Улучшенные штаммы e.coli для продуцирования плазмидной днк

010864 Заявление относительно федеральной поддержки исследования или разработки Данное изобретение разработано частично при государственной поддержке по гранту 1 R43GM072141-01, выданному Национальным Институтом Здоровья (National Institutes of Health). Правительство обладает определенными правами на это изобретение. Для данной заявки на изобретение заявлен приоритет предварительной заявки на патент US60/ 602074, поданной 16 августа 2004 г. Область изобретения Настоящее изобретение относится к продуцированию ковалентно замкнутых кольцевых (ссс) рекомбинантных молекул ДНК, таких как плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы(ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды, и более конкретно представляет собой способ очистки указанных молекул ДНК от примесей молекул нуклеиновых кислот, ассоциированных с ферментацией. Предшествующий уровень техники Настоящее изобретение относится к продуцированию ковалентно замкнутых кольцевых (ссс) рекомбинантных молекул ДНК. Такие молекулы полезны в биотехнологии, трансгенных организмах, генной терапии, терапевтической вакцинации, сельскохозяйственных и ДНК-вакцинах. В изобретении было проведено исследование предшествующего уровня техники. Плазмиды Е.coli в течение длительного времени представляли собой единственный наиболее важный источник рекомбинантных молекул ДНК, используемых исследователями и в промышленности. В настоящее время плазмидная ДНК становится все более важной в качестве следующего поколения биотехнологических продуктов (генных лекарственных средств и ДНК-вакцин), продвигающихся в клинические испытания и в конечном счете на фармацевтический рынок. Плазмидные ДНК-вакцины могут найти применение в качестве профилактических вакцин при вирусных, бактериальных или паразитических заболеваниях; иммунизирующих агентов для получения гипериммунных глобулиновых продуктов; терапевтических вакцин для инфекционных заболеваний; или в качестве противораковых вакцин. Основные способы получения плазмид (путем бактериальной ферментации) и их очистки методом щелочного лизиса хорошо известны (Birnboim, НС, Doly J. 1979 Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). Сначала ферментированную бактериальную пасту ресуспендируют и лизируют (используя комбинацию гидроксида натрия и додецилсульфата натрия), после чего раствор нейтрализуют путем добавления кислой соли (например ацетата калия),осаждающей бактериальную ДНК и большую часть клеточного дебриса. Основная масса суперспиральной плазмидной ДНК остается в растворе вместе с примесями бактериальной РНК, ДНК и белков, а также эндотоксином E. coli (липополисахарид или ЛПС). Альтернативно, лизис с использованием обработки теплом/лизоцимом в присутствии неионного детергента используют для высвобождения интактной плазмидной ДНК. Клетки также можно лизировать,и нуклеиновые кислоты высвобождать, используя воздействие сверхкритических флюидов при высоком давлении или путем обработки органическими растворителями или детергентами. Эти способы лизиса высвобождают клеточные примеси, для удаления которых затем требуются стадии очистки. Кроме того, используемые в настоящее время при получении плазмидной ДНК методы щелочного лизиса или лизиса клеток путем тепловой денатурации являются дорогостоящими, неэффективными и создают значительные токсичные отходы. Альтернативные рентабельные способы синтеза еще не разработаны. Растворимую фракцию затем отделяют путем фильтрования и подвергают ряду стадий очистки, которые могут включать: расщепление РНКазой; хроматографию (ионообменную гель-фильтрацию, гидроксиапатитную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, обращенно-фазовую хроматографию, ВЭЖХ и т.д.); диафильтрацию; экстракцию органическими растворителями, избирательное осаждение и т.д. Описанные в уровне техники примеры последующих методов очистки плазмид после лизиса снижают уровни геномной ДНК до 0,01-1% или менее. Следующие способы, описанные в уровне техники,не являются исчерпывающим перечнем и включают стадии определенного уменьшения геномной ДНК: 0,01% геномной ДНК с использованием гидроксиапатита (Wils P. and Ollivier M. 2004 патентUS6730781), 0,05% геномной ДНК с использованием хроматографии гидрофобных взаимодействий (Nochumson S., Durland R., Yu-Speight A., Welp J., Wu K., and Hayes R. 2001 заявка на патент США 2001/0034435; Diogo M.M., Querioz J.A., Monteiro, G.A., Martins S.A.M., Ferreira, G.N.M. and PrazeresD.M.F. 2000 Biotech Bioeng 68:576-583), 1% геномной ДНК с использованием осаждения сульфатом аммония (McNeilly DS. 2001 патент США 6214586), 0,2% геномной ДНК с использованием гельфильтрационной хроматографии (Lemmens R., Olsson U., Nyhammar T., and Stadler J. 2003. J Chromatography В 784:291-300), менее 1% геномной ДНК с использованием ультрафильтрации в тангенциальном потоке (Bussey L.B., Adamson R., and Atchley A. 2000, патент US6011148), менее 1% геномной ДНК с использованием дифференциального осаждения полиэтиленгликолем (Marquet M., Horn N., Meek J. andLRA (липид-извлекающего агента) на криолите (Lander RJ, Winters MA, and Meacle FJ. 2002 заявка на патент US2002/0151048), 0,1% геномной ДНК с использованием хроматографии тройной спирали(Crouzet J., Scherman D., and Wils P. 2001 патент US6287762). Введение плазмидной ДНК людям требует некоторых специальных рассмотрений и разрешений,принятых регулирующим органом FDA (Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств), включая пункты рассмотрения плазмидных ДНК-вакцин для профилактики инфекционных заболеваний (Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation andGuidance for industry: Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy). Эти документы указывают на беспокойство в отношении различных примесей и предлагают тесты, которые могут быть использованы для оценки уровней каждой примеси. Тем не менее, эти руководящие документы умалчивают максимальные приемлемые уровни примесей РНК, ДНК или белков, поскольку они не известны. Тем не менее,допустимое предельное значение для геномной ДНК будет составлять 0,00001%, если отнести 100 пг геномной ДНК/дозу, в настоящее время требующееся в соответствии с регламентирующим руководствомFDA для лекарственных средств на основе рекомбинантных белков (FDA. 1993 Points to consider in thecharacterization of cell lines used to produce biologies) к дозе ДНК-вакцины 1 мг. Эти уровни являются на несколько логарифмических порядков более низкими по сравнению со стандартными крупномасштабными препаратами плазмидной ДНК (0,01-5% геномной ДНК) и не могут быть достигнуты с использованием существующих в настоящее время рентабельных способов получения. Необходимы новые способы для того, чтобы получения дальнейшего уменьшения содержания геномной ДНК. Нуклеиновые кислоты могут быть удалены на ранней стадии процесса (например путем расщепления нуклеазами) или позже (например путем хроматографического разделения). Сравнительно общепринятой до недавнего времени практикой являлось применение бычьей панкреатической рибонуклеазы(РНКаза А) в лизирующем буфере для разрушения РНК. Хотя этот подход был достаточно эффективным в уменьшении количества и размера РНК, он также приводит к введению бычьей РНКазы, что является нежелательным с точки зрения регламентирующего руководства, поскольку она может быть загрязнена прионовыми агентами, а именно агентом бычьего губчатого энцефалита (BSE). Действительно, существует все возрастающее желание проводить ферментации и очистки бактериальных продуктов (предназначенных для применения людям или животным) полностью в условиях отсутствия продуктов животного происхождения (APF). В настоящее время авторам изобретения не известны высокоэффективные имеющиеся в продаже ферменты для специфического разрушения геномной ДНК Е.coli, в то же время оставляющие интактной суперспиральную плазмиду (нуклеаза, "безопасная для плазмиды"). Однако иногда в частично очищенные препараты плазмидной ДНК добавляют нуклеазы, такие как АТФ-зависимые Rec BCD экзонуклеазыUS6242220; Isfort R.J. 1992 BioTechniques 12: 798-804). В близком подходе неочищенный препарат плазмиды подвергают тепловой обработке для денатурации всей некольцевой ДНК до одноцепочечной формы, затем добавляют одноцепочечные экзонуклеазы, такие как SI нуклеаза, нуклеаза золотистой фасоли,Р 1 нуклеаза, Т 7 экзонуклеаза, Bal31 нуклеаза, экзонуклеаза I, экзонуклеаза III, экзонуклеаза VII или экзонуклеаза лямбда (Hyman E.D. 1992 международная заявка на патент 92/13963). Эти ДНКазные ферменты нельзя добавлять непосредственно к лизируемой смеси (как РНКазу), поскольку они, как правило,менее долговечны по сравнению с РНКазой, и будут инактивироваться в среде со щелочью/SDS (додецилсульфатом натрия). Таким образом, эти подходы являются дорогостоящими и непрактичными для получения плазмиды в промышленном масштабе. Для преодоления помех, возникающих при добавлении очищенных нуклеаз к препаратам плазмидной ДНК, разработаны альтернативные подходы, в которых для удаления геномной ДНК используют эндогенные нуклеазы. Более ранние способы вызывали общее повреждение ДНК (например ультрафиолетовое излучение в восстановлении дефектных хозяев (Sancar A., Hack A.M. and Rupp W.D. 1979 J Bacteriol. 137: 692-693), или ионизирующее излучение (MacPhee D.G., Radford A.J. and Reanney D.C. 1988 патент US4755464), где плазмиды выживают вследствие меньшей вероятности повреждения (т.е. более мелкая мишень по сравнению с геномом) по сравнению с хромосомой; деградация, опосредованная эндогенными нуклеазами (например RecBCD), происходящее в результате появления сайтов нарушения ДНК в геноме. Сообщалось о более специфической системе, в которой для расщепления геномной ДНК используются эндонуклеазы рестрикции, где рестриктирующую эндонуклеазную активность контролируют с помощью термочувствительной метилазы. Сдвиг до температуры рестрикции инактивирует метилазу, что приводит к расщеплению геномной ДНК и последующему разрушению эндогенной экзонуклеазой (Hanak J., Alexis J. and Ward J.M. 2001 международная заявка на патент WO 01/29209). Однако уровень сокращения генома является умеренным при использовании этих способов, и плазмиды должны быть сконструированы таким образом, чтобы в них отсутствовали соответствующие сайты рестрикции, в результате этот способ не имеет всеобщего применения. Были разработаны специализированные штаммы Е.coli, которые экспрессируют рекомбинантные нуклеазы в периплазматическое пространство для того, чтобы не повреждать экспрессию генов Е.coli во время клеточного роста. В одном из случаев бычью панкреатическую РНКазу направляют в периплазма-2 010864 тическое пространство с помощью сигнала секреции. При лизисе РНКазы смешиваются с РНК, разрушая ее (Cooke G.D., Cranenburgh R.M., Hanak J.A.J., Dunnill P., Thatcher D.R., Ward J.M. 2001 A J. Biotechnology 85: 297-304). Эту систему используют для уменьшения уровней РНК в процессе щелочного лизиса. Посредством этого способа не достигают уменьшения уровней геномной ДНК. Разработаны похожие системы, сверхэкспрессирующие периплазматическую нуклеазу стафилококков (Cooke G.D., Cranenburgh R.M., Hanak J.A.J., Ward J.M. 2003 J. Biotechnology 101: 229-239; Huisman G.W., Luo L.Z. and Peoples OP. 2004 заявка на патент США 2004/0014197; Boynton Z.L., Koon J.L., Brennan E.M., Clouart J.D.,Horowitz D.M., Gerngross T.U., and Huisman G.W. 1999 Pseudomonas putida. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1524-1529) или эндогенную периплазматическую нуклеазу EndA E.coli (Leung WS, and Swartz JR. 2001US6258560) для уменьшения нуклеиновыми кислотами загрязнения препарата белка или других биоматериалов. Эти системы не безопасны для плазмид и для их активности требуются мягкие способы белковой очистки и буферы. Индукция безопасных для плазмид ДНКаз в ферментативной культуре теоретически обсуждается Kelly 2003 (Kelly W.J. 2003 Biotechnol Appl Biochem 37 219-223), но методология или нуклеаза конкретно не определены. Автолитические клеточные линии разработаны для облегчения продуцирования белка (Leung andSwartz, выше, 2001) В этой клеточной линии лизоцим экспрессируется клеткой в цитоплазме и высвобождается в периплазму в нужный момент времени путем ко-экспрессии холина (пептид или белок, заполняющий мембрану), который создает канал, обеспечивающий возможность вытекания лизоцима и других цитоплазматических белков из цитоплазмы в периплазму. Примеры комбинаций лизоцим/холин, которые могут быть использованы, известны в уровне техники. Некоторые комбинации лизоцим/холин обсуждаются в Young 1992 (Young R 1992 Microbiol. Molec. Reviews, 56: 430-481) и включены в данное описание посредством ссылки. Лизирующие белки фага лямбда используют в автолитических клеточных линиях для продуцирования белков (Leung and Swartz, выше, 2001) Автолитические условия, в отличие от щелочного или теплового лизиса, не вызывают избирательной денатурации геномной ДНК. Продукт лизиса является очень вязким, что создает проблемы при обработке. Для продуцирования белка неспецифические нуклеазы добавляют или периплазматически экспрессируют в штамме (например endA нуклеаза Leung and Swartz, выше, 2001, нуклеаза Staphylococcus,Cooke et al., выше, 2003, Huisman et al, выше, 2005, Boynton et al., выше, 1999) для уменьшения вязкости после клеточного лизиса. Такие системы не могут быть использованы для получения плазмид. Способы очистки, используемые при получении плазмидной ДНК, являются дорогостоящими, неэффективными и создают значительные токсичные отходы. Остаточные уровни геномной ДНК значительно превосходят приемлемые в настоящее время стандарты для коммерческих продуктов. Эти ограничения накладывают издержки в виде увеличения стоимости и уменьшения чистоты на коммерческое использование способов получения плазмидной ДНК. Даже в свете предшествующего уровня техники остается необходимость в рентабельном способе уменьшения содержания геномной ДНК. Кроме того, необходим упрощенный, менее дорогостоящий способ очистки, уменьшающий применение дорогих или токсичных химических веществ. Описание изобретения Изобретение представляет собой способ продуцирования ДНК, при котором в бактериальный геном встраивают один или более чем один ген, кодирующий безопасную(ые) для плазмиды нуклеазу(ы), и которые экспрессируются в виде белка, секретируемого в периплазматическое пространство. Когда плазмиду или ДНК-репликон выращивают в клетках, нуклеазу повторно вводят в цитоплазму, уменьшая уровень нуклеиновых кислот, отличающихся от нужного репликона, что облегчает его очистку. В одном из предпочтительных воплощений нуклеаза представляет собой химерную нуклеазу. В еще одном предпочтительном воплощении химерная нуклеаза представляет собой ДНКазу, с по меньшей мере частью фермента РНКазы в виде партнера слияния. В других предпочтительных воплощениях используют химерный фермент, в котором D15 экзонуклеаза фага Т 5 слита с РНКазой А или РНКазой S. В предпочтительной форме этого способа нуклеазу(ы) направляют в периплазматическое пространство с помощью сигнального пептида или эквивалентного способа, и клетки автолизируются таким образом, что бактериальная геномная ДНК и/или РНК расщепляется, а ДНК введенного репликона не расщепляется, и таким образом облегчается очистка введенного репликона. В других предпочтительных воплощениях автолиза достигают путем использования фаговых лизирующих белков, экспрессирующихся в клетках, или путем применения антибиотиков. В изобретение включены штаммы бактерий, имеющих по меньшей мере одну безопасную для плазмиды нуклеазу, с партнером слияния или без него, и плазмиду, очистка которой облегчается с помощью безопасной для плазмиды нуклеазы. Краткое изложение сущности изобретения Цель и/или задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить композиции и способ очистки плазмиды. Еще одна задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способ уменьшения примесей нуклеиновых кислот в очищенной плазмидной ДНК. Еще одна задача изобретения заключается в уменьшении стоимости продукции за счет очистки плазмидной ДНК. Еще одна задача и/или цель изобретения заключается в том, чтобы уменьшить токсичные отходы при очистке плазмидной ДНК. Еще одно изобретение заключается в улучшенных способах продуцирования плазмиды, которые,-3 010864 по сравнению со способами, определенными в области техники, улучшены путем: улучшения качества плазмиды за счет уменьшения уровней плазмиды с одноцепочечными разрывами (открытая кольцевая плазмида) или линеаризованных вариантов плазмиды; упрощенного продуцирования с использованием надежных стадий получения; упрощенного продуцирования за счет исключения многочисленных стадий продуцирования; уменьшения стоимости за счет исключения многочисленных стадий продуцирования; улучшения качества плазмиды путем уменьшения количества примесей нуклеиновых кислот после очистки плазмиды благодаря удалению основных примесей до введения в дальнейшую обработку; улучшения соответствия регламентирующему руководству путем удаления геномной ДНК из конечных препаратов плазмиды; улучшения соответствия регламентирующему руководству за счет исключения веществ животного происхождения, таких как рибонуклеаза А; и улучшения соответствия регламентирующему руководству за счет удаления токсичных отходов. Дополнительные задачи и преимущества изобретения станут понятными при рассмотрении графических материалов и следующего описания. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 иллюстрируется разрушение денатурированной плазмиды и геномной ДНК Е.coli экзонуклеазой Т 5. На фиг. 2 изображен вектор pVEXSaplstuffer. На фиг. 3 показан способ направленной амплификации и клонирования последовательностей кДНК в векторах pVEX. На фиг. 4 показан вектор pVEXSaplOmpAStuffer. На фиг. 5 показан вектор pVEXBSaplOmpAStuffer. На фиг. 6 показан вектор pVEXBOmpARNase. На фиг. 7 показан вектор pVEXBOmpAT5RNase. На фиг. 8 показано удаление геномной ДНК с помощью экзонуклеазы Т 5 РНКазы. Представлена фотография геля с препаратами плазмидной ДНК с применением и без применения гена(ов) предпочтительной Т 5 экзонуклеазы и РНКазы. На фиг. 9 показано применение ассоциации S-пептида и S-белка для получения химеры РНКаза ST5. На фиг. 10 показан гидролиз нуклеиновой кислоты химерной нуклеазой. На фиг. 11 показано уменьшение содержания РНК с помощью конструкций S-пептид-Т 5 + S-белок и Т 5 РНКаза. На фиг. 12 показано уменьшение РНК и геномной ДНК с помощью конструкции S-пептид-Т 5 + Sбелок. На фиг. 13 показано высвобождение цитоплазматического содержимого Е.coli через пору, образованную посредством PhiX174 ген Е. На фиг. 14 показан нативный "лишний" вектор pACYCB. На фиг. 15 показан вектор pACYCBgeneE. На фиг. 16 показано высвобождение плазмиды, опосредованное лизирующим белком гена Е. На фиг. 17 показано удаление геномной ДНК с помощью нуклеазы после автолиза, индуцированного антибиотиком. На фиг. 18 показано применение хозяев-продуцентов, экспрессирующих периплазматическую нуклеазу, в получении плазмиды. На фиг. 19 показано применение хозяев-продуцентов, экспрессирующих периплазматическую нуклеазу, в автолитическом способе получения плазмиды. Подробное описание изобретения Обращаясь к графическим материалам, на фиг. 1 показано расщепление денатурированной плазмиды и геномной ДНК Е. coli c помощью экзонуклеазы Т 5 в крупномасштабном получении плазмиды: 1) маркер молекулярной массы ДНК [наибольшая полоса соответствует 12 килобаз], 2) образец плазмиды в в способе крупномасштабного получения плазмиды, 3) тот же образец, контроль Т 5 экзонуклеазной реакции без добавления экзонуклеазы Т 5, 4) тот же образец, расщепленный с помощью 2% мас./мас., экзонуклеазы Т 5. Нижняя полоса соответствует суперспиральной ДНК, средняя полоса соответствует смеси суперспирального димера и мономера с одноцепочечными разрывами, верхняя полоса соответствует смеси димера с одноцепочечными разрывами и геномной ДНК. Геномная ДНК и плазмида с одноцепочечными разрывами количественно удалены из средней и верхней полосы. Аналогичные результаты наблюдаются при использовании 1% мас./мас., экзонуклеазы Т 5. На фиг. 2 показан вектор pVEXSaplStuffer. На фиг. 3 показан способ направленной амплификации и клонирования последовательностей кДНК в векторах pVEX: А) плазмида, содержащая две уникальные адресные метки (tags), получаемые путем расщепления ферментами класса IIS, располагающиеся между разрезами, и Б) типичный праймер, содержащий сигнал распознавания фермента класса IIS (Sapl), по меньшей мере один промежуточный нуклеотид и перекрывающуюся область с уникальной непалиндромной последовательностью (GGG, в этом примере адресная метка)-4 010864 На фиг. 4 показан вектор pVEXSaplOmpAStuffer На фиг. 5 показан вектор pVEXBSaplOmpASruffer На фиг. 6 показан вектор pVEXBOmpARNase На фиг. 7 показан вектор pVEXBOmpAT5RNase На фиг. 8 показано удаление геномной ДНК с помощью Т 5 РНКазы. Представлена фотография геля препаратов плазмидной ДНК с геном(ами) предпочтительной Т 5 экзонуклеазы и РНКазы и без них. Дорожки 1, 5 и 9 получены с Т 5 РНКазой, дорожки 3, 7 и 11 получены без Т 5 РНКазы, дорожки 2, 6 и 10 получены с РНКазой, а дорожки 4, 8 и 12 получены без РНКазы. Образцы 1-8 представляют собой нуклеиновые кислоты Qiagen, полученные после щелочного лизиса. Образцы 9-12 представляют собой быстро экстрагированную тотальную ДНК. Образцы 5-12 получены из клеток, хранившихся при 4 С, тогда как образцы 1-4 получены из клеток, хранившихся при -20 С. М) означает маркер молекулярной массы ДНК. Наибольшая полоса соответствует 12 килобаз. В направлении сверху полоса с наибольшей молекулярной массой соответствует геномной ДНК (гДНК), тогда как следующая полоса соответствует суперспиральной димерной плазмидной ДНК [pDNA(2)], следующая полоса соответствует суперспиральной мономерной плазмидной ДНК (pDNA) и наиболее быстро двигающаяся полоса соответствует РНК (РНК). Стрелка на дорожке 1 указывает на уменьшение содержания геномной ДНК. На фиг. 9 проиллюстрировано применение ассоциации S-пептида и S-белка с получением химеры РНКазаS-Т 5. На фиг. 10 показан гидролиз нуклеиновой кислоты химерной нуклеазой. На фиг. 11 продемонстрировано уменьшение содержания РНК с помощью конструкций S-пептидТ 5+S-белок и Т 5 РНКаза. Щелочные лизаты готовили из индуцированных культур клеток DH5, содержащих указанные плазмиды, нуклеиновые кислоты осаждали этанолом и разделяли на 1%-ном агарозном геле. РНК (основная полоса) обнаруживали путем последующего окрашивания SYBR Green II (MolecularProbes): Дорожка 1 = pVEXBOmpAS-пептидТ 5 + pACYCBOmpASБелок, Дорожка 2 = pXEXBOmpAT5Sпептид + pACYCBОmрASБелок, Дорожка 3 = pVEXBPhoARNase, Дорожка 4 = pVEXBOmpAT5RNase,Дорожка 5 = pVEXBOmpAT5 и Дорожка 6= pVEXBPhoA(сдвиг рамки считывания)RNAse (отрицательный контроль). На фиг. 12 продемонстрировано уменьшение содержания РНК и геномной ДНК с использованием конструкции S-пептид-Т 5+ S-белок. Щелочные лизаты готовили из индуцированных (дорожки 1-4 и 6) и неиндуцированных (дорожка 5) культур клеток DH5, содержащих указанные плазмиды, нуклеиновые кислоты осаждали этанолом и разделяли на 1%-ном агарозном геле. РНК и ДНК обнаруживали путем последующего окрашивания SYBR Green II: Дорожка 1 = pYEXBOmpAS-пептидТ 5, Дорожка 2 =pVEXBPhoASпептид-T5, Дорожка 5 = pVEXBPhoASпептид-Т 5 + pACYCBOmpASбелок (неиндуцированный) и Дорожка 6 = pVEXBPhoASпептид-Т 5 + pACYCBOmрАSбелок (индуцированный). Стрелки указывают на уменьшение полосы РНК (внизу) и полосы геномной ДНК (сверху) на дорожке 2. На фиг. 13 показано высвобождение цитоплазматического содержимого Е.coli через пору, образованную посредством гена Е PhiX174. На фиг. 14 показан нативный "лишний"вектор pACYCB. На фиг. 15 показан вектор pACYCBgeneE. На фиг. 16 показано высвобождение плазмиды, опосредованное лизирующим белком гена Е. Клетки, культивируемые с pACYCBgeneE + pDNAVACCUltra-EGFP (зеленый флуоресцирующий белок) из 1 не индуцированы, из 2 - индуцированы в течение 40 мин арабинозой: А = Тотальные нуклеиновые кислоты (осадок), В = Тотальные нуклеиновые кислоты (осадок), оставшиеся после экстракции буфером Pl,С = нуклеиновые кислоты, экстрагированные Pl (50 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, рН 8), D = нуклеиновые кислоты, экстрагированные LB (средой Луриа-Бертани); Е = нуклеиновые кислоты, экстрагированные PBS ( в физиологическом растворе, забуференном фосфатом); F = нуклеиновые кислоты, экстрагированные 10 мМ Tris рН 8,5; G = нуклеиновые кислоты, экстрагированные 50 мМ фосфатом натрия, 0,3 М NaCl рН 7; и Н = нуклеиновые кислоты, экстрагированные 10 мМ MgCl2.M) означает маркер молекулярной массы ДНК. Наибольшая полоса составляет 12 килобаз. В направлении сверху полоса с наибольшей молекулярной массой соответствует геномной ДНК (гДНК), тогда как следующая полоса соответствует суперспиральной димерной плазмидной ДНК [pDNA(2)] и мономерной плазмиде с одноцепочечными разрывами, следующая полоса соответствует суперспиральной мономерной плазмидной ДНК (pDNA; стрелка) и наиболее быстро двигающиеся полосы соответствуют РНК(РНК). На фиг. 17 показано удаление геномной ДНК после автолиза, индуцированного антибиотиком: Дорожка 1 = маркер молекулярной массы ДНК; Дорожка 2 = Тотальная ДНК после автолиза (pACYCBT5RNase+gWizGFP штамм); Дорожка 3 = Тотальная ДНК после автолиза (pACYCBNativestuffer +gWizGFP штамм) и Дорожка 4 = Образец с дорожки 2 после инкубации в течение 30 мин при 37 С. Стрелка указывает на удаление полосы геномной ДНК в штамме с T5RNase. На фиг. 18 изображено применение хозяев-продуцентов, экспрессирующих периплазматическую-5 010864 нуклеазу, в получении плазмиды. В формате 1 используется предварительная обработка перед клеточным лизисом для удаления геномной ДНК, плазмиды с одноцепочечными разрывами или линейной плазмиды, и/или РНК, в то время как в формате 2 используется последующая обработка (или одновременная обработка) после клеточного лизиса для удаления геномной ДНК, плазмиды с одноцепочечными разрывами или линейной плазмиды, и/или РНК. На фиг. 19 показано применение хозяев-продуцентов, экспрессирующих периплазматическую нуклеазу, в автолитическом способе продуцирования плазмиды. Определения Автолиз: способы лизиса, заставляющие клетки претерпевать автолиз, такой как клеточный лизис,индуцированный -лактамом, образование клеточных "теней", индуцированное лизирующим белком фага phiX174, клеточный лизис, индуцированный фагом Т 4 или фагом лямбда путем коэкспрессии фагового лизоцима/холина и т.д; ссс: ковалентно замкнутая кольцевая; химерный фермент: слияние между ферментом и вторым белком, например слияние экзонуклеазыD15 фага Т 5 и полноразмерной бычьей РНКазы А или ее фрагментов; ДНК-репликон: плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды; полоса "тени": денатурированная ссс ДНК; пДНК: плазмидная ДНК; фаговые лизирующие белки: белки, заставляющие клетку претерпевать автолиз или образование клеточных "теней", например образование клеточных "теней", индуцированное лизирующим белком фага phiX174, или клеточный лизис, индуцированный коэкспрессией лизоцима/холина фага Т 4 или фага лямбда; плазмида: плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды; нуклеаза, безопасная для плазмиды: экзонуклеаза, разрушающая различные формы ДНК, кроме ковалентно замкнутой кольцевой (ссс) ДНК, включая плазмидную ДНК; РНКаза: рибонуклеаза; РНКаза А: бычья панкреатическая рибонуклеаза А; Т 5 экзонуклеаза: экзонуклеаза D15 бактериофага Т 5. Изобретение относится к способам уменьшения содержания геномной ДНК при очистке плазмидной ДНК (пДНК) с использованием грамотрицательной бактерии Е.coli в качестве хозяина-продуцента с использованием механического ферментационного сосуда. Основная проблема технологии очистки заключается в отделении пДНК от геномной ДНК Е.coli. Изобретение представляет собой способ уменьшения содержания геномной ДНК при выделении ковалентно замкнутой кольцевой (ссс) ДНК. Разработан рентабельный подход, в котором при получении плазмиды применяют нуклеазы. Нуклеаза, "безопасная для плазмиды", секретируется в периплазматическое пространство, таким образом защищая клетку при выращивании, и возникновение контакта между нуклеазой и геномной ДНК контролируется при сборе или во время клеточного лизиса. Предпочтительные воплощения продуцирования нуклеазы В одном из предпочтительных воплощений изобретения (фиг. 10) один или более чем один специализированный "безопасный для плазмиды" гидролитический фермент (такой как экзонуклеаза D15 фага Т 5, экзонуклеаза RecBCD, другие АТФ-зависимые экзонуклеазы, экзонуклеаза III, экзонуклеаза VII или химерные гибридные ферменты) секретируются в периплазматическое пространство с помощью сигнального пептида или его эквивалента, после чего чего фермент(ы) остает(ют)ся секвестрированным(и) до завершения клеточного роста и индуцирования/продуцирования пДНК. После контролируемого повторного контакта фермента с цитоплазматическим содержимым (вследствие нарушения мембраны или контролируемого повторного проникновения в цитоплазму) фермент расщепляет или гидролизует нежелательные бактериальные вещества, такие как нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), белки, углеводороды,липополисахариды и т.д., что приводит, по существу, к очищенной плазмидной ДНК. Могут быть использованы нативные нуклеазы. Может быть использована любая безопасная для плазмиды нуклеаза, такие как экзонуклеазы RecBC (Экзонуклеаза V) и RecBCD, относящиеся к грамположительным экзонуклеазам RexAB или AddAB, экзонуклеазы архей (например Geobacillus kaustophilusAddAB), другие АТФ-зависимые экзонуклеазы, Экзонуклеаза III, Экзонуклеаза VII. Это неисчерпывающий перечень, и рассматриваются нуклеазы из Е.coli или других бактериального, архейного или эукариотического источника. Предпочтительными являются нуклеазы, такие как экзонуклеаза D15 бактериофага Т 5, которая удаляет "полосы "теней". В случае безопасных для плазмиды термофильных нуклеаз может быть необязательным секретирование нуклеазы в периплазму, если активность фермента достаточно уменьшена при требующейся температуре роста. Это позволяет применять дополнительные методы редукции генома, такие как тепловая обработка (42-95 С) в процессе ферментации.-6 010864 Изобретение охватывает применение экзонуклеаз, "безопасных для плазмид", которые разрушают геномную и предпочтительно денатурированную и плазмидную ДНК с одноцепочечными разрывами, не разрушая суперспиральную плазмидную ДНК. Предпочтительно, экзонуклеаза D15 бактериофага Т 5 (экзонуклеаза Т 5) представляет собой кандидат ДНКазы для применения при обработке плазмиды. Экзонуклеаза Т 5 не расщепляет суперспиральную плазмиду, но способна расщеплять не только линейную одно-и двухцепочечную ДНК (Sayers J.R. and Eckstein F. 1990 J. Biol. Chem. 265: 18311- 18317), но также ДНК с петлями денатурации, такую как "побочная полоса или полоса "теней" ДНК, которая часто сохраняет биологическую активность и втягивается при расщеплении ферментами рестрикции (Sayers J.R.,Evans D., and Thomson J.B. 1996 Anal. Biochem. 241: 186-189). Авторы изобретения продемонстрировали,что очищенная экзонуклеаза Т 5 может быть использована для специфического удаления всех несуперспиральных видов ДНК, присутствующих в образцах после крупномасштабного (1 г) получения плазмиды (фиг. 1). Также рассмотрены химерные нуклеазы. Это потенциально может быть осуществлено путем ассоциации фермента нуклеазы с партнером слияния, который сам устойчив к инактивации или удалению при щелочном лизисе или других рассматриваемых крупномасштабных методах получения плазмиды. Партнером слияния может быть любой белок или пептид, который придает желаемое свойство стабилизации или локализации. В предпочтительном воплощении используют химерную нуклеазу, в которой экзонуклеаза D15 Т 5, "безопасная для плазмиды" нуклеаза, слита с партнером слияния. Например, бычья панкреатическая РНКаза А устойчива к инактивации или удалению во время процедуры получения плазмиды путем жесткого щелочного лизиса. Кроме того, РНКазу А, экспрессируемую в Е.coli, выделяют в активной форме в подвергнутых центрифугированию супернатантах после щелочного лизиса. Альтернативно, также рассматривается слияние с тиоредоксином (Lu Z., DiBlaio-Smith E.A., Grant K.L.,Warne N.W., LaVallie E.R., Collins-Racie L.A., Follettie M.T., Williamson M.J., and McCoy J.M. 1996 J. Biol.Chem. 271: 5059-5065), С-концевым солюбилизирующим доменом альфа-синуклеина (Kim JS. 2003, заявка на патент США 2003/0125522; Park S.M., Ann K.J., Jung H.Y., Park J.H. and Kim J. 2004 Protein Eng.Des. Sel. 17:251-60), термостабильным Ftr из Methanopyrus kandleri (de Marco A., Casatta E., Savaresi S.,Geerlof A. 2004 J. Biotechnol. 107: 125-33) или другими белками, увеличивающими стабильность слитых партнеров (Zhou P., Alexey L. and Wagner G. 2003 заявка на патент США 2003/0092885; Sanders МС. 2002, заявка на патент США 2002/0142384). Наиболее предпочтительно было бы желательно комбинировать ферменты с РНКазной и ДНКазной активностями таким образом, который совместим со способами обработки ДНК. Одним из путей осуществления этого является разработка штаммов бактерий, в которых ко-экспрессируются гибридные ферменты, содержащие по меньшей мере вещества с РНКазной и ДНКазной активностями. Для того, чтобы этот подход был успешным, может быть необходимо исходно секретировать их сначала в периплазму(для защиты клетки от нуклеолиза), и защитить ДНКазу от потери ее активности при лизисе. Авторы изобретения продемонстрировали в данном описании изобретения удаление геномной ДНК и РНК при продуцировании плазмиды в нескольких клеточных линиях, экспрессирующих периплазматически локализованную экзонуклеазу Т 5, слитую с РНКазой А или РНКазой S. Авторы изобретения продемонстрировали, что эти слитые ферменты применяют при удалении примесей нуклеиновых кислот при обработке плазмиды путем щелочного лизиса, автолиза или экстракции. Применение экзонуклеазы Т 5 в продуцирующем хозяине для улучшения продуцирования плазмидной ДНК не было предложено и не подразумевалось в предшествующем уровне техники. Объединение нуклеаз РНКазы и ДНКазы в химерную нуклеазу также не была предложено в предшествующем уровне техники. Также применение химерных нуклеаз при получении плазмид не было предложено в предшествующем уровне техники. Новые описанные здесь продукты слияния экзонуклеазы Т 5 и РНКазы позволяют одновременно уменьшить содержания примесей двух основных нуклеиновых кислот. Дополнительно к сочетанию двух важных элементов, РНКазный элемент неожиданно улучшал активность ДНКазного фрагмента (фиг. 12). Этот синергический результат улучшает функционирование химерной нуклеазы по сравнению с неслитыми материнскими конструкциями. Кроме того, один белковый объект легче встроить в продуцирующие клеточные линии и контролировать в процессе экспрессии, чем два компонента (например РНКазу и экзонуклеазу Т 5), которые не ассоциированы. Предпочтительные воплощения способа получения плазмиды Клетки, экспрессирующие нуклеазу, безопасную для плазмиды, продуцируются в ферментативной культуре. После продуцирования плазмиду очищают от клеток. При очистке плазмиды предпочтительно можно использовать описанные в области техники способы щелочного лизиса, теплового лизиса или механического лизиса. Уменьшение содержания геномной ДНК может быть осуществлено до и/или во время, и/или после лизиса. Редукция генома также может происходить при экстракции плазмиды, например при осмотическом шоке (Baker, M., Taylor М. and Uppal S. 2003 WO 03/046177Al), когда периплазматическая или секретируемая нуклеаза по изобретению устраняет геномную ДНК в процессе экстракции ДНК из клетки. Штаммы, содержащие нуклеазу, безопасную для плазмиды, используют в двух предпочтительных форматах очистки плазмиды (форматы 1 и 2, фиг. 18).-7 010864 Формат 1 включает удаление геномной ДНК (и РНК химерными нуклеазами) до клеточного лизиса(стадия предварительной обработки). Нуклеазу вводят в цитоплазму после продуцирования (т.е. пермеабилизация внутренней мембраны). Авторы изобретения продемонстрировали уменьшение содержания РНК и геномной ДНК при щелочном лизисе с предварительной обработкой (формат 1) с использованием конструкций OmpAS-пептидТ 5+OmpASБелок (фиг. 11-12) и конструкций OmpAT5RNase (фиг. 8). Индуцируемые факторы, разрушающие мембрану, такие как холины бактериофагов, или разрушающие мембрану химические вещества или детергенты потенциально могут быть использованы совместно для избирательного введения гидролитических ферментов непосредственно в цитоплазму в конце цикла ферментации, до начала обработки. Такая предварительная обработка может обеспечить некоторый контроль над степенью расщепления в клетке перед обработкой клеточной пасты. Такое улучшение устранит необходимость защиты ферментов от лизирующих реагентов (поскольку они были бы активны перед лизисом). Кроме того, в этом формате эндогенные нуклеазы, такие как RecBCD, могут принимать участие в направленной деградации геномной ДНК. Формат 2 включает удаление геномной ДНК (и РНК химерными нуклеазами) без добавления описанной стадии предварительной обработки. Уменьшение содержания геномной ДНК может происходить в процессе приготовления клеток, или во время либо после лизиса. Если уменьшение происходит после лизиса, может быть необходима стабилизация фермента в условиях клеточного лизиса и последующая обработка для активации фермента. В случае теплового лизиса и щелочного лизиса может потребоваться соответственно увеличенная термостабильность или стабильность к щелочному SDS (додецилсульфат натрия), и последующая замена буфера для удаления высокой концентрации ЭДТА и SDS. Авторы изобретения продемонстрировали уменьшение содержания РНК и геномной ДНК при автолизе без предварительной обработки (формат 2) с использованием конструкции OmpAT5RNase (фиг. 17). Формат 2 также является перспективным для альтернативных способов лизиса, таких как механический лизис в присутствии компактизующих агентов (Wilson R.C. and Murphy J.C. 2002, заявка на патент США 20020197637) или механический лизис с микрофлюидизацией (гомогенизатор со сталкивающимися струями) или помол в шаровой мельнице (Jem K.J. 2002 патент США 6455287), где не требуется термостабильность или стабильность к щелочному SDS. В предпочтительном воплощении клетки лизируют, используя автолиз. Один из способов автолиза заключается в разрушении клеток путем добавления в ферментативную среду агентов, разрушающих клеточную стенку, таких как В-лактамные антибиотики. Альтернативно, лизоцим или кодируемые фагом пептидные антибиотики могут продуцироваться штаммом хозяина для разрушения клетки. Рекомбинантный лизоцим может экспрессироваться клеткой в цитоплазматической форме и высвобождаться в периплазму в нужный момент времени путем ко-экспрессии холина (заполняющего мембрану пептида или белка), создающего канал, который обеспечивает возможность вытекания лизоцима и других цитоплазматических белков из цитоплазмы в периплазму. Примеры комбинаций лизоцим/холин, которые можно использовать, известны в данной области техники и включены в данное описание посредством ссылки. Условия автолиза, в отличие от щелочного или теплового лизиса, не ведет к избирательной денатурации геномной ДНК. Продукт лизиса является очень вязким, что создает проблемы с обработкой. Авторы изобретения продемонстрировали здесь новое наблюдение, заключающееся в том, что автолиз, например лизис, опосредованный антибиотиками или фагами, в присутствии безопасной для плазмиды нуклеазы приводит к избирательному удалению геномной ДНК и уменьшению вязкости (фиг. 17). Такая комбинация автолиза с нуклеазой, безопасной для плазмиды, не предлагалась и не подразумевалась в данной области техники. Действительно, способы автолиза не рассматривались для применения при получении плазмид, возможно ввиду высоких уровней примесей геномной ДНК, присутствующих без безопасных для плазмиды нуклеаз по изобретению. Способы автолиза до настоящего времени рассматривались только в отношении применения в получении биомолекул, не являющихся ДНК, и часто включали неспецифическую нуклеазу для удаления плазмидной и геномной ДНК. Безопасные для плазмиды нуклеазы по изобретению облегчают новое применение широкого ряда способов автолиза для крупномасштабного получения плазмидной ДНК. Автолитическая очистка плазмиды также решает проблему, считавшуюся ранее неразрешимой, а именно исключение многочисленных стадий клеточного лизиса и очистки при обработке плазмиды. Типичный способ очистки плазмиды может быть значительно укорочен и сделан рентабельным путем включения автолитической очистки по изобретению (фиг. 19). Это устраняет необходимость применения токсичных реагентов и многие элементы (стадии) очистки плазмида без потери производительности. Продуцирование нуклеазы Экспрессия гена нуклеазы может регулироваться конститутивными или более предпочтительно индуцируемыми промоторами. Предпочтительные индуцируемые промоторы включают в себя, без ограничения ими, лямбда PR и PL, другие фаговые промоторы, такие как Т 5, Т 7, синтетические промоторы,такие как tac и trc, эндогенные промоторы, такие как lac, промоторы холодового шока (cspA), araBAD,промоторы, реагирующие на стационарную фазу или истощение, промоторы, чувствительные к скорости-8 010864 роста (rmf), pH (cadA) или кислородному голоданию (nar). Индукция может быть вызвана повышенной температурой (PL, tac), понижением температуры (cspA; промотор холодового шока) с термостабильными репрессорами (лямбда репрессор, lac репрессор), индукторами (IPTG (изопропилтиогалактозид) дляtac, trc и lac; арабиноза для AraBAD) или другими средствами (например вхождение в стационарную фазу, сдвиг рН или кислорода, истощение глюкозы или аминокислот; обзор в:Makrides S.C. 1996 Microbiol. Rev. 60:512-538). Альтернативно, ген можно индуцировать регулируемой антисмысловой РНК. В данной области известно несколько сигнальных пептидов с периплазматическим или внеклеточным нацеливанием, и они включены в данное описание посредством ссылки (например Choi J.H. and LeeS.Y. 2004 S Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 625-635). Примерами лидерных пептидов для периплазматического нацеливания являются OmpA, PhoAOmpT и PelB. Нуклеаза также может быть закреплена на мембране с использованием известных закрепляющих меток, таких как "закрепляющая периплазматическая экспрессия" с использованием лидеров, таких как лидер NlpA и первые шесть аминокислот (Harvey B.R., Georgiou G., Hayhurst A., Jeong K.J., Iverson B.L.,and Rogers G.K. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 9193-9198). Альтернативно, нуклеаза может секретироваться из клетки в среду для роста и контактировать с геномной ДНК в процессе лизисе. Альтернативно, нуклеазы могут быть сконструированы для усиления активности или стабильности,или распределения во время очистки (Collen А., Ward M., Tjerneld F. и Stalbrand H. 2001 J. Chromatogr. A. 910:275-84), с использованием сайт-направленного мутагенеза, добавления небольших пептидных нацеливающих меток или направленного изменения (Zhao H., Chockalingam K., and Chen Z. 2002 Curr. Opin.Biotechnol. 13: 104-10) с использованием подходов молекулярной селекции (Ness J.E., Kim S., Gottman A.,Pak R., Krebber A., Borchert T.V., Govindarajan S., Mundorff E.C., и Minshull J. 2002 Nat. Biotechnol. 20: 1251-5; Kurtzman A.L., Govindarajan S., Vahlle K., Jones J.T., Heinrichs V., Patten PA. 2001 Curr. Opin. Biotechnol. 12:361-70). Пориновые системы для клеточного автолиза Существуют два класса фаговых пориновых белков, которые образуют поры в мембране. Они известны в литературе и не ограничивающий перечень возможных поринов для практического воплощения изобретения включен в данное описание посредством ссылки (Young 1992, выше; Wang IN, Smith DL andYoung R. 2000 Annu. Rev. Microbiol. 54: 799-825). Один класс состоит из двухцепочечных ДНКбактериофагов, таких как Т 4 и фаг лямбда Е.coli, или бактериофаг LL-H Lactobacillus. Эти пориновые белки названы холинами и они собираются в цитоплазматической мембране с образованием пор для высвобождения в периплазму белков, разрушающих клеточную стенку. Эти отверстия варьируются от небольших (Т 4 t белок, который по видимому подходит для лизоцима, который он пропускает из цитоплазмы в периплазму) до достаточно больших, таких, что через них могут проходить белки более 100 кДа, такие как В галактозидаза (лямбда S; внутренний диаметр пор более 10-12 нм, аналогичный по размеру цитотоксинам стрептиномицин О/листериализин О). Авторы изобретения рассматривают применение продуцирующих штаммов, использующих эти порины и лизоцим в комбинации с безопасными для плазмиды нуклеазами по изобретению для получения плазмид. Автолитические штаммы, использующие эти порины, сконструированы для продуцирования белков (Leung and Swartz, выше, 2001), но использование в продуцировании плазмид не описано в уровне техники. Альтернативно, фаг с одноцепочечной ДНК, такой как PhiX174, продуцирует один лизирующий белок (ген Е), требующийся для высвобождения фага. Этот белок и лизирующие белки другого фага с одноцепочечной ДНК могут ингибировать образование клеточной стенки аналогично пенициллину (обзор в: Bernhardt T.G., Wang I.N., Struck D.K. and Young R. 2002 Res. Microbiol. 153: 493-501). Продукт гена Е образует между внешней и внутренней мембранами канал, имеющий микрометровый диаметр, эффективно изолируя периплазму и нелитически выводя содержимое цитоплазмы, включая плазмидную ДНКand Roof W.D. 2000 Trends Micro. 8: 120-128). Систему phiX 174 ген Е используют для получения бактериальных "теней", для доставки антигена или ДНК-вакцины (Jalava K., Iko F.O., Riedmann E and LubitzW. 2003 Expert Rev. Vaccines 2: 45-51). Для доставки ДНК-вакцины "тени" заполняют плазмидной ДНК. Разработаны способы получения "теней", основанные на том наблюдении, что рост при высоком содержании магния (например 0,1 М MgSO4) препятствует лизису. Получение включает: 1) экспрессию гена Е в присутствии Mg; 2) замену буфера для клеток; и 3) добавление по каплям магния с образованием каналов и выведением цитоплазматического содержимого (обзор в Jalava et al., выше, 2003). Бактериальные "тени" не оценивали в отношении применений в получении плазмидной ДНК, и целостность высвобождаемой плазмиды ранее не оценивали (Witte and Lubitz, выше, 1989). Штаммы хозяев для экспрессии гена нуклеазы и/или автолитической генной экспрессии Ген нуклеазы может находиться в плазмиде, которая совместима с целевой плазмидой, или наиболее предпочтительно интегрирован в геном. Конструирование штамма может быть осуществлено в любом штамме бактерий, который подходит для продуцирования плазмиды. Штаммы бактерий, несущих интегрированные копии плазмид, экспрессирующих нуклеазу, получают, используя широкий ряд способов, например лямбда red gam рекомбинацию. (Murphy K.С. 1998 J.Bact. 180: 2063-2071; Datsenko K.A., Wanner BL. 2000 Proc. Natl. Acad Sci. (USA).; 97:6640-6645). Этот способ успешно использовали в recA-штаммах, таких как DH5, представляющих собой обычного хозяина для продуцирования плазмиды. Описывая кратко, экспрессирующую(ие) кассету(ы), включающую(ие) фланкированный ген устойчивости к антибиотику, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, содержащих последовательности, гомологичные сайту встраивания. Целевой штамм DH5 трансформируют устойчивой к ампициллину плазмидойpKD46, содержащей функциональный фрагмент с лямбда Red рекомбинацией, и продуцирование Red рекомбиназы индуцируют арабинозой. Клетки готовят и, как описано, электропорируют с ПЦР фрагментом. Гомологичные рекомбинанты отбирают с помощью канамицина и ликвидируют хелперную плазмиду pKD46 путем сдвига к непермиссивной температуре (pKD46 имеет температурочувствительное начало репликации) и подтверждают утрату устойчивости к ампициллину. Продуцирование плазмиды Штаммы Е.coli с интегрированными генами нуклеазы могут быть использованы для получения плазмидной ДНК в ферментативной культуре. Примеры ферментативных процессов известны в уровне техники (смотри обзор Carnes A.E. 2005 BioProcess International, October 2005, в печати). Nature Technology Corporation использует периодические процессы и периодические процессы с подпиткой в не содержащих продуктов животного происхождения ферментативных средах для периодических процессов(NTC3018) и периодических процессов с подпиткой (NTC3019), оптимизированных для получения плазмид. Эти среды разработаны для поддержания уменьшенных скоростей роста и сохранения стабильности и целостности плазмиды. При использовании автоматизированного периодического ферментативного процесса с подпиткой, регулируемой так, чтобы поддерживать определенную скорость роста 0,12/ч достигают выходов плазмиды, составляющих 1100 мг/л и OD600 120. Авторы изобретения рассматривают использование штаммов хозяев, вырабатывающих нуклеазы,безопасные для плазмиды, для продуцирования подпитывающих обогащенных плазмидой потоков ферментативной культуры в примере способов очистки плазмиды. Комбинация штаммов, продуцирующих нуклеазу с высоким ферментативным выходом, и приведенный в качестве примера способ очистки может обеспечить рентабельные способы для дополнительного уменьшения уровней геномной ДНК до уровней, приемлемых для генной терапии и применений в ДНК-вакцинации. Примеры Способ по изобретению дополнительно проиллюстрирован следующими примерами. Они приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для какого-либо ограничения объема изобретения. Пример 1. Экспрессирующие векторы pVEX. Вектор pVEXSaplstuffer для экспрессии белков представлен на фиг. 2. Плазмида имеет начало репликации pBR322 (ROP делеция) и маркер устойчивости к ампициллину. Этот вектор имеет индуцируемый Тас-промотор, регулирующий экспрессию интересующего гена в Е.coli. Экспрессия подавляется продуктом гена laclq (кодируемого плазмидой) и индуцируется путем добавления к культуре IPTG. Интересующие гены клонируются в "лишнем фрагменте", который состоит из сайтов клонированияSapl типа IIS, которые образуют липкие концы ATG и ТАА, представленные на фиг. 3. Гены копируют путем амплификации клонов или геномной ДНК с использованием праймеров с характерными адресными метками и определенными уникальными последовательностями. Внутренние сайты Sapl в целевом гене как правило не являются вредными, поскольку вероятность того, что внутренний сайт Sapl будет соответствовать одной из адресных меток (tags) составляет только 1/16. Производное этой плазмиды pVEXSaplHNtagstuffer сливает интересующий ген с N-концевой HNметкой (tag), за которой следует сайт расщепления энтерокиназой. Эта метка связывает со смолой для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC) подобно гистидиновой метке (his-tag),обеспечивая возможность аффинной очистки. Гены подвергают амплификации посредством ПЦР с праймерами, содержащие введенные сайты Sapl на концах для получения 5'-AAG (последний лизиновый остаток сайта расщепления энтерокиназой) и липкие концы 3'-ТАА 3 пар оснований после расщепленияSapl (New England Biolabs, Beverley NJ). Пример 2. Конструкция секретирующего вектора pVEXSaplOmpA. Сигнальный пептид секреции OmpA встраивали в вектор pVEXstuffer следующим образом. Олигонуклеотиды, кодирующие сигнальный пептид секреции OmpA отжигали и клонировали в сайт NcolpVEXSaplstuffer с получением pVEXSaplOmpAstuffer. Полученный клон экспрессирует лидерную последовательность OmpA, который направляет интересующий белок в периплазму. Лидерная последовательность OmpA отщепляется, оставляя интересующий белок с лидерной последовательностью из 2 аминокислот (Ala-Thr) перед Met кодоном интересующего гена. Карта этого вектора показана на фиг. 4. Цитоплазматические конструкции могут быть превращены в секретируемые конструкции путем переноса фрагмента Ncol/Xhol, содержащего интересующий ген, в этот вектор. OmpAHNtagstuffer, кодирующийN-концевую HN-метку (tag), конструировали точно в соответствии с описанным выше, используя Ncol расщепленный pVEXSaplHN tagstuffer для встраивания отожженного олиго.- 10010864 Пример 3. Конструкция экспрессирующего вектора pVEXOmpAHNRNase. Ген бычьей панкреатической РНКазы амплифицировали посредством ПЦР из бычьей геномной ДНК. Всю ПЦР осуществляли, используя Pfu ДНК-полимеразы (для того, чтобы избежать добавления дополнительных оснований на концы дефосфорилированных фрагментов) с использованием стандартных методик ПЦР. Продукт ПЦР длиной 400 п.о. расщепляли Sapl, и фрагменты длиной 100 и 300 п.о. (внутренний сайт Sapl) очищали в геле и клонировали в Sapl расщепленный pVEXOmpAHNstuffer вектор, используя стандартные методики клонирования. Последовательность рекомбинантов (pVEXOmpAHNRNase) верифицировали. Пример 4. Клонирование экзонуклеазы Т 5. Ген экзонуклеазы D15 Т 5 амплифицировали посредством ПЦР из фага Т 5 (АТСС 11303-В 5), клонировали и последовательность подтверждали. Фрагмент длиной 900 п.о. очищали и фрагмент, совместимый с HNstuffer использовали в качестве матрицы для ПЦР. Эти фрагменты очищали и клонировали по дефосфорилированным ("тупым") концам в сайт Smal вектора pW2.0, производного pUC19 с модифицированным полилинкером. Клоны pW2.0-T5 и pW2.0-HNT5 выделяли и последовательность верифицировали. Пример 5. Конструкция экспрессирующего вектора pVEXBOmpAstuffer. Конструировали вторую экспрессирующую систему с меньшей не полностью блокированной экспрессией и меньшей общей индуцируемой экспрессией. Этот вектор pVEXBSaplOmpAstuffer содержит промотор AraBAD и индуцируется путем добавления арабинозы в отличие от индукции IPTG для родительского вектора pVEXSaplOmpAstuffer, содержащего промотор tac. Промотор Ara BAD и фланкирующий репрессор аrаС амплифицировали посредством ПЦР из геномной ДНК DH5. Этот амплифицированный продукт (1,3 килобаз) расщепляли Aarl и клонировали в вектор pVEX, расщепленный EcoRl/Xhol. Полученный клон содержал оперон AraBAD ниже "лишнего" фрагмента. Область AraBAD вырезали с помощью Xhol и EcoRl, и липкие концы затупляли путем заполнения дезоксинуклеозидтрифосфатами (dNTP) и с использованием фрагмента Кленова. Фрагмент 1,3 кб клонировали в скелетный фрагмент 2,8 кб векторов pVEXSaplOmpAstuffer (п.о. 247-3108) иpVEXSaplOmpAHNtagstuffer. Скелетные фрагменты получали путем очистки на геле вектора, расщепленного Mlul и Xbal, затупленного фрагментом Кленова и dNTP, и обработанного CIP (телячьей кишечной фосфатазой). Полученные клоны отбирали по ориентации локуса AraBAD с помощью рестрикционного расщепления, и последовательность верифицировали. В конечных конструкциях, pVEXBSaplOmpAstuffer (фиг. 5) и pVEXBSaplOmpAHNtagstuffer, ген laclq и промотор tac замещены репрессором Ara С и промотором araBAD. Пример 6. Конструкция pVEXBOmpAHNRNase. Ген HNPHКазы вырезали из pVEXOmpAHNRNAse путем расщепления с помощью Ncol/Xhol и переносили в вектор pVEXBSaplOmpAHNtagstuffer, расщепленный Ncol/Xhol. Пример 7. Конструкция экспрессирующего вектора pVEXBOmpARNase.HNметку удаляли из pVEXBOmpAHNRNase путем ПЦР-амплификации всей плазмиды, используя праймеры, содержащие Aarl. ПЦР-амплификация приводила к ПЦР-фрагменту, соответствующему длине вектора. Расщепление очищенного ПЦР-продукта с помощью Aarl создавало совместимые липкие концы(дважды подчеркнутые в праймерах), которые при лигировании приводили к точной делеции HN-метки. Клоны pVEXBOmpARNase (фиг. 6) выделяли и подтверждали посредством рестрикционного расщепления и секвенирования. Пример 8. Конструкция экспрессирующего вектора pVEXBOmpAT5RNase.HNметку удаляли из pVEXBOmpAHNRNase путем ПЦР-амплификации всей плазмиды с использованием праймеров, содержащих Aarl. Экзонуклеазу Т 5 затем клонировали в плазмиду, содержащую разрывы. ПЦР-амплификация pVEXBOmpAHNRNase приводила к ПЦР-фрагменту, соответствующему длине вектора. ПЦР-амплификация pW2.0T5 с Т 5-специфическими праймерами приводила к гену Т 5 длиной 900 п.о. Расщепление очищенных ПЦР-продуктов с использованием Aarl создавало совместимые липкие концы, которые при лигировании приводили к точной делеции HN-метки и встраиванию гена Т 5. Клоны pVEXBOmpAT5RNase (фиг. 7) выделяли и подтверждали посредством рестриктирующего расщепления и секвенирования. Пример 9. Расщепление геномной ДНК с помощью Т 5 РНКазы в процессе получения плазмиды. Клеточные линии DH5, содержащие плазмиды pVEXBOmpARNase (РНКаза) или pVEXBOmpAT5RNase (Т 5 РНКаза), выращивали при 37 С в жидких средах LB, содержащих 5 мМ MgSO4, и экспрессию белка индуцировали в середине фазы логарифмического роста (приблизительно 0,5 OD600/мл) путем добавления арабинозы до 0,2%. Культуры собирали через 4 ч после индукции при 29 С. Контрольные неиндуцированные культуры также выращивали в идентичных условиях. Клетки осаждали и хранили при -20 С или 4 С в течение ночи. Клетки после хранения при -20 С оттаивали и инкубировали в течение 10 мин при 37 С. Клетки после хранения при 4 С использовали без дополнительной обработки. Лизис наблюдался в клетках, инду- 11010864 цированных РНКазой, но не в клетках, индуцированных Т 5 РНКазой или неиндуцированных. Расщепление нуклеиновой кислоты оценивали в двух анализах. В первом анализе тотальную ДНК экстрагировали из клеток, хранившихся при 4 С, используя протокол быстрого скрининга Williams et. al.NaCl, 10 мМ ЭДТА), экстрагировали фенолом, обрабатывали РНКазой, и ДНК разделяли в 1%-ном агарозном геле после добавления красителя для отслеживания. Во втором анализе тотальную нуклеиновую кислоту (включая РНКазу) выделяли, используя минипрепаративные буферы (Р 1, Р 2, N3) и протоколQiagen, за исключением того, что к Р 1 буферу не добавляли РНКазу (Qiagen QIAprep minprep Handbook,March 2002). После приготовления осветленного лизата путем центрифугирования, его инкубировали при 37 С в течение 10 мин, нуклеиновые кислоты осаждали путем добавления 3 объемов 95% этанола,собирали путем центрифугирования, промывали 70%-ным этанолом и ресуспендировали в буфере Qiagen ЕВ (10 мМ Tris, pH 8,5), содержащем 10 мМ MgSO4. Образец инкубировали в течение 10 мин при 37 С,добавляли краситель для отслеживания, и нуклеиновые кислоты разделяли на 1%-ном агарозном геле. Результаты (фиг. 8) демонстрируют "безопасное для плазмиды" специфическое расщепление геномной ДНК путем слияния с Т 5 РНКазой во время получения плазмиды посредством щелочного лизиса. Индуцированные клетки были живыми (продолжали расти после индукции) и не подвергались лизису во время замораживания-оттаивания. Обратите внимание на полное удаление полосы хромосомной ДНК(широкая полоса более 12 кб) в щелочных лизатах с индуцированной Т 5 РНКазой на дорожках 1 и 5 по сравнению с неиндуцированной Т 5 РНКазой и контролями РНКазы. Никакого расщепления плазмидной ДНК не наблюдалось в образцах, которые хранились при -20 С (сравните дорожки 1 и 3; оставшаяся крупная полоса на дорожке 1 соответствует суперспиральному димеру), тогда как полное удаление геномной ДНК и частичное расщепление плазмидной ДНК наблюдается в образцах, приготовленных при 4 С. Это указывает на то, что различные способы предварительной обработки (инкубация в течение ночи при 4 С по сравнению с замораживанием оттаиванием и в течение 10 мин при 37 С с образцами после хранения при -20 С) по разному вводила нуклеазу в цитоплазму. Частичное удаление геномной ДНК в экстрактах тотальной нуклеиновой кислоты с воздействием Т 5 РНКазы также наблюдается на дорожке 9,но оно не настолько полное как для предварительно обработанных образцов, очищенных посредством щелочного лизиса. Гель сканировали, и полосы на дорожках 1-4 суммировали и оценивали количественно. Результаты обобщены в табл. 1. Уровень геномной ДНК ниже на дорожке с индуцированной РНКазой благодаря наблюдаемому клеточному лизису. Уровень геномной ДНК в образце с индуцированной Т 5 РНКазой в 50 раз ниже, чем в образце с неиндуцированной Т 5 РНКазой, без какого-либо уменьшения уровня плазмиды. Это демонстрирует применимость химерной нуклеазы для уменьшения уровня геномной ДНК при обработке плазмиды. Таблица 1. Количественная оценка полос в геле на дорожках 1-4 в соответствии с фиг. 8 Пример 10. Слияния РНКаза S-T5. Другие безопасные для плазмиды химерные нуклеазы с экзонуклеазой Т 5 конструировали, используя систему S-пептид S-белок, с получением химерных нуклеаз, полезных для удаления геномной ДНК и РНК. Здесь авторы изобретения описывают конструирование и оценку таких слияний и демонстрируют их применимость при получении плазмид. Как показано ниже, эти слияния сохраняют как РНКазную,так и усиленную ДНКазную активность. Продемонстрировано, что слияние гетерологических белков с N-концевым S-пептидом РНКазы А приобретает РНКазную активность после объединения с S-белком РНКазы. S-Пептид представляет собойN-концевой фрагмент бычьей панкреатической РНКазы А длиной 20 аминокислот, высвобождаемый путем расщепления субтилизином; С-концевой фрагмент (21-124) представляет собой S-белок. S-Белок иS-пептид связываются с высокой аффинностью (3,110-11 М при рН 8,3) как РНКаза S, которая обладает ферментативной активностью аналогичной нативной РНКазе 7. Система с S-меткой(tag) (McCormick M.and Mierendorf R. 1994 InNovations 1: 4-7) представляет собой систему очистки белка, которую используют для слияния гетерологичных белков с функциональной РНКазой. S-Метка представляет собой 15 N- 12010864 концевых остатков аминокислот S-пептида, и даже при слиянии с гетерологичным белком, взаимодействует с S-белком с образованием активной РНКазы. S-Метка (и S-пептид) является хорошо растворимой,экспрессируется до высоких уровней в Е.coli и может опосредовать высокоаффинное взаимодействие сS-белком при слиянии по любому концу. Реагенты для быстрого обнаружения и количественной очистки слияний S-метки или S-пептида, основанные на ассоциации с S-белком (вестерн-блот с S-меткой) или разбавлении функциональной РНКазы S (быстрый анализ с S-меткой), имеются в продаже у Novagen. Использование данной системы для получения химерной нуклеазы показано на фиг. 9.pVEXBOmpA-S-белок осуществляет слияние лидерной последовательности секреции OmpA (сигнальная последовательность) с S-белковым фрагментом РНКазы. Получали два варианта, кодирующие или слияние OmpASбелок (16-124) или OmpASБелок (20-124). Оба демонстрируют похожую функцию invivo. Эти конструкции разработаны для высвобождения точного S-белкового фрагмента после отщепления лидера OmpA во время периплазматической секреции. Экспрессирующую кассету из этих конструкций переносили в pACYC177 (совместимую с pVEX) для исследований ко-экспрессии. pACYC177 является более низкокопийным чем pVEX, так что должно получаться меньше S-белка, чем S-пептида. Это сделано намеренно, поскольку S-пептид может требоваться для облегчения фолдинга S-белка.S-Пептид (для ассоциации с S-белком) сливали с N-концом экзонуклеазы Т 5 (S-пептид-Т 5) с получением слитого вектора S-petide-T5 (pVEXBOmpAS-пептид-Т 5) или с С-концом с получением секретируемого вектора Т 5-Sпептид (pVEXBOmpAT5-Sпептид). Использовали лидерную последовательность секреции OmpA или PhoA для точного высвобождения нативного N-конца S-пептида. При ко-экспрессии фрагменты S-пептида и S-белка сконструированы для того, чтобы ассоциироваться в виде РНКазы S, придающей РНКазную функцию, а также ДНКазную функцию от слитой экзонуклеазы Т 5. Пример 11. Слияния РНКаза S-T5 для очистки плазмид. Общая стратегия уменьшения содержания геномной ДНК с использованием РНКаза S-T5 в качестве примера показана на фиг. 10. Экспрессию и анализ осуществляли, как описано в примере 9 для Т 5 РНКазы. Уменьшение содержания геномной ДНК и РНК наблюдалось в клеточных линиях, экспрессирующих эти слияния (фиг. 11-12). Конструкция OmpAS-пептид-Т 5 в присутствии любой конструкцииOmpAS-белок (16-124 или 20-124) уменьшала содержание геномной ДНК и РНК по сравнению с любой из конструкций по одиночке. Конструкция OmpАТ 5-S-пептид была чувствительной к протеолизу (полосы расщепления обнаружены с помощью анализа SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и, как ожидалось, обладала уменьшенной РНКазной и ДНКазной активностью по сравнению с конструкцией OmpAS-пептид-Т 5. Все другие конструкции Т 5 или S-пептид-Т 5 были протеолитически стабильны (полосу ожидаемого размера наблюдали посредством анализа SDSPAGE). Продемонстрировано увеличение активности экзонуклеазы Т 5 при ассоциации с РНКазой S, которая также сохраняет РНКазную активность. Пример 12. Конструкция экспрессирующего вектора PhiX174 gene E. Белок, кодируемый геном Е phiX174, клонировали под контролем AraBAD в плазмиде, совместимой с существующими высококопийными плазмидами с ориджином pUC (например gWiz-GFP,pDNAVACCUltra-EGFP) и плазмидами с ориджином pBR322 (например pVEXBT5RNase).pVEXB-native stuffer. Вектор pVEXSaplstuffer расщепляли Xbal и Mlul. Липкие концы заполняли с использованием фрагмента Кленова и dNTP и инактивировали нагреванием. Концы дефосфорилировали телячьей кишечной фосфатазой. Фрагмент массой 2,8 кб очищали на геле от фрагмента массой 1,5 кб. Вектор pVEXB расщепляли с помощью EcoRl и Xhol. Липкие концы заполняли с использованием фрагмента Кленова и dNTP. Фрагмент массой 1,3 кб, содержащий промотор araB, очищали на геле от фрагмента массой 4,3 кб. Фрагменты со стадий 1 и 2 лигировали, трансформировали и отбирали с помощью Amp. Клон (pVEXB-nativestuffer) с правильной ориентацией отбирали путем рестриктазного расщепления и подтверждали посредством секвенирования. Векторы pACYCB-native (фиг. 14) и OmpA-stuffer. Кассету из экспрессирующихся векторов pVEXBOmpAstuffer и nativestuffer переносили в векторpACYC для того, чтобы обеспечить ко-экспрессию с векторами с ориджином pUC и pBR322 (например векторы pVEX и pDNAVACCUltra). Получали плазмиду pACYC-RIL (фрагмент А), обработанную CIP,очищенную на геле и расщепленную Xmnl. pVEXBOmpAstuffer и pVEXBnativestuffer расщепляли с помощью EcoRl (заполняли с использованием фрагмента Кленова и dNTPs) и более мелкие фрагменты очищали (pVEXBOmpAstuffer составляет 2703, 1466, фрагмент В 1; pVEXBnativestuffer немного меньше,фрагмент В 2). Фрагменты А, В 1 (pACYCBOmpAstuffer) или А и В 2 (pACYCBnativestuffer) смешивали и лигировали. Результаты лигирования трансформировали в компетентные клетки DH5 и отбирали на хлорамфениколовых агарозных пластинах. Клоны и ориентацию подтверждали посредством рестрикционного расщепления.- 13010864 геномной ДНК phiX174 в качестве матрицы. Использовали отжиг 545 С, отжиг 2555 С со временем удлинения 1 минута при 72 С и денатурацией в течение 30 с при 95 С. pACYC-Bnativestuffer расщеплялиSapl, и два фрагмента (4375, 282, 34) очищали. Фрагмент ПЦР также расщепляли Sapl. 3 фрагмента смешивали и лигировали. Продукты лигирования трансформировали в DH5 и трансформировали на средеLB+хлорамфеникол+глюкоза (0,2%) (глюкозу добавляют для уменьшения не полностью блокированной экспрессии). Вектор pACYCB phiX174 ген Е верифицировали посредством рестрикционного расщепления и секвенирования. Пример 13. Высвобождение высококопийной плазмиды с ориджином pUC путем индуцированного геном Е образования клеточных "теней". Клеточные линии получали путем трансформации Z компетентных (Zymos) клеток Е.coli очищенными плазмидами и выращивания на агарозных планшетах, содержащих антибиотик и 0,2% глюкозы(для уменьшения неполностью блокированной экспрессии гена Е с арабинозного промотора). Клеточные линии выращивали при 37 С в средах LB, содержащих 34 мкг/мл хлорамфеникола (штаммы, содержащие плазмиду, экспрессирующую ген Е), и/или 50 мкг/мл канамицина (штаммы, содержащие плазмидуpDNAVACCUltra), или 100 мкг/мл ампициллина (штаммы, содержащие плазмиды pVEX) и индуцировали в середине фазы логарифмического роста (приблизительно 0,5 OD600/мл). Индукцию арабинозой осуществляли путем добавления арабинозы из 100 концентрированного раствора до конечной концентрации 0,2%. Экстракты сред для анализа в геле готовили путем 1) применения осветленных сред или 2) экстракции фенолом и хлороформом, осаждения этанолом и ресуспендирования в ТЕ (20 концентрация). Экстракты клеточных осадков для анализа в геле готовили путем ресуспендирования клеточного осадка в буфере (10-20 концентрация), инкубации при определенной температуре и длительности, с последующей экстракцией фенолом и хлороформом. Супернатанты анализировали непосредственно посредством электрофореза в геле. Тотальные нуклеиновые кислоты в клеточных осадках экстрагировали с использованием буфера для разрушения клеток в соответствии с описанным Williams et. al., выше, 1994,с использованием 10-20-кратной концентрации (по сравнению с объемом исходных сред) буфера для разрушения клеток и без добавления РНКазы. Экстракты анализировали в отношении нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозном геле, и РНК и ДНК визуализировали путем последующего окрашивания разведенным в отношении 1/10000 SYBR Green II (Sigma). Высвобождение нуклеиновых кислот путем экспрессии гена Е лизирующего белка. Готовили и оценивали три клеточные линии: 1) pACYC-B-gene E, 2) pACYC-B-geneE+pDNAVACCUltra-GFP и 3) pDNAVACCultra-GFP. pDNAVACCultra представляет собой высококопийную устойчивую к канамицину плазмиду с ориджином рМВ 1, совместимую с плазмидами pACYC. Клетки представляли собой: А) неиндуцированные; или Б) индуцированные арабинозой до 0,2%; или В) индуцированные арабинозой до 0,2% в присутствии 0,2 М MgSO4 (для ингибирования образования "теней"). Клетки индуцировали в течение 30 мин и собирали аликвоты. Супернатанты анализировали в отношении нуклеиновых кислот посредством электрофореза в агарозном геле, и РНК и ДНК визуализировали путем последующего окрашивания разведенным в отношении 1/10,000 SYBR Green II (Sigma). Осадки из 1,5 мл клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 1 ч, и клетки осаждали. Клеточные экстракты в ТЕ анализировали посредством электрофореза в геле, как описано выше. После индукции наблюдали высвобождение плазмиды (pDNAVACCultra-GFP) путем экспрессии гена Е PhiX174 в LB и экстракцию супернатанта. Также высвобождались РНК и геномная ДНК. Большую часть плазмиды в клетках высвобождали из индуцированного образца (без MgSO4) в средах и ТЕ экстракте. Если ген Е индуцировали в присутствии 0,2 М MgSO4, плазмида не высвобождалась в LB, но высвобождалась, когда концентрацию Mg уменьшали в буфере для экстракции, ТЕ. Эти эксперименты продемонстрировали, что в присутствии гена Е и высококопийной плазмиды происходит образование"теней" клеток культуры, и что высвобождение плазмиды зависит от индукции гена Е. Высвобождение плазмид из клеточной линии только с плазмидой pDNAVACCUltra отсутствовало, что указывало на то,что высвобождение плазмиды зависит от продукта phiX174 гена Е. Кроме того, высвобождение плазмиды в среды можно предотвратить путем включения в среды 0,2 М MgSO4. Это позволяет собрать клетки и заменить буфер для удаления магния и обеспечивает возможность высвобождения плазмиды. Изучали динамику индуцированного геном Е phiX174 высвобождения плазмиды pDNAVACCultraGFP. Интактная плазмида высвобождалась из клеток через 30-40 мин индукции. Плазмиду из неиндуцированных и индуцированных геном Е phiX174 + pDNAVACCultra-GFP осадков экстрагировали PI, ТЕ, PBS, ЕВ (10 мМ Tris, pH 8,5), ВВ (50 мМ РО 4, 300 мМ NaCl) или 10 мМMgCl2. Плазмиду и РНК и геномную ДНК экстрагировали при всех этих условиях (фиг. 16). При использовании PI или ЕВ экстрагировали основную массу плазмиды, причем небольшое количество плазмиды оставалось в клеточном осадке после экстракции (сравните дорожки В 2 и В 1, фиг. 16). Высвобождение плазмиды в ЕВ демонстрирует, что для указанного высвобождения не требуется ЭДТА. Это полезно,поскольку позволяет обработку без индуцированного ЭДТА высвобождения липополисахаридов (ЛПС) в процессе обработки.- 14010864 Наблюдали некоторые различия в относительной экстракции плазмиды и геномной ДНК, и целостности РНК. Например, при использовании ВВ, 10 мМ MgCl2 и PBS экстрагировалось меньше РНК, тогда при использовании 10 мМ MgCl2 как экстрагировалось меньше геномной ДНК и плазмиды. Эти солевые и катионные эффекты могут быть оптимизированы для увеличения чистоты высвобождаемой плазмиды. Высвобождение pDNAVACCultra-GFP путем экспрессии PhiX174 гена Е в присутствии спермина определяли путем сравнения высвобождения плазмиды в неиндуцированных, индуцированных и индуцированных клетках +10 или 30 мМ спермина. Высвобождение плазмиды и геномной ДНК в LB ингибировали с помощью 30 мМ спермина и частично ингибировали с помощью 10 мМ. РНК не обнаруживалась в общем осадке или каких-либо элюированиях с использованием 30 мМ спермина. Клетки, обработанные спермином, были устойчивы к экстракции плазмиды с использованием PI, ТЕ или ЕВ, но некоторое количество плазмиды экстрагировалось из клеток, обработанных 30 мМ спермином с PBS, ВВ (50 мМ РО 4, 300 мМ NaCl) или 10 мМ MgCl2. Когда индуцированные клетки инкубировали в течение ночи при КТ, наблюдалось высвобождение плазмиды в среды при всех трех индуцирующих условиях. Большее количество РНК высвобождалось (или компактизировалось) при использовании спермина,и наблюдалось очень небольшое образование одноцепочечных разрывов в плазмиде после инкубации в течение ночи в LB. Это указывало на то, что высвободившаяся плазмида стабильна при хранении в средах. Высвобождение плазмиды, опосредованное геном Е PhiХ 174, тестировали в 30 минутных инкубациях клеточных осадков при КТ, 37 С, 55 С и 65 С в буфере PI или 50 мМ Tris, 10 мМ MgCl2, рН 8,0. Высвобождение и целостность плазмиды не изменялись при КТ, 37 С или 55 С, некоторый лизис происходил при 65 С в PI с образованием одноцепочечных разрывов в плазмиде и увеличении уровня геномной ДНК. Некоторое расщепление РНК наблюдали при 37 С по сравнению с КТ в PI, но не в Tris/Mg. Суммарно, эти результаты демонстрируют, что высвобождение плазмиды, индуцированное лизирующим белком, кодируемым геном Е, осуществимо для высвобождения интактной плазмиды из клеток с высоким выходом. Высвобождение плазмиды можно контролировать путем изменения ионной силы/рН экстрагирующего буфера со спермидином или без него, или другими компактизаторами в средах. Плазмида стабильна при высвобождении в среды или экстрагирующий буфер. Также продемонстрировано, что клеточный буфер может быть заменен множеством буферов для высвобождения плазмиды в условиях, обеспечивающих оптимальное ферментативное удаление геномной ДНК/РНК. Однако высокие уровни геномной ДНК и РНК высвобождаются при использовании данного способа. Пример 14. Удаление геномной ДНК и РНК, высвобождаемой при образовании клеточных "теней",индуцированном лизирующим белком, кодируемым геном Е. Уменьшение содержания РНК и геномной ДНК с помощью нуклеазы. Готовили и оценивали пять клеточных линий: 1) pACYC-B-gene E; 2) pACYC-B-gene Е +pVEXBT5RNase. pVEXBT5RNase представляет собой имеющую умеренную копийность устойчивую к ампициллину плазмиду с ориджином рМВ 1, совместимую с плазмидами pACYC, которая содержит индуцируемую арабинозой нуклеазу, обладающую активностью против РНК, геномной ДНК, но не против суперспиральной плазмиды. Культуры либо не индуцировали, либо выращивали в течение 70 мин после индукции (0,2% арабиноза для индукции как гена Е и Т 5 РНКазы), и с помощью электрофореза в геле оценивали содержание нуклеиновых кислот в супернатантах культуры и осмотический шок клеточных осадков. У индуцированных клеточных линий, содержащих лизирующий белок, кодируемый PhiX174 геном Е, иpVEXBT5RNase, в среды высвобождалось существенно меньше геномной ДНК при индукции T5RNase. Тот же самый эффект наблюдался в клеточных осадках, подвергшихся осмотическому шоку, (5 мМMgSO4, данные не представлены). Высвобождение геномной ДНК из неиндуцированных клеток происходит вследствие не полностью блокированной экспрессии лизирующего белка, вызывающего образование клеточных "теней" при высоких значениях OD600, используемых в этом эксперименте для неиндуцированного контроля. Показано, что ко-экспрессия Т 5 РНКазы разрушает геномную ДНК, высвобождаемую вследствие экспрессии гена Е, и может быть использована для улучшения чистоты высвобожденной плазмиды и уменьшения вязкости лизата. Пример 15. Получение плазмидной ДНК с использованием автолиза, опосредованного белком, кодируемым PhiX174 геном Е. Для получения плазмиды может быть необходимо, чтобы в геном была интегрирована экспрессия пориновых генов. Экспрессия поринового гена может контролироваться индуцируемыми промоторами. Предпочтительные индуцируемые промоторы включают, без ограничения ими, лямбда PR и PL, другие фаговые промоторы, такие как Т 5, Т 7, синтетические промоторы, такие как tac и trc, эндогенные промоторы, такие как lac, промоторы холодового шока (cspA), araBAD, промоторы стационарной фазы или истощения, промоторы, чувствительные к скорости роста (rmf), pH (cadA) или кислородному голоданию. Индукция может быть вызвана повышенной температурой (PL, tac), понижением температуры (cspA; промотор холодового шока) с термостабильными репрессорами (лямбда репрессор, lac репрессор), ин- 15010864 дукторами (IPTG для tac, trc и lac; арабиноза для AraBAD) или другими средствами (например введение в стационарную фазу, сдвиг рН или кислорода, истощение глюкозы или аминокислот; обзор в: MakridesS.C. 1996 Microbiol. Rev. 60:512-538). Альтернативно, ген можно индуцировать регулируемой антисмысловой РНК. Разработаны различные индуцируемые системы экспрессии гена Е phiX174, регулируемые теплом (мутировавший лямбда PR, регулируемый С 1857; Jechlinger W., Szostak M.P., Witte A., and Lubitzlac или фаговыми регуляторами, Jechlinger W., Szostak M.P. and Lubitz W. 1998 Gene 218: 1-7) или химическими веществами (лактоза или IPTG с lacPO/Ptac или 3MBZ с xylS репрессор-PTol). Высвобождение плазмиды в среды может быть индуцировано экспрессией гена Е. Добавление буферов непосредственно в среды может быть использовано для увеличения высвобождения или избирательности. Клеточная масса затем может быть удалена фильтрацией или центрифугированием, при этом плазмида остается в осветленном бульоне. Содержание геномной ДНК и РНК в осветленном растворе может быть уменьшено путем применения нуклеазы (или включенной в геном штамма и экспрессирующейся в клеточной линии, или добавляемой экзогенно). Альтернативно, содержание примесей РНК и геномной ДНК может быть уменьшено путем использования существующих известных способов, таких как избирательная денатурация или деградация путем температурной или щелочной обработки осветленного бульона. В этом случае после образования "теней" происходит удаление геномной ДНК и РНК из осветленной культуры, а не полный клеточный лизис, и высвобождение клеточных компонентов, таких как ЛПС, может быть уменьшено. Высвобождение плазмиды из клеток также может быть осуществлено без хелатора металлов, такого как ЭДТА, для дальнейшего уменьшения выделения ЛПС из клеточных "теней". Компактизаторы, такие как полиэтиленгликоль(ПЭГ), или СТАВ, или двухвалентные катионы, такие как CaCl2, могут быть использованы для селективной очистки плазмидной ДНК от примесей геномной ДНК и РНК. Такие способы уменьшения содержания геномной ДНК или РНК известны в уровне техники. Альтернативно, высвобождение плазмиды может быть замедлено путем включения агентов, изменяющих жесткость мембраны (например 0,2 М MgSO4) или увеличивающих компактизацию ДНК (например, спермина) до или после индукции гена Е. Окончательная популяция клеток может быть собрана,и буфер может быть заменен на буфер, облегчающий высвобождение плазмиды (например, в случаеMgSO4 путем уменьшения концентрации Mg). Пример 16. Получение плазмидной ДНК с использованием автолиза, опосредованного антибиотиками. Оценивали альтернативный способ автолиза, в котором используют антибиотики, ингибирующую синтез клеточной стенки. Кассету Т 5 РНКаз в конструкции pVEXBOmpAT5RNase переносили в конструкцию pACYCB. Культуры pACYCBTSRNase или pACYCBNative stuffer (контроль), каждая из которых ко-трансформирована плазмидой gWizGFP, выращивали в LB + 50 мкг/мл канамицина + 34 мкг/мл хлорамфеникола + 4 мМ MgSO4, экспрессию белка индуцировали арабинозой до конечной концентрации 0,2% в течение 1 ч при 30 С в середине фазы логарифмического роста, и клеточный автолиз индуцировали путем добавления ампициллина и цефотаксима (Fluka) (В-лактамовые антибиотики) до конечных концентраций соответственно 100 и 10 мкг/мл. Культуры встряхивали в течение ночи при 30 С для осуществления лизиса и расщепления нуклеазой. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием, и содержание нуклеиновой кислоты в супернатанте оценивали путем электрофореза в агарозном геле (окрашивание SYBR green II) после экстракции фенолом и хлороформом для удаления белков. Уровень геномной ДНК значительно уменьшался в штамме T5RNase, но не в контроле. Оставшуюся геномную ДНК удаляли посредством инкубации (37 С, 30 мин). Не наблюдалось уменьшения содержания плазмиды, несмотря на удлиненную инкубацию лизированной культуры при повышенных температурах. Как ожидалось, вязкость лизата значительно уменьшалась при использовании клеточной линии T5RNase по сравнению с контрольной клеточной линией. Эти результаты демонстрируют общую применимость комбинации нуклеаз, безопасных для плазмиды, с различными способами автолиза для получения плазмид. Таким образом, очевидно, что нуклеазы, безопасные для плазмиды, и ассоциированные способы продуцирования по изобретению обеспечивают композиции и способы для улучшенного получения плазмид. Хотя вышеприведенное описание содержит множество особенностей, их следует рассматривать не как ограничения изобретения, а как примеры одного из предпочтительных воплощений изобретения. Возможно множество других вариантов. Например, наблюдалось уменьшение содержания геномной ДНК с использованием эндогенных экзонуклеаз (recBCD), когда разрывы хромосом индуцируют путем использования рестрикционных эндонуклеаз (Hanak and Ward, 2001) или гамма-излучения (MacPhee et.al., 1988). Эти концы затем являются субстратом для эндогенных нуклеаз. В этом формате клетки продолжают расти после индукции разрывов хромосом (в течение ночи при излучении). Это плохо работает при использовании эндогенной экзонуклеазной активности для избавления от ДНК, и может быть значительно улучшено путем применения безопасных для плазмиды эндонуклеаз по изобретению.- 16010864 Соответственно, объем изобретения должен быть определен не проиллюстрированными воплощениями, а прилагаемой формулой изобретения и ее правовыми эквивалентами. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ продуцирования ковалентно замкнутой суперспиральной плазмидной ДНК, включающий стадии: А) введения гена, кодирующего одну или более чем одну безопасную для плазмиды нуклеазу в геном Е.coli; и Б) направления продуцирования указанных нуклеаз с введенных генетических последовательностей таким образом, что ферменты направляются в периплазматическое пространство с помощью сигнального пептида или эквивалентным образом; В) выращивания клеток Е.coli в присутствии ДНКрепликона, такого как плазмидный, космидный репликон или репликон бактериальной искусственной хромосомы; Г) введения нуклеаз(ы) в содержимое цитоплазмы таким образом, что геномная ДНК E.coli расщепляется, а введенный ДНК-репликон не расщепляется; и Д) очистки введенного ДНК-репликона от бактериального содержимого; где указанный способ увеличивает чистоту плазмиды. 2. Способ по п.1, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) содержит(ат) один или более чем один химерный фермент. 3. Способ по п.1, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) включает(ют) ДНКазу, по меньшей мере, с фрагментом фермента РНКазы в качестве партнера слияния. 4. Способ по п.1, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) вкпючает(ют) химерный фермент,представляющий собой продукт слияния экзонуклеазы D15 фага Т 5 с РНКазой А. 5. Способ по п.1, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) включает(ют) химерный фермент,представляющий собой продукт слияния экзонуклеазы D15 фага Т 5 с РНКазой S. 6. Способ продуцирования ковалентно замкнутой суперспиральной плазмидной ДНК, включающий стадии: А) введения гена, кодирующего одну или более чем одну безопасную для плазмиды нуклеазу в геном Е.coli; Б) направления продуцирования указанных нуклеаз с введенных генетических последовательностей таким образом, что ферменты направляются в периплазматическое пространство с помощью сигнального пептида или эквивалентного способа; В) выращивания клеток E.coli в присутствии ДНКрепликона, такого как плазмидный, космидный репликон или репликон бактериальной искусственной хромосомы; Г) аутолиза клеток таким образом, что геномная ДНК E.coli расщепляется, а введенный ДНК-репликон не расщепляется; и Д) очистки введенного ДНК-репликона от бактериального содержимого; где указанный способ увеличивает чистоту плазмиды. 7. Способ по п.6, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) содержит(ат) один или более чем один химерный фермент. 8. Способ по п.6, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) содержит(ат) химерный фермент,представляющий собой продукт слияния экзонуклеазы D15 фага Т 5 с РНКазой А. 9. Способ по п.6, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) включает(ют) химерный фермент,представляющий собой продукт слияния экзонуклеазы D15 фага Т 5 с РНКазой S. 10. Способ по п.6, где безопасная(ые) для плазмиды нуклеаза(ы) содержит(ат) ДНКазу, по меньшей мере, с фрагментом фермента РНКазы в качестве партнера слияния. 11. Способ по п.6, где аутолиз осуществляют с использованием фаговых лизирующих белков. 12. Способ по п.6, где аутолиз осуществляют с использованием антибиотиков. 13. Композиция, содержащая один или более чем один бактериальный штамм, включающая: А) по меньшей мере одну безопасную для плазмиды нуклеазу, такую как экзонуклеаза D15 Т 5, с одним или более партнерами слияния или без них; и Б) по меньшей мере одну плазмиду, где безопасную для плазмиды нуклеазу используют для увеличения чистоты плазмиды, полученной в результате очистки. 14. Композиция по п.13, где безопасная для плазмиды нуклеаза представляет собой экзонуклеазу