Растение ячменя с пониженной активностью липоксигеназы 1 и получаемые из него напитки

007955 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений. Более конкретно данное изобретение связано с мутантным геном липоксигеназы 1 ячменя (lox-1), который кодирует фермент с резко пониженной активностью образования 9-гидроксиоктадекановой кислоты. Изобретение также относится к применению растений ячменя, гомозиготных по lох-1, в процессах пивоварения с целью уменьшения появления неприятного привкуса в продуктах пивоварения, таких как пиво, при хранении. Предпосылки создания изобретения Липоксигеназы представляют собой семейство ферментов (ЕС 1.13.11.12), которые катализируют двойное окисление свободных и этерифицированных полиненасыщенных жирных кислот, имеющих конфигурацию 1(Z), 4(Z)-петадиена. Долгое время считали, что продукты катализируемых липоксигеназой реакций являются основными виновниками появления затхлого запаха у зерен/семян растений и в пищевых продуктах, полученных из зерен/семян (Robinson et al., 1995, Food Chem., 54: 33-43). Липоксигеназы связаны с процессом получения гексанальдегидов, образующихся при переработке соевых бобов,которые имеют неприятный запах, что ограничивает применение соевых белков в пищевой промышленности. Полагают, что изозимы (изоферменты) липоксигеназы, экспрессируемые в семенах сои, вносят вклад в окисление липидов и образование гексаналей. Мутанты сои, у которых отсутствует один или более этих изозимов, получают с целью уменьшения образования гексаналей и повышения стабильности вкуса. Успех этого подхода оценивает Hildebrand et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936. Мутанты, у которых отсутствует липоксигеназа сои 3, образуют гексанали в более высоких количествах, это позволяет предположить, что этот изозим превращает 13-гидроксипероксиоктадеканоиды, получаемые при окислении липидов, в нелетучие продукты. Продуктивность "трижды - нулевых" (дефектных по трем липоксигеназам) линий сои, у которых отсутствуют все три липоксигеназы семян, свидетельствует о том,что эти ферменты не являются существенными для нормальных агротехнических и посевных характеристик (Narvel et al., 1998, Crop Sci. 38: 926-928). Липоксигеназы также причастны к появлению неприятного привкуса у риса, который может возникать при хранении зерна. Выделение свободных жирных кислот можно обнаружить в зернах при хранении, что является показателем метаболизма запасов триглицеридов. Найдено, что разновидность рисаDaw Dam аккумулирует небольшие количества (низкие уровни) пентаналей и гексаналей, придающие более высокую вкусовую стабильность при хранении (Susuki et al. 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 11191124). Этот желательный фенотип объясняют отсутствием липоксигеназы-3 риса, которая окисляет ненасыщенные липидные ацильные цепи с образованием 9-гидроксипероксиоктадекановых изомеров положения. Общепризнанно, что метаболический путь липоксигеназы является сложным, со многими ответвлениями, и физиологически не до конца понятным. Предполагают, что модификации метаболического пути липоксигеназы, которые меняют активность 9-гидроксиперокисления в зерновых культурах, регулируют их восприимчивость к загрязнению микотоксином, Aspergillus spp. (Международная заявка WO 9726364), что согласуется с включением этого метаболического пути в устойчивость к растительным патогенам, но не относится к цели представленного в данном описании изобретения. Среди многих ароматических летучих веществ, которые вносят свой вклад в привкус (аромат) пива,высшие ненасыщенные альдегиды, содержащие 6-12 атомов углерода в цепи, имеют особенно низкий порог вкусовой чувствительности (Meilgaard 1975, MBAA Tech. Quart. 12: 151-168). Транс-2-ноненаль,который является членом этой группы, имеет чрезвычайно низкий порог вкусовой чувствительности 0,11 миллиардных долей (долей на биллион) и придает пиву неприятный привкус, напоминающий солому,картон. Этот признак - неприятный привкус, придаваемый транс-2-ноненалем, является общей характеристикой пива, хранившегося в течение 1-3 месяцев или более, и особенно вреден для вкуса и запаха светлого пива, которое готовят с легким солодом и которое имеет нежный вкус и запах. Давно известно, что сульфит повышает стабильность вкусовых качеств пива не только за счет связывания кислорода и антиокислительных свойств, но также за счет образования летучих бисульфитных производных альдегидов и кетонов, присутствующих в пиве. Двумя основными источниками сульфита в пиве являются: сульфит, вырабатываемый дрожжами во время ферментации за счет метаболического пути усвоения серы, и сульфит, добавляемый в пиво перед расфасовкой. Условия ферментации, которые повышают продукцию и секрецию сульфита под действием дрожжей, делают возможным образование аддуктов сульфит - карбонил (сульфитного производного карбонильного соединения) из карбонильных соединений, присутствующих в сусле, и предотвратить их дальнейшее превращение под действием дрожжей (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisbon, pp. 209-216). Таким образом карбонильные соединения, такие как ацетальдегид и диацетил, можно перенести в пиво. Способность сульфита предотвращать появление карбонильного соединения транс-2-ноненаля в процессе старения пива демонстрируется варкой пива со штаммом дрожжей, блокирующим метаболический путь ассимиляции серы (Johannesen et al., 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Nice, pp. 655-662). После разлива по бутылкам пиво подвергают принудительному старению, выдерживая при 37 С в течение 7 дней, после чего, как было найдено,уровни транс-2-ноненаля были намного выше порога вкусовой чувствительности. Если к пиву с низким содержанием сульфита непосредственно перед разливом по бутылкам добавлять 10 млрд. долей сульфи-1 007955 та, образование транс-2-ноненаля во время принудительного старения значительно снижается. Реакция между сульфитом и карбонильными соединениями обратима и идет под термодинамическим и кинетическим контролем. Значения кажущейся константы равновесия бисульфитных соединений находятся в интервале от 10-6 М для карбонильных соединений, таких как ацетальдегид, гексаналь и деканаль, до 10-3 для диацетила и пирувата (Dufour, 1991, см. выше). При хранении пива за счет газообмена кислород через упаковку может поступать в пиво, и при этом тратится сульфит, так, что более слабые бисульфитные аддукты диссоциируют и в пиве появляются свободные карбонильные соединения. Хотя сульфит, несомненно, повышает устойчивость вкусовых свойств пива, особенно на короткое время, его сохранение в упакованном пиве сильно зависит от газообмена через упаковку и от температуры. В готовом пиве естественные уровни сульфита, вырабатываемого в процессе ферментации, меняются, и добавление сульфита перед разливом по бутылкам не является общепринятой практикой. По этим причинам один сульфит не предлагает надежного способа долговременного повышения стабильности вкусовых качеств пива при различных условиях хранения пива, применяемых по всему земному шару. Общепринятым является то, что транс-2-ноненаль, обнаруживаемый в пиве, образуется при окислении полиненасыщенных жирных кислот, получающихся из липидов ячменного зерна, из которых наиболее распространенной является жирная кислота, содержащая в цепи 18 углеродных атомов, линолевая кислота [классифицируемая как 18:2,n-6-полиненасыщенная жирная кислота (Broun, Gettner and Sommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216)]. Однако в литературе отсутствует согласие по поводу механизма образования транс-2-ноненаля. Было высказано предположение о наличии ферментативных метаболических путей, ведущих к образованию транс-2-ноненаля из полиненасыщенных жирных кислот, но отдельные ферментативные стадии не подтверждены экспериментально на ячменном зерне или в процессе соложения (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol. 9: 161-215). Была выдвинута концепция использования технологии антисмыслового гена или гена косупрессии для понижения уровней липоксигеназы-1 в ячменных зернах, и тем самым для контроля 9-гидроксиперокисления и понижения уровня альдегида и спирта в конечном ячменном зерне, как способ контроля образования неприятного привкуса, но результаты такого подхода не сообщаются (McElroy and Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245-249). Был предпринят тест с тепличной выгонкой как способ оценки потенциала пива по trans-2 ноненалю, где образование транс-2-ноненаля в сусле или в пиве инициируют, выдерживая образцы при повышенных температурах и пониженном рН (100 С, при рН 4,0 в течение 2 ч). Попытки коррелировать потенциал trans-2-ноненаля в сусле и в готовом пиве с общим уровнем липоксигеназной активности в высушенном солоде показывают, что липоксигеназа может вносить вклад в появление trans-2-ноненаля в старом пиве (Drost et al., 1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124-131). Вывод, который можно сделать из этого исследования, очень ограничен тем фактом, что липоксигеназная активность в пивном солоде регулируется в конце процесса соложения степенью инактивации фермента во время сушки в печи. Таким образом, изучалось только влияние остаточной липоксигеназной активности солода на потенциал trans-2 ноненаля в полученном сусле и готовом пиве. В исследовании не удалось оценить липоксигеназы, которые катализируют первую стадию липоксигеназного ферментативного метаболического пути в ячменном зерне во время развития и соложения, и их роль в качестве детерминант, определяющих уровни транс-2 ноненаля, обнаруживаемого в пиве. На самом деле, отсутствие культурных растений ячменя, дефектных по одному или более изоэнзимов липоксигеназы, не позволило предоставить убедительное доказательство роли метаболического пути липоксигеназы в ячменном солоде при контролировании образования транс-2-ноненаля. Такие эксперименты необходимы для оценки вклада ферментативного метаболического пути, по сравнению с аутоокислительным/химическим путями, в образование trans-2-ноненаля в пиве. Процесс пивоварения включает высокотемпературную стадию кипения сусла, где, как предполагают,идут эти неферментативные реакции (Nol et al., 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323-4326). Сущность изобретения Данное изобретение включает растения ячменя с резко пониженной липоксигеназной-1 активностью. В одном варианте изобретения растения ячменя по изобретению содержат мутантного ДНК, кодирующую фермент липоксигеназу 1 (LOX-1), активность которого понижена или отсутствует в сравнении с контрольным растением ячменя или его частью, содержащим немутантную ДНК, что обусловлено заменой одного или более консервированных аминокислотных остатков, ограничивающих активную полость фермента, на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аргинин, треонин,серин, тирозин, триптофан, аспарагин или глутамин. Как показано в данном описании, солод и сусло, получающиеся из ячменя с пониженной липоксигеназной активностью по изобретению, например, из культурных сортов ячменя, гомозиготных для мутантного гена lох-1, применимы для производства пива со значительно повышенной стабильностью вкусовых качеств и с пониженными уровнями trans-2-ноненаля, в частности, в условиях, которые, как известно, промотируют появление T2N. Данное изобретение демонстрирует корреляцию между активностью липоксигеназы-1 ячменного солода по продуцированию 9-гидрокси пероксиоктадекадиеновых кислот (9-HPOD) и присутствием транс-2-ноненаля в пиве. Изобретение, кроме того, показывает, что использование ячменя, гомозиготного мутантного для гена lох-1, в процессе пивоварения повышает стабильность вкусовых свойств пива как при хранении, так и при воздействии повышенных температур во-2 007955 время хранения. Эти свойства повышают качество пива и позволяют увеличить срок его хранения и уменьшить потребность в охлаждении пива при транспортировке и хранении. Данное изобретение включает растения ячменя и их фрагменты с пониженной липоксигеназной-1 активностью, включая сорта ячменя, экспрессирующие мутантный LOX-1 белок по данному описанию, а также способы создания таких растений ячменя, фрагментов растений, продуктов растений и, в особенности, солода и пива, получаемых из растений ячменя по изобретению. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет собой график, изображающий влияние ингибитора нордигидрогвайяретовой кислоты (NDGA) на активность очищенной методом иммуноаффиной хроматографии липоксигеназы 1 и 2 зародышей - на 3-ий день после того, как ячменное зерно дало росток. Фиг. 2 представляет собой график, показывающий массу сырой ткани развивающегося зерна линииG и cv Винтаж (Vintage) от 5 дней после цветения до полной спелости (FM). Каждое значение представляет собой средний вес одного зерна из 6 колосьев. Фиг. 3 представляет собой график, показывающий сухой вес развивающегося зерна линии G и cv Винтаж от 5 дней после цветения до полной спелости (FM). Каждое значение представляет собой средний вес одного зерна из 3 образцов из 5 колосьев. Фиг. 4 представляет собой график, показывающий общую липоксигеназную активность развивающихся зерен линии G и cv Винтаж от 5 дней после цветения до полной спелости (FM). Фиг. 5 представляет собой график, показывающий 9- и 13-HPOD продукты окисления линолевой кислоты, обусловленного липоксигеназной активностью в развивающихся зернах линии G. Фиг. 6 представляет собой график, показывающий общую липоксигеназную активность зародыша прорастающего зерна линии G и cv Винтаж, выражаемую как мкмол/мин/10 зародышей (U/10 зародышей). Фиг. 7 представляет собой график, показывающий 9-HPOD и 13-HPOD продукты окисления линолевой кислоты, обусловленного липоксигеназной активностью, в прорастающих зернах линии G и cv Винтаж,показаны уровни 9-HPOD и 13-HPOD. Фиг. 8 представляет собой Вестерн-блот, показывающий иммунологический анализ липоксигеназы 1 в зародыше развивающегося зерна линии G и cv Винтаж от 5 дней после цветения до полной спелости(FM). Фиг. 9 представляет собой Вестерн-блоттинг, показывающий иммунологический анализ липоксигеназы-1 в зародыше зерна линии G и cv Винтаж [дикого типа] в период прорастания от дня 0 до дня 6. Фиг. 10 представляет собой Нозерн-блоттинг при использовании гибридизации с 3' нетранскрибируемой областью кДНК lох-1 в качестве зонда и показывающий транскрипты липоксигеназы 1, обнаруживаемые в развивающемся зерне линии G и cv Винтаж [дикого типа] от 5 дней после цветения до полной спелости (FM). Фиг. 11 представляет собой Нозерн-блоттинг при использовании гибридизации с 3' нетранскрибируемой областью кДНК lох-1 в качестве зонда и показывающий транскрипты липоксигеназы 1, обнаруживаемые в зародышах зерна линии G и cv Винтаж [дикого типа] в период прорастания от дня 0 до дня 6. Фиг. 12A-12G представляют собой сравнительный анализ первичной структуры нуклеотидной последовательности промотора и транскрибируемой области аллеля дикого типа cv Винтаж (WT) и аллеля линии G (LG) lох-1. Подчеркнуты сайт начала транскрипции (+1), ATG стартовый кодон трансляции(+69) и стоп-кодон трансляции (+4231) последовательности гена. Нуклеотидные мутации, идентифицируемые в аллеле линии G, показаны жирным курсивом и отмечены звездочкой. Фиг. 13 представляет собой схематическое изображение гена lох-1 cv Винтаж (дикого типа) и мутантного гена lох-1 линии G. Транскрипт от +1 до +4375 состоит из 7 экзонов (заштрихованы точечным пунктиром) и 6 интронов (не заштрихованы). Указаны две мутации в гене lох-1. Фиг. 14 представляет собой схематическое изображение генных кассет транзиторной экспрессии кДНК lох-1 дикого типа и гена lох-1 и мутантного гена lох-1 линии G. Кодирующие последовательности липоксигеназы клонируют между конститутивным промотором убиквитина кукурузы с интроном 1 (Ubi1) и терминатором nos. Фиг. 15 представляет собой гистограмму , показывающую липоксигеназную-1 активность в протопластах алейронов ячменя, трансфицируемых при использовании генных кассет, содержащих кДНК lох 1 дикого типа; мутантный lох-1 ген линии G; ген WT lох-1; и репортерный ген контрольного GUS. Липоксигеназную активность в экстрактах трансфицируемых протопластов анализируют в титрационных микропланшетах окислением KI и количественной спектрофотометрией. Липоксигеназную-1 активность выражают в единицах (units) на мкг белка в экстракте и показывают как среднее из 3 измерений, полученных при анализе в двойном повторе. Фиг. 16 представляет собой сравнительный анализ первичной структуры, показывающий, что RFLPlох-1 вызван точковой мутацией в положении 2347 нуклеотида, что создает дополнительный сайт рестрикции АаtII.-3 007955 Фиг. 17 представляет собой схематическое изображение PCR фрагментов lох-1, амплифицированных и подвергшихся расщеплению в анализе полимеразной цепной реакцией - расщеплением амплифицированного полиморфного сайта (PCR-CAPS). Положения праймеров PCR указаны стрелками, а сайтыAatII показаны над геном (положение последовательности). Области экзонов и интронов внутри PCRпродукта отмечены точечной штриховкой или не заштрихованы, соответственно, и даны размеры фрагментов гидролитического расщепления АаtII. На фиг. 18 показан электрофоретический агарозный гель с изображением PCR фрагментов lох-1(652 п.о.), амплифицированных на первой стадии анализа PCR-CAPS геномной ДНК линии G и cv Винтаж. Фиг. 19 представляет собой изображение электрофоретического агарозного геля, показывающееRFLP, обнаруживаемый в гене дикого типа и мутантном гене lох-1. Фрагменты гидролитического расщепления AatII мутантного гена включают уникальный фрагмент рестрикции 313 п.о., показанный звездочкой. Фиг. 20 представляет собой таблицу, показывающую программу возвратного скрещивания одиночной рецессивной генной пары ll (признак низкой липоксигеназной активности) линии G с cv Alexis. Растениями генотипа LL являются растения, экспрессирующие липоксигеназную активность дикого типа(доминантный аллель), растения генотипа ll представляют собой растения, экспрессирующие низкую липоксигеназную активность (рецессивный аллель). Ll представляют собой гетерозиготные растения,содержащие как аллель дикого типа, так и аллель с низкой липогеназной активностью. Так как низкая липогеназная активность является рецессивным признаком, растения Ll проявляют липоксигеназную активность дикого типа. Ожидается, что после каждого цикла возвратного скрещивания (включая самоопыление) ll потомство составляет 25% потомства. Указана частота встречаемости низкой липогеназной активности. Вычисленное процентное содержание генетической среды cv Alexis, имеющей аллель с низкой липоксигеназной активностью, указано как % Alexis. Фиг. 21 представляет собой изображение электрофоретического агарозного геля, показывающееPCR-CAPS обнаружение мутантного гена lох-1 в потомстве ll программы беккросса линия G - Alexis. Анализ PCR-CAPS на геномной ДНК линии G (дорожка 2), cv Винтаж (дорожка 3), ll потомства 3 его (дорожка 4) и 4 ого беккросса (дорожки 5-9). ДНК лэддер (дорожка 1). Контрольная беккросс - линия с высокой lох активностью (дорожка 10). На фиг. 22 А-22 В представлен сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей липоксигеназ сои LOX-1 (Gm1), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) и липоксигеназ ячменяLOX-1 (Hv1) и LOX-2 (Hv2). Подробное описание изобретения Предметом изобретения охватываются растительные материалы, растительные продукты и способы производства напитка, такого как пиво, с пониженным содержанием транс-2-ноненаля, соединения, придающего неприятный привкус, в результате чего повышается стабильность вкуса напитка, например пива, во время хранения и при действии повышенных температур по сравнению с контрольным напитком. Более конкретно, данное изобретение включает сорта ячменя, развивающиеся и прорастающие зерна которых продуцируют резко пониженные уровни активности фермента липоксигеназы, обозначенногоLOX-1, и, при использовании в процессе пивоварения дают в результате пиво с пониженными уровнямиtrans-2 -ноненаля по сравнению с контрольным сортом ячменя. Далее описываются способы, применяемые для получения, характеристики и подтверждения сорта ячменя, имеющего значительно пониженную LOX-1 активность, и применение этого вида ячменя для производства пива с устойчивым вкусом. 1. Определения. Нижеприведенные термины, употребляемые в данном описании, имеют указанные значения."Часть (фрагмент) растения" обозначает растение или специфическую часть растения, такую как стебель, листья, корни, цветы, семена, зерна, плоды или почки."Мутантный lох-1 ячменя" обозначает мутагенизированный ген ячменя, кодирующий мутантный полипептид липоксигеназы-1."Немутированный (немутантный) контроль" обозначает растение, нуклеиновую кислоту, ген, полипептид, часть растения или растительный продукт, содержащий ген или белок дикого типа."Гетерологичная" обозначает ненативную последовательность, например, последовательность из других видов, или последовательность, полученную методом рекомбинантной ДНК, или синтетическую последовательность, которая отличается от нативной последовательности."Растительный продукт" обозначает продукт, получающийся в результате процессинга растения или части растения, и включает, например, солод и сусло."Кислая аминокислота" обозначает аспарагиновую или глутаминовую кислоту."Органолептические свойства" обозначает свойства, относящиеся к обонянию или вкусовым ощущениям, которые анализируются, например, в дегустационном зале (на стенде) для проверки вкусовых"Пониженное содержание транс-2-ноненаля" означает менее 50% по сравнению с условиями дикого типа (контроль). 2. Липоксигеназная активность. Ферменты липоксигеназного типа катализируют окисление полиненасыщенных жирных кислот. В ячмене известны изоэнзимы (изозимы, изоферменты) LOX-1 и LOX-2. LOX-1 главным образом катализирует 9-гидроксиперокисление, тогда как LOX-2 прежде всего катализирует 13-гидроксиперокисление полиненасыщенных октадекановых жирных кислот. Данные, приведенные в нижеописанных примерах,демонстрируют корреляцию между активностью LOX-1 ячменя в отношении 9-гидроксиперокисления и присутствием транс-2-ноненаля в пиве. Следовательно, ячмень с пониженной активностью применим для производства пива с пониженным уровнем и/или потенциалом транс-2-ноненаля по сравнению с контрольным. 3. Получение ячменя с низкой липогеназной активностью. Для получения растений по изобретению, то есть для уменьшения уровня липогеназной-1 ферментной активности, экспрессирующей в ячмене устойчиво и с наследованием этого признака, можно использовать несколько известных генетических подходов. Эти подходы-способы включают, но без ограничения, технологию антисмысловых последовательностей и мутагенез, например, химический мутагенез и радиационный мутагенез, а также сайт-направленный мутагенез. Трансформация ячменя. Ячмень можно трансформировать с помощью различных нуклеотидных молекул, созданных таким образом, чтобы управлять экспрессией гена lох-1 или менять структуру гена lох-1. Различные методы,например, перенос, опосредуемый Agrobacterium tumofaciens (Tingay et al., 1997, Plant J., 11: 1369-1376),бомбардировка частицами (Wan and Lemaux, 1994, Plant Physiol., 104: 37-48), или внедрение ДНК, опосредуемое полиэтиленгликолем (ПЭГ) (Funatsuki and Kihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91: 707-712), можно успешно применять для введения нуклеиновых кислот в клетку ячменя, например, в протопласт, каллюс или в зародыш. Для того, чтобы "запустить" экспрессию интересующего нас гена, можно использовать различные промоторы. Для экспрессии lох-1-содержащих векторов, включающих антисмысловые последовательности, можно использовать область нативного промотора lox-1. Промоторная последовательность lох-1 содержится в нуклеотидах 2602-3511, которые включают 5' Ubi.1 (Wan and Lemaux, см. выше; Kjruff etal., in P. Mathis, Ed., 1995, Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol. II, 151-154). Векторы экспрессии также могут содержать область терминации транскрипции, например, 3' терминатор транскрипции гена нопалинсинтазы (3'-nos) (Bevan, et al., 1983, Nucl. Acids Res., 11: 369-385) был слит с генами, экспрессирующими в трансгенном ячмене (Wan and Lemaux, см. выше; Funatsuki and Kihara, см. выше). Векторы экспрессии также могут содержать ген, который делает возможным отбор трансформированных клеток, когда вектор успешно интегрирован в клетку. Эти гены могут кодировать гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, например, ген неомицин фосфотрансферазы (npt) или фосфинотрицинацетилтрансферазы (bаr). Будучи экспрессированы, такие гены устойчивости делают возможным рост трансформированной клетки в средах, содержащих неомицин - биалафос, соответственно (Например, Wan and Lemaux, см. выше; Funatsuki and Kihara, см. выше; Kjrulff et al., in P. Mathis, см. выше). После трансформации клетки можно выращивать в избирательных средах в течение определенного периода, а затем культивировать, допуская образование корней, а затем корневых систем и затем ростков(всходов). Успешная методика трансформации культуры ячменя создана Funatsuki and Kihara, (см. выше), по этой методике трансформация протопластов ячменя при использовании ПЭГ с векторами экспрессии, содержащими неомицинтрансферазу, и последующий отбор в неомицине дали плодородные(фертильные) растения, содержащие трансген. Показано, что трансген встраивается в геном, и большинство трансгенных растений экспрессирует белок, кодируемый трансгеном. Эти трансгенные растения также способны переносить и экспрессировать трансген после кроссов. Понятно, что для трансформации ячменя известны и применимы различные методы, векторы экспрессии, промоторы, селективные маркеры и т.п. Мутагенез ячменя. Ген lох-1 может быть нацелен для (может стать мишенью) сайт-направленного мутагенеза с применением химерных РНК/ДНК олигонуклеотидов. Показано, что эти химерные РНК/ДНК олигонуклеотиды успешно вводят мутации в растительные клетки (Zhu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; andNatl. Acad. Sci. 93:2071-2076) в нужных положениях. Химерные РНК/ДНК олигонуклеотиды можно трансформировать в представляющие интерес протопласты или клетки ячменя различными способами,например, используя описанные выше способы методы трансформации при использовании ПЭГ или бомбардировки частицами. Отдельные протопласты или клетки можно затем регенерировать с помощью тканевых культур в целые фертильные растения, а событие мутации может быть подтверждено и про-5 007955 должено, например, при использовании подхода на основе PCR (ПЦР), как подробно описано далее, в примерах. Этот метод сайт-направленного мутагенеза можно применить, чтобы мутировать специфические остатки в гене lох-1. Ген lох-1 может мутировать в одном или более положений нуклеотида на участке промотора, чтобы негативно модулировать или запретить транскрипцию lох-1. Сайт-специфичный мутагенез можно также применять для введения замен в кодирующую область lох-1, которая, например, понижает активность фермента. Такие мутации включают, но без ограничения, инсерции, делеции и замены, приводящие к сдвигу рамки считывания, усечению белка LOX-1 и/или к изменению нейтральной или гидрофобной природы полости ферментного субстрата. Антисмысловая экспрессия. Понижение уровня экспрессии lох-1 можно также осуществлять, используя экспрессию lох-1 антисмысловых конструкций в клетках ячменя. Сообщалось о методах экспрессии антисмысловых конструкций в ячмене для уменьшения экспрессии нецеленного белка, например, в Gilpin, M.J. et al., 1998, In: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Garab, ed., Vol. IV, 2983-2986; Kjruff et al., 1995, In: Photosynthesis: from Light to Biosphere, P. Mathis, Ed., Vol. II, 151-154. Клетки ячменя можно трансформировать при использовании конструкции экспрессии и антисмысловой нуклеотидной последовательности. Конструкция экспрессии продуцирует антисмысловую молекулу РНК, способную специфически связываться, по меньшей мере, с частью мРНК, продуцируемой при использовании гена lох-1 дикого типа, через комплиментарную пару оснований, и способную нарушать сплайсинг пре-мРНК или трансляцию такой мРНК. Конститутивный или тканеспецифический/специфический во времени промотор, например, описанный выше lох-1 промотор ячменя, может"запустить" экспрессию антисмысловой нуклеотидной последовательности. Химический мутагенез. Химический мутаген азид натрия (NaN3) широко используется для мутагенеза ячменя, и известно,что он вызывает устойчивый мутагенез в последовательности ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоте) генома ячменя (Olsen et al., 1993, Proc. Natl. Read. Sci. USA, 90: 8043-8047). Другие химические мутагены, например, этилметансульфонат (EMS), азидоглицерин (AG, 3-азидо-1,2-пропандиол), нитрозометилмочевину (MNU) и гидразид малеиновой кислоты также можно применять для индуцирования мутаций ДНК (Rank, J. et al., 1997, Mutat. Res. 390:121-7), так же как и УФ-излучение. Как показано в нижеприведенных примерах, зерна культурных сортов (cultivars, (cv ячменя Винтаж и Карузо (Caruso) обрабатывают азидом натрия и разводят самоопылением через 3 е поколение (М 3). 4. Идентификация и селекция ячменя с низкой липоксигеназной активностью. Идентификацию и селекцию растений ячменя с пониженной изоферментной липоксигеназной активностью в зернах можно осуществлять, например, анализируя липоксигеназную активность. Ферментативные анализы можно применять для определения активности двух основных липоксигеназ, как известно, присутствующих либо в спелом, либо в прорастающем зерне, LOX-1 и LOX-2. Такие анализы должны различать LOX-1 активность от LOX-2 активности. Один избирательный анализ LOX-1 и LOX-2 основан на окислении полиненасыщенной жирной кислоты при участии липоксигеназы и спектрофотометрическом обнаружении гидропероксидного продукта такого окисления. Специфичность этого анализа в отношении LOX-1 объясняется тем, что в нем используется сравнительная нечувствительность LOX-1 к ингибитору, например, к NDGA, по сравнению сLOX-2. Избирательный анализ можно также осуществлять, используя иммунопреципитацию для того, чтобы селективно удалить LOX-1 или LOX-2 из аналитической смеси. Специфические антитела противLOX-1 или против LOX-2, например, моноклональные антитела, можно получать из очищенных LOX-1 или LOX-2, как описано в Holtman et al., 1996, см. выше. Эти методы анализа можно адаптировать для работы в титрационных микропланшетах или в других известных форматах для многократного анализа с высокой производительностью, делающих возможным быстрый скрининг многих образцов (большой выборки). Эти анализы можно выбрать для скрининга кончиков листьев прорастающих зерен, не нарушая их, так что проростки, выбираемые для скрининга, можно размножать дальше. Потерю LOX-1 активности в предполагаемых мутантах можно подтвердить анализом ферментативной активности. Например, зерновые экстракты можно инкубировать с линолевой кислотой и продукты окисления линолевой кислоты можно анализировать обращенно-фазовой ВЭЖХ. Относительные количества 9-HPOD и 13-HPOD, образующихся из линолевой кислоты, представляют собой меру LOX-1 активности, основным продуктом которой является 9-HPOD. Как показано в приведенных ниже примерах, примерно, 20000 зерен генерации М 3 мутагенизированных cv Винтаж и cv Карузо подвергают скринингу на LOX-1 и LOX-2 активность методом окисления в присутствии ингибитора, а также методом иммунопреципитации. С помощью этих двух методов скрининга найдено, что в мутанте cv Винтаж наблюдается основное снижение LOX-1 активности, и этот мутант обозначают Линия G. Мутантный фенотип наследуется в М 4 и М 5 поколениях. Семена, полученные от ячменя линии 3, депонированы 4 января 2001 года в Национальной коллек-6 007955 ции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY,Scotland, UK, по условиям Будапештского Соглашения, под номером NCIMB 41078. 5. Генетические последовательности. Точное описание генотипического изменения, которое объясняет фенотип с низкой липоксигеназной активностью у растений ячменя по изобретению, применимо для идентификации растений, имеющих это генетическое изменение, и для введения путем скрещивания этого генетического признака в культурные сорта ячменя в соответствии с бридинг-программой. Ряд известных молекулярных и биохимических методов можно использовать для определения генетических основ фенотипа с низкой липоксигеназной активностью. Общепризнанно, что как цис-действующие, так и транс-действующие генетические последовательности могут определять экспрессию данного гена в геноме и активность генного продукта. Контрольные точки в генной экспрессии включают регуляцию тайминга, тканеспецифичность и скорость генной транскрипции, устойчивость транскрипта и скорость трансляции транскрипта. Как уровень генной экспрессии, так и устойчивость и специфическая активность кодируемого фермента будут определять уровень ферментной активности, обнаруживаемой в ткани. Изменения в последовательности гена растения можно определять секвенированием ДНК известных релевантных частей генома, тогда как метод Нозерн-блоттинга дает инструмент, позволяющий контролировать устойчивые уровни транскрипта в данной ткани растения. Фермент, экспрессирующий в ткани растения, можно оценивать, извлекая фермент из ткани и измеряя ферментативную активность. Как показано в приведенных ниже Примерах, идентичность генетических изменений, которые определяют фенотип с низкой липоксигеназной активностью мутанта Линии G, индуцированного в cv Винтаж, устанавливают следующим образом. Структурный ген, кодирующий белок LOX-1 как в родительском cv Винтаж, так и в Линии G, амплифицируют полимеразной цепной реакцией (PCR, ПЦР) и секвенируют "uрstrеаm" (в 3'-5' направлении) последовательности промотора, которые регулируют экспрессию гена, а также полную кодирующую последовательность, которая содержит последовательности интронов и экзонов. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена lох-1 Линии G и дикого типа cv Винтаж позволяет выявить 2 нуклеотидные замены в 2 экзонах, из которых один (в положении +2347) ведет к неконсервативной аминокислотной замене (Глицин 368 Аспартат) в экспрессирующем белке. На фиг. 22 показано сравнение первичных структур липогеназ LOX1 (Асc. No. P08170), LOX2 (Асc.LOX2 (Acс. No. AAB70865.1) ячменя (hv: Hordeum vulgare). Консервативные аминокислотные остатки и консервативные замены заряженных остатков показаны жирным шрифтом. Отнесение вторичной структуры LOX3 сои Glycine max, где Н=альфа спирали, а Е=бета нити, показано над сравнением первичной структуры, а остатки, релевантные ферментной функции (отмеченные звездочкой или темным кружком),показаны, как описано в Skrzypczak-Jankun et al., 1997, Proteins 29:15-31. Аминокислоты, которые участвуют в связывании не гем-железа или имеют существенное значение для катализа в LOX3 сои, включают: H518, H523, Н 709, [3 атома N]; N713, I857. Эквивалентными остатками в LOX1 ячменя являются Н 517, Н 522, Н 708, N712 и I862. Остатки в LOX3 сои с прогнозируемой ролью в катализеследующие: Н 266, Н 513, Н 776, F264, F272, F714, W519, R552, R726, D766, D779, K278. Эквивалентные остатки в LOX 1 ячменя суть следующие: Н 261, H512, H775, F259, F267, F713, W518, R551, R725, D778 и K273. Остатки (+) пролина (Р 86, 109, 167, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 486, 541, 548, 600, 616, 627, 685, 726, 734, 788, 829,833, 839, 857) и глицина (G49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474, 490, 567, 607, 674, 676, 720, 736, 783,828, 850, 855), локализованные в положениях в петлях и в виде спирали -"колпачка" (кэппинг) во вторичных структурах белков, могут облегчить резкие витки и скручивания пептидного остова. Сравнение первичных структур липоксигеназ родственных растений показывает, что глицин-368 вLOX-1 сои, является одним из 35 высококонсервативных остатков из общего числа 58 остатков, которые"покрывают" полость II субстрата фермента, как видно из его кристаллической структуры. Эти консервативные остатки отчетливо видны (боксы) при сравнении первичных структур последовательностей липоксигеназ на фиг. 22 (Minor et al., 1996, Biochemistry, 35: 10678-10701) и включают следующие остаткиLOX-1 ячменя: Y224, L268, W355, Е 364, G368, V369, N370, I374, L424, L499, K501, A502, V504, D508, S509, Н 512, Q513, L514,Н 517, W518, Н 522, I556, L559, А 560, L564, I565, I570, Т 574, S585, Q715, Y718, N724, R725, P726, Т 727, L772 и I862. Все, кроме 7 из 35 консервативных остатков являются нейтральными или гидрофобными остатками. Замена заряженного остатка в положении глицин-368 в ячмене или в положении другого консервативного нейтрального или гидрофобного остатка, "устилающего" полость II субстрата, по-видимому, нарушает структурные и функциональные свойства фермента. Мутация GD368 в LOX1 Линия G ячменярасположена между альфа-спиралью Н 6 и бета-нитью Е 12. Как показано на фиг. 22, семейство липоксигеназ ферментов имеют общую высокую степень консервативности последовательностей, что отражается в их консервативной вторичной структуре, определенной для нескольких членов семейства растительных липоксигеназ, включая LOX1 и LOX3 сои-7 007955 67,8% подобна последовательности LOX3 сои. Несколько аминокислотных остатков в изозиме LOX3 сои идентифицированы как лиганды для не гем-железа или предполагается, что они существенны для его активности (помечено). Ввиду высокой консервативности последовательностей LOX1 ячменя и LOX3 сои резонно прогнозировать, что остатки в последовательности LOX1 ячменя, гомологичные остаткам,идентифицируемым как важные для функции LOX3, могут также быть существенны для ферментативной активности. То есть, неконсервативные аминокислотные замены в любом из этих положений, включая замены тех остатков в LOX1 ячменя, которые соответствуют 35 высококонсервативным остаткамLOX3 сои, "покрывающим" полость субстрата, и в других положениях, существенных для активности фермента, по-видимому, предполагаются для уменьшения липоксигеназной активности. Известно, что аминокислотные остатки пролин и глицин облегчают витки в пептидном остове, когда они локализованы между вторичными структурными элементами, что позволяет белку принимать скрученную третичную структуру. Остатки пролина и глицина также обычны в мотивах спираль-кэппинг("колпачок", Parker and Hefford, 1997, Protein Eng., 10: 487-496, http://www.expasy.ch). Одиночная неконсервативная замена в LOX1 Линии G, когда глицин, локализованный между двумя предсказанными структурными элементами, заменяют на аспартат, приводит к значительной потере ферментной активности. Прогнозируется, что мутация в гене lох-1, вызывающая неконсервативные аминокислотные замены одного или более остатков пролина или глицина в LOX1 ячменя, локализованных в областях вне структурных элементов, может аналогичным образом предотвращать скручивание нативного белка и, следовательно, снижать активность кодируемого фермента. Таким образом, в одном варианте изобретения полезное мутантное растение ячменя по изобретению, имеющее пониженную липоксигеназную 1 активность, содержит мутированную нуклеотидную последовательность, которая изменяет нейтральную или гидрофобную природу полости субстрата фермента с помощью инсерции одной или более кислых, основных или нейтральных аминокислот. Например,полезная нуклеотидная последовательность [SEQ ID NO: 11] кодирует белок LOX-1 ячменя [SEQ ID NO: 12], содержащий замену аминокислоты 368-глицина на Хаа, где Хаа представляет собой кислую, основную или полярную аминокислоту. Одной конкретной аминокислотной последовательностью мутантногоLOX-1 ячменя по изобретению является такая аминокислотная последовательность, в которой Хаа обозначает аспарагиновую кислоту, например, Линия G. Как показано далее в примерах, генотипические изменения в Линии G не оказывают заметного влияния на экспрессию гена lох-1, но LOX-1 активность, обнаруживаемая в спелых и прорастающих зернах Линии G, составляет, примерно, 9% активности, обнаруживаемой в зернах родительской линии, cv Винтаж. Чтобы получить непосредственное доказательство того, что мутация аминокислоты в LOX-1 Линии G ответственна за фенотип с низкой LOX-1 активностью, кодирующую последовательность lох-1 Линии G и кодирующую последовательность lox-1 cv Винтаж транзиторно экспрессируют в протопластах алейрона ячменя. При этом показано, что активность мутантного фермента LOX-1 значительно понижена по сравнению с LOX-1 ферментом LOX-1 дикого типа. 6. Перенос между генеалогическим линиями. Обнаружение изменений генетического признака у растений ячменя генотипа по изобретению применимо для идентификации наличия специфического генетического признака в линии ячменя и для того,чтобы способствовать переносу этого признака между генеалогическими линиями в бридинг - программе. Ряд молекулярных "инструментов" применим для обнаружения изменений в геномной последовательности. Такие методы включают, но без ограничения, методы обнаружения на основе полиморфизма длины рестрикционных объектов (Gebhardt and Salamini 1992, Int. Rev. Cytology., 135: 201-237) и количественной PCR, такие как амплификация с применением флуоресцентных праймеров, например, системы проб TaqMan (Ibraham et al., 1998, Anal. Chem. 70, 2013-2017). Выбор метода обнаружения зависит от специфического генетического признака, но, предпочтительно, должен быть быстрым и давать недвусмысленно интерпретируемые данные. Как показано далее в примерах, анализ с помощью PCR-амплифицированного полиморфного сайта отщепления (PCR-CAPS) предложен для обнаружения мутантного гена липоксигеназы-1 Линии G. Нуклеотидная замена в гене lох-1 Линии G в положении +2347 вводит дополнительный сайт распознавания рестриктазой AatII, который можно обнаруживать методом PCR-CAPS. Соответствующие способы обнаружения lох-1 не ограничиваются этим методом, но равным образом основаны на методике TaqMan и других известных методах обнаружения. Как показано далее в примерах, анализ PCR-CAPS применен к 4 поколениям генеалогического материала из программы возвратного скрещивания, где фенотип с низкой липоксигеназной активностью в Линии G систематически возвратно скрещивался (беккросс) с cv Alexis. Показано, что наследование фенотипа с низкой липоксигеназной активностью сопутствует наследованию гена lох-1, а фенотип определен как рецессивный и наблюдается только в линиях, гомозиготных для гена lох-1. Соответственно, потомство растения по изобретению включает линии скрещивания, например, получаемые в программе обратного скрещивания, которые содержат мутантный lох-1 и экспрессируют фенотип с низкой липоксигеназной активностью. 7. Пивоварение.-8 007955 Растения ячменя по изобретению, включая части растений, потомство растений, зерна и растительные продукты, такие как солод и сусло, с низкой липоксигеназной 1 активностью, представленные в данном описании, применимы в производстве напитка с пониженными уровнями свободного транс-2 ноненаля в течение определенного периода времени или при хранении в условиях повышенных температур, по сравнению с напитком, произведенным из контрольного сорта ячменя дикого типа. С целью такого сравнения содержание сульфита в пиве контролируют до 5 м.д., так как общепризнанно, что более высокие уровни сульфита в момент разлива по бутылкам на время замедляет появление свободного транс-2-ноненаля. Например, пиво, сваренное из солода, полученного из мутантного ячменя Линии G по данному описанию, обладает стабилизированными органолептическими свойствами в течение определенного периода времени по сравнению с пивом, сваренным из солода, полученного из контрольного немутантного ячменя. Пробы сваренного пива и оценка пива, разлитого по бутылкам, являются лучшим способом оценки влияния различных ингредиентов на качество и стабильность готового пива. Для того, чтобы проверить влияние различных ячменных солодов, требуется достаточное количество ячменного зерна, чтобы от опытных работ по соложению и варке перейти к масштабам пилотной установки и полупромышленным масштабам. Во время размножения ячменя можно оценивать продуктивность линии ячменя. Качества соложения линии ячменя можно оценивать во время соложения в масштабах пилотной установки или в промышленных масштабах и, предпочтительно, они должны находиться в пределах рекомендуемого в стране качества соложения, например, в соответствии с рекомендациями Европейской Конвенции Пивоваров для качества соложения (Analytica-EBC/European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans CarlGetrnke-Fachverlag, Nrnberg, Germany). После варки пива в пилотных или полупромышленных масштабах пиво разливают в коричневые бутылки и охлаждают до 5 С для оптимального хранения. На этой стадии свежее пиво можно анализировать на опытными дегустаторами (стенды для проверки вкусовых качеств), способными обнаружить специфический вкус и аромат пива, включая транс-2-ноненаль, соединение с неприятным привкусом. Кроме того, пиво анализируют химически на основные вкусовые компоненты, включая транс-2-ноненаль. Эти методы анализа качества пива затем повторяют для пива после хранения в различных условиях, которые, как известно, выявляют стабильность пива при длительном хранении, например, в режиме принудительного старения. Как показано далее в примерах, ячмень Линии G выращивают (размножают) в поле в течение нескольких сезонов, чтобы получить 10 т солода этой линии в промышленной солодовне. Контрольные сорта ячменя cv Винтаж и cv Невада, оба имеющие фенотип LOX-1 дикого типа, солодят в аналогичных условиях. Высушенный солод Линии G и контрольных культурных сортов ячменя соответствует техническим условиям, предъявляемым к полупромышленным испытаниям варки пива. Опытные пробы варки пива осуществляют в масштабе 30 гл и оценка пива, только что разлитого по бутылкам, показывает, что пиво, сваренное из солода как Линии G, так и контрольных культурных сортов, имело содержание транс-2-ноненаля ниже вкусового порога и признано удовлетворительным при испытании вкусовых качеств. Два режима принудительного старения, либо хранение при 37 С в течение 7 дней, либо хранение от 6 до 12 недель при 30 С, применяют для оценки стабильности вкусовых качеств пива. Найдено, что стабильность вкусовых качеств пива, сваренного из солода Линии G, выше стабильности вкусовых качеств контрольного солода, как в отношении оценки вкусовых качеств, так и с точки зрения уровня свободного транс-2-ноненаля, и улучшение найдено статистически значимым. Примеры Данное изобретение далее поясняется представленными ниже примерами. Следует понимать, что примеры, описывающие предпочтительные варианты изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Пример 1. Скрининг и отбор изофермента (изоэнзима) липоксигеназы. Мутанты из мутагенизированного ячменя. 1. Мутагенез ячменя. Зерна ячменя, Hordeum vulgare cv Винтаж и cv Карузо, мутагенизируют под действием азида натрия по опубликованной методике (Kleinhofs et al., 1978 Mutation Research 51: 29-35). Мутагенез вводит точковые мутации в геномную ДНК, которая, например, может вызвать аминокислотные замены в кодируемых белках. Мутантные M1 зерна размножают в солодовне в течение двух поколений и зерна М 3 собирают для скрининга. Наблюдаемая частота встречаемости отдельных генных мутантов с характерными признаками в поколении М 2, согласно Kleinhofs et al., 1978, см. выше, составляет 1,0-2,7 мутантов на 10000 зерен из поколения М 2. Так как большинство генных мутантов являются рецессивными и обнаруживаются только в гомозиготном состоянии, скрининг мутагенизированной популяции проводят в поколении М 3, где ожидаемая доля гомозиготных мутантных зерен будет выше. В мутагенизированном материале М 3 ожидается частота встречаемости мутаций 0,9-2,3 на 10000 зерен. 2. Недеструктивный анализ липоксигеназной-1 (LOX-1) и липоксигеназной-2 (LOX-2) активности в М 3 мутагенизированных зернах. Быстрая методика скрининга с целью обнаружения мутантных зерен ячменя с пониженной LOX-1 создана на основе следующих критериев: Методика скрининга не должна препятствовать размножению зерен/рассады; уровни экспрессии липоксигеназной активности отобранной ткани зерна/проростка-9 007955 должны поддаваться количественному определению; метод анализа должен отличать активность LOX-1 от активности LOX-2; и методика анализа должна охватывать множество образцов. Уровни общей липоксигеназной активности в различных тканях прорастающего зерна, а именно, в ростке, корне и в ткани скутеллума зародыша и в эндосперме, анализируют следующим образом: Экстракты ткани проростка готовят, гомогенизируя ткани в ледяном 20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, содержащем 2 мМ NaN3 и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), с последующим удалением нерастворимого материале центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. Липоксигеназную активность в 100 мкл экстракта анализируют при 25 С, добавляя 2,9 мл 20 мМ субстрата линолевой кислоты, получаемого диспергированием 35 мкл линолевой кислоты (свободная кислота, L-1376, Sigma, USA) в 5 мл Н 2 О, содержащей 1% Tween 20. За реакцией следят спектрофотометрически, проверяя, пропорциональна ли скорость увеличения поглощения при 234 нм (А 234 нм) вследствие образования сопряженного диена в продукте гидроперокисления имеющейся ферментной активности. Одну единицу липоксигеназной активности определяют как А 234=0,001 в минуту в реакции на 3 мл, эквивалентной окислению 0,12 мкмол линолевой кислоты. Листовая ткань зерна, прораставшего в течение 4 дней в темноте, имела наиболее высокие уровни липоксигеназной активности (Holtman et al., 1996, Plant Physiology 111: 569-576). Поэтому для недеструктивного анализа липоксигеназы выбирают верхушки листьев 4-дневного проростка. Проверяют оптимальное значение рН общей липоксигеназной активности ячменя между 4,5 и 9,0; оказывается, оптимальным является рН 6,5. Поэтому для скрининга выбирают буфер 0,25 мМ HEPES (рН 6,5), содержащий 0,2 М борной кислоты. Так как оба фермента, LOX-1 и LOX-2, обнаруживаются с помощью иммунологического анализа в ростках 4-дневных проростков (сеянцев) (Holtman et al., 1996, см. выше), то применяют специфический анализ LOX-1 и LOX-2. Найдено, что ингибитор липоксигеназы, нордигидрогвайяретовая кислота(NDGA), идентифицированная Eskin et al., 1977, Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1-40, является селективным ингибитором липоксигеназ ячменя. NDGA в количестве 1x10-5 М сильно ингибирует LOX-2 активность очищенного ячменя, тогда как LOX-1 сохраняет 47% активности (фиг. 1). Селективность этого ингибитора проверяют анализом верхушек листьев, устанавливая соотношение 9-гидропероксиоктаноида (9-HPOD) к 13-гидропероксиоктаноиду (13-HPOD), которые образуются при окислении линолевой кислоты LOX-1 и LOX-2, соответственно. В анализе липоксигеназы в верхушках листьев cv Винтаж доля образующегося 13-HPOD падает с 24,5 до 9,5% при добавлении 1 х 10-5 М NDGA. Селективный анализ на LOX-2 активность в экстрактах верхушек листьев основан на примененииLOX-1-специфического моноклонального антитела (5D2) (Holtman et al., 1996, см. выше) для иммунопреципитации LOX-1, присутствующего в экстрактах. Остаточная липоксигеназная активность, обнаруживаемая в экстрактах после осаждения LOX-1, является мерой LOX-2 активности. Эффективность этой иммунопреципитации (описанной ниже) оценивают, определяя количественно остаточный LOX-1 иLOX-2 в супернатанте экстракта методом ELISA с применением специфических моноклональных антител против LOX-1 (обозначено 5D2) и LOX-2 (обозначено 5.8) (Holtman et al., 1996, см. выше). Иммунопреципитацией LOX-1 из экстрактов верхушек листьев cv Винтаж удаляется 85% белка (LOX-1) и 15% белка LOX-2. Иммунопреципитацию осуществляют в 96-луночном планшете с V-образными лунками, добавляя 5 мкл гранул Dynabeads (Dynal), нагруженных 5D2, и 75 мкл буфера [20 мл Tris-HCl pH 7,5, 1% (об./об.) сыворотки плода коровы (HyClone)] к 20 мкл каждого экстракта верхушки листьев. Планшеты инкубируют в планшетном шейкере (MTS4, IKA, Labor Technik) в течение 1 ч при 4 С. Иммунопреципитат собирают центрифугированием при 4 С в центрифуге Sigma 302-K в течение 10 мин при 2000 об./мин. Супернатант (70 мкл) от каждого образца анализируют на липоксигеназную активность в 96-луночном плоскодонном планшете, как описано ниже, но с добавлением 100 мкл буфера для анализа (25 мМHEPES, 0,2 М борной кислоты, рН 6,5). Анализ LOX-1 и LOX-2 адаптируют для высокопроизводительного скрининга. Кончики листьев (1 см) от восьми зерен с 4-дневными проростками по отдельности гомогенизируют в 150 мкл ледяного буфера (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5) в течение 2 х 30 с в многолуночном гомогенизаторе (Berg et al., 1992, Electrophoresis 13: 76-81). После центрифугирования в течение 15 мин при 3000 об./мин 40 мкл супернатанта каждого экстракта переносят в плоскодонный 96-луночный планшет. В каждую лунку добавляют 170 мкл буфера (25 мМ HEPES, 0,2 М борной кислоты рН 6,5, 110-5 М NDGA) и 10 мкл субстрата (20 мМ линолевой кислоты) и затем инкубируют в течение 20 мин при 25 С. Реакцию прекращают, добавляя 20 мкл насыщенного раствора йодистого калия (KI), и инкубируют еще в течение 8 мин при 25 С. Окислительно-восстановительная реакция между гидропероксидиенами и KI дает I2, который контролируют по максимуму экстинкции при 350 нм в планшет-ридере (Multiskan MCC/340). 3. Идентификация возможных мутантов липоксигеназы 1 в зернах М 3 и М 4 мутагенизированного ячменя. Зерна поколения М 3 cv Винтаж и cv Карузо хранят при 45 С в течение 6,5 дней для прерывания покоя, что гарантирует 95%-ную всхожесть. Зерна М 3 cv Винтаж и cv Карузо проращивают и проводят- 10007955 скрининг на линии, LOX-1 активность которых составляет 15% или менее активности зерен дикого типа. Предполагаемые мутантные линии (50 линий cv Винтаж и 42 линий cv Карузо) размножают до поколения М 4, собирают и проросшее зерно снова подвергают скринингу. Мутантный фенотип LOX-1 подтверждают в одной линии cv Винтаж и в шести линиях cv Карузо, после определения липоксигеназной активности в экстрактах 5 верхушек листьев из каждой линии. После изучения LOX-1 и LOX-2 активности в прорастающих зародышах этих 7 предполагаемых мутантов только у мутанта cv Винтаж (обозначенного Линия G) наблюдается основное уменьшение LOX-1 активности. В спелых находящихся в состоянии покоя зернах липоксигеназная активность, присутствующая в зародыше, представляет собой почти исключительно LOX-1 активность вследствие различного характера экспрессии двух изоферментов (изоэнзимов) (Schmitt and Mechelen, 1997, Plant Sci. 128: 141-150). Общая липоксигеназная активность в экстрактах зародышей спелых сухих зерен Линии G (поколение М 5) равна 0,060,04 U/мг белка по сравнению с 0,0740,44 U/мг в экстрактах зародышей cv Винтаж, как определено спектрофотометрическим анализом липоксигеназы, описанным в разделе 2 примера 1. Найдено, что остаточная липоксигеназная активность в спелом зародыше Линии G как поколения 4, так и поколения 5 составляет, приблизительно, 9% от значения в родительской линии. Пример 2. Линия G является мутантом cv Винтаж с фенотипом с низкой липоксигеназной активностью. Агрономические качества и мутантный фенотип Линии G анализируют на материале поколения М 5. Исходные (начальные) анализы проводят для того, чтобы подтвердить, что анализируемый М 5 материал является гомозиготным для мутантного фенотипа. Фенотип с низкой активностью LOX-1, обнаруживаемый в поколении М 3, мог возникнуть в результате доминантной или рецессивной мутации. Если Линия П, выбираемая в поколении М 3, гетерозиготна для доминантной мутации, тогда в последующих поколения будет наблюдаться расщепление по фенотипу. Определяют липоксигеназную активность у 26 отдельных зародышей зерен Линии G поколения М 5 в состоянии покоя. Липоксигеназная активность у всех зародышей Линии G очень низка, при среднем значении 0,060,04 U(ед.) липоксигеназы на мг белка, по сравнению с 0,0740,44 U(ед.) липоксигеназы на мг белка у зародышей cv Винтаж дикого типа cv Винтаж. Эти данные подтверждают, что Линия G в поколении М 5 гомозиготна для признака низкой липоксигеназной активности. 1. Линия G имеет физиологию роста и развитие зерна растения дикого типа. Зерно Линии G и cv Винтаж проращивают и выращивают в камере искусственного климата при 16 часовом световом дне при 15 С и 8 ч в темноте при 12 С при относительной влажности 80%. Признаки роста растений Линии G и cv Винтаж аналогичны в том, что касается веса растения, числа ростков на растение, начала цветения и числа зерен в колосе. Вес сырой ткани (фиг. 2) и сухой вес (фиг. 3) зерна Линии G и дикого типа cv Винтаж в период развития с 5 дней после цветения (DAF) до полной спелости,приблизительно, 90 DAF, очень схожи. 2. Зерна Линии G имеют фенотип с низкой липоксигеназной 1 активностью в течение всего периода развития. Липоксигеназную активность определяют в экстрактах развивающегося ячменного зерна Линии G(поколение М 5) и дикого типа cv Винтаж. Зерна гомогенизируют в ледяном буфере Tris-HCl pH 7,5, содержащем 0,1 об.% Nonidet Р-40, неионного детергента, который повышает экстракцию липоксигеназы,и центрифугируют при 15000 g в течение 20 мин для удаления нерастворимых материалов. Липоксигеназную активность в экстрактах определяют полярографически в 200 мкл насыщенного кислородом буфера (0,2 М борной кислоты, 25 мМ HEPES, рН 6,5), содержащего 1,2 мМ линолевой кислоты при 25 С,используя электрод типа электрода Кларка для измерения расхода кислорода. Липоксигеназная активность повышается в течение первых 20 дней развития зерна как Линии G, так и дикого типа, но только в зерне Линии G уровень активности падает в период созревания зерна (фиг. 4). Относительные количества 9-HPOD и 13-HPOD, образующихся при окислении линолевой кислоты,являются мерой уровней активности LOX-1 и LOX-2 в зерновых экстрактах. В данном случае Nonidet P40 не добавляют в буфер для экстракции из зерен, чтобы избежать совместную экстракцию расходующих гидроперекись (гидропероксид) ферментов. Экстракты (100 мкл), смешанные с 10 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, содержащего 200 мкМ линолевой кислоты, инкубируют в течение 20 мин. Реакцию прекращают, доводя рН до 3,5, и добавляют внутренний стандарт. Гидропероксиды, образующиеся при анализе, наносят на колонку с октадецильной твердой фазой (Bakerbond, Baker) и элюируют метанолом. 9HPOD и 13-HPOD затем разделяют обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С-18 изократическим элюирующим растворителем (тетрагидрофуран:метанол:Н 2 О:уксусная кислота; 25:30:44,9:0,1 (об./об.), рН смеси доводят до 5,5 с помощью концентрированного раствора аммиака) при скорости тока 0,5 мл/мин,как описано в Aarle et al., 1991, FEBS Letters 280: 159-162. Гидропероксиды обнаруживают при 234 нм и пики HPOD корректируют в соответствии с внутренним стандартом, простагландином В 2. На фиг. 5 показано, что 13-HPOD является основным продуктом липоксигеназной активности, присутствующей в зерне в течение первых 20 DAF, тогда как 9-HPOD образуется при использовании липоксигеназ, активных в период созревания зерна. Хотя зерновые экстракты как Линии G, так и дикого типа имеют общий одинаковый профиль 13-HPOD синтетической активности, у зерен Линии G не наблюдается подъема 9-HPOD синтетической активности, который имеется у зерен дикого типа. Эти данные согла- 11007955 суются с потерей LOX-1 активности в созревающих зернах ячменя Линии G. 3. Зерна Линии G имеют фенотип с низкой липоксигеназной 1 активностью при прорастании. Общую липоксигеназную активность в экстрактах зерновых зародышей, пророщенных при 15 С,анализируют, как описано в примере 1. Липоксигеназная активность, присутствующая в находящемся в покое зерне дикого типа, падает в первые 4 дня прорастания, а затем увеличивается (фиг. 6). В линии G липоксигеназная активность в находящемся в покое зерне очень низка, но увеличивается после 4 дней. Анализ HPOD, образующихся вследствие липоксигеназной активности в прорастающих зародышах,показывает, что 9-HPOD является основным продуктом липоксигеназ, присутствующих в находящемся в покое зерне дикого типа (фиг. 7). Уровень образования 9-HPOD падает с падением липоксигеназной активности в экстрактах. Подъем липоксигеназной активности через 4 дня сопровождается образованием 9-HPOD и 13-HPOD. Низкая липоксигеназная активность находящегося в покое зерна Линии G связана с отсутствием образования HPOD, тогда как подъем активности через 4 дня, главным образом, приводит к образованию 13-HPOD. Эти данные дают доказательство того, что LOX-1 активность, приводящая к образованию 9-HPOD, значительно понижена в зародышах развивающегося, находящегося в покое и прорастающего ячменного зерна Линии G, тогда как LOX-2 активность, приводящая к образованию 13HPOD, не изменяется в Линии G. Пример 3. Линия G имеет мутантный ген липоксигеназы 1 (lох-1), вызывающий появление фенотипа с низкой липоксигеназной активностью. Изучена молекулярная основа фенотипа с низкой LOX-1 активностью Линии g, чтобы получить полное описание мутанта. Для полной характеристики фенотипа проводят следующие анализы. 1. Липоксигеназа-1 синтезируется в развивающемся и прорастающем зерне Линии G. Вестерн блот анализ экстрактов зародышей развивающихся и прорастающих ячменных зерен осуществляют параллельно с определением липоксигеназной активности, как описано в примере 2. Сырые экстракты разделяют электрофорезом в натрийдодецилсульфат-акриламидном геле (SDS-PAGE) по методике Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685. Разделенные белки переносят на нитроцеллюлозу, используя полусухой блоттинг по методике Towbin et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354. Блот гибридизуют с зондом LOX-1 специфического моноклонального антитела, 5D2, как описано Holtman et al.,1996, Plant Physiology 111: 569-576, в разведении 500 х, с последующим инкубированием с антителом козы к мыши, связанным со щелочной фосфатазой, и обнаруживают с помощью нитро голубого тетразолия и 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата - субстратов щелочной фосфатазы, как описано в Holtman et al.,1996, Plant Physiol. 111: 569-576. Вестерн блот анализ показывает, что белок LOX-1 обнаруживается в развивающемся зерне в зародышах cv Винтаж от 10 DAF, и уровень повышается во время созревания зерна (фиг. 8). Белок также присутствует в зародыше находящегося в покое зерна cv Винтаж, но медленно уменьшается во время прорастания (фиг. 9). Хотя LOX-1 распознается в экстрактах зародышей ЛинииG и мигрирует в SDS-PAGE как белок размера, аналогичного LOX-1 cv Винтаж, определяемые иммунным анализом уровни белка в Линии G немного ниже, чем в cv Винтаж. 2. Ген lох-1 экспрессирует во время развития и прорастания зерна Линии G. Тотальную РНК выделяют из зародыша развивающегося и прорастающего ячменного зерна по методике Hensgens and van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163-168, параллельно с измерением липоксигеназной активности, описанным в примере 2. Образцы РНК (7,5 пг) выделяют на денатурирующих агарозных гелях и анализируют методом Нозерн-блоттингом, как описано Sambrook et al., 1989 вMolecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY. Блоты гибридизуют с 32 Р-меченым зондом, полученным из 3' нетранслируемой области, нуклеотиды 2659-2801 [SEQ ID NO: 1],кДНК lox 1 (EMBL NO L35931), как описано Holtman et al., 1996 Plant Physiol. 111: 569-576, используя набор случайных праймеров Amersham Random Prime Kit. Транскрипты Lox-1, кодирующие LOX-1, обнаруживают в зародышах развивающихся и зрелых зерен cv Винтаж и Линии G с 30 DAF (фиг. 10). Уровень транскриптов lох-1 повышается при прорастании как в зародышах cv Винтаж, так и Линии G, что показывает de novo экспрессию гена lох-1 (фиг. 11). Так как детектируемые уровни транскриптов lох-1 аналогичны в зародышах Линии G и cv Винтаж, ни пониженная транскрипция, ни устойчивость транскрипции lох-1 не могут быть ответственны за фенотип с низкой липоксигеназной активностью Линии G. 3. Ген lох-1 Линии G кодирует мутантную форму липоксигеназы-1. Нуклеотидную последовательность гена lох-1 Линии G и cv Винтаж анализируют и сравнивают,чтобы определить молекулярную основу для низко-LOX-1 фенотипа Линии G, который характеризуется нормальной транскрипцией гена lох-1, но пониженными аккумуляцией и активностью в экспрессирующем ферменте-липогеназе - в зерне. Геномную ДНК Линии G и cv Винтаж дикого типа выделяют из листовой ткани проростка по методу, описанному Pich and Schubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328. Ген lox-1 в препаратах геномной ДНК амплифицируют полимеразной цепной реакцией (PCR), используя праймеры на основе гена lox-1 (vanMechelen et al. 1995, BBA 1254: 221-225; Rouster et al., 1997, Plant J. 11: 513-523). Положение и последовательность кодирующих областей, указанных на фиг. 12, суть следующие. Для PCR-амплификации домена промотора lох-1 (от -361 до +68) Линии G и lox-1 cv Винтаж при- 12007955 меняют прямой праймер 5'-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC- 3' [SEQ ID NO: 2] и обратный праймер 5'-ТАТ AGG АТС CTT GTT СТТ GGC СТС СТС ТСС TCG-3' [SEQ ID NO: 3]. Для PCR-амплификации кодирующей области lox-1 Линии G применяют прямой праймер 5'-AGTTGC TGA-3' [SEQ ID NO: 5]. Для PCR-амплификации кодирующей области lox-1 cv Винтаж применяют прямой праймер 5'-СААPCR-реакции проводят с 250 нг геномной ДНК в объеме 50 мкл, содержащем 50 пмол праймера и 2U бое ДНК полимеразы (Promega), в соответствии с инструкциями изготовителя фермента. Амплификацию PCR проводят в блоке Stratagene Robocycler: 1 мин при 94 С, 1 цикл; 1 мин при 94 С, 2 мин при 62 С и 5 мин при 72 С, 30 циклов; 10 мин при 72 С, 1 цикл. Продукты PCR разделяют на 1,2% агарозных гелях. Фрагменты ДНК, соответствующие по длине амплифицированной области, очищают с помощью набора для экстракции из геля Qiax П (Qiagen) и клонируют в плазмиду пкДНК 2.1 (Invitrogen). Нуклеотидную последовательность обеих нитей клонированной промоторной и кодирующей областей lox-1 определяют, используя реакцию терминации дидезоксинуклеотидной цепи со специфическими олигонуклеотидными праймерами и анализируют на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE Biosystems). Сравнение последовательностей осуществляют, применяя пакет программ для анализа последовательностей DNA STAR (DNA STAR Inc., USA). Промоторная область и интронэкзонная структура кодирующей области lox-1 ячменя показаны на фиг. 13, они установлены в результате сравнения нуклеотидных последовательностей геномной и кДНКlох-1 дикого типа (фиг. 12). Секвенируемая область lох-1 промоторной области от -363 до +68 (нумерация относительно определенного сайта начала транскрипции; van Mechelen et al., 1995, ВВА 1254: 221225) является достаточной для того, чтобы направлять эмбриоспецифическую и транзиторно регулируемую генную экспрессию, характерную для нативного гена (Rouster et al., 1998, Plant J 15: 435-440). Промотор и транскрибируемая область гена lох-1 дикого типа [SEQ ID NO: 8] представляет собой область протяженностью 4663 nt (нуклеотидов) и содержит 6 интронов между 82 nt и 634 nt в длину, которые отсутствуют в соответствующей кДНК [SEQ ID NO: 10] и должны, следовательно, быть удалены при сплайсинге транскрипта РНК. Сравнение нуклеотидной последовательности lох-1 Линии G с нуклеотидной последовательностью дикого типа (фиг. 12) показывает, что аллель lох-1 Линии G имеет две точковых мутации. Одна мутация представляет собой молчащую замену СТ в положении 221 в экзоне 1, а вторая представляет собой замену GА в положении 2347 в экзоне 3 (фиг. 13). Ген lох-1 дикого типа ячменя кодирует белок из 862 аминокислотных остатков [SEQ ID NO: 9], тогда как мутация в положении 2347 аллеля lох-1 Линии G вызывает аминокислотную замену глицина на аспарагиновую кислоту в остатке 368 кодируемого белка. Сравнение первичных структур родственных растительных липоксигеназ показывает, что глицин 368 в LOX-1 ячменя является строго консервативным. Кроме того, этот остаток, который соответствует глицину-353 в LOX-1 сои, является одним из 51 нейтрального или гидрофобного остатка, который "покрывает" полость субстрата фермента, как видно из кристаллической структуры (Minor et al., 1996, Biochemistry 35: 10687-10701), и показано на фиг. 22. Следовательно, инсерция заряженного аминокислотного остатка в это положение, по-видимому, нарушает структурные и функциональные свойства фермента. 4. Мутантный белок LOX-1, кодируемый аллелем lох-1 Линии G, обладает низкой ферментной активностью и ответственен за фенотип с низкой липогеназной активностью Линии G. Мутагенез зерен cv Винтаж под действием азида натрия, который вызвал мутантный аллель lох-1 Линии G, возможно, вызвал дополнительные мутации в геноме Линии G. Два экспериментальных подхода выбраны для того, чтобы продемонстрировать, что скорее мутантный аллель lох-1 Линии G ответственен за ее фенотип с низкой липоксигеназной активностью, нежели другие мутации в геноме. Ферментную активность LOX-1, кодируемого мутантным и дикого типа аллелем lох-1, определяют для того, чтобы доказать, что замена глицинаспарагиновая кислота в мутантном ферменте вызывает пониженную стабильность и активность. Два гена lох-1 транзиторно экспрессируют в протопластах алейронов, выделенных из набухших спелых зерен, так как полагают, что уровень экспрессии эндогенной липоксигеназы в этих клетках ниже предела обнаружения. Ни один из идентифицированных генов липоксигеназы ячменя, которые экспрессируют в прорастающем ячмене, не обнаруживают в тканях алейронов (van Mechelenet al., 1999, см. выше). Для того, чтобы направлять транзиторную экспрессию гена lох-1 в протопластах алейронов, их кодирующие области трансляционно сливают с конститутивным промотором, о котором известно, что он активен в этих протопластах. Кодирующие области мутантного (положения в последовательности от +1 до +4350) и дикого типа гена lох-1 (положения в последовательности от +69 до +4230) и кДНК lох-1 дикого типа (положения в последовательности от +69 до +2654), каждую клонированную в плазмиду пкДНК 2.1 (см. раздел 3), разрезают гидролизом по сайтам KpnI и EcoRV в полилинкере вектора. Кодирующие области клонируют в плазмиду pUBARN (Jensen et al., 1998, Hereditas 129: 215-225) между конститутивно активным промото- 13007955 ром убиквитина Ubi кукурузы (как описано в патенте США 005510474 А) и терминатором Nos вместо гена bar, который кодирует фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (фиг. 14). Протопласты выделяют из ткани алейрона набухшего Hordeum vulgare cv Himalaya (Гималайя) в соответствии с протоколом Skriver et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270. Аликвоты 2105 протопластов трансфицируют при 0 С при использовании 100 пг плазмидной ДНК (эквимолярные количества каждой плазмиды) с помощью опосредуемого ПЭГ поглощения ДНК (Lee et al., 1997, Plant Mol.Biol. 13: 21-29), а затем инкубируют в культуральной среде протопластов алейронов при 25 С, как описано ранее (Skriver et al., 1991 см. выше). После 48 ч инкубации культуральную среду осторожно удаляют и протопласты снова суспендируют в 300 мкл буфера для анализа липоксигеназы (0,2 мМ борной кислоты, 25 мМ HEPES, рН 6,5). Гомогенаты центрифугируют при 15,000 g в течение 5 мин для осаждения нерастворимого материала, а супернатанты (10 мкл) последовательно анализируют на общую липоксигеназную активность, используя быстрый метод скрининга, описанный в примере 1, раздел 1, но ингибиторNDGA опускают. Содержание белка в экстрактах протопластов определяют по Брэдфорд методом "сухого связывания" (Bradford 1976, Anal. Biochem., 72: 248) с реагентами, выпускаемыми Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA, а липоксигеназную активность выражают в мг белка в экстракте. Протопласты, трансфицированные при использовании контрольной плазмиды pUBI-GUS, где промотор убиквитина - 1 кукурузы направляет экспрессию репортерного гена -глюкуронидазы, не показывают заметной липоксигеназной активности. Транзиторная экспрессия дикого типа гена lох-1 и кДНК в протопластах в обоих случаях дает высокие уровни липоксигеназной активности в экстрактах протопластов. (фиг. 15). Более высокая экспрессия кДНК lох-1 дикого типа по сравнению с геномной последовательностью может быть вызвана более высокой частотой трансфекции для меньшей плазмиды экспрессии кДНК lох-1 (4929 п.о. против 6505 п.о. генной конструкции lох-1). Транзиторная экспрессия мутантного гена lох-1 дает низкие уровни липоксигеназной активности, 10% от липоксигеназной активности дикого типа. Эти данные четко показывают,что мутантный ген lox-1 в Линии G кодирует липоксигеназу со значительно более низкой активностью,которая ответственна за "низко - липоксигеназный" фенотип. Пример 4. Метод PCR-расщепление амплифицированного полиморфного сайта (PCR-CAPS): cпособ, применяемый для идентификации мутантного гена lох-1. Аналитический метод, позволяющий идентифицировать мутантный ген lох-1 Линии G в любой генетической среде, создан на основе анализа PCR-CAPS. Анализ включает PCR-амплификацию фрагментов геномной ДНК с последующим расщеплением амплифицированных последовательностей с помощью специфической рестриктазы для выявления полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP,ПДРФ). Кодирующая последовательность мутантного гена lох-1 "укрывает" две точковые мутации (см. пример 3), где мутация в положении 2347 (фиг. 12) вводит дополнительный сайт расщепления рестриктазой AatII, не обнаруженный в мутантном гене lox-1 (фиг. 16). Показано, что нижеприведенный PCRCAPS анализ, основанный на полиморфизме, вызванном присутствием этого сайта рестрикции в генеlох-1, позволяет различать ген lох-1 дикого типа и мутантный ген lох-1. Геномную ДНК выделяют из молодых листьев М 6 проростков Hordeum vulgare, Л. cv Винтаж и Линии G в соответствии с протоколом Pich and Schubert (1993, см. выше). Последовательность ДНК, охватывающая положение 2347 (сайт мутации гена lох-1 Линии G), амплифицируют PCR, используя праймеры, специфические для гена lox-1 [SEQ ID NO: 8]. Фрагменты ДНК, амплифицированные при использовании выбранного прямого праймера 5'-CGCTACGACGTCTACAACGA-3' [SEQ ID NO: 13] и обратного праймера 5'-CAGACTACTTTTTGGCGGGA-3' [SEQ ID NO: 14], показаны на фиг. 17. Реакции PCR проводят с 250 нг геномной ДНК в объеме 50-мкл, содержащем 50 пмол каждого праймера и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы (Promega) согласно инструкциям производителя. Амплификацию PCR проводят в блоке Stratagene Robocycler следующим образом: 1 мин при 94 С, 1 цикл; 1 мин при 94 С, 1,5 мин при 60 С и 2 мин при 72 С, 30 циклов; 10 мин при 72 С, 1 цикл. Амплифицированные фрагменты мутантного и дикого типа гена lох-1 суть 650 п.о. (фиг. 18), соответствующий ожидаемому по размеру (фиг. 17). PCR продукты, очищенные на вращающейся колонке (Qiagen), расщепляют с помощью 25 единиц AatII рестриктазы в течение 24 ч при 37 С и анализируют на 1,2% агарозном геле. Расщепление PCR-продукта lох-1 дикого типа дает фрагменты ДНК протяженностью 10, 179 и 462 п.о., а фрагменты продукта PCR мутантного lох-1 имеют в длину 10, 149, 179, и 313 п.о., где дополнительные фрагменты возникают благодаря частичному расщеплению продукта PCR lох-1 (фиг. 19). Структура фрагмента соответствует предполагаемой ПДРФ в результате этой мутации, где фрагмент 313 п.о. является уникальным для мутантного lох-1. Этот анализ PCR-CAPS дает воспроизводимый и специфический метод для идентификации аллеля lох-1 в ячмене и, следовательно, может использоваться в бридинг - программе ячменя, направленной на введение этого гена в новые сорта ячменя. Пример 5. Обратное скрещивание фенотипа с низкой липоксигеназной активностью Линии G с сv Алексис демонстрирует сцепление мутантного гена lох-1. Многократное обратное скрещивание используют для переноса фенотипа с низкой липоксигеназ- 14007955 ной активностью от линии G в рекуррентную родительскую форму (с которой гибрид скрещивается вновь) (в данном случае cv Алексис). Программа обратного скрещивания, показанная на фиг. 20, объединенная с селекцией фенотипа с низкой липоксигеназной активностью, постепенно заменяет геном ЛинииG на рекуррентный родительский геном. Кроме того, исключаются другие мутации, вводимые в геном Линии G во время мутагенеза под действием азида натрия. В первом беккроссе гомозиготной Линии G с низкой липоксигеназной активностью (указанный генотип ll) с cv Алексис (указанный генотип LL) линии потомства будут гетерозиготными (указанный генотип Ll). Фенотип с низкой липоксигеназной активностью вследствие рецессивной мутации не различим в линиях, гетерозиготных по причине мутации. Потомки являются самоопыляемыми и дают популяцию с нормальной менделевской сегрегацией, а именно, 1 LL: 2 Ll: 1 ll. Гомозиготный генотип ll с низким lох, образующийся в результате первого беккросса, содержит 50% генетического фона cv Алексис. После десяти циклов обратного скрещивания рекуррентный родительский фон составляет приблизительно 99,9%.Hordeum vulgare, L cv Алексис и Линии G размножают в теплице по программе обратного скрещивания. Зерна потомства беккроссов проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге, пропитанной 4 мл Н 2 О, в течение 3 дней при 22 С в темноте. "Низко-липоксигеназные" линии подвергают скринингу, измеряя общую липоксигеназную активность в экстрактах колиоптиля (верхушка 7 мм) проростков, как описано в примере 1. Потомков из 3 го и 4 го беккросса также анализируют на наследование мутантного гена lох-1 методом PCR-CAPS, описанным в примере 4. Ожидаемая частота "низко-липоксигеназного" фенотипа в потомстве после расщепления четырех поколений беккроссов составляет 25% для рецессивной мутации. Наблюдаемая частота низкой липоксигеназной активности в потомстве (24 зерна) четырех поколений беккроссов согласуется с ожидаемой частотой (фиг. 20). При анализе 3 го и 4 го беккросс-потомства с гомозиготным ll генотипом с низким lох методом PCR-CAPS найдено, что все они имеют диагностический фрагмент 313 п.о., тогда как у потомков с низкой липоксигеназной активностью дикого типа этот фрагмент отсутствует (фиг. 21). Программа обратного скрещивания показывает, что мутантный аллель lох-1 можно переносить в новую генетическую среду и что он наследуется при рецессивным монофакториальным способом согласно менделевскому расщеплению. Так как рекуррентный родительский фон составляет 93,8% в потомстве, полученном в результате 4 х-кратных беккроссов, совместное наследование мутантного гена lox1 и фенотипа с низкой активностью липоксигеназы подтверждает сцепление этого гена. Пример 6. Пиво, сваренное из ячменного солода Линии G, накапливает меньше транс-2-ноненаля при стоянии, что дает повышенную вкусовую стабильность.Hordeum vulgare, L cv Винтаж и Линии G размножают в поле в течение нескольких сезонов, чтобы получить достаточно зерна для соложения в промышленных масштабах. Нижеследующие пробные соложение и пивоварение в промышленных масштабах, а также анализы готового пива осуществляют для того, чтобы продемонстрировать ценность ячменя Линии G с низкой липоксигеназной активностью для повышения вкусовой стабильности. 1. Промышленное соложение и сушка ячменя Линии G и cv Винтаж. Соложение осуществляют в масштабе 10 т в промышленной солодовне в двух опытах следующим образом. Опыт 1. Ячменное зерно Линии G (урожай 1996 года). Условия замачивания: 8 ч влажное; 14 ч сухое; 8 ч влажное; 10 ч сухое; 4 ч влажное при температуре воды для замачивания 16 С. Условия соложения: 12 ч при 18 С; 24 ч при 16 С; 24 ч при 14 С; 60 ч при 12 С. Условия сушки: 12 ч при 60 С; 3 ч при 68 С; 4 ч при 74 С; 3 ч при 80 С. Опыт 2. Ячменное зерно cv Винтаж и Линии G (урожай 1996/1997 года). Условия замачивания: 8 ч влажное; 10 ч сухое: 6 ч влажное; 15 ч сухое; 4 ч влажное при температуре воды для замачивания 15 С. Условие соложения: 5 дней при температуре воздуха внутри 15 С и при опрыскивании для поддержания уровня влажности. Условия сушки: 10 ч при 50 С; 2 ч при 60 С; 2,5 ч при 80 С. Сравнение анализа соложения 2 образцов солода Линии G из опыта 1 с контрольным солодом cv Невада (табл. 1), а из опыта 2 с cv Винтаж (табл. 2) подтверждают, что солод Линии G подходит для испытания пивоварения. 2. Промышленное пивоварение из солода Линии G, cv Винтаж и контрольного солода cv Невада. Проводят две опытных варки пива, используя сусло, приготовленное из солода Линии G и контрольного солода cv Невада из опыта 1 и из солода Линии G и контрольного солода cv Винтаж из опыта 2. Пиво варят в промышленном масштабе 30 гл из 475 кг солода по следующей схеме: Затирание при 50 С; 30 мин при 50 С; 30 мин нагревание от 50 до 70 С. Часть сусла нагревают в течение 20 мин от 70 до 100 С и 5 мин при 100 С, в то время, как основную часть затора выдерживают при 70 С еще в течение 25 мин, а затем обе порции затора объединяют и выдерживают при 76 С в течение 10 мин. Стадии пивоварения - кипячение сусла, отделение отработанного зерна в вирпуле, охлаждение, брожение, осветление и разлив в коричневые стеклянные бутылки - осуществляют в соответствии со стандартной практикой пивоварения. 3. Вкусовая стабильность и содержание T2N в пиве, сваренном из солода Линии G, солода cv Винтаж и контрольного солода cv Невада. Свежеприготовленное разлитое по бутылкам пиво хранят при 5 С и анализируют в течение 2 месяцев с момента производства. Вкусовую стабильность свежего и постоявшего пива оценивают в двух независимых лабораториях после хранения пива в двух различных условиях. В лаборатории А пиво подвергают принудительному старению, когда пиво хранят при 37 С в течение 7 дней, тогда как в лаборатории В пиво хранят при 30 С в течение 6 и 12 недель. Уровни транс-2-ноненаля в пиве определяют газовой хроматографией и масс-спектрометрией после дериватизации карбонильных групп под действием O(2,3,4,5,6-пентафторбензил)гидроксиламина, в основном, как описано Gronquist et al. 1993 Proceedings ofthe 24 EBC Congress, Oslo, 421-428. Опытный дегустатор пива дает общую оценку пива, которая включает определение "привкуса картона", указывающего на наличие свободного транс-2-ноненаля в пиве.- 17007955 Лаборатория А. Стойкость к принудительному старению. Сравнение пива, сваренного из солода Линии G и контрольного солода, cv Невада, в первой опытной варке пива (табл. 3) показывает, что пиво из ячменя Линии G имеет более высокую вкусовую стабильность и более низкое содержание транс-2-ноненаля после принудительного старения по сравнению с контрольным. Вторая опытная варка, в которой сравнивают пиво, сваренное из солода Линии G, с пивом,сваренным из солода cv Винтаж, родительского культурного сорта, подтверждает данные первого опыта. Шкала оценки вкуса и аромата пива от 1 до 10 по мере повышения качестватранс-2-ноненаль Таблица 4 Шкала оценки вкуса и аромата пива от 1 до 10 по мере повышения качестватранс-2-ноненаль Лаборатория В: cтойкость к хранению при 30 С. Пиво, сваренное из солода Линии G, имеет более низкие уровни транс-2-ноненаля после 6- и 12 недельного хранения при повышенной температуре 30 С по сравнению с пивом, сваренным из любого эталонного солода (табл. 5 и 6), и имеет более высокую вкусовую стабильность по оценкам дегустаторов(стенд для определения вкусовых качеств). Вкусовой порог для транс-2-ноненаля в этих анализируемых образцах пива лежит около 0,08 млрд. долей. Таблица 5 Оценка присутствия транс-2-ноненаля по шкале 1-10 Показано, что повышенная вкусовая стабильность пива, сваренного из солода Линии G, после хранения при 30 С является статистически значимой (табл. 7). Таблица 7 Так как естественные уровни сульфита низки в обеих опытных варках пива, уровни свободного транс-2-ноненаля в старом пиве близко отражают потенциал транс-2-ноненаля в различных образцах пива, а именно, уровень аддуктов транс-2-ноненаля, присутствующих в пиве. Добавление сульфита может временно задерживать процесс старения за счет комплексообразования свободного транс-2-ноненаля до тех пор, пока уровни сульфита не уменьшатся вследствие окисления из-за газообмена через упаковку. Описанные опыты по варке пива с ячменным солодом с низким LOX-1 дают первое несомненное доказательство того, что LOX-1 активность в ячмене в период соложения и процесса варки пива является главным фактором, определяющим появление соединения с неприятным привкусом, транс-2-ноненаля, в старом пиве. В вышеприведенном описании приводятся ссылки на многочисленные публикации. Каждая публикация вводится в данное описание в качестве ссылки для всех целей, как если бы была представлена полностью.