Способ получения лимонной кислоты и ее солей путем периодической и непрерывной ферментации гриба aspergillus niger

1 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения лимонной кислоты и ее солей, которые могут использоваться в пищевой промышленности, медицине, фармокологии. Известны способы получения лимонной кислоты и ее солей из ферментационных растворов, получаемых при культивировании различных микроорганизмов: дрожжей (патент РФ 695230, патент РФ 2007459, патент РФ 842106,патент РФ 2096461), грибов (авт. св. СССР 1592336, патент РФ 1296580), бактерий (авт. св. СССР 1221243), консорциума дрожжей и грибов(патент РФ 2098485). Несмотря на разнообразие продуцентов лимонной кислоты при промышленном производстве лимонной кислоты, предпочтение отдается грибам Aspergillus niger. Известны способы получения лимонной кислоты путем культивирования гриба Aspergillus niger на различных углеводсодержащих средах: крахмале, молочной сыворотке, этиловом спирте, сахаре, мелассе (патент РФ 213238,Авт. св. СССР 1211290, патент РФ 2095416, патент РФ 2076906) при периодическом, отъемнодоливном или непрерывном культивировании(патент РФ 2095416, патент РФ 907072, патент РФ 2076906). Наиболее близким к заявленному изобретению относится способ получения лимонной кислоты, описанный в патенте РФ 2125607. Согласно данному патенту лимонную кислоту получают путем ферментации гриба Aspergillusniger ВКПМ F - 718 на мелассной питательной среде в две стадии. На первой стадии используют мелассу с рН среды 4,0 - 5,0, температура выращивания 32-34 С, через 30-48 ч от начала культивирования начинают непрерывную подачу мелассы и питательной среды со скоростью разбавления 0,025-0,03 ч-1. На второй стадии используют перетекающую с первой стадии суспензию микроорганизмов, процесс ведут при 30-32 С и рН 2,0-3,0. Отбор суспензии осуществляют с той же скоростью. Маточные растворы,образующиеся при кристаллизации лимонной кислоты, используют для дополнительного получения солей лимонной кислоты. При реализации данного изобретения концентрация лимонной кислоты в среде составляет 73-75 г/л. Выход от РВ 91-95%. Известно, что на синтез лимонной кислоты оказывают влияние условия культивирования,качество посевного материала, состав питательной среды. В описанном патенте указано, что подращивание мицелия на питательной среде, содержащей мелассу, сахарозу, этиловый спирт и микроэлементы (Zn, Co, Мо) способствует улучшению качества засевного материала. Однако в патенте не приводятся данные о выходе лимонной кислоты до и после подращивания мицелия при вышеописанных условиях. Кроме того, при выращивании гриба Aspergillus niger 2 на питательных средах с разными источниками углерода используют один и тот же состав минеральных солей, что не позволяет создать оптимальные условия для выращивания гриба и накопления им лимонной кислоты. Задача изобретения заключается в интенсификации процесса производства лимонной кислоты и повышении его эффективности. Решение поставленной задачи обеспечивается за счет применения технологических приемов, способствующих улучшению качества посевного материала и оптимизации условий культивирования и выделения лимонной кислоты, что позволяет в условиях периодической ферментации повысить выход лимонной кислоты и при непрерывном режиме увеличить скорость протока до 0,05 - 0,06 ч-1. Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. На стадии приготовления посевного материала с целью улучшения его качества используют наполнитель конидий,содержащий измельченные отруби, пептон, измельченный сахар, измельченную лимонную кислоту. Применение данного наполнителя конидий обеспечивает не только сохранность спор, но и способствует повышению их биохимической активности. Использование данного наполнителя наряду со снижением расхода конидий, способствует повышению биосинтеза лимонной кислоты на 7% и увеличению активности прорастания (всхожести) конидий на 15%. На стадии ферментации с целью создания оптимальных по минеральному составу условий культивирования для гриба Aspergillus niger и повышения выхода лимонной кислоты в среду культивирования вводят азот в виде аммонийных солей, сульфат железа и неионогенный ПАВ (Твин-40). При этом оптимальное количество солей азота и железа на среде с сахаромсырцом составляет 1 г/л и 8-9 г/л соответственно, а на среде с мелассой 2 г/л и 10 -15 г/л соответственно. Количество вводимого ПАВ составляет 120-170 г/л. Ферментацию ведут при начальном рН среды 4,5-5,5. Оптимизация минерального состава, рН среды и введение в среду культивирования ПАВ повышает выход лимонной кислоты в среднем на 12%. Применение вышеописанных технологических приемов при непрерывном режиме культивировании позволяет увеличить скорость протока среды до 0,05-0,06 ч-1. Полученная на стадии ферментации лимонная кислота ( кристаллическая или очищенные производственные растворы) далее направляется на получение солей лимонной кислоты (цитрата натрия или цитрата калия). В реактор, снабженный мешалкой, змеевиком - охладителем, РН-метром, термометром,загружают раствор щелочи (40% раствор NaOH или 35-40% раствор КОН). Затем после включения мешалки и подачи воды на охлаждение в реактор подают 50-60% раствор лимонной ки 3 слоты. Нейтрализацию ведут до уровня рН=7,27,6 (в случае NaOH) или рН 7,8-8,0 (при использовании КОН), не допуская при этом повышения t до 80 С. Процесс выпарки и кристаллизации ведут в вакуум-кристаллизаторе, представляющем собой вертикальный аппарат, снабженный мешалкой, термометром, вакуумметром. Выпарку ведут при 0,8-0,9 ат, не допуская подъема температуры выше 80 С. При достижении плотности упариваемого раствора цитрата натрия до 1,48-1,54 кг/дм 3(цитрата калия до 1,58 кг/дм 3) процесс заканчивают и переходят к кристаллизации. При этом подают в змеевик воду и охлаждают массу до t=42-45 (или до 20 С). При этом получают трехзамещенный 2-водный цитрат натрия (или трехзамещенный 1-водный цитрат калия). Полученные кристаллы отделяют от маточного раствора в фильтрующей центрифуге с непрерывной выгрузкой осадка и сушат в сушилке с псевдоожиженном слоем. Затем проводят рассев кристаллов по фракциям, нестандартные кристаллы возвращают на перекристаллизацию. Товарный продукт фасуют в бумажные мешки. Пример 1. Посевной материал готовили следующим образом: сухие конидии смешивали в соотношении 1:1 с наполнителем следующего состава: измельченные отруби - 50%; пептон - 35%; измельченный сахар -14%; измельченная лимонная кислота - 1%. Для получения однородного посевного материала конидии с наполнителем перемешивали в течение 60 ч. Всхожесть данного посевного материала составляет 95% (в контрольном варианте - 80%). Гриб Asp.niger выращивали на среде с мелассой: Меласса - 2% (по РВ);FeSO47H2O - 15 г/л. рН среды устанавливали 4,5. Дополнительно в среду культивирования вносят ПАВ(Твин-40) в количестве 170 мг/л. Выращивание ведут в условиях непрерывного режима в 2-х последовательно соединенных ферментерах.I стадию осуществляют при начальной величине рН=4,5 и t=32C. Через 26 ч от начала ферментации, после снижения интенсивности образования мицелия, процесс переводят на непрерывный режим путем непрерывной подачи в среду раствора мелассы (с содержанием РВ 8%) и питательных солей со скоростью Д=0,05 4 ч-1. Перетекающая суспензия с такой же скоростью поступает на вторую стадию (во второй ферментер), где ферментацию ведут при температуре 30 С. Величину рН на второй стадии снижают до 2,0. Концентрация лимонной кислоты в среде составляет 86 г/л. Пример 2. То же, что и в примере 1, но выращивание ведут на среде следующего состава: Сахар - 95 г/л;FеSO47 Н 2O - 8,5 г/л; рН среды 5,5. Концентрация лимонной кислоты составляет 79 г/л. Пример 3. То же, что и в примере 1, но в среду культивирования добавляют Твин-40 в количестве 120 мг/л. Скорость протока Д = 0,06 ч-1 Концентрация лимонной кислоты составляет 90 г/л. Пример 4. То же, что и в примере 1, но процесс ведут в периодическом режиме в течение 7 суток. Концентрация лимонной кислоты в среде составляет 110 г/л. Пример 5. В реактор, снабженный рубашкой, подают 40%-ый раствор NaOH и 60%-ый раствор лимонной кислоты до тех пор, пока рН среды не установится 7,5. Полученный раствор упаривают при 0,9 атм до концентрации цитрата натрия 1,5 кг/л. Полученный раствор охлаждают до температуры 45 С. Выпавшие кристаллы трехзамещенного цитрата натрия отделяют на центрифуге и сушат. Пример 6. В реактор подают 35%-ый раствор КОН и 50 %-ый раствор лимонной кислоты до тех пор,пока рН раствора не установится 8,0. Полученный раствор упаривают при 0,8 атм до концентрации цитрата калия 1,58 кг/л. Далее раствор охлаждают до температуры 20 С. Выпавшие кристаллы цитрата калия отделяют центрифугированием и сушат. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ производства лимонной кислоты и ее солей путем ферментации гриба Aspergillusniger ВКПМ F-718, включающий стадию подготовки посевного материала, последующее культивирование указанного гриба в питательной среде, содержащей источник углерода, азота,фосфора и микроэлементы, и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что на стадии подготовки посевного материала в качестве наполнителя конидий используют композицию,включающую измельченные отруби, пептон, 5 измельченный сахар, измельченную лимонную кислоту, в среду культивирования дополнительно вводят неиногенный ПАВ, в частности,Твин-40, количество азота и солей железа корректируют в составе питательной среды в зависимости от вида источника углерода, рН среды 6 на начальной стадии ферментации устанавливают 4,5-5,5. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость протока среды при непрерывном режиме ферментации составляет 0,05-0,06 ч-1.