Фармацевтическая композиция для лечения туберкулеза и заболеваний, опосредованных helicobacter pylori, на основе полимерных наночастиц, способ ее получения и способы лечения

012121 Настоящее изобретение относится к области медицины и фармации, конкретно, к фармацевтической композиции рифабутина, выполненной на основе наночастиц, содержащих полимер/полимеры молочной кислоты и/или сополимер/сополимеры молочной и гликолевой кислот, и пригодной для внутривенного введения нуждающемуся в этом пациенту в терапевтически эффективном количестве, к способу ее получения и к способу лечения туберкулеза и заболеваний, опосредованных Helicobacter pylori, включающему внутривенное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом пациенту. Рифабутин (1',4-дидегидро-1-дезокси-1,4-дигидро-5'-(2-метилпропил)-1-оксорифамицин XIV) - полусинтетический антибиотик широкого спектра действия. Эффективен в отношении внутриклеточно и внеклеточно расположенных микроорганизмов. Селективно подавляет ДНК-зависимую РНК-полимеразу бактерий. Оказывает бактерицидное действие. Высокоактивен в отношении Mycobacterium spp.(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, в том числе расположенных внутриклеточно) и др. атипичных микобактерий. От 1/3 до 1/2 штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину, чувствительны к рифабутину, что указывает на неполную перекрестную резистентность между этими антибиотиками. Активен также в отношении многих грамположительных микроорганизмов. При монотерапии быстро развивается устойчивость. Показан при хроническом полирезистентном туберкулезе легких, вызванном рифампицинрезистентными штаммами Mycobacterium tuberculosis (в составе комбинированной терапии), инфекциях,вызванных Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium xenopi и др. атипичными бактериями, а также при заболеваниях, опосредованных Helicobacter pylori (в особенности штаммами,устойчивыми к кларитромицину). Рифабутин быстро и полностью всасывается в желудочно-кишечном тракте, время достижения максимальной концентрации вещества в плазме крови (Tmax) составляет 2-4 ч, время достижения 50%ной концентрации вещества в плазме крови (Т 1/2) 35-40 ч; хорошо приникает в органы и ткани (наиболее высокая концентрация создается в легких); подвергается биотрансформации в печени, выделяется с мочой и желчью. В связи с ростом заболеваемости туберкулезом в мире, вызванным появлением лекарственнорезистентных штаммов и распространением заболеваний иммунной системы, в том числе СПИДа, необходимо создание новых противотуберкулезных лекарственных средств. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, в период до 2020 года количество вновь инфицированных туберкулезом достигнет 1 миллиарда, 200 миллионов человек заболеют и 35 миллионов умрут от туберкулеза, если не будут найдены новые, более эффективные средства лечения. К сожалению, в литературе неоднократно была показана высокая гастроинтестинальная токсичность рифабутина, в связи с чем его пероральное применение является рискованным. Кроме того, наиболее широкое распространение в РФ и странах СНГ туберкулез получил, в частности, в учреждениях пенитенциарной системы, где заключенные зачастую избегают приема лекарственных средств, вводимых перорально. В связи с этим возникает задача создания лекарственной формы рифабутина, отличной от твердых пероральных лекарственных форм. Из уровня техники известен евразийский патент 9878, в котором раскрыта композиция из биоразлагаемых микрочастиц для ингаляции, которая применима для специфичной доставки к мишеням лекарств для лечения туберкулеза легких, причем данная композиция включает два противотуберкулезных препарата, выбранных из группы, состоящей из рифабутина, рифапентина, изониазида, пиразинамида и этамбутола, и биоразлагаемый полимер для доставки лекарств, при этом соотношение препараты:полимер составляет от 1:2 до 2:1, описан также способ ее получения и способ лечения туберкулеза,включающий ингаляционное введение данной композиции нуждающемуся в этом пациенту в фармацевтически эффективном количестве. Однако использование ингаляционного пути введения рифабутина не всегда оказывается удобным, в связи с чем возникает необходимость создания лекарственных форм рифабутина на основе таких коллоидных систем доставки (микро- и наночастиц), которые можно было бы вводить пациенту внутривенно. Известен из уровня техники патент США 6264991, в котором раскрыт способ лечения и/или профилактики внутриклеточных инфекций (включая туберкулез), включающий внутривенное введение в терапевтически эффективном количестве микросфер диаметром 1-5 или 5-10 мкм, выполненных на основе биосовместимого полимера (предпочтительно на основе полимеров молочной кислоты или сополимеров молочной и гликолевой кислоты), содержащих в терапевтически эффективном количестве противотуберкулезное лекарственное средство (включая рифабутин). В то же время пригодные для парентерального применения составы с рифабутином, характеризующимся, как было указано выше, практически полной нерастворимостью в водных средах, не приводятся, в связи с чем остается актуальной задача,связанная с разработкой таких составов, решаемая в настоящем изобретении. Настоящее изобретение относится, таким образом, к фармацевтической композиции для лечения туберкулеза и заболеваний, опосредованных Helicobacter pylori, на основе полимерных наночастиц, содержащих рифабутин в терапевтически эффективном количестве и вспомогательные вещества, пригодной для внутривенного введения нуждающемуся в этом пациенту, отличающейся тем, что в качестве-1 012121 вспомогательных веществ содержит полимер/полимеры молочной кислоты и/или сополимер/сополимеры молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в сополимерах до 50 мол.% с дополнительной карбоксильной группой или без дополнительной карбоксильной группы на конце молекулы или сополимеры полимеров молочной кислоты или сополимеров молочной или гликолевой кислоты с полиэтиленгликолем; при этом молекулярная масса (М.М.) полимеров и сополимеров составляет от 2 до 200 кДа, причем предлагаемая фармацевтическая композиция представляет собой лиофилизат с размером частиц 0,1-0,8 мкм, а при добавлении воды или физиологического раствора - устойчивую суспензию с размером частиц 0,1-0,8 мкм; фармацевтическая композиция дополнительно содержит водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с М.М. не более 70 кДа и может содержать пластификатор липидной природы и наполнители при следующем соотношении компонентов,вес.%: Изобретение относится также к способу получения фармацевтической композиции и к способам лечения туберкулеза и заболеваний, опосредованных Helicobacter pylori, включающим внутривенное введение композиции в терапевтически эффективном количестве. В качестве пластификатора фармацевтическая композиция содержит лецитин, липоевую кислоту или -токоферилсукцинат, а в качестве водорастворимого природного или синтетического полимерного стабилизатора эмульсии с М.М. не более 70 кДа содержит эфиры моноглицеридов, сывороточный альбумин. В качестве наполнителей в предлагаемом средстве могут быть использованы сахара, обладающие криопротекторными свойствами (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза), и соли (например, хлорид натрия, цитрат натрия). Фармацевтическую композицию рифабутина получают следующим образом: известным методом изготовления простой эмульсии вода/масло путем однократной или многократной гомогенизации органической и водной фаз, содержащих компоненты заявленного средства, с последующим испарением органического растворителя получают суспензию из полимеров молочной кислоты или сополимеров молочной и гликолевой кислоты с размером отдельных частиц 0,1-0,8 мкм. Сорбцию рифабутина внутри частиц полимера осуществляют в процессе образования суспензии наночастиц при удалении органического растворителя из эмульсии. Систему, состоящую из 2-20 вес.% раствора полимера/полимеров молочной кислоты (PLA) и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA), 0,5-5 вес.% раствора рифабутина и 0,005-1 вес.% пластификатора (например, лецитин, липоевая кислота, -токоферилсукцинат) в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде или хлороформе) и 0,5-5 вес.% водного раствора полимерного стабилизатора эмульсии (объемное соотношение органической и водной фаз 1:5), гомогенизируют до получения эмульсии. Органический растворитель из полученной эмульсии удаляют путем испарения при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Затем полученную суспензию фильтруют,добавляют 0-10 вес.% наполнителя - криопротектора (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и лиофилизируют. Степень включения рифабутина составляет 70-98%. Средний размер частиц составляет 100-800 нм (в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии). Ниже приведены примеры (составы 1-10), полученные в соответствии с вышеописанным способом и служащие исключительно для иллюстрации заявляемого изобретения, а не для ограничения объема притязаний. 1. Состав 1 (размер частиц 207 нм):PLGA 50:50 - сополимер молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в сополимерах до 50 мол.% с дополнительной карбоксильной группой или без дополнительной карбоксильной группы на конце молекулы; ЧСА - человеческий сывороточный альбумин;PLGA-ПЭГ - сополимер молочной и гликолевой кислот с полиэтиленгликолем. Ниже приводятся результаты сравнительных исследований противотуберкулезной активности композиции рифабутина для внутривенного введения (в соответствии с настоящим изобретением) и эталонного препарата рифабутина для энтерального введения по методу определения бактериостатической активной концентрации (БАК) (п.1), а также противотуберкулезной активности рифабутина в сравнении с эталонным препаратом in vitro (п.2). Материалы и методы исследования. Материалом исследования явились образцы крови крыс после введения им исследуемых препаратов: рифабутина для внутривенного введения (Rv), эталонного рифабутина (Э) и растворимого рифабутина при пероральном его введении (Ro). Использовали цельную кровь животных, которую забирали из подъязычной вены через 30 мин, 1, 2, 3, 6 и 24 ч после введения препаратов. Препараты вводили однократно в дозе 2,5 мг/кг массы животных. Препараты для перорального введения вводили внутрижелудочно с помощью специального зонда. Рифабутин для внутривенного введения вводили в хвостовую вену. БАК определяли в соответствии с методическими рекомендациями Модификация определения бактериостатической активности крови больных туберкулезом на плотной питательной среде методом серийных разведений, 1983 г. Из образцов крови готовили серийные разведения и засевали на питательную среду ЛевенштейнаЙенсена вместе с микобактериями туберкулеза. В качестве тест-культуры использовали лабораторный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv (МВТ), чувствительный ко всем противотуберкулезным препаратам. Задержкой роста МВТ признается полное отсутствие колоний или наличие единичных (до 20 мелких колоний) на плотной питательной среде. Результаты исследования. Учет роста культуры микобактерий проводили через 3 недели после засева. Результаты определения БАК представлены в табл. 1. Таблица 1 Значения БАК в зависимости от препарата и времени забора крови Рост колоний МВТ как в контроле, т.е. без добавления препаратов. Как следует из таблицы, при внутривенном введении рифабутина БАК отличалась от таковой при энтеральном введении препаратов. Максимальное значение разведения крови (1:16) наблюдалось при заборе крови через 0,5 ч при внутривенном способе введения рифабутина. Затем значение БАК резко падало и оставалось на этом уровне (1:4) до 3 ч. При заборе крови через 6 ч отсутствие роста МВТ определялось при разведении крови 1:2; к 24 ч рост МВТ был во всех разведениях крови, как в контроле. При-4 012121 внутрижелудочном введении рифабутина как эталонного препарата, так и новой формы рифабутина,значения БАК возрастали постепенно от 1:4 через 0,5 ч после введения до 1:8 к 2 ч. Через 3 ч уровень БАК снижался до 1:4; через 6 ч - до 1:2. Через 24 ч БАК не определялась. Различий в динамике изменений БАК при использовании рифабутина эталонного (Э) и рифабутина растворимого не выявлено. Заключение. При внутривенном введении новой лекарственной формы рифабутина создаются более высокие концентрации препарата, обеспечивающие значительную бактериостатическую активность крови (БАК) в отношении МВТ. Дальнейшее резкое снижение значений БАК обусловлено распределением препарата в тканях организма, что имеет особо важное значение для лечения туберкулезной инфекции. Различий в динамике изменения БАК между эталонным препаратом и новой формой рифабутина при их внутрижелудочном введении не выявлено. Материалы и методы исследования. Для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) рифабутина для внутривенного введения в сравнении с эталонным препаратом рифабутин для энтерального введения использовали стандартную методику, рекомендованную для доклинических исследований Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М., 2000, с. 287-292). Сравнение противотуберкулезной активности исследуемых препаратов произведено на нескольких штаммах микобактерий: 1) стандартный лабораторный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 25618 (номер по каталогу международной коллекции American Type Culture Collection - Bethesda, Md.), чувствительный к противотуберкулезным препаратам; 2) штамм 1274, выделенный от больного туберкулезом, чувствительный к противотуберкулезным препаратам; 3) штамм 33, выделенный от больного туберкулезом, с множественной лекарственной устойчивостью, с устойчивостью к 40 мкг/мл рифампицина; 4) штамм 239, выделенный от больного туберкулезом, с множественной лекарственной устойчивостью, с устойчивостью к 80 мкг/мл рифампицина. Все этапы эксперимента in vitro проводились в условиях строгого соблюдения стерильности. 1. Приготовление стандартной бактериальной суспензии. Культуры микобактерий туберкулеза, выращенные на плотной питательной среде в течение 3-4 недель, снимали платиновой лопаточкой, растирали в фарфоровой ступке и суспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия. Полученную суспензию переносили в пробирку и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин для самопроизвольного осаждения наиболее крупных конгломератов микобактерий. Затем надосадочную жидкость переносили в другую пробирку, добавляли изотонический раствор хлорида натрия, сравнивая с оптическим стандартом мутности 5. Подготовленная таким образом бактериальная взвесь соответствует содержанию 5108 КОЕ в 1 мл жидкости. Доза засева бактериальной суспензии составляла 0,2 мл, что соответствует 108 КОЕ. 2. Определение in vitro минимальной бактериостатической концентрации. Бактериостатическую концентрацию изучаемых препаратов определяли методом серийных разведений. Исходные растворы препаратов готовили следующим образом: рифабутин для внутривенного введения (0,9 мг) растворяли в 1,1 мл стерильной дистиллированной воды; навеску рифабутина для энтерального введения сначала растворяли в спирте этиловом (маточный раствор), а затем готовили исходную концентрацию с использованием среды Школьниковой. Затем их вносили в объеме 2 мл в опытный ряд пробирок, составляя серии концентраций от 8 до 0,03 мкг/мл. В каждом опытном ряду предусматривали наличие 2 контрольных пробирок с 2 мл питательной среды, не содержащей препарат. Во все пробирки вносили по 0,2 мл бактериальной суспензии, содержащей 5108 КОЕ/мл. Пробирки закрывали силиконовыми пробками и инкубировали при 37 С в течение 14-20 суток до получения видимого глубинного роста микобактерий в виде хлопьевидного или зернистого осадка. Результаты оценивали по данным микроскопического исследования мазков, полученных из осадка из каждой пробирки и окрашенных по Цилю-Нильсенену. Величину ингибирующей концентрации испытуемого препарата определяли по количеству кислотоустойчивых микобактерий и интенсивности образования микроколоний по следующей схеме: На основании полученных результатов определяли минимальную бактериостатическую концентрацию препарата, приводящую к частичномуМПК 50 (МПК, подавляющая рост 50% микроорганизмов исследуемой популяции) или полному (0) МПК 90 (МПК, подавляющая рост 90% микроорганизмов исследуемой популяции) подавлению роста микобактерий. 3. Определение бактерицидной активности препарата in vitro. Для определения бактерицидной активности препаратов культивирование микобактерий и приготовление различных концентраций препаратов производили по описанной выше схеме опытов. Для определения жизнеспособности изучаемых тест культур их подвергали воздействию препаратов в течение 0 дней, после чего осадки МВТ, дважды отмытые от препаратов путем центрифугирования в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, ресуспендировали в 1 мл 0,9 вес.% раствора NaCl, засевали на 2 пробирки с яичной средой Левенштейна-Йенсена и инкубировали в течение 2,5 мес. при 37 С. Интенсивность роста МВТ оценивали по следующей схеме: 0 - отсутствие роста;+ - 1-20 колоний МВТ на 2 пробирках;- 20-100 колоний МВТ на 2 пробирках;- более 100 колоний МВТ на 2 пробирках. Отсутствие роста 99% микробной популяции (0) расценивали как наличие бактерицидной активности у исследуемых препаратов. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) препарата устанавливали по суммарным данным культурального и микроскопического исследований. Результаты исследования. Результаты определения МПК и МБК рифабутина для внутривенного введения и эталонного препарата для энтерального введения представлены в табл. 2 и 3. Таблица 2 МПК и МБК (в мкг/мл) рифабутина для внутривенного введения в отношении различных штаммов МВТ Таблица 3 МПК и МБК (в мкг/мл) эталонного рифабутина для энтерального введения в отношении различных штаммов МВТ Заключение. Таким образом, противотуберкулезная активность композиции рифабутина для внутривенного введения по уровню МПК и МБК, определенных в опытах in vitro, не отличается от таковой эталонного рифабутина для энтерального введения. Величина МПК и МБК для обоих препаратов зависела от степени чувствительности микобактерий туберкулеза. Наименее чувствительным к исследуемым препаратам оказался штамм 239, полирезистентный, с устойчивостью 80 мкг/мл рифампицина. Предлагаемая фармацевтическая композиция рифабутина (в виде лекарственной формы для внутривенного введения) может быть успешно использована для лечения туберкулеза в случаях, когда использование пероральной формы препарата невозможно или затруднено.-6 012121 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция для лечения туберкулеза и заболеваний, опосредованных Helicobacter pylori, на основе полимерных частиц размером 100-800 нм, содержащих рифабутин в терапевтически эффективном количестве и вспомогательные вещества, пригодная для внутривенного введения нуждающемуся в этом пациенту, отличающаяся тем, что в качестве вспомогательных веществ содержит полимер/полимеры молочной кислоты и/или сополимер/сополимеры молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в сополимерах до 50 мол.% с дополнительной карбоксильной группой или без дополнительной карбоксильной группы на конце молекулы или сополимеры полимеров молочной кислоты или сополимеров молочной или гликолевой кислоты с полиэтиленгликолем; при этом молекулярная масса (М.М.) полимеров и сополимеров составляет от 2 до 200 кДа, причем композиция представляет собой лиофилизат с размером частиц 0,1-0,8 мкм, а при добавлении воды или физиологического раствора - устойчивую суспензию с размером частиц 0,1-0,8 мкм; композиция дополнительно содержит водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с М.М. не более 70 кДа, в случае необходимости, пластификатор липидной природы и наполнители при следующем соотношении компонентов, вес.%: 2. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что полимерный стабилизатор выбран из эфиров моноглицеридов или человеческого сывороточного альбумина. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что пластификатор выбран из лецитина, липоевой кислоты и -токоферилсукцината. 4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что наполнители выбраны из группы,включающей глюкозу, лактозу, маннит, трегалозу, хлорид натрия и цитрат натрия. 5. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что:A) гомогенизируют до образования эмульсии 2-20 вес.% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот, 0,5-5 вес.% раствора рифабутина и 0,005-1 вес.% раствора пластификатора в органическом растворителе; Б) удаляют органический растворитель из полученной эмульсии путем испарения при пониженном давлении с помощью роторного испарителя;B) полученную суспензию фильтруют; Г) добавляют к отфильтрованной суспензии 0-10 вес.% наполнителя; Д) лиофилизируют. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из метиленхлорида или хлороформа. 7. Способ лечения туберкулеза, включающий внутривенное введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-4 в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом пациенту. 8. Способ лечения заболеваний, опосредованных Helicobacter pylori, включающий внутривенное введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-4 в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом пациенту.