Амидаза из aspergillus niger и применение амидазы для получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида

АМИДАЗА ИЗ ASPERGILLUS NIGER И ПРИМЕНЕНИЕ АМИДАЗЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА С ПОНИЖЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АКРИЛАМИДА Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности и обеспечивает способ получения пищевого продукта или продукта питания с пониженным содержанием акриламида, включающий стадию тепловой обработки с последующим добавлением фермента - амидазы к промежуточной форме пищевого продукта или продукта питания. Изобретение также относится к пищевым продуктам или продуктам питания с пониженным содержанием акриламида, полученным способом по изобретению. Изобретение также относится к изолированным амидазам из Aspergillus niger и рекомбинантным амидазам, кодирующим их полинуклеотидам, векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам. Применение амидазы позволяет снизить уровень акриламида в пищевом продукте или продукте питания.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) 014853 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам получения пищевого продукта, корма для домашних животных или кормового продукта, включающим по меньшей мере одну стадию тепловой обработки, и к пищевому продукту, корму для домашних животных или кормовым продуктам, полученным такими способами. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым ферментам, подходящим для способа по изобретению. Сведения о предшествующем уровне техники Акриламид получают коммерчески в течение ряда лет. Поэтому его токсикологический статус вполне установлен. Акриламид используют, главным образом, для получения полиакриламида и последнее соединение используют для различных применений, таких как получение питьевой воды, закрепление почвы, обработка промышленных сточных вод, добыча нефти и лабораторные применения. Акриламид считается возможным канцерогеном для животных и людей. В 1991 г. в ScientificCommittee on Food проведены исследования мономерного акриламида в контакте с пищевыми материалами и сделан вывод, что акриламид является генотоксичным канцерогеном. Bergmark et al. (Chem. Res.Toxicol., 10: 78-84, 1997) показали, что акриламид является компонентом табачного дыма. Это стало первым связующим звеном между образованием акриламида и нагреванием биологического материла. Недавно сделано сообщение о появлении акриламида в ряде жареных и полученных в печи пищевых продуктах (Tareke et al., Chem. Res. Toxicol., 13: 517-522, 2000), что вызвало беспокойство во всем мире. Другое исследование показало, что значительные количества акриламида обнаруживаются в ряде печеных, жареных и полученных в печи обычных пищевых продуктов, и показано, что появление акриламида в пищевом продукте было результатом процесса тепловой обработки. Официальный предел акриламидного загрязнения в пищевых продуктах в UK установлен в 10 ч./млрд (10 мкг/кг). Величины, приведенные в литературе, превышали указанную величину во многих продуктах, например крупах, хлебопродуктах, кофе, картофельных чипсах (замороженном картофеле,жаренном кусочками) и хрустящем картофеле. Соотношение между вводимой дозой акриламида и частотой появления опухолей установили в испытаниях, в которых крысам, за которыми наблюдали в течение 2 лет, скармливали акриламид с питьевой водой (Friedman et al., Fundam. Appl. Pharmacol., 85: 154-168, 1986; Johnson et al., Toxicol. Appl.Pharmacol., 85: 154-168, 1986). Tareke et al. исследовали гемоглобинсвязанный акриламид у крыс - какN-(2-карбамоилэтил)валин - в связи с пищевым рационом, содержащим акриламид. Путем объединения полученных результатов вычислено, что ежедневное потребление акриламида в 1,6 мг/кг соответствует риску появления рака 710-3 для людей при воздействии на протяжении жизни. Предположен путь образования акриламида из аминокислот и восстанавливающих сахаров(Mottram et al., Nature, 419: 448, 2002). Согласно такой гипотезе акриламид образуется во время реакции Мейлларда. Во время запекания, жарения и обжаривания реакции Мейлларда вносят существенный вклад в цвет, запах и вкус продукта. С реакциями Мейлларда ассоциируется расщепление аминокислот по Штреккеру и предлагается путь к акриламиду. Образование акриламида становится заметным, когда температура превышает 120 С, и наивысшую скорость образования наблюдают примерно при 170 С. Когда присутствуют как аспарагин, так и глюкоза, наблюдали наивысшие количества акриламида, в то время как глутамин и аспарагиновая кислота дают появление только следовых количеств. В интересах общественного здравоохранения существует острая потребность в пищевых продуктах,которые имеют существенно более низкие уровни акриламида или предпочтительно лишены его. В первую очередь инициирована исследовательская деятельность для того, чтобы разгадать механизм образования акриламида в пищевых продуктах. До настоящего времени результаты не привели к удовлетворительному решению проблемы. В настоящее время пищевые компании исследуют возможности избежать образования акриламида за счет снижения температуры тепловой обработки в печи и в процессах обжарки. Однако такие адаптации, по существу, приведут к пищевым продуктам с изменившимися вкусовыми свойствами (меньше продуктов Мейлларда) или изменившимся составом (более высокое содержание жиров). Заявки на патент US 2004/0058046 и US 2004/0058054 относятся к способам предотвращения образования акриламида путем обработки промежуточной формы пищевого продукта ферментом, который разрушает аминокислоты, участвующие в образовании акриламида, в частности аспарагин. Модификация аминокислот может быть нежелательной с точки зрения качества продукта, например когда релевантные аминокислоты представляют существенную фракцию массы продукта. Примером является случай с картофелем, в котором присутствует примерно 0,1 мас.% аспарагина относительно сухой массы картофеля. Акриламид, образовавшийся в картофельных чипсах, составляет примерно 100 ч./млрд,что указывает, что только небольшая часть аспарагина, присутствующего в картофеле, переходит в акриламид. Однако применение способов по вышеуказанным заявкам на патент может привести к необходимости модифицировать весь или по меньшей мере большую часть присутствующей питательной релевантной аминокислоты аспарагина.-1 014853 Кроме того, в некоторых случаях данный способ трудно применить, например, когда ни одна из промежуточных форм пищевого продукта, которые имеют место перед стадией тепловой обработки,не содержит достаточно влаги для того, чтобы действовал фермент, добавленный извне. Наконец,акриламид может образовываться, несмотря на все меры, принятые для того, чтобы этого избежать. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является новый способ получения пищевого продукта, способный снизить уровень акриламида в пищевом продукте, причем способ подходит для применения к пищевому продукту или его промежуточной форме или исходным материалам, причем в то же время сохраняется высокий уровень питательных релевантных аминокислот. Цель настоящего изобретения достигается способом получения пищевого продукта, включающим следующие стадии: тепловая обработка пищевого продукта до температуры, при которой образуется акриламид; и последующее добавление фермента, причем указанный фермент способен модифицировать акриламид. Неожиданно, можно применить фермент, способный модифицировать акриламид, к пищевому продукту и получить нужные низкие уровни акриламида, причем в то же время сохраняется высокий уровень питательных релевантных аминокислот, например аспарагина. Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к изолированной амидазе, которую можно получить из Aspergillus niger, с аминокислотной последовательностьюSEQ ID NO: 23 или ее функциональным эквивалентам, обладающим по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23. Настоящее изобретение во втором своем аспекте относится к изолированной амидазе, которую можно получить из Aspergillus niger, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32, или ее функциональным эквивалентам, обладающим по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32. В своем третьем аспекте изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, выбранному из:(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которую можно получить из Aspergillusniger, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, или ее функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23;(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которую можно получить из Aspergillus niger, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 12;(c) изолированного полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 12, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 12. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, выбранному из:(a) изолированного полинуклеотида, кодирующего амидазу, которую можно получить из Aspergillusniger, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, или его функциональные эквиваленты, обладающие по меньшей мере 70% или большей гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32;(b) изолированного полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один функциональный домен амидазы, которую можно получить из Aspergillus niger, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 21;SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 21, или его функциональных эквивалентов, обладающих по меньшей мере 70% или большей гомологией с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 10 илиSEQ ID NO: 21. Изобретение в своем пятом аспекте относится к вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность, относящуюся к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения. В своем шестом аспекте изобретение относится к изолированной амидазе, которую можно получить экспрессией полинуклеотида, относящегося к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения,или вектора, относящегося к пятому аспекту, в соответствующей клетке-хозяине, например Aspergillusniger. В своем седьмом аспекте изобретение относится к рекомбинантной амидазе, содержащей функциональный домен любой из амидаз, относящихся к аспектам 1, 2 или 6 настоящего изобретения.-2 014853 В восьмом аспекте изобретение касается рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, относящийся к третьему и четвертому аспектам настоящего изобретения, или вектор, относящийся к пятому аспекту. В своем девятом аспекте изобретение касается рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид, относящийся к любому из аспектов 1, 2 или 6, 7 настоящего изобретения. В своем десятом аспекте изобретение относится к способу получения амидазы по любому из аспектов 1, 2, 6, 7, включающему стадии трансформации подходящей клетки-хозяина изолированным полинуклеотидом по любому из аспектов 3, 4 или вектором, относящимся к аспекту 5, культивирования указанной клетки в условиях, допускающих экспрессию указанного полинуклеотида, и, при необходимости,очистки кодируемого полипептида из указанной клетки или культуральной среды. В своем одиннадцатом аспекте изобретение относится к способу продуцирования полинуклеотида по любому из аспектов 3, 4, включающему стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом, и выделения указанного полинуклеотида из указанной клетки-хозяина. Изобретение в своем двенадцатом аспекте относится к способу продуцирования вектора, относящегося к аспекту 5 настоящего изобретения, включающему стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным вектором, и выделения указанного вектора из указанной клетки-хозяина. В своем тринадцатом аспекте изобретение относится к способу получения пищевого продукта с пониженным содержанием акриламида, включающему обжарку пищевого продукта при температуре, при которой образуется акриламид, с получением обжаренного пищевого продукта с последующим приведением обжаренного пищевого продукта и/или порошков, смесей и/или экстрактов, полученных из обжаренного пищевого продукта, в контакт с ферментом амидазой в водных условиях с получением ферментативно обработанного пищевого продукта, причем указанный фермент способен модифицировать акриламид. В одном из воплощений способа фермент добавляют в количестве, достаточном для уменьшения количества акриламида на 50%, предпочтительно на 70%, предпочтительнее на 80% и наиболее предпочтительно на 90% по сравнению с количеством в пищевом продукте, к которому фермент не был добавлен. В еще одном из воплощений способа водные условия получают посредством добавления воды или пасты, содержащей воду, к обжаренному пищевому продукту и/или порошкам, смесям и/или экстрактам,полученным из обжаренного пищевого продукта, и ферментативно обработанный пищевой продукт содержит по меньшей мере 15 мас.% воды. В еще одном из воплощений способа пищевой продукт представляет собой кофейный продукт,предпочтительно обжаренные кофейные зерна либо части или экстракты обжаренных кофейных зерен,молотый кофе, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты и декофеинированный вариант кофейных продуктов. В следующем из воплощений способа обжаренный пищевой продукт представляет собой обжаренные зерна какао или обжаренные орехи. В еще одном из воплощений способа ферментативно обработанный пищевой продукт представляет собой сваренный кофе, жидкий кофейный напиток, кофейный экстракт или декофеинированный вариант этих кофейных продуктов, напиток какао или шоколадный напиток. В еще одном из воплощений способа ферментативно обработанный пищевой продукт высушивают или частично высушивают с получением концентрированного кофейного экстракта быстрорастворимого кофе, или декофеинированного варианта этих кофейных продуктов, или быстрорастворимого шоколадного напитка, или быстрорастворимого напитка какао. В еще одном из воплощений способа фермент способен гидролизовать короткоцепочечные нециклические амиды. В своем следующем аспекте изобретение относится к применению амидазы по любому из аспектов 1, 2, 6, 7 в способе получения пищевого продукта, относящемся к аспекту 13 и его предпочтительным воплощениям. Наконец, еще в одном аспекте изобретение относится к пищевому продукту с пониженным содержанием акриламида, который можно получить способом, относящимся к аспекту 13 и его предпочтительным воплощениям.-3 014853 Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Термин "пищевой продукт" в данном месте описания и далее включает как продукты питания для потребления людьми, так и корма для потребления животными, включая корм для домашних животных и корма, если в описании четко не указано иное. Пищевой продукт включает напитки. Кроме того, термин "пищевой продукт" охватывает исходный материал, промежуточные пищевые продукты и пищевые продукты, готовые к употреблению, если в описании четко не указано иное. Настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающему по меньшей мере одну стадию тепловой обработки, включая добавление фермента, способного модифицировать акриламид, после указанной стадии тепловой обработки. Форма пищевого продукта, к которой применяют фермент, не должна быть только конечным продуктом - могут иметь место дополнительные стадии переработки после добавления фермента. Предпочтительными пищевыми продуктами являются пищевые продукты, которые подвергают тепловой обработке в сухом состоянии и, следовательно, содержат количество акриламида, сниженное до более низких уровней. Сухое состояние означает содержание влаги менее 20 мас.%, предпочтительно менее 15 мас.%. Кофейные зерна, порошкообразный кофе, кофейные напитки или напиток, содержащий кофе, являются наиболее предпочтительными продуктами для обработки. Кофейные зерна"обжаривают" в сухом состоянии для получения их аромата. Во время такой обжарки или тепловой обработки будет образовываться акриламид. Такие зерна весьма затруднительно обрабатывать предварительно, например, аспарагиназой для предотвращения образования акриламида. В WO 2004/037007 раскрывается такая предварительная обработка. В WO 2004/037007 образующийся акриламид пытаются растворять путем приведения добавляемого извне фермента в контакт с соединением внутри более или менее твердой матрицы. Способы по WO 2004/037007 требуют дополнительной существенной переработки, включая сушку,гидратацию, уменьшение размера частиц и т.д., перед стадией обжарки. Это в целом несовместимо с обработкой кофе. Используемые способы являются достаточно трудоемкими и занимающими длительное время, а снижение по акриламиду является скромным. Кроме того, также эффективно замачивание неактивированным ферментом (см. пример 3 вWO 2004/037007), так как, по меньшей мере, частично эффект имеет место просто из-за водной экстракции аспарагина из кофейных зерен, а не из-за активности фермента. При такой экстракции также будут теряться ценные для кофейного аромата соединения. В способе по изобретению стадии тепловой обработки являются стадиями, на которых часть промежуточного пищевого продукта подвергается воздействию температур, при которых образование акриламида ускоряется, например, при 105C или выше, 120C или выше. Как правило, температура на стадии тепловой обработки в общем процессе получения составляет максимально 250C, чаще до 220 или 200C. Стадию тепловой обработки в способе по изобретению можно осуществлять в сушильных печах, например, при температуре 150-250C, таких как для выпечки хлеба и других печеных продуктов; в масле, таком как для обжаривания замороженного картофеля кусочками, картофельных чипсов или соевого пирога, например, при 150-200C; на плитах, или на, или под нагретым грилем. Предпочтительными стадиями нагревания являются обжарка или обработка на гриле. Пищевой продукт можно получить по меньшей мере из одного сырья, которое имеет растительное происхождение, например клубнеплодов, таких как картофель, сладкий картофель или кассава; бобовых,таких как горох или соевые бобы; ароматных растений, таких как табак, кофе или какао; орехов или зерновых, таких как пшеница, рожь, кукуруза, маис, ячмень, крупяные, гречиха, рис или овес. В объем данного изобретения также входят пищевые продукты, полученные из нескольких видов сырья, например пищевые продукты, содержащие как кукурузу, так и картофель. Пищевой продукт также может содержать по меньшей мере один вид сырья, имеющего животное происхождение. Пищевой продукт также может содержать по меньшей мере один вид сырья, имеющего источником грибы, такой как сырье, полученное из грибов или белка грибов. Примером пищевых продуктов, для которых можно применить способ по изобретению, являются обжаренные продукты и/или порошки, смеси и/или экстракты, полученные из обжаренных продуктов. Примерами обжаренных продуктов являются кофейные зерна или какао-бобы; орехи, такие как арахис,миндаль, грецкие орехи, орехи пекан, фундук; крупы, такие как обжаренная кукуруза; корни, такие как цикорий; отдельные вещества, такие как сахар, используемый для карамельного кулера. Способ по изобретению особенно подходит для кофейных зерен или какао-бобов. Настоящее изобретение также относится к продуктам, полученным из обжаренных материалов. Примерами продуктов, полученных из обжаренных материалов, являются заваренный кофе, кофейный экстракт, кофейный концентрат, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, молотый кофе, декофеинированные варианты таких кофейных продуктов, какао-порошок, шоколад, растворимый шоколадный напиток, тертый орех, пиво, виски, солод, экстракт солода, соевый соус.-4 014853 Настоящее изобретение исключительно подходит для обжаренных пищевых продуктов, так как при получении таких продуктов, как правило, не включается стадия с включением влаги, достаточной для действия фермента на промежуточные продукты, перед стадией тепловой обработки. Особенно предпочтительными способами являются способы, которые включают воздействие жидкой или влажной окружающей среды после стадии тепловой обработки, как, например, жидкостная экстракция обжаренных или термообработанных материалов или смешивание молотых обжаренных или термообработанных материалов с другим влажным материалом или с водой. Примерами продуктов, полученных такими способами, являются кофе, какао-напиток, шоколад, миндальная приправа, соевый соус и карамельный кулер. Без предвзятого отношения к способам, описанным выше, способ по изобретению также можно использовать для других пищевых продуктов, содержащих акриламид. Акриламид образуется в пищевом продукте за счет взаимодействия аспарагина и глюкозы, когда пищевой продукт нагревают при температурах 100-120C и выше. Образование акриламида будет усиливаться с повышением температуры. Некоторые пищевые продукты обрабатывают при температурах, при которых будет образовываться акриламид, как, например, при выпечке хлеба в печи при 225C, жарении замороженного картофеля кусочками в масле примерно при 160-180 С или обжаривании кофейных зерен при температурах 180 С и выше. В некоторых заявках на патент описывается возможность предотвращения образования акриламида. Примером является ферментативная обработка аспарагина с использованием аспарагиназы. Показано,что такая обработка является весьма успешной. Например, в хлебе, замороженном картофеле, жаренном кусочками, и чипсах количество образовавшегося акриламида существенно снизилось. В таких случаях фермент добавляют к пищевому продукту перед термической обработкой. Фермент добавляли в тесто перед выпечкой. Замороженный картофель, который жарят кусочками, или чипсы можно сбрызнуть раствором фермента. В случае замороженного картофеля, жаренного кусочками, и хлеба только поверхность пищевого продукта будет подвергаться воздействию температуры выше 100 С. В хлебе внутренняя часть не будет нагреваться выше 80 или 90C из-за присутствия воды. Также внутренняя часть замороженного картофеля, который жарят кусочками, не будет нагреваться выше температуры кипения воды,и во внутренней части акриламид, по существу, не будет образовываться, и, таким образом, ферментативной обработки только наружной поверхности замороженного картофеля, который жарят кусочками,достаточно для предотвращения образования акриламида. Авторы обнаружили, что применение такой аспарагиназы менее эффективно в пищевых продуктах,которые будут подвергаться термической обработке таким образом, что весь пищевой продукт будет иметь температуру выше 120C, и для такого случая не существует способов включения фермента во весь пищевой продукт коммерчески привлекательным способом. Как правило, такие пищевые продукты являются твердыми и не перемешиваются (не уподобляются тесту), имеют толщину по меньшей мере 3 мм и содержат только незначительные количества воды, как правило менее 20 мас.%, предпочтительно менее 12 мас.% воды. Хорошим примером таких продуктов являются кофейные зерна. Такие зерна обжаривают для получения кофейных зерен, подходящих для приготовления кофе. Во время обжарки все зерно будет иметь температуру свыше 150 С. Акриламид будет образовываться не только в наружном слое,как в случае замороженного картофеля, жаренного кусочками, но также будет образовываться во всем объеме зерна. В самом распространенном способе кофейные зерна снимают, отшелушивают, выдерживают для дозревания ("ферментируют"), промывают и сушат (или в сушильной печи или потоком горячего воздуха). Указанные стадии приняты поставщиками кофе (в странах-поставщиках). Полученный продукт представляет собой зеленые кофейные зерна с содержанием влаги 9,8-12,5% (рекомендацией являются 11-12%). На данной стадии зерно может хорошо храниться. Для "обычного" кофе зерна просто обжаривают. Мелкомасштабное оборудование работает примерно при 160 С (температура внутри становится выше 200 С). На промышленном оборудовании, вероятно,используют более высокие температуры воздуха (но более короткое время обжарки). Поэтому настоящее изобретение предпочтительно используется в способе получения пищевого продукта, который представляет собой кофейный продукт, предпочтительно кофейные зерна, молотый кофе, растворимый кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты или декофеинированные варианты кофейных продуктов. Для декофеинирования существует по меньшей мере 4 способа (все осуществляются на зеленых кофейных зернах). 1. Сверхкритическая экстракция CO2. В данном случае фермент не может действовать. 2. Экстракция метиленхлоридом. В данном случае зерна сначала обрабатывают водяным паром. 3. Экстракция этилацетатом. В данном случае кофеин экстрагируют из зерен водой (вместе с рядом других (ароматических) соединений), затем кофеин извлекают этилацетатом и добавляют снова промывку зерен водой для возвращения запаха. 4. Швейцарский способ с водой. Имеет сходство со способом 3, но применяют поглощение активированным углем вместо этилацетата.-5 014853 Хотя настоящее изобретение можно применять во всех способах декофеинирования, способ настоящего изобретения наиболее выгодно применять при получении обычных кофейных продуктов. Авторы неожиданно обнаружили, что количество акриламида можно уменьшить в кофе, обрабатывая не кофейные зерна, а экстракты, полученные из указанных кофейных зерен. Поэтому настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания акриламида в пищевом продукте путем обработки пищевого продукта, который обработан при температурах выше 100 С,предпочтительно выше 120 С и наиболее предпочтительно выше 150 С и затем приведен в контакт в водной среде с ферментом амидазой. Предпочтительно водную среду получают добавлением жидкости или пасты, содержащей воду. Жидкость или паста может содержать фермент, но жидкость или паста также может добавляться отдельно от фермента. После добавления жидкости или пасты пищевой продукт может находиться в водном состоянии (например, кофейный экстракт, или шоколад, или какао-напиток), в пастообразном состоянии(например, ореховое масло или миндальная приправа), в форме эмульсии (например, ореховое масло) до тех пор, пока ферментативно обработанный пищевой продукт содержит по меньшей мере 15 мас.%,предпочтительно по меньшей мере 25 мас.%, предпочтительнее по меньшей мере 40 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 мас.% воды. Пищевой продукт по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой заваренный кофе, жидкие кофейные напитки, кофейные экстракты, какао-напитки или шоколадные напитки. После ферментативной обработки пищевой продукт можно высушить или частично высушить. Поэтому концентрированный кофейный экстракт, растворимый кофе,растворимый шоколадный напиток или растворимые напитки-какао, ферментативно обработанные амидазой, также являются частью настоящего изобретения. При необходимости амидазу можно инактивировать. Это можно осуществить, например, кратковременной термической обработкой при подходящей температуре, например при 90 С. Авторы стали первыми, кто сумел получить кофе из кофейных зерен или кофейного порошка, содержащий менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида (мкг акриламида / кг сухого кофе) в промышленном масштабе. Поэтому настоящее изобретение относится к обжаренным кофейным зернам, кофейным напиткам,заваренному кофе, содержащим менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе. Настоящее изобретение также относится к упаковкам, таким как герметичные упаковки из фольги,необязательно, вакуумные герметизированные банки или горшки, изготовленные из металла, стекла или полимеров, и подобные упаковки, содержащим по меньшей мере 50 г, предпочтительно по меньшей мере 100 г обжаренных кофейных зерен, кофейных экстрактов, концентрированных кофейных напитков, кофейных напитков, заваренного кофе, содержащих менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе. Как правило, такие упаковки будут содержать менее 1000 кг, предпочтительно менее 100 кг, предпочтительнее менее 10 кг и наиболее предпочтительно менее 1 кг обжаренных кофейных зерен, кофейных экстрактов, концентрированных кофейных напитков, кофейных напитков, заваренного кофе, содержащих менее 50 ч./млрд, предпочтительно менее 30 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 10 ч./млрд акриламида относительно сухого вещества кофе. Фермент, используемый в способе по изобретению, представляет собой фермент, способный модифицировать акриламид. Термин "фермент" обозначает "один фермент", а также "сочетание нескольких ферментов". Предпочтительно фермент способен модифицировать короткоцепные нециклические амиды. Как правило, короткоцепные нециклические амиды содержат самое большее 6 атомов C в своей алифатической цепи, предпочтительнее самое большее 5, даже предпочтительнее самое большее 4 и наиболее предпочтительно самое большее 3 атома С. Алифатическая цепь может быть линейной или разветвленной. Предпочтительнее фермент способен модифицировать акриламид, ацетамид и/или пропионамид. Предпочтительной модификацией акриламида является модификация под действием амидазы. Предпочтительно препарат фермента, используемый в способе по изобретению, происходит от микроорганизмов, и его получают способами ферментации, известными в технике. Микроорганизмы могут представлять собой бактерии, грибы или дрожжи. Фермент можно получить из различных источников, таких как, например, растения, животные и микроорганизмы, такие как, например, виды Alcaligenes, Arthrobacter, Brevibacterium, Escherichia,Klebsiella, Mycobacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Pseudomonas, Rhodococcus, Xanthomonas,Aspergillus и Bacillus, предпочтительно Aspergillus, Bacillus или Saccharomyces, предпочтительнееAspergillus. Примером подходящего штамма Escherichia является Escherichia coli. Примером подходящего штамма Rhodococcus является Rhodococcus rhodochrous. Примерами подходящих штаммовStreptomyces является Streptomyces lividans. Примерами подходящих штаммов Saccharomyces являются,например, Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Saccharomycespastorianus или Saccharomyces paradoxus. Примерами подходящих штаммов Aspergillus являютсяcirculans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis. Предпочтительно фермент получают из пищевых микроорганизмов, например Aspergillus niger,Saccharomyces cerevisae или Bacillus subtilis, наиболее предпочтительно из Aspergillus niger. Предпочтительно фермент предоставляют в устойчивой форме, как правило жидкой форме, форме порошка, гранул или инкапсулированной форме. Независимо от композиции фермента можно применять любые добавки и стабилизаторы, известные в технике как применяемые для улучшения и/или поддержания активности ферментов. Когда фермент входит в состав жидкой формы, его можно применять к продукту любым возможным способом, например пропитыванием, опрыскиванием или смешиванием. Фермент также можно, например, добавлять в жидкий экстракт, эмульсию или суспензию продукта, промежуточного для пищевого продукта. С другой стороны, фермент можно получать in situ с помощью микроорганизма, способного продуцировать указанный фермент. Фермент можно добавлять в количестве примерно 100-0,1 Е/л, предпочтительнее менее 50 Е/л, даже предпочтительнее самое большее 10 Е/л или от 5 до 1 Е/л (где 1 Е определяется как гидролиз 1 мкмоль амида в минуту), см. пример 8. Амидазы (или амидогидролазы) представляют собой ферменты, которые гидролизуют химическую связь C-N амида, причем посредством этого образуются аммиак и уксусная кислота, и акриламидаза превращает акриламид в аммиак и акриловую кислоту (пропеновую кислоту). Амидазы являются хорошо исследованным классом ферментов, классифицированным как "ферменты, гидролизующие углерод-азотные связи, иные, чем пептидные связи" (ЕС 3.5). Особый интерес представляет группа, действующая на линейные амиды (3.5.1). Другой группой ферментов, которые катализируют подобную реакцию, являются бета-лактамацилазы (ЕС 3.5.1.11), где C и N также оба являются замещенными, например глутарилацилаза, где С является частью глутаровой кислоты и N частью беталактамового цикла. Другими ферментами, которые действуют подобным образом, являются аспарагиназа (3.5.1.1), глутаминаза (3.5.1.2), гидролаза циклического димера 6-аминогексаноата (ЕС 3.5.2.12), гидролаза амидов жирных кислот, хитиндеацетилаза (3.5.1.41), глутамил-тРНК(Gln)-амидотрансфераза. Реакция гидролиза, которую указанные соединения могут катализировать, подобна реакции для пептидаз(ЕС 3.4), но в случае пептидаз как C, так и N гидролизуемой связи содержатся в аминокислотах. Следует отметить, что применение амидаз по изобретению для модификации акриламида, как только он образуется, существенно отличается от применения, например, аспарагиназы для разрушения аминокислот с целью предотвращения образования акриламида, как описано на известном уровне техники,например в US 2004/0058046 или US 2004/0058054. Многие, но не все, из указанных ферментов имеют общий структурный мотив - консервативную область, богатую остатками глицина, серина и аланина. Сообщается, что существует три основных семейства амидаз: группа собственно амидаз (примеры А.oryzae, S.typhimurium); группа нитрилаз (примеры P.aeruginosa, R.erythropolis, H.pylori, В.stearothermophilus); группа уреаз (пример М.smegmatis) (Novoet al., Biochem. J., 365: 731-738, 2002). Субстраты для амидаз включают ацетамид, индолацетамид, фенилацетамид, паранитрофенилацетамид, паранитроацетанилид, хлорацетамид, пропионамид, бутирамид,изобутирамид, сукцинамид, акриламид, метакриламид, бензамид и никотинамид. Имеются сообщения в уровне техники о применении амидаз из различных источников для гидролиза акриламида для удаления мономерного акриламида из полиакриламидных продуктов для возможности безопасного применения полимера. Например, в патенте США 4925797 описывается применение для такой цели амидазы из Methylophilus methylotrophus. Авторы указанного патента обращаются к вопросу присутствия акриламида в полимерах, которые могут контактировать с пищевым продуктом, и предлагают способ удаления акриламида из полимера для того, чтобы избежать загрязнения пищевого продукта. В патенте США 5962284 амидазу из вида Rhodococcus используют для снижения уровней акриламида в полиакриламидных гелях. В патенте США 6248551 описывается акриламидаза из Helicobacter pyroli. Другие авторы используют иммобилизованные клетки для того, чтобы добиться разрушения акриламида,например в патенте США 6146861, где для такой цели используют клетки Rhodococcus rhodochrous. Указанные применения не направлены на сам содержащийся акриламид, не указывают применение таких амидаз для самих пищевых продуктов для снижения уровней акриламида, а только указывают на пригодность амидаз для применений к пищевым продуктам. Вышеуказанные применения также относятся к использованию бактериальных амидаз. Однако также известны гидролизующие действия амидаз из грибов. Ацетамидазу из Emericella применяют в области молекулярной генетики как селектированный маркер для генетически трансформированных клеток грибов. Однако по сравнению со знаниями о возможных субстратах, специфичности и возможностях бактериальных амидаз о свойствах ферментов грибов известно немногое. Также амидазы из грибов не используют для эффективного удаления акриламида. Более того, успешное применение гидролизующих акриламид ферментов для пищевых продуктов - успешное в смысле того, что количество акриламида снижается до приемлемых уровней - пока не достигалось. Это не является незначительным моментом,так как уровни, которых необходимо достигнуть и, следовательно, концентрация субстрата фермента-7 014853 являются исключительно низкими, находясь в таких низких интервалах, в ч./млрд, как 200 ч./млрд, предпочтительнее менее 100 ч./млрд, даже предпочтительнее менее 50 ч./млрд и наиболее предпочтительно менее 20 ч./млрд. Неожиданно авторы обнаружили, что мицелиальный гриб Aspergillus niger содержит несколько генов, кодирующих ферменты, которые способны гидролизовать акриламид. Более того, обнаружено, что некоторые из таких ферментов секретированы в культуральную жидкость, что облегчает их получение и извлечение. Более того, обнаружено, что некоторые из таких ферментов способны эффективно удалять акриламид из продуктов питания, в частности из продуктов питания, в которых акриламид образуется во время стадии термической обработки. В другом аспекте изобретение относится к новым идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, содержащим гены, кодирующие новые амидазы, которые, например, можно получить изAspergillus niger. Новые амидазы можно использовать в способе получения пищевых продуктов по настоящему изобретению, например при получении кофейного экстракта. Полинуклеотиды. Изобретение также относится к новым полинуклеотидам, кодирующим новые ферменты амидазы. Настоящее изобретение относится к новым полинуклеотидам, кодирующим амидазу, в рабочем порядке названным AMID01, AMID02, AMID03, AMID04, AMID05, AMID06, AMID07, AMID08, AMID09,AMID10 и AMID11 (далее в данном описании называемые AMID01-11), имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, соответственно состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32 и 33 (далее в данном описании называемых SEQ ID NO: 23-33) или функциональных эквивалентов любой из них. Последовательность генов, кодирующих AMID01-11, определяли секвенированием геномного клона, полученного из Aspergillus niger. Изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, содержащим ген, кодирующий амидазу AMID01-11, а также к его полной последовательности кДНК и его кодирующей последовательности. Соответственно изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 (далее в данном описании называемыхSEQ ID NO: 1-11), или выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21 или 22 (далее в данном описании называемых SEQ ID NO: 12-22), или функциональных эквивалентов любой из них. Конкретнее, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, способному к гибридизации предпочтительно в строгих условиях, предпочтительнее в весьма строгих условиях, с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранного из группы, состоящей изSEQ ID NO: 12-22. Преимущественно такие полинуклеотиды можно получить из мицелиальных грибов,в частности из Aspergillus niger. Конкретнее, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22. Изобретение также относится к изолированному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, или функциональных эквивалентов любой из них. Используемые в данном описании термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые можно выделить из хромосомной ДНК, включающим открытую рамку считывания, кодирующую белок, например аспарагиназу из A.niger. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, ген относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей определение, приведенное в данном описании. Молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такую как молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 111, или выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, или функциональных эквивалентов любой из них, можно выделить с использованием стандартных методов молекулярной биологии и сведений о последовательностях, приведенных в данном описании. Например, с использованием в качестве зонда для гибридизации всей или части нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно выделить с использованием стандартных методов гибридизации и клонирования (например, описанных в Sambrook J., Fritsh E.F. and Maniatis Т., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). Кроме того, молекулу нуклеиновой кислоты, включающую всю или часть нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, можно выделить полимеразой цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе сведений о последовательности, относящейся к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22.-8 014853 Нуклеиновую кислоту по изобретению можно амплифицировать с использованием кДНК, мРНК или, с другой стороны, геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олигонуклеотидных праймеров согласно стандартным методам ПЦР-амплификации. Амплифицированную таким образом нуклеиновую кислоту можно клонировать в соответствующий вектор и охарактеризовать анализом последовательности ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или способные к гибридизации с нуклеотидными последовательностями по изобретению, можно получить стандартными методами синтеза, например с использованием автоматизированного синтезатора ДНК. В предпочтительном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22. Последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, соответствует соответственно кодирующей области кДНК A.niger AMID01-11. Данная кДНК содержит последовательности, кодирующие соответственно полипептид A.niger AMID01-11, соответствующий SEQ ID NO: 23-33. В другом предпочтительном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO: 12-22, или функционального эквивалента любой из указанных нуклеотидных последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная другой нуклеотидной последовательности,представляет собой молекулу, которая достаточно комплементарна другой нуклеотидной последовательности, такой, которая может гибридизировать с другой нуклеотидной последовательностью, причем посредством этого образуется устойчивый дуплекс. Один аспект изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также молекулам нуклеиновой кислоты, достаточным для применения в качестве зондов для гибридизации для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению, и фрагментам таких молекул нуклеиновой кислоты, подходящим для применения в качестве праймеров ПЦР для амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты."Изолированный полинуклеотид" или "изолированная нуклеиновая кислота" представляют собой ДНК или РНК, которая не прилегает непосредственно к обеим кодирующим последовательностям, к которым она непосредственно прилегает (одна с 5'-конца и одна с 3'-конца) во встречающемся в природе геноме микроорганизма, от которого они происходят. Таким образом, в одном воплощении изолированная нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'-некодирующие (например, промоторные) последовательности, которые непосредственно прилегают к кодирующей последовательности. Поэтому термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующую плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариота или эукариота или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, полученного ПЦР или обработкой рестриктазой) независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего другой полипептид, который, по существу, свободен от клеточного вещества, вирусного вещества или культуральной среды (при получении методами рекомбинантных ДНК), или химические предшественники, или другие химические вещества(синтезированные химически). Кроме того, "изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе как фрагмент и его нельзя обнаружить в естественном состоянии. Предполагается, что используемые в данном описании термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК(например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновую кислоту можно синтезировать с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозин- или фосфоротиоатнуклеотидов). Такие олигонуклеотиды можно использовать, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют измененную способность к образованию пар оснований или повышенную устойчивость к нуклеазам. Другое воплощение изобретения относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой по меньшей мере для одной из молекул нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из AMID01-11, например ее кодирующей цепи. В объем изобретения также входят комплементарные цепи молекул нуклеиновой кислоты, описанные в данном описании. Ошибки секвенирования. Сведения о последовательностях, приведенные в данном описании, не следует так точно истолковывать, как требование включения ошибочно идентифицированных оснований. Конкретные последовательности, описанные в данном описании, можно легко использовать для выделения полного гена из мицелиальных грибов, в частности A.niger, который, в свою очередь, можно легко подвергнуть дальнейшему секвенированию, причем посредством этого идентифицируются ошибки секвенирования.-9 014853 Если не указано иное, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК в данном описании, определены с использованием автоматизированного секвенатора ДНК и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированных молекулами ДНК, определенными в данном описании, предсказаны трансляцией последовательности ДНК, определенной так, как указано выше. Следовательно, как известно в технике для любой последовательности ДНК, определенной с применением автоматизированных средств, любая нуклеотидная последовательность, определенная в данном случае, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные с применением автоматизированных средств, типично по меньшей мере примерно на 90%, типичнее от по меньшей мере примерно на 95% до по меньшей мере примерно на 99,9% идентичны фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическую последовательность можно точнее определить с применением других подходов, включая методы ручного секвенирования ДНК, хорошо известные в данной области техники. Как также известно в технике, отдельная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности, по сравнению с фактической последовательностью, может вызвать сдвиг рамки считывания при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодированная определенной нуклеотидной последовательностью, начиная с точки такой вставки или делеции, будет полностью отличаться от аминокислотной последовательности, действительно кодированной секвенированной молекулой ДНК. Специалист в данной области техники может установить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки. Фрагменты нуклеиновой кислоты, зонды и праймеры. Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать только часть или фрагмент нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, например фрагмент, который можно использовать в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий часть белка AMID01-11. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена AMID01-11 и кДНК, допускает получение зондов и праймеров, создаваемых для применения при идентификации и/или клонировании других членов семействаAMID01-11, а также гомологов AMID01-11 из других видов. Зонд/праймер типично содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид, который типично содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизирует, предпочтительно в строгих условиях, по меньшей мере примерно с 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20, предпочтительно примерно 22 или 25, предпочтительнее примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или большим числом последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, или функционального эквивалента любой из них. Зонды на основе нуклеотидных последовательностей AMID01-11 можно использовать для детекции транскриптов геномных последовательностей AMID01-11, кодирующих такие же или гомологичные белки, например, в других микроорганизмах. В предпочтительных воплощениях зонд также содержит присоединенную к нему группу-метку, например группу-метку, которая может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды также можно использовать как часть диагностического набора для идентификации клеток, которые экспрессируют белокAMID01-11. Идентичность и гомология. Термины "гомология" или "процент идентичности" в данном описании используются как взаимозаменяемые. Для цели данного изобретения определено, что для того, чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, можно включить бреши в последовательность в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислот или позициях нуклеотидов. Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в данной позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций)100). Предпочтительно обе последовательности имеют одну и ту же длину. Специалист в данной области техники будет осознавать тот факт, что несколько различных компьютерных программ доступны для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needelman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, который включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступны на http://www.gcg.com), с использованием или матрицы Blossom 62, или матрицы РАМ 250, и штрафом за брешь 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафом за уд- 10014853 линение бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту следует иметь в виду, что все такие различные параметры будут давать несколько различные результаты, но что общая процентная идентичность двух последовательностей существенно не изменяется с использованием различных алгоритмов. В еще одном воплощении процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в пакете программ GCG (доступны наhttp://www.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и штрафом за брешь 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафом за удлинение бреши 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении процентную идентичность двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989, включенного в программу ALIGN (версия 2.0) (доступна на http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess/cgi), с таблицы остатков массы РАМ 120, штраф за удлинение бреши 12 и штраф за удлинение бреши 4. Нуклеотидные и белковые последовательности по настоящему изобретению также можно использовать в качестве "последовательности запроса" для осуществления поиска относительно публичных баз данных в отношении, например, идентичности других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнить с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0), Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-10. Поиски нуклеотидов BLAST можно выполнить с помощью программы NBLAST, оценка = 100, длина слова = 12, и получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновой кислоты AMID01-11 по изобретению. Поиски белкаBLAST можно выполнить с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, и получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белка AMID01-11 по изобретению. Для того чтобы получить выравнивания с брешами для целей сравнения, можно использовать GappedBLAST, как описано в Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST. См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). Гибридизация. Используемый в данном описании термин "гибридизация" предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на примерно 50%, по меньшей мере на примерно 60%, по меньшей мере на примерно 70%, предпочтительнее по меньшей мере на примерно 80%, даже предпочтительнее по меньшей мере на примерно 85-90%, предпочтительнее по меньшей мере на примерно 95% гомологичные друг другу, типично остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительным неограничительным примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6 Х смеси хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) примерно при 45C с последующими одной или несколькими промывками в 1X SSC, 0,1% SDS при 50 С, предпочтительно при 55 С, предпочтительно при 60 С и даже предпочтительнее при 65 С. Очень строгие условия включают, например, гибридизацию при 68 С в 5 Х SSC/5 Х растворе Денхардта/1,0% SDS и промывку в 0,2 Х SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. С другой стороны, промывку можно осуществлять при 42 С. Специалисту в данной области техники будет известно, какие условия применить в случае строгих и очень строгих условий гибридизации. Другие указания, касающиеся таких условий, легко доступны в технике, например в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, N.Y. и в Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John WileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизирует только с поли-А-последовательностью (такой как 3'-концевой участок поли(А) мРНК) или с комплементарным участком остатков T (или U), не включается в полинуклеотид по изобретению, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такой полинуклеотид может гибридизировать с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли(А) или его комплемент (например, практически любой клон двухцепочечной кДНК). Получение полноразмерной ДНК из других организмов. При типичном подходе можно подвергать скринингу библиотеки кДНК, сконструированные из других микроорганизмов, например мицелиальных грибов, в частности, из вида Aspergillus. Например, штаммы Aspergillus можно подвергать скринингу на гомологичные полинуклеотидыAMID01-11 методом нозерн-блоттинга. После детекции транскриптов, гомологичных полинуклеотидам по изобретению, библиотеки кДНК можно конструировать из РНК, выделенной из соответствующего штамма, с использованием стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. С другой стороны, полную библиотеку геномных ДНК можно подвергать скринингу с использованием зонда, способного к гибридизации с полинуклеотидом AMID01-11 по изобретению. Гомологичные последовательности генов можно выделить, например, осуществляя ПЦР с использованием двух наборов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей, описанных в данном описании.- 11014853 Матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют последовательности новой нуклеотидной последовательности AMID01-11 или ее функционального эквивалента. Затем фрагмент ПЦР можно использовать для выделения клона полноразмерной кДНК различными известными способами. Например, амплифицированный фрагмент можно пометить и использовать для скрининга бактериофаговой или космидной библиотеки кДНК. С другой стороны, меченый фрагмент можно использовать для скрининга геномной библиотеки. Технологию ПЦР также можно использовать для выделения последовательностей полноразмерных кДНК из других микроорганизмов. Например, РНК можно выделить, следуя стандартным процедурам,из соответствующего источника клеток или ткани. Реакцию обратной транскрипции можно осуществить на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для наибольшего 5'-конца амплифицированного фрагмента для премирования синтеза первой цепи. Затем полученный гибрид РНК/ДНК можно "нарастить" ("tailed") (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции с терминальной трансферазой, гибрид можно расщепить РНКазой Н и затем можно начать синтез второй цепи с помощью затравки (например, поли-С-праймером). Таким образом, можно легко выделить последовательности кДНК в обратном направлении от амплифицированного фрагмента. Для общего представления о применимых стратегиях клонирования см., например,Sambrook et al., цит. выше; и Ausubel et al., цит. выше. Кодирует или нет гомологичный фрагмент ДНК функциональный белок AMID01-11 можно легко проверить способами, известными в технике. Векторы. Другой аспект изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам,содержащим нуклеотидную последовательность, описанную выше, кодирующую белок AMID01-11 или его функциональный эквивалент. Используемый в данном описании термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцеобразной петле двухцепочечной ДНК, в которую могут быть легированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть легированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируют в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и посредством этого реплицируют вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно соединены. Такие векторы в данном описании отнесены к "экспрессирующим векторам". Вообще,экспрессирующие векторы для применения в методах рекомбинантных ДНК часто находятся в форме плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" в данном описании можно использовать как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается,что изобретение включает также другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы(например, ретровирусы с нарушенной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы),которые служат эквивалентным функциям. Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению могут содержать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может, например, включать одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, используемых для экспрессии, которые оперативно соединены с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Вектор по изобретению предпочтительно содержит последовательность полинуклеотида по изобретению, оперативно соединенную с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанной последовательности полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине. Для рекомбинантного экспрессирующего вектора "оперативно соединенный" означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) способом, который допускает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипция/трансляция in vitro или в клетке-хозяине,когда вектор введен в клетку-хозяина). Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие регулирующие элементы экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; GeneExpression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факто- 12014853 ров, как выбор клетки-хозяина, которую трансформируют, желательный уровень экспрессии белка и т.д. Экспрессирующие векторы по изобретению можно вводить в клетки-хозяев для получения посредством этого белков или пептидов, кодированных нуклеиновыми кислотами, описанными в данном описании(например, белков AMID01-11, мутантных форм белков AMID01-11, их фрагментов, вариантов или функциональных эквивалентов и т.д.). Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению можно конструировать для экспрессии белков AMID01-11 в клетках прокариотов или эукариотов. Например, белки AMID01-11 можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как клетки Е.coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках, клетках грибов или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева также описаны в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods inEnzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). С другой стороны, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т 7 и Т 7-полимеразы. Экспрессирующие векторы, применимые в настоящем изобретении, включают векторы, имеющие хромосомное, эписомное и вирусное происхождение, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, мицелиальных грибов, дрожжевой эписомы, хромосомных элементов дрожжей,вирусов, таких как бакуловирусы, папиловирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц,вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные их сочетанием, такие как векторы, полученные из плазмиды и генетических элементов бактериофагов, такие как космиды и фагемиды. Вставка ДНК должна быть оперативно соединена с соответствующим промотором, таким как фаговый промотор лямбда-PL, Е.coli lac, промоторы trp и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR нескольких названий. Другие подходящие промоторы будут известны специалистам. В специфическом воплощении предпочтительными являются промоторы, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии аспарагиназ в мицелиальных грибах. Такие промоторы известны в технике. Экспрессирующие конструкции могут содержать сайты инициации транскрипции, терминации и в транскрибируемой области - сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет включать инициирующий трансляциюAUG в начале и терминирующий кодон соответственно, расположенный в конце транслируемого полипептида. Векторную ДНК можно ввести в прокариотные и эукариотные клетки обычными методами трансформации или трансфекции. Предполагается, что используемые в данном описании термины "трансформация" и "трансфекция" относятся к разнообразным известным в технике методам введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая копреципитацию фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекцию, опосредуемую DEAE-декстраном, трансдукцию, заражение, липофекцию, катионную липид-опосредованную трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook et al. (Molecular Cloning: AHarbor, NY, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и других лабораторных руководствах. В случае устойчивой трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от экспрессирующего вектора и используемого метода трансфекции только небольшую часть чужеродной ДНК можно интегрировать в их геном. Для того чтобы идентифицировать и выбрать указанные компоненты,как правило, в клетку-хозяина вместе с геном, представляющим интерес, вводят ген, который кодирует селективный маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительные селективные маркеры включают маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, можно ввести в клеткухозяина с тем же вектором, который кодирует белок AMID01-11, или можно ввести с отдельным вектором. Клетки, устойчиво трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать путем отбора на лекарственное средство (например, клетки, которые имеют введенный ген селективного маркера, будут выживать, в то время как другие клетки погибают). Экспрессию белков в прокариотах часто осуществляют в векторах Е.coli, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией белков. Как указывалось, экспрессирующие векторы будут предпочтительно содержать селективные маркеры. Такие маркеры включают устойчивость к дигидрофолатредуктазе или неомицину в случае эукариотной клеточной культуры и устойчивость к тетрациклину или ампициллину в случае культивирования Е.coli и других бактерий. Характерные примеры соответствующего хозяина включают бактериальные клетки, такие как клетки Е.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, таких как S2 дрозофилы и S19 совки; клетки животных, такие как СНО, COS и меланомы Bowes; и растительные клетки. Соответствующие среды и условия культивирования вышеописанных клеток-хозяев известны в технике.- 13014853 К числу векторов, предпочтительных для применения в бактериях, относятся pQE70, pQE60 иPQE-9, доступные от Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16A,pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. К числу предпочтительных эукариотических векторов относятся PWLNEO, pSV2CAT,pOG44, pZT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы будут явно очевидны для специалиста. К числу известных бактериальных промоторов для применения в настоящем изобретении относятся промоторы lacl и lacZ Е.coli, промоторы Т 3 и Т 7, промотор gpt, промоторы лямбда-PR, PL и промоторtrp, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR,таких как LTR вируса саркомы Рауса ("RSV"), и металлотионеиновые промоторы, такие как промотор мышиного металлотионеина-1. Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, высшими эукариотами можно усилить встраиванием в вектор энхансерной последовательности. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, как правило примерно от 10 до 300 п.о., которые действуют,усиливая транскрипционную активность промотора в клетке-хозяине данного типа. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который располагается на поздней стороне ориджина репликации в п.о. 100270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации и аденовирусные энхансеры. Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду в экспрессируемый полипептид можно ввести соответствующий сигнал секреции. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут являться гетерологичными сигналами. Полипептид можно экспрессировать в модифицированной форме и можно включать не только сигналы секреции, но также другие гетерологичные функциональные области. Так, например, область других аминокислот, в частности заряженных аминокислот, можно присоединить к N-концу полипептида для улучшения устойчивости и персистенции в клетке-хозяине во время очистки или во время последующей работы и хранения. Также к полипептиду можно присоединить пептидные группы для облегчения очистки. Полипептиды по изобретению. Изобретение относится к изолированному полипептиду с аминокислотной последовательностью,выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей согласно SEQ ID NO: 23-33,аминокислотной последовательности, которую можно получить экспрессией соответственно полинуклеотида SEQ ID NO: 1-11 в соответствующем хозяине или получить экспрессией соответственно полинуклеотида SEQ ID NO: 12-22 в соответствующем хозяине. Также пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент вышеуказанных полипептидов, является составной частью настоящего изобретения. Все вышеуказанные полипептиды охватываются термином "полипептиды по изобретению". Термины "пептид" и "олигопептид" считаются синонимами (как общепринято), и каждый термин можно использовать как взаимозаменяемый, когда в контексте требуется указать цепь по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово "полипептид" используется в данном описании в случае цепей, содержащих больше семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов в данном описании пишутся слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксиконцу. Однобуквенный код аминокислот, используемый в данном описании, широко известен в технике, и его можно найти в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989). Под "изолированным" полипептидом или белком предполагается полипептид или белок, удаленный из его естественного окружения. Например, рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются изолированными для цели изобретения, так как являются нативными или рекомбинантными полипептидами, которые, по существу, очищены любым подходящим методом, таким как, например, метод одностадийной очистки, описанный в Smith and Johnson, Gene, 67: 31-40 (1988). Амидазу AMID01-11 по изобретению можно извлечь и очистить из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе,гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно использовать для очистки высокоэффективную жидкостную хроматографию ("ВЭЖХ"). Полипептиды по настоящему изобретению включают очищенные продукты природного происхождения, продукты процедур химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотного или эукариотного хозяина, включая, например, бактериальные, дрожжевые клетки, клетки высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, использованного в рекомбинантной процедуре получения, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозили- 14014853 рованными или могут быть негликозилированными. Кроме того, полипептиды по изобретению в некоторых случаях также могут включать начальный модифицированный метиониновый остаток в результате процессов, опосредуемых хозяином. Фрагменты белков. Изобретение также относится к биологически активным фрагментам полипептидов по изобретению. Биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или образованные от аминокислотной последовательности белка AMID01-11 (например, аминокислотной последовательности, соответственно выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:23-33), которые включают меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, и обнаруживают по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего полноразмерного белка. Типично биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка AMID01-11. Биологически активный фрагмент белка по изобретению может представлять собой полипептид,который, например, имеет 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот в длину. Кроме того, можно получить рекомбинантными методами другие биологически активные белки, в которых делетированы другие области, и они эквивалентны одной или нескольким биологическим активностям нативной формы полипептида по изобретению. Изобретение также относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которые кодируют вышеуказанные биологически активные фрагменты белка AMID01-11. Функциональные эквиваленты. Термины "функциональные эквиваленты" и "функциональные варианты" используются в данном описании как взаимозаменяемые. Функциональные эквиваленты ДНК AMID01-11 представляют собой фрагменты ДНК, кодирующие полипептид, который обнаруживает отдельную функцию амидазыAMID01-11 по изобретению представляет собой полипептид, который обнаруживает отдельную функцию амидазы AMID01-11 A.niger, определенной в данном описании. Его функциональные эквиваленты также включают биологически активные фрагменты. Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, или замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Соответственно несущественной аминокислотой является остаток, который можно заменить в аминокислоте, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO: 23-33, без существенного изменения биологической функции. Например, предсказывают аминокислотные остатки, которые являются консервативными в белках AMID01-11 по настоящему изобретению, особенно не поддающиеся изменению. Более того, аминокислотные остатки, консервативные в белках AMID01-11 по настоящему изобретению и других амидазах, вероятно, не подлежат изменению. Термин "консервативная замена" предназначен для обозначения замены, при которой аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток со схожей боковой цепью. Такие семейства известны в технике и включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагины, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин, триптофан), боковыми бета-ответвлениями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот типично могут содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологической функции кодированного полипептида. Соответственно изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белки AMID01-11, содержащим изменения в аминокислотных остатках, которые несущественны для определенной биологической активности. Такие белки AMID01-11 различаются в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, все еще сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где белок содержит, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, показанной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33. Например, руководство, касающееся того, как осуществить фенотипически молчащие аминокислотные замены, приводится в Bowie J.U. et al., Science, 247: 1306-1310 (1990), где авторы указывают, что существует два основных подхода для исследования толерантности аминокислотной последовательности к замене. Первый способ основан на процессе эволюции, при котором мутации или принимаются, или отторгаются естественным отбором. Во втором подходе используют генную инженерию для внедрения аминокислотных замен в определенные позиции клонированного гена и отбор или скрининг для идентификации последовательностей, которые сохраняют функциональность. Как утверждают авторы, такие- 15014853 исследования показывают, что белки являются неожиданно толерантными в отношении замен аминокислот. Авторы также показывают, что, вероятно, замены разрешаются в определенной позиции белка. Например, наиболее погруженные аминокислотные остатки требуют неполярные боковые цепи, в то время как некоторые особенности поверхностных боковых цепей, как правило, имеют консервативный характер. Другие такие фенотипически молчащие замены описаны в Bowie et al., цит. выше, и ссылках, цитированных в указанной работе. Изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AMID01-11, гомологичный белку, соответствующему любому белку, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, можно создать введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в кодирующие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, таких, что одна или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок вводятся в кодированный белок. Такие мутации можно вводить стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Термин "функциональные эквиваленты" также охватывает ортологи белка AMID01-11 A.niger. Ортологи белка AMID01-11 A.niger представляют собой белки, которые можно выделить из других штаммов или видов и которые обладают подобной или идентичной биологической активностью. Такие ортологи можно легко идентифицировать как содержащие аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO: 23-33. Как определено в данном описании, термин "по существу, гомологичная" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислот или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например, с подобными боковыми цепями) второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, содержащие общий домен, имеющие примерно 40%, предпочтительно 65%, предпочтительнее 70%, еще предпочтительнее 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или более, в данном описании определяются как, по существу, идентичные. Также нуклеиновые кислоты, кодирующие членов семейства AMID01-11, которые, таким образом,имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11,или группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, входят в объем изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки AMID01-11 из различных видов, которые, таким образом, имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, входят в объем изобретения. Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологам ДНК AMID01-11 по изобретению, можно выделить на основе их гомологии с нуклеиновыми кислотами AMID01-11, раскрытыми в данном описании, с использованием кДНК, раскрытых в данном описании, или их подходящих фрагментов в качестве зонда гибридизации согласно стандартным методам гибридизации, предпочтительно в очень строгих условиях гибридизации. Кроме встречающихся в природе аллельных вариантов последовательности AMID01-11, специалисту будет известно, что мутацией можно ввести замены в нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, что приводит к заменам в аминокислотной последовательности белка AMID01-11, по существу, без изменения функции белка AMID01-11. В другом аспекте изобретение относится к улучшенным белкам AMID01-11. Улучшенные белкиAMID01-11 представляют собой белки, в которых по меньшей мере одна биологическая активность улучшена. Такие белки можно получить произвольным введением мутаций во всю колирующую последовательность AMID01-11 или ее часть, например насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты можно рекомбинантно экспрессировать и скринировать на биологическую активность. Например, в технике имеются стандартные анализы для измерения ферментативной активности амидаз, и таким образом можно легко отобрать улучшенные белки. В предпочтительном воплощении белок AMID01-11 имеет аминокислотную последовательность,соответствующую SEQ ID NO: 3. В другом воплощении полипептид AMID01-11, по существу, гомологичен аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, хотя отличается по аминокислотной последовательности из-за природной вариации или мутагенеза, описанных выше. В другом предпочтительном воплощении белок AMID01-11 имеет аминокислотную последовательность, кодированную фрагментом выделенной нуклеиновой кислоты, способным к гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной соответственно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-22, предпочтительно в очень строгих условиях гибридизации.- 16014853 Соответственно белок AMID01-11 представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, выбранной соответственно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-33, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида, выбранного из группы, состоящей изSEQ ID NO: 23-33. Функциональные эквиваленты белка по изобретению также можно идентифицировать, например,скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например укороченных мутантов, белка по изобретению на аспарагиназную активность. В одном воплощении смешанную библиотеку вариантов получают комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновой кислоты. Смешанную библиотеку вариантов можно получить, например, ферментативным легированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов, так что вырожденный набор потенциальных последовательностей белка можно экспрессировать в виде отдельных полипептидов. Существует множество способов, которые можно использовать для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов по изобретению из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в технике (см., например, Narang (1983), Tetrahedron, 39: 3; Itakura et al. (1984), Annu. Rev. Biochem.,53: 323; Itakura et al. (1984), Science, 198: 1056; Ike et al. (1983), Nucleic Acid Res., 11: 477). Кроме того, можно использовать библиотеки фрагментов кодирующей последовательности полипептида по изобретению для получения мозаичной популяции полипептидов для скрининга и последующего отбора вариантов. Например, библиотеку фрагментов кодирующей последовательности можно получить обработкой двухцепочечного фрагмента ПЦР кодирующей последовательности, представляющей интерес, нуклеазой в условиях, в которых однонитевой разрыв имеет место только примерно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией ДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которая может включать смысловые/антисмысловые пары из различных продуктов разрыва,удалением одноцепочечных частей из реформированных дуплексов обработкой нуклеазой S1 и легированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. Таким способом можно получить экспрессирующую библиотеку, которая кодирует различные размеры N-концевые и внутренние фрагменты белка, представляющего интерес. В технике известны некоторые методы скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек,полученных точечными мутациями отсечения, и скрининга библиотек кДНК на генные продукты с выбранным свойством. Наиболее широко используемые методы скрининга больших библиотек генов, которые соответствуют высокопроизводительному анализу, включают клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию соответствующих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых детекция нужной активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого детектирован. В сочетании со скрининг-анализами для идентификации вариантов белка по изобретению можно использовать рекурсивный множественный мутагенез (Recursive ensemble mutagenesis, REM) - метод, который усиливает частоту появления функциональных мутантов в библиотеках (Arkin and Yourvan (1992), Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993), Protein Engineering, 6(3): 327-331). Кроме последовательности гена AMID01-11, соответственно представленной в SEQ ID NO: 1-11,для специалиста в данной области техники будет очевидно, что в данной популяции могут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, которые могут привести к изменениям в аминокислотной последовательности белка AMID01-11. Такие геномные полиморфизмы могут существовать в клетках из различных популяций или внутри популяции из-за природной аллельной вариации. Аллельные варианты также могут включать функциональные эквиваленты. Фрагменты полинуклеотида по изобретению также могут содержать полинуклеотиды, некодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать как зонды или праймеры для ПЦР-реакции. Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, можно использовать в качестве зондов гибридизации или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые не кодируют полипептид с активностью AMID01-11, включают, среди прочего, (1) выделение гена, кодирующего белок AMID01-11, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК,например, из иных, чем A.niger, организмов; (2) гибридизацию in situ (например, FISH) с метафазными хромосомными пластинками для получения точного местоположения в хромосоме гена AMID01-11, как описано в Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988); (3) нозерн блотт-анализ для детекции экспрессии мРНК AMID01-11 в определенных тканях и/или клетках и (4) зонды и праймеры, которые можно использовать в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой кислоты, поддающейся гибридизации с зондом AMID01-11 в данном биологическом образце (например, ткани).- 17014853 Изобретение также охватывает способ получения функционального эквивалента гена или кДНКAMID01-11. Такой способ влечет за собой получение меченого зонда, который включает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую всю последовательность, выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO: 23-33, или ее часть, или ее вариант; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты меченым зондом в условиях, которые допускают гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, причем посредством этого образуются дуплексы нуклеиновой кислоты, и получение полноразмерной последовательности гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в любом меченом дуплексе с получением гена, родственного гену AMID01-11. В одном воплощении нуклеиновая кислота AMID01-11 по изобретению по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-11, или из группы, состоящей изSEQ ID NO: 12-22, или комплемента любой из них. В другом предпочтительном воплощении полипептид AMID01-11 по изобретению по меньшей мере на 40, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, показанной в последовательности пептида, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO: 23-33. Клетки-хозяева. В другом воплощении изобретение относится к клеткам, например трансформированным клеткамхозяевам или рекомбинантным клеткам-хозяевам, которые содержат нуклеиновую кислоту по изобретению. "Трансформированная клетка" или "рекомбинантная клетка" представляет собой клетку, в которую(или в предшественника которой) методами рекомбинантных ДНК введена нуклеиновая кислота по изобретению. Включены как прокариотические, так и эукариотические клетки, например, бактерий, грибов,дрожжей и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частностиAspergillus niger. Можно выбрать клетку-хозяина, которая модулирует экспрессию представляющих интерес последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена специфичным желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут облегчить оптимальное функционирование белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов генов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, известные специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии,можно выбрать для того, чтобы гарантировать желательную и правильную модификацию и процессинг чужеродного экспрессируемого белка. С этой целью можно использовать эукариотические клеткихозяева, которые обладают клеточным механизмом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева хорошо известны в технике. Клетки-хозяева также включают клеточные линии млекопитающих, такие как СНО, VERO, BHK,HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, WI38 и другие, и клеточные линии сосудистого сплетения. При необходимости полипептиды по изобретению можно получить с помощью устойчиво трансфицированной клеточной линии. Ряд векторов, подходящих для устойчивой трансфекции клеток млекопитающих, широко доступен, способы конструирования таких клеточных линий также широко известны,например, из Ausubel et al. (цит. выше). В другом аспекте изобретение относится к пищевым продуктам, которые можно получить способом по изобретению, описанным в данном описании ранее, или с применением новой аспарагиназы, описанной в данном описании, для получения пищевых продуктов. Такие пищевые продукты характеризуются существенно пониженными уровнями акриламида по сравнению с пищевыми продуктами, полученными способами получения, которые не включают добавление одного или нескольких ферментов в количестве,которое эффективно для снижения уровня аминокислот, которые участвуют в образовании акриламида во время стадии термической обработки. Способ по изобретению можно использовать для достижения уменьшения содержания акриламида в полученном пищевом продукте предпочтительно более чем на 50%, предпочтительнее более чем на 75%, даже предпочтительнее более чем на 80% и наиболее предпочтительно более чем на 90% по сравнению с пищевым продуктом, полученным обычным способом. Пример 1. Клонирование ферментов амидаз. Используют два типа конструкций. Первый тип содержит "стандартный" селективный маркерamdS, который допускает прямую селекцию трансформированных штаммов на селективном субстрате ацетамиде. Это вполне подходит для секретируемых амидаз, но в случае внутриклеточных ферментов такой тип имеет такой недостаток, что будет иметься фоновая активность маркерной ацетамидазы. Поэтому для ряда амидаз, которые, как предполагается, являются внутриклеточными, применяют второй тип конструкции с использованием безмаркерной конструкции, вводимой котрансформацией со вторым вектором, содержащим маркер устойчивости к флеомицину.- 18014853 Выделение генов. 1. Пустая кассета как фон/отрицательный контроль. 2. Ацетамидаза amdS A niger (SEQ ID NO: 11). 3. Ацетамидаза amdS E.nidulans. 4. Новые амидазы, см. табл. 1. Таблица 1 Новые амидазы по изобретению из Aspergillus niger ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности указанных генов приводятся в перечне последовательностей в конце данного документа и обозначаются, как указано выше. Олигонуклеотидные праймеры создают для амплификации гена, кодирующего ген, представляющий интерес, из генома A.niger CBS513.88. Как указано ранее, праймеры, подходящие для поиска генов по изобретению, можно получить так, как известно специалисту в данной области техники. Табл. 2 показывает нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые используют для амплификации некоторых генов амидаз по изобретению. Таблица 2 Последовательности праймеров Структура указанных олигонуклеотидных праймеров схожа для всех генов, которые амплифицировали. В 5'-конце верхнего праймера располагается сайт рестрикции Pacl для облегчения процедуры клонирования. В середине к стартовому кодону добавляют линкер. Конец 3' верхнего праймера комплементарен 5'-концу гена, представляющего интерес, включая стартовый кодон ATG. Структура всех верхних праймеров 5'-CCCTTAATTAACTCATAGGCATCATG-ген-специфическая последовательность-3', где стартовый кодон ATG подчеркнут. В 5'-конце нижнего праймера располагается сайт рестрикции Ascl для облегчения процедуры клонирования. Конец 3' нижнего праймера комплементарен перевернутой последовательности 3'-конца гена,представляющего интерес, находящейся приблизительно на 100 пар оснований по ходу транскрипции от стоп-кодона. Структура всех нижних праймеров 5'-TTAGGCGCGCC-ген-специфическая последовательность-3'. Длина ген-специфической последовательности в праймерах составляет 20-25 нуклеотидов, в зависимости от содержания GC комплементарной части праймера. Геномную ДНК выделяют из CBS513.88 A.niger согласно стандартной процедуре и используют в реакции ПЦР как с верхними, так и с нижними праймерами для амплификации гена, кодирующего амидазу, представляющую интерес. Специалисту в данной области техники будет известно, как оптимизировать условия ПЦР для каждого сочетания гена и праймера. Фрагменты ПЦР клонируют в вектор pCR2.1 (Invitrogen) и амплифицируют в E.coli. После расщепления плазмиды Pacl и Ascl гены амидазы субклонируют в экспрессирующем векторе Aspergillus. Для генов ZDK и ZDN процедура отличается. Указанные гены выделяют из библиотеки кДНКAspergillus niger, конструируют согласно методам, описанным в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbour Press, 1989". После высокопроизводительного секвенирования 20000 клонов идентифицировали указанные гены как гомологи амидазы и отобрали их для экспрессии в A.niger снова субклонированием в один из экспрессирующих векторов, описанных далее.- 19014853 В случаях, когда используют селективный маркер amdS, экспрессирующим вектором являетсяpGBFIN5 (WO 9932617). Экспрессирующий вектор также расщепляют Pacl и Ascl. Правильную ориентацию вставки в полученных плазмидах проверяют расщеплением подходящими рестриктазами и анализом последовательностей встроенного гена. Такая процедура клонирования размещает ген амидазы в прямом направлении промотора glaA Aspergillus niger и обратном направлении терминатора glaA. Кроме того, в плазмиде присутствует ген amdS Aspergillus nidulans для удобного отбора в A.niger (WO 9846772). Структура таких экспрессирующих плазмид отображена на фиг. 1. В случаях, когда используют маркер отбора по флеомицину, экспрессирующим вектором являетсяpGBFINGFP-2 (фиг. 2). Экспрессирующий вектор также расщепляют Pacl и Ascl. Правильную ориентацию вставки в полученных плазмидах проверяют расщеплением подходящими рестриктазами и анализом последовательностей встроенного гена. Такая процедура клонирования заменяет ген GFP в вектореpGBFINGFP-2 на ген, представляющий интерес, и размещает ген амидазы в прямом направлении промотора glaA Aspergillus niger и обратном направлении терминатора glaA, что приводит к pGBFINAAA-1(фиг. 3). Кроме того, в данной плазмиде присутствует ген устойчивости к флеомицину для удобного отбора в A.niger. Сверхэкспрессия в Aspergillus niger.CBS513.88 A.niger используют в качестве хозяина для сверхэкспрессии гена аспартатпротеазы. Поэтому экспрессирующие векторы трансформируют в указанный гриб. Процедура трансформации подробно описана в WO 9846772. Там также описано, как отбирать трансформанты и направленные многокопийные компоненты. Предпочтительно для получения материала образца отбирают трансформантыA.niger, содержащие множество копий экспрессирующей кассеты. Штаммы A.niger, содержащие множество копий экспрессирующей кассеты, используют для получения материала образца культивированием штаммов в культурах в колбах при встряхивании. Применимый способ культивирования штаммов A.niger и отделения мицелия от культуральной жидкости описан в WO 9846772. Затем культуральную жидкость используют для очистки амидазы и измерения амидазной активности. Пример 2. Ферментация Aspergillus niger и получение экстрактов культур. Ферменты амидазы получают выращиванием трансформированных штаммов А.niger следующим способом. Свежие споры (106-107) штаммов A.niger инокулируют в 20 мл среды CSL (100-мл колба, мешалка) и выращивают в течение 20-24 ч при 34 С и 170 об/мин. После инокуляции 5-10 мл CSL предварительно культивируют в 100 мл среды, содержащей 150 г/л мальтозы, 60 г/л bacto soytone, 1 г/л NaH2PO4, 15 г/л(NH4)2SO4, 1 г/л MgSO44H2O, 0,08 г/л твина-80, 0,02 г/л базидона, 20 г/л морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES), 1 г/л L-аргинина, в 500-миллилитровых колбах, встряхиваемых для перемешивания, при 30 С и 250 об/мин в течение 5 суток. Биомассу собирают центрифугированием в 50-миллилитровые пробирки Грейнера (30 мин,5000 об/мин, 4 С). Все последующие стадии осуществляют на льду. Для выделения и определения внутриклеточных ферментов получают бесклеточные экстракты, измельчая биомассу в осевшей фракции до порошка в жидком азоте. Для выделения и определения секретированных ферментов получают бесклеточные супернатанты сначала фильтрацией через стекломикроволоконный фильтр GF/A Whatman(150 мм AE) для удаления более крупных частиц и затем доведением величины pH до 5 4 н. KOH (при необходимости) и стерильной фильтрацией через фильтр 0,2 мкм (насадка на флакон) с отсосом для удаления грибного материала. Супернатантные фракции хранят при 4 С (или -20 С). Пример 3. Детекция амидазной активности методом ЯМР. Порошок клеточного экстракта (полученный так, как описано выше) сушат вымораживанием и снова растворяют в забуференной фосфатом D2O (pD=7,0) в концентрации 50 мг/мл. После центрифугирования супернатант смешивают (1:1, об./об.) с амидазным субстратом (10 мг/мл в D2O) и инкубируют при 37C. По прошествии достаточного времени инкубации (см. примеры далее) инкубированные смеси центрифугируют (конечная концентрация 5 мг/мл субстрата и 25 мг/мл экстракта). Измерение ацетамидазной активности осуществляют методом ядерного магнитного резонанса так, как описано в рекомендациях изготовителя. Спектры 1 Н ЯМР регистрируют на приборе Bruker DRX-600, работающем при частоте для протонов 600 МГц при температуре зонда 300 К (27 С). Используют 5-миллиметровый зонд тройного резонанса с градиентами самоэкранирования. Получают спектры 1 Н ЯМР стандартных соединений для того, чтобы показать, что все включенные соединения имеют уникальные сигналы ЯМР, на основании которых их можно идентифицировать и определить количественно (не показано). Для того чтобы получить спектры каждого стандартного соответствующего соединения, получают исходный раствор каждого соединения в D2O (Cambridge Isotope Laboratories). Исходные растворы получают в концентрациях 10 мг/мл, взвешивая субстрат стандартного соединения и добавляя D2O. Из полученных исходных растворов 500 мкл смешивают с 500 мкл 0,5 М фосфатного буфера, pH 6,96 (KH2PO4/K2HPO4). Затем получают спектры 1H ЯМР каждого соединения, т.е. акриламида, акриловой кислоты, ацетамида, уксусной кислоты, пропионамида и пропионовой кислоты, при 600 МГц в D2O при 27 С (конечная концентрация 5 мг/мл субстрата или стандартного соединения в D2O). Идентифицируют для каждого соединения уни- 20014853 кальные химические сдвиги, которые не перекрываются другими сигналами, вызванными другими соединениями. Кроме того, контролируют чистоту каждого стандарта и подтверждают отсутствие возможных загрязнений. Соединения имеют характеристические сигналы, указанные далее. Акриламид (каталожный номер 8.00830, партия 4202056, Merck NJ, USA): 5,82 (дд, Hb, J=10,3 Гц,1,2 Гц), 6,22 (дд, Hc, J=17,2 Гц, 1,2 Гц), 6,28 (д, Ha, J=10,3 Гц), 6,31 (д, Ha, J=10,3 Гц): м.д. Акриловая кислота (каталожный номер 14723-0, партия S17163-034, Aldrich, WI, USA): 5,65 (дд, Hb,J=10,4 Гц, 1,6 Гц), 6,01 (дд, Hc, J=17,4 Гц, 1,6 Гц), 6,11 (д, СН 2=CH, 3J=10,3 Гц), 6,14 (д, СН 2=CH,3J=10,3 Гц). Ацетамид (каталожный номер 12263-7, партия 16813 ВА-453, Aldrich, WI USA): 1,99 (с, CH3): м.д. Уксусная кислота (каталожный номер 1.00063, партия K31668363, Merck NJ, USA): 1,90 (с, CH3): м.д. Пропионамид (каталожный номер 14393-6, партия 25009JB-413, Aldrich, WI, USA): 1,10 (т, CH3),2,27 (к, CH2): м.д. Пропионовая кислота (каталожный номер Р-1386, партия 083 K3404, Sigma, St Louis, Mo, USA): 1,09 (т, CH3), 2,37 (к, CH2): м.д. Пример 4. Детекция амидазной активности колориметрическим определением. Определение активности выполняют согласно Skouloubris et al. [Mol. Microbiol., 40: 596-609, 2001]. Реакция протекает в буферном растворе (РЕВ), содержащем 1 мМ фосфата (pH 7,4) и 10 мМ ЭДТА. Получают 100-мМ раствор амидного субстрата в РЕВ. Смешивают 200 мл полученного раствора субстрата с 50 мл клеточного экстракта и смесь инкубируют в течение 30 мин при 30-37 С. Активность фермента оценивают количественно, определяя количество выделившегося аммиака. Для этой цели добавляют 400 мл фенолнитропруссида и 400 мл щелочного гипохлорита и смесь инкубируют еще в течение 6-10 мин при 50-55 С. Поглощение измеряют при 625 нм и количество образовавшегося аммиака вычисляют из калибровочной кривой с использованием 0-25 мл 5-мМ раствора (NH4)2SO4, доведенного до 50 мл РЕВ. Одну единицу амидазы определяют как количество фермента, требуемое для гидролиза 1 мкмоль амида/мин/мг общего белка. Обнаружено, что на результаты колориметрического анализа влияет количество клеточного экстракта, используемое при инкубации. Если добавляют возрастающие количества экстракта A.niger до наивысшей концентрации на калибровочной кривой (25 мл 5 мМ (NH4)2SO4), поглощение света уменьшается от 0,44 до 0 (фиг. 4). Следовательно, калибровочные кривые необходимо получать в присутствии соответствующего количества клеточного экстракта. Более того, обнаружено, что может влиять природа клеточного экстракта. Если калибровочные кривые получают или с 20 мл экстракта A.niger, или 20 мл экстракта K.lactis,первая линия имеет существенно меньший угол наклона (фиг. 5). Пример 5. Амидаза от Sigma. Амидазу из Pseudomonas aeruginosa закупают у Sigma (St. Louis, МО, USA, фермент продуцирован в Е.coli,каталожный номер А-6691). Для того чтобы определить активность фермента в отношении различных амидных субстратов в высококонцентрированной форме, 10 мкл раствора фермента (содержащего 0,47 мг белка) смешивают с 500 мкл фосфатного буфера в D2O (0,5 М, pD=6,96) и затем добавляют 500 мкл раствора амидного субстрата (10 мг/мл в D2O). Конечная концентрация амидных субстратов составляет 5 мг/мл, что соответствует 70 мМ для акриламида, 85 мМ для ацетамида и 68 мМ для пропионамида. Осуществляют дополнительные инкубации со 100- и 1000-кратными разведениями фермента. После получения точки для образца для t=0 реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в случае инкубации с концентрированным ферментом и при 37 С в случае инкубации с разведенным ферментом. Табл. 3 показывает процент конверсии амидных субстратов в указанные моменты времени. Результаты показывают, что фермент из P.aeruginosa способен гидролизовать все три субстрата, но что активность в отношении акриламида является значительно меньшей, чем в отношении двух других субстратов. Результаты для акриламида наводят на мысль, что начальная скорость конверсии достаточно высокая, но через некоторое время конверсия прекращается. Пример 6. Детекция и частичная очистка внеклеточных амидаз Aspergillus niger. Внеклеточные амидазы ZDK и ZDO выделяют в частично очищенном виде хроматографией в несколько стадий из супернатанта, полученного так, как описано ранее. Супернатант сначала концентрируют в 5-7 раз ультрафильтрацией с использованием мембраныBiomax-10 и доводят pH до величины буфера на первой стадии хроматографии. После каждой стадии хроматографии собранные фракции (включая несвязанную фракцию сквозного потока) анализируют на наличие нужного белка методом электрофореза ДДС-Na-ПААГ (DS-PAGE), фракции, содержащие нужный белок, собирают и снова концентрируют ультрафильтрацией и их pH доводят до pH на последующей стадии хроматографии. Сначала колонки уравновешивают 5 объемами от объема колонки определенных буферов. Затем в колонку загружают образец и колонку промывают еще 3 объемами от объема колонки буфера для уравновешивания. Затем образцы элюируют из колонки с градиентом NaCl, переходя от буфера для уравновешивания к той же буферной системе с добавленным к ней 1 М NaCl в количестве 20 объемов колонки. Таблица 4 Все стадии хроматографии Стадия 3 в случае очистки ZDK исключается. Согласно анализу методом SDS-PAGE ZDK в конечном препарате имеет чистоту примерно 90%, в то время как подобный препарат амидазы ZDO показывает несколько дополнительных полос белка(фиг. 6). Общая концентрация белка в обоих образцах составляет примерно 0,5 мг/мл. Пример 7. Определение внутриклеточных амидаз Aspergillus niger в бесклеточном экстракте. Бесклеточные экстракты получают так, как описано ранее. Такие экстракты используют для определения активности внутриклеточных амидаз, экспрессированных в A.niger, методом ЯМР, описанным в примере 3. Сначала контролируют условия анализа с использованием известных амидаз amdS из Е.nidulans и гомологов из A.niger (SEQ ID NO: 11).- 22014853 Таблица 6 Проценты конверсии амидных субстратов после 4-суточной инкубации Ясно, что холостой штамм-хозяин показывает очень низкие исходные активности на всех субстратах. Также ясно, что акриламид для указанных ферментов является более бедным субстратом, чем два других амида, и что трансформант, экспрессирующий amdS A.niger, обладает значительно большей активностью, чем трансформанты, экспрессирующие фермент Е.nidulans. Таблица 7 Проценты конверсии амидных субстратов после 4-суточной инкубации Ясно, что абсолютные активности указанных трансформантов значительно меньшие, чем трансформантов в табл. 6. Однако это может иметь место из-за неоптимизированных генных конструкций,используемых для получения экспериментальных ферментов. Но также ясно, что относительная активность указанных ферментов в отношении акриламида по сравнению с ацетамидом и пропионамидом значительно большая, чем для известных ферментов amdS. Пример 8. Определение амидаз Aspergillus niger в культуральном супернатанте. Активность препаратов секретированных амидаз, которые также используют для анализаSDS-PAGE в примере 6, определяют колориметрическим методом. Таблица 8 Высвобождение NH3 секретированными амидазами из амидных субстратов при pH 7,5 Можно видеть, что амидаза ZDO оказывает предпочтение пропионамиду как субстрату. Относительная активность в отношении акриламида сравнима с активностью амидаз amdS. Явное отсутствие активности в случае фермента ZDK вынуждает контролировать оптимальный pH для указанных ферментов с пропионамидом как субстратом с использованием следующих буферных систем (концентрация 100 мМ): цитрат Na для pH 3,0-5,5; фосфат Na для рН 6,0-7,0; трис-HCl для рН 7,58,9. Результаты приводятся на фиг. 7 и 8. Ясно, что неудача в выявлении активности ZDK при рН 7,5 имеет место из-за узкого оптимума рН данного фермента в кислой среде. Напротив, ZDO показывает широкий и биполярный оптимум. Это можно соотнести с наличием двух различных белков в препаратах ZDO. Активность ферментов в отношении различных субстратов проверяют при оптимальной величине рН (определенной с пропионамидом в качестве субстрата). Результаты приводятся в табл. 9. Таблица 9 Величины оптической плотности при анализе NH3 при оптимальном рН Оба фермента из числа испытываемых субстратов предпочитают пропионамид. Однако в случаеZDO следует помнить, что такое предпочтение определено только при одном из двух оптимумов рН. Если биполярное соотношение рН-активность в самом деле имеет место из-за присутствия двух различных ферментов или двух форм одного и того же фермента, предпочтение субстрата при другом оптимуме может быть иным.- 23014853 Из величин OD можно оценить специфическую активность с использованием калибровочной кривой для NH3 и установленного содержания белка. Для ZDK и ZDO вычислены специфические активности 0,7 и 0,2 ммольмин-1 мг-1 соответственно. Пример 9. Амидазы в Aspergillus niger и других микроорганизмах. Известную последовательность таких новых амидаз используют в качестве зонда для поиска других амидаз в геномах других микроорганизмов. Ряд других гомологичных ферментов идентифицирован в грибах и бактериях. Пример 10. Определение акриламида в образцах пищевых продуктов. Предварительная обработка образцов. Высушенный и гомогенизированный образец (600 мг) экстрагируют с использованием 5 мл воды милли-Q. К экстракту добавляют 1 мкг внутреннего стандарта акриламида 13 С 3 в растворе (CIL). После 10-минутного центрифугирования (6000 об/мин) в колонку Extreluut-3 ВТ (Merck) вносят 3 мл верхнего слоя. С использованием 15 мл этилацетата акриламид элюируют из колонки. Этилацетат выпаривают в слабом потоке азота для уменьшения объема до приблизительно 0,5 мл. Условия хроматографии. Раствор этилацетата анализируют с использованием газовой хроматографии. Разделение получают с использованием колонки CP-Wax 57 (Varian) (длина 25 м, внутренний диаметр 0,32 мм, пленка 1,2 мкм) и гелия в качестве газа-носителя с постоянной скоростью потока 5,4 мл/мин. Осуществляют безразрывное впрыскивание 3 мкл. Поддерживают температуру печи 50 С в течение 1 мин, после чего температуру повышают со скоростью 30 С/мин до 220 С. После 12-минутной выдержки при постоянной температуре(220 С) печь охлаждают и стабилизируют перед следующим впрыскиванием. Детекцию выполняют с использованием подключенной масс-спектрометрии с химической ионизацией по типу положительных ионов с метаном в качестве ионизационного газа. Для количественного определения контролируют характеристические ионы m/z 72 (акриламид) и m/z 75 (13C3 акриламид). Используемое оборудование. ГХ HP 6890 (Hewlet Packard).MSD (масс-селективный детектор) HP5973 (Hewlet Packard). Препарат кофе. Концентрированные растворы ферментов ZDK и ZDO получают ультрафильтрацией и затем стабилизируют, добавляя 50% (мас./об.) (конечный объем) глицерина, 0,02% (мас./об.) CaCl2, 0,1% (мас./об.) метионина и 0,1% (мас./об.) бензоата натрия. Показано, что такие концентрированные стабилизированные растворы имеют амидазную активность 0,087 Е/мл для ZDK и 18,5 Е/мл для ZDO, измеренную в мкмоль аммиака, высвобождаемого в минуту из 100 мМ пропионамида. Свежезаваренный кофе разделяют на порции по 6 мл и инкубируют при 30 С. Затем добавляют 0,3 мл раствора амидазы и продолжают инкубацию при 30 С. Инкубацию, при которой добавляют 0,3 мл воды вместо раствора фермента, используют в качестве контроля. Образцы сушат вымораживанием и анализируют на акриламид согласно способу, описанному выше.