Новые ферменты для ферментативного отбеливания пищевых продуктов

НОВЫЕ ФЕРМЕНТЫ ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОТБЕЛИВАНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Зорн Хольгер, Шайбнер Мануэла, Хюльсдау Бербел, Бергер Ральф Гюнтер (DE), Бур Де Лекс, Мейма Рульф Бернхард (NL) Представитель: Данное изобретение относится к новым полипептидам, соответствующим кароазам 01-05 или любым функциональным эквивалентам любых из них, подходящим для применения в способе приготовления пищевых продуктов, обладающих повышенной белизной, применению фермента для увеличения белизны по меньшей мере части пищевого продукта, способу приготовления пищевого продукта, где фермент применяют, и полученному пищевому продукту.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) 015800 Данное изобретение относится к новым ферментам, подходящим для применения в способе приготовления пищевых продуктов, обладающих повышенной белизной, к применению фермента для увеличения белизны по меньшей мере части пищевого продукта, к способу приготовления пищевого продукта,где используют фермент, и получаемому пищевому продукту. В некоторых типах пищевых продуктов белый цвет по меньшей мере части пищевого продукта представляется желательным, например, в молочных продуктах, например сырах, сыворотке, масле и сухом молоке, и в продуктах на основе муки, например хлебе и макаронных изделиях. Сырье или промежуточные продукты таких пищевых продуктов, однако, могут содержать пигменты, которые могут придавать пищевому продукту цвет в диапазоне от не совсем белого до желтого. Примерами таких пигментов являются каротиноиды (каротины и ксантофиллы) и флавоны. В белом хлебе, например, белый мякиш считают желательным свойством. Более белый мякиш можно получить путем применения ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, липаза и/или липоксигеназа, см., например,"Oxido-reductases and Lipases as Dough-Bleaching Agent" by P. Glinas et al., Cereal Chem., 75(6), 810-814(1998). Все упомянутые ферменты обладают отбеливающим действием на мякиш. В настоящее время хлебопекарная промышленность в основном применяет ферментно-активную соевую муку, которая содержит липоксигеназы. Липоксигеназы в соевой муке способны отбеливать пигменты пшеничной муки в результате действия свободных радикалов и других реакционноспособных кислородных частиц, которые формируются во время окисления жирных кислот липоксигеназой. Эта реакция называется соокисление. В соевой муке присутствуют три липоксигеназы: L1, L2 и L3, при этом L2 и L3 обладают наилучшей отбеливающей активностью (W. Grosch, G. Laskawy и F. Weber, J. Agric. Food Chem., 24 (1976), 456). Соевая мука содержит не только липоксигеназы, но и жирные кислоты, которые необходимы для эффекта отбеливания, что приводит к улучшению эффекта отбеливания. Недостатком, связанным с использованием соевых бобов в качестве источника липоксигеназы, является тот факт, что в настоящее время большая часть соевых бобов генетически модифицирована(ГМО). Так как по всему миру существует потребительское предпочтение к использованию добавок,улучшающих хлеб, произведенных не из ГМО, крайне необходима альтернатива соевой липоксигеназе. Известные ферменты, иные, чем липоксигеназы L2 и L3 из сои, имеют тот недостаток, что их действие не является таким же хорошим, как действие липоксигеназы из сои. На практике, для того чтобы получить желаемую белизну, эти ферменты следует сочетать с кофакторами или другими ферментами для достижения желаемого уровня белизны мякиша. Пероксидазы катализируют не-ферментативное окисление молекулярным кислородом ненасыщенных соединений, например ненасыщенных жирных кислот.(C.E. Eriksson et. al., JAOS, 48 (1971) 442). Эти окисленные жирные кислоты генерируют радикалы, которые, возможно, реагируют с пигментами муки с образованием менее окрашенных продуктов, подобных продуктам реакции с липоксигеназой. Целью данного изобретения является предложение новых ферментов, подходящих для приготовления пищевого продукта, обладающего повышенной белизной по меньшей мере части пищевого продукта. Удивительно было обнаружить, что отбеливающие ферменты по изобретению способны непосредственно превращать пигмент в форму, которая приводит к повышенной белизне. Эти ферменты могут различными путями проявлять свое непосредственное отбеливающее действие на эти пигменты. Например, они могут непосредственно превращать пигменты путем насыщения ненасыщенных связей в пигментах посредством, например, гидрогенизации или они могут непосредственно расщеплять пигменты с образованием продуктов разложения. Под термином "непосредственное" подразумевают то, что эти ферменты действуют на пигмент сами по себе как субстраты. Использование кофакторов для достижения превращения, в частности, не исключается. Более того, было найдено, что отбеливающий полипептид по изобретению способен непосредственно расщеплять пигменты (так называемый расщепляющий фермент). Подходящие расщепляющие ферменты по изобретению представляют собой ферменты, которые способны расщеплять каротиноиды(каротины и ксантофиллы) и флавоны. Каротиноиды могут быть расщеплены двумя различными путями: центральным и эксцентричным. Центральное расщепление каротиноидов приводит к образованию ретиноидов (C20-соединений). Эксцентричное расщепление может давать более разнообразную группу соединений, как, например, абсцизовую кислоту. Ферментом, способным к центральному расщеплению каротиноидов, является, например -каротин-15,15'-монооксигеназа (EC 1.14.99.36), как описано, например, вEP-A-1031623 и J. Lintig and K. Vogt (2000) J. Biol. Chem., 275, 11915. Этот фермент был ранее известен как -каротин 15,15'-диоксигеназа = EC 1.13.11.21. Дополнительное преимущество применения ферментов, способных к центральному расщеплению,состоит в образовании ретиноидов. Они являются жизненно важными компонентами в зрении. -каротин расщепляется на две молекулы ретиналя. Этот ретиналь может быть модифицирован в ретинол, также известный как витамин A. Примерами ферментов, способных к эксцентричному расщеплению каротиноидов, являются 9-цис-эпоксикаротиноиддиоксигеназа (например, X. Qin and J.A.D. Zeevaart (1999),Proc. Nat. Acad. Science, 96, 15354) и -каротин 9',10'-диоксигеназа (например, Kiefer et al. (2001), J. Biol.Chem., 287, 14110). Эта цель достигается с помощью нового фермента, который раскрывает данное изобретение. По первому объекту изобретение относится к изолированным полипептидам, обладающим отбеливающей активностью, одной или более характеристик и выбранным из группы, состоящей из: 1) изолированного полипептида, соответствующего любой из SEQ ID NO: 08-12 или функциональных эквивалентов любого из них; 2) изолированного полипептида, получаемого путем экспрессии полинуклеотида, соответствующего любой из SEQ ID NO: 01-07 или функциональных эквивалентов любого из них, или вектора, содержащего указанные полинуклеотиды или функциональные эквиваленты любого из них, в соответствующей клетке-хозяине, например Aspergillus niger; и 3) полипептида, содержащего по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 13-17. Термин "полипептиды, обладающие отбеливающей активностью" здесь и далее определяет полипептид, который способен разлагать -каротин или полипептид, который способен отбеливать пищевые продукты. Разложение -каротина может быть измерено, например, по меньшей мере одним из способов,раскрытых в разделе "Материалы и методы" настоящей патентной заявки, например, способом по Зорну(Zorn) или способом по Азизу (Aziz). Предпочтительно полипептид по изобретению показывает отбеливающую активность как в тестах по Азизу, так и в тестах по Зорну. Способность к отбеливанию пищевых продуктов можно определять путем сравнения белизны продукта A, при изготовлении которого используют исследуемый полипептид, с белизной продукта B, который отличается от продукта A только тем, что исследуемый полипептид не использовали в этом продукте, например, визуально или с помощью известного способа измерения отражения, при этом b-фактор продукта A будет ближе к 0, чем bфактор продукта B, в том случае, если исследуемый полипептид обладает отбеливающей активностью. Даже более предпочтительно полипептид по изобретению способен к разложению -каротина при определении по Зорну и способен к отбеливанию пищевых продуктов при определении путем измеренияb-фактора путем измерения отражения. Наиболее предпочтительно полипептид по изобретению способен к разложению -каротина при определении по Зорну в случае, если пищевые продукты, которые отбеливают, имеют нерегулярную структуру поверхности, например хлебный мякиш, т.к. тогда способ измерения отражения не столь надежен. В предпочтительном воплощении изобретение предлагает очищенный полипептид. Полипептиды по изобретению включают полипептиды, кодированные полинуклеотидами по изобретению. Особенно предпочтительным является полипептид, соответствующий SEQ ID NO: 08-12, или функциональные эквиваленты любого из них. Слитые белки, содержащие полипептид по изобретению, также находятся в рамках этого изобретения. Изобретение также предлагает способы получения полипептидов по изобретению. Во избежание неясности SEQ ID NO: 01-07 относятся к группе ДНК-последовательностей, содержащей SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, иID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; и SEQ ID NO: 13-18 относятся к группе белковых последовательностей, содержащей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. Более того, термины кароаза-01, кароаза-02, кароаза-03, кароаза-04,кароаза-05 (всей группе соответствует название "кароаза-01-05") используются для полипептидов, имеющих соответственно SEQ ID NO: 08-12. По второму объекту изобретение предлагает полинуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется предпочтительно в очень жестких условиях с последовательностью,соответствующей любой из SEQ ID NO: 01-07. Соответственно изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, которые приблизительно на 55%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 70%,даже более предпочтительно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичны последовательностям,соответствующим SEQ ID NO: 01-07. В более предпочтительном воплощении изобретение предлагает такой изолированный полинуклеотид, получаемый из грибов, предпочтительно мицелиальных грибов, в частности Marasmius является предпочтительным, например M. scorodonius. В одном воплощении изобретение предлагает изолированный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид с аминокислотной последовательностью,отображенной в SEQ ID NO: 08-12 или функциональные эквиваленты любого из них. В еще одном предпочтительном воплощении изобретение предлагает изолированный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полипептида, соответствующего SEQID NO: 08-12 или функциональные эквиваленты любого из них. В предпочтительном воплощении изобретение предлагает ген отбеливающего фермента, соответствующего SEQ ID NO: 01-07. В другом предпочтительном воплощении изобретение предлагает полинуклеотид, кодирующий отбеливающий фермент, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 08-12 или варианты, или фрагменты любого из этих полипептидов.-2 015800 В еще одном предпочтительном воплощении изобретение предлагает полинуклеотид, содержащий кодирующую последовательность, кодирующую полипептиды по изобретению, предпочтительной является полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 01-07. По третьему объекту изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотидную последовательность по изобретению и праймеры, зонды и фрагменты, которые могут быть использованы для амплификации или детектирования ДНК по изобретению. В предпочтительном воплощении предлагают вектор, где полинуклеотидная последовательность по изобретению функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодированной аминокислотной последовательности в подходящей клетке-хозяине, такой как бактерия или мицелиальный гриб, предпочтительно Marasmius, например M. scorodonius, Aspergillus,например A. niger или A. oryzae. Изобретение также предлагает способы приготовления полинуклеотидов и векторов по изобретению. По четвертому объекту изобретение также относится к рекомбинантно продуцированным клеткамхозяевам, которые содержат гетерологичные или гомологичные полинуклеотиды по изобретению. В другом воплощении изобретение предлагает рекомбинантные клетки-хозяева, где экспрессия пероксидазы по изобретению является значимо повышенной или где активность пероксидазы является повышенной. В другом воплощении изобретение предлагает рекомбинантно продуцированные клетки-хозяева,которые содержат гетерологичные или гомологичные ДНК по изобретению и где клетка способна продуцировать функциональную пероксидазу по изобретению, предпочтительно клетка способна к сверхэкспрессии пероксидазы по изобретению, например штамм Aspergillus, содержащий повышенное число копий гена по изобретению. По пятому объекту изобретение также относится к применению отбеливающего полипептида по изобретению в любом промышленном процессе предпочтительно в виде, описанном здесь. Полипептиды по изобретению Изобретение предлагает изолированный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 08-12, так же, как и аминокислотную последовательность, получаемую путем экспрессии полинуклеотида с SEQ ID NO: 01-07 в соответствующем хозяине. Также пептид или полипептид, содержащий функциональный эквивалент вышеназванных полипептидов,содержится в данном изобретении. Вышеназванные полипептиды совместно охватывают (содержат) термин "полипептиды по изобретению". Термины "пептид" и "олигопептид" здесь и далее считаются синонимами (как это общепризнано), и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо, если контекст требует показать цепочку, состоящую по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово "полипептид" применяется здесь для цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов здесь написаны слева направо и в направлении от аминного конца к карбоксильному концу. Однобуквенный код аминокислот, использованный здесь, общеизвестен в этой области и может быть найден в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989). Термин "изолированный" полипептид или белок предназначен полипептиду или белку, удаленному из его естественного окружения. Например, рекомбинантно продуцированные полипептиды и белки,экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются изолированными для целей изобретения, т.к. являются нативными или рекомбинантными полипептидами, которые были существенно очищены с использованием подходящих способов, таких как, например, одностадийный способ очистки, раскрытый в Smithand Johnson, Gene, 67:31-40 (1988). Отбеливающие ферменты кароазы-01-05 по изобретению или их функциональные эквиваленты могут быть выделены и очищены от культур рекомбинантных клеток хорошо известным способом, включающим аммонийсульфатное или этанольное осаждение, экстрагирование кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, фосфатноцеллюлозную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, афинную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию и пектиновую хроматографию. Для очистки наиболее предпочтительно использование жидкостной хроматографии высокого разрешения ("HPLC"). Полипептиды данного изобретения включают естественно очищенные продукты, продукты химических синтетических процессов и продукты, продуцированные рекомбинантными методами из прокариотических или эукариотических хозяев, включающих, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, который используется в процессе рекомбинантного продуцирования, полипептиды данного изобретения могут быть гликозилированы или могут быть негликозилированы. Кроме того, полипептиды по изобретению могут также включать ранее модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях как результат процессов с промежуточным участием хозяина.-3 015800 Функциональные эквиваленты Термины "функциональные эквиваленты" и "функциональные варианты" применяются здесь взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК, соответствующих кароазам 01-05, представляют собой изолированные ДНК-фрагменты, которые кодируют полипептид, который проявляет, по меньшей мере, такую же или лучшую отбеливающую активность, чем по меньшей мере один из отбеливающих ферментов кароаз 01-05 из Marasmius scorodonius, как определено здесь. Функциональный эквивалент полипептида типа кароазы 01-05 по изобретению представляет собой полипептид, который проявляет, по меньшей мере, такую же или лучшую отбеливающую активность,чем по меньшей мере один из отбеливающих ферментов кароаз 01-05 из Marasmius scorodonius, как определено здесь. Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замены одной или более аминокислот любой из SEQ ID NO: 08-12 или замен, включений или делеций не жизненно важных аминокислот любой из них. Соответственно не жизненно важная аминокислота представляет собой остаток, который может быть заменен в любой из SEQ ID NO: 08-12 без существенного изменения биологической функции. Например, предсказывается, что аминокислотные остатки, которые сохраняются в белках кароазах 01-05 данного изобретения, особенно не подвержены изменению. Более того, видимо, сохраняющиеся аминокислоты в белках кароаз 01-05 по данному изобретению и других пероксидазах не подвержены изменению. Термин "консервативная замена" предназначен для обозначения такой замены, при которой аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, обладающим подобной боковой цепью. Эти семейства известны в данной области и включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота,глутаминовая кислота), незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глутамин,серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин,изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), -разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин,триптофан, гистидин). Функциональные эквиваленты нуклеиновых кислот могут обычно содержать молчащие мутации или мутации, которые не изменяют биологическую функцию кодированного полипептида. Соответственно изобретение предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки кароазы 01-05, которые содержат изменения в аминокислотных остатках, которые не являются жизненно важными для конкретной активности. Такие белки кароазы 01-05 отличаются по аминокислотной последовательности от любой из SEQ ID NO: 08-12, однако сохраняют по меньшей мере один вид биологической активности. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где белок содержит существенного гомологичную аминокислотную последовательность по меньшей мере приблизительно на 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, отображенной в любой из SEQ ID NO: 08-12. Например, рекомендации, касающиеся того, как произвести замены фенотипически молчащих аминокислот, предлагают Bowie, J.U. et al., Science, 247:1306-1310 (1990), где авторы показывают, что существуют два основных подхода к изучению толерантности аминокислотной последовательности к изменениям. Первый способ опирается на процесс эволюции, в котором мутации либо принимаются, либо отвергаются естественной селекцией. Второй подход использует генную инженерию для внесения изменений в аминокислоты в конкретных позициях клонируемого гена и выбирает или проверяет на идентичность последовательности, которые сохраняют функциональность. Как авторы утверждают, эти исследования выявили, что белки на удивление толерантны к аминокислотной замене. Авторы далее показывают, какие изменения, по-видимому, разрешены в определенных позициях белка. Например, наиболее замаскированные аминокислотные остатки нуждаются в неполярных боковых цепях, в то время как немногие свойства поверхностных боковых цепей обычно сохраняются. Другие такие фенотипично молчащие замены описаны в Bowie et al., supra, и цитируемых там ссылках. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок кароаза 01-05, гомологичный белку, соответствующему любой из SEQ ID NO: 08-12, может быть создана путем интродуцирования одной или более нуклеотидных замен, добавлений или делеций в кодирующую нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 01-07, так что одну или более замен, делеций или включений аминокислот интродуцируют в кодированный белок. Такие мутации могут быть введены путем стандартных процедур, таких как сайтнаправленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Термин "функциональные эквиваленты" также охватывает ортологи белков кароаз 01-05 из M.scorodonius. Ортологами белков кароаз 01-05 из M. scorodonius являются белки, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и обладают подобной или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут легко быть идентифицированы как содержащие аминокислотную последовательность, которая является существенно гомологичной любой из SEQ ID NO: 08-12. В данном контексте термин "существенно гомологичные" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество амино-4 015800 кислот или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например, с подобной боковой цепью) тем,что имеются во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, имеющие приблизительно 55%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, даже более предпочтительно 75, 80, 85, 90, 95,96, 97, 98 или 99% идентичность или более, определяют здесь как достаточно идентичные. Также нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства кароаз 01-05, которые соответственно имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 01-07, находятся в рамках изобретения. Более того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки кароазы 01-05 из различных видов, которые, тем самым, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от SEQ IDNO: 01-07, находятся в рамках изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам (например, натуральным аллельным вариантам) и гомологам ДНК, соответствующих кароазам 01-05 по изобретению, могут быть выделены на основании их гомологичности нуклеиновым кислотам, соответствующим кароазам 01-05, раскрытым здесь с использованием ДНК, раскрытых здесь, или их подходящего фрагмента в виде гибридизационных зондов в соответствии со стандартными процедурами гибридизации предпочтительно в крайне жестких условиях гибридизации. В дополнение к встречающимся в природе аллельным вариантам последовательностей кароаз 01-05,как понимает квалифицированное лицо, изменения могут быть внесены путем мутации в нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 01-07, что, тем самым, приводит к изменениям в аминокислотной последовательности белков кароаз 01-05 без существенного изменения функции белков кароаз 01-05. По другому объекту изобретения предложены улучшенные белки кароазы 01-05. Улучшенные белки кароазы представляют собой белки, где по меньшей мере один вид биологической активности улучшен. Такие белки можно получить путем случайного введения мутаций во всю или часть кодирующей последовательности кароазы 01-05, такого как насыщающий мутагенез, и мутанты, полученные в результате, могут быть рекомбинантно экспрессированы и исследованы на биологическую активность. Например, в этой области предлагают стандартные испытания для измерения ферментативной активности пероксидаз, и поэтому улучшенные белки могут быть легко отобраны. В предпочтительном воплощении белок кароаза 01-05 имеет аминокислотную последовательность,соответствующую любой из SEQ ID NO: 08-12 соответственно. В другом воплощении полипептид, соответствующий кароазе 01-05, является существенного гомологичным аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 08-12 соответственно, и сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности полипептида по SEQ ID NO: 08-12 соответственно, хотя отличается по аминокислотной последовательности, благодаря естественной вариации или мутагенезу, как описано выше. В еще одном предпочтительном воплощении белок кароаза 01-05 имеет аминокислотную последовательность, кодированную изолированным фрагментом нуклеиновой кислоты, способным гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, соответствующей SEQ ID NO: 01-07, предпочтительно в крайне жестких условиях гибридизации. Соответственно белок кароаза 01-05 является белком, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере приблизительно 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичную аминокислотной последовательности, отображенной в любой из SEQ ID NO: 08-12, и сохраняет по меньшей мере один вид функциональной активности полипептида, соответствующего любой из SEQ ID NO: 08-12. По другому объекту изобретения полипептид содержит по меньшей мере одну из последовательностей, отображенных в SEQ ID NO: 13-17. Предпочтительно полипептид по изобретению содержит по меньшей мере две из последовательностей, отображенных в SEQ ID NO: 13-17. Наиболее предпочтительно полипептид содержит все последовательности, отображенные в SEQ ID NO: 13-17. Функциональные эквиваленты белка по изобретению могут также быть идентифицированы, например, путем скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например процессированных мутантов, белка по изобретению на пероксидазную активность. В одном воплощении вариегатную библиотеку вариантов генерируют путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот. Вариегатную библиотеку вариантов можно получить, например, путем ферментативного лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов в генные последовательности, так что вырожденный набор потенциальных белковых последовательностей экспрессируется как индивидуальные полипептиды, или альтернативно, как набор слитых белков большего размера (например, для фагового дисплея). Существует множество способов, которые можно использовать для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов по изобретению из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al.Res., 11:477). В дополнение, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности полипептида по изобретению могут быть использованы для генерирования вариегатной популяции полипептидов для скрининга-5 015800 последующей селекции вариантов. Например, библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть генерирована путем обработки двухцепочечного ПЦР-фрагмента кодирующей последовательности, представляющей интерес, нуклеазой в условиях, в которых одноцепочечный разрыв (nicking) происходит только приблизительно один раз на молекулу, денатурации двухнитевой ДНК, ренатурации ДНК с образованием двухнитевой ДНК, которая может включать пары смысловая/антисмысловая ДНК из различных продуктов, подвергшихся одноцепочечному разрыву, удаления одноцепочечных кусков из восстановленных дуплексов путем обработки нуклеазой S1 и лигирования полученной в результате библиотеки фрагментов в вектор экспрессии. С помощью этого способа можно получить библиотеку экспрессии, которая кодирует разного размера N-терминальные и внутренние фрагменты белка, представляющего интерес. Несколько процедур известны в данной области для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных путем точечных мутаций при процессинге, и для скрининга кДНК-библиотек генных продуктов, обладающих выбранными свойствами. Наиболее широко используемые процедуры скрининга больших генных библиотек, пригодные для анализа с высокой пропускной способностью,обычно включают клонирование генной библиотеки в воспроизводимые векторы экспрессии, трансформирование соответствующих клеток полученной в результате библиотекой векторов, и экспрессией комбинаторных генов в условиях, при которых детектирование желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. Рекурсивный совместный мутагенез(REM), процедура, которая увеличивает частоту функциональных мутантов в библиотеках, может быть использован в сочетании со скрининговыми испытаниями для идентификации вариантов белка по изобретению (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) ProteinEngineering, 6(3):327-331). Для квалифицированного лица в данной области будет очевидно, что в дополнение к генным последовательностям кароаз 01-05, отображенным в SEQ ID NO: 01 или 02 для кароазы-01; SEQ ID NO: 03 или 04 для кароазы-02; SEQ ID NO: 05 для кароазы-03; SEQ ID NO: 06 для кароазы-04 и SEQ ID NO: 07 для кароазы-05 соответственно, полиморфизмы ДНК-последовательности, которые могут приводить к изменениям в аминокислотной последовательности белков кароаз, могут существовать в данной популяции. Такие генетические полиморфизмы могут существовать в клетках из различных популяций или внутри популяции за счет естественной аллельной вариации. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты. Фрагменты полинуклеотида по изобретению могут также содержать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать как зонды или праймеры для реакции ПЦР (полимеразной цепной реакции). Нуклеиновые кислоты по изобретению, вне зависимости от того, кодируют они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы как гибридизационные зонды или праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применение молекул нуклеиновых кислот данного изобретения, которые не кодируют полипептид, обладающий активностью кароаз 01-05, включают, в частности, (1) выделение гена, кодирующего белки кароазы или его аллельных вариантов из библиотек кДНК,например из организмов иных, чем M. scorodonius; (2) in situ гибридизацию (например, флуоресцентную гибридизацию in situ, (FISH на метафазных хромосомных пластинках для получения точной локализации генов кароаз 01-05 в хромосомах, как описано в Verma et al., Human Chromosomes: а Manual of BasicTechniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) блот-анализ Нозерна для детектирования экспрессии мРНК кароаз 01-05 в специфических тканях и/или клетках и 4) зонды и праймеры, которые могут быть использованы как диагностический инструмент для анализа присутствия нуклеиновой кислоты, способной к гибридизации зондом с кароаз 01-05 в данном биологическом образце (например, ткани). Также изобретение охватывает способ получения функциональных эквивалентов гена кароаз 01-05. Такой способ влечет за собой получение меченого зонда, который включает изолированную нуклеиновую кислоту, которая кодирует всю или часть последовательности, соответствующей любой из SEQ IDNO: 08-12 или варианту любой из них; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновых кислот с меченым зондом в условиях, которые позволяют гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновых кислот библиотеки с образованием, тем самым, дуплексов нуклеиновых кислот и приготовление полномерной генной последовательности из фрагментов нуклеиновых кислот в любом меченом дуплексе для получения гена,родственного гену кароаз 01-05. В одном воплощении нуклеиновая кислота по изобретению, соответствующая кароазе 01-05, по меньшей мере на 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична последовательности нуклеиновых кислот, отображенной в SEQ ID NO: 01 или 02 для кароазы-01; SEQ ID NO: 03 или 04 для кароазы-02; SEQ ID NO: 05 для кароазы-03; SEQ ID NO: 06 для кароазы-04 и SEQ ID NO: 07 для кароазы-05 соответственно, или комплементу любой из них. В другом предпочтительном воплощении полипептид по изобретению, соответствующий кароазе 01-05, по меньшей мере на 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, отображенной в любой из SEQ ID NO: 08-12 соответственно.-6 015800 Полинуклеотиды Данное изобретение предлагает полинуклеотиды, кодирующие отбеливающий фермент (пероксидазу), условно называемый кароаза 01-05, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии сSEQ ID NO: 08-12 или функциональные эквиваленты любого из них. Последовательность генов, кодирующая кароазу 01-05, была определена с помощью амплифицированной кДНК, полученной из Marasmius scorodonius. Последовательности, имеющие SEQ ID NO: 02 и SEQ ID NO: 04, кодирующие кароазу 01 и кароазу-02 соответственно, являются оптимизированными версиями генов, как это понимается, где оптимизация кодона имела место. Оптимизация кодона может быть осуществлена согласно способам,известным квалифицированному лицу в данной области, и особенно подходит для улучшения экспрессии гена в клетке-хозяине. Изобретение предлагает полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий пероксидазы кароазы 01-05. Соответственно изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 01-07 или функциональным эквивалентам любого из них. Обнаружение того, что SEQ ID NO: 01-07 на Marasmius scorodonius имеет отбеливающую активность, было очень удивительным, особенно потому, что последовательности имеют очень низкую гомологичность известным отбеливающим ферментам. Более конкретно, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, способному к гибридизации в жестких условиях, предпочтительно в крайне жестких условиях, с полинуклеотидом, соответствующим SEQ ID NO: 01-07. Преимущественно такие полинуклеотиды можно получить из грибов,предпочтительно мицелиальных грибов, в частности из Marasmius scorodonius. Более конкретно, изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 01-07. В данном контексте и далее термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают открытую считывающую рамку, кодирующую белок, например отбеливающий фермент M. scorodonius. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, ген относится к молекуле изолированной нуклеиновой кислоты, как определено здесь. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, такая как молекула нуклеиновой кислоты,имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 01-07 или ее функциональный эквивалент, может быть выделена с использованием стандартных процедур молекулярной биологии и информации о последовательностях, предложенной здесь. Например, при использовании всей или части последовательности нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 01-07 в качестве гибридизационного зонда молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть выделены с использованием стандартных процедур гибридизации и клонирования (например, как описано в Sambrook, J., Fritsh, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning:Spring Harbor, NY, 1989). Более того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая всю или часть SEQ ID NO: 01-07, может быть выделена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе информации о последовательности, содержащейся в SEQ ID NO: 01-07. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК,мРНК или альтернативно, геномной ДНК, в качестве темплата, и соответствующих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными процедурами ПЦР-амплификации. Нуклеиновая кислота,амплифицированная таким образом, может быть клонирована в соответствующий вектор и охарактеризована с помощью анализа ДНК-последовательностей. Более того, олигонуклеотиды, соответствующие или способные к гибридизации в нуклеотидную последовательность по изобретению, могут быть приготовлены с помощью стандартных синтетических процедур, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора. В предпочтительном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, отображенную в SEQ ID NO: 01-07. Эта ДНК содержит последовательности, кодирующие полипептид кароазу 01-05 из M. Scorodonius, соответствующий SEQID NO: 08-12 соответственно. В другом предпочтительном воплощении понятие изолированная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, отображенной в SEQ ID NO: 01-07 или функциональным эквивалентам этой нуклеотидной последовательности. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна другой нуклеотидной последовательности, представляет собой такую молекулу, которая является достаточно комплементарной другим нуклеотидным последовательностям, так что она может гибридизоваться с другими нуклеотидными последовательностями, тем самым образуя стабильный дуплекс. Один объект изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид по изобретению, или к их функциональным эквивалентам, таким как биологически-7 015800 активный фрагмент или домен, так же, как и к молекулам нуклеиновых кислот, адекватным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, и фрагментам таких молекул нуклеиновых кислот, подходящих для использования в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутации молекул нуклеиновой кислоты."Изолированный полинуклеотид" или "изолированная нуклеиновая кислота" представляют собой ДНК или РНК, которая не непосредственно контактирует с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она непосредственно контактирует (одной на 5'-конце и одной на 3'-конце) в геноме, естественно встречающемся в организме, из которого он был получен. Таким образом, в одном воплощении изолированная нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'-некодирующие (например, промотор) последовательности, которые непосредственно контактируют с кодирующей последовательностью. Термин поэтому включает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующийся плазмид или вирус или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует как отдельная молекула (например, кДНК или геномный фрагмент ДНК, продуцированный путем ПЦР или при обработке рестрикционной эндонуклеазой) независимо от других последовательностей. Он также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, которая, по существу, не содержит клеточный материал, вирусный материал или культурную среду (если она была продуцирована методом рекомбинантных ДНК), или химические предшественники, или другие химические вещества (если она была химически синтезирована). Более того, "изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который не является естественно встречающимся как фрагмент и не может быть обнаружен в естественном состоянии. В данном контексте термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты " предназначены для охватывания ДНК молекул (например, кДНК или геномной ДНК) и РНК молекул (например,мРНК) и аналогов ДНК или РНК, генерированных с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием олигонуклеотидных аналогов или производных (например, нуклеотидов инозина или фосфоротиоата). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для приготовления нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности к спариванию оснований или повышенную резистентность к нуклеазам. Другое воплощение изобретения предлагает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой по отношению к молекуле кароазной 01-05 нуклеиновой кислоты, например, кодирующую цепь молекулы кароазной 01-05 нуклеиновой кислоты соответственно. Также в рамки изобретения включены комплементарные цепи молекул нуклеиновой кислоты, описанные здесь. Ошибки секвенирования Информацию о последовательностях, как она представлена здесь, не следует толковать так узко,чтобы потребовалось включение ошибочно считанных оснований. Конкретные последовательности, раскрытые здесь, могут быть легко использованы для выделения полного гена из грибов, в частности M.Scorodonius, которые, в свою очередь, могут легко быть подвергнуты дальнейшим секвенциальным анализам, что, тем самым, выявляет ошибки секвенирования. Если не указано обратное, все нуклеотидные последовательности, определенные путем секвенирования молекулы ДНК, здесь определяли с использованием автоматического ДНК-секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированные ДНК-молекулами, определенными здесь,были предсказаны трансляцией ДНК-последовательности, как она определена выше. Поэтому, как является известным в данной области для любой ДНК-последовательности, определенной с помощью этого автоматического подхода, любая нуклеотидная последовательность, определенная здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определенные с помощью автоматики,обычно являются по меньшей мере приблизительно на 90% идентичными, более обычно по меньшей мере приблизительно на величину от 95% до по меньшей мере приблизительно 99,9% идентичными реальной нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Реальная последовательность может быть более точно определена с использованием других подходов, включающих способы секвенирования ДНК вручную, хорошо известные в данной области. Как также известно в данной области, единичное включение или делеция в определенной нуклеотидной последовательности, по сравнению с реальной последовательностью, вызовет сдвиг рамки при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодированная определенной нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличной от аминокислотной последовательности, реально кодированной секвенированной молекулой ДНК, начиная с точки такого включения или делеции. Квалифицированное лицо в данной области способно выявить такие ошибочно считанные основания и знает, как исправить такие ошибки. Фрагменты нуклеиновых кислот, зонды и праймеры Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, отображенной в SEQ ID NO: 01-07, например фрагмент, кото-8 015800 рый может быть использован как зонд или праймер, или фрагмент, кодирующий часть белка кароазы 0105. Нуклеотидная последовательность, определенная клонированием гена кароаз 01-05 и кДНК, позволяет генерировать зонды и праймеры, предназначенные для использования при считывании и/или клонировании других членов семейства кароаз 01-05, так же, как и гомологов кароаз 01-05 из других видов. Зонд/праймер обычно содержит существенно очищенный олигонуклеотид, который обычно содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно в крайне жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 12 или 15, предпочтительно приблизительно 18 или 20,предпочтительно приблизительно 22 или 25, более предпочтительно приблизительно 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, или 75, или более последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, отображенной в SEQ ID NO: 01-07 или функциональными эквивалентами любой из них. Зонды на основе кароазных 01-05 нуклеотидных последовательностей могут быть применены для детектирования транскриптов или геномных последовательностей кароаз 01-05, кодирующих такие же или гомологичные белки, например, в других организмах. В предпочтительных воплощениях зонд, более того, содержит меченую группу, присоединенную к нему, например меченой группой могут быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или ферментный кофактор. Такие зонды могут также быть использованы, как часть набора диагностических тестов для идентификации клеток, которые экспрессируют белок кароаза 01-05. Идентичность и гомологичность Термины "гомологичность" или "процент идентичности" применяются взаимозаменяемо здесь. Для целей этого изобретения определено здесь, что для того, чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, разрывы могут быть введены в первую аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновых кислот для оптимального совпадения со второй последовательностью аминокислот или нуклеиновых кислот). Остатки аминокислот или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных позициях или нуклеотидных позициях затем сравнивают. Когда позиция в первой последовательности занята таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как в соответствующей позиции во второй последовательности, тогда молекулы идентичны в этой позиции. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = количество идентичных позиций/общее количество позиций (т.е. перекрывающихся позиций)100). Предпочтительно две последовательности имеют одинаковую длину. Квалифицированное лицо осведомлено о том факте, что несколько различных компьютерных программ являются доступными для определения гомологичности двух последовательностей между собой. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей может быть выполнено с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970, который включен в программуGAP в пакете программ GCG (доступную на http://www.accelrys.com/solutions/bioinformatician/), с использованием либо матрицы Blossom 62, либо матрицы PAM250, и веса замены 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса совпадения 1, 2, 3, 4, 5, или 6. Квалифицированное лицо оценит, что все эти различные параметры дают слегка различные результаты, но что общий процент идентичности двух последовательностей незначительно различается при использовании различных алгоритмов. В еще одном воплощении процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей определяют с использованием программы GAP из пакета программ GCG с применением матрицы NWSgapdna.CMP и веса замены 40, 50, 60, 70 или 80 и веса совпадения 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении процент идентичности двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма E. Meyers и W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989, который включен в программуPAM120 веса остатка, штрафа за продолжение делеции, равного 12, и штрафа за делецию, равного 4. Последовательности нуклеиновых кислот и белковые последовательности данного изобретения могут далее быть использованы как "запрашиваемая последовательность" для осуществления поиска по общедоступным базам данных, для того, например, чтобы идентифицировать другие члены семейства или родственные последовательности. Такой поиск может быть осуществлен с использованием программNBLAST и XBLAST (версия 2.0) of Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10. BLAST-нуклеотидный поиск может быть осуществлен с помощью программы NBLAST, где вес выравнивания = 100, длина слова =12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам кароазных 01-05 нуклеиновых кислот по изобретению. Поиск белков по BLAST может быть осуществлен с помощью программ XBLAST, где вес выравнивания = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам кароазных 01-05 нуклеиновых кислот по изобретению. Для получения выравниваний пробелов в целях сравнения Gapped BLAST может быть использована, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acid Res., 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST иGapped BLAST могут быть использованы дефолт-параметры соответствующих программ (например,-9 015800XBLAST и NBLAST), см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Гибридизация В данном контексте термин "гибридизующие" предназначен для описания условий гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, по меньшей мере приблизительно на 55%,по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85-90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичные друг другу, обычно остаются гибридизованными друг другом. Предпочтительным, неограничивающим примером таких гибридизационных условий является гибридизация в 6 хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45C, сопровождающаяся одним или более промываниями в 1SSC, 0,1% SDS при 50C, предпочтительно при 55C, предпочтительно при 60C и еще более предпочтительно при 65C. Крайне жесткие условия включают, например, гибридизацию при 68C в 5SSC/5 раствор Денхарда/1,0% SDS и промывание 0,2SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. Альтернативно, промывание может быть осуществлено при 42C. Квалифицированный специалист в данной области будет знать, какие условия применить для жестких и крайне жестких условий гибридизации. Дополнительные рекомендации относительно таких условий легко доступны в данной области, например в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory,Cold Spring Harbor Press, N.Y. и Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (JohnWileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли(A) последовательностью (такой как 3' терминальный поли(A)-тракт мРНК), или с комплементарным участком T (или U) остатков, не будет включен в полинуклеотид по изобретению, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, т.к. такой полинуклеотид стал бы гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли(A) участок или его комплемент (например, практически любой двухцепочечный кДНК-клон). Получение полномерной ДНК из других организмов При типичном подходе может быть проведен скрининг кДНК-библиотек, сконструированных из других организмов, например мицелиальных грибов, в частности из рода Marasmius. Например, может быть проведен скрининг штаммов Marasmius на гомологичные кароазные 01-05 полинуклеотиды с помощью блот-анализа Нозерна. При детектировании транскриптов, гомологичных полинуклеотидам по изобретению, кДНК-библиотеки могут быть сконструированы из РНК, выделенных из соответствующего штамма, с применением стандартных процедур, хорошо известных специалистам в данной области. Альтернативно, может быть проведен скрининг общей геномной библиотеки ДНК с использованием зонда, способного к гибридизации с полинуклеотидом по изобретению, соответствующим кароазам 01-05. Гомологичные генные последовательности могут быть выделены, например, путем осуществления ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе нуклеотидных последовательностей, как указано здесь. Темплатом для реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, которые, как известно, или, как предполагается, экспрессируют полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован, чтобы обеспечить то, чтобы амплифицированные последовательности представляли собой новые последовательности нуклеиновых кислот кароаз 01-05 или их функциональные эквиваленты. Фрагмент ПЦР может тогда быть использован для выделения клона полномерной кДНК множеством известных способов. Например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотек бактериофагов или космид кДНК. Альтернативно, меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки. ПЦР-технология также может быть использована для выделения полномерных кДНК-последовательностей из других организмов. Например, РНК может быть выделена с использованием стандартных процедур из соответствующего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть осуществлена на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного к самому 5'-концу амплифицированного фрагмента, для примирования синтеза первой нити. Полученный в результате РНК/ДНК гибрид может затем быть подвергнут "наращиванию" (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции с терминальной трансферазой, гибрид может быть гидролизован РНКазой H и затем может быть примирован синтез второй нити (например, с помощью поли-C праймера). Таким образом, обратные кДНК-последовательности амплифицированного фрагмента могут легко быть изолированы. Обзор удобных стратегий клонирования см., например, вSambrook et al., supra и Ausubel et al., supra. Векторы Другой объект изобретения относится к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белки кароазы 01-05 или их функциональные эквиваленты.- 10015800 В данном контексте термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Один тип вектора представляет собой"плазмиду", которую описывают, как петлю кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор,где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную природу репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомальные векторы млекопитающих) встраиваются в геном клеткихозяина при введении в клетку-хозяин и, тем самым, реплицируются совместно с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы описывают здесь как "векторы экспрессии". Как правило, векторы экспрессии, применяемые в технологии рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины "плазмида" и"вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо здесь, т.к. плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако изобретение направлено на то, чтобы включать такие другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы,аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые обслуживают эквивалентные функции. Рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению содержат нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантный вектор экспрессии включает одну или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, подлежащих использованию для экспрессии, которые оперативно связаны с последовательностью нуклеиновых кислот, подлежащих экспрессии. В рекомбинантном векторе экспрессии выражение "оперативно связана" предназначено для обозначения того, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, связана с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким способом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяин). Подразумевается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы управления экспрессией (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gent Expression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают те, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих разновидностях клеток-хозяев, и те,которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клеткехозяине (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Квалифицированные лица в данной области оценят, что дизайн вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформированию, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Векторы экспрессии по изобретению могут быть введены в клетки-хозяева, чтобы, тем самым, продуцировать белки или пептиды, кодированные нуклеиновыми кислотами, как описано здесь (например, белки кароазы 01-05, мутантные формы белков кароаз, фрагменты, варианты или их функциональные эквиваленты,слитые белки и т.д.). Рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут быть сконструированы для экспрессии белков кароаз 01-05 в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белки кароазы 01-05 могут быть экспрессированы в клетках грибов, бактериальных клетках, таких как E. coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных векторов экспрессии), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждают, кроме того, в Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован in vitro, например, с использованием T7 промотора регуляторных последовательностей и T7-полимеразы. Векторы экспрессии, пригодные для данного изобретения, включают хромосомные, эписомальные и производные от вирусов векторы, например векторы на основе бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы на основе их сочетаний, такие как производные плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, таких как космиды и фагемиды. ДНК-вставка должна быть оперативно связана с соответствующим промотором, таким как PL-промотор фага лямбда, lac, trp и tac промоторы E. coli, ранние и поздние SV40 промоторы и промоторы ретровирусных LTR, и это не все. Другие подходящие промоторы известны квалифицированному лицу. В конкретном воплощении являются предпочтительными те промоторы, которые способны управлять высоким уровнем экспрессии пероксидаз в прокариотах или мицелиальных грибах. Такие промоторы известны в данной области. Конструкты для экспрессии могут содержать сайты для инициирования транскрипции, терминации и на транскрибированном участке сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструктами, будет включать AUG, инициирующую трансляцию, в начале и кодон терминации, соответствующе расположенный на конце полипептида, подлежащего транслированию.- 11015800 Вектор ДНК может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки путем общепринятой трансформации или процедуры трансфекции. В данном контексте термины "трансформация" и"трансфекция" предназначены для описания множества известных в данной области процедур для введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включающих соосаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, DEAE-декстранопосредованную трансфекцию, трансдукцию,инфекцию, липофекцию, катионную липид-опосредованную трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформирования или трансфецирования клеток-хозяев можно найти в Sambrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и других лабораторных руководствах. Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что, в зависимости от вектора экспрессии и использованной процедуры трансфекции, лишь малая часть клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для того чтобы идентифицировать и вычленить эти интегранты, ген, который кодирует селектируемый маркер (например, резистентность к антибиотикам) обычно интродуцируют в клетку-хозяина совместно с геном, представляющим интерес. Предпочтительные селектируемые маркеры включают те, которые придают резистентность по отношению к лекарствам, таким как G418,гидромицин и метатрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же векторе, который кодирует белок кароазу 01-05, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы лекарственной селекцией (например, клетки, которые инкорпорировали селектируемый маркерный ген, выживут, в то время как другие клетки умрут). Экспрессию белков в прокариоты часто осуществляют в E.coli с помощью векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией либо слитых, либо неслитых белков. Векторы, соответствующие слитым белкам, присоединяют несколько аминокислот к белку, кодированному им, например к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие векторы, соответствующие слитым белкам, обычно служат трем целям: 1) увеличению экспрессии рекомбинантного белка; 2) увеличению растворимости рекомбинантного белка и 3) помощи в очистке рекомбинантного белка за счет действия в качестве лиганда при очистке белка методом аффинной хроматографии. Часто в векторы экспрессии, соответствующие слитым белкам, вводят сайт протеолитического расщепления в точке, соответствующей соединению слитого фрагмента и рекомбинантного белка для того, чтобы облегчить отделение рекомбинантного белка от слитого фрагмента, следующее за очисткой слитого белка. Такие ферменты и последовательности их когнатного распознавания включают фактор Xa, тромбин и энтерокиназу. Как показано, векторы экспрессии будут предпочтительно содержать селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или неомицин-резистентность для эукариотической клеточной культуры и тетрацилин- или ампицилин-резистентность для культивирования в E. coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящего хозяина включают бактериальные клетки, такие какE. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, таких как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как CHO, COS и Bowes melanoma; и клетки растений. Соответствующие культурные среды и условия для описанных клеток-хозяев известны в данной области. Среди векторов, предпочтительных для применения в бактериях, имеются pQE70, pQE60 и pQE-9,доступные из Qiagen; векторы pBS, векторы Fagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A,pNH46A, доступные из Stratagene и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные из Pharmacia. Среди предпочтительных эукариотических векторов имеются PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 иpSG, доступные из Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные из Pharmacia. Другие подходящие векторы будут легко очевидны квалифицированному специалисту. Известные бактериальные промоторы, применимые в данном изобретении, включают E. coli lacI иIacZ промоторы, T3 и T7 промоторы, gpt промоторы, лямбда PR, PL промоторы и trp промоторы, промотор HSV-тимидинкиназы, ранние и поздние SV40 промоторы, промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса ("RSV"), и промоторы металлотионеинов, такие как промотор металлотионеина-I мыши. Транскрипция ДНК, кодирующей полипептиды данного изобретения, высшими эукариотами может быть повышена путем включения энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры являются цисдействующими элементами ДНК, обычно приблизительно из 10-300 бп (bp), которые содействуют увеличению транскрипционной активности промотора в данном виде клетки-хозяина. Примеры энхансеров включают SV40 энхансер, расположенный на позднем участке источника репликации при бп 100-270,цитомегаловирусный энхансер раннего промотора, полиомный энхансер на позднем участке источника репликации и аденовирусные энхансеры. Для секреции транслированного белка в люмен эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение соответствующий секреторный сигнал может быть включен в экспрессированный полипептид. Сигналы могут быть эндогенными к полипептиду или они- 12015800 могут быть гетерологичными сигналами. Полипептид может быть экспрессирован в модифицированной форме, такой как слитый белок, и может включать не только секреторные сигналы, но и дополнительные гетерологичные функциональные участки. Таким образом, например, участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлен на N-конце полипептида для улучшения стабильности и персистентности в клетке-хозяине во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также пептидные фрагменты могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки. Клетки-хозяева В другом воплощении изобретение описывает клетки, например трансформированные клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, охватываемую изобретением. "Трансформированная клетка" или "рекомбинантная клетка" представляет собой клетку, в которую (или предшественнику которой) была введена с помощью процедуры рекомбинантных ДНК нуклеиновая кислота по изобретению. В прокариотические и эукариотические клетки включены, например, бактерии, грибы, дрожжи и т.п. Примерами подходящих клеток-хозяев являются Microcystis, Lepista, например L. irina, Cyathus например C. pallidus, Ganoderma, например G. applanatum, Ischnoderma, например I. benzoinum, Marasmius, например, M. scorodonius, Trametes, например Т. suaveolens of T. versicolor, Cryptococcus, напримерC. laurentii, Hypomyces, например H. odoratus или Phaffia, например P. rhodozyma, Phanerochaete, например Р. chrysosporium, Lentinula, например L. edodes, Coprinus, например C. cinereus, Gloeophyllum, например G. trabeum, Ophiostoma, например O. piliferum, Aspergillus, например A. niger, A. oryzae, A. nidulans, Thermomyces, например T. lanuginosa, Sporotrichum, например S. thermophile, Aureobasidium, например A. pullulans, Amorphotheca, например A. resinae, Leucosporidium, например L. scottii, Cunninghamella,например C. elegans. Особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности Aspergillus,например Aspergillus oryzae или Aspergillus niger, и Marasmius, например Marasmius scorodonius, или клетки из дрожжей, таких как Pichia, например Pichia Pastoris, или клетки из бактерий. Может быть выбрана клетка-хозяин, которая модулирует экспрессию внесенных последовательностей или модифицирует и обрабатывает генные продукты конкретным, желаемым способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут облегчить оптимальное функционирование белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, известные лицам, квалифицированным в данной области молекулярной биологии и/или микробиологии, могут быть выбраны для того, чтобы обеспечить желаемую и правильную модификацию и обработку чужеродного экспрессируемого белка. Для этих последних эукариотических клеток-хозяев,которые обладают клеточным механизмом для правильной обработки первичного транскрипта, гликозилирование и фосфорилирование генного продукта может быть применено. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области. Клетки-хозяева также включают, но не ограничиваются клеточными линиями млекопитающих, такими как CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, и клеточными линиями хориоидного сплетения. При желании полипептиды по изобретению могут быть продуцированы стабильно-трансфецированными клеточными линиями. Целый ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, общедоступен, способы конструирования таких клеточных линий также общеизвестны,например, в Ausubel et al. (supra). Применение полипептидов по изобретению в промышленных процессах Другой объект изобретения содержит применение полипептидов по изобретению или их функциональных эквивалентов (далее описываемых как отбеливающие ферменты) в промышленных процессах, в качестве, например, детергентов, в ферментативных камнепромывных (stone-wash) процессах производства пищевых продуктов, например хлебобулочных изделий или молочных продуктов. Полипептид по изобретению может быть использован в качестве ферментного препарата или продуцирован in situ микроорганизмом, способным продуцировать указанный фермент. Ферментный препарат может быть получен из различных источников, например из растений, животных и микроорганизмов. Предпочтительно ферментный препарат получают из микроорганизма, т.к. микроорганизмы делают возможным получение фермента в промышленном масштабе контролируемым образом. Ферментный препарат, произведенный из микроорганизма, может быть получен с помощью классических процессов ферментирования выбранного микробного штамма или путем ферментирования микроорганизма, который подвергает оверэкспрессии полипептид по изобретению. Микроорганизм может быть бактерией, грибом или дрожжами. Примеры микроорганизмов, подходящих в качестве клеток-хозяев для неклассического ферментирования, указаны выше в абзаце, относящемся к клеткам-хозяевам. Ферментный препарат может также содержать другие подходящие ферменты, такие как, например,оксидоредуктазы, амилазы, липолитические ферменты, гидролизующие ферменты. Удивительно, но бы- 13015800 ло найдено, что в особенности сочетание оксидоредуктаз, например гексозооксидазы, пиранозооксидазы,мальтозооксидазного фермента или глюкозооксидазы имеет синергетическое действие на ферментативную активность отбеливающего фермента по изобретению. Оксидоредуктазу можно получить из различных источников, включая микроорганизмы. Предпочтительно применяется оксидоредуктаза из фунгальных источников, например из мицелиального гриба. Подходящей оксидоредуктазой является глюкозооксидаза, получаемая, например, из видов Aspergillus, таких как Aspergillus niger. Данное изобретение поэтому также относится к новым ферментным композициям полипептида по изобретению с оксидоредуктазой. Этот эффект даже усиливается в случае, если в аппликации, в которой применяется ферментный препарат по изобретению, присутствует субстрат, по отношению к которому оксидоредуктаза является активной. В случае если такой субстрат не присутствует, его можно также добавить в процесс. Примером такого субстрата является прибавление глюкозы при применении гексозооксидазы или глюкозооксидазы. Данное изобретение поэтому также относится к новой композиции, содержащей ферментный препарат,содержащей полипептид по изобретению и оксидоредуктазу, так же, как и субстрат для оксидоредуктазы. Изобретение, кроме того, относится к применению нового сочетания ферментов и новой композиции в процессе производства пищевого продукта по изобретению, который описан ниже. Удивительно, но было найдено, что полипептиды по изобретению или их функциональные эквиваленты могут быть использованы для увеличения белизны по меньшей мере части пищевого продукта. Предпочтительно отбеливающий полипептид по изобретению применяется в следующем процессе производства пищевых продуктов. Процесс производства пищевого продукта, в котором промежуточная форма указанных пищевых продуктов содержит пигмент, процесс, который содержит прибавление по меньшей мере одного полипептида по изобретению в количестве, которое эффективно увеличивает белизну по меньшей мере части пищевого продукта по сравнению с пищевым продуктом, во время производства которого указанный фермент не добавляют. Промежуточная форма пищевого продукта определена здесь как любая форма, которая возникает в процессе производства до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма может содержать отдельные виды использованного сырья и/или их смесь, и/или смеси с добавками, и/или технологические добавки, или последовательно образующиеся их формы. Полипептид по изобретению добавляют в эффективных количествах. Квалифицированное лицо может легко определить это эффективное количество путем варьирования дозировки фермента и измерения степени разложения пигментов и/или повышения белизны конечного пищевого продукта. В случае, если фермент способен превращать -каротин, эффективное количество фермента может быть выражено в терминах единиц -разложения (например, единиц Азиза (Aziz) или Зорна (Zorn), см. "Материалы и методы"). Пищевой продукт может быть приготовлен по меньшей мере из одного вида сырья, которое имеет растительное происхождение, такого как пшеничная мука. Известно, что последняя содержит пигменты,такие как каротиноиды (каротины и ксантофиллы) и флавоны, которые отвечают, например, за цвет мякиша испеченного хлеба. Альтернативно, эти пигменты могут происходить из источников иных, чем растительное сырье, например из молока. Примерами каротиноидов являются, кроме того, вещества на основе каротина, в частности на основе -каротина или капсантина, более конкретно -каротин и каротин, лютеин, ликопен, антераксантин, капсантин, зеаксантин, виолаксантин, астаксантин, кантаксантин, лютеоксантин, неоксантин, и соответствующие апо-каротиноиды. Предпочтительным пищевым продуктом для способа по изобретению является испеченный хлеб и другие испеченные продукты из пшеничной муки и/или муки из других натуральных зерновых. Например, для пищевого продукта "испеченный хлеб" промежуточные формы содержат, например,пшеничную муку, ее исходную смесь с другими ингредиентами хлеба, такими как, например, вода, соль,дрожжи и композиции, улучшающие хлеб, перемешанное тесто, замешанное тесто, заквашенное тесто и частично пропеченное тесто. В случае, если фермент способен превращать -каротин, фермент добавляют к пшеничной муке и/или муке из других натуральных зерновых, или к любой исходной смеси с другими ингредиентами хлеба в таком количестве, которое дает между 1 и 5000 единиц Зорна на 1 кг муки,предпочтительно между 5 и 1000 единиц Зорна на 1 кг муки, более предпочтительно между 10 и 500 единицами Зорна на 1 кг муки и наиболее предпочтительно между 25 и 250 единиц Зорна на 1 кг муки. Фермент может также быть добавлен вместе с или в качестве части смеси улучшителя хлеба с другими улучшающими тесто и/или хлеб технологическими добавками, известными в данной области, такими как один или более ферментов, известных в данной области (например, амилолитические ферменты, такие как -амилаза, -амилаза, амилоглюкоксидаза, противоочерствитель мальтогенная -амилаза, липолитические ферменты, такие как липаза, фосфолипаза, галактолипаза, окисляющие ферменты, такие как глюкозооксидаза, херозооксидаза, лакказа, пиранозооксидаза, карбогидратооксидаза, хемицеллюлолитические ферменты, такие как ксиланаза, арабинофуранозидаза, целлюлолитические ферменты, такие как эндоглюканазы (такие как целлюлазы), целлобиогидролазы, протеазы и/или химические технологические- 14015800 добавки, известные в данной области, такие как восстанавливающие и окисляющие агенты (например,аскорбиновая кислота, глютатион), эмульгаторы (например, DATEM) и т.д.). Для некоторых видов макаронных изделий белизна продукта является желательной. Например, для макаронных изделий промежуточные формы содержат, например, пшеничную муку, исходную смесь ее с водой, солью и другими ингредиентами макаронных изделий, смешанное тесто и конечный макаронный продукт, который может быть свежим, сухим, подвергшимся кипячению, паровой обработке и/или обжариванию. Пищевой продукт может также быть молочным продуктом. Под молочными продуктами подразумевают продукты, которые содержат по меньшей мере 10 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 30 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 50 мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70 мас.% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80 мас.% в расчете на сухие твердые компоненты, происходящие из молока, предпочтительно коровьего молока. Компонентами, происходящими из молока, являются, например, жиры, белки, например сывороточный сырный сгусток и казеин и т.д. Натуральное молоко, особенно коровье молоко, может содержать окрашивающие соединения, такие как каротиноиды, например -каротин. Белизна играет важную роль, например, в сырах, жидком масле, сухом молоке или продуктах из молочной сыворотки. Например, для сыров, таких как Feta, Mozzarella, Ricotta и голубых сыров, например Danish Blue, Roquefort или Gorgonzola, белизну считают желательной. В сырах, где козье или овечье молоко, по меньшей мере, частично замещают коровьим молоком, белизна сыра может представлять проблему из-за -каротина, который присутствует в коровьем молоке. Для некоторых сыров натуральные окрашивающие агенты, такие как аннато или -каротин применяются в качестве агентов, окрашивающих пищевой продукт. Однако этот окрашивающий агент будет также присутствовать в сыворотке. Когда эту сыворотку далее перерабатывают, например, в детскую молочную смесь, цвет сывороточного продукта может быть нежелательным. Для пищевого продукта"мягкий сыр" промежуточные продукты содержат, например, молоко и сырный сгусток. Измерение белизны продукта может быть сделано визуально или путем измерения отражения, например, сканированием. При измерении отражения цвета количественно оценивают тремя параметрами:L-фактор (от черного = 0 до белого = 100), a-фактор (от зеленого = -60 до красного = +60) и b-фактор (от синего = -60 до желтого = +60). В случае каротиноидов b-фактор произведенного продукта предпочтительно настолько близок к 0, насколько возможно, предпочтительно между 10 и 0, более предпочтительно между 5 и 0 и еще более предпочтительно ниже чем 1, и наиболее предпочтительно ниже чем 0,5. По дополнительному объекту изобретение предлагает пищевой продукт, получаемый с помощью способа по изобретению, как описано здесь. Эти пищевые продукты характеризуются наличием по меньшей мере частей, обладающих значимо повышенной белизной, по сравнению с пищевыми продуктами, получаемыми способами производства, которые не содержат прибавление одного или более ферментов, способных превращать пигменты в промежуточных продуктах. По еще одному объекту изобретение предлагает применение ферментов, способных преобразовывать пигменты, для отбеливания пищевых продуктов, например продуктов на основе муки или произведенных из молока. Удивительно, было найдено, что эти ферменты могут преимущественно быть использованы в качестве пятновыводителей в домашних детергентах. В частности, ферменты оказались очень эффективными для удаления окрашенных пятен, например пятен от травы, пятен от кофе и чая, как с хлопчатобумажных, так и с синтетических (например, полиэстер) тканей. Более того, ферменты могли бы также быть использованы в ферментативных процессах полного отбеливания (stone-bleaching), например при отбеливании краски индиго на синих джинсах до желаемого уровня. Материалы и методы Измерение степени превращения -каротина. Измерение степени разложения -каротина по Азизу. Ферментная активность может быть определена как активность в превращении -каротина согласноA. Ben Aziz (1971), Phytochemistry 10, 1445. Одна ферментная единица определена здесь как количество фермента, которое превращает 1 мкг -каротина в минуту (далее именуется как Азиз-единица). Измерения степени разложения -каротина по Зорну. Ферментную активность можно также определять как активность в превращении -каротина согласно Zorn et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 62:331-336. Одна ферментная единица определена здесь как количество фермента, которое превращает 1 мкмоль -каротина в 1 мин (далее именуется как Зорн-единица). Анализ осуществляли следующим образом: 1,5 мл образца, содержащего фермент, преинкубировали в кювете при 27C в течение 5 мин перед тем, как добавить 100 мкл сток-раствора-каротина (см. далее ниже). При необходимости концентрированный супернатант культуры разбавляли буфером лимонная кислота/фосфат с pH 5,5 (этот буфер готовили путем смешивания 43 мл 0,1 М лимонной кислоты с 56 мл 0,2 М раствора Na2PO4). Снижение адсорбции наблюдали в течение 15 мин при 450 нм и 27C с использованием спектрофотометра в держателе ячеек с контролем температуры. Кривую проверяли на линейность и ферментную активность рассчитывали по линейной части кривой по сле- 15015800 дующему уравнению:E - уменьшение адсорбции при 450 нм в 1 мин;d - толщина кюветы, см. Ферментную единицу по Азизу можно перевести в Зорн-единицу путем деления Азиз-единиц на молекулярную массу -каротина = 536,85. Приготовление сток-раствора -каротина. Сток-раствор -каротина готовили следующим образом: 5 мг -каротина и 500 мг Твин-80 растворяли в 50 мл дихлорметана. Дихлорметан отгоняли при 40C и 800 мбар в роторном испарителе. После того как почти весь дихлорметан отогнали, добавляли 30 мл воды и остаток дихлорметана элиминировали в роторном испарителе и под конец в токе азота. Полученный в результате раствор фильтровали и дополняли до 50 мл водой в градуированной колбе. Раствор следует хранить на холоде (холодильник), и он является стабильным лишь в течение нескольких дней. Отбеливание пищевых продуктов Степень отбеливания определяли после экстрагирования каротиноидов из мякиша или теста, как показано Gelinas, Cereal Chem., 75, 810-184 (1998). Каротиноиды определяли посредством полного экстрагирования липидов из хлебного мякиша, как показано Gelinas (1998). Белизну пищевого продукта можно определять как визуально, так и путем измерения отражения. Визуальный осмотр может быть осуществлен путем сравнения пищевых продуктов, к которым добавляют отбеливающий фермент, с контрольным образцом без добавления отбеливающего фермента. Измерения отражения могут быть осуществлены путем сканирования пищевого продукта на цветовом сканере(Hewlett Packard Scanjet ADF). Эти данные можно анализировать с использованием программыLabSMART (LabSMART, LLC, Logan Utah, USA). Пример 1. Культивация и определение активности фермента, преобразующего -каротин, полученного из Marasmius scorodonius. Культивация и определение активности ферментов, преобразующих -каротин: кароазы-1 и кароазы-2, полученных из Marasmius scorodonius, осуществляли, как описано Зорном с сотр. (2003). Для этого мицелий из коллекции культур Marasmius scorodonius (получаемой из Centraal Bureau voor Schimmelcultures - Utrecht, Голландия, с депозитным номером CBS 137.83) использовали для инокуляции на агаровых пластинах с добавлением эмульгированного -каротина. Инкубирование пластин осуществляли при 24C в течение 14 дней. Качалочные колбы объемом 300 мл, содержащие 100 мл стандартного питательного раствора (SNL, содержащий 30 г/л глюкозы-H2O; 4,5 г/л аспарагинаH2O; 1,5 г/л KH2PO4; 0,5 г/л MgSO4; 3,0 г/л экстракта дрожжей; 1 мл/л стерилизованного раствора следовых элементов, содержащего 5 мг/лCuSO45aq, 80 мг/л FeCl36aq, 90 мг/л ZnSO47aq, 30 мг/л MnSO41aq и 40 мг/л ЭДТА; pH доводили до 6,0 с помощью 1 N NaOH перед стерилизацией) инокулировали мицелием и инкубировали при 24C в течение 7 дней в качалочном инкубаторе при 150 об/мин. Прекультуры проверяли на отсутствие микробных загрязнений, гомогенизировали с помощью Ultra Turrax и использовали для инокуляции основных культур (250 мл в 500 мл колбах Эрленмейера). Начиная со второго дня, каждый день отбирали образцы объемом по 2 мл, центрифугировали для удаления мицелия и измеряли активность с помощью спектрофотометрического анализа. После 4 дней культивации активность -разложения составляла примерно 0,3 Зорн-единицы на 1 л супернатанта, не содержащего клетки. Пример 2. Действие H2O2 на активность ферментов, преобразующих -каротин: кароазы-1 и кароазы-2, полученных из M. scorodonius. Действие 10 мкл 20 мМ перекиси водорода (H2O2) определяли в ходе in vitro анализа разложения-каротина, как описано выше. Концентрированные супернатанты культур M. scorodonius, содержащие кароазу-1 и кароазу-2, использовали. Активность разложения -каротина повышалась от 4,3 до 10,9 мЕ в присутствии H2O2. Когда использовали фермент, инактивированный нагреванием, совсем никакого разложения -каротина не наблюдалось. Это ясно показало, что H2O2 стимулирует активность разложения-каротина ферментом, разлагающим -каротин. Пример 3. Действие глюкозооксидазы (GOX) из Aspergillus niger на активность кароазы-1 и кароазы-2, полученных из M. scorodonius. 50 мкл концентрированного супернатанта культуры M. scorodonius смешивали с 1290 мкл 50 мМ натриево-ацетатного буфера (pH 5,5). 160 мкл 500 мМ раствора глюкозы добавляли и смесь выдерживали в течение 5 мин при 27C. Глюкозооксидазу из Aspergillus niger получали из Fluka. Реакцию начинали прибавлением 0-2 мкл сток-раствора глюкозооксидазы (100 Е/мл, что соответствует активности 0-200 мЕGOX) и 100 мкл раствора -каротина (приготовление, как упомянуто в "Материалах и способах"). Сни- 16015800 жение адсорбции регистрировали при 450 нм в течение 10 мин при 27C (табл. 1). Таблица 1 Разложение -каротина концентрированным супернатантом культуры M. scorodonius в присутствии 50 мМ глюкозы и различных доз GOX Во второй серии экспериментов концентрацию глюкозы варьировали, в то время как значение глюкозооксидазной активности сохраняли постоянным. Поэтому 50 мкл концентрированного супернатанта культуры M. scorodonius смешивали с 1434-1290 мкл 50 мМ натриево-ацетатного буфера (рН 5,5) и добавляли 16-160 мкл 500 мМ раствора глюкозы (табл. 2). Смесь выдерживали в течение 5 мин при 27C и реакцию начинали прибавлением 0-1 мкл GOX (что соответствует активности 0 или 100 мЕ) и 100 мкл раствора -каротина. Таблица 2 Разложение -каротина концентрированным супернатантом культуры M. scorodonius в присутствии различных концентраций глюкозы и дозировке глюкозооксидазы, равной 100 мЕ В скобках (50 мМ глюкозы, 100 мЕ GOX, без добавления супернатанта культуры) никакого разложения -каротина не наблюдали. Из этих экспериментов ясно, что присутствие GOX в присутствии глюкозы сильно стимулирует разложение -каротина концентрированным супернатантом M. scorodonius. Пример 4 и сравнительные примеры A, B и C. Тест по выпеканию булочек. В стандартном процессе выпекания булочки готовили из 200 г пшеничной муки (смеси 160 г пшеничной муки (Kolibri - Meneba, Голландия) и 40 г пшеничной муки (Ibis- Meneba, Голландия 1,4 г сухих дрожжей Fermipan (DSM Bakery Ingredients, Delft, Голландия), 4 г соли, 50 ppm аскорбиновой кислоты, 4 ppm фунгальной -амилазы Bakezyme P500 (DSM Food Specialties, Delft, Голландия),60 ppm фунгальной хемицеллюлазы Bakezyme HS2000 (DSM Food Specialties, Delft, Голландия) и такого количества фермента, разлагающего -каротин, как показано в табл. 3, и 116 мл воды в лопастном смесителе в течение 6 мин и 15 с. Температура теста составляла 28C. Непосредственно после смешивания тесто разделяли на две части по 150 г каждая, округляли и подвергали расстойке в течение 45 мин в расстойном шкафу при 30C, формовали и укладывали в формы. После окончательной расстойки в течение 70 мин при 30C тесто выпекали в течение 20 мин при 225C. После 24-часового хранения в закрытом боксе при комнатной температуре качество мякиша и цвет испеченного хлеба оценивал пекарь; количество каротиноидов определяли после экстрагирования хлебного мякиша, как показано в табл. 4. Таблица 3 Дозировка фермента (выраженная в Зорн-единицах на 200 г муки) Из табл. 4 можно заключить, что при добавлении отбеливающих ферментов по изобретению в тесто каротиноиды разлагаются, давая в результате более белый мякиш. Эффективность способа по изобретению лучше, чем для используемого фермента сои Липоксигеназы 2, и является, по меньшей мере, таким же или лучше, чем при применении ферментно-активной соевой муки. Пример 5. Приготовление мини-сыров. Миниатюрные сыры приготовляли, как описано Shakeel-Ur-Rehman et al. (Protocol for the manufacture of miniature cheeses in Lait, 78 (1998), 607-620). Сырое коровье молоко пастеризовали нагреванием в течение 30 мин при 63C. Пастеризованное молоко переносили в широкогорлые пластиковые центрифужные бутылочки (200 мл на бутылочку) и охлаждали до 31C. После этого 0,72 мл стартовой культурыDS 5LT1 (DSM Gist B.V., Delft, Голландия) добавляли к каждым 200 мл пастеризованного молока в центрифужной бутылочке и молоко сквашивали в течение 20 мин. Затем добавляли CaCl2 (132 мкл 1 мольл-1 раствора на 200 мл сквашенного молока), что сопровождали прибавлением коагулянта (0,04 IMCU на 1 мл). В случае, когда эксперимент включал применение кароазы-01 и кароазы-02, этот фермент добавляли вместе с коагулянтом. Растворы молока выдерживали в течение 40-50 мин при 31C до того, как сформируется сгусток. Сгусток разрезали вручную резаком из натянутой проволоки, находящейся на расстоянии 1 см от рамки. Разрез оставляли затягиваться в течение 2 мин, что затем сопровождали осторожным перемешиванием в течение 10 мин. После этого температуру повышали постепенно до 39C в течение 30 мин при непрерывном перемешивании смеси сгусток/сыворотка. По достижении pH, равного 6,2, смесь сгусток/сыворотка центрифугировали при комнатной температуре в течение 60 мин при 1,700 g. Сыворотку отжимали, а сгустки держали на водяной бане при 36C. Сыры переворачивали каждые 15 мин до того,как pH уменьшалось до 5,2-5,3, а затем центрифугировали при комнатной температуре при 1,700 g в течение 20 мин. После дальнейшего отжима сыворотки степень отбеливания сыра определяли путем сканирования. Применение отбеливающих ферментов кароазы-01 и кароазы-02 приводило к более белым сырам. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Изолированный полипептид, обладающий отбеливающей активностью и одной или более характеристиками, выбранный из группы, состоящей из:a. изолированного полипептида в соответствии с любой из SEQ ID NO: 8-12 или функциональных эквивалентов любого из них, причем указанные функциональные эквиваленты являются по меньшей мере на 65% идентичными любой последовательности SEQ ID NO: 8-12;b. изолированного полипептида, получаемого путем экспрессии полинуклеотида в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-7 или функциональных эквивалентов любого из них, или вектора, содержащего указанные полинуклеотиды или функциональные эквиваленты любого из них, в соответствующей клетке-хозяине, например Aspergillus niger, причем функциональный эквивалент любой последовательностиSEQ ID NO: 1-7 кодирует полипептид, по меньшей мере на 65% идентичный любой последовательностиc. полипептида, содержащего по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 13-17. 2. Изолированный полипептид по п.1, получаемый из Marasmius scorodonius. 3. Изолированный полинуклеотид, способный к гибридизации с полинуклеотидом, соответствующим SEQ ID NO: 01-07, или его функциональными эквивалентами, причем функциональный эквивалент любой последовательности SEQ ID NO: 1-7 кодирует полипептид, по меньшей мере на 65% идентичный любой последовательности SEQ ID NO: 8-12. 4. Изолированный полинуклеотид по п.3, способный к гибридизации в крайне жестких условиях с полинуклеотидом, соответствующим SEQ ID NO: 1-7, или его функциональными эквивалентами. 5. Изолированный полинуклеотид по п.3 или 4, получаемый из гриба, предпочтительно мицелиального гриба. 6. Изолированный полинуклеотид по п.5, получаемый из Marasmius, предпочтительноM. scorodonius. 7. Изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1. 8. Изолированный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полипептида, соответствующего SEQ ID NO: 8-12, или его функциональные эквиваленты, причем указан- 18015800 ные функциональные эквиваленты являются по меньшей мере на 65% идентичными любой последовательности SEQ ID NO: 8-12. 9. Изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1-7, или его функциональные эквиваленты, причем функциональный эквивалент любой последовательности SEQ ID NO: 1-7 кодирует полипептид, по меньшей мере на 65% идентичный любой последовательности SEQ ID NO: 8-12. 10. Изолированный полинуклеотид, соответствующий SEQ ID NO: 1-7. 11. Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по пп.3-10. 12. Вектор по п.11, где указанная полинуклеотидная последовательность по пп.5-11 оперативно связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии указанной полинуклеотидной последовательности в подходящей клетке-хозяине. 13. Вектор по п.12, где указанной подходящей клеткой-хозяином является мицелиальный гриб или бактерия. 14. Способ получения полинуклеотида по пп.3-10 или вектора по пп.11-13, включающий стадии культивирования клетки-хозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом или указанным вектором, и выделение указанного полинуклеотида или указанного вектора из указанной клетки-хозяина. 15. Изолированный полипептид, получаемый экспрессией полинуклеотида по любому из пп.3-10 или вектора по любому из пп.11-13 в соответствующей клетке-хозяине. 16. Рекомбинантный отбеливающий фермент, содержащий функциональный домен полипептида кароазы 01-05. 17. Способ получения полипептида по любому из пп.1, 2 или 15, включающий стадии трансформирования подходящей клетки-хозяина изолированным полинуклеотидом по любому из пп.3-10 или вектором по любому из пп.11-13, культивации указанной клетки в условиях, позволяющих экспрессию указанного полинуклеотида и, при необходимости, очищения кодированного полипептида от указанной клеточной или культурной среды. 18. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пп.3-10 или вектор по любому из пп.11-13. 19. Рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид по любому из пп.1, 2 или 15. 20. Применение полипептида по любому из пп.1, 2 или 15 для увеличения белизны пищевого продукта по сравнению с пищевым продуктом, для которого указанный полипептид не используется. 21. Способ производства пищевого продукта, промежуточная форма которого содержит пигмент,включающий добавление по меньшей мере одного полипептида по любому из пп.1, 2 или 15 в количестве, которое является эффективным для непосредственного превращения указанного пигмента в форму,которая приводит к увеличению белизны пищевого продукта, по сравнению с пищевым продуктом, в который указанный полипептид не добавляют в процессе его производства. 22. Способ по п.21, где пищевой продукт изготовляют из муки, предпочтительно пшеничной муки. 23. Способ по п.21, где пищевым продуктом является молочный продукт. 24. Способ по любому из пп.21-23, где пигмент является каротиноидом. 25. Способ по любому из пп.21-24, где фермент добавляют в виде ферментного препарата, производного из микроорганизма или приготовленного in situ микроорганизмом, способным продуцировать указанный фермент. 26. Способ по п.25, где фермент добавляют в виде ферментного препарата, производного из или продуцированного in situ бактерией, грибом или дрожжами. 27. Способ по п.26, где гриб принадлежит к виду Marasmius, предпочтительно Marasmius scorodonius. 28. Способ по любому из пп.21-27, где дополнительно добавляют оксидоредуктазу в процессе производства пищевого продукта. 29. Пищевой продукт, получаемый способом по любому из пп.21-28. 30. Применение полипептида по любому из пп.1, 2 или 15 для непосредственного превращения пигментов в форму, которая приводит к увеличенной белизне пищевого продукта. 31. Применение полипептида по любому из пп.1, 2 или 15 в качестве детергента или в ферментативных процессах глубокого отбеливания.