Способ получения ферментированного молочного продукта при синергетической ферментации lactobacillus rhamnosus и lactobacillus paracasei subsp. paracasei

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА ПРИ СИНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ LACTOBACILLUS RHAMNOSUS И Изобретение относится к способу получения ферментированного продукта при синергетической ферментации Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: КОМПАНИ ЖЕРВЭ ДАНОН (FR) Настоящее изобретение относится к способу ферментации, включающему синергетический рост по меньшей мере двух штаммов Lactobacillus. Способы сбраживания молочно-кислыми бактериями развивались на протяжении веков. При молочно-кислом брожении молочно-кислые бактерии превращают сбраживаемые сахара в энергию, что обеспечивает рост бактерий и приводит в результате к образованию молочной кислоты. Сбраживание молочно-кислыми бактериями широко используется для получения пищевых продуктов. В течение длительного времени считалось, что некоторые ферментированные пищевые продукты,такие как йогурт, оказывают положительное воздействие на здоровье как за счет улучшенной усвояемости/доступности нутриентов благодаря ферментации, так и за счет специфического воздействия самих бактерий. В последнее время проводилось множество клинических исследований, нацеленных на изучение положительного воздействия на здоровье некоторых штаммов, продуцирующих молочную кислоту. Эти штаммы, как правило, называют пробиотиками. В соответствии с принятым в настоящее времяFAO/WHO определением, пробиотиками являются: "Живые микроорганизмы, которые при введении в соответствующих количествах оказывают положительное воздействие на здоровье хозяина". Подавляющее большинство используемых в качестве пробиотиков микроорганизмов представляют молочнокислые бактерии, в частности штаммы Lactobacillus и Bifidobacteria. Сначала считалось, что пробиотики оказывают положительное воздействие на хозяина, главным образом улучшая баланс микрофлоры в желудочно-кишечном тракте, конкурируя с патогенными бактериями и бактериями, продуцирующими токсины. В настоящее время исследуется и документируется специфическое воздействие на здоровье, включая облегчение хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, профилактику и лечение диареи, индуцированной патогенами, урогенетальные инфекции и атопические заболевания. Считается, что такое воздействие оказывают сами бактерии, а также их метаболиты, продуцируемые в процессе ферментации. Различные исследования связывают различные штаммы пробиотиков, даже принадлежащие к одним и тем же видам, с различным положительным воздействием на здоровье. Например, поскольку кишечник человека является "домом" для около 400-500 типов микроорганизмов, которые заселяют различные участки пищеварительного тракта, считается, что каждый из множества штаммов пробиотиков,заселяющих различные участки, оказывает свое положительное воздействие. Дальнейшее исследование выявило дополнительные положительные целебные свойства композиций, содержащих множество видов или штаммов пробиотиков, по сравнению с таковыми, содержащими один единственный штамм (TIMMERMAN et al., Int. J. Food Microbiol., 96, 219-33, 2004; WILLIAMS etal., Aliment Pharmacol. Ther, 2008). В WO2005095656 и VERDENELLI et al. (Eur. J. Nutr, 48, 355-63, 2009) описывается способ отбора штаммов пробиотиков, включающий стадию тестирования их адгезионных свойств к клеткам желудочно-кишечного тракта в присутствии бактерий других штаммов; в частности, в этих документах описаны два штамма: Lactobacillus rhamnosus IMC 501 и Lactobacillus paracasei IMC 502,отобранные при использовании этого способа, и предлагается использовать их при совместном введении для улучшения или восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Композиции с множеством штаммов пробиотиков, как правило, получают, выращивая по отдельности каждый штамм пробиотиков, используемый в композиции, при условиях, подходящих для роста указанного штамма, и добавляя их в конечный продукт после выращивания. Такой процесс имеет недостаток, состоящий в больших временных затратах и необходимости использовать отдельные емкости для ферментации каждого штамма пробиотика, что приводит к высокой стоимости. Дополнительно, в большинстве случаев штаммы пробиотиков отделяют от ростовой среды перед добавлением в конечный продукт. Следовательно, метаболиты, которые они выделяют в среду в процессе ферментации и которые могут вносить свой вклад в оказание положительного воздействия на здоровье, больше не присутствуют в конечном продукте. Однако совместное культивирование нескольких штаммов или видов бактерий связано с проблемой, заключающейся в возможной конкуренции и/или взаимодействии этих двух бактерий. Например,если штаммы с различными скоростями роста культивируют совместно, как правило, штамм с более быстрым ростом подавляет другой штамм. Также метаболиты, продуцируемые каждым штаммом, могут оказывать стимулирующее воздействие или наоборот оказывать ингибирующее воздействие на один или более из совместно культивируемых штаммов. Хорошо известны синергетические и антогонистические эффекты, возникающие в процессе ферментации, между бактериями, используемыми при традиционном получении пищевого продукта. Например, классический "йогуртный симбиоз" представляет совместное культивирование Streptococcusthermophilus и Lactobacillus bulgaricus. Синергизм этих двух бактерий приводит к ускоренному размножению их обоих и подкислению молока. Примеры антагонистического воздействия комбинаций различных бактерий могут быть найдены в предшествующем уровне техники (Е. coli and S. Thyphimurium: В настоящее время мало что известно о взаимодействии между видами или штаммами Lactobacillus и еще меньше о пробиотиках Lactobacillus. Сообщалось (LEE, Process Biochemistry, 40, 1559-64, 2005),что при получении молочной кислоты смешенное культивирование молочно-кислых бактерий может быть более эффективным, чем культивирование только одного, но отсутствуют сведения о синергетическом эффекте при совместном культивировании бактерий подвидов Lactobacillus casei/paracasei и Lactobacillus rhamnosus. В WO2005095656 и VERDENELLI et al. (Eur. J. Nutr., 48, 355-63, 2009) не описывается совместное культивирование двух штаммов Lactobacillus rhamnosus IMC 501 и Lactobacillus paracaseiIMC 502. Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда штаммы Lactobacillus видовparacasei и rhamnosus совместно культивируют в молочной ферментационной среде, происходит синергетический рост этих бактерий. В результате за заданное время ферментации рН ферментируемой среды более кислый, и/или биомасса бактерий при совместном культивировании равна и, как правило, выше,чем при моно культивировании каждого индивидуального штамма. Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения ферментированного молочного продукта, содержащего два или более штамма Lactobacillus, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 штаммов Lactobacillus, где указанный способ включает:a) инокулирование молочной ферментационной среды указанными штаммами Lactobacillus;b) ферментацию инокулированной среды инкубированием ее при температуре, подходящей для роста указанных штаммов, до достижения заданного целевого рН или до достижения заданного целевого показателя популяции бактерий;c) остановку ферментации и извлечение ферментированного продукта; где штаммы Lactobacillus выбирают из штаммов видов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и/или штаммов вида Lactobacillusrhamnosus. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин молочная ферментационная среда относится к жидкой среде на основе молока. Подразумевается любой источник животного или растительного молока. Однако предпочтительным является коровье молоко. Оно может быть, например, цельным, частично или полностью обезжиренным молоком, необязательно восстановленным из сухого молока. Также среда может состоять из фракции молока, например сыворотки или смесей двух или более фракций молока. Предпочтительно указанную среду используют без дополнительных добавок. Однако необязательно в нее могут быть добавлены такие ингредиенты, как сахара, крахмал, загустители и тому подобное, при условии, что эти ингредиенты не оказывают воздействия на рост одного или более совместно культивируемого штамма Lactobacillus, при условии, что они подходят для потребления человеком или животными. В частности, в случае, когда один или более штамм Lactobacillus не может ферментировать лактозу (например, в случае Lactobacillus rhamnosus LGG), сахар, который может быть переработан указанным штаммом (например, глюкоза), может быть добавлен в молочную ферментационную среду,предпочтительно в концентрации вплоть до 10%, предпочтительно в пределах от 1 до 10%. Указанную среду, как правило, стерилизуют перед инокуляцией штаммами Lactobacillus. Стерилизацию проводят при использовании традиционных известных способов, таких как тепловая обработка. рН культуральной среды перед инокуляцией бактериями предпочтительно составляет в пределах от 5,5 до 7, предпочтительно около 6,5. Для инокуляции среды может быть использована любая комбинация штаммов или видов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и/или штаммов видов Lactobacillus rhamnosus. Например, может быть использовано два или более штамма одного вида, или комбинация одного,двух или более штаммов одного из видов с одним, двумя или более штаммами другого вида. Как правило, по меньшей мере один из указанных штаммов имеет пробиотические или потенциально пробиотические свойства. Предпочтительно по меньшей мере два и еще более предпочтительно все штаммы, используемые для инокуляции среды, имеют пробиотические или потенциально пробиотические свойства. Сообщалось о пробиотических свойствах штаммов обоих видов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и Lactobacillus rhamnosus. Примеры указанных штаммов с пробиотическими свойствами Lactobacillus paracasei subsp. paracasei включаютparacasei); Примеры указанных штаммов с пробиотическими свойствами Lactobacillus rhamnosus включаютLactobacillus rhamnosus HN001, описанный, например, в W09910476. Предпочтительными комбинациями штаммов являются таковые, которые включают по меньшей мере один и предпочтительно по меньшей мере два из Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 11518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-3689 и Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690. На-2 024087 пример, они могут включать Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-1518 с Lactobacillus paracaseiCNCM 1-3690. По существу, предпочтительная комбинация штаммов включает три штамма Lactobacillusparacasei subsp. paracasei CNCM 1-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-3689 и Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690. Эти комбинации дополнительно могут включать другие штаммы пробиотиков и не пробиотиковLactobacillus paracasei subsp. paracasei и/или Lactobacillus rhamnosus. Как правило, численность штаммов Lactobacillus, инокулированных в молочную ферментационную среду, составляет по меньшей мере 106 КОЕ/мл, предпочтительно в пределах от 5106 до 1108 КОЕ/мл,более предпочтительно в пределах от 1107 до 5107 КОЕ/мл и еще более предпочтительно около 2107 КОЕ/мл. Пропорция каждого из штаммов в общей популяции инокулированных Lactobacillus может быть выбрана по доли пропорции, которую желательно получить в конечном ферментированном продукте. Как правило, каждый индивидуальный штамм должен составлять по меньшей мере 1% от общей инокулированной популяции. Следовательно, он может составлять вплоть до 99% в случае совместного культивирования двух штаммов, вплоть до 98% в случае совместного культивирования трех штаммов и так далее. Предпочтительно каждый индивидуальный штамм составляет по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10% от общей популяции. Индивидуальные штаммы могут быть инокулированы по отдельности или смешаны вместе перед инокуляцией. После инокуляции молочной среды ферментацию проводят при обычных условиях, подходящих для роста инокулированных штаммов бактерий. Обе, и Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и Lactobacillus rhamnosus представляют мезофильные бактерии. Следовательно, температура ферментации, как правило, составляет в пределах от 30 до 42 С,предпочтительно в пределах от 34 до 38 С, наиболее предпочтительно около 37 С. Ферментацию останавливают, когда ферментационная среда достигает заданного целевого рН, или когда общая популяция Lactobacillus достигает заданного целевого показателя. Как правило, целевой рН составляет в пределах от 3,7 до 4,2; предпочтительно в пределах от 3,75 до 3,9; наиболее предпочтительно около 3,8. Целевой показатель общей популяции Lactobacillus, как правило, составляет по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз,и, как правило, вплоть до в 1000 раз больше инокулированной популяции. Как правило, ферментацию останавливают, когда популяция бактерий составляет по меньшей мере 108 КОЕ/мл, предпочтительно по меньшей мере 109 КОЕ/мл. Время ферментации для достижения целевого рН или целевой популяции Lactobacillus зависит от условий ферментации (включая, в частности, размер инокулированной популяции, композицию молочной ферментационной среды, и/или температуру ферментации). При использовании комбинации штаммов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и/или Lactobacillus rhamnosus, время ферментации уменьшается. Оно может быть, например, по меньшей мере короче на 1%, предпочтительно по меньшей мере короче на 5%, предпочтительно по меньшей мере короче на 10%, например, в пределах на от 1 до 80% или в пределах на от 5 до 50%, или в пределах на от 10 до 40% короче, чем время ферментации, необходимое для достижения того же целевого рН или той же целевой популяции Lactobacillus со штаммами Lactobacillus paracasei subsp. paracasei или Lactobacillus rhamnosus, культивированными по отдельности при тех же условиях ферментации. Время ферментации короче в пределах на от 1 до 10% считается слабым синергизмом. Время ферментации короче по меньшей мере на 10% считается сильным синергизмом. Как правило, условия ферментации выбирают, таким образом, чтобы время ферментации составляло в пределах от 10 до 120 ч, предпочтительно в пределах от 25 до 75 ч и предпочтительно, чтобы время ферментации не превышало 50 ч. Также настоящее изобретение относится к ферментированному молочному продукту, полученному способом по настоящему изобретению. Как правило, этот продукт содержит дополнительно к штаммам,используемым для ферментации ферментируемой молочной среды, штаммы Lactobacillus paracasei subsp.paracasei или Lactobacillus rhamnosus. Следовательно, он содержит все метаболиты, продуцированные штаммами во время ферментации, включая, метаболиты, полученные в результате взаимодействия между совместно культивированными штаммами (например, метаболиты, выделенные одним из штаммов,которые затем были метаболизированы другим штаммом). Этот ферментированный молочный продукт может быть использован, как таковой, в частности, как пищевой продукт или как пищевая добавка. Он также может быть добавлен в пищевой продукт, в частности в молочный продукт, такой как йогурт, или нутритивную или фармацевтическую или косметическую композицию. Пищевая композиция наряду с нутритивными, фармацевтическими или косметическими композициями, включающими ука-3 024087 занный ферментированный молочный продукт, также является частью настоящего изобретения. Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано неограничивающими Примерами вариантов воплощения способа по настоящему изобретению дополнительно к описанию. Пример 1. Синергетический рост двух или трех штаммов Lactobacillus. Материалы и методы. 1) Штаммы. Проводят исследование следующих штаммов: штаммы Lactobacillus rhamnosus:Paracasei A,Paracasei В,CNCM 1-1518,CNCM 1-3689,HN001, CNCM 1-3690, CNCM 1-1518 и CNCM 1-3689 представляют известные штаммы пробиотиков, в то время как Rhamno A, Rhamno В, Paracasei A and Paracasei В представляют обычные, случайно выбранные штаммы. 2) Криопробирки. Полученные ранее согласно приведенной ниже инструкции штаммы хранят в криопробирках (2 мл). Культуру штамма получают при использовании бульона Man Rogosa Sharpe (MRS) инкубированием в течение 16 ч при температуре 37 С; для улучшения стабильности штамма при хранении добавляют стерилизованный DMSO (5,3%). Криопробирку замораживают в потоке жидкого азота в течение 30 мин. Чистоту штамма проверяют при использовании API gallery 50CH + метиленовый синий. Криопробирки хранят при температуре -80 С. 3) Субкультура с ростовой средой. Каждый штамм культивируют по отдельности. Криопробирки размораживают в стерильных условиях и добавляют 1 мл (1%) культуры в 100 мл стерильного бульона MRS, используемого в качестве ростовой среды, и инкубируют при температуре 37 С до достижения культурой стационарной фазы (рН около 4,00). Субкультуру центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4 С. Супернатант заменяют стерильным солевым раствором триптона. 4) Ферментация в молочной среде. Молочная среда содержит обезжиренное сухое молоко (120 г) и дистиллированную воду (930 г). После 1 ч регидратации смесь стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при температуре 115 С. Бактерии субкультур инокулируют при общей популяции бактерий 2107 клеток/мл в 200 мл молочной среды. Когда используют 2 штамма, каждый штамм составляет 1/2 от общей популяции бактерий; когда используют 3 штамма, каждый штамм составляет 1/3 от популяции бактерий. Ферментацию проводят при температуре 37 С, и проводят наблюдение, измеряя снижение рН культуральной среды. Ферментацию останавливают, когда достигается целевой показатель рН 3,80. Подсчет клеток проводят, проводя серии разведений ферментированной среды солевым раствором триптона, и культивируют в чашках Петри на агаре MRS. Чашки Петри инкубируют при температуре 37 С в течение 72 ч в анаэробных условиях. Результаты. Результаты приведены в табл. I и II и на фиг. 1-3. В табл. I приведено общее количество бактерий при достижении целевого рН 3,80. В табл. II приведено уменьшение времени ферментации, необходимого для достижения целевого рН 3,80 (среднее 2 независимых экспериментов). Уменьшение рассчитывают как разницу между временем, необходимым для достижения рН 3,80 для штамма с самой большой скоростью ферментации при отдельном культивировании, и временем, за которое достигнут рН 3,80 при использовании комбинации штаммов. Авторы настоящего изобретения считают, что синергетический эффект достигнут, когда время снижения ферментации при использовании комбинации составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере, при том же минимальном уровне популяции. В табл. I приведены результаты по общему количеству. Целевое количество (такое же, как для ферментации каждого отдельного штамма = по меньшей мере 1109 КОЕ/г) достигнуто для каждой тестируемой комбинации, приведенной в табл. II. Из табл. II ясно видно, что все комбинации L. rhamnosus и/или L. casei дали неожиданное синергетическое усиление роста, отраженное снижением времени ферментации по меньшей мере на 1 ч. Этот синергетический эффект даже сильнее при совместном культивировании трех штаммов. Фиг. 1 - кривые ферментации при одинаковых условиях культивирования 2 индивидуальных штаммов CNCM 1-3689 и CNCM 1-3690 и при совместном культивировании 2 штаммов (комбинация 5). Совместная ферментация приводит к 6-часовому снижению времени ферментации. Фиг. 2 - кривые ферментации при одинаковых условиях культивирования 2 индивидуальных штаммов CNCM 1-1518 и CNCM 1-3690 и при совместном культивировании 2 штаммов (комбинация 7). Совместная ферментация приводит к 10-часовому снижению времени ферментации. Фиг. 3 - кривые ферментации при одинаковых условиях культивирования 3 индивидуальных штаммов CNCM 1-1518, CNCM l-3689 и CNCM 1-3690 и при совместном культивировании 3 штаммов (комбинация 11). Совместная ферментация приводит к 12-часовому снижению времени ферментации. Эти результаты подтверждают таковые, приведенные в табл. II, показывая синергетическое воздействие совместной ферментации штаммов на скорость роста, и что комбинация трех различных штаммов более эффективна в более короткое время ферментации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения ферментированного молочного продукта, содержащего два или более штаммаLactobacillus, где указанный способ включает:a) инокулирование среды для ферментации, содержащей молоко, указанными штаммами Lactobacillus;b) ферментацию инокулированной среды до достижения заданного целевого рН от 3,7 до 4,2 или до момента, когда общая популяция Lactobacillus по меньшей мере в 10 раз превысит инокулированную популяцию;c) остановку ферментации и извлечение ферментированного продукта, где штаммы Lactobacillus выбирают из штаммов видов Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, выбранных из Lactobacillus paracaseicasei Shirota; и/или штаммов вида Lactobacillus rhamnosus, выбранных из Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690, или Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), или Lactobacillus rhamnosus HN001, и содержат по крайней мере один штамм, выбранный из Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-3689 и Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690. 2. Способ по п.1, где штаммы Lactobacillus инокулируют в среды для ферментации, содержащей молоко, в общем количестве по меньшей мере 106 КОЕ/мл. 3. Способ по любому из пп.1 или 2, где каждый индивидуальный штамм составляет по меньшей мере 1% от общей популяции инокулированных Lactobacillus. 4. Способ по любому из пп.1-3, где ферментацию останавливают, когда общая популяция Lactobacillus по меньшей мере в 100 раз превысит инокулированную популяцию. 5. Способ по любому из пп.1-4, где ферментацию останавливают, когда общая популяция Lactobacillus составляет по меньшей мере 108 КОЕ/мл. 6. Способ по любому из пп.1-5, где общая популяция Lactobacillus в полученном ферментированном продукте составляет в пределах от 106-109 КОЕ/мл. 7. Способ по любому из пп.1-6, где инокулированные штаммы включают, по меньшей мере, комбинацию штаммов, выбранных изLactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-3689 и Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690. 8. Способ по п.7, где инокулированные штаммы включают три штамма Lactobacillus paracasei subsp.CNCM 1-3690. 9. Ферментированный молочный продукт, полученный способом по любому из пп.1-8. 10. Композиция, включающая молочный продукт и следующие штаммы Lactobacillus:Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-1518, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CNCM 1-3689 и Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690,для получения ферментированного молочного продукта по п.9. 11. Молочный продукт, содержащий композицию по п.10.