеризации. Если данный протокол представить в виде графика зависимости времени от температуры, то получится трапеция. Третий аспект изобретения относится к способу пастеризации микробных клеток, где способ включает применение такого протокола пастеризации, что площадь под кривой зависимости времени (мин) от температуры (C) составляет менее 13000Cмин. На графике зависимости времени от температуры площадь представляет количество энергии, затрачиваемой на нагревание клеток во время проведения способа пастеризации. Было установлено, что быстрое нагревание и/или быстрое охлаждение (которые соответствуют первой и третьей стадиям второго аспекта, соответственно) могут обеспечить преимущества такие, как лучшее качество масла. Кроме того, количество энергии, необходимой для проведения способа пастеризации, можно снизить по сравнению со способами пастеризации, описанными в данной области. Следовательно, данный третий аспект относится к затрате энергии, необходимой для проведения способа пастеризации. Четвертый аспект изобретения относится к способу пастеризации микробных клеток, где способ включает (нагревание клеток и далее) выдерживание клеток при повышенной температуре (T, C) в течение времени (t, мин), например, на стадии плато, где значение произведения tT (т.е. умножение параметров времени и температуры, например, во время стадии плато) находится в пределах от 140 до 100800Cмин. Как очевидно, понятно, что данный четвертый аспект аналогичен второму аспекту в том отношении, что он включает стадию плато. В данном случае клетки можно выдерживать при постоянной или максимальной температуре. Следовательно, произведение tT может представлять собой площадь под кривой зависимости времени от температуры для данной стадии плато. Первый аспект - быстрое нагревание В данном аспекте клетки нагревают таким образом, что температура клеток изменяется от 40 до 70C (или 60C) в течение не более 30 мин (например, не более 15 мин). Предпочтительно время, необходимое для нагревания от 40 до 70C, занимает не более 40-50 мин. Альтернативно или дополнительно клетки нагревают со скоростью по меньшей мере 0,5C/мин. Конечно, микробные клетки могут стартовать (или начать нагреваться) при температуре ниже 40C. Например, клетки могут находиться при комнатной или окружающей температуре. Клетки могут находиться при температуре ферментации такой,как 305C. Таким образом, клетки могут находиться при температуре в пределах от 20 до 40C, такой как 23-27C (или от 25-29C до 32-37C), когда начинается нагревание (пастеризация). В некоторых случаях микробные клетки можно охладить, например, после окончания ферментации. Таким образом,клетки могут иметь (на старте) температуру в пределах от 5 до 10C, например от 7 до 9C, когда начинается нагревание. Микробные клетки можно нагревать таким образом, чтобы их температура была выше (60C или) 70C. Таким образом, это значение может быть не конечной температурой микробных клеток во время пастеризации. Фактически клетки можно нагревать до температуры выше (60C или) 70C. Температура может повышаться до значения в пределах от 70 до 90C, 110 или 130C, например от 75 до 87C и оптимально от 78 до 84C. Следовательно, максимальная температура во время пастеризации может находиться в данных пределах, но для некоторых воплощений может достигать 100, 120 или 140C. Предпочтительно клетки поддерживаются или выдерживаются при данной (максимальной) температуре. Следовательно, очевидно понятно, что клетки можно нагревать при температуре ниже или начиная от 40 до температуры 70C или выше. Пределы от 40 до 70C могут обеспечить выстрел в более широком пределе значений температуры нагревания, для которого можно (и, следовательно, рассчитать) определить период времени (и, следовательно, скорость). Можно рассчитать, что нагревание (от 40 до 70C в течение 30 мин) соответствует скорости 1C/мин. Однако скорость может быть несколько ниже, чем это требуется, и в первом аспекте быстрое-2 015509 нагревание означает, что скорость нагревания является выше 0,5C/мин. Предпочтительно скорость составляет по меньшей мере 0,6, 1,0 или даже 1,5C/мин. Однако предусматриваются особенно высокие значения скорости нагревания в зависимости от оборудования и объема, или массы микробных клеток,которые подвергаются нагреванию. Так, значения скорости нагревания выше 2,0 или даже 2,5C/мин также находятся в объеме изобретения. Особенно высокие значения скорости нагревания можно получить с использованием специального оборудования. Оно позволяет достичь высокой температуры в короткий период времени и таким образом свести до минимума любое окисление или разрушение PUFA, или масла из микробных клеток, которые затем можно выделить. Так, может иметь место нагревание до максимальной температуры, равной 140,150 или даже 160C. Предпочтительно нагревание проводят до температуры от 100 до 180C, например от 120 до 160C, предпочтительно от 130 до 150C. При использовании быстрых нагревателей данные значения температуры можно обеспечить особенно быстро, например в течение менее одной минуты(30 с). Подобных значений температуры можно достичь в течение 20, 30, 40 и 50 с или обеспечить в течение 150, 175, 200, 225 или 250 с. Однако данных значений температуры можно достичь так очень быстро, например, в течение 2, 4, 6, 8 или 10 с, например, при использовании инфузионного нагревателя или при использовании относительно небольших проб. Таким образом, можно достичь значений скорости нагревания до 50, 100, 150 и даже 200C в минуту. Также возможны несколько меньшие значения скорости нагревания от 5-10C до 50-60C в минуту, например от 15 до 45C/мин. Было установлено, что подобное быстрое нагревание во время быстрой пастеризации является не только более эффективным и требующим меньших затрат энергии, но оказалось, что оно является по меньшей мере одним фактором, ответственным за получение масла из микробных клеток лучшего качества (при экстракции из клеток после пастеризации). Второй аспект - протокол трехстадийной пастеризации Первой стадией может быть стадия нагревания. Она фактически соответствует быстрому нагреванию, описанному в первом аспекте изобретения, и следовательно, все признаки и характеристики первого аспекта применимы к первой стадии (нагреванию) второго аспекта с соответствующими, необходимыми изменениями. Второй стадией является период, когда клетки находятся на плато (при температуре). Так, клетки можно выдерживать при определенной желаемой температуре (с допуском плюс или минус 1, 2, 5 или даже 10C) для желаемого периода времени. Таким образом, клетки выдерживают при постоянной температуре. Предпочтительно данная температура (или пределы температуры) на стадии плато является максимальной температурой, достигаемой во время пастеризации. Температура на стадии плато (и/или максимальная температура во время пастеризации) предпочтительно составляет по меньшей мере 70C. Она может быть ниже 90 или 100C, преимущественно в пределах от 70 до 85C, например от 70 до 77C. Альтернативно она может находиться в пределах 80-160C, например 100-140C. Продолжительность стадии плато или период времени, при котором клетки выдерживают при желаемой или максимальной температуре, может составлять от 5 с до 90 мин, например от 1 или 10 до 80 мин, например от 20 до 70 мин. Оптимально данный период времени составляет от 40 или 50 до 60 или 70 мин, например, от 45 до 65 мин, преимущественно от 55 до 63 мин. Также возможны короткие периоды времени от 8 с до 5 мин. Третьей стадией является стадия охлаждения. Предпочтительно клетки охлаждают до температуры, которая является аналогичной или находится в пределах, указанных для начала нагревания (или первой стадии). Предпочтительно микробные клетки охлаждают и/или нагревают линейно (на первой и/или третьей стадиях соответственно), т.е. при построении графика зависимости времени от температуры режим охлаждения или нагревания представляет(примерно) прямую линию. Клеткам дают возможность охладиться, или их можно охладить активно,например, при использовании теплообменника или охлаждающих веществ, например, (понижая) до окружающей температуры или комнатной температуры, или ниже. Предпочтительно скорость охлаждения составляет по меньшей мере 0,4C/мин, 0,6C/мин,1,0C/мин или 1,5C/мин. Данные значения представляют достижимые скорости охлаждения, когда клеткам самим дают возможность охладиться. Однако возможны более высокие значения скорости охлаждения, особенно, если применяется активное охлаждение. Так, являются достижимыми скорости охлаждения, равные по меньшей мере 2,0C/мин, 2,5C/мин, 3,0C/мин и даже 3,5C/мин. Однако возможны более высокие значения скорости охлаждения, такие как выше 5C/мин, например от 7C/мин или 10C/мин до 50C/мин или 60C/мин, предпочтительно от 15C/мин до 45C/мин. Предпочтительная скорость нагревания и/или охлаждения предпочтительно поддерживается по меньшей мере на уровне 10C/мин, 20C/мин или 30C/мин, хотя в некоторых воплощениях ее можно достичь по меньшей мере в пределах от 40C/мин до 50C/мин. Очевидно, понятно, что при быстрой стадии нагревания и быстрой стадии охлаждения количество энергии, используемой при пастеризации, уменьшается. Данное обстоятельство приводит не только к-3 015509 экономии затрат, но также может не оказывать отрицательного влияния на качество (конечное) масла из микробных клеток, фактически оно оказывает положительное действие на масло. Третий аспект - площадь под кривой зависимости времени от температуры (затраты энергии) Из второго аспекта становится очевидным, что, если протокол пастеризации по изобретению представить в виде графика зависимости времени от температуры, то он имеет форму трапеции. Первая (нагревание) и третья (охлаждение) стадии могут быть треугольной по форме, в то время как средняя или вторая (плато) стадия (предмет четвертого аспекта) представляет (как правило) прямоугольник. Площадь под кривой зависимости времени от температуры представляет количество энергии, вложенной в систему. При разделении протокола пастеризации на три части можно высчитать площадь графика и, следовательно, затраты энергии. В третьем аспекте площадь под кривой зависимости времени (в мин) от температуры (в C) составляет ниже 13000Cмин. Однако достигаются значения ниже и возможны значения ниже 11000, 10000,9000, 8000 и даже 1000Cмин. В предпочтительных аспектах изобретения данные значения могут составлять не более 7000, 6000 или 800Cмин. На представленном графике время отложено на оси x (или горизонтальной оси, или абсциссе), и 0C представляет исходную точку. Температура, следовательно,будет откладываться на оси y (или вертикальной оси, или ординате), и 0C представляет исходную точку. После нагревания микробных клеток до температуры пастеризации они могут охладиться сами (или их можно охладить). Как правило, клетки охлаждают до комнатной или окружающей температуры или,по меньшей мере, до температуры ниже 30C. Следовательно, имеется период времени не только для нагревания клеток до температуры в пределах от 30C до 60C, но также период времени для охлаждения клеток от 60C до 30C. Можно суммировать два периода времени для получения общего периода нагревания и охлаждения в пределах 30C-60C и обратно до 30C. Предпочтительно данный общий период времени составляет менее 150 мин, например менее 120 или 100 мин. Однако при меньших пробах можно достичь более коротких периодов времени, и общий период времени (от 30 до 60C и обратно до 30C) может составлять менее 70, 50 и даже 30 мин. Четвертый аспект - протокол пастеризации со стадий плато Данный протокол может быть одним по второму аспекту, где имеется (например, первая) стадия нагревания и (например, вторая) стадия охлаждения и средняя стадия плато (например, вторая или средняя, или промежуточная). Однако это не является обязательным, и предусматриваются для включения другие протоколы пастеризации. Четвертый аспект относится к предпочтительным признакам данной стадии плато. Все признаки и характеристики второго (и других) аспектов относятся к четвертому аспекту с соответствующими, необходимыми изменениями. Все клетки поддерживают и выдерживают при определенной желаемой температуре (с допуском плюс или минус 1C, 2C, 5C или даже 10C) для температуры (T, C) в течение времени (t, мин). Данные два параметра можно перемножить с получением произведения tT. Оно преимущественно составляет от 140 или 280 до 50000 или 100800Cмин. Предпочтительно данное произведение равняется от 500,1000, 2000 или 3000 или даже 6000 до 10000, 18000 или 25000Cмин. Оптимальное значение произведения tT находится в пределах от 2000 до 6000, например от 3000 до 5000, оптимально от 4000 до 4500Cмин. В некоторых воплощениях произведение tT составляет от 13 до 900, например от 100 или 200 до 700 или 800, оптимально от 300 или 400 до 600 или 700Cмин. Таким образом, аналогично третьему аспекту, понятно, что произведение tT представляет собой площадь под кривой зависимости времени от температуры клеток при их выдерживании при повышенной температуре. Таким образом, произведение tT фактически представляет площадь под кривой только для стадии плато (но не стадии нагревания или охлаждения). Экстракция PUFA Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу получения PUFA из микробных клеток,где способ включает пастеризацию клеток по одному из первого, второго, третьего или четвертого аспектов изобретения, описанных ранее, и экстракцию и/или выделение PUFA из пастеризованных клеток. Шестой аспект настоящего изобретения относится к маслу из микробных клеток, которое может содержать по меньшей мере 40% арахидоновой кислоты (ARA) и/или может иметь содержание триглицеридов, равное по меньшей мере 90%. Масло может иметь значение POV менее 2,5, 1,5, 0,8, 0,6 или даже 0,5, и/или значение AnV менее 1,0. Масло готовят способом по пятому аспекту. Полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) и масла из микробных клетокPUFA может представлять собой одну PUFA или две, или более различных PUFA. Каждая PUFA может происходить из семейства n-3 или n-6. Предпочтительно это C18, C20 или C22 PUFA. Она может представлять собой PUFA по меньшей мере с 18 атомами углерода и/или по меньшей мере с 3 или 4 двойными связями. PUFA можно обеспечить в виде свободной жирной кислоты, соли, в виде эфира жирной кислоты (например, метилового или этилового эфира), в виде фосфолипида и/или в виде моно-, диили триглицерида.-4 015509 Подходящие (n-3 и n-6) PUFA включают докозагексаеновую кислоту (DHA, 22:63), соответственно из водорослей или грибов, таких как-линоленовую кислоту (ALA, 18:33); конъюгированную линоленовую кислоту (октадекадиеновую кислоту, CLA); дигомолиноленовую кислоту (DGLA, 20:36); арахидоновую кислоту (ARA, 20:46); и эйкозапентаеновую кислоту (EPA, 20:53). Предпочтительные PUFA включают арахидоновую кислоту (ARA), докозагексаеновую кислотуPUFA могут продуцироваться клетками, пастеризованными способом по изобретению, такими как микробные клетки. Последние могут представлять собой бактерии, водоросли, грибы или дрожжи. Грибы являются предпочтительными, предпочтительно порядка Mucorales, например Mortierella, Phycomyces, Blakeslea, Aspergillus, Thraustochytrium, Pythium или Entomophthora. Предпочтительным источникомARA является Mortierella alpina, Blakeslea trispora, Aspergillus terreus или Pythium insidiosum. Водоросли могут представлять собой динофлагеллаты и/или включают Porphyridium, Nitszchia или Crypthecodinium(например, Crypthecodinium cohnii). Дрожжи включают таковые, относящиеся к родам Pichia или Saccharomyces, такие как Pichia ciferii. Бактерии могут быть представителями рода Propionibacterium. Масло из микробных клеток может быть жидким (при комнатной температуре). Предпочтительно, чтобы большая часть PUFA находилась в виде триглицеридов. Так предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 60% или оптимально по меньшей мере 70%, PUFA находилось в виде триглицеридов. Однако количество триглицеридов может быть выше, например, оно может составлять по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, оптимально по меньшей мере 95 или 98% масла. Из данных триглицеридов предпочтительно, чтобы по меньшей мере 40%, например по меньшей мере 50% и оптимально по меньшей мере 60% PUFA находилось в положении глицерина (находящегося в скелете триглицерида), также известного как 1- или 3-положение. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 30%, оптимально по меньшей мере 40% PUFA находилось в(2)-положении. Масло из микробных клеток может содержать по меньшей мере 10, 35, 40 или 45% или более желаемой PUFA, такой как арахидоновая кислота. Оно может иметь содержание триглицеридов по меньшей мере 90%. Предпочтительно масло из микробных клеток имеет содержание триглицеридов в пределах от 90 до 100%, например по меньшей мере 96%, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% и оптимально выше 99,5%. Как правило, масло из микробных клеток будет иметь содержание эйкозапентаеновой кислоты (EPA) ниже 5%, предпочтительно ниже 1% и более предпочтительно ниже 0,5%. Масло может иметь содержание каждой C20, C20:3, C22:0 и/или C24:0 полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) на уровне менее 5%, менее 2%, менее 1%. Содержание свободных жирных кислот (FFA) может составлять 0,4, 0,2 или 0,1. Масло может включать незначительно или совсем не включать GLA и/или DGLA. Масло из микробных клеток может быть неочищенным маслом. Его можно экстрагировать из клеток с использованием растворителя, такого как двуокись углерода в сверхкритическом состоянии, гексан или изопропанол. Способ пастеризации Как правило, пастеризацию проводят после окончания ферментации. В предпочтительном воплощении пастеризация будет завершать ферментацию, поскольку тепло во время пастеризации будет приводить к гибели клеток. Следовательно, пастеризации можно подвергать ферментационный бульон (или клетки в жидкой (водной) среде), хотя, ей можно подвергать микробную биомассу, полученную из бульона. В последнем случае пастеризация может иметь место, пока еще микробные клетки находятся в ферментере. Предпочтительно пастеризация имеет место перед любой последующей обработкой микробных клеток, например грануляционным измельчением (например, экструзией) или замешиванием. Предпочтительно протокол пастеризации является достаточным для ингибирования или инактивации одного или более ферментов, которые могут оказывать отрицательное влияние или разрушать PUFA или масло из микробных клеток, например липазы. По окончании ферментации ферментационный бульон можно профильтровать или обработать иначе для удаления воды или водной жидкости. После удаления воды можно получить плотный осадок из биомассы. Если пастеризация не имела место, то затем обезвоженные клетки (или плотный осадок из биомассы) можно подвергнуть пастеризации. Способ экстракции PUFA Затем можно экстрагировать PUFA (или масло, как правило, содержащее PUFA) из (пастеризованных) микробных клеток. Предпочтительно его экстрагируют из (например, высушенных) гранул (напри-5 015509 мер, экструдатов), содержащих клетки. Экстракцию можно проводить с использованием растворителя. Предпочтительно используют неполярный растворитель, например C1-8, предпочтительно C2-6 алкан, например гексан. Можно применять двуокись углерода (в жидкой форме, например, в суперкритическом состоянии). Предпочтительно растворителю дают просочиться через высушенные гранулы. Подходящие методы грануляции и экструзии микроорганизмов и последующая экстракция масла из микробных клеток,содержащего PUFA, описана в заявке WO-A-97/37032. Растворителем извлекают неочищенное масло, содержащее PUFA. Данное масло можно использовать в таком состоянии без дополнительной обработки или его можно подвергнуть одной или более стадиям рафинирования. Однако, как правило, неочищенное масло содержит растворитель, такой как растворитель, используемый для экстракции масла (например, гексан или спирт, такой как изопропиловый спирт), или масло, не подвергнутое одной (или предпочтительно всем) последующей стадии рафинирования. Подходящие методы рафинирования описаны в заявке на международный патентPCT/EP01/08902 (содержание данного документа и всех других, представленных здесь, включено здесь в виде ссылки). Например, масло можно подвергнуть одной или более стадиям рафинирования, которые могут включать обработку кислотой или дегуммирование, обработку щелочью или удаление свободных жирных кислот, отбеливание или удаление пигментов, фильтрацию, фракционирование охлаждением(или охлаждение, например, для удаления насыщенных триглицеридов), дезодорацию (или удаление свободных жирных кислот) и/или осветление фильтрованием (или удаление нерастворимых в масле веществ). Все данные стадии очистки описаны подробнее в PCT/EP01/08902 и их можно применять на стадиях, описанных в настоящей заявке с соответствующими необходимыми изменениями. Полученное масло особенно подходит для пищевых целей и его можно добавлять к продуктам питания (для человека) или кормам (для животных). Примеры включают молоко, детские молочные смеси,лечебные напитки, хлеб и корм для животных. Микробные клетки Клетки микробов (или микроорганизмов), используемые в настоящем изобретении, могут быть любыми из описанных ранее, особенно в разделе, посвященном PUFA и маслам из микробных клеток. Они могут включать или способны продуцировать, PUFA или масло, и соответственно содержащее PUFA масло можно экстрагировать или выделить из клеток. Они могут находиться в нитчатной форме, как грибы или бактерии, или в виде единичных клеток, подобно дрожжам, водорослям и бактериям. Клетки могут включать микроорганизмы, такие как дрожжи, грибы, бактерии или водоросли. Предпочтительными грибами являются таковые, относящиеся к порядку Mucorales, например, гриб может представлять таковой родов Mortierella, Phycomyces, Blakeslea или Aspergillus. Предпочтительными грибами являются виды Mortierella alpina, Blakeslea trispora и Aspergillus terreus. В отношении дрожжей, то предпочтительно они представляют таковые, относящиеся к родам Pichia(например, вид Pichia ciferrii) или Saccharomyces. Бактерии могут быть представителями рода Propionibacterium. Если клетки происходят из водорослей, то предпочтительно это динофлагеллаты, и/или они относятся к роду Crypthecodinium. Предпочтительными являются водоросли вида Crypthecodinium cohnii. Нагревание Его можно проводить нагреванием (клеток) непосредственно или опосредованно. Если нагревание является непосредственным, то его можно проводить пропусканием пара в ферментер. При опосредованном способе можно воздействовать на среду посредством теплообменника, стенок ферментера или нагревательных спиралей, или внешнего теплообменника, такого как пластинчатый теплообменник. Как правило, пастеризация имеет место в ферментере, в котором проводят ферментацию. Однако для некоторых микроорганизмов (таких как бактерии) часто является предпочтительным вначале удалить клетки из резервуара и затем проводить пастеризацию. Пастеризация может иметь место перед другими обработками микроорганизмов, например высушиванием или грануляцией. В результате пастеризации, как правило, погибает большая часть или, если не все, микроорганизмы. После пастеризации погибает по меньшей мере 95, 96 или даже 98% всех микроорганизмов, т.е. которые становятся нежизнеспособными. Подкисление В некоторых случаях желательно уменьшить риск роста пастеризованных клеток. При этом одной возможностью является подкисление клеток подходящей кислотой. Таким образом, для предупреждения роста микроорганизмов может быть желательным довести клетки до значения pH в пределах 3-4. Однако можно использовать более широкие пределы pH в зависимости от клеток, и, таким образом, pH можно довести до 2-5, оптимально до предела примерно от 3,3 до 3,7. Подкисление клеток можно проводить перед пастеризацией. Однако предпочтительно проводить его после. Значение pH можно установить любыми способами или любой подходящей кислотой. Предпочтительно проводить его с использованием фосфорной кислоты, такой как 85%, или разбавленная 55% или 33% фосфорная кислота.-6 015509 Перекисное число (POV) Предпочтительно значение POV масла из микробных клеток находится в пределах от 4 до 8 или 12,особенно для неочищенного масла. Однако POV может быть не более 3,0, 2,5 или 2,0. Однако можно получить значительно более низкие значения POV при использовании способа по изобретению, и данные значения могут быть ниже 1,5 или ниже 1,0. Можно получить значения ниже 0,8 или 0,6 и даже ниже 0,4. Значения POV (из воплощений) находятся в пределах от 1,3 (или 0,8) до 0,4. Перекисное число POV обычно выражается в виде мэкв/кг. Анизидиновое число (AnV) Данное число является показателем содержания альдегидов. Предпочтительно значение анизидинового числа масла из микробных клеток составляет от 5, 6, 7 или 10 до 15, 20 или 25, особенно для неочищенного масла. Преимущественно AnV равняется не более 20, например не более 15. Оно может составлять не более 10 или даже не более 5. Предпочтительно значение POV и/или AnV относится в большей мере к неочищенному маслу, чем рафинированному. Значения AnV (в предпочтительных примерах) находятся в пределах от 15 до 5, необязательно от 12 до 7. Неочищенные масла по сравнению с рафинированными Некоторые различия между данными двумя маслами представлены ниже. Каждое неочищенное или рафинированное масло может иметь один или более признаков в последующей таблице соответственно для неочищенного или рафинированного масла. Как правило, неочищенное масло содержит антиоксидант (например, токоферол, аскорбилпальмитат). Соответственно неочищенное масло по настоящему изобретению может иметь один или более следующих признаков:(a) содержание неомыляющихся веществ от 2,0 до 3,5% (мас./мас.);(c) содержание свободных жирных кислот от 0,1 или 0,2 до 1%, например 0,2-0,6% или 0,3-0,5%;(e) содержание фосфора по меньшей мере 2, 3 или 5 мг/кг;(f) содержание кремния от 50 или 100 млн-1 до 500 млн-1; и/или(g) содержание воды менее 1 или от 0,5 до 1 или 2%.-7 015509 Применения масел и PUFA Шестой аспект изобретения относится к композиции, содержащей масло по пятому аспекту, и где является подходящим одно или более других (дополнительных) веществ. Композиция может представлять собой продукт питания и/или пищевую добавку для животных или людей. В воплощениях по изобретению, которые предназначены для потребления человеком, масла могут быть обеспечены как подходящие для потребления человеком, как правило, рафинированием или очисткой масла, полученного из микробных клеток. Композиция может представлять собой детскую молочную смесь или продукт питания (для человека). В данном случае состав молочной смеси можно скорректировать таким образом, что она будет включать аналогичные количества липидов или PUFA, которые имеются в обычном женском молоке. Это может включать смешивание масла из микробных клеток по изобретению с другими маслами для получения соответствующей композиции. Композиция может представлять собой корм или добавку для животных и рыб. Подобные корма и добавки можно скармливать любым сельскохозяйственным животным, в частности овцам, крупному рогатому скоту и птице. Кроме того, корма или добавки можно скармливать водным организмам, предназначенным для разведения, например рыбам и панцирным водным животным. Таким образом, композиция может содержать одно или более кормовых веществ или ингредиентов для подобных животных. Масло по изобретению можно продавать непосредственно как масло и в соответствующей упаковке, как правило, в разовых алюминиевых бутылях, покрытых изнутри эпоксифенольным лаком и продутых азотом. Масло может содержать один или более антиоксидантов (например, токоферол, витамин E,пальмитат), каждый, например, в концентрации от 50 до 800 млн-1, например от 100 до 700 млн-1. Подходящие композиции могут включать фармацевтическую или ветеринарную композиции, например, для перорального введения, или косметические композиции. Масло можно принимать как таковое или можно инкапсулировать, например, в оболочку и, таким образом, оно может быть в виде капсул. Оболочка или капсулы могут содержать желатин и/или глицерин. Композиция может включать другие ингредиенты, например флаворанты (например, флаворанты с запахом и вкусом лимона и лайма), или фармацевтически приемлемый или приемлемый для ветеринарии носитель или наполнитель. Предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта изобретения применимы к другому аспекту с соответствующими, необходимыми изменениями. Далее изобретение будет описано с помощью примеров при обращении к последующим примерам,которые представлены для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения. Пример 1. Полагают, что окисление во время получения масла из микробных клеток, содержащего PUFA,происходит в результате ферментативной активности. Пастеризацию рассматривали в качестве способа,снижающего вероятность окисления во время обработки микробных клеток для получения из них масла. Было установлено, что степень стабилизации зависит от условий пастеризации. Следовательно, проводили ряд опытов для определения того, какие условия пастеризации могут оказывать влияние на уровень окисления и, в частности, значение перекисного числа (POV) масла. Перекисное число определяли с использованием стандартной методики, подробно описанной в AOCS:Cd8-53. При постановке опытов следовали следующему протоколу: ферментация, хранение, пастеризация,экстракция (масла из микробных клеток), анализ масла. Грибы Mortierella alpina культивировали в ферментере. Ферментацию проводили в течение примерно 148 ч. М. alpina продуцировали PUFA, называемую арахидоновой кислотой (ARA). Биомассу извлекали из ферментера и хранили (при температуре ниже -18C). Пробы биомассы М. alpina отбирали из ферментационного бульона при ее сохранении в ферментере и сразу же замораживали. Тестировали различные протоколы пастеризации. Пастеризацию проводили при трех различных значениях температуры, а именно 40, 70 и 85C. Затем следовали три стадии с первой стадией быстрого нагревания с последующей стадией плато (второй или средней стадией) при желаемой температуре, которая была максимальной используемой температурой. Затем следовала стадия быстрого охлаждения(третья). Различные пробы биомассы находились на средней стадии (плато) в течение трех различных временных периодов, а именно 1, 2 и 24 ч. После пастеризации получали масло из микробных клеток с использованием влажной экстракции. Данную пробу биомассы фильтровали, отжимали (под давлением) и экстрагировали масло. Затем масло из микробных клеток анализировали, в основном определяли перекисное число (POV) с использованием метода AOCS. В некоторых пробах определяли содержание ARA. Результаты анализа показывали, что масло, полученное из микробных клеток, содержало примерно 420 г ARA на кг. Подробный протокол Ферментации и экстракции проб 1 л ферментационного бульона извлекали из ферментера и фильтровали (фильтр Зейтца, 2 л,F-FA10). Затем полученный осадок промывали 600 мл деминерализованной воды. Сырой осадок высу-8 015509 шивали в течение 1 мин и затем отжимали (с использованием аппарата HAFICO, тинктурный пресс COAO21, 300-400 атм) при 400 бар. Затем сырой экструдат использовали для экстракции масла из микробных клеток при помощи 500 мл гексана (Merck) при комнатной температуре (20-25C) в течение 1 ч с использованием устройства Ultra Turrax. Затем гексан сливали. Затем оставшийся осадок промывали 250 мл свежей порции гексана (при перемешивании в течение 30 мин) при комнатной температуре. Гексан сливали и затем добавляли к ранее используемой для экстракции порции гексана. Затем экстракт фильтровали с использованием стеклянного фильтра в комбинации со стеклянным фильтром GFA. Затем гексан выпаривали с использованием аппарата Rotavapor из прозрачного экстракта примерно при 50C в течение примерно 15 мин. Затем масло переносили в герметичные стаканы и каждый стакан с пробой продували азотом в течение 30 с. Затем стаканы с пробами закрывали и хранили при-18C. Протоколы пастеризации Тестировали три различных протокола (A, B и C). Каждый состоял из трех стадий, первой стадии нагревания, второй стадии плато (при максимальной температуре) и третьей стадии охлаждения. В табл. 1 представлены протоколы трех режимов пастеризации. Таблица 1 Дополнительно три режима пастеризации A, B и C представлены графически на фиг. 1. Очевидно,понятно, что можно рассчитать площадь под кривой зависимости температуры (T, C) от времени (t,мин) для каждой из трех стадий для каждого режима и затем суммировать с получением общей площади под кривой для каждого из трех режимов. Данные расчеты дополнительно приведены в табл. 1 выше. Перекисное число (POV) определяли для масел, полученных в результате экстракции из клеток после проведения трех протоколов пастеризации A, B и C. Значения POV экстрагированных масел соответственно составляли 8,7, 14,3 и 2,4. Режим B имел низкую скорость нагревания и низкую скорость охлаждения, и его включали только для сравнения. В результате он дал наиболее высокое значение POV, равное 14,3. В противоположность оба режима A и C находились в объеме изобретения. Режим A имел более высокую скорость нагревания и скорость охлаждения на первой и третьей стадиях по сравнению с режимом B. Предпочтительно по изобретению скорости нагревания и охлаждения представляют, по меньшей мере, таковые, представленные для режима A. Режим A давал значение POV, равное 8,7. Однако наилучшие результаты получали с режимом C, при котором значение POV составляло только 2,4. Как можно видеть из фиг. 1, в данном случае была очень быстрая стадия нагревания и быстрая стадия охлаждения (третья). Пример 2. Опыты проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что значения температуры пастеризации находились в более широких пределах, а именно составляли 40C (для сравнения), 70 и 85C. Режим температуры (C) в зависимости от времени (мин) представлен на фиг. 2 и в табл. 2 ниже. Кривая в основном одинакова для всех четырех проб, но, конечно, с увеличением плато пастеризации (от 1 до 4 или 24 ч) соответственно. Таблица 2 Тестировали пробы из двух различных ферментаций (обе с M. alpina) различной продолжительности. Пробы 11-20 в табл. 3 имели несколько более длительную ферментацию, где примерно 2 м 3 бульона переносили в инокуляционный ферментер и ферментацию проводили в течение 48 ч без дополнительного внесения глюкозы. После пастеризации пробы обрабатывали, начиная с фильтрования под давлением азота примерно 1 бар. Затем полученный осадок промывали производственной водой (примерно 0,6 от начального объема бульона). Обезвоживание проводили с использованием пресса для отжима фруктов под давлением поршня 300-400 бар. Затем добавляли 500 мл свежей порции гексана и перемешивали в течение 1 мин с использованием устройства Ultra Turrax в течение 1 мин. Затем проводили экстракцию в течение 1 ч при комнатной температуре. После фильтрования полученный осадок промывали 250 мл свежей порции гексана и полученный растворитель выпаривали в вакууме при 60-70C. Затем продували азотом и хранили при -18C. Результаты представлены в табл. 3, в которой показаны первое и второе значения перекисного числа и среднее из данных двух значений, а также значение анизидинового числа (AnV). На фиг. 3 и 4 также показано уменьшение POV и AnV (соответственно для более короткой и более продолжительной ферментации). Таблица 3 Из данных таблицы следует, что без пастеризации POV составляло 5,6 или 5,7. Пастеризация при 40C снижала значение POV, но требовался относительно длительный период времени (такой как 24 ч) при температуре пастеризации для снижения значения POV до приемлемого значения, равного 2,1. Использование более высоких значений температуры приводило к значительно лучшему результату. Например, при пастеризации только в течение 1 ч при 70C значение POV составляло 2,2 по сравнению с POV, равному 2,1 и соответствующему 24 ч при 40C. Еще более лучшие результаты получали при более высоких значениях температуры, так при 85C в течение 1 ч значение POV равнялось только 1,2. Данные фигуры представлены для более короткой ферментации, хотя аналогичные результаты получали с клетками, выросшими при более длительной ферментации. Так, на фиг. 3 и 4 графически представлено изменение значений POV и AnV в зависимости от различий во времени пастеризации. Как и предполагалось, более длительная пастеризация приводила к более низким значениям AnV и POV. Однако большое значение имело использование относительно более- 10015509 высокой температуры во время пастеризации. Заметное снижение AnV и POV обнаруживали при увеличении температуры пастеризации (Тпаст) до 70C, и еще более низкие значения соответствовали температуре 85C. Верхние три линии, обозначенные крестиками, кружками и звездочками, показывают значения AnV, в то время как нижние три линии, обозначенные ромбами, квадратами и треугольниками, представляют значения POV. В табл. 4 ниже представлено рассчитанное произведение tT (в Cмин) для девяти различных протоколов пастеризации (три различных температуры на стадии плато и три различных периода времени). Фактически данное произведение представляет площадь под кривой (зависимости времени t, мин от температуры T, C) для стадии плато (после стадии нагревания, но перед стадией охлаждения). Таблица 4 Пример 3. Последующие опыты по пастеризации проводили с использованием ферментационного бульона,проводя ферментацию в промышленном масштабе, с использованием гриба M. alpina, приведенного в качестве примера выше. Транспортировали непастеризованный бульон (800 л) и хранили при 4C. Затем бульон переносили в резервуар с перемешиванием емкостью 700 л и проводили 10 различных протоколов пастеризации. Первое, пастеризацию проводили при пяти различных (максимальных) значениях температуры, а именно 140, 120, 100, 80 и 60C со временем выдерживания (плато) (при максимальной температуре),равным 8 с. Второе, пастеризацию проводили при 140, 120, 100, 80 и 60C при времени выдерживания(плато) при максимальной температуре, равном 300 с. Отбирали пробы (2 л) и затем сразу же замораживали при -18C. Отбирали стерильные пробы(200 мл) и замораживали, и из проб экстрагировали неочищенное, содержащее ARA, масло. Пробу ферментационного бульона (1,7 л) фильтровали под давлением N2 1 бар. Осадок промывали 0,6 объемами конденсационной воды и отжимали примерно в течение 5 мин под давлением 400 кг/см 2. Затем к влажному осадку добавляли н-гексан (500 мл) и перемешивали с использованием устройстваUltra Turrax при 24000 об/мин. Масло экстрагировали при комнатной температуре (примерно 21C) в течение примерно 110 мин. Суспензию фильтровали под вакуумом при использовании фильтра для средGF/A Ватман. Осадок промывали 250 мл свежей порции гексана. Гексан выпаривали в течение 15 мин на водяной бане при температуре примерно 60-70C. Затем полученное масло переносили в герметичные стаканы, которые продували азотом в течение 30 с и затем закрывали и хранили до анализа при -18C. На фиг. 5, 6 и 7 представлены данные последующего анализа. На фиг. 6 и 7 показаны кривые зависимости времени от температуры для двух серий опытов, в первой время стадии плато (выдерживания) составляло 8 с, и во второй время стадии плато (выдерживания) составляло 5 мин, соответственно каждое для 5 значений температуры. Как следует из графиков, горизонтальная средняя линия (представляющая 8 с или 5 мин) показывает стадию плато. На фиг. 5 представлены полученные значения POV и AnV для всех 10 режимов пастеризации. Как следует из этих данных, более низкие значения POV получали при значительно более высокой температуре и более длительный период выдерживания (5 мин) соответствовал наиболее низким значениямPOV. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Микробное масло, которое содержит по меньшей мере 35% требуемой полиненасыщенной жирной кислоты PUFA и которое имеет анизидиновое число AnV ниже 25. 2. Масло по п.1, которое содержит по меньшей мере 40% указанной PUFA. 3. Масло по п.1 или 2, в котором указанная требуемая PUFA является арахидоновой кислотой ARA. 4. Масло по п.1 или 2, которое имеет анизидиновое число от 5 до 25. 5. Масло по п.1 или 2, в котором AnV масла составляет не выше 20. 6. Масло по п.4, в котором AnV масла составляет не выше 15. 7. Масло по любому из пп.1-6, которое имеет содержание триглицеридов по меньшей мере 90%. 8. Масло по любому из пп.1-7, имеющее пероксидное число (POV) не выше 3,0. 9. Масло по п.8, имеющее POV не выше 2,0. 10. Масло по любому из пп.1-9, продуцируемое грибом. 11. Масло по п.10, в котором гриб является грибом рода Mortierella. 12. Масло по п.11, в котором гриб является грибом вида Mortierella alpina. 13. Масло по любому из пп.1-12, которое является неочищенным маслом.- 11015509 14. Масло по п.13, подвергнутое одной или более стадиям рафинирования. 15. Масло по п.14, в котором стадии рафинирования включают обработку кислотой или дегуммирование, обработку щлочью или удаление свободных жирных кислот, отбеливание или удаление пигментов, фильтрацию, фракционирование охлаждением, дезодорацию и/или осветление фильтрованием. 16. Масло по п.14 или 15, добавляемое в пищевые продукты для человека или в корма для животных. 17. Масло по п.14 или 15, добавляемое в смесь для детского питания. 18. Пищевой или кормовой продукт, содержащий масло по любому из пп.14 или 15. 19. Продукт по п.18, который является смесью для детского питания. 20. Продукт по п.18, который является кормовой композицией для животных, в частности морских животных. 21. Способ получения микробного масла по любому из пп.1-13, включающий пастеризацию клеток и экстрагирование или выделение микробного масла из подвергнутых пастеризации клеток, в котором пастеризация является, по меньшей мере, трхстадийным процессом, то есть на первой стадии клетки нагреваются от температуры ниже 40C до температуры выше 60C, при этом температура клеток "проходит" диапазон с 40 по 60C не более чем за 30 мин; на второй стадии, которая проводится при постоянной температуре, поддерживается повышенная температура T, C, по меньшей мере 60C, в течение некоторого времени t, мин, при этом tT продукта составляет от 140 до 100800Cмин, а на третьей стадии осуществляется охлаждение. 22. Способ по п.21, в котором температура клеток на первой стадии тепловой обработки "проходит" диапазон с 40 по 60C не более чем за 15 мин. 23. Способ по п.21 или 22, в котором tT продукта на стадии поддержания постоянной температуры составляет от 500 до 10000Cмин. 24. Способ по любому из пп.21-23, в котором температура на стадии поддержания постоянной температуры составляет по меньшей мере 70C. 25. Способ по п.24, в котором температура на стадии поддержания постоянной температуры составляет от 100 до 140C. 26. Способ по любому из пп.21-25, в котором клетки на третьей стадии охлаждаются со скоростью по меньшей мере 0,6C/мин.