Пептиды, увеличивающие продукцию бактериоцинов, способы увеличения продукции бактериоцинов и выделенные бактериоцины

ПЕПТИДЫ, УВЕЛИЧИВАЮЩИЕ ПРОДУКЦИЮ БАКТЕРИОЦИНОВ,СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ БАКТЕРИОЦИНОВ И ВЫДЕЛЕННЫЕ БАКТЕРИОЦИНЫ В изобретении новые пептиды, продуцируемые бактериоцин-продуцирующими бактериями,стимулируют продукцию бактериоцинов in vitro. Бактерии-продуценты культивируют в присутствии новых бактерий-индукторов и пептида, имеющего карбокситерминальную последовательность VKGLT для того, чтобы осуществить увеличение продукции бактериоцина.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЕ ЮНАЙТЕД СТЭЙТС ОФ АМЕРИКА ЭЗ РЕПРЕЗЕНТИД БАЙ ДЕ СЕКРЕТЭРИ ОФ АГРИКАЛЧЭ(US); ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ (RU) 017633 Область изобретения Это изобретение относится к новым пептидам, которые стимулируют продукцию бактериоцинов бактериями-продуцентами в присутствии бактерий-индукторов, и к способам использования этих пептидов для продуцирования бактериоцина. Описание родственного уровня техники Нормальные кишечные бактерии являются критически важными для здоровья любого животногохозяина. Хозяин получает пользу от способствующих пищеварению метаболических процессов, опосредованных нативной бактериальной биотой. Что касается кишечных бактерий, то конкуренция и являющаяся ее результатом эволюция обеспечивают питательные вещества и жизненное пространство и увеличивают репродуктивный потенциал, что позволяет определенным штаммам и видам получать преимущество в выживании. В ходе бактериальной эволюции возникла продукция бактериоцинов. Бактериоцины являются антагонистами по отношению к другим организмам в пределах данной конкурентной ниши и таким образом обеспечивают экологическое преимущество. Эти бактериоцины, как правило,представляют собой низкомолекулярные полипептиды, и их классифицируют на основании различий в молекулярной массе (Klaenhammer, FEMS Microbiol. Rev., vol. 12-39-85, 1993). Эти соединения могут быть легко расщеплены до составляющих их аминокислот протеазными ферментами хозяина. Бактериоцины могут представлять собой существенный компонент преимуществ, возникающих из-за конкурентного исключения (Nurmi and Rantala, Nature, London, vol. 241, 210-211, 1973).Nurmi и Rantala (1973, см. выше) впервые описали преимущества конкурентного исключения в контроле колонизации сальмонеллой вылупившихся цыплят посредством использования неидентифицированной бактериальной флоры, полученной из фекалий здоровых взрослых птиц. Этот подход является привлекательной альтернативой существующим в настоящее время сельскохозяйственным практикам с использованием синтетических антибиотиков. Описана выделенная из слизистой оболочки способная к конкуретному исключению флора (Stern et al., патент США 5451400, выдан в сентябре 1995 г.) в виде анаэробной культуры, полученной из соскобов слизистой выстилки кишечника здоровых взрослых куриц. Эта неидентифицированная флора обеспечивала у цыплят великолепную защиту против колонизации Salmonella, однако демонстрировала только неустойчивый контроль колонизации Campylobacter(Stern, Poult. Sci, vol. 73, 402-407, 1994). Конкурентное исключение имеет место в кишечном тракте диких птиц и вносит вклад в экологию здорового кишечника. Микроорганизмы продуцируют множество разных соединений, которые демонстрируют антибактериальные свойства. Одна из групп этих соединений, бактериоцины, состоит из бактерицидных белков,у которых механизм действия такой же, как у ионофорных антибиотиков. Бактериоцины часто являются активными против видов, которые являются близкородственными продуценту бактериоцина. Их широкое распространение в видах бактерий, выделенных из комплексных микробных сообществ, таких как кишечный тракт, ротовая полость или другие эпителиальные поверхности, свидетельствует о том, что бактериоцины могут играть регуляторную роль в смысле популяционной динамики в бактериальных экосистемах. Бактериоцины определяют как продуцируемые бактериями соединения, которые имеют биологически активную белковую группировку и обладают бактерицидным действием (Tagg et al., Bacteriological Reviews, vol. 40, 722-256, 1976). Другие характеристики могут включать: (1) узкий спектр ингибиторной активности, сосредоточенный в области близкородственных видов; (2) присоединение к специфическим клеточным рецепторам; (3) плазмидные генетические детерминанты продукции бактериоцина и иммунитет клетки-хозяина к бактериоцину. Не полностью определенные антагонистические вещества были обозначены как "бактериоцин-подобные вещества". Некоторые бактериоцины, эффективные против грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных бактерий, имеют широкий спектр активности. Было предложено, что термин бактериоцин, когда его используют для описания ингибиторных агентов, продуцируемых грамположительными бактериями, должен отвечать следующим минимальным критериям: (1) представлять собой пептид и (2) обладать бактерицидной активностью(Tagg et al., см. выше). Для того чтобы сделать коммерческое использование бактериоцинов экономически выгодным, необходима оптимизация выхода в ходе продуцирования (Chen and Hoover, Comprehensive Reviews in FoodScience and Food Safety, vol. 2, 82-100, 2003). Chen и Hoover утверждают, что в случае продуцирования низина было установлено, что ключевыми факторами в ростовых средах являлось поддержание оптимального рН и обогащение среды специфичными питательными веществами для каждого штамма или штаммов, продуцирующего(их) бактериоцин.Knutsen et al. (Journal of Bacteriology, vol. 186 (10), 3078-3085, 2004) раскрывают бактериоцининдуцирующий пептид (BIP), состоящий из 27 аминокислот, который индуцирует продукцию бактериоцина в Streptococcus pneumoniae. Diep et al. (Molecular Biology, vol. 47 (2), 483-494, 2003) указывают на то, что согласно ряду сообщений ряд грамположительных бактерий используют так называемый основанный на пептидных феромонах путь передачи сигналов для регуляции продукции антимикробных пептидов, известных как бактериоцины, многочисленными молочно-кислыми бактериями. Они также раскрывают пептидный феромон, PlnA, который индуцирует продукцию бактериоцина. Van Belkum и Stiles(Nat. Prod. Rep., vol. 17, 323-335, 2000) сообщают о том, что некоторым бактериоцинам для их продукци-1 017633 рования требуются продукты регуляторных генов. Они утверждают, что эти гены кодируют секретируемые индукторные пептиды и белки, которые гомологичны гистидинкиназам и регуляторам ответных реакций. Эта ссылка дополнительно раскрывает то, что некоторые бактериоцины класса II индуцируются индукторным пептидом, в то время как другие, такие как карнобактериоцин В 2 и сакацин Р, индуцируются индукторным пептидом или подвергаются автоиндукции синтезированным бактериоцином. При том, что найдены различные пептиды, которые индуцируют продукцию бактериоцинов в бактериях, в данной области остается необходимость в комерческом получении бактериоцинов с использованием пептидов, которые увеличивают выход продукции бактериоцина in vitro. В изобретении предложены пептиды, которые отличаются от пептидов из предшествующего уровня техники, и предложен способ продуцирования больших количеств бактериоцинов для коммерческого использования. Краткое описание сущности изобретения Таким образом, задача изобретения состоит в том, чтобы предложить пептиды, которые стимулируют продукцию бактериоцинов in vitro. В задачу изобретения также входит предложение пептидов, которые стимулируют продукцию бактериоцинов in vitro и имеют карбокси-терминальную последовательность VKGLT (SEQ ID NO: 1). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO: 3). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT(SEQ ID NO: 5). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить пептид, имеющий аминокислотную последовательность WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT(SEQ ID NO: 7). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцинов in vitro, при котором пептид, имеющий карбокситерминальную последовательность VKGLT(SEQ ID NO: 1) добавляют к культуре бактериоцин-продуцирующих клеток. Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина OR-7 in vitro, при котором пептид, имеющий SEQ ID NO: 3, добавляют к культуре клеток Lactobacillus salivarius PVD-32 (NRRL B-30514). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 50-52 in vitro, при котором пептид, имеющий SEQ ID NO: 5, добавляют к культуре клеток Enterococcus faecium LWP 50-52 (NRRL B-30746). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 760 in vitro, при котором пептид, имеющий SEQ ID NO: 7, добавляют к культуре клеток Streptococcus cricetus LWP 760 (NRRL B-30745). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина линией клеток-продуцентов дополнительным включением индукторной клеточной линии. Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина OR-7 линией клеток-продуцентов Lactobacillus salivarius PVD-32 дополнительным включением индукторной клеточной линии Lactobacillus crispatus LWP 252 (NRRL B-30884). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукции бактериоцина 50-52 линией клеток-продуцентов Enterococcus faecium LWP 50-52 дополнительным включением индукторной клеточной линии Lactobacillus acidophilus LWP 320 (NRRL B-30510). Задача изобретения состоит также в том, чтобы предложить способ увеличения продукция бактериоцина 760 линией клеток-продуцентов Streptococcus cricetus LWP 760 дополнительным включением индукторной клеточной линии Lactobacillus acidophilus LWP 320. Дополнительные аспекты и преимущества этого изобретения должны стать очевидными из нижеследующего описания. Депонирование микроорганизмовfaecium, обозначенный как NRRL B-30746 (штамм LWP-50-52), были депонированы 3 мая 2004 г.; и Lactobacillus acidophilus, обозначенный как NRRL B-30510 (штамм LWP 320), был депонирован 3 августа 2001 г. Lactobacillus crispatus, обозначенный как NRRL B-30884 (штамм LWP 252), депонирован 4 ноября 2005 г. Все указанные штаммы были депонированы в соответствии с Будапештским договором соместно с U.S.D.A. Agricultural Research Service Patent Culture Collection (National Center for Agricultural UtilizationResearch, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604). Краткое описание чертежей Фиг. 1 А и 1 Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина OR-7 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия(SDS-PAGE) (А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гель наносили Campylobacter jejuni для определения того, какая(ие) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 1 дорожка 1 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 210012500 (Amersham Pharmacia Biotech): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 2, содержащая чис-2 017633 тый бактериоцин OR-7, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 5,5 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид из PVD-32,имела массу приблизительно 2,5 кДа. На фиг. 1 Б дорожка 1 содержит чистый бактериоцин OR-7, что соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела pI приблизительно 8,4. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из PVD-32, имела pI приблизительно 7,9. Дорожка 3 содержала стандарты pI (Protein Test Mixture I, Marker Proteins, Serva): 10,0, 9,2, 8,1, 6,9,5,5, 4,3. Фиг. 2 А и 2 Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина 50-52 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия(А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гели наносили Campylobacter jejuni для определения того, какая(ие) полоса(ы) соответствует антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 2 А дорожка 1 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 2100-12500(Amersham Pharmacia Biotech): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 2, содержащая чистый бактериоцин 50-52, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 3,9 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид для LWP-50-52,имела массу приблизительно 3,1 кДа. На фиг. 2 Б дорожка 1 содержит чистый бактериоцин 50-52, что соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела pI приблизительно 8,4. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из LWP-50-52, имела pI приблизительно 8,1. Дорожка 3 содержала стандарты pI (Protein Test Mixture I, Marker Proteins, Serva): 10,0, 8,1, 7,9, 6,4,5,5, 4,3, 4,1 и 3,8. Фиг. 3 А и 3 Б представляют собой фотографии, показывающие прямое выявление сигнального пептида и бактериоцина 760 после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (А) и изоэлектрофокусирования (Б). На гели наносили Campylobacter jejuni для определения того, какая(ые) полоса(ы) соответствует(ют) антимикробной активности, молекулярной массе и изоэлектрической точке. На фиг. 3 А дорожка 3 представляет собой маркеры молекулярной массы диапазона 2100-12500 (Amersham Pharmacia Biotech): 2100; 5780; 8400; 12500 Да. Полоса на дорожке 1, содержащая чистый бактериоцин 760, соответствует антимикробной активности, зона ингибирования роста имела массу приблизительно 5,5 кДа. Полоса на дорожке 3, содержащая чистый сигнальный пептид из LWP 760, имела массу приблизительно 2,1 кДа. На фиг. 3 Б полоса на дорожке 1, содержащая чистый бактериоцин 760, соответствует антимикробной активности; зона ингибирования роста имела pI приблизительно 9,5. Полоса на дорожке 2, которая содержит чистый сигнальный пептид из LWP-760, имела pI приблизительно 8,9. Дорожка 3 содержала стандарты pI (Protein Test Mixture I, Marker Proteins, Sen/a): 10,0, 8,1, 7,9, 6,4, 5,5, 4,3,4,1 и 3,8. Подробное описание изобретения Важность кишечных инфекций у людей признается все шире, и связь заражения домашней птицы и инфекции у человека хорошо документирована. Способность уменьшить эту опасность для здоровья вмешательствами на птицеводческих предприятиях также хорошо известна. При производстве и обработке бройлеров фекальные вещества, содержащие патогены, переносятся на мясо и сохраняются при кухонной обработке пищи. Метаболиты конкурирующих организмов могут вносить вклад в контроль таких патогенов, какHYD32), Streptococcus cricetus, обозначенный как NRRL В-30745 (штамм LWP-760); и Enterococcus faecium, обозначенный как NRRLB-30746 (штамм LWP-50-52), продуцируют новые бактериоцины, которые представляют собой объект находящейся на рассмотрении заявки на патент США 10/644927, поданной 21 августа 2003 г., и находящейся на рассмотрении заявки на патент США 10/426688, дата подачи 1 мая 2003, причем обе полностью включены сюда ссылкой. Эти штаммы также продуцируют новые пептиды,который стимулируют эти штаммы к продуцированию повышенных количеств бактериоцинов in vitro. В изобретении предложены новые сигнальные пептиды и штаммы, продуцирующие эти пептиды,новые индукторные штаммы, аминокислотные последовательности и способы использования новых пептидов и индукторных штаммов.Lactobacillus salivarius, PVD-32, (NRRL B-30514) продуцирует сигнальный пептид SEQ ID NO: 3. Он представляет собой аэробные грамположительные бациллы, способные к росту при приблизительно 37 С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями неправильной формы. Колонии имеют белый цвет и достигают приблизительно 3 мм в диаметре после аэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37 С.Enterococcus faecium, LWP 50-52 (NRRL B-30746) продуцирует сигнальный пептид SEQ ID NO: 5. Эти факультативно аэробные грамположительные кокки способны к росту при приблизительно 37 С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов, образуя колонии с краями неправильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 2 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования при приблизительно 37 в течение приблизительноStreptococcus cricetus, LWP-760 (NRRL B-30745) продуцирует сигнальный пептид SEQ ID NO: 7. Эти факультативно аэробные грамположительные кокки способны к росту при приблизительно 37 С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями правильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 1 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37 С.Lactobacillus acidophilus, LWP 320 (NRRL B-30510), является индукторным штаммом, который представляет собой факультативно аэробные граммположительные кокки и способен к росту при приблизительно 37 С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями неправильной формы. Колонии имеют белый цвет и достигают приблизительно 3 мм в диаметре после микроаэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37 С.Lactobacillus crispatus LWP 252 (NRRL B-30884) является индукторным штаммом, который представляет собой аэробные грамположительные кокки и способен к росту при приблизительно 37 С. Штамм растет на питательном агаре и агаре для определения количества микроорганизмов с образованием колоний с краями правильной формы. Колонии имеют серый цвет и достигают приблизительно 1 мм в диаметре после аэрофильного культивирования в течение приблизительно 24 ч при приблизительно 37 С. Сигнальные пептиды из штаммов, продуцирующих бактериоцины, были выделены и очищены. Клетки продуцентов в основном секретируют бактериоцины класса II посредством системы транспортации ABC (Haverstein et al., Mol. Microbiol., vol. 16, 229-240,1995; Gajic et al., J. Biol. Chem., vol. 36, 3429134298, 2003). Секреция некоторых бактериоцинов этого класса имеет место благодаря сигнальным пептидам, которые активируются Sec-транслоказой, локализованной на цитоплазматических мембранах(Cintas et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 63, 4321-4330, 1997; Doi et al., J. Biosci. Bioeng., vol. 93, 434436, 2002; Leer et al., Microbiology, vol. 141, 1629-1635, 1995; Martinez et al., Microbiology, vol. 145, 31553161, 1999; Tomita et al., J. Bacteriol., vol. 178, 3585-3593, 1999; Worobo et al., J. Bacteriol., vol. 177, 31433149, 1995 и Herranz et al., J. Appl. Environ. Microbiol., vol. 71 (4), 1959-1963, 2005). Другая функция сигнальных пептидов вероятно ассоциирована с бактериальным феноменом "quorum sensing" восприятие кворума), De Kievit et al, Infection and Immunity, vol. 68(9), 4839-4849, 2000; Dunny et al., in: Microbial Signaling and Communication, England et al. (eds.), University Press, Cambridge, United Kingdom, 117-138,1999;Dunning and Leonard, Annu. Rev. Microbiol., vol. 51, 527-564, 1997 и Kleerebezem et al., Mol. Microbiol.,vol. 24, 895-904, 1997). Сигнальный пептид либо в отдельности, либо в комплексе с метаболитами индукторного штамма активирует гистидин-протеинкиназу в продуценте, тем самым увеличивая продукцию бактериоцина. Для получения максимальной продукции пептида клетки, которые продуцируют сигнальные пептиды, такие как PVD 32, LWP 50-52 и LWP 760, культивировали приблизительно 2-10 ч в бульоне М 9, обогащенном аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из фенилаланина, триптофана,аланина и их смесей. Предпочтительное воплощение изобретения включает количества аминокислот в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1% для каждой аминокислоты, включенной в композицию. Среда, представляющая собой приблизительно 10% бульон для Brucella, приводит к продукции сигнального пептида в более низкой концентрации. Сигнальный пептид выделяют из супернатанта культуры, используя осаждение сульфатом аммония с последующими: (1) гель-фильтрацией с использованием хроматографии высокого разрешения на Superose 12 и (2) гидрофобной хроматографией на октил-сефарозе 6 В Fast Flow. Сигнальные пептиды по изобретению используют для увеличения продукции бактериоцинов in vitro клетками-продуцентами в присутствии бактерий-индукторов. Сигнальный пептид можно добавлять в любой момент времени в ходе культивирования бактерий-индукторов и продуцентов. Из подробного описания изобретения обычный специалист в данной области может легко определить, когда добавлять сигнальный пептид для достижения высоких уровней продукции бактериоцина по сравнению с продукцией бактериоцина в культурах, содержащих только пептид и продуцент или только и бактериииндукторы, и продуценты. Антагонистическая активность бактериоцинов, продуцируемых при использовании сигнального пептида и индукторного штамма бактерий, против С. jejuni и S. enteritidis оценивали при помощи капельного теста. Его стадии включают в себя внесение различных концентраций чистого препарата(мкг/мл) бактериоцина в объем приблизительно 10 мкл, наносимый на обогащенный кровью агар дляCampylobacter или питательный агар (агар МРА или Meta Peptone), предварительно засеянный клетками целевых бактерий. Чашки, содержащие культуры С. jejuni, инкубировали при приблизительно 42 С в микроаэробных условиях. Чашки, содержащие S. enteritidis, инкубировали при приблизительно 37 С в аэробных условиях. Активность бактериоцина выражали в произвольных единицах измерения (AU) на один миллилитр препарата, в котором появляется видимая зона ингибирования роста культуры (Henderson et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 295, 5-12, 1992; включено сюда ссылкой). Удель-4 017633 ную активность можно также выражать в произвольных единицах измерения на миллиграмм чистого бактериоцина. Сигнальные пептиды по изобретению включают любой пептид с карбокситерминальной последовательностью VKGLT (SEQ ID NO: 1), продуцируемый бактериоцин-секретирующими бактериями, который увеличивает продукцию бактериоцина при добавлении к культуре, включающей в себя бактериипродуценты или бактерии-продуценты и бактерии-индукторы. В рамках изобретения бактерия-индуктор определена как любая бактерия, которая при культивировании с бактериоцин-продуцирующей бактерией, то есть бактерией-продуцентом, и с сигнальным пептидом продуцента увеличивает продукцию бактериоцина по сравнению с продукцией культуры, содержащей только бактерию-продуцент и ее сигнальный пептид. В рамках изобретения термин "пептид" означает соединение по меньшей мере из двух или более аминокислот или аналогов аминокислот. Аминокислоты или аналоги аминокислот могут быть связаны пептидными связями. В еще одном воплощении аминокислоты могут быть связаны другими связями,например сложноэфирной, простой эфирной и т.д. Пептиды могут находиться в любой структурной конфигурации, включая линейные, разветвленные или циклические конфигурации. При использовании здесь термин "аминокислоты" относится к природным или синтетическим аминокислотам, в том числе D- илиL-оптическим изомерам, и к аналогам аминокислот. Производные и аналоги пептидов по изобретению включают, без ограничения, производные и аналоги, которые содержат в качестве первичной аминокислотной последовательности полную или частичную аминокислотную последовательность пептида, включая измененные последовательности, в которых функционально эквивалентные аминокислотные остатки заменены остатками в последовательности,приводящими к консервативной аминокислотной замене. Например, один или более чем один аминокислотный остаток в последовательности можно заменить другой аминокислотой с такой же полярностью, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит к скрытому изменению. Замены аминокислоты в последовательности можно выбирать из других членов того класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Аминокислотами, содержащими ароматические кольцевые структуры, являются фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин,цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Такие изменения нельзя считать значительно влияющими на кажущуюся молекулярную массу при определении электрофорезом в полиакриламидном геле или по изоэлектрической точке. Неконсервативные аминокислотные замены также можно водить для замены аминокислотой с особенно предпочтительным свойством. Например, Cys можно вести в потенциальный сайт для образования дисульфидных мостиков с другим Cys. Pro можно ввести по причине его особенно плоской структуры. Пептиды по изобретению можно синтезировать химическим путем. Синтетические пептиды можно получать при использовании хорошо известных методик твердофазной, жидкофазной или пептидной конденсации или любой их комбинации, и они могут включать природные и/или синтетические аминокислоты. Аминокислоты, используемые для синтеза пептидов, могут быть стандартной Вос(N-аминозащищенной Nтрет-бутилоксикарбонил)аминокислотной смолой при стандартных протоколах снятия защиты, нейтрализации, сочетания и промывки по исходному твердофазному способу Merrifield (J. Am.Chem. Soc, vol. 85, 2154, 1963), или лабильной при действии щелочи N-аминозащищенной 9 флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) аминокислотой (Carpino and Han, J. Org. Chem., vol. 37, 3403-3409,1972). Кроме того, способ по изобретению можно использовать с другими N-защитными группами, известными специалистам. Твердофазный пептидный синтез можно осуществлять методиками в пределах квалификации обычного специалиста в данной области (см., например, Stewart and Young, Solid PhaseSynthesis, Second Edition, Pierce Chemical Company, Rockford, III., 1984; Fields and Noble, Int J. Pept. Protein Res., vol. 35, 161-214, 1990) или при использовании автоматических синтезаторов. Нижеследующие примеры предназначены только для того, чтобы дополнительно иллюстрировать это изобретение и не предназначены для того, чтобы ограничить объем этого изобретения, определенный формулой изобретения. Пример 1. Клетки штаммов Enterococcus faecium LWP50-52, Streptococcus cricetus LWP-760 и LactobacillusBrucella, 10%-ный бульон для Brucella или М 9, обогащенная аминокислотами, как указано ниже в табл. 1. Колбы культивировали при вращении при приблизительно 37 С в течение приблизительно 2, 4, 6 и 8 ч. Скорость вращения составляла приблизительно 120 об/мин. Аликвоты культуральной жидкости центрифугировали при приблизительно 6000 g в течение приблизительно 15 мин при приблизительно -4 С. Пептиды выделяли осаждением белков приблизительно 40%-ным раствором (NH4)2SO4 при приблизи-5 017633 тельно 4 С в течение приблизительно 24 ч с последующей гель-фильтрацией с использованием хроматографии высокого разрешения на Superose-12 с отбором низкомолекулярных фракций. Эти фракции наносили на колонку для гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе 6 В Fast Flow и белки элюировали с использованием градиента приблизительно 0,4-0,9 М K2HPO в 0,1 М трис-буфере, рН 5,1. Результаты представлены ниже в табл. 1. Как видно из табл. 1, пептиды, выделенные из продуцентов PVD 32, LWP 50-52 и LWP 760, вляются низкомолекулярными и накапливаются в основном в культурах, содержащих голодные среды (М 9 + указаны аминокислоты). Таблица 1 Выделение и очистка индукторных пептидов из штаммов PVD-32, LWP-50-52 и LWP-760 Выделенный сигнальный пептид для PVD-32 обладает слабой антагонистической активностью против С. jejuni и S. Enteritidis, как определено капельным тестом. Его активность составляла приблизительно 200 AU/мл, а его молекулярная масса составляла приблизительно 2,5 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрическая точка (pI) составляла приблизительно 7,9 (фиг. 1 А и 1 Б). Выделенный сигнальный пептид для LWP50-52 не обладал антагонистической активностью против С. jejuni и S. enteritidis при определении капельным тестом. Его молекулярная масса составляла приблизительно 3,1 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а изоэлектрическая точка (pI) составляла приблизительно 8,1 (фиг. 2 А и 2 Б). Выделенный сигнальный пептид для LWP-760 не обладал антагонистической активностью по отношению к С. jejuni и S. enteritidis при определении капельным тестом. Его молекулярная масса составляла приблизительно 2,1 кДа при определении электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, и его изоэлектрическая точка составляла приблизительно 8,9 (фиг. 3 А и 3 Б). Пример 2. Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из клеток PVD-32, в продукции бактериоцина OR-7 клетки PVD-32 культивировали в колбах с приблизительно 300 мл приблизительно 10%-ного бульона для Brucella. К бульону добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток PVD-32,содержащей приблизительно 109 KOE (колониеобразующие единицы)/мл, также добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма LWP 252, содержащей приблизительно 109 KOE/мл,и приблизительно 0,10, 0,01 или 0,001 мг/мл сигнального пептида PVD 32. Контрольная проба не содержала сигнальный пептид. Некоторые пробы содержали другие концентрации сигнального пептида и штамма-продуцента без индукторного штамма. Две пробы содержали либо 0,1 мг/мл сигнального пептида из LWP 760, либо 0,1 мг/мл сигнального пептида из LWP-50-52 как с индукторным штаммом, так и со штаммом-продуцентом. Колбы культивирвали при приблизительно 37 С в течение приблизительно 14 ч при скорости перемешивания приблизительно 120 об/мин. Результаты суммированы ниже в табл. 2. По окончании 14 ч супернатант из культур помещали в центрифужные колбы на 500 мл с приблизительно одним миллилитром регенерирированной сефарозы SP Fast Flow (500:1 об./об.). Эту смесь инкубировали приблизительно 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Суспензию затем промывали при приблизительно 100 мл 0,2 М буфера трис-HCl с рН приблизительно 6,4. Бактериоцины элюировали центрифугированием с приблизительно 100 мл приблизительно 0,2 М K2HPO4, рН приблизительно 5,8, при приблизительно 7000 g в течение приблизительно 10 мин. Антагонистическую активность фракций бактериоцина против С. jejuni и S. enteritidis оценивали с помощью капельного теста, как описано выше. Уровень чистоты фракций бактериоцина определяли электрофорезом в полиакриламид-6 017633 ном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрические точки фракций определяли изоэлектрической фокусировкой. Концентрации белка для всех фракций бактериоцина определяли при 215 нм при использовании спектрофотометра. Результаты представлены в табл. 2 ниже. Как видно из табл. 2, культивирование PVD-32 (продуцент) с LWP-252 (индуктор) в присутствии приблизительно 0,01 мг очищенного сигнального пептида из PVD-32 увеличивает выход бактериоцинаOR-7 до приблизительно 214,5 мг из одного литра культуральной жидкости. Добавление сигнальных пептидов, выделенных из штаммов LWP 50-52 и LWP 760, не увеличивает выход бактериоцина OR-7 по сравнению с контролем. Это указывает на то, что сигнальный пептид является высокоспецифичным по отношению к продуценту. Синтез бактериоцина увеличивается, когда сигнальный пептид, продуцент и индуктор одновременно введены в культуральную жидкость. Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина при крупномасштабном культивировании продуцирующие и индуцирующие штаммы выращивали в биореакторе с приблизительно шестью литрами культуральной жидкости. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида составляло 109 KOE/мл PVD-32 (штамм-продуцент), 109 KOE/мл LWP-252 (индукторный штамм) и 0,01 мг/мл очищенного сигнального пептида из PVD-32. Бактериоцин OR-7 выделяли после приблизительно 8, 10, 12 и 14 ч культивирования, см. табл. 3. Схема очистки является такой, как описано выше. Эксперименты повторяли три раза. Таблица 2 Влияние сигнального пептида, выделенного из PVD-32, на продукцию бактериоцина OR-7-7 017633 Таблица 3 Культивирование штамма-продуцента PVD-32 и индукторного штамма LWP-252 в присутствии сигнального пептида PVD-32 в условиях большего масштаба Контроль: биореактор V-61, 10%-ный бульон для Brucella, PVD-32, LWP 252, при рН 6,9, 37 С, 150 об/мин, 14 ч культивирования. Сигнальный пептид: биореактор V-61, 10%-ный бульон для Brucella,PVD-32, LWP252, сигнальный пептид PVD-32 - 0,2 мг, рН 6,9, 37 С, 150 об/мин, 14 ч культивирования. Одновременное культивирование PVD-32 (штамм-продуцент) и LWP-252 (индукторный штамм) в присутствии специфичного сигнального пептида, выделенного из PVD-32, обеспечивает продукцию приблизительно 214-225 мг бактериоцина OR-7 на литр культуральной жидкости. Пример 3. Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из LWP 50-52, в продукции бактериоцина 50-52 культивирвали LWP 50-52 при 37 С, как описано выше в примере 2. К 10%-ному бульону для Brucella добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток LWP 50-52, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, добавляли к бульону приблизительно 109 KOE/мл индукторного штамма LWP-320,и также добавляли приблизительно 0,10, 0,01 или 0,001 мг/мл сигнального пептида LWP 50-52. Контрольная проба не содержала сигнальный пептид. Некоторые пробы содержали другие концентрации сигнального пептида и штамма-продуцента без индукторного штамма. Две пробы содержали либо 0,10 мг/мл сигнального пептида из LWP 760, либо 0,10 мг/мл сигнального пептида из PVD-32 как с индукторным штаммом, так и со штаммом-продуцентом. Колбы культивирвали при приблизительно 37 С в течение приблизительно 14 ч при использовании скорости перемешивания приблизительно 120 об/мин. Результаты суммированы ниже в табл. 4. Выделение бактериоцина 50-52 включает две стадии: (1) выделение бактериоцина из супернатанта культуральной жидкости и (2) выделение бактериоцина из осадка клеток обоих штамов, индукторного и продуцента. На стадии 1 культуры собирали и отделяли центрифугированием при приблизительно 10000g в течение приблизительно 15 мин для осаждения клеток. Супернатант наносили на колонку с октилсефарозой 4 Fast Flow для получения бактериоцина при использовании буфера для элюции, представляющего собой буфер K2HPO4 приблизительно 20 мМ с рН приблизительно 7,0. Осадок клеток со стадии 2 суспендировали в фосфатном буфере с приблизительно 0,7% NaCl, рН приблизительно 5,6 (буфер для элюции) и суспензию перемешивали и инкубировали приблизительно 20 мин. После инкубации суспензию центрифугировали при приблизительно 10000 g приблизительно 15 мин. Бактериоцин выделяли из супернатанта с помощью ионообменной хроматографии на Superose SP Fast Flow при использовании буфера для элюции, содержащего приблизительно 10 мМ трис-HCl и приблизительно 125 мМ NaCl, рН приблизительно 7,5. Антагонистические активности фракции бактериоцина против С. jejuni и S. enteritidis оценивали в капельном тесте. Уровень чистоты бактериоцинов определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрические точки фракций определяли при использовании изоэлектрической фокусировки. Концентрации белка для всех фракций бактериоцина определяли при приблизительно 215 нм с помощью спектофотометрического способа.-8 017633 Таблица 4 Влияние сигнального пептида, выделенного из LWP 50-52, на продукцию бактериоцина 50-52 Как видно из табл. 4, одновременное культивирования LWP 50-52 (штамм-продуцент) и LWP 320(индукторный штамм) в присутствии приблизительно 0,01 мг/мл сигнального пептида из LWP 50-52 в течение приблизительно 8 ч увеличивает выход бактериоцина 50-52 до приблизительно 353,1 мг из 1 л культуральной жидкости. Добавление сигнальных пептидов, изолированных из PVD-32 и LWP 760 не увеличивает выход бактериоцина 50-52 по сравению с контролем. Следует отметить, что синтез бактериоцина увеличивается максимально, если сигнальный пептид вводят в культуральную жидкость приблизительно через 2 ч после начала культивирования при суммарном времени культивирования приблизительно 12 ч. Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина при крупномасштабном культивировании продуцирующие и индуцирующие штаммы выращивали в биореакторе V-6 л, содержащем приблизительно 6 л среды. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида поддерживали, как в табл. 5, для условий 10%-ного бульона для Brucella, LWP 50-52, LWP 320, 0,01 мг/мл сиг- 11017633 нального пептида LWP 50-52, добавленного после приблизительно 2 ч культивирования. Выделение бактериоцина 50-52 осуществляли в моменты приблизительно 8, 10, 12 и 14 ч культивирования, как описано выше. Контроль содержал 10%-ный бульон для Brucella, LWP 50-52, LWP-320, при рН приблизительно 6,9, при приблизительно 37 С и приблизительно 150 об/мин. Бактериоцин 50-52 выделяли после приблизительно 12 ч культивирования. Для второго условия условия были теми же, за исключением того, что приблизительно 0,22 мг сигнального пептида LWP 50-52 добавляли после 2 ч культивирования. Результаты показаны ниже в табл. 5. Каждое условие повторяли три раза. Таблица 5 Культивирование штамма-продуцента LWP 50-52 и индукторного штамма LWP-320 в присутствии сигнального пептида LWP 50-52 Культивирование LWP 50-52 с LWP-320 в присутствии сигнального пептида LWP 50-52, внесенного приблизительно через 2 ч после начала культивирования, обеспечивает продукцию 360 мг/литр бактериоцина 50-52 после приблизительно 12 ч культивирования. Пример 4. Для определения эффективности сигнального пептида, выделенного из LWP-760, для продукции бактериоцина 760 культивирвали LWP-760 при приблизительно 37 С, как описано выше в примере 2. К приблизительно 10%-ному бульону для Brucella добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток LWP760, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, и приблизительно 1 мл, 0,1, 0,01 или 0,001 мг/мл препарата сигнального пептида LWP-760 добавляли либо во время культивирования, либо приблизительно через 2, 4 или 6 ч после начала культивирования. Для другой совокупности переменных к приблизительно 10%-ному бульону для Brucella добавляли приблизительно 1 мл суспензии клеток LWP-760, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, добавляли к этому бульону приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма LWP-320, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, и приблизительно 1 мл, приблизительно 0,1, 0,01 или 0,001 мг/мл препарата сигнального пептида LWP-760 либо во время культивирования, либо приблизительно через 2, 4 или 6 ч после начала культивирования. Следующая совокупность условии включала в себя приблизительно 1 мл суспензии клеток LWP-760, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, которую добавляли к приблизительно 10%-ному бульону для Brucella, приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамм LWP-320, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, которую добавляли к бульону, и приблизительно 1 мл, приблизительно 0,1 мг/ мл препарата очищенного сигнального пептида LWP-50-52 или очищенного сигнального пептида PVD-32, который добавляли в начале культивирования. Контроль содержал приблизительно 1 мл суспензии клеток LWP-760, содержащей приблизительно 109 KOE/мл, и приблизительно 1 мл суспензии клеток индукторного штамма LWP-320,содержащей приблизительно 109 KOE/мл в 10%-ном бульоне для Brucella. Бактериоцин 760 выделяли с помощью центрифугирования для разделения клеток и культуральной жидкости при приблизительно 10000 g в течение приблизительно 15 мин. Супернатант наносили на колонку с октил-сефарозой-4 Fast Flow для извлечения бактериоцина и элюировали буфером для элюции,представляющим собой приблизительно 15 мМ K2HPO4 при рН приблизительно 6,3. Клеточный осадок суспендировали в фосфатном буфере, содержащем приблизительно 0,7% NaCl, рН приблизительно 5,6(буфер для элюции), и суспензию перемешивали и инкубировали в течение приблизительно 20 мин. После инкубационного периода суспензию центрифугировали при приблизительно 10000 g в течение приблизительно 15 мин. Супернатант наносили на колонку Superose SP Fast Flow для выделения бактериоцина с помощью буфера для элюции, содержащего приблизительно 25 мМ трис-HCl и приблизительно 90 мМ NaCl при рН приблизительно 6,4. Антагонистические активности фракций бактериоцина против С. jejuni и S. enteritidis оценивали в капельном тесте, как описано выше. Уровень чистоты бактериоцина 760 определяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Изоэлектрическую точку определяли с помощью изоэлектрической фокусировки. Концентрации белка определяли при приблизительно 215 нм с помощью спектрофотометрического способа. Результаты представлены ниже в табл. 6.- 12017633 Таблица 6 Влияние сигнального пептида LWP-760 на продукцию бактериоцина 760 Как видно из табл. 6 выше, культивирование индукторного штамма LWP 760 с индукторным штаммом 320 и приблизительно 0,01 мг сигнального пептида из LWP 760 при 4 ч культивирования увеличивает выход бактериоцина 760 до приблизительно 693 мг из одного литра культуральной жидкости. Внесение сигнального пептида из PVD 32 и LWP 50-52 не увеличивает выход продукции бактериоцина 760 по сравнению с контролем. Для оценки влияния сигнального пептида на продукцию бактериоцина в крупномасштабных условиях выращивали LWP 760 и LWP 320 в биоректоре V-6 л с приблизительно 6 л 10%-ного бульона дляBrucella. Соотношение концентраций культур и сигнального пептида поддерживали как для условий,которые дают 510 мг/литр бактериоцина 760 в указанной табл. 7. Бактериоцин 760 выделяли приблизительно через 8, 10, 12 и 14 ч культивирования. Максимум продукции бактериоцина имел место после 12 Контроль: биореактор V-6 л, 10%-ный бульон для Brucella, LWP 760, LWP 320, при рН 6,9, 37 С,150 об/мин, 12 ч культивирования. Сигнальный пептид: биореактор V-6 л, 10%-ный бульон для Brucella,LWP 760, LWP 320, сигнальный пептид LWP 760 - 0,22 мг, добавлен через 2 ч культивирования, рН 6,9,37 С, 150 об/мин, 12 ч культивирования. Пример 5. Аминокислотные последовательности сигнальных пептидов определяли расщеплением по Эдману при использовании автоматического секвенатора 491 cLC (Applied Biosystems, La Jolla, Calif.) по инструкциям изготовителя. Определение молекулярной массы каждого сигнального пептида осуществляли времяпролетной масс-спектрометрией с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDITOFMS) с использованием масс-спектрометра с электрораспылительной ионизацией (API IIITAGA 6000E, CJEX, Mumbai, Индия) по инструкциям изготовителя. Результаты показаны в табл. 8 ниже. Таблица 8 Аминокислотные последовательности бактериоцинов OR-7, LWP 50-52 и LWP 760 и их соответствующих сигнальных пептидов Вышеприведенное подробное описание дано для иллюстрации. Такие подробности даны исключительно для обеспечения возможности того, чтобы специалисты смогли вносить вариации без отклонения от духа и объема этого изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептид, который имеет карбокситерминальную аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 1, где указанный пептид увеличивает продукцию бактериоцина при добавлении в культуру бактериоцин-продуцирующих клеток. 2. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. 3. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. 4. Пептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.- 17017633 5. Способ увеличения продукции бактериоцина, включающий:(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 6. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 2, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Lactobacillus salivarius NRRL В 30514 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus crispatus NRRL 30884 в систему культивирования;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 7. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 4, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Enterococcus faecium NRRL B30746 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus acidophilus NRRL B-30510 в систему культивирования;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 8. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 6, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Streptococcus cricetus NRRL В 30745 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus acidophilus NRRL B-30510 в систему культивирования;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 9. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 2, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Lactobacillus salivarius NRRL B30514 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus crispatus NRRL 30884 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 10. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 4, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Enterococcus faecium NRRL B30746 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus acidophilus NRRL B-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1 в указанную систему;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 11. Способ стимуляции продукции бактериоцина, имеющего SEQ ID NO: 6, включающий:(а) добавление бактериоцин-продуцирующего штамма бактерий Streptococcus cricetus NRRL В 30745 и индукторного штамма бактерий Lactobacillus acidophilus NRRL B-30510 в систему культивирования;(б) добавление пептида по п.1;(в) культивирование указанных бактерий с указанным пептидом для достижения повышенной продукции указанного бактериоцина. 12. Выделенный штамм бактерий Enterococcus faecium NRRL B-30746, продуцирующий бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. 13. Выделенный штамм бактерий NRRL B-30745, продуцирующий бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. 14. Выделенный бактериоцин, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6. 15. Бактериоцин по п.14, продуцируемый штаммом NRRL B-30746. 16. Бактериоцин по п.14, продуцируемый штаммом NRRL B-30745.