Штаммы talaromyces и ферментные композиции

(US), Зийл Ван Маргриета Фредерик Ким, Фоллебрехт Адрианус Вильхельмус Херманус,Сарантинопоулос Панайотис (NL) Воробьева Е.В. (RU) Настоящее изобретение относится к штаммам Talaromyces. Изобретение также относится к ферментным композициям, которые могут вырабатывать штаммы Talaromyces. Кроме того,изобретение относится к способам получения полезных продуктов из лигноцеллюлозного материала с помощью ферментных композиций.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к штаммам Talaromyces и мутантам с улучшенной выработкой целлюлаз. Изобретение также относится к ферментным композициям, которые могут вырабатывать штаммы Talaromyces. Кроме того, изобретение относится к способам получения полезных продуктов из (лигно)целлюлозного материала с помощью ферментных композиций. Предшествующий уровень техники Углеводы являются наиболее распространенными органическими соединениями на Земле. Однако многие углеводы депонируются в сложных полимерах, включая крахмал (основной запасающий углевод в семенах и зернах), и агрегатах углеводов и лигнина, известных как лигноцеллюлоза. Основными углеводными компонентами лигноцеллюлозы являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектины. Эти сложные полимеры часто упоминаются под общим названием лигноцеллюлоза. Биопреобразование возобновляемой лигноцеллюлозной биомассы в поддающийся ферментации сахар, который затем ферментируется с получением спирта (например, этанола), в качестве альтернативы жидкому топливу привлекло пристальное внимание исследователей после 1970-х г., когда из-за снижения добычи нефти ОПЕК разразился нефтяной кризис. В течение последних двух десятилетий этанол широко применялся в качестве 10% примеси к бензину в США или как чистое топливо для автомобилей в Бразилии. Совсем недавно специально для программы "чистый город" внедрили Е 85, 85% этанольную смесь. Важность топливного биоэтанола будет расти параллельно с ростом цен на нефть и постепенным истощением ее источников. Кроме того, поддающиеся ферментации сахара применяют для получения пластиков, полимеров и другой биопродукции и эта отрасль, как ожидается, будет в существенной степени расти, что приведет к повышению спроса на дешевые распространенные ферментируемые сахара,которые могут быть использованы в качестве сырья вместо сырья на основе нефти. Депонирование таких больших количеств углеводов в растительной биомассе обеспечивает изобильный источник потенциальной энергии в форме сахаров как пятиуглеродных, так и шестиуглеродных, которые могут быть применены во множестве промышленных и сельскохозяйственных процессов. Однако огромный энергетический потенциал этих углеводов в настоящее время используется недостаточно, поскольку эти сахара блокированы в сложных полимерах и, следовательно, не являются легко доступными для ферментации. Способы, с помощью которых получают сахара из растительной биомассы, обеспечат изобильный, экономически конкурентно способный источник ферментируемого сырья для химических соединений, пластмасс и топлива. Независимо от типа целлюлозного сырья стоимость и гидролитическая эффективность ферментов являются основными факторами, которые ограничивают коммерциализацию процессов биопреобразования биомассы. Производственные затраты на микробно продуцируемые ферменты тесно связаны с продуктивностью вырабатывающего фермент штамма и выходом конечной активности в ферментативном бульоне. Целлюлазы являются ферментами, которые гидролизуют целлюлозу (-1,4-глюкан или бета Dглюкозидные связи), что приводит к образованию глюкозы, целлобиозы, целлоолигосахаридов и т.п. Целлюлазы традиционно разделены на три основных класса: эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) ("EG"), экзоглюканазы или целлобиогидролазы (ЕС 3.2.1.91) ("СВН") и -глюкозидазы ([бета]-D-глюкозидглюкогидролаза; ЕС 3.2.1.21) ("BG") (см., например, Knowles et al., TIBTECH 5, 255-261, 1987; Shulein, Methods Enzymol., 160, 25, pp. 234-243, 1988). Эндонуклеазы действуют главным образом на аморфные части волокна целлюлозы, тогда как целлобиогидролазы также способны деградировать кристаллическую целлюлозу (Nevalainen and Penttila, Mycota, 303-319, 1995). Таким образом, присутствие целлобиогидролазы в целлюлазной системе требуется для эффективной солюбилизации кристаллической целлюлозы (Suurnakki et al. Cellulose 7: 189-209, 2000). -Глюкозидаза высвобождает единицы D-глюкозы из целлобиозы,целлоолигосахаридов и других глюкозидов (Freer, J. Biol. Chem., vol. 268, no. 13, pp. 9337-9342, 1993). Известно, что целлюлазы вырабатываются большим количеством бактерий, дрожжей и грибов. Некоторые грибы продуцируют полную систему целлюлаз, способную деградировать кристаллические формы целлюлозы, при этом целлюлазы легко вырабатываются в больших количествах при ферментации. Мицелиальные грибы играют особую роль, поскольку многие дрожжи, такие как Saccharomycescerevisiae, утратили способность гидролизовать целлюлозу (см., например, Aubert et al., 1988; Wood et al.,Methods in Enzymology, vol. 160, no. 9, pp. 87-116, 1988, and Coughlan et al., "Comparative Biochemistry ofFungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems". Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30, 1988). Классификации грибных целлюлаз СВН, EG и BG могут быть дополнительно расширены для включения множества элементов в каждую классификацию. Например, множество СВН, EG и BG было выделено из различных грибных источников, включая Trichoderma reesei, которая содержит известные гены для 2 СВН, т.е. СВН I и СВН II, по меньшей мере 8 EG, т.е. EG I, EG II, EG III, EGIV, EGV, EGVI,EGVII и EGVIII, и по меньшей мере 5 BG, т.е. BG1, BG2, BG3, BG4 и BG5. Несмотря на продолжающиеся в последние несколько десятилетий исследования, имеющие своей целью понимание ферментативной деградации лигноцеллюлозной биомассы и производство целлюлаз,-1 021855 желательным остается обнаружение или создание высокоактивных целлюлаз и гемицеллюлаз. Также было бы весьма желательно создать высокоэффективные ферментные композиции, способные осуществлять быструю и эффективную биодеградацию лигноцеллюлозных материалов. Кроме того, доступные в настоящее время ферменты, обладающие целлюлазной активностью, как правило, полученные из Trichoderma, функционируют при мезофильных температурах, например от 45 до 50C, и при pH 5,0. Это, однако, может привести к бактериальной инфекции, уменьшающей выход продукта, так что желательно проводить осахаривание при температуре 65C или выше. Кроме того,применение мезофильных температур увеличивает вязкость используемой биомассы, что ограничивает содержание используемого сухого материала. Также при использовании в качестве субстрата предварительно обработанной кислотой биомассы pH должно быть поднято до таких значений, при которых фермент может осахаривать сахара в биомассе. В контексте коммерчески жизнеспособной топливной этанольной промышленности это влечет за собой потребность, например, в гидроксиде натрия или сульфате кальция и потребность в производстве огромных количеств соответствующих солей, например гипса, в случае гидроксида натрия. Соответственно, необходимо проводить осахаривание с помощью фермента,который может работать при pH 4,0 или ниже. Сущность изобретения Изобретение обеспечивает мутантные штаммы Talaromyces, которые обладают улучшенной целлюлолитической активностью по меньшей мере 6 FPU2%/мл. Мутантные штаммы по изобретению демонстрируют хороший рост и хорошую споруляцию. Изобретение также относится к ферментным композициям, содержащим целлобиогидролазу (СВН) и эндоглюканазу (EG), где композиция содержит 40% или больше СВН и 20% или больше EG. Предпочтительно, если ферментные композиции имеют протеазную активность по большей мере 60 APU/мл. Ферментные композиции могут чрезвычайно эффективно гидролизовать лигноцеллюлозный материал, например кукурузную солому или пшеничную солому, в мономерные сахара, которые затем могут быть преобразованы в полезный продукт, такой как этанол. Для проведения высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозного субстрата могут быть использованы ферментные композиции. Это очень важно в контексте коммерчески жизнеспособного производства топливного этанола из лигноцеллюлозной биомассы, поскольку потребуются более низкие количества фермента (по сравнению с доступными в настоящее время продуктами). Более того, этот гидролиз может быть проведен при высокой температуре, которая (i) уменьшает риск бактериальной инфекции и (ii) в результате дает менее вязкую пульпу биомассы. Последний эффект является значимым, поскольку позволяет лучше смешивать ферменты, что приводит к улучшенной эксплуатации растительного сухого вещества, и позволяет достичь более высокой концентрации этанола. Таким образом, снижается использование энергии, улучшается устойчивость и при маломощном ферментационном процессе снижаются капиталовложения. Также гидролиз может быть проведен при низком значении pH. Это необходимо, поскольку биомасса часто предварительно обработана кислотой. В обработанной таким способом биомассе не требуется корректировать pH, если ферменты, впоследствии используемые для осахаривания, способны действовать при низких значениях pH. Это подразумевает снижение потребности, например, в гидроксиде натрия или сульфате кальция и подразумевает процесс, в котором отсутствует отработанная соль. Это имеет значение в процессе, в котором, например, производится топливный этанол, поскольку в таких процессах потребляются большие количества материала. Это позволяет проводить процесс, в котором не требуется корректировка pH, т.е. нет необходимости добавления кислот или оснований. Таким образом,способ может быть проведен как безотходный процесс ("zero waste process") и/или процесс,в котором не требуется внесение неорганических химических веществ. Кроме того, было показано, что ферментная композиция может эффективно гидролизовать биомассу при использовании высокого содержания сухого вещества. Крайне необходимо, чтобы ферменты,применяемые в производстве, например, топливного этанола, были способны функционировать в субстратах, обладающих высокой вязкостью (т.е. композиция с высоким содержанием сухой массы), поскольку это позволяет достичь более высоких количеств конечного продукта, например топливного этанола. Кроме того, изобретение относится к способам получения полезных продуктов из лигноцеллюлозного материала с помощью ферментных композиций. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлены различные фенотипы колоний штамма Talaromyces emersonii TEC-1A. А) ТЕС-1 А; В) ТЕС-101, четко выраженный белый воздушный мицелий (80% популяции); С) ТЕС-102, редуцированный воздушный мицелий (20% популяции); ТЕС-104, отсутствие воздушного мицелия, коричневый цвет (1% популяции). На фиг. 2 представлены результаты времязависимых экспериментов в перемешиваемых колбах с вариантами штамма ТЕС-1 А с различной морфологией колоний, выращиваемых на среде 2 для Talaromyces. На фиг. 3 показана эффективность мутантов ТЕС-101 по выработке целлюлаз, индуцированныхNTG (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином), во вторичных тестах в перемешиваемых колбах (среда 2 для Talaromyces). Анализ с пшеничной соломой осуществляли при pH 4,5 в течение 20 ч при 65C с неразведенной надосадочной жидкостью. Представляющие интерес штаммы размещены относительно идентификационного штамма (ID). Уровни целлюлаз выражены в единицах пшеничной соломы на мл(англ. wheat straw units per milliliter), WSU/мл. Уровень целлюлаз, вырабатываемый родительским контрольным штаммом ТЕС-101, указан жирной линией. На фиг. 4 представлена сводка результатов скрининга третьего порядка в перемешиваемых колбах. Ферментации в среде 2 для Talaromyces 96 ч при 46C с использованием спор со скошенного агара. ТЕС 101 является спонтанным мутантом, который продуцирует более высокие, чем обычно, уровни целлюлаз. Анализ с пшеничной соломой осуществляли при pH 4,5 в течение 20 ч при 65C. Синие столбики представляют неразведенные образцы; розовые столбики представляют образцы, разведенные четыре раза. Оранжевые столбики представляют уровень выработки целлюлаз родительским контролем ТЕС-101 и являются средним двух или трех экспериментов в перемешиваемых колбах. На фиг. 5 показана зависимость преобразования пшеничной соломы от дозы. Штаммы, протестированные в перемешиваемых колбах: ТЕС-142 и ТЕС-101 . Активность целлюлазы выражена в единицах пшеничной соломы на мл, WSU/мл. На фиг. 6 показана кривая зависимости от дозы разведенных надосадочных жидкостей культур мутантов, выращенных в перемешиваемых колбах в среде 2 для Talaromyces в течение 4 дней при 46C и проанализированных на предмет уровней целлюлаз в анализе с пшеничной соломой, которые выражены в единицах пшеничной соломы на мл (WSU/мл). На фиг. 7 представлено сравнение выхода этанола "Filtrase NL"и надосадочной жидкости ТЕС-142 в дозазависимых экспериментах по ферментации с одновременным осахариванием (англ.Simultaneous Saccharification Fermentation, SSF) на предварительно обработанной и отмытой пшеничной соломе. ТЕС-142 выращивали в течение 96 ч в 10 л методом периодической ферментации. Выработка этанола выражена в виде процента от максимального теоретического выхода этанола, полученного из 48,5% содержания глюкановых волокон (NREL) предварительно обработанной пшеничной соломы, который отмечен по оси у как "Макс. теоретический выход этанола (%)". На фиг. 8 представлено сравнение роста ТЕС-165, дерепрессированного по глюкозе мутанта по ферментам, относительно его репрессируемого по глюкозе родительского штамма ТЕС-147. Раствор спор (107/мл) помещали на ТЕС-среду и выращивали при 40C в течение 3-4 дней. Размер колонии указывает степень роста. На фиг. 9 показано сравнение активностей СВН I+II и -глюкозидазы ТЕС-165 относительно ТЕС 101 с помощью флуоресцентных субстратов 4-метилумбеллиферилD-целлобиозида (MUC) или 4 метилумбеллиферилD-глюкозы (MUG) соответственно. Для получения одиночных колоний раствор спор (107/мл) каждого штамма рассевали штрихом на дуплицированных агаровых чашках с ТЕС-средой,содержащей 0,1 мМ MUC или MUG с 2% глюкозой или без не. Чашки инкубировали при 40C в течение 1-2 дней. Чашки фотографировали в УФ-свете (366 нм). Светлые области агаровой чашки являются флуоресцентным (синим) сигналом, вызванным гидролизом субстрата целлюлазами, вырабатываемыми в ходе грибного роста; размер и интенсивность флуоресцентного сигнала указывает на степень активности фермента. На фиг. 10 представлено сравнение ксиланазной активности дерепрессированных по глюкозе мутантов ТЕС-165, ТЕС-199, ТЕС-201 и ТЕС-207 с недерепрессированными по глюкозе родительскими штаммами ТЕС-147 и ТЕС-193 с помощью цветных субстратов AZCL. Для получения одиночных колоний раствор спор (107/мл) каждого штамма рассевали штрихом на агаровых чашках со средой ТЕС, содержащих 0,1% AZCL и 2% глюкозу. Чашки инкубировали при 40C в течение 3-4 дней. Размер и интенсивность темных областей (синее гало), окружающих грибной рост, указывают на степень ферментативной активности. Подробное описание изобретения По всему данному описанию и в сопровождающих пунктах формулы изобретения слова "содержать", "включать" и их вариации, такие как "содержит", "содержащий", "включает" и "включающий",должны толковаться включительно. Т.е. эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или целых, специально не перечисленных, там, где позволяет контекст. Слова в единственном числе также подразумевают множественное число. К примеру, элемент может обозначать один элемент или больше одного элемента. Штаммы Talaromyces по изобретению обладают целлюлолитической активностью по меньшей мере 6 FPU2%/мл. Предпочтительно, если они имеют целлюлолитическую активность по меньшей мере 7FPU2%/мл, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15,по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20FPU2%/мл. Предпочтительными диапазонами целлюлолитической активности являются 6-300 FPU2%/мл,6-150 FPU2%/мл или 10-75 FPU2%/мл. Для активности EG - 5000-200000 WBCU/мл, 5000-100000 и 8000-3 021855 50000 WBCU/мл. В данном документе измеренная целлюлолитическая активность основана на модифицированном способе Adney и Baker, который описан в примерах, и выражена в единицах, сокращенно обозначенных как FPU2%/мл. Высокая целлюлолитическая активность желательна, поскольку она снижает конечную стоимость ферментной композиции, которую можно получить из штамма. Предпочтительно, если штаммы Talaromyces имеют эндоглюканазную активностью по меньшей мере 5000 WBCU/мл, более предпочтительно по меньше мере 6000 WBCU/мл, более предпочтительно по меньшей мере 7000 WBCU/мл, более предпочтительно по меньшей мере 8000 WBCU/мл, более предпочтительно по меньшей мере 9000 WBCU/мл или наиболее предпочтительно по меньшей мере 10000WBCU/мл или больше. Предпочтительными диапазонами для эндоглюканазной активности являются 5000-200000 WBCU/мл, 5000-100000 или 8000-50000 WBCU/мл. В данном документе измеренная эндоглюканазная активность штаммов основана на способе, который описан в примерах, и выражена в Единицах Целлюлазы Белой Биотехнологии (англ. White Biotech Cellulase Units)/мл, сокращенно обозначенная как WBCU/мл. Высокая эндоглюканазная активность является желательной, поскольку эндоглюканазная активность даст больше ферментативных участков для экзоглюканаз (СВН I и II), присутствующих в ферментной композиции, при этом субстрат может быть деградирован более быстро. Предпочтительно, если штаммы Talaromyces обладают низкой протеазной активностью, в частности низкой активностью кислых протеаз по большей мере 60 APU/мл, по большей мере 50 APU/мл, по большей мере 40 APU/мл, наиболее предпочтительно по большей мере 35 APU/мл, по большей мере 30APU/мл, по большей мере 20 APU/мл, по большей мере 10 APU/мл. В данном документе измеренная активность кислых протеаз основана на способе, который описан в примерах, и выражена в Единицах Кислой Протеазы (англ. Acid Protease Units)/мл, сокращенно обозначенная как APU/мл. Желательная низкая протеазная активность поможет получить более стабильную (рассчитанную на длительный период) ферментную композицию. Предпочтительно, если штамм Talaromyces имеет споруляцию и продуцирует титр спор по меньшей мере 106/мл. Хорошая споруляция облегчает дальнейшее улучшение штамма классическими способами или способами генной инженерии. Изобретение также относится к Мутантным штаммам Talaromyces, полученным мутацией штаммаTalaromyces дикого типа, где уровни одного или нескольких белков СВН I, CBH II, EG/CEA, EG/СЕВ,ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, EG/GH61 и/или белка, деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, увеличиваются по меньшей мере в 1,5 раза относительно уровня белка в штамме Talaromyces дикого типа, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза. В любом воплощении вышеуказанного СВН I имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или СВН II имеет молекулярную массу около 46674 Да, и/или EG/CEA имеет молекулярную массу около 36825 Да, и/или EG/СЕВ имеет молекулярную массу около 51462 Да, и/или ацетилксиланксилаза имеет молекулярную массу около 48690 Да, и/или сволленин-подобный белок имеет молекулярную массу около 67911 Да, и/или EG/GH61 имеет молекулярную массу около 27007 Да. Молекулярные массы в данном документе рассчитываются на основе последовательности аминокислот и выражаются в Да. Уровни белков в данном документе определяются по данным APEX, как описано в примере 14, за исключением тех ситуаций, для которых указано применение другого способа, например ДСН-ПААГ или протеазного анализа. В таких ситуациях способ будет осуществлен, как описано в примерах. В любом воплощении в штаммах Talaromyces по изобретению уровень белков СВН I, СВН II,EG/CEA, EG/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобного белка, EG/GH61 и белка,деградирующего углеводы, имеющего молекулярную массу около 22993 Да, повышен по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно повышен по меньшей мере в 2 раза. В любом воплощении в мутантных штаммах Talaromyces по изобретению уровень белка одного или нескольких белков, а именно EG/GH61, сволленин-подобного белка и/или белка, деградирующего углеводы (Temer1170), повышен относительно штамма Talaromyces дикого типа, предпочтительно, если уровень выше по меньшей мере в 2 раза. В любом воплощении в мутантных штаммах Talaromyces по изобретению, имеющих сравнимый со штаммом Talaromyces дикого типа уровень белков одного или нескольких из эндоглюканазы EG, ксилозидазы, хитиназы и/или протеазы, снижен относительно выработки в штамме Talaromyces дикого типа,предпочтительно, если выработка снижена по меньшей мере в 2 раза. В любом воплощении в мутантных штаммах Talaromyces по изобретению есть эндоглюканаза, EG, которая имеет молекулярную массу около 24136 Да, и/или ксилозидаза, которая имеет молекулярную массу около 95022 Да, и/или хитаназа, которая имеет молекулярную массу около 45111 Да, и/или протеаза, которая имеет молекулярную массу около 28800 Да. В любом воплощении мутантные штаммы Talaromyces по изобретению имеют отношение уровня белка EG/GH61 к сумме уровней белков a) EG, b) EG/CEA и с) EG/СЕВ, равное по меньшей мере 0,8,предпочтительно по меньшей мере 1,0. В любом воплощении мутантные штаммы Talaromyces по изобретению продуцируют белки СВН I,-4 021855 СВН II, EG/CEA, EG/СЕВ, ксиланазы, ацетилксиланэстеразы, сволленин-подобный белок, EG/GH61 и белок, деградирующий углеводы, Temer01170, которые не репрессируются глюкозой. В одном воплощении штаммом Talaromyces emersonii является ТЕС-142 (также обозначаемый какBox 85167, NL-3508 AD Утрехт, Нидерланды, 1 июля 2009 г., имеющий регистрационный номер CBS 124902, или его функционально эквивалентный мутант или потомок. В одном воплощении штаммом Talaromyces emersonii является ТЕС-192 (также обозначаемый какBox 85167, NL-3508 AD Утрехт, Нидерланды, 25 июня 2010 г., имеющий регистрационный номер CBS 127389, или его функционально эквивалентный мутант или потомок. Изобретение также относится к ферментным композициям, содержащим целлобиогидролазу (СВН) и эндоглюканазу (EG), где композиция содержит 40% (относительный % белка к общему белку, основанный на изображении ДСН-ПААГ) или больше СВН и 20% (относительный % белка к общему белку,основанный на изображении ДСН-ПААГ) или больше EG. Предпочтительно, если ферментные композиции имеют протеазные активности по большей мере 60 APU/мл, по большей мере 50 APU/мл, по большей мере 40 APU/мл или по большей мере 35 APU/мл. Изобретение также относится к способу преобразования лигноцеллюлозного материала в полезный продукт, включающий следующие стадии: а) предварительной обработки одного или нескольких лигноцеллюлозных материалов для получения предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала;b) ферментативной обработки предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала для получения одного или нескольких сахаров; с) преобразования сахара в один или несколько полезных продуктов и d) разделения одного или нескольких полезных продуктов, где в стадии а), b) или с) добавляют или применяют ферментную композицию. Предпочтительно, если в этом способе лигноцеллюлозным материалом являются садовые обрезки,чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, мискант, сорго сахарное, стебли канолы, стебли сои, бородач, трипсакум,лисохвост; свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие отходы животных, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, мягкая древесина, тополь, сосна, кустарники, травы, пшеница, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы,кукурузная сердцевина, волокна из сердцевин, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые городские отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал,сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, макулатура, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал,фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты,просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничная крупка, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученный в ходе сельскохозяйственного процесса, или древесные отходы лесного хозяйства, или комбинация любых двух или нескольких из них. Описанная выше стадия а) является предварительной обработкой одного или нескольких лигноцеллюлозных материалов для получения предварительно обработанного лигноцеллюлозного материала. В стадии предварительной обработки сырье может быть предварительно обработано нагреванием,механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления доступности субстрата ферментативному гидролизу и/или для гидролиза гемицеллюлозы и/или для солюбилизации гемицеллюлозы и/или целлюлозы и/или лигнина, любым известным в данной области способом. Предварительная обработка может включать воздействие на лигноцеллюлозный материал (горячей) водой, паром (паровым взрывом), кислотой, основанием, растворителем, нагреванием, пероксидом, озоном, механическим измельчением, дроблением, перемалыванием или быстрым сбросом давления или комбинацией любых двух или нескольких из перечисленного. Химическую предварительную обработку часто объединяют с термической предварительной обработкой, например, в диапазоне 150-220C в течение от 1 до 30 мин. Предпочтительно, если в способе по изобретению полезным продуктом являются этанол, бутанол,молочная кислота, пластмассы, органическая кислота, растворитель, добавка к корму для животных, лекарственное средство, витамин, аминокислота, фермент или химическое сырье. Настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит целлюлазную и/или гемицеллюлазную ферментативную активность и которая обладает способностью модифицировать, например деградировать, некрахмальный углеводный материал. Некрахмальный углеводный материал является материалом, который содержит,состоит из или в существенной степени состоит из одного или нескольких некрахмальных углеводов. Углевод в данном контексте включает все сахариды, например полисахариды, олигосахариды, дисахариды или моносахариды. Композиция, описанная в данном документе, как правило, модифицирует некрахмальный углеводный материал химической модификацией такого материала. Химическая модификация углеводного материала может привести к деградации такого материала, например гидролизом, окислением или другой химической модификацией, такой как действие лигазы. Некрахмальным углеводом, который подходит для модификации композицией, так как описано в данном документе, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлозные остатки, которые могут рассматриваться как потенциальный возобновляемый источник сырья, являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в сырье,полученном из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов до растворимых сахаров,включая как мономеры, так и мультимеры, например глюкозу, целлобиозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, галактуроновую кислоту, глюкуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, включает действие различных ферментов, действующих совместно. Кроме того, значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения могут составить пектины и другие пектиновые субстанции, такие как арабинаны (от около четверти до половины сухой массы могут быть пектинами). Целлюлоза является линейным полисахаридом, состоящим из глюкозных остатков, связанных 1,4-связями. Линейная природа целлюлозных волокон, а также стехиометрия -связанной глюкозы (относительно -) образует структуры, которые более склонны к образованию водородных связей между цепями, чем сильно разветвленные -связанные структуры крахмала. Таким образом, целлюлозные полимеры, в общем, менее растворимы и образуют более тесно связанные волокна, чем волокна, обнаруженные в крахмале. Эндоглюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы на целлоолигосахариды (с целлобиозой в качестве основного продукта), в то время как глюкозидазы (BG) преобразуют олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу. Гемицеллюлоза является сложным полимером, и е композиция часто широко варьирует от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В общем, основным компонентом гемицеллюлозы является -1,4-связанная ксилоза, пятиуглеродный сахар. Однако эта ксилоза часто ветвиться в положениях 0-3 и/или 0-2 атома ксилозы и может быть заменена арабинозой, галактозой, маннозой, глюкуроновой кислотой, галактуроновой кислотой или этерифицирована уксусной кислотой (а арабиноза может быть этерифицирована ферруловой кислотой). Гемицеллюлоза также может содержать глюкан, который является общим названием для -связанных шестиуглеродных сахаров (таких как -(1,3)(1,4) глюканы и гетероглюканы, упомянутые выше) и дополнительно глюкоманнаны (в которых как глюкоза, так и манноза присутствуют в линейном каркасе, связанные друг с другом -связями). Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с -L-арабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкуронидазами и -ксилозидазами катализируют гидролиз гемицеллюлоз. Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины являются наиболее сложными полисахаридами в клеточной стенке растений. Они надстраиваются вокруг основной цепи из (1,4)-связанных единиц D-галактуроновой кислоты, чередующейся в определенном порядке с L-рамнозой. В любой клеточной стенке существует множество структурных единиц, которые соответствуют этому описанию, и, в общем, считается, что они являются единой пектиновой молекулой,в которой основные цепи и различные структурные единицы непрерывно следуют друг за другом. Основными типами структурных единиц являются галактоуронан (гомогалактоуронан), который может быть заменен метанолом на карбоксильной группе и ацетатом в О-2 и О-3; рамногалктоуронан I(RGI), в котором единицы галактуроновой кислоты чередуются с единицами рамнозы, несущими боковые цепи с (1,4)-связанным галактаном и (1,5)-связанным арабинаном. Арабинановые боковые цепи могут быть прикреплены напрямую к рамнозе или ненапрямую через галактановые цепи; ксилогалактуронан с одиночными ксилозильными единицами на О-3 галактуроновой кислоты (тесно ассоциированной сRGI); и рамногалактуронан II (RGII), особенно сложная минорная единица, содержащая необычные сахара, например апиозу. Единица RGII может содержать два апиозных остатка, которые в подходящих ионных условиях могут обратимо образовывать эфиры с боратом. Ферментная композиция будет содержать ферментативные активности, как правило, полученные из сапрофитного грибного микроорганизма класса Penicillium и из рода Talaromyces, например из Talaromyces emersonii. Talaromyces emersonii также может называться Geosmithia emersonii или Penicillium emersonii. Talaromyces emersonii также называют Talaromyces duponti и Penicillium duponti. Ферментная композиция содержит по меньшей мере две активности, хотя, как правило, композиция будет содержать больше чем две активности, например три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или больше. Как правило, ферментная композиция изобретения может содержать по меньшей мере одну целлюлазу и по меньшей мере одну гемицеллюлазу. Однако ферментная композиция изобретения может содержать целлюлазы, но не ксиланазы. Кроме того, композиция изобретения может содержать дополни-6 021855 тельную ферментную активность, т.е. дополнительную активность, которая либо напрямую, либо косвенно приводит к деградации лигноцеллюлозы. Примеры таких вспомогательных активностей упомянуты в данном документе. Таким образом, ферментная композиция может содержать эндоглюканазную активность, и/или целлобиогидролазную активность, и/или -глюкозидазную активность. Ферментная композиция может содержать больше чем одну ферментную активность в одном или нескольких этих классах. Например,ферментная композиция может содержать две эндоглюканазные активности, например эндо-1,3(1,4)глюканазную активность и эндо 1,4-глюканазную активность. Такая композиция может также содержать одну или несколько ксиланазных активностей. Такая композиция может содержать вспомогательную ферментативную активность. Ферментная композиция может быть получена из Talaromyces emersonii. В изобретении предполагается, что основной набор (деградирующих лигноцеллюлозу) ферментативных активностей может быть получен из Talaromyces emersonii. Talaromyces emersonii может предоставить высокоэффективный набор активностей для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, что продемонстрировано в данном документе. Такая активность может затем быть дополнена дополнительными ферментативными активностями из других источников. Такие дополнительные активности могут быть получены из классических источников и/или получены посредством генетически модифицированного организма. Активности ферментной композиции могут быть термостабильными. В данном документе это означает, что активность имеет температурный оптимум 40C или выше, например около 50C или выше,например около 60C или выше, например около 70C или выше, например около 75C или выше, например около 80C или выше, например 85C или выше. Активности в ферментной композиции, как правило, не будут иметь тот же температурный оптимум, но предпочтительно будут тем не менее термостабильными. Кроме того, ферментные активности в ферментной композиции способны работать при низком pH. Для целей этого изобретения низкое значение pH означает pH около 5,5 или ниже, около 5 или ниже,около 4,5 или ниже, около 4,0 или ниже, около 3,8 или ниже или около 3,5 или ниже. Активности в ферментной композиции могут быть определены комбинацией любых значений вышеупомянутого температурного оптимума и pH. Примененная в способе изобретения композиция может содержать в дополнение к активностям,полученным из Talaromyces, целлюлазу (например, полученную из источника, отличного от Talaromyces) и/или гемицеллюлазу (например, полученную из источника, отличного от Talaromyces) и/или пектиназу. Ферментная композиция может содержать один, два или три класса целлюлаз, например одну, две или все из перечисленного: эндоглюканазу (EG), экзоцеллобигидролазу (СВН) и -глюкозидазу (BG). Ферментная композиция может содержать два или несколько этих классов целлюлаз. Ферментная композиция изобретения может содержать активность, которая имеет другой тип целлюлазной активности и/или гемицеллюлазной активности и/или пектиназной активности, чем та, что представлена в ферментной композиции. Например, композиция изобретения может содержать первый тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, предоставленной композицией, как описано в данном документе, и второй тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, предоставленной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой. В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы, либо частично, например в целлодекстрины, либо полностью, в глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию целлодекстринов и мономеров глюкозы при контакте с целлюлозой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза. В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать один или несколько из представленного: ксилан, глюкуроноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу,является ферментом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономеры сахара,например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с гемицеллюлозой. Такая деградация будет, как правило, проводиться путем реакции гидролиза. В данном документе пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие единицы либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в мономеры сахаров. Пектиназа по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и мономеров сахаров при контакте с пектином. Та-7 021855 кая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза. Соответственно, композиция изобретения может содержать любую целлюлазу, например целлобиогидролазу и эндо 1,4-глюканазу, -глюкозидазу или -(1,3)(1,4)-глюканазу. В данном документе целлогидролазой (ЕС 3.2.1.91) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-гликозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с концов цепей. Этот фермент может также называться целлюлазой 1,4 целлобиозидазой, 1,4-целлобиогидролазой, 1,4D-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой, экзо-1,4D-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. Целлобиогидролазы могут быть дополнительно разделены на целлобиогидролазу I (СВН I) и целлобиогидролазу II (СВН II). СВН I определяются как целлобиогидролазы, которые гидролизуют целлюлозу, главным образом, с восстанавливающих концов, отщепляя целлобиозу. СВН II определяются как целлобиогидролазы, которые гидролизуют целлюлозу, главным образом, с невосстанавливающих концов, отщепляя целлобиозу. В данном документе эндо 1,4-глюканазой (ЕС 3.2.1.4) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4D-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или -D-глюканах зерновых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в -D-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент может также называться целлюлазой, авицелазой, -1,4-эндоглюкангидролазой,-1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлудекстриназой, эндо-1,4D-глюканазой, эндо-1,4Dглюканогидролазой, эндо-1,4 глюканазой или эндоглюканазой. СЕА в данном документе является эндоглюканазой ЕС 3.2.1.4, которая на основании ее трехмерной структуры классифицируется как относящаяся к семейству 5 гликозилгидролаз (GH5). Известные активности GH5 включают хитозаназу (ЕС 3.2.1.132); маннозидазу (ЕС 3.2.1.25); целлюлазу (ЕС 3.2.1.4); глюкан 1,3 глюкозидазу (ЕС 3.2.1.58); лихенниназу (EK 3,2.1.73); глюкан эндо-1,6 глюкозидазу (ЕС 3.2.1.75); маннаноэндо 1,4-маннозидазу (ЕС 3.2.1.78), эндо-1,4-ксиланазу (ЕС 3.2.1.8): целлюлозо-1,4-целлобиозидазу (ЕС 3.2.1.91): эндо 1,6-галактаназу (ЕС 3.2.1.-); 1,3-маннаназу (ЕС 3.2.1.-); ксилоглюкан-специфичную эндо 1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.151); маннанотрансглюкозилазу (ЕС 2.4.1.-). СЕВ в данном документе является эндоглюканазой ЕС 3.2.1.4, которая на основании ее трехмерной структуры классифицируется как относящаяся к семейству 7 гликозилгидролаз (GH7). Известные активности GH7 включают эндо 1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.4); [действующую на восстанавливающих концах] целлобиогидролазу (ЕС 3.2.1.-); хитозаназу (ЕС 3.2.1.132): эндо 1,3-1,4-глюканазу (ЕС 3.2.1.73). В данном документе -глюкозидазой (ЕС 3.2.1.21) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых, невосстанавливающих остатков -D-глюкозы с высвобождением D-глюкозы. Такой полипептид может обладать широкой специфичностью по отношению к -Dглюкозидам и может также гидролизовать одно или несколько из представленных: -D-галактозид, -Lарабинозид, -D-ксилозид или -D-фукозид. Этот фермент может также называться амигдалазой, -Dглюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазой. В данном документе -(1,3)(1,4)-глюканазой (ЕС 3.2.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-глюкозидных связей в -D-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4 связи. Такие полипептиды могут действовать на лихенин и -D-глюканы зерновых, но не на -Dглюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также называться лихениназой,1,3-l,4D-глюкан-4-глюканогидролазой, -глюканазой, эндо 1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или глюконазой смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, который описан как эндо-1,3(4)глюконаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в -D-глюканах,когда остаток глюкозы, чья восстанавливающая группа участвует в образовании гидролизуемой связи,самозамещается по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-бетаглюканазу, ламинариназу, 1,3(1,3;1,4)D-глюкан 3 (4) глюканогидролазу; субстраты включают ламинарии, лихенин и -D-гликаны зерновых. Ферментная композиция изобретения может содержать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, -ксилозидазу, -L-арабинофуранозидазу, -D-глюкуронидазу, ацетилксиланэстеразу, феруоилэстеразу, кумароилэстеразу, -галактозидазу, -галактозидазу, -маннаназу или -маннозидазу. В данном документе эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) является ферментом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4D-ксилозидных связей в ксиланах. Этот фермент также называют эндо-1,4-ксиланазой или 1,4D-ксиланксиланогидролазой. Альтернативой является ЕС 3.2.1.136, глюкуроноарабиноксиланэндоксиланаза, фермент, который способен гидролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах. В данном документе -ксилозидазой (ЕС 3.2.1.37) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-ксиланов, удалять последовательные остатки D-ксилозы с невосстановливающих концов. Такие ферменты могут также гидролизовать ксилобиозу. Этот фермент также называется ксилан-1,4 ксилозидазой, 1,4D-ксиланксилогидролазой, экзо-1,4 ксилозидазой или ксилобиазой. В данном документе -L-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на -L-арабинофуранозиды, -L-арабинаны, содержащие (1,2)- и/или (1,3)- и/или(1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалктаны. Этот фермент может также называться -N-арабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза. В данном документе -D-глюкуронидазой (ЕС 3.2.1.139) является полипептид, который способен катализировать реакцию следующего вида: -D-глюкоронозид +H2O=спирт + D-глюкуронат. Этот фермент также может называться альфа-глюкоронидазой или альфа-глюкозидуроназой. Эти ферменты также могут гидролизовать 4-О-метилированную глюкуроновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернативой является ЕС 3.2.1.131: ксилан-альфа-1,2-глюкуронозидаза, которая катализирует гидролиз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей. В данном документе ацетилксиланэстеразой (ЕС 3.1.1.72) является любой полипептид, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксилоолигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп на полимерном ксилане, ацетилированной ксилозе, ацетилированной глюкозе, альфа-нафтилацетате или -нитрофенилацетате, но как правило, не на триацетилглицерине. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин. В данном документе, феруоилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида: феруоил-сахарид + H2O=ферулат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Он может, как правило, катализировать гидролиз 4 гидрокси-3-метоксициннамоильной (феруоильной) группы на этерифицированном сахаре, которым обычно в "естественных" субстратах является арабиноза. -Нитрофенолацетат и метилферулат, как правило, являются более слабыми субстратами. Этот фермент также называют гидролазой циннамоилового эфира, эстеразой феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстеразой. Он также может называться вспомогательным ферментом гемицеллюлазы, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений. В данном документе кумароилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида: кумароил-сахарид + H2O=кумарат + сахарид. Сахарид может быть,например, олигосахаридом или полисахаридом. Этот фермент также называют транс-4-кумароилэстеразой, транскумароилэстеразой, -кумароилэстеразой или эстеразой -кумаровой кислоты. Этот фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, так что также может называться ферруоилэстеразой. В данном документе -галактозидазой (ЕС 3.2.1.22) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз конечных, невосстанавливающих -D-галактозных остатков в -D-галактозидах, включая галактозные олигосахариды, галактоманнаны, галактаны и арабиногалактаны. Такой полипептид может быть способен гидролизовать -D-фукозиды. Этот фермент может также называться мелибиазой. В данном документе -галактозидазой (ЕС 3.2.1.23) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -D-галактозы в -D-галактозидах. Такой полипептид может быть способен гидролизовать -L-арабинозиды. Этот фермент также может называться экзо-(14)D-галактаназой или лактазой. В данном документе -маннаназой (ЕС 3.2.1.78) является любой полипептид, который способен катализировать статистический гидролиз 1,4D-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Этот фермент также может называться маннаноэндо-1,4 маннозидазой или эндо-1,4 маннаназой. В данном документе -маннозидазой (ЕС 3.2.1.25) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -D-маннозы в -D-маннозидах. Этот фермент также может называться маннаназой или манназой. Ферментная композиция изобретения может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзо-галактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамногалактуронангалактуроногидролазу и ксилогалактуроназу. В данном документе эндо-полигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4D-галактозидуроновые связи в пектате и других галактуронанах. Этот фермент также может называться полигалактуроназа, пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли 1,4-галактуронидгликангидролаза,эндогалактуроназа; эндо-D-галактуроназа или поли(1,4D-галактуронид)гликангидролаза. В данном документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, который способен катализировать реакцию: пектин + n H2O=n метанол + пектат. Фермент также может быть известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза. В данном документе эндо-галактаназа (ЕС 3.2.1.89) является ферментом, который способен катали-9 021855 зировать эндогидролиз 1,4D-галактозидных связей в арабиногалактанах. Фермент также может быть известен как арабиногалактанэндо-1,4 галактозидаза, эндо-1,4 галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4D-галактаногидролаза. В данном документе пектинацетилэстераза определяется как любой фермент, который имеет ацетилэстеразную активность, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах остатков GalUA пектина. В данном документе эндо-пектинлиазой (ЕС 4.2.2.10) является любой фермент, способный катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактуронанметилового эфира для получения олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метилD-галакт-4-энуронозиловых группами на их невосстанавливающих концах. Фермент также может быть известен как пектинлиаза, пектин-транс-элиминаза; эндопектинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, PL, PNL илиPMGL или (14)-6-О-метилD-галактуронанлиаза. В данном документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является любым ферментом, способным катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактоуронана для получения олигосахаридов с 4 деоксиD-галакт-4-энуронозильными группами на их невосстанавливающих концах. Фермент также может быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза -1,4-D-эндополигалактуроновой кислоты, PGA-лиаза, РРаза-N, лиаза эндо 1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектин-трансэлиминаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты или (14)Dгалактуронанлиаза. В данном документе альфа-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -L-рамнозы в -Lрамнозидах или, в ином случае, в рамногалактоуронане. Этот фермент также может быть известен как L-рамнозидаза Т, -L-рамнозидаза N или -L-рамнозидрамногидролаза. В данном документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является любым полипептидом, который способен гидролизовать пектиновую кислоту из невосстановленного конца, высвобождая дигалактуронат. Фермент также может быть известен как экзо-полигалактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза. В данном документе экзо-галактуроназа (ЕС 3.2.1.67) является любым полипептидом, который способен катализировать (1,4D-галактуронид)n + H2O=(1,4D-галактуронид)n-i + D-галактуронат. Фермент также может быть известен как 1,4 галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галакуронат)гидролаза, экзо-D-галактуроназа, экзо-D-галактуронаназа, экзополи-D-галактуроназа или поли(1,4-D-галактуронид)галактуроногидролаза. В данном документе экзополигалакуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9) является любым полипептидом, который способен катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-дезоксиD-галакт-4-энуронозил)-Dгалактуронат от восстановленного конца пектата, т.е. деэстерифицированного пектина. Этот фермент также может быть известен как пектат дисахаридлиаза, пектатэкзолиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектатлиаза, экзополигалактуроновая кислота-транс-элиминаза, РАТЕ, экзо-РАТЕ, экзоPGL или (14)D-галактуронан дисахаридлиаза восстанавливающих концов. В данном документе рамногалактуронангидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в любой эндоформе в строго чередующихся рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарида [(1,2L-рамноил(1,4)галактозилуроновой] кислоты. В данном документе рамногалактоуронанлиазой является любой полипептид, который способен расщеплять связи -L-Rhap-(14)D-GalpA в эндоформе в рамногалактоуронане посредством элиминации. В данном документе рамногалактоуронанацетилэстеразой является любой полипептид, который катализирует деацетилирование каркаса перемежающихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане. В данном документе рамногалактоуронангалактуроногидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать галактуроновую кислоту из невосстанавливающего конца строго перемежающейся структуры рамногалактуронана в экзоформе. В данном документе ксилогалактуроназой является любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан посредством расщепления -ксилозозамещенного каркаса из галактуроновой кислоты в эндо-форме. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронангидролаза. В данном документе -L-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на -L-арабинофуранозиды, -L-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или(1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент также может быть известен как -Nарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза. В данном документе эндо-арабинозидазой (ЕС 3.2.1.99) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,5 арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент также может быть известен как эндо-арабиназа, арабинан эндо-1,5L-арабинозидаза, эндо-1,5L-арабинаназа, эндо 1,5-арабаназа, эндоарабаназа или 1,5L-арабинан 1,5L-арабинаногидролаза. Ферментная композиция по изобретению, как правило, может содержать по меньшей мере одну целлюлазу, и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу, и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых является полипептидом по изобретению). Ферментная композиция изобретения может содержать целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или -гликозидазу. Такая композиция может также содержать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ. Кроме того, в композиции изобретения могут присутствовать один или несколько (например, два,три, четыре или все) из перечисленных белков: амилаза, протеаза, липаза, лигниназа, гексозилтрансфераза, глюкуронидаза или экспрансин или целлюлозоиндуцируемый белок или интегрирующий на целлюлозе белок или подобный белок (выше они называются вспомогательными активностями)."Протеаза" включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также ферменты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара(гликопептидазы). Множество протеаз характеризуются в соответствии с ЕС 3.4 и являющиеся подходящими для применения в изобретении включены в данный документ посредством ссылки. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы."Липазы" включают ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты, и ацилглицериды,включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения патогенных инфекций и потерь воды. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин."Лигниназа" включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуру лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушить лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганецпероксидазы, лакказы и феруоилэстеразы и другие описанные в данной области ферменты, которые способны деполимеризовать или, в ином случае, разрушать лигниновые полимеры. Также включенными являются ферменты, которые способны гидролизовать связи, образованные между гемицеллюлозными сахарами (в частности, арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, без ограничения перечисленным,следующие группы ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13),лакказы (ЕС 1.10.3.2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73)."Гексозилтрансфераза" (2.4.1-) включает ферменты, которые способны катализировать трансферазную реакцию, но которые могут также катализировать реакцию гидролиза, например целлюлозы и/или продуктов деградации целлюлозы. Примером гексозилтрансферазы, которая может быть применена в изобретении, является -глюканозилтрансфераза. Такой фермент может быть способен катализировать деградацию (1,3) (1,4) глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы."Глюкуронидаза" включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, например-глюкуронозида, с получением спирта. Охарактеризовано множество глюкуронидаз и они могут подходить для применения в изобретении, например -глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроно-глюкуронидаза(ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфглюкозаминглюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат -глюкуронидаза (3.2.1.128) или -D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139). Ферментная композиция может содержать экспансин или экспансин-подобный белок, такой как сволленин (см. Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) или сволленин-подобный белок. Экспансины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки в ходе роста растительной клетки. Экспансины были предложены для разрушения водородных связей между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки без гидролитической активности. Таким образом, они, как считается,позволяют раздвинуть целлюлозные волокна и расширить клеточную стенку. Сволленин, экспансинподобный белок, содержит домен N-концевого углеводсвязывающего модуля семейства I (CBD) и Сконцевой экспансин-подобный домен. Для целей изобретения экспансин-подобный белок или сволленин-подобный белок могут содержать один или оба таких домена и/или могут привести к разрушению клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), необязательно без выработки детектируемых количеств восстанавливающих сахаров. Ферментная композиция может содержать индуцируемый целлюлозой белок, например полипептидный продукт генов cip1 или cip2 или аналогичных генов (см. Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34),31988-31997, 2003), интегрирующий на целлюлозе/целлюлосому белок, например полипептидный продукт гена cipA или cipC, или скаффолдин или скаффолдин-подобный белок. Скаффолдины и интегрирующие на целлюлозе белки являются мультифункциональными интегрирующими субъединицами, которые могут организовать целлулолитические субъединицы в мультиферментный комплекс. Это достигается за счет взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т.е. домена сцепления на скаффолдине и стыковочного домена на каждой ферментной единице. Субъединица скаффолдина также несет модуль связывания с целлюлозой (cellulose-binding module (CBM, который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или интегрирующий на целлюлозе белок для целей изобретения может содержать один или оба таких домена. Ферментная композиция может состоять из представителей каждого класса ферментов, упомянутого выше, из нескольких членов одного ферментного класса или из любой комбинации этих ферментных классов или вспомогательных белков (т.е. тех упомянутых в данном документе белков, которые не обладают ферментативной активностью как таковой, но, тем не менее, помогают при деградации лигноцеллюлозы). Ферментная композиция может состоять из ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; из (2) клонированных генов, экспрессирующих ферменты; (3) сложной жидкой питательной среды(такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, где штаммы секретируют белки и ферменты в среды); (4) клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего ферменты. Различные ферменты в композиции изобретения могут быть получены из различных источников. Ферменты могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал(такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и т.п. могут быть добавлены, например, в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены в сырье. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома или пшеничная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье. В применениях и способах, описанных в данном документе, описанные выше компоненты композиции могут быть предоставлены одновременно (т.е. по сути в виде единой композиции) или отдельно или последовательно. Изобретение таким образом относится к способам, в которых применяется описанная выше композиция, и относится к применениям композиции в промышленных процессах. В принципе, ферментная композиция изобретения может быть применена в любом способе, который требует обработки материала, содержащего некрахмальный полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция изобретения могут быть применены при обработке некрахмального полисахаридного материала. В данном документе полисахаридным материалом является материал, который содержит или который существенным образом состоит из одного или, что чаще, более чем одного некрахмального полисахарида. Как правило, растения, грибы и материал, полученный из них, содержат значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке растительного или грибного материала или материала, полученного из него. Важным компонентном растительного некрахмального полисахаридного материала является лигноцеллюлоза (которая также называется здесь лигноцеллюлозной биомассой). Лигноцеллюлоза является растительным материалом, который состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином водородными и ковалентными связями. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке лигноцеллюлозного материала. В данном документе лигноцеллюлозным материалом является материал, который содержит или в основном состоит из лигноцеллюлозы. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида некрахмальным полисахаридом может быть лигноцеллюлозный материал/биомасса. Соответственно, изобретение обеспечивает способ обработки некрахмального полисахарида, в котором обработка содержит деградацию и/или модификацию целлюлозы и/или гемицеллюлозы. Деградация в данном контексте означает, что в результате обработки образуются продукты гидролиза целлюлозы и/или гемицеллюлозы и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки появляются более короткие олигосахариды, чем те, что присутствуют в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в данном контексте может приводить к высвобождению олигосахаридов и/или сахаров-мономеров. Все растения и грибы содержат некрахмальный полисахарид как и практически все полисахаридные материалы, полученные из растений и грибов. Соответственно, в способе изобретения для обработки некрахмального полисахарида указанный некрахмальный полисахарид может быть представлен в виде растения или материала, полученного из растений, или материала, содержащего растения, или материала, полученного из растений, например из растительной пульпы, растительного экстракта, продукта питания или его ингредиента, ткани, текстильного изделия или предмета одежды. Изобретение обеспечивает способ получения сахара из лигноцеллюлозного материала, где способ включает контакт описанной в данном документе композиции с лигноцеллюлозным материалом. Такой способ позволяет получать свободные сахара (мономеры) и/или олигосахариды из лигноцеллюлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды с помощью полипептида или ферментной композиции изобретения. Процесс преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара предпочтительно позволяет проводить преобразование в ферментируемые сахара. Такой процесс может называться "осахариванием". Соответственно, способ изобретения может приводить к высвобождению одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из перечисленного: глюкозы, целлобиозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы. Лигноцеллюлозная биомасса, подходящая для применения в изобретении, включает первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому,жмых сахарного тростника, просо, мискант, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, стебли канолы, стебли сои, сорго сахарное, зерна кукурузы,включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница или ячмень (включая влажный и сухой способы помола), которые часто называют "отруби или волокна",а также твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Биомасса может также быть, без ограничения перечисленным, травянистым материалом, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, твердыми бытовыми отходами, макулатурой, пульпой или отходами бумажного производства."Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры,листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, древенистые культуры с коротким оборотом, кустарники,просо, деревья, овощи, фруктовые корки, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или любой их комбинацией или смесью. Помимо первичной биомассы или сырья, уже обработанного в пищевой, кормовой или бумажной и целлюлозной отраслях, биомасса/сырье может быть дополнительно обработано тепловой, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления ферментативной деградации. Ферментируемые сахара могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации с добавленной стоимостью, неограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства,добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье,пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол,включая топливный этанол. Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения, включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту; пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3 пропан-диол; этилен, глицерин; растворитель; добавка для питания животных, лекарство, такое как лактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин,триптофан, треонин и аспарагиновая кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы, и химическое сырье. Композиция, природа заместителя и степень разветвленности гемицеллюлозы очень отличаются у двусемядольных растений (двудольных, т.е. растений, чьи семена имеют два котиледона или семядоли,такие как лимская фасоль, арахис, миндаль, горох, фасоль) по сравнению с односемядольными растениями (однодольными; т.е. растениями, имеющими одиночный котиледон или семядолю, такие как кукуруза, пшеница, рис, травы, ячмень). У двудольных гемицеллюлоза состоит главным образом из ксилоглюканов, которые являются 1,4 связанными цепями глюкозы с 1,6 связанными ксилозильными боковыми цепями. В однодольных, включая большинство зерновых культур, основными компонентами гемицеллюлозы являются гетероксиланы. Они главным образом содержат 1,4 связанные ксилозные каркасные полимеры с 1,3 связями с арабинозой, галактозой, маннозой и глюкуроновой кислотой или 4-О-метилглюкуроновой кислотой, а также ксилозой, модифицированной уксусной кислотой, связанной посредством эфирной связи. Также присутствуют -гликаны, содержащие 1,3- и 1,4 связанные глико- 13021855 зильные цепи. В однодольных целлюлоза, гетероксиланы и -глюканы могут присутствовать в примерно равных количествах, на каждое из которых приходится около 15-25% сухого вещества клеточных стенок. Также различные растения могут содержать различные количества и различные композиции пектиновых веществ. Например, сахарная свекла содержит около 19% пектина и около 21% арабинана в пересчете на сухое вещество. Соответственно, композиция изобретения может быть адаптирована с учетом определенного сырья,которое будет использоваться. Иными словами, спектр активностей композиции изобретения может варьировать в зависимости от рассматриваемого сырья. Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно или последовательно или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей,грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты вырабатываются, но не выделяются, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал может быть обработан для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавление антимикробных средств) перед добавлением к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы), используется сырье (такое как кукурузная солома). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут добавляться в лигноцеллюлозное сырье. В способе изобретения фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллюлозный субстрат или на растительную биомассу, выступающую в качестве сырья, что приводит к преобразованию этого сложного субстрата в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или других полезных продуктов ферментации. Соответственно, другой аспект изобретения включает способы, в которых применяют описанную выше композицию, вместе с дополнительными ферментами или с физическими обработками, такими как температура и pH, для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды. Хотя композиция обсуждалась в качестве отдельной смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, при этом температура, pH и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае, для конкретной ферментной смеси могут быть определены оптимальные pH и температура. Композиция взаимодействует с субстратом при любых соответствующих условиях. Например,ферменты можно инкубировать при около 25C, около 30C, около 35C, около 37C, около 40C, около 45C, около 50C или около 55C, около 60C, около 65C, около 70C, около 75C, около 80C, около 85C, около 90C или выше. То есть их можно инкубировать при температуре от около 20C до около 95C, например, в буферах с ионной силой от низкой до средней и/или при pH от низкого до нейтрального. Под "средней ионной силой" понимается буфер, который имеет концентрацию ионов около 200 миллимоль/л (мМ) или менее для какого-либо одного ионного компонента. pH Может быть в диапазоне от около 2,5, около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5, около 5,5, около 6, около 6,5, около 7, около 7,5, около 8,0, до около 8,5. Как правило, диапазон pH будет от около pH 3,0 до около pH 9. Как правило, реакция может быть проведена в условиях с низким pH, как определено выше. Таким образом, способ изобретения может быть проведен так, что корректировка pH (т.е. доведение до нейтрального pH) не потребуется. Иначе говоря, предварительно обработанное кислотой сырье может быть использовано как есть, без необходимости добавления, например, гидроксида натрия, до добавления ферментной композиции по изобретению. Сырье может быть отмыто до ожижения/гидролиза. Такой отмывкой может быть, например, вода. Инкубация композиции в этих условиях приводит к высвобождению или освобождению значительных количеств сахаров из лигноцеллюлозного материала. Под значительным количеством понимается по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более от имеющихся сахаров. Может быть применена стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания, включающая инкубацию с ферментом или ферментной смесью. Эта стадия может быть осуществлена при различных температурах, но предпочтительно, если предварительное осахаривание происходит при температуре, наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или наиболее подходящей для прогнозируемого ферментного оптимума тестируемых ферментов. Температура предварительного осахаривания может находится в диапазоне от около 10C до 80C, от около 20C до около 80C, от около 30C до около 70C, от около 40C до около 60C, от около 37C до около 50C, предпочтительно от около 37C до около 80C, более предпочтительно около 50C. При отсутствии данных о температурном оптимуме предпочтительнее осуществлять реакции предварительной обработки при 37C вначале, а затем при более высокой температуре, такой как 50C. pH Предварительно осахаренной смеси может находиться в диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 5,0. Опять же, может не потребоваться корректировка pH до осахаривания, поскольку ферментная композиция, как правило, подходит для применения при низком pH, как описано в данном документе. Стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 1 ч до около 120 ч, предпочтительно от около 2 ч до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 ч до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение от около 2 ч до около 6 ч. Обработка целлюлазой может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 ч до около 168 ч, предпочтительно от около 12 ч до около 96 ч, более предпочтительно от около 24 ч до около 72 ч, еще более предпочтительно в течение от около 24 ч до около 48 ч. Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, которые включают, без ограничения, аминокислоты, витамины, лекарства, кормовые добавки для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, этанол,включая топливный этанол. Существенным является то, что способ изобретения может быть осуществлен при высоких концентрациях сухого вещества (лигноцеллюлозного материала) в реакции гидролиза. Таким образом, изобретение может быть проведено с содержанием сухого вещества около 5% или выше, около 8% или выше,около 10% или выше, около 15% или выше, около 20% или выше, около 25% или выше, около 30% или выше, около 35% или выше, около 40% или выше. Соответственно, изобретение обеспечивает способ получения продукта ферментации, где способ включает а) деградацию лигноцеллюлозы с помощью способа, как описано в данном документе; иb) ферментацию полученного материала для получения продукта ферментации. Такой процесс может быть проведен без какой-либо потребности в корректировке pH в ходе процесса. Иначе говоря, процесс является процессом, который может быть проведен без добавления кислоты(от) или основания(ий). Однако это исключает стадию предварительной обработки, в которой может быть добавлена кислота. Суть в том, что ферментная композиция изобретения способна действовать при низком значении pH и, следовательно, нет необходимости в корректировке pH предварительно обработанного кислотой сырья для осуществления осахаривания. Соответственно, способ изобретения может быть безотходным способом, в котором используют только органические продукты без необходимости введения неорганических химических веществ. В соответствии с изобретением могут быть получены продукты ферментации, включая аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топлива или другие органические полимеры, молочная кислота, этанол, включая топливный этанол (под термином "этанол" понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды). Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол и бутанол); молочную кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропан-диол; этилен, глицерин, пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, растворитель; добавку к кормам для животных, лекарство, такое как -лактамный антибиотик или цефалоспорин; витамин, аминокислоту, такую как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспарагиновую кислоту; фермент, такой как протеаза, целлюлаза, амилаза, глюканаза, лактаза, липаза, лиаза, оксидоредуктаза, трансфераза или ксиланаза и химическое сырье или добавку к кормам для животных. Способ получения продукта ферментации необязательно может содержать извлечение продукта ферментации. Такой процесс может быть проведен в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно, если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом и/или в условиях с ограничением по С. Способ анаэробного сбраживания здесь определен как способ сбраживания, запускаемый в отсутствие кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем около 5,около 2,5 или около 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов,так и акцепторами электронов. Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также фактическими характеристиками перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч. Настоящее изобретение также относится к мутантам Talaromyces emersonii, которые способны сверхпродуцировать деградирующие лигноцеллюлозы ферменты, которые могут деградировать растительную биомассу. Микроорганизм модифицирован таким образом, чтобы синтез лигноцеллюлозных ферментов увеличился по сравнению с немодифицированной формой микроорганизма. Изобретение охватывает любую мутацию гена микроорганизма, которая приводит к увеличению выработки ферментов, деградирующих лигноцеллюлозы. Классический мутагенез и последующая программа скрининга является хорошо известным эмпирическим нерекомбинантным подходом улучшения штаммов (Vinci and Byng, 1999)."Мутагенез" означает индукцию наследуемых изменений - мутаций - в генетическом материале микроорганизма, обычно хромосомной ДНК (Crueger, 1993). Эти мутации вызваны изменениями в генотипе микроорганизма (мутанта). Мутации случаются спонтанно in vivo или после индукции мутагенами(например, радиацией или химическими агентами). Мутации также могут быть индуцированы in vitro посредством методов сайтнаправленной генетической инженерии. Мутагенез, индуцируемый в микроорганизмах физическими или химическими агентами, происходит случайно. Наиболее часто используемыми физическими мутагенами являются нагревание, замораживание и оттаивание, облучение дальним ультрафиолетом, облучение ближним ультрафиолетом в присутствии 8-метоксипсоралена и ионизирующее облучение. Предпочтительным физическим мутагеном является облучение УФ. Наиболее часто используемыми химическими мутагенами являются: (i) мутагены, влияющие на нереплицирующуюся ДНК (например, азотистая кислота, гидроксиламин и алкилирующие агенты), и (ii) мутагены, влияющие на реплицирующуюся ДНК (например, аналоги оснований, такие как 5 бромурацил, 2-аминопурин и N4-гидроксицитидин; и мутагены, сдвигающие рамку считывания, такие как акридиновый оранжевый, профлавин, 9-аминоакридин, акрифлавин, ICR-соединения ICR170 иICR191, хомидиум бромид и фотореактивные псоралены). За исключением ультрафиолетового облучения, алкилирующие агенты, группа химических мутагенов, являются наиболее мощными мутагенными системами для практического применения (Brookes, 1990, Crueger, 1993). Большинство алкилирующих агентов действуют как монофункциональные агенты, как, например, эпоксиды (например, диэпоксибутан [DEB]), этиленимины (например, этиленимин [EI]), алкилсульфаты (например, диэтилсульфат [DES],диметилсульфата [DMS], алкилалкансульфонаты (например, метилметансульфонат [MMS], этилметансульфонат [EMS]), нитрозамиды (например, метилнитрозомочевина [МНМ], этилнитрозомочевина[ENNG], пропил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин [PNNG] 4-нитрохинолин [NQO]) и действующие косвенно диметилнитрозамины [DMN] и диэтилнитрозамины [DEN]. Ди- и полифункциональными алкилирующими агентами являются азотистые иприты (например, ди-(2-хлорэтил) сульфид [иприт], ди-(2-хлорэтил)амин [азотистый иприт], ICR-соединения, митомицин С). Предпочтительными химическими мутагенами являются NTG и NQO или комбинации обоих. Для облучения или химических агентов мутационные изменения, как правило, являются результатами ошибок репликации или механизмов репарации посредством включения неправильного основания или нуклеотида в полинуклеотидную цепь или прямого химического взаимодействия с основанием или нуклеотидом. Механизмами репарации являются, например, фотореактивация, репарация длинными последовательностями и эксцизионная репарация, пострепликационная репарация, SOS репарация, репарация алкилирований, адаптивный ответ и репарация двухцепочечных разрывов. При использовании химических или физических мутагенов типичные проценты выживания, используемые в данной области, находятся в диапазоне от 0,01 и 60%. Предпочтительно, если процент выживания находится в диапазоне от 0,05 до 50%. Более предпочтительно, если процент выживания находится между 0,1 и 30%. Специалисту хорошо известно, что конидиоспоры являются предпочтительным материалом для мутагенеза грибных микроорганизмов, включая виды Talaromyces. Мутанты, однако,могут быть получены из клеток мицелия. Способ отбора, описанный в данном документе, может быть применен для отбора мутантов, полученных либо из конидиоспор, либо из клеток мицелия. В дополнение к этим методам мутации в генах-мутаторах также могут усилить мутагенез в микроорганизмах за счет увеличения скорости спонтанных мутаций в других генах. Е. coli, например, имеет по меньшей мере девять локусов, которые известны как вызывающие мутаторные фенотипы: например,локус mutT повышает частоту мутаций в 1000 раз, главным образом трансверсий ATCG; mutD5 является наиболее мощным мутатором, который имеет дефект экзонуклеазы из ДНК-полимеразы III и дефект в пострепликационной репарации ошибочно спаренных оснований (Horiuchi et al., 1989; Schaaper andRadman, 1989; Crueger, 1993). Различные гены-мутаторы также были генетически охарактеризованы в В.subtilis. Хотя спонтанная мутация не затронута в мутанте В. subtilis mutT, частота спонтанной мутации может быть значительно усилена при использовании мутантов mutS, mutL, mutM и mutY из В. subtilis"Мутация" может быть делецией, заменой или добавлением в последовательность гена. Мутация может быть разрушением, мутацией со сдвигом рамки или нонсенс-мутацией. Мутация может быть разрушением, влияющим на всю последовательность гена или на его часть. Мутация может затронуть кодирующую или некодирующую последовательность, например промотор гена. Мутация может быть ре- 16021855 зультатом полной потери транскрипции гена или преждевременной терминации трансляции. Аналогичным образом, мутация может быть расположена в предшествующем (или "расположенном выше") гене,который разрушает транскрипцию смежного (или "расположенного ниже") гена(ов), посредством процесса, известного как полярность. В ином случае, мутация может оказывать влияние, заключающееся в том, что транслируемый белок, в сравнении с белком дикого типа, несет мутацию, которая приводит белок в нефункциональное состояние. Такие мутации могут повысить выработку целлюлаз множеством различных путей. Например, мутации в пределах промотора и регуляторных (цис) участков гена, кодирующего целлюлазу, могут напрямую затронуть экспрессию указанного гена, что повысит уровень или активность целлюлазы. В ином случае, мутации могут затронуть экспрессию генов, которые кодируют белки, участвующие в механизме внеклеточной секреции белков. Повышение уровня этих белков может дать в результате более высокий уровень секреций в культуральную среду. Также мутации могут действовать на протеазы или РНКнуклеазы для предотвращения деградации мРНК-транскриптов целлюлазных генов или целлюлазных ферментов, что таким образом повышает уровни белка целлюлаз относительно немодифицированной клетки. Таким образом, штаммы Talaromyces по изобретению могут быть получены способом, который включает следующие стадии:a) отбора и выделения варианта в виде одной колонии из множества морфологий колоний штаммаb) мутагенеза варианта в виде колонии и скрининг полученных мутантов на предмет высокой целлюлазной активности;c) отбора и выделения из мутантов одного или нескольких мутантных штаммов с высокой целлюлазной активностью; и необязательноd) отбора и выделения варианта в виде одной колонии мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью из множества морфологий колоний мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью;e) мутагенеза штаммов из варианта в виде колонии стадии d) и скрининга полученных мутантов на предмет устойчивости к аналогам глюкозы (например, к 2-деокси-D-глюкозе [DOG]);f) отбора и выделения из мутанта стадии е) одного или нескольких дерепрессированных по глюкозе мутантных штаммов с высокой целлюлазной активностью;g) повторного мутагенеза мутанта с улучшенной целлюлазной активностью из стадии с) и скрининга полученных мутантов на предмет более высокой целлюлазной активности; и необязательноh) мутагенеза штаммов из варианта в виде колонии стадии g) и скрининга полученных мутантов на предмет устойчивости к аналогам глюкозы (например, к 2-деокси-D-глюкозе [DOG]);i) повторное выделение дерепрессированного по глюкозе мутантного штамма с высокой целлюлазной активностью из одного или нескольких дерепрессированных по глюкозе мутатных штаммов с высокой целлюлазной активностью из стадии h). В одном воплощении в стадии b) мутагеном является NTG. NTG дает высокий мутационный фактор для устойчивости к FOA (5-фторооротовой кислоте). В одном воплощении в стадиях е) и h) мутаген является комбинацией NQO и NTG. Данная комбинация мутагенов дает высокий мутационный фактор для устойчивости к DOG (2-деоки-D-глюкозе). Эффективность мутагенеза в данном документе оценивается путем определения выживания после мутагенной обработки и повышения частоты появления мутантов, устойчивых к 5-фтороротовой кислоте(FOA), фенотипу, легко поддающемуся балльной оценке. Соотношение этих частот в данном документе называется мутационным фактором (MF). В одном воплощении отбор на стадиях с) и f) проводят в две стадии, где первой сортировкой является высокопроизводительный скрининг, а вторая сортировка проводится по выработке целлюлаз в культурах в перемешиваемых колбах."Промотор" является последовательностью ДНК, которая расположена выше старта транскрипции гена и участвует в распознавании и связывании с РНК полимеразой и/или с другими белками для инициации транскрипции гена. Обычно промотор определяют в условиях, в которых экспрессируется ген. Термин "дерегулированный" или "дерегуляция" включает изменение или модификацию по меньшей мере одного гена в микроорганизме таким образом, чтобы уровень активности генного продукта в микроорганизме изменился или модифицировался. Предпочтительно, если по меньшей мере один ген изменяется или модифицируется таким образом, чтобы генный продукт усиливался или увеличивался."Дерегулированный" промотор является промотором, который допускает генную экспрессию в условиях роста и окружающей среды, в которой он обычно является репрессированным. "Сильно дерегулированный промотор" является промотором, который вызывает инициацию мРНК с большей частотой по сравнению с нативным промотором в условиях роста и окружающей среды, когда он является дерепрессированным. Мутации могут снизить или полностью предотвратить экспрессию одного или более чем одного гена, который репрессирует экспрессию генов, кодирующих целлюлазы. Это привело бы к появлению клеток с повышенной выработкой целлюлаз. Примерами таких регуляторных генов (также общеизвестных как транскрипционные факторы) являются, без ограничения перечисленным, Acel из Trichoderma reesei иmig1 из Saccharomyces cerevisiae и их ортологи, обнаруженные в грибах, включая Talaromyces emersonii и родственные виды. Мутации также могут увеличить экспрессию или сверхэкспрессию одного или больше чем одного гена, который активирует экспрессию генов, кодирующих целлюлазы. Это привело бы к появлению клеток с повышенной выработкой целлюлаз. Примерами таких регуляторных генов (также общеизвестных как транскрипционные факторы) являются, без ограничения перечисленным, XlnR из Aspergillus niger иAceII из Trichoderma reesei и их ортологи, обнаруженные в грибах, включая Talaromyces emersonii и родственные виды. Мутации также могут повысить экспрессию целлюлазных генов, чья экспрессия репрессируется глюкозой, клеточное состояние, общеизвестное как дерепрессия по глюкозе или мутации, дерепрессированные по глюкозе. Клетки для выработки целлюлаз, которые являются дерепрессированными по глюкозе, являются клетками, которые допускают более высокую выработку одной или нескольких целлюлаз,когда глюкоза все еще присутствует в ростовой среде или в соответствующих количествах в клетках, в которых целлюлазы, как правило, не вырабатываются или продуцируются на более низких уровнях. Дерепрессия по глюкозе может быть вызвана различными мутациями в клетке, включая, без ограничения перечисленным, мутации в промоторной области гена, кодирующего целлюлазу, которая предотвращает связывание с репрессирующими по глюкозе регуляторными белками. Предотвращение связывания с такими регуляторными белками делает возможной экспрессию кодирующего целлюлазу гена в присутствии глюкозы. Примером регуляторного белка, который участвует в репрессии по глюкозе выработки фермента/целлюлазы в грибах, является, без ограничения перечисленным, CreA из Aspergillus nidulan и его ортологи, обнаруженные в грибах, включая Talaromyces emersonii и родственные виды. В ином случае, мутации генов, которые регулируют экспрессию CreA и схожих ортологов, также будут приводить к повышенной экспрессии кодирующего целлюлазу гена в присутствии глюкозы. В одном воплощении штамм Talaromyces является дерепрессированным по глюкозе. В одном воплощении выработка ферментов дерепрессированным штаммом в присутствии глюкозы в течение 96 ч по меньшей мере в два раза выше, чем у родительского штамма в схожих условиях. В предпочтительных воплощениях соотношение составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 раз. В одном воплощении штамм Talaromyces вырабатывает ксиланазу при росте в присутствии глюкозы. В любом воплощении дерепрессированный по глюкозе штамм имеет целлюлазную активность, которая составляет по меньшей мере 25% активности (репрессированного глюкозой) родительского штамма дикого типа, который растет в схожих условиях в среде 2 для Talaromyces без глюкозы в течение 96 ч. В настоящем изобретении классический мутагенез и скрининг проводили в следующей последовательности: (i) получение библиотек мутантов с помощью УФ или NTG отдельно или в сочетании с NQO;(ii) отбор случайных мутантов по повышенной выработке целлюлаз или мутантов, устойчивых к аналогам глюкозы, что приводит к дерепрессии по глюкозе при выработке целлюлаз; (iii) эксперименты в перемешиваемых колбах с мутантами, демонстрирующими улучшенную выработку целлюлаз в присутствии или отсутствие глюкозы, и, наконец, (iv) ферментация для определения уровней целлюлазы тех мутантов, которые в экспериментах в перемешиваемых колбах выработали целлюлаз значимо больше, чем родительский штамм, или которые вырабатывают целлюлазу в присутствии глюкозы. Микроорганизм изобретения способен вырабатывать выше нормы один или несколько лигноцеллюлозных ферментов. При использовании в данном документе термин "выработка лигноцеллюлозного фермента выше нормы" относится к значимо повышенной выработке лигноцеллюлозного фермента микроорганизмом изобретения по сравнению с формой дикого типа указанного микроорганизма. Предпочтительно, если выработка лигноцеллюлозного фермента выше нормы означает выработку по меньшей мере 6 FPU на мл культуральной среды. Другой аспект изобретения заключается в способе получения смеси целлюлаз, который включает(а) культивирование микроорганизмов по изобретению в условиях, в которых получают целлюлазную смесь; и (b) необязательно извлечение целлюлазной смеси из клеточной культуральной среды. Способ изобретения включает стадию культивирования модифицированных микроорганизмов в условиях, при которых вырабатывается смесь целлюлаз. Термин "культивирование" включает поддержание и/или рост живого микроорганизма настоящего изобретения. Микроорганизм изобретения культивируют в питательной среде, подходящей для выработки смеси целлюлаз с помощью известных в данной области способов. Культуральная среда, необходимая для процесса культивирования по изобретению, не является критичной для изобретения. Питательные вещества добавляют в процесс в соответствии с потребностями рассматриваемого организма, при этом питательные вещества предоставляются в избытке. Целесообразно, если культуральная среда содержит источник углерода, источник азота, а также дополнитель- 18021855 ные соединения, необходимые для роста микроорганизма и/или образования ценной целлюлазной смеси. Например, дополнительные соединения могут быть необходимы для индукции выработки ценного соединения. Общее количество источника углерода и азота, добавляемое в процессе культивирования в соответствии с изобретением, может варьировать в зависимости, например, от потребностей микроорганизма и/или длины процесса культивирования. Например, микроорганизм изобретения может быть культивирован в подходящей среде и в условиях, позволяющих экспрессировать и/или выделять смесь целлюлаз. Культивирование проводится в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с помощью процедур, известных в данной области (см., например, Bennett J.W. and LaSure, L., eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Подходящие среды можно получить у коммерческих поставщиков или их можно приготовить по опубликованным составам (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Примеры подходящих источников углерода или углеродных субстратов, известных в данной области, можно найти в WO 98/37179, включая, без ограничения перечисленным, сложные углеводы, такие как соевая или зерновая крупа, зерновая мука, крахмалы, сахара, сахарные спирты, углеводороды, масла, жиры, жирные кислоты, органические кислоты и спирты. Зерновая мука определяется, без ограничения перечисленным, как полированный рис, пшеница, очищенная пшеница, кукуруза, ячмень, овес или овсяная мука. Примеры подходящих источников азота, известные в данной области, включают, без ограничения перечисленным, овощные белки, пептоны, пептиды и аминокислоты, полученные из зерновых, бобовых и клубней, белки, пептиды и аминокислоты, полученные из животных источников, таких как мясо, молоко, и животные побочные продукты, таких как пептоны, мясные экстракты, гидролизаты казеина, соевая крупа, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мочевина, сульфат аммония, хлористый аммоний,нитрат аммония и фосфат аммония. Дополнительные соединения, требуемые для роста микроорганизма и/или для образования продукта, такие как фосфат, сульфат, микроэлементы (например, соли магния, железа, марганца, кальция, меди,цинка, бора, молибдена и/или кобальта), витамины или промоторы роста, могут быть добавлены в количествах, которые могут варьировать между различными классами микроорганизмов, т.е. между грибами,дрожжами и бактериями. Кроме того, количество добавляемого дополнительного соединения может быть определено типом образуемого ценного соединения. Как правило, количество компонентов среды,необходимых для роста микроорганизма, может быть определено относительно количества источника углерода, используемого в культивировании, поскольку количество образуемой биомассы главным образом будет определено количеством используемого источника углерода. Микроорганизм предпочтительно культивируют с индуктором для индукции целлюлазных ферментов. Индукторы могут быть одним или несколькими олиго-, ди- или моносахаридами, которые приводят к индукции выработки целлюлаз клеткой-хозяином. Индуктор может быть получен ферментативным гидролизом целлюлозы одним или несколькими целлюлазными ферментами для получения главным образом -связанных глюкозных димеров. Подходящие коммерческие индукторы, включают, без ограничения перечисленным, "Avicell", "Arbocell", "Buckeye" и "Viscokraft". Более предпочтительным является выделение мутанта Talaromyces, который не требует целлюлозы для индукции целлюлазных ферментов. Микроорганизм можно культивировать в жидких средах либо непрерывно, либо периодически, обычными способами культивирования, такими как постоянная культура, культура в пробирке, перемешиваемая культура, аэрируемая спинкультура или ферментация. Предпочтительно, если микроорганизмы культивируют в ферментере. Процесс культивирования по изобретению может быть осуществлен как периодический, повторяющийся периодический, подпитываемый, повторяющийся подпитываемый, как непрерывное культивирование, в режиме взвеси или твердого вещества. Для конкретного применения (т.е. для примера) периодический процесс применяют, когда до начала процесса культивирования все компоненты среды добавляют в среду напрямую, полностью в избытке. В предпочтительном воплощении дерепрессированный по глюкозе штамм культивируют в условиях с подпиткой. В соответствии с этим воплощением могут быть получены очень высокие ферментные титры, например, при подпитываемом процессе активности целлюлаз могут достичь, например, 20 FPU2%/мл или больше, 25 FPU2%/мл или больше или 30 FPU2%/мл или больше. Подпитываемый процесс не осуществим с репрессируемым глюкозой штаммом, поскольку глюкоза, которая подается в подпитываемый процесс, будет репрессировать выработку целлюлаз, что в результате приведет к низким выходам целлюлаз. Как правило, процесс микробного культивирования может быть разделен на фазу роста, целью которой является образование биомассы, и фазу продуцирования, целью которой является выработка ценного соединения. Специалисту в данной области ясно, что эти две эти фазы не могут быть строго разделены во времени, но в некоторой степени могут перекрываться. Процесс культивирования по изобретению предпочтительно осуществляют в промышленном масштабе. Процесс промышленного масштаба следует понимать как включающий процесс культивирования в ферментере, объем которого составляет 0,01 м 3, предпочтительно 0,1 м 3, предпочтительно 0,5 м 3, предпочтительно 5 м 3, предпочтительно 10 м 3, более предпочтительно 25 м 3, наиболее предпочтительно 50 м 3. Дополнительный аспект настоящего изобретения касается выбора последующей переработки жид- 19021855 кой питательной среды. Периодический процесс, примененный в соответствии с изобретением, облегчает последующую переработку особенно из-за высокого выхода ценного соединения и низкого количества побочных продуктов. Последующая переработка может включать извлечение, а также стадии разработки композиций. После окончания процесса культивирования ценный продукт может быть извлечен из жидкой питательной среды с помощью стандартной методологии, разработанной для извлечения представляющего интерес ценного соединения. Соответствующая технология последующей переработки, таким образом,зависит от природы и клеточной локализации ценного соединения и от требуемого уровня чистоты представляющего интерес продукта. В типичном процессе извлечения биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью, например, центрифугирования или фильтрации. Ценное соединение затем извлекают из биомассы в случае, когда ценный продукт накапливается внутри или связан с микробными клетками. Термин "извлечение" включает выделение, экстракцию, сбор, отделение или очистку соединения из культуральных сред. Выделение соединения может быть осуществлено в соответствии с любой известной в данной области методологией выделения и очистки, включая, без ограничения перечисленным,изменение pH, экстракцию растворителем, диализ, клеточную фильтрацию и ультрафильтрацию, концентрирование, лиофилизацию и т.п. Конечно, биомасса как таковая также может быть использована. В ином случае, если ценный продукт секретируется из микробной клетки, его можно извлечь из культуральной жидкости. Биомасса и/или ценное соединение могут быть включены в состав в виде жидких или твердых продуктов. В другом воплощении требуемое соединение не очищают из микроорганизма или культуры, в качестве источника продукта могут быть использованы цельная культура или культуральная надосадочная жидкость. В конкретном воплощении культуру или культуральную надосадочную жидкость применяют без модификации. В дополнительном воплощении культуру или культуральную надосадочную жидкость добавляют напрямую к лигноцеллюлозному материалу для гидролиза. Различные воплощения изобретения, описанные в данном документе, могут быть объединены перекрестно. Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение. Примеры Общая методология Штаммы Штаммы Talaromyces emersonii настоящего изобретения получены из АТСС 16479, который ранее являлся Penicillium geosmithia emersonii. Другими обозначениями Т. emersonii АТСС 16479 являютсяCBS393.64, IFO31232 и IMH 16815. Одиночную колонию АТСС 16479 очищали и хранили; этим штаммом является ТЕС-1. Для приготовления стоков для дальнейших исследований применили массовую инокуляцию ТЕС-1, и этот штамм назвали ТЕС-1 А. Все мутанты, описанные в данном документе, получены из одиночной колонии ТЕС-1 А, названной ТЕС-101. Среды и растворы 1. Общий рост, очистка колоний и консервация штаммов Картофельный агар с декстрозой, PDA (Potato dextrose agar), (Fluka, Cat. No. 70139) 2. Споруляция Агаровая среда для Talaromyces Композиция солевой фракции Солевая фракция соответствовала раскрытию WO 98/37179, табл. 1. Отклонениями от композиции этой таблицы были CaCl22H2O 1,0 г/л, KCl 1,8 г/л, лимонная кислота 1 H2O 0,45 г/л (хелатирующее средство). 3. Анализ флуоресценции в чашках С-агар 4. Среда для уменьшения размера колоний СТХ-агар С-агарCTXG-агар СТХ-агар глюкоза вплоть до 1,5% 6. Отбор устойчивых к аналогам глюкозы мутантов Стерилизованная фильтром фтороротовая кислота (Sigma, Cat. No. F5013; 10% стоковый раствор,приготовленный в DMSO) добавляют после смешивания до конечной концентрации 0,1% (1 г/л). Среды для перемешиваемых колб 1. Среда для инокуляции Среда 1 для TalaromycesA3 50%, А 2 25% и A3 20% называются среда 2 для Talaromyces (T2), среда 3 для Talaromyces (Т 3) и среда 4 для Talaromyces (T4) соответственно. Рецептуры даны в табл. 1. Таблица 1. Композиция ростовых сред для проверки выработки целлюлаз в перемешиваемых колбах и микротитрационных планшетах. Стерилизация 20 мин при 120C Аналоги/интермедиаты 2-дезоксиглюкоза (Sigma, Cat. No. D6134): готовили стоковый раствор на воде в концентрации 10%. 1-тиоглюкоза (Sigma, Cat. No. T6375): готовили стоковый раствор на воде в концентрации 10%. Протокол выращивания в перемешиваемых колбах Предварительные культуры Штаммы выращивали из стоков на скошенных агарах со средой для Talaromyces в течение 5-7 дней при 40C; стоки штаммов хранили при -80C в 10% глицерине. Выращенные штаммы на скошенном агаре необходимо хранить при комнатной температуре с максимальным периодом хранения две недели,после этого для тестирования штаммов необходимо приготовить свежие культуры на скошенном агаре. Споры и мицелий со скошенных агаров использовали для инокуляции предварительных культур,содержащих среду 1 для Talaromyces (20 мл культуральной среды в 100-мл колбе Эрленмейера). Инокуляцию осуществляли пипетированием 2 мл среды 1 для Talaromyces на поверхности скошенного агара,многократным пипетированием и соскабливанием до удаления мицелия; суспендированную биомассу перемешивали в среде для инокуляции. Несколько капель оставшейся клеточной суспензии использовали для инокуляции свежих скошенных агаров для проверки сохранности штамма. Затем предварительную культуру выращивали максимум 20 ч при 44C с перемешиванием (280 об/мин). Продуцирующая культура Один или 0,5 мл предварительной культуры использовали для инокуляции 20 мл продуцирующей среды (табл. 1) в 100-мл колбе Эрленмейера. Культуры инкубировали в течение 4 дней при 44C с перемешиванием (280 об/мин). Анализы целлюлаз 1. Анализ на пшеничной соломе (англ. Wheat Straw assay) (WSU-анализ). Приготовление образцов Для культур в перемешиваемых колбах 10 мл культурального бульона переносили в 12-мл одноразовую пробирку и центрифугировании для удаления биомассы. Один мл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками для хранения при -20C. Для 24-луночных микротитрационных планшетов планшеты центрифугировали для удаления биомассы. Один мл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками для хранения при -20C. Для 96-луночных полуглубоких планшетов в каждую лунку вначале добавляли 300-400 мкл воды. После этого планшеты центрифугировали для удаления биомассы. Максимум 200 мкл надосадочной жидкости затем переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками для хранения при -20C. Приготовление предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы. Предварительно обработанную разведенной кислотой пшеничную солому промывали водой до достижения pH раствора с пшеничной соломой значения 6,5 или выше и гомогенизировали массу с помощью "ULTRA-TURRAX", лиофилизировали и перемалывали для анализа. Для получения предварительно обработанной пшеничной соломы можно применять предварительную обработку разведенной кислотойBiochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp. 69-85). Под 1 WSU понимают 0,119 мг/мл глюкозы, высвобожденной из 2,1 мас./об.% отмытой обработанной соломы 200 мкл ферментной смеси в течение 20 ч при 65C и pH 4,50. Высвобождение глюкозы не является линейной функцией количества фермента в композиции. Другими словами, удвоение количества фермента автоматически не приводит к удвоению количества глюкозы в течение одного и того же периода времени. Следовательно, предпочтительно выбрать разведение композиции, тестируемое для активности WSU так, чтобы WSU не превышало 40. Измерение целлюлазной активности в единицах WSU Сохраненные образцы размораживали и осуществляли серийные разведения в деминерализованной воде с 2-кратным шагом, вплоть до разведения в 32 раза. Разведенный образец использовали для осуществления измерений, в которых анализировали 200 мкл разведенного образца. В первом измерении 200 мкл разведенного образца переносили во флакон, который содержал 700 мкл воды, содержащей 3%(мас./об.) сухого материала предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы и 100 мкл 250 мМ цитратного буфера, конечный pH скорректировали до pH 4,5. Во втором измерении пустой образец, 200 мкл разведенного образца переносили во флакон, который вместо предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы содержал 700 мкл воды и 100 мкл 250 мМ цитратного буфера, конечный pH корректировали до 4,5. Анализируемые образцы инкубировали в течение 20 и/или 60 ч при 65C. После инкубации анализируемых образцов к ним добавляли 100 мкл раствора внутреннего стандарта (20 г/л малеиновой кислоты, 40 г/л ЭДТА в D2O). Количество высвобожденной глюкозы рассчитывается на основании сигнала при 5,20 ppm относительно диметил-сила-пентан-сульфоната,определенного посредством 1D 1 Н ЯМР с рабочей частотой для протонов 500 МГц, с помощью пульсовой программы с супрессией воды, при температуре 27C. Число WSU рассчитывали из данных путем вычитания количества глюкозы, которое было определено в холостом образце, из количества глюкозы,которое было измерено в образце, инкубированном с пшеничной соломой. Единицы пшеничной соломы(Wheat straw units) выражены как функция коэффициента разбавления образца. 2. Анализ с фильтровальной бумагой (FPU2%-анализ) Целлюлазную активность также измеряли в значениях "единиц фильтровальной бумаги" (filter paperunits, FPU) на мл при проведении анализа единиц фильтровальной бумаги в исходном (неразведенном) ферментном растворе. Способ модифицировали из аналитической процедуры Adney и Baker (1996, МоАwww.nrel.gov/biomass/analyticalprocedures.html) для того, чтобы сделать его чувствительнее, чем стандартный способ, который основан на рекомендациях международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC). Для количественных результатов ферментные композиции сравнивали на основе значимых и равных преобразований. Содержание 1,0 мг восстанавливающего сахара, такого как глюкоза,преобразованного в течение 60 мин, на 50 мг фильтровальной бумаги (2% преобразование вместо международного стандарта 4%), приняли как цену деления для расчета единиц фильтровальной бумаги (FPU) по IUCA. В этой процедуре выход восстанавливающего сахара не является линейной функцией количества фермента в анализируемой смеси, поскольку двойное количество фермента не даст двойное количество восстанавливающего сахара в течение одного и того же периода времени. Процедура анализа, следовательно, предусматривает выявление разведения исходного ферментного стока, при котором аликвота разведения объемом 0,5 мл катализирует 2% преобразование в течение 60 мин, после чего по разведению осуществляется расчет активности (в FPU2%/мл) исходного стока.FPU рассчитывали с помощью следующей формулы: Активность по фильтровальной бумаге=0,37/([Фермента] высвобождающего 1,0 мг глюкозы) [Единиц/мл][Фермент] означает долю раствора исходного фермента, присутствующую в непосредственно тес- 23021855 тируемом разведении фермента. Ферментные анализы индивидуальных целлюлаз-Глюкозидаза (WBDG) Ферментативную активность -глюкозидазы определяли при 37C и pH 4,40 с помощью паранитрофенилD-глюкопиранозида (Sigma, Cat. No. N-7006) в качестве субстрата. Ферментативный гидролиз pNPD-глюкопиранозида приводит к высвобождению пара-нитрофенола (pNP) и D-глюкозы. Для определения ферментативной активности измеряли количественно высвобожденный пара-нитрофенол,определенный в щелочных условиях. Через 20 мин инкубации реакцию останавливали добавлением карбоната натрия и поглощение измеряли при длине волны 405 нм. Активность -гликозидазы рассчитывали путем применения коэффициента молярной экстинкции пара-нитрофенола (Sigma, Cat. No. N-7660). Примененная методология является абсолютным способом и активность выражается в наномолях высвобожденного -нитрофенола в секунду на мл или на г образца. Активность -глюкозидазы выражается в единицах Бета-D-Глюкозидазы Белой Биотехнологии (англ. White Biotech Beta-D-Glucosidase,WBDG) на г или на мл. Одна единица WBDG определяется как количество фермента, которое высвобождает один наномоль пара-нитрофенола в секунду из пара-нитрофенилD-глюкопиранозида при определенных условиях анализа (4,7 мМ pNPBDG, pH 4,40 и Т=37C). Абсолютную активность рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов для расчетов. Активность эндоглюконаз (WBCU) Эндоглюканаза катализирует гидролиз карбоксиметилцеллюлозы. Количество восстанавливающих сахаров, образованных в ходе ферментной реакции, определяли с помощью реактива динитросалициловой кислоты. Образцы инкубировали в присутствии раствора карбоксиметилцеллюлозы (Novacel, ref.394) 18 г/л в ацетатном буфере, pH 4,60 при 37C. Инкубацию останавливали через 60 мин добавлением раствора гидроксида натрия. Образцы кипятили в течение 5 мин в присутствии реактива динитросалициловой кислоты (Acros 15644500). После разведения водой интенсивность цвета измеряли при 540 нм. Методологию использовали как относительный способ. Результаты связаны с целлюлазной композицией с формально присвоенной активностью. Активность выражали в единицах WBCU. Единица WBCU определяется как количество целлюлазы, которая гидролизует в течение 1 ч некоторое количество эквивалентных гликозидных связей для образования 0,5 мг глюкозы в условиях анализа. Активность рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значенийdeltaOD540 относительно активности образцов с известной активностью, с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии. Анализы измерения белков 1. Общий белок ТХУ/биуретовая реакция Способ являлся комбинацией осаждения белка с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с целью удаления мешающих веществ и для того, чтобы сделать возможным определение белка с помощью колориметрической биуретовой реакции. В биуретовой реакции ион меди (ii) восстанавливается в медь(i), которая образует комплекс с азотами и углеродами пептидных связей в щелочном растворе. Фиолетовый цвет указывает на присутствие белков. Интенсивность цвета и, следовательно, абсорбция при 546 нм прямо пропорциональна концентрации белка в соответствии с законом Ламберта-Бера. Стандартизацию осуществляли с помощью БСА (бычьего сывороточного альбумина), а содержание белка выражали в г белка как эквивалента БСА/л или мг белка как эквивалента БСА/мл. Содержание белка рассчитывали с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значений OD546 относительно концентрации образцов с известной концентрацией, с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии. 2. Индивидуальные белки с помощью ПААГ, денситометра и ЖХ/МС/МС измерений Предварительная обработка образцов для ДСН-ПААГ Осуществляли приготовление образцов на основе вычисленной концентрации белка. Для разведения образцов в пять раз (1 мг/мл) к 10 мкл образцов добавляли по 40 мкл воды "MilliQ" и 50 мкл ТХУ(20%), после чего высаживали белки. После 1 ч на льду образец центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали (10 мин, 14000 об/мин). Осадок обрабатывали, как описано ниже. ДСН-ПААГ Осадок растворяли в 65 мкл воды "MilliQ", 25 мкл буфера для образцов "NuPAGE LDS" (4), "Invitrogen" и 20 мкл средства для восстановления образцов "NuPAGE" (10), "Invitrogen". Перед стадией денатурации образец разводили в 5 раз смесью "MilliQ": буфер для образцов "NuPAGELDS" и 10 мкл средства для восстановления образцов "NuPAGE" в соотношении 65:25:10. После смешивания образцы инкубировали в термомиксере в течение 10 мин при 70C. Растворы образцов наносили на 4-12% БисТрис гель (NuPAGE BisTris, Invitrogen). Также на гель наносили образец (10 мкл) маркера М 12 (Invitrogen). Гель прогоняли при 200 В в течение 50 мин на "XCELL Surelock" с 600 мл разведенного в 20 раз буфера с ДСН во внешней камере для буфера и 200 мл разведенного в 20 раз буфера с ДСН, содержаще- 24021855 го 0,5 мл антиоксиданта (NuPAGE Invitrogen), во внутренней камере для буфера. После прогона гель споласкивали дважды диминерализованной водой, гели фиксировали раствором 50% метанол/7% уксусная кислота в течение 1 ч и окрашивали "Sypro Ruby" (50 мл на гель) в течение ночи. Изображение получали с помощью "Typhoon 9200" (610 ВР 30, Green (532 нм), РМТ 600 В, 100 мкм) после отмывки геля водой "MilliQ". Количественный анализ белка Соотношение белковых полос в дорожке определяли сканером "Typhoon" с помощью стандартных способов, известных в данной области. Образец наносили трижды и уровень яркости определяли программным анализом изображений. Значения выражали как относительный % белка по отношению к общему белку, рассчитанному по уровню яркости полосы выбранного белка относительно общего уровня яркости полос всех белков. Выбранные полосы вырезали с помощью "Exquest Spotcutter" от "BioRad" (FE003) и смывали с помощью воды "MilliQ" в 96-луночный микротитрационный планшет. Воду "MilliQ" отбрасывали и все полосы резали второй раз для того, чтобы собрать больше материала образца. Расщепление белков в геле для анализа последовательностей пептидов с помощью ЖХ/МС/МС Кусочки геля, собранные в микротитрационный планшет, отмывали 50 мМ NH4HCO3 pH 7,8. Промывку повторяли несколько раз, каждый раз уплотняя кусочки геля между стадиями отмывки с помощью ацетонитрила для удаления примесей и для обеспечения идеальных условий расщепления в геле. Количество добавляемых 50 мМ NH4HCO3 и ацетонитрила может варьировать в зависимости от размера кусочков геля; кусочек геля должен быть хорошо погружен в растворы. Добавляли свежеприготовленный раствор трипсина и инкубировали микротитрационные планшеты в течение по меньшей мере получаса на льду или при 4C в холодильнике с последующей инкубацией в течение ночи при 37C при нагреве крышки микротитрационного планшета. После ночной инкубации кусочки геля обрабатывали ультразвуком в течение 1-5 мин и жидкую фракцию переносили в новый микротитрационный планшет"LoBind". Для удаления из кусочков геля максимально возможного количества пептидов в кусочки геля добавляли минимально возможный объем ацетонитрила и муравьиной кислоты с последующей обработкой ультразвуком в течение 1-5 мин. Жидкую фракцию переносили в микротитрационные планшеты"LoBind" и добавляли малый объем муравьиной кислоты. Аминокислотную последовательность триптических пептидов определяли с помощью стандартного анализа ЖХ/МС/МС, известного в данной области. Для анализа пептидных смесей использовали так называемое детальное сканирование (survey scan). Данный способ, в котором сканирование состоит из двух сегментов, определен следующим образом: 1) полный сканирующий МС-анализ для отбора ионов-предшественников для МС/МС, основанного на определенных критериях; 2. МС/МС выбранных ионов для получения информации об аминокислотной последовательности. С помощью этой процедуры один ион-предшественник единовременно отбирали для МС/МС в пределах определенных пороговых значений, что дает массивы данных МС/МС по пептидам, всей представленной аминокислотной последовательности части белка. Все спектры МС/МС использовали для идентификации белка поиском по базе с помощью поискового системы "Mascot" в соответствующих базах данных. 3. Индивидуальные белки с помощью протеомного анализа "APEX" Материалы ЖХ-МС/МС-система, состоящая из "Accela" и "LTQ-Velos" от "Thermo Fisher" (Сан-Хосе, Калифорния, США). Колонки были приобретены у "Agilent": "Zorbax", 2,1 мм 5 м, С 18-колонка с частицами 1,8 м. "Biofuse fresco" от "Heraeus" использовали для центрифугирования пробирок "Eppendorf", "Beckman Coulter Allegra X-15R" использовали для центрифугирования пробирок "Greiner". Термомиксер"Comfort" от "Eppendorf" (Гамбург, Германия) использовали для инкубации, а пробирки "Eppendorf Lobind" использовали для всех экспериментов. Поиски по базам данных осуществляли с помощью поисковой машины "Sorcerer 2" (SageN, Сан-Диего, Калифорния, США), использующей "Trans-Proteomics Pipeline" (TPP). Результаты идентификации обрабатывали с помощью свободного программного обеспечения "Absolute Protein Expression software" (APEX), http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics/apex.htm, для получения количеств белков. Буферы А и В, ЖХ-МС-категории, 0,1% муравьиная кислота в воде и 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле соответственно приобретены у "Biosolve" (Валкенсваард, Нидерланды). Бычий сывороточный альбумин (БСА), мочевина, йодацетамид (IAA) и 6,1 N раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) приобрели у "Sigma Aldrich" (Сент-Луис, Миссури, США). Раствор ТХУ разводили в 4,5 раза для получения 20% раствора ТХУ. Дитиотреитол (ДТТ) приобрели у "Roche Applied Science" (Индианаполис, Индиана, США). Муравьиную кислоту (МК) приобрели у "JT Baker" (Филипсбург, Нью-Джерси, США). Трипсин со степенью чистоты для секвенирования приобрели у "Roche Applied Science" (Пензберг, Германия). Преципитация с ТХУ и расщепление Образцы осторожно размораживали и хранили на льду столько, сколько необходимо для приготовления образцов. Образцы разводили до концентрации белка 5 мг/мл. 100 мкл Образца и 50 мкл 0,1 мг/мл БСА разводили 1:1 20% ТХУ. Образцы инкубировали при 4C в течение 30 мин и осаждали белки центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, 4C. Надосадочную жидкость удаляли и осадки отмывали 200 мкл ацетона при -20C. Белки снова осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, 4C и удаляли надосадочную жидкость. Отмытые осадки разводили в 75 мкл 8 М мочевины. Данный раствор разводили 392, 5 мкл 100 мМNH4HCO3. Добавляли 5 мкл 500 мМ ДТТ и инкубировали образцы при комнатной температуре в течение 30 мин при максимальном перемешивании на термомиксере. Цистеины алкилировали добавлением 13,5 мкл 550 мМ IAA и инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин с максимальным перемешиванием на термомиксере в темноте. Расщепление осуществляли добавлением 20 мкл 250 мкг/мл трипсина, pH 3 и инкубацией при 37C в течение ночи при максимальной перемешивании в термомиксере. Для обеспечения полноты расщепления добавляли еще 5 мкл 250 мкг/мл трипсина, pH 3 и продолжали расщепление в течение 3 ч при 37C. Образцы анализировали с помощью системы "Accela LTQ-Velos system" (Thermo Electron). Колонка "Agilent" 2,15 мм, C18-колонка, частицы 1,8 м. Градиент 80 мин 5-40% AcN, 0,1% муравьиная кислота, 2 мин 40-60% AcN, 0,1% муравьиная кислота. Скорость потока 400 л/мин. Инъецируемый объем 20 л. Общее время выполнения, включая инъекцию, отмывку колонки и повторное установление равновесия, составило 85 мин.MS-Способ: 10 порядка двойная (double play) улучшенная МС, m/z 300-2000, и МС/МС на 10 лучших пиках. Сортировка по заряженному состоянию пропускает только ионы 2+ и 3+. Динамическое исключение: повтор 1, длительность исключения 10 с. Анализ данных с помощью "Sorcerer" и "Spotfire" Данные искали в базе данных Talaromyces emersonii (TEMER), которую вручную редактировали для включения последовательностей внутреннего стандарта БСА. Поиск по базам данных осуществляли на"Sorcerer 2", с помощью ТРР. Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных статистических инструментов. Анализы протеаз Примененный способ использовали для определения протеазной активности в кислых условиях (pH 3,5). Образец инкубировали в присутствии гемоглобина (Sigma, Cat. No. H2625) как субстрата при 60C. Реакцию останавливали через 60 мин добавлением трихлоруксусной кислоты. Образовавшийся преципитат удаляли фильтрацией с помощью фильтра "Whatman 42". Оптическую плотность фильтрата, измеренную при 280 нм, сравнивали с плотностями растворов калибровочной линии, определенных в той же серии. Активность выражается в APU (англ. Acid Protease Unit, Единицах Кислой Протеазы) на мл или на г. 1 APU является количеством фермента, который в условиях теста гидролизует количество субстрата в минуту, дающего раствор с оптической плотностью при 280 нм, равный оптической плотности раствора,содержащего 1,911 мкг тирозина на мл. Активность рассчитывается с помощью известных в данной области стандартных протоколов расчета путем нанесения значений OD280 относительно активности образцов с известной активностью с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии. Анализ целлюлаз в чашках Флуоресцентный анализ целлюлаз в чашках Флуоресцентные соединения 4-метилумбеллиферилD-целлобиозид (Sigma, Cat. No. M6018) и метилумбеллиферилглюкозу (Sigma, Cat. No. M3633) использовали для визуализации экспрессии СВН и -глюкозидазной активности, соответственно, колоний, выращенных на чашках с С-агаром. Субстраты 4-метилумбеллиферил -D-целлобиозу (англ. 4-methylumbelliferyl -D-cellobiose, MUC) и 4-метилумбеллиферил -D-глюкозу (англ. 4-methylumbelliferyl -D-glucose, MUG) хранили в виде 10 мМ стоковых растворов в ДМСО и непосредственно перед использованием стоки разводили в 10 раз 50 мМ натрийацетатным буфером, pH 4,5. Полученные растворы стерилизовали через фильтр (0,2 мкм) и добавляли к расплавленной агаровой среде (CTXG) до конечной концентрации 0,1 мМ и разливали по чашкам Петри. Использовали различные концентрации глюкозы: без глюкозы, 0,1, 0,5 и 1%. В качестве контроля использовали чашки агара с 0,5% мальтозой. Планшеты "Q tray", содержащие CTXG + флуоресцентный субстрат, инокулировали 104 мутировавших спор из отобранных мутантных библиотек. В качестве контролей агаровые чашки подобным образом инокулировали эталонными штаммами, ТЕС-147, ТЕС-123 и ТЕС-101. В ходе инкубации при 40C на предмет флуоресценции в присутствии или отсутствие глюкозы ежедневно проверяли колонии в "Qtray" в УФ-свете (366 нм). Всего 106 мутированных спор скринировали на флуоресцентной агаровой среде. Мутанты, которые давали наиболее сильную флуоресценцию в присутствии или отсутствие глюкозы,сохраняли для дальнейшего исследования.AZCL ксилан (анализ ксиланаз на чашках) Цветные соединения AZCL ксилан из овса (Megazyme, Cat. no I-AZXOT) использовали для визуализации экспрессии ксиланазной активности колоний, выращиваемых на агаровых чашках. Использовали YNB-агар, содержащий 1% целлюлозу, a AZCL ксилан добавляли к агару до конечной концентрации 0,1%. Также в агар по мере необходимости добавляли 2% глюкозу. Тестируемые штаммы инокулировали (т.е. рассевали штрихом для получения одиночных колоний) на эти агаровые чашки с помощью суспензии спор из глицериновых стоков или с помощью хорошо спорулирующих скошенных агаров. Чашки с агаром инкубировали в течение 2-3 дней при 40C. Качество роста и размер окрашенного в синий цвет гало, окружающего колонии, использовали для оценки уровня выработки ксиланазы среди различных штаммов. Условия мутагенеза Приготовление спор Споры собирают с агаровых чашек со средой 2 для Talaromyces, которые были инокулированы разведенной в 10 раз суспензией спор из стока спор штамма ТЕС-101. После инкубации в течение 7 дней при 40C сбор завершали соскабливанием спорулирующего мицелия с агаровых чашек с помощью 10% раствора глицерина. Споры суспендировали в 10% глицерине и хранили при -80 С.NTG Партию спор Т. emersonii (108 спор) инокулировали в 20 мл среды 1 для Talaromyces и эту культуру инкубировали в течение 4 ч при 45C с перемешиванием (280 об/мин) для начала прорастания спор. Суспензию спор центрифугировали и концентрировали ресуспендированием осадка в 10 мл 0,01 М буфера Трис-малеиновая кислота, pH 8,0, содержащего 0,01% Тритон 100. Пророщенные споры подвергали мутагенезу NTG с помощью известных в данной области стандартных способов (Cerda Olmedo, 1987,Mutagenesis. In Phycomyces (E. Cerda-Olmedo and E. D. Lipson, eds.), pp. 341-344. CSH Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, USA). Были использованы следующие концентрации NTG: 0, 0,05, 0,1 и 0,2 мг/мл. Добавление 10% раствора Na2S2O3 использовали для остановки/инактивации реакции NTG. После мутагенеза обработанные клетки отмывали один раз в физиологическом солевом буфере и разведения (10-1-10-5/мл) рассевали на чашки с агаровой средой для Talaromyces для определения выживания клеток. Чашки инкубировали при 45C в течение 3-7 дней для определения титров KOE. Каждую партию мутантов (0,5 мл) использовали для инокуляции одного планшета "Q-tray" (24 м 4 см; VWR), содержащего ТЕС-агар. Остаток суспензии мутированных клеток хранили при -80C пробирках для замораживания с 10% глицерином. Затем для оценки качества партий мутантов определяли частоту FoAr-мутантов в различных партиях мутантов. 107 Спор на партию мутанта помещали на среду с FOA-агаром. Чашки инкубировали при 40C в течение 3-7 дней для определения титров КОЕ. Партии мутантов с выживаемостью клеток 5-25%, которые имели по меньшей мере 10-кратное увеличение количества FoAr-колоний, использовали для скрининга мутантов обычным способом. УФ Пророщенные споры облучали УФ стандартными способами, известными из (Bos, C.J. and Stadler,D., 1996. Mutation. In Fungal Genetics, Principles and Practice (C.J. Bos., ed.), pp. 28-31, Marcel Dekker, NewNQO Пророщенные споры обрабатывали NQO известными в данной области стандартными способами(Jerzy Bal et al., 1977, Mutation Research 56: 153-156). Вкратце, применяемый протокол является аналогичным протоколу, использованному для мутагенеза пророщенных спор Talaromyces с NTG. Использованные концентрации NQO составили 0,5, 1 и 2,5 мкг/мл суспензии спор. Время инкубации в присутствии NQO составило 1 ч. Добавление 10% раствора Na2S2O3 использовали для остановки/инактивации реакции NQO. Слияние протопластов для объединения мутаций Образование протопластов Условия для образования протопластов были получены из известных в данной области протоколов(Peberdy, 1975, Arch Micro 105: 201-205; Peberdy, 1985, J. Gen. Microbiol. 131: 2813-2823. Штаммы Talaromyces с различными селективными маркерами, например, с устойчивостью к FOA (5-фтороротовой кислоте) и устойчивостью к DOG (2-деокси-D-глюкозе) инокулировали из различных глицериновых стоков в среду 1 для Talaromyces и выращивали в перемешиваемых колбах в течение 48 ч при 45C, 280 об/мин. Два мл этих инокуляционных культур использовали для инокуляции 500 мл перемешиваемых колб с 50 мл среды YGG (на л: 8 г KCl, 16 г глюкозыH2O, 20 мл 10% дрожжевого экстракта, 10 мл 100 пен./стреп., 6,66 г YNB + аминокислоты, 1,5 г лимонной кислоты и 6 г K2HPO4). Инкубацию продолжали в течение 16 ч при 45C в ротационном шейкере при 250-280 об/мин. Мицелии из этих культур затем собирали центрифугированием в 50-мл пробирки "Greiner" в течение 10 мин при 4000 об/мин или использовали фильтровальную бумагу "Miracloth" (Calbiochem). Осадки промывали и ресуспендировали в 0,6 М KCl/20 мМ цитратном буфере, pH 5,8. Выделение протопластов Для образования протопластов на 2 г мицелия добавляли 10 мл буфера STC (на л: 218 г сорбита (1,2 М), 7,35 г CaCl22 Н 2 О, 10 мМ Tris/HCl pH 7,5) и 2 мл раствора "Glucanex" (250 мг/мл Glucanex 200G(Novozymes) в H2O). Смесь инкубировали в ротационном шейкере при 100 об/мин и 34C в течение 90150 мин. Протопласты отделяли от мицелия с помощью фильтра "Miracloth" и добавляли STC до конечного объема 45 мл. Суспензию протопластов суспендировали в течение 10 мин при 390 g и при 4C, а после этого протопласты ресуспендировали в 45 мл STC. Протопласты центрифугировали в течение 10 мин при 390 g и при 4C и ресуспендировали в буфере STC в концентрации 107-108 протопластов/мл. Качество и количество протопластов оценивали под микроскопом. Слияние протопластов Слияние протопластов индуцировали смешиванием 1 мл суспензии протопластов с 6 мл 60% PEG 4000 (Merck), содержащего 50 мМ CaCl2, с последующей инкубацией в течение 15 мин при комнатной температуре. После инкубации PEG разводили добавлением 30 мл KCl/цитратный буфер и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 2 мл свежего KCl/цитратный буфер и эту суспензию протопластов помещали на восстанавливающие агаровые чашки. Для восстановления использовали чашки с агаровой средой для Talaromyces, как описано, но с добавлением сорбитола в качестве осмотического стабилизатора, в конечной концентрации 0,8 М. После инкубации в течение 7 дней при 40C споры собирали с восстанавливающих агаровых чашек и эти суспензии спор рассевали на селективные агаровые среды для отбора слитых с обоими селектируемыми маркерами. Периодическое выращивание Процедура инокуляции Содержимое одного флакона добавляли к среде для предварительного культивирования: 2-л колба с ребрами для перемешивания [20 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л глюкозы pH 6,8 (с KOH), 300 мл среды,стерилизация паром 20 мин при 121C]. Предварительную культуру выращивали в течение 24-48 ч при 48C и 200 об/мин. Временной интервал может быть адаптирован для конфигурации перемешиваемой колбы и жизнеспособности флакона. Основная процедура ферментации Среду составляли как смесь муки крупного помола (3%), целлюлозы (6%), источника азота (2,5%; известные в данной области примеры источников азота включают соевую крупу, дрожжевой экстракт,кукурузный экстракт, аммиак, соли аммония, нитратные соли), а также солевой фракции. Солевую фракцию привели в соответствие с WO 98/37179, табл. 1, с. 12. Отклонениями от композиции этой таблицы были: CaCl22 водный 1,0 г/л, KCl 1,8 г/л, лимонная кислота 1 водная 0,45 г/л (хелатирующее средство). Среду стерилизовали паром в одной фракции. Биореакторы инокулировали при 10% соотношении инокулюма, а рабочий объем равнялся 10 л. pH Процесса контролировали между 5,0-3,0 (с помощью фосфорной кислоты и аммиака), а температуру - на уровне 42-52C. Воздушный поток поддерживали на уровне от 0,5 до 1,5 vvm (англ. volume air per volume broth per minute, объем воздуха на объем питательной среды в минуту) и DOT выше 30% насыщения кислородом перед инокуляцией с целью перемешивания. В качестве противопенного средства периодически использовали "Clerol": 2 с каждые 30 мин, в течение первых 24 ч, затем 2 с каждый час позднее. В конце фазы предварительного культивирования брали образцы для проверки контаминации, определения глюкозы и измерения pH. В ходе основной ферментации образцы отбирали каждые 24 ч и осуществляли следующие анализы: контроль контаминации, измерение pH, ДСН-ПААГ гели, определение концентрации общего белка (биуретовый метод с ТХУ), активность в единицах фильтровальной бумаги (FPU2%/мл), активность -глюкозидазы (WBDG), активность эндоглюканазы (WBCU) и анализ на пшеничной соломе, как описано выше. Пример 1 В этом примере описано выделение и характеризация вариантов Т. emersonii с различной морфологией колоний.Talaromyces emersonii является термофильным мицелиальным грибом. Споруляция на стандартной агаровой среде PDA крайне незначительна (106/мл), рост на среде 2 для Talaromyces дает улучшенную споруляцию (-107/мл). После рассева серийных разведений ТЕС-1 А на чашках с агаровой средой для Talaromyces могут быть распознаны колонии с тремя различными фенотипами (фиг. 1): ТЕС-101, четко выраженный белый воздушный мицелий (80% популяции); ЕС-102 и ТЕС-103, редуцированный воздушный мицелий (20% популяции; извлечено два изолята); ТЕС-104, отсутствие воздушного мицелия, коричневый цвет (1% популяции). Фенотип ТЕС-104 остается стабильным в течение многих поколений после роста на агаровых чашках или в жидких ростовых средах. Однако в случае ТЕС-101 схожие с ТЕС-104 варианты колоний продолжают образовываться с низкой частотой (1%). Тесты споруляции показали, что ТЕС-104 производит наивысшие титры спор (107 мл). Однако во времязависимых экспериментах с перемешиваемыми колбами только ТЕС-101 вырабатывает целлюлазу на уровне, схожем или более высоком, чем уровни родительского ТЕС-1 А (фиг. 2). Более того, в 10-л ферментере периодическая ферментация ТЕС-101 вместе с ТЕС-1 А дает 5FPU2%/мл после 96 ч ферментации, тогда как ТЕС-104 дает меньше целлюлазы (2,3 FPU2%/мл). Следовательно, ТЕС-101 показал лучшие общие характеристики и был выбран для дальнейшего улучшения штамма. ТЕС-101 (также обозначаемый как FBG 101) депонировали в CENTRAAL BUREAU VOORSCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Утрехт, Нидерланды, 30 июля 2010 г., с регистрационным номером CBS 127450. Если где-либо в данном документе дается ссылка на"штамм Talaromyces дикого типа", или "штамм дикого типа", или "дикий тип", то подразумевается и/или используется ТЕС-101. Пример 2 В этом примере описано выделение мутантов Т. emersonii с улучшенной выработкой целлюлаз посредством высокопроизводительного скрининга случайных мутантов. Обработанные NTG споры ТЕС-101 рассевали из замороженных стоков на агаровую среду для Talaromyces и выращивали в течение 4 дней при 40C. Примерно 6000 мутантов переносили в 96-луночные микротитрационные планшеты (англ. microtiter plates, MTP), содержащие агаровую среду для Talaromyces (20 мкл/лунка). Эти МТР, названные "мастер-планшетами", инкубировали при 40C в течение 5 дней. Несколько лунок оставили пустыми, чтобы они позже содержали немутированный родитель ТЕС-101 и фермент "Filtrase NL". Мастер-планшеты пересевали репликой с помощью автоматического устройства для инокуляции в 24-луночные МТР, содержащие среду 4 для Talaromyces (3 мл/лунку). Для того чтобы осуществить это, в лунки мастер-планшетов добавляли физиологические соли (150 мкл/лунку) и суспензию спор переносили в 24-луночные МТР. Кроме того, по этому протоколу инокулировали новый 96-луночный мастерпланшет (200 мкл/лунку агаровой среды для Talaromyces). 24-Луночные планшеты инкубировали в шейкере при 46C и 80% влажности в течение 96 ч. Культуры откручивали для удаления биомассы и один мл надосадочной жидкости переносили во множество флаконов для проверки целлюлазной активности с помощью анализа с пшеничной соломой. Мутанты, целлюлазная активность которых в ростовой среде была на 20-30% больше активности контрольной надосадочной жидкости из ТЕС-101, отбирали для дальнейших раундов скрининга. Данные раунды скрининга является более строгими, чем первый, что позволяет избавиться от ложноположительных результатов. Для каждого отобранного мутанта первичного скрининга готовили по два скошенных агара для каждого штамма для вторичного скрининга в культурах в перемешиваемых колбах. Споры из этих культур использовали для инокуляции культур в дуплицированные перемешиваемые колбы, содержащие среду 2 для Talaromyces. В некоторых сериях второй скошенных агар использовали вначале для инокуляции среды 1 для Talaromyces (в перемешиваемых колбах); после роста в течение 24 ч 1 мл из этой культуры инокулировали в продуцирующую среду в перемешиваемой колбе. Целлюлазную активность (анализ на пшеничной соломе при pH 4,5, 20 ч при 65C, неразведенные образцы) всех мутантов, проверенных в перемешиваемых колбах, представлена на фиг. 3. Среднее значение целлюлазных активностей контрольного родительского штамма ТЕС-101 составило 62,64,9WSU. Один конкретный мутант (DoE 600) имел значимое улучшение 63%. В четвертичном скрининге тридцать наилучших мутантных штаммов из вторичных тестов снова проверяли в перемешиваемой колбе. Процедура была похожа на способ, используемый в вторичном скрининге. Штаммы отдельно проверяли инокуляцией спор со скошенного агара непосредственно в продуцирующую среду. На фиг. 4 дан обзор продуцирования всех испытанных повторно штаммов. Первый набор в перемешиваемых колбах DoE523, 529, 531, 541, 552, 553, 558, 618 и спонтанный мутант ТЕС-101, которые продуцируют уровни целлюлаз выше, чем нормальные, повторно тестировали с использованием неразведенной надосадочной жидкости в анализе с пшеничной соломой; все другие проверяли на разведенных образцах для предотвращения ингибирования глюкозой выработки целлюлазы. В целом, большинство штаммов имели повышенную целлюлазную активность по сравнению с родительским штаммом. Интересно, что штамм DoE 600 продемонстрировал наибольшее повышение, превышающее 100%. Готовили маточные банки клеток всех 30 отобранных мутантов ТЕС-101 из четвертичного скрининга. Идентификаторами штаммов являются ТЕС-107-122, ТЕС-127-130 и ТЕС-135-144. Эксперименты определения зависимости от дозы на пшеничной соломе подтвердили, что ТЕС-142(DoE600) вырабатывает едва ли не в два раз больше целлюлазной активности, чем контрольный родительский штамм ТЕС-101 (фиг. 5).