Применение вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии “масло в воде” для индуцирования сd4 т-клеточного ответа и/или улучшенного ответа, основанного на в-клетках памяти

011393 Область изобретения Настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и схемам вакцинации для иммунизации против гриппа. В частности, изобретение относится к вакцинным композициям,содержащим адъювант на основе эмульсии масло в воде и, возможно, 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-МФЛ), их применению в медицине, в частности их применению в усилении иммунных ответов на антигены вируса гриппа, и к способам приготовления, где эмульсия масло в воде содержит стерин, метаболизируемое масло и эмульгатор. Предшествующий уровень техники Вирусы гриппа являются одними из наиболее повсеместно распространенных вирусов, представленных в мире, поражающих людей и домашний скот. Грипп приводит в результате к экономическому бремени, заболеваемости и даже смертности, которые являются важными. Вирус гриппа представляет собой РНК-содержащий оболочечный вирус, имеющий размер частиц приблизительно 125 нм в диаметре. Он состоит в основном из внутреннего нуклеокапсида или коры рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированного с нуклеопротеином, окруженного вирусной оболочкой, имеющей структуру липидного бислоя и внешних гликопротеинов. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из белков матрикса, а внешний слой - в основном из липидного материала организма хозяина. Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена: гликопротеины нейраминидазу (NA) и гемагглютинин (HA), которые выглядят в виде зубцов длиной 10-12 нм на поверхности частиц. Именно эти поверхностные белки, в особенности гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов вируса гриппа. Эти поверхностные антигены постепенно, иногда быстро претерпевают некоторые изменения, приводящие к антигенным вариациям вируса гриппа. Эти антигенные изменения, названные дрейфы и смещения являются непредсказуемыми и могут оказывать значительное воздействие с иммунологической точки зрения, поскольку они в конечном счете ведут к возникновению новых штаммов вируса гриппа и к тому, что обеспечивают вирусу возможность избегать воздействия иммунной системы, вызывая хорошо известные, почти ежегодные эпидемии. Штаммы вируса гриппа, подлежащие включению в противогриппозную вакцину, каждый сезон определяет Всемирная организация здравоохранения в сотрудничестве с руководящими органами национального здравоохранения и производителями вакцин.HA представляет собой наиболее важный антиген при определении серологической специфичности различных штаммов вируса гриппа. Этот белок массой 75-80 кДа содержит множество антигенных детерминант, некоторые из которых находятся в областях, которые претерпевают изменения последовательности в различных штаммах (штамм-специфические детерминанты), а другие находятся в областях,которые обычны для множества молекул HA (общие для детерминант). Вирусы гриппа вызывают эпидемии почти каждую зиму, причем уровни инфекции для вируса типаA или B составляют 40% в течение шестинедельного периода. Инфекция вирусом гриппа приводит в результате к различным болезненным состояниям из субклинической инфекции от слабой инфекции верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Типичные эпидемии, вызванные вирусом гриппа, вызывают увеличение частоты пневмонии и респираторного заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствуют увеличенные уровни госпитализации или смертности. Тяжесть заболевания прежде всего определяется возрастом хозяина, его иммунным статусом и сайтом инфекции. Пожилые люди в возрасте 65 лет и старше особенно восприимчивы, составляя 80-90% всех смертей, связанных с вирусом гриппа в развитых странах. Индивиды, страдающие от скрытых хронических заболеваний, также наиболее вероятно подвержены таким осложнениям. Маленькие дети также могут страдать от тяжелого заболевания. Таким образом, эти группы в особенности должны быть защищены. Помимо этих групп в состоянии риска руководствам системы здравоохранения также рекомендуется вакцинировать здоровых взрослых людей, находящихся в контакте с пожилыми людьми. Вакцинация играет критическую роль при контроле ежегодных эпидемий вируса гриппа. Имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины представляют собой или инактивированную, или живую ослабленную противогриппозную вакцину. Инактивированные противогриппозные вакцины состоят из трех возможных форм антигенного препарата: инактивированный целый вирус, субвирионы, в которых очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для растворения липидной оболочки (так называемая "убиквиторная" вакцина), или очищенные HA и NA (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в.м.) или интраназально(и.н.). Противогриппозные вакцины всех типов обычно представляют собой тривалентные вакцины. Они,как правило, содержат антигены, полученные из двух штаммов вируса гриппа A и одного штамма вируса гриппа B. Стандартная инъецируемая доза 0,5 мл в большинстве случаев содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма, измеренная путем одномерной радиальной иммунодиффузии (SRD) (J.M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subjunitBiol. Stand. 9, (1981), 317-330). Имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины рассматривают как безопасные для всех возрастных групп (De Donato et al., 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Тем не менее, имеется небольшое свидетельство того, что имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины действуют у маленьких детей в возрасте до двух лет. Кроме того, уровни эффективности вакцин, о которых сообщают,для предотвращения типичной подтвержденной заболеваемости вирусом гриппа составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже чем уровни эффективности 60-90%, о которых сообщалось для более молодых взрослых людей (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc, 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern.Med. 123, 523-527). Показано, что эффективность противогриппозной вакцины коррелирует с сывороточными титрами антител, ингибирующими гемагглютинацию (HI), к вирусному штамму и в нескольких исследованиях обнаружили, что более пожилые взрослые люди демонстрируют меньшие титры HI после иммунизации вирусом гриппа по сравнению с более молодыми взрослыми людьми (Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439). Таким образом, сохраняется необходимость в новых вакцинах, обладающих улучшенной иммуногенностью. Приготовление вакцинного антигена с сильными адъювантами представляет собой возможный подход для усиления иммунных ответов на антигены субвириона. Субъединичная противогриппозная вакцина с адъювантом MF59 в виде эмульсии масло в воде имеется в продаже, и продемонстрирована ее способность индуцировать более высокий титр антител по сравнению с полученными при использовании субъединичной вакцины без адъюванта (De Donato et al.,1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Тем не менее, в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала свой улучшенный профиль по сравнению с субъединичной вакциной без адъюванта(Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289). Все еще сохраняется необходимость в улучшенных противогриппозных вакцинах, в особенности в популяции пожилых людей. Изложение сущности изобретения В первом аспекте настоящего изобретение предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции для индуцирования по меньшей мере 1) улучшенного CD4 T-клеточного иммунного ответа, 2) улучшенного ответа на основе B-клеток памяти против указанного вируса или антигенной композиции у человека, где указанная эмульсия масло в воде содержит метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор. Подходяще, указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В конкретном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет капли масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеет диаметр меньше 1 мкм. В конкретном воплощении иммуногенная композиция способна индуцировать как улучшенныйCD4 T-клеточный иммунный ответ, так и улучшенный ответ на основе B-клеток памяти по сравнению с полученным с антигеном без адъюванта или антигенной композицией без адъюванта. Во втором аспекте настоящего изобретения предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человеческого индивида с ослабленным иммунитетом или популяции с ослабленным иммунитетом, такой как взрослый с высоким риском или пожилой человек, против вируса гриппа, где указанная эмульсия масло в воде содержит метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор. В предпочтительном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм. В третьем аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом, приготовленным с адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, подходящим образом альфатокоферол и эмульгатор. Предпочтительно ревакцинацию осуществляют у субъектов, которые были вакцинированы в предшествующий сезон против вируса гриппа. Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев. Предпочтительно, предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде, содержащего метаболизируемое масло, стерин(такой как альфа-токоферол) и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде, где указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде содержит-2 011393 по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм. В еще одном предпочтительном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат, несущий общиеCD4 T-клеточные эпитопы или общие B-клеточные эпитопы, или оба с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. В четвертом аспекте настоящего изобретения предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, представляющим собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа. В предпочтительном воплощении указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, из которых по меньше мере 70% по интенсивности имеют диаметры меньше 1 мкм. В еще одном аспекте предложен способ вакцинации человеческого индивида с ослабленным иммунитетом или популяции с ослабленным иммунитетом, такого как взрослые люди с высоким риском или пожилые люди, иммуногенной композицией, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии масло в воде, как определено выше. В еще одном воплощении изобретения предложен способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащим метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор, где указанный способ включает введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа с адъювантом или без адъюванта. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В еще одном воплощении предложен способ вакцинации человеческой популяции или индивида против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против варианта штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку:(1) первой композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъюванта на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло,стерин и эмульгатор, и(2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариант штамма вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В еще одном воплощении в изобретении предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло,стерин и эмульгатор. Подходящим образом, указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В еще одном аспекте изобретения предложен способ разработки противогриппозной вакцины,включающий: 1) выбор антигена вируса гриппа, содержащего CD4+ эпитопы, и 2) объединение указанного антигена вируса гриппа с эмульсией масло в воде, как определено выше, где указанная вакцина после введения млекопитающему способна индуцировать усиленный CD4 ответ у указанного млекопитающего. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения дополнительно описаны в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Распределение размера масляных капель в SB62 эмульсии масло в воде, измеренное путем фотон-корреляционной спектроскопии (ФКС). Фиг. 1 А демонстрирует измерения размера SB62 партия 1023 с использованием Malvern Zetasizer 3000HS: A = разведение 1/10000 (регистрация 22-24) (анализ в Contin и адаптированной оптической модели 1,5/0,01); Б = разведение 1/20000 (регистрация 28-30) (анализ в Contin и адаптированной оптической модели 1,5/0,01). Фиг. 1 Б демонстрирует схематическую иллюстрацию регистрации 22 (верхняя часть) и регистрации 23 (нижняя часть) по интенсивности. Фиг. 2. Схематическая иллюстрация препарата партии МФЛ. Фиг. 3. Схематическая иллюстрация препарата адъюванта AS03+МФЛ. Фиг. 4. Клиническое испытание Explo Flu-001. CD4 T-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа (Q1 = первая квартиль, Q3 = третья квартиль). Фиг. 5. Клиническое испытание Explo Flu-001. CD 8T-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа (Q1 = первая квартиль, Q3 = третья квартиль). Фиг. 6. Клиническое испытание Explo Flu-001. Перекрестно-реактивный CD4 T-клеточный ответ на убиквиторный антиген вируса гриппа после вакцинации Fluarix + AS03. Фиг. 7. Клиническое испытание Explo Flu-001. Ответ на основе B-клеточной памяти после вакцинации.-3 011393 Фиг. 8. Клиническое испытание Explo Flu-002. CD4 T-клеточный ответ против убиквиторного антигена вируса гриппа после ревакцинации. Фиг. 9. Клиническое испытание Explo Flu-002. Титры антител против HI после ревакцинации. Фиг. 10. Исследование на хорьках I. Контроль температуры (примирование и контрольное заражение). Фиг. 10 А представляет собой примирование. Фиг. 10 Б представляет собой контрольное заражение. Фиг. 11. Исследование на хорьках I. Выделение вируса. Фиг. 12. Исследование на хорьках II. Контроль температуры (примирование и контрольное заражение). Фиг. 12 А представляет собой примирование. Фиг. 12 Б представляет собой контрольное заражение. Фиг. 13. Исследование на хорьках II. Выделение вируса. Фиг. 14. Исследование на хорьках II. Фиг. 14 А Титры HI к H3N2 A/Panama (вакцинный штамм). Фиг. 14 Б Титры HI к H3N2 A/Wyoming (штамм для контрольного заражения). Фиг. 15. Исследование на мышах. Частоты CD4 T-клеток в C57BI/6 примированных мышах с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации). Фиг. 16. Исследование на мышах. Частоты CD8 T-клеток в C57BI/6 примированных мышах с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации). Фиг. 17. Исследование на мышах. Частоты CD4 (верхняя часть) и CD8 (нижняя часть) T-клеток у мышей C57BI/6, примированных гетерологическими штаммами с использованием полного инактивированного вируса в качестве рестимулирующего антигена (7 день после иммунизации). Фиг. 18. Клиническое испытание на людях. Ответ на основе B-клеточной памяти после вакцинации пожилых людей с использованием Fluarix, Fluarix+AS03, Fluarix+AS03+МФЛ (различие между до и после). Фиг. 19. Исследование на хорьках III. Контроль температуры до и после контрольного заражения. Фиг. 20. Исследование на хорьках III. Выделение вируса до и после контрольного заражения. Фиг. 21. Исследование на хорьках III. Титры HI на H3N2 A/Woming (вакцинный штамм). Фиг. 22. Исследование на хорьках III. Титры HI на H3N2 A/Panama (штамм для контрольного заражения). Фиг. 23. Клиническое испытание на людях. Титры HI (геометрические средние титры (ГСТ на 21,90 и 180 день после вакцинации (персистенция). Фиг. 24. Клиническое испытание на людях. CD4 ответ - все тесты в двух параллелях. Совокупные антигены на 21, 90 и 180 день после вакцинации (персистенция). Фиг. 25. Клиническое испытание на людях. Титры HI в клиническом испытании с ревакцинациейAS03+МФЛ по сравнению с Fluarix. Фиг. 26. Клиническое испытание на людях. КОИ для CD4 ответа - все тесты в двух параллелях Совокупные антигены на 0 и 21 день. Фиг. 27. Клиническое испытание на людях с использованием AS03+МФЛ в двух концентрациях. Титры HI на 0 и 21 день. Фиг. 28. Клиническое испытание на людях с использованием AS03+МФЛ в двух концентрациях. Реактогенность. Подробное описание изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что противогрипозная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, способна улучшать CD4 T-клеточный иммунный ответ и/или ответ на основе B-клеточной памяти против указанного антигена или антигенной композиции у человека по сравнению с полученным при применении вируса или его антигенного препарата без адъюванта. Заявленные композиции благоприятно используют для индукции CD4 T-клеточного ответа против вируса гриппа, который способен обнаруживать эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) II класса. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективно нацеливать клеточно-опосредованную иммунную систему для усиления ответа против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа(после вакцинации и инфицирования). Адъювантные противогриппозные композиции по изобретению обладают несколькими преимуществами: 1) улучшенная иммуногенность: дает возможность для восстановления слабого иммунного ответа у пожилых людей (в возрасте более 50 лет, типично в возрасте старше 65 лет) до уровней, которые обнаружены у молодых людей (ответы в виде антител и/или T-клеточные ответы);-4 011393 2) улучшенный профиль перекрестной защиты: улучшенная перекрестная защита против вариантов(дрейфующих) штаммов вируса гриппа; 3) возможность для использования уменьшенной дозы антигена для достижения похожего ответа,таким образом обеспечивая улучшенную способность в случае чрезвычайных ситуаций (например, пандемии). В частности, композиции по настоящему изобретению способны обеспечивать более хорошую сывороточную защиту против вируса гриппа после ревакцинации, оцениваемую тем, что количество людей,столкнувшихся с вирусом гриппа, коррелирует с защитой. Кроме того, композиция для применения в настоящем изобретении также способна вызвать тенденцию более сильного ответа на основеB-клеточной памяти после первой вакцинации человека и более сильного гуморального ответа после ревакцинации по сравнению с неадъювантной композицией. Авторы настоящего изобретения также способны продемонстрировать, что заявленная адъювантная композиция способна не только вызвать, но также поддерживать защитные уровни антител против всех трех штаммов, представленных в вакцине, у большей части индивидов по сравнению с полученными при использовании неадъювантной композиции (например, см. табл. 43). Таким образом, в еще одном воплощении заявленная композиция способна обеспечивать персистентный иммунный ответ против заболевания, связанного с вирусом гриппа. В частности, под персистентностью понимают иммунный ответ в виде антител HI, который способен удовлетворять критериям по меньшей мере после 3 месяцев, предпочтительно по меньшей мере после 6 месяцев после вакцинации. В частности, заявленная композиция способна вызвать защитные уровни антител у более чем 70% индивидов, подходящим образом более чем у 80% индивидов или подходящим образом более чем у 90% индивидов, по меньшей мере, в отношении одного штамма вируса гриппа, предпочтительно для всех штаммов, представленных в вакцине, по меньшей мере после 3 месяцев. В специфическом аспекте защитные уровни антител больше 90% получают по меньшей мере через 6 месяцев после вакцинации против по меньшей мере одного, подходящим образом двух или всех штаммов, представленных в вакцинной композиции. Штаммы и антигены вируса гриппа. Вирус гриппа или его антигенный препарат для применения по настоящему изобретению может представлять собой убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат. В альтернативном воплощении препарат вируса гриппа может содержать другой тип инактивированного антигена вируса гриппа, такой как инактивированный полный вирус, или очищенная HA и NA (субъединичная вакцина), или виросома вируса гриппа. В еще одном воплощении вирус гриппа может представлять собой живой ослабленный препарат вируса гриппа. Убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат для применения по настоящему изобретению подходящим образом представляет собой инактивированный вирусный препарат, где вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для растворения липидной оболочки. Убиквиторный вирус или его убиквиторный антигенный вирусный препарат подходящим образом готовят путем фрагментации полного вируса гриппа, инфекционного или инактивированного, растворяющими концентрациями органических растворителей или детергентов и последующего удаления всех или большей части растворяющего агента и некоторой части или большей части вирусного липидного материала. Под убиквиторным вирусным антигенным препаратом понимают убиквиторный вирусный препарат, который мог претерпеть некоторую степень очистки по сравнению с убиквиторным вирусом, в то же время сохраняя большую часть антигенных свойств убиквиторных вирусных компонентов. Например, когда вирус получают в яйцах, убиквиторный вирус может быть отделен от белков-примесей из яйца, или когда получают в клеточной культуре, убиквиторный вирус может быть отделен от примесей клеток хозяев. Убиквиторный вирусный антигенный препарат может содержать убиквиторные вирусные антигенные компоненты более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие убиквиторный вирус (названные убиквиторная противогриппозная вакцина) или убиквиторные вирусные антигенные препараты, как правило, содержат остаточный белок матрикса и нуклеопротеин и иногда липид, а также мембранные оболочечные белки. Такие убиквиторные вирусные вакцины обычно содержат большую часть или все вирусные структурные белки, хотя не обязательно в тех же самых пропорциях, как в полном вирусе. Альтернативно, вирус гриппа может находиться в форме вакцины на основе полного вируса. Это может свидетельствовать о преимуществе по сравнению с убиквиторной вирусной вакциной в случае пандемии, поскольку позволяет избежать неопределенности в том, может ли убиквиторная вирусная вакцина успешно получена для нового штамма вируса гриппа. Для некоторых штаммов обычные детергенты, использованные для продукции убиквиторного вируса, могут разрушать вирус и делать его неприменимым. Хотя всегда имеется возможность применения различных детергентов и/или разработки различного способа продукции убиквиторной вакцины, это может занять время, которое может отсутствовать в ситуации пандемии. Дополнительно к большей степени определенности при использовании подхода полного вируса также имеется большая степень продукции вакцины по сравнению с убиквиторным вирусом, поскольку значительные количества антигена теряются во время дополнительных стадий очистки,-5 011393 необходимых для приготовления подходящей убиквиторной вакцины. В еще одном воплощении получают вирус гриппа в форме очищенной субъединичной противогриппозной вакцины. Субъединичные противогриппозные вакцины, как правило, содержат два основных оболочечных белка HA и NA и могут обладать дополнительным преимуществом по сравнению с вакцинами на основе полного вириона, так как они, как правило, менее реактогенны, в частности, у молодых вакцинированных пациентов. Субъединичные вакцины могут быть получены рекомбинантно или очищены из разрушенных вирусных частиц. В еще одном воплощении препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические одноламеллярные везикулы, которые сохраняют функциональные вирусные оболочечные гликопротеины HA и NA в оригинальной конформации, встроенной в фосфолипидную бислойную мембрану виросом. Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть получен из яиц или из тканевой культуры. Например, антиген вируса гриппа или его антигенные препараты по изобретению могут быть получены в результате применения обычного способа с развивающимся эмбрионом путем выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть собраны в большом количестве в сокращенный срок. Альтернативно, они могут быть получены из любых новых способов генерации с использованием тканевой культуры для выращивания вируса или экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для роста вируса включают, например, клетки почки собаки, такие как клетки почки Мадина Дарби (MDCK) или клетки клонаMDCK, MDCK-подобных клеток, клетки почки обезьяны, такие как клетки AGMK, включающие клеткиVero, подходящие линии свиных клеток, или любой клеточный тип другого млекопитающего, подходящего для продукции вируса гриппа для задач вакцин. Подходящие клеточные субстраты также включают человеческие клетки, например клетки MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничиваются клеточными линиями; например, также включены первичные клетки, такие как фибробласты эмбриона цыпленка и клеточные линии птиц. Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат может быть получен при помощи любого из множества коммерчески применимых способов, например способа split flu, описанного в патентеDD 300833 и DD 211444, включенном здесь путем ссылки. Традиционно, split flu получали с использованием обработки сольвентом/детергентом, таким как три-н-бутилфосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Tween (известной как расщепление "Tween-простой эфир"), и этот способ до настоящего времени используют в некоторых средствах производства. Другие используемые в настоящее время расщепляющие агенты включают детергенты или протеолитические ферменты либо соли желчных кислот,например дезоксихолат натрия, как описано в патентеDD 155875, включенном здесь путем ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (CTAB), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, такие как описанные выше, включающиеTriton Х-100 (например, в способе, описанном в Una et al., 2000, Biologicals 28, 95-103) и Triton N-101 или комбинации любых двух или более чем двух детергентов. Способ приготовления убиквитоной вакцины может включать множество различных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, таких как стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации,зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной) в различных комбинациях,и, возможно, стадию инактивации, например теплом, формальдегидом или парапропиолактоном или ультрафиолетовым излучением (УФ), которая может быть осуществлена перед или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен в виде партии, непрерывного или полунепрерывного способа. Предпочтительный способ расщепления и очистки убиквиторной иммуногенной композиции описан в WO 02/097072. Предпочтительные антигенные препараты вакцины split flu по изобретению содержат остаточное количество Tween 80 и/или Triton X-100, оставшееся после способа получения, хотя они могут быть добавлены или их концентрации скорректированы после приготовления убиквиторного антигена. Предпочтительно представлены Tween 80 и Triton X-100. Предпочтительные диапазоны конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в дозе вакцины составляют:Triton X-100: от 0,001 до 0,1% (мас./об.), предпочтительнее от 0,005 до 0,02% (мас./об.). В специфическом воплощении конечная концентрация Tween 80 составляет от 0,045-0,09%(мас./об.). В еще одном специфическом воплощении антиген предложен в 2-кратной концентрированной смеси, которая имеет концентрацию Tween 80 в диапазоне 0,045-0,2% (мас./об.) и должна быть разведена в два раза после конечного приготовления адъювантом (или буфером в контрольном препарате). В еще одном специфическом воплощении конечная концентрация Triton Х-100 составляет 0,0050,017% (мас./об.). В еще одном специфическом воплощении антиген предложен в виде 2-кратной концентрированной смеси, которая имеет концентрацию Triton X-100 в диапазоне 0,005-0,034% (мас./об.) и должна быть разведена вдвое до конечной концентрации адъювантом (или буфером в контрольном пре-6 011393 парате). Предпочтительно противогриппозный препарат готовят в присутствии низкого уровня тиомерсала или предпочтительно в отсутствии тиомерсала. Предпочтительно получающийся в результате противогриппозный препарат стабилен в отсутствии ртутьорганических консервантов, в частности препарат не содержит остаточного тиомерсала. В частности, противогриппозный препарат содержит гемагглютининовый антиген, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (как правило, 5 мкг/мл или меньше). Специфически стабилизацию B штамма вируса гриппа осуществляют при помощи производного альфа-токоферола, такого как альфа-токоферола сукцинат (также известный как витамина E сукцинат т.е. VES). Такие препараты и способы их приготовления раскрыты вWO 02/097072. Предпочтительная композиция содержит три инактивированных антигена расщепленного вириона,полученные из штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения, подходящего сезонного вируса гриппа. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии масло в воде содержатся в одном и том же контейнере. Это называют однофлаконным подходом. Предпочтительно флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии масло в воде содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и смешиваются непосредственно перед или после введения субъекту. Он назван как двухфлаконный подход. В качестве примера, когда вакцина представляет собой двухкомпонентные вакцины для общего объема дозы 0,7 мл, концентрированные антигены(например, концентрированные тривалентные инактивированные антигены расщепленного вириона) представлены в одном флаконе (335 мкл) (контейнер с антигеном), и предварительно заполненный шприц содержит адъювант (360 мкл) (контейнер с адъювантом). В момент инъекции содержимое флакона, содержащего концентрированные антигены инактивированного расщепленного вириона, удаляют из флакона путем использования шприца, содержащего адъювант, с последующим мягким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют внутримышечной иглой и объем корректируют до 530 мкл. Одна из доз разведенной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл. Адъювант на основе эмульсии масло в воде. Адъювантная композиция по изобретению содержит адъювант на основе эмульсии масло в воде,предпочтительно указанная эмульсия содержит метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметр меньше чем 1 мкм. Для того чтобы любая композиция масло в воде подходила для введения людям, масляная фаза системы эмульсии должна содержать метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в области техники. Метаболизируемое может быть определено как способное к превращению путем метаболизма (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25thedition, (1974. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетическое масло, которое является нетоксичным для реципиента и способно к превращению путем метаболизма. Орехи, семена и зерна представляют собой обычные источники растительных масел. Синтетические масла также являются частью этого изобретению и могут включать имеющиеся в природе масла, такие как NEOBEE и др. Особенно подходящее метаболизируемое масло представляет собой сквален. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах - в оливковом масле, масле проростков пшеницы, рисовом масле и дрожжах, и представляет собой особенно предпочтительное масло для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло за счет того, что он представляет собой промежуточное соединение в биосинтезе холестерина (Merck index, 10th Edition, entry no. 8619). Эмульсии "масло в воде" сами по себе хорошо известны в области техники и были предложены в качестве полезных как адъювантные композиции (EP 399843; WO 95/17210). Подходящим образом метаболизируемое масло представлено в количестве от 0,5 до 20% (конечная концентрация) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 1,0 до 10% от общего объема, предпочтительно в количестве от 2,0 до 6,0% от общего объема. В специфическом воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве приблизительно 0,5, 1,0, 3,5% или 5,0% от общего объема иммуногенной композиции. В еще одном специфическом воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве 0,5, 1,0, 3,57 или 5,0% от общего объема иммуногенной композиции. Предпочтительно системы на основе эмульсии масло в воде по настоящему изобретению имеют небольшой размер капель масла в субмикронном диапазоне. Подходящим образом размеры капель находятся в диапазоне от 120 до 750 нм, предпочтительнее размеры в диаметре составляют от 120 до 600 нм. Наиболее предпочтительно эмульсия масло в воде содержит капли масла, по меньшей мере 70% из-7 011393 которых по интенсивности меньше чем 500 нм в диаметре, предпочтительнее по меньшей мере 80% по интенсивности меньше чем 300 нм в диаметре, предпочтительнее по меньшей мере 90% по интенсивности находятся в диапазоне от 120 до 200 нм в диаметре. Размер капель масла, т.е. диаметр, по настоящему изобретению приведен по интенсивности. Имеется несколько путей определения диаметра капли масла по интенсивности. Интенсивность измеряют путем применения аппарата для измерения размера, подходящим образом путем динамического светорассеяния, такого как Malvern Zetasizer 4000 HS или предпочтительно Malvern Zetasizer 3000HS. Подробная процедура приведена в примере II.2. Первая возможность заключается в определении среднего диаметраz (СДz) путем динамического светорассеяния (ФКС-фотонно-корреляционная спектроскопия); этот способ дополнительно позволяет получить индекс полидисперсности (ИПД) и как СДz, так и ИАД рассчитывают с использованием кумулятивного алгоритма. Эти значения не требуют знания показателя преломления частицы. Второй способ заключается в расчете диаметра капли масла путем определения распределения полного размера частиц при помощи другого алгоритма Contin, или NNLS, или автоматического "Malvern" (используемый по умолчанию алгоритм, предложенный для аппарата для определения размера). Обычно, поскольку показатель преломления частицы в сложной композиции неизвестен, в рассмотрение принимают только распределение интенсивности, и если необходимо, среднее значение интенсивности выводят из этого распределения. Эмульсия масло в воде содержит стерин. Стерины хорошо известны в области техники. Например, холестерин хорошо известен и, например, раскрыт в Merck Index, 11th Edn., p. 341 в виде встречающегося в природе стерина, обнаруженного в животном жире. Другие подходящие стерины включают бета-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, альфа-токоферол и эргокальциферол. Указанный стерин подходящим образом представлен в количестве от 0,01 до 20% (мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 0,1 до 5% (мас./об.). Предпочтительно, когда стерин представляет собой холестерин, он представлен в количестве от 0,02 до 0,2%(мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительнее в количестве 0,02% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл или 0,07% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл или 0,1% (мас./об.) в объеме дозы вакцины 0,7 мл. Подходящим образом стерин представляет собой альфа-токоферол или его производное, такое как альфа-токоферола сукцинат. Предпочтительно альфа-токоферол представлен в количестве от 0,2 до 5,0% (об./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительнее в количестве 2,5% (об./об.) или 0,5% (об./об.) в объеме дозы вакцины 0,5 мл либо 1,7-1,9% (об./об.), предпочтительно 1,8% в объеме дозы вакцины 0,7 мл. Для ясности концентрации, приведенные в об./об., могут быть преобразованы в концентрацию, выраженную в мас./об., путем применения следующего коэффициента пересчета: концентрация альфа-токоферола 5% (об./об.) эквивалентна концентрации альфа-токоферола 4,8% (мас./об.). Эмульсия масло в воде может дополнительно содержать эмульгатор. Эмульгатор может быть представлен в количестве от 0,01 до 5,0 мас.% от массы иммуногенной композиции (мас./мас.), предпочтительно представлен в количестве от 0,1 до 2,0 мас.% (мас./мас.). Предпочтительные концентрации составляют от 0,5 до 1,5 мас.% (мас./мас.) от общей массы композиции. Эмульгатор подходящим образом может представлять собой полиоксиэтилена сорбитанмоноолеат(Tween 80). В специфическом воплощении объем дозы вакцины 0,5 мл содержит 1% (мас./мас.)Tween 80, и объем дозы вакцины 0,7 мл содержит 0,7% (мас./мас.) Tween 80. В еще одном специфическом воплощении концентрация Tween 80 составляет 0,2% (мас./мас.). Адъювант на основе эмульсии масло в воде может быть использован с другими адъювантами или иммуностимуляторами и таким образом важное воплощение по изобретению представляет собой препарат масло в воде, содержащий сквален или другое метаболизируемое масло, альфа-токоферол иTween 80. Эмульсия масло в воде также может содержать Span 85 и/или лецитин. Типично масло в воде содержит от 2 до 10% сквалена от общего объема иммуногенной композиции, от 2 до 10% альфатокоферола и от 0,3 до 3% Tween 80 и может быть получено в соответствии со способом, описанным вWO 95/17210. Предпочтительно отношение сквален:альфа-токоферол составляет 1 или меньше, поскольку это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Также может быть представлен Span 85 (полиоксиэтилена сорбитантриолеат), например, на уровне 1%. Иммуногенные свойства иммуногенной композиции, используемой для первой вакцинации по настоящему изобретению. В настоящем изобретении противогриппозная композиция способна вызывать улучшенныйCD4 T-клеточный иммунный ответ против по меньшей мере одного из компонента антигена(ов) или антигенной композиции по сравнению с CD4 T-клеточным иммунным ответом, получаемым с использованием соответствующей композиции, которая является неадъювантной, т.е. не содержит какой-либо экзогенный адъювант (здесь также названная простой композицией). Под улучшенным CD4 T-клеточным иммунным ответом понимают, что более высокий CD4 ответ получают у человека после введения адъювантной иммуногенной композиции по сравнению с получаемым после введения той же самой композиции без адъюванта. Например, более высокийCD4 T-клеточный ответ получают у человека после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом на основе эмульсии масло в воде,содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол и эмульгатор, по сравнению с ответом, вызываемым после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который является неадъювантным. Такой препарат благоприятно используют для индукции противогриппозного CD4 T-клеточного ответа, способного обнаруживать эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC). Предпочтительно указанный иммунологический ответ, вызываемый адъювантной убиквиторной противогриппозной композицией для применения в настоящем изобретении, более высокий по сравнению с иммунологическим ответом, вызываемым какой-либо другой простой неадъювантной противогриппозной вакциной, такой как субъединичная противогриппозная вакцина или вакцина на основе полного вируса гриппа. В частности, но не исключительно, указанный улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ получают у иммунологически непримированного пациента, т.е. пациента, который является серонегативным в отношении указанного вируса гриппа или антигена. Эта серонегативность может быть результатом того, что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый интактный пациент) или альтернативно не удалось сформировать ответ на указанный антиген после встречи с ним. Предпочтительно указанный улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ получают у субъекта с ослабленным иммунитетом, такого как пожилой человек, типично в возрасте 65 лет или более, или взрослого человека в возрасте меньше 65 лет, имеющего высокий риск медицинского показания (взрослый с высоким риском), или ребенка в возрасте до двух лет. Улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ может быть оценен путем измерения количества клеток, продуцирующих какой-либо из следующих цитокинов: клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (CD40L, IL-2, интерферон гамма IFN-, фактор некроза опухоли альфа TNF-); клетки, продуцирующие по меньшей мере CD40L и другой цитокин (IL-2, TNF-, IFN-); клетки, продуцирующие по меньшей мере IL-2 и другой цитокин (CD40L, TNF-, IFN-); клетки, продуцирующие по меньшей мере IFN- и другой цитокин (IL-2, TNF-, CD40L); клетки, продуцирующие по меньшей мере TNF- и другой цитокин (IL-2, CD40L, IFN-). Имеется улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ, когда клетки, продуцирующие какойлибо из вышеприведенных цитокинов, находятся в более высоком количестве после введения адъювантной композиции по сравнению с введением неадъювантной композиции. Типично, удовлетворяется по меньшей мере одно, предпочтительно два из пяти упомянутых выше условий. В конкретном воплощении клетки, продуцирующие все четыре цитокина, представлены в более высоком количестве в адъювантной группе по сравнению с неадъювантной группой. Улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ, придаваемый адъювантной противогриппозной композицией по настоящему изобретению, может быть идеально получен после разового введения. Подход с использованием разовой дозы является весьма подходящим, например, в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых случаях, особенно для пожилых людей, или в случае детей младшего возраста (в возрасте меньше 9 лет), впервые вакцинированных против вируса гриппа, может быть благоприятно вводить две дозы той же самой композиции в течение одного сезона. Вторая доза указанной той же самой композиции (все еще рассматриваемой как композиция для первой вакцинации) может быть введена в течение развития первичного иммунного ответа и они могут быть подходящим образом разнесены по времени. Типично, вторую дозу композиции вводят через несколько недель или приблизительно один месяц, например через 2, 3, 4, 5 или 6 недель после первой дозы для того, чтобы помочь иммунной системе у индивидов, у которых не формируется иммунный ответ или плохо формируется иммунный ответ. В специфическом воплощении введение указанной иммуногенной композиции альтернативно или дополнительно вызывает улучшенный ответ на основе B-клеток памяти у пациентов, которым вводили адъювантную иммуногенную композицию, по сравнению с ответом на основе B-клеток памяти, вызванным у индивидов, иммунизированных неадъювантной композицией. Предполагают, что улучшенный ответ на основе B-клеток памяти подразумевает увеличенную частоту В лимфоцитов в периферической крови, способных к дифференцировке в антителосекретирующие клетки плазмы крови после встречи с антигеном, что измеряют путем стимуляции дифференцировки in-vitro (см. раздел Примеров, например способы B-клеточной памяти Elispot). В еще одном специфическом воплощении вакцинация с использованием адъювантной композиции для первой вакцинации не оказывает измеряемого воздействия на CD8 ответ. Заявители неожиданно обнаружили, что композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, приготовленный с адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол и эмульгатор, эффективно способствует T-клеточным ответам в популяции людей с нарушением иммунной системы. Как продемонстрировали заявители, вве-9 011393 дение разовой дозы иммуногенной композиции при первой вакцинации, как описано в изобретении, способно обеспечить более хорошую сывороточную защиту, что оценивают по корреляции защиты для противогриппозных вакцин после ревакцинации против вируса гриппа в популяции пожилых людей, по сравнению с вакцинацией неадъювантной противогриппозной вакциной. Заявленный адъювантный препарат также способен индуцировать улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с получаемым при использовании неадъювантного препарата. Это открытие может ассоциироваться с увеличенной способностью к ответу после вакцинации или инфекции по сравнению с антигенным воздействием вируса гриппа. Кроме того, это также может ассоциироваться со способностью к перекрестному ответу, т.е. более высокой способностью к ответу против штаммов варианта вируса гриппа. Этот улучшенный ответ может быть особенно благоприятен в популяции людей с нарушением иммунной системы, такой как популяция пожилых людей (в возрасте 65 лет и выше), в частности популяции пожилых людей с высоким риском. Это может приводить в результате к уменьшению общего уровня заболеваемости и смертности и предотвращению срочной госпитализации в больницу при пневмонии и других заболеваниях, подобных вирусу гриппа. Это также может быть преимуществом для популяции детей (в возрасте меньше 5 лет, предпочтительно меньше 2 лет). Кроме того, это дает возможность для того, чтобы вызвать CD4 T-клеточный ответ, который более устойчив по времени, например все еще представлен через один год после первой вакцинации, по сравнению с ответом, вызываемым неадъювантным препаратом. Предпочтительно CD4 T-клеточный иммунный ответ, такой как улучшенный CD4 T-клеточный иммунный ответ, получаемый у непримированного субъекта, охватывает индукцию перекрестнореактивного CD4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивныхCD4 T-клеток. Под перекрестно-реактивным CD4 ответом понимают CD4 T-клеточные нацеливающие перекрестно-реагирующие эпитопы между штаммами вируса гриппа. Обычно доступные противогриппозные вакцины эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, имеющих гемагглютинины, обладающие похожими антигенными характеристиками. Когда инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа претерпевает незначительные изменения (такие как точечная мутация или аккумуляция точечных мутаций, приводя в результате, например, к аминокислотным заменам) поверхностных гликопротеинов, в частности гемагглютинина (антигенный вариант штамма вируса в результате дрейфа), вакцина может все еще обеспечивать некоторую защиту,хотя они могут обеспечивать лишь ограниченную защиту, тогда как вновь созданные варианты могут избежать иммуногенности, вызванной предшествующим инфицированием вирусом гриппа или вакцинацией. Антигенный дрейф ответственен за ежегодные эпидемии, возникающие во время межпандемических периодов (WileySkehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394). Индукция перекрестно-реактивныхCD4 T-клеток придает дополнительное преимущество композиции по изобретению, заключающееся в том, что она может обеспечивать также перекрестную защиту, другими словами, защиту против гетерологических инфекций, т.е. инфекций, вызванных циркулирующим штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант (например, дрейф) штамма вируса гриппа, содержащийся в иммуногенной композиции. Это может быть благоприятно в том случае, когда циркулирующий штамм сложно репродуцировать в яйцах или продуцировать в тканевой культуре, что делает применение дрейфующего штамма рабочей альтернативой. Это также может быть благоприятно, когда субъект получает первую и вторую вакцинацию с разницей в несколько месяцев или год, и штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции, используемой для второй иммунизации, представляет собой дрейфующий вариант штамма,используемого в композиции, применяемой для первой вакцинации. Обнаружение перекрестно-реактивных CD4 T-клеток после вакцинации противогриппозной вакциной. После введения классической тривалентной противогриппозной вакцины (3 недель) существует значительное увеличение частоты CD4 T-клеток периферической крови, отвечающих на препарат антигенного штамма (полный вирус или убиквиторный антиген), гомологичного представленному в вакцине(H3N2: A/Panama/2007/99, H1N1: A/New Caledonia/20/99, B: B/Shangdong/7/97) (см. пример III). Сравнимое увеличение частоты может наблюдаться в том случае, если CD4 T-клетки периферической крови рестимулированы штаммами вируса гриппа, классифицированными как дрейфующие штаммы(H3N2: A/Sydney/5/97, H1N1: A/Beijing/262/95, B: B/Yamanashi/166/98). Наоборот, если CD4 T-клетки периферической крови рестимулированы штаммами вируса гриппа,классифицированными экспертом в области техники как дрейфующие штаммы (H2N2: A/Singapore/1/57,H9N2: A/Hongkong/1073/99), отсутствует заметное увеличение после вакцинации.CD4 T-клетки, которые способны распознавать гомологичные и дрейфующие штаммы вируса гриппа, названы в представленном документе как "перекрестно-реактивные". Адъювантные противогриппозные композиции, заявленные для применения в настоящем изобретении, способны демонстрировать гетеросубтипичную перекрестную реактивность, поскольку существует видимая кроссреактивность против дрейфующих штаммов вируса гриппа. В соответствии с вышеприведенными наблюдениями CD4 T-клеточные эпитопы, содержащиеся в различных штаммах вируса гриппа, были идентифицированы у человека (Gelder C. et al., 1998, lnt. Immunol., 10(2):211-22; Gelder C.M. et al., 1996, J. Virol., 70(7):4787-90; Gelder C.M. et al., 1995, J. Virol., 1995,- 10011393 69(12):7497-506). В специфическом воплощении адъювантная композиция может обеспечить дополнительное преимущество, заключающееся в том, что она обеспечивает более хорошую защиту против циркулирующих штаммов, которые претерпели основное изменение (такое как генная рекомбинация, например между двумя различными видами) гемагглютинина (антигенный сдвиг), против которого существующие в настоящее время вакцины не обладают эффективностью. Другие адъюванты. Композиция может содержать дополнительный адъювант, в частности адъювант на основе лигандаToll-подобного рецептора 4 (TLR-4), подходящим образом нетоксичное производное липида А. Подходящий TRL-4 лиганд представляет собой 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-МФЛ). Другие подходящие TLR-4 лиганды представляют собой липополисахарид (ЛПС) и производные, МДП(мурамилдипептид) и F белок респираторно-синцитиального вируса (RSV). В одном из воплощений композиция дополнительно может включать лиганд Toll-подобного рецептора 4 (TLR), такой как нетоксичное производное липида А, особенно монофосфориллипид А или конкретней 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-МФЛ). 3D-МФЛ продается под товарным знаком MPL от Corixa corporation (здесь МФЛ) и в основном способствует CD4+ T-клеточным ответам с фенотипом IFN- (Th1). Он может быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в GB 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют 3D-МФЛ с небольшими частицами. 3D-МФЛ имеет такой размер частиц, что он может быть стерильно фильтрован через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в WO94/21292 и в примере II. 3D-МФЛ могут быть использованы, например, в количестве от 1 до 100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве от 10 до 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 3D-МФЛ, например, составляет от 1 до 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Предпочтительнее количество 3D-МФЛ составляет от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции находится в диапазоне приблизительно от 0,5 приблизительно до 1 мл. Типичные дозы вакцины составляют 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мл. В предпочтительном воплощении конечная концентрация 50 мкг 3D-МФЛ содержится в 1 мл композиции вакцины или 25 мкг в 0,5 мл дозы вакцины. В других предпочтительных воплощениях конечная концентрация 35,7 или 71,4 мкг 3D-МФЛ содержится в 1 мл композиции вакцины. Конкретно, 0,5 мл объем дозы вакцины содержит 25 или 50 мкг 3D-МФЛ на дозу. Доза МФЛ подходящим образом способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящее количество МФЛ представляет собой такое количество, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с неадъювантной композицией или по сравнению с композицией, в которой содержится другое количество МФЛ в качестве адъюванта, в то же время оставаясь приемлемой исходя из профиля реактогенности. Синтетические производные липида А известны, некоторые описаны как агонисты TLR-4 и включают: ОМ 174 (2-дезокси-6-орто[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-ортофосфоно(3-D-глюкопиранозил)]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]D-глюкопиранозилдигидрофосфат)OM197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3 гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (WO 01/46127),но не ограничиваются ими Другие подходящие TLR-4 лиганды представляют собой, например, липополисахарид и его производные мурамилдипептид (МДП) или F белок респираторно-синцитиального вируса. Другой подходящий иммуностимулятор для применения в настоящем изобретении представляет собой Quil A и его производные. Quil A представляет собой сапониновый препарат, выделенный из южно-американского дерева Quilaja Saponaria Molina и впервые описанный Dalsgaard et al. в 1974 ("Saponinadjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, vol. 44, Springer Verlag, Berlin, р. 243-254), обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты Quil А, выделенные при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сохраняют адъювантную активность без токсичности, ассоциирующейся с Quil A (EP 0362278), например QS7 и QS21 (также известные как QA7 и QA21). QS-21 представляет собой природный сапонин, полученный из коры Quillaja saponaria Molina, который индуцирует ответ в виде CD8+ цитотоксичных T-клеток (CTL), Th1 клеток и преимущественно в виде IgG2a антител,и представляет собой предпочтительный сапонин в контексте настоящего изобретения. Описаны конкретные препараты QS21, которые являются особенно предпочтительными, эти препараты дополнительно содержат стерин (WO96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут находиться в форме эмульсии масло в воде (WO 95/17210).- 11011393 Ревакцинация и композиция, используемая для ревакцинации (композиция для повторной иммунизации). В одном из аспектов настоящего изобретения предложено применение антигена вируса гриппа при приготовлении противогриппозной иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа, или его антигенным препаратом, или его вариантом, приготовленным с адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор. Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первичной вакцинации(й), предпочтительно через 8-14 месяцев, предпочтительнее приблизительно через 10-12 месяцев после первичной вакцинации(й). Иммуногенная композиция для ревакцинации (композиция для повторной иммунизации) может содержать какой-либо тип антигенного препарата, инактивированного или живого ослабленного. Она может содержать тот же самый тип антигенного препарата, т.е. убиквиторный вирус гриппа или его убиквторный вирусный антигенный препарат, полный вирион, очищенную HA и NA (субъединичную) вакцину или виросому, в качестве иммуногенной композиции, используемой для первой вакцинации. Альтернативно, композиция для повторной иммунизации может содержать тип антигена вируса гриппа, т.е. убиквиторный вирус гриппа или его убиквторный вирусный антигенный препарат, полный вирион,очищенную HA и NA (субъединичную) вакцину или виросому, отличающийся от используемого для первой вакцинации. Композиция для повторной иммунизации может быть адъювантной или неадъювантной. Неадъювантная композиция для повторной иммунизации может представлять собойFluarix/-Rix/lnflusplit, вводимый внутримышечно. Препарат содержит три инактивированных убиквиторных вирионовых антигена, полученных из штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения для соответствующего сезона вируса гриппа. Соответственно, в предпочтительном воплощении изобретения предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных вирусом гриппа или его антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор. Указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде предпочтительно содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметры меньше чем 1 мкм. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. В специфическом воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации (также названная здесь ниже композиция для повторной иммунизации) содержит вирус гриппа или его антигенный препарат,который несет общие CD4 T-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Предполагают, что общий CD4 T-клеточный эпитоп обозначает пептиды/последовательности/эпитопы из различных антигенов, которые могут распознаваться той же самой CD4 клеткой (см. примеры описанных эпитопов в: Gelder C. et al., 1998, lnt. Immunol., 10(2):211-22;Gelder C.M. et al,. 1996, J. Virol., 70(7):4787-90; Gelder C.M. et al., 1995, J. Virol., 1995, 69(12):7497-506). В предпочтительном воплощении штамм вируса гриппа может ассоциироваться с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой. В частности, когда вакцина представляет собой мультивалентную вакцину, такую как бивалентная или тривалентная вакцина, по меньшей мере один штамм ассоциируется с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой. Подходящие штаммы представляют собой H5N1, H9N2,H7N7, H2N2 и H1N1, но не ограничиваются ими. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение:(в) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и(г) адъюванта на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций вирусом гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа. Предпочтительно указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% которых по интенсивности имеют диаметры меньше чем 1 мкм. Подходящим образом указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. Типично композицию для повторной иммунизации, когда ее применяют, вводят в следующий сезон вируса гриппа, например приблизительно через год после первой иммуногенной композиции. Композиция для повторной иммунизации (далее "сенсибилизирующая композиция") также может быть введена каждый последующий год (третья, четвертая, пятая вакцинация и т.д.). Сенсибилизирующая композиция может представлять собой ту же композицию, что и композиция, используемая для первой вакцинации.- 12011393 Подходящим образом сенсибилизирующая композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который представляет собой вариант штамма вируса гриппа, используемого для первой вакцинации. В частности, штаммы вируса гриппа или его антигенного препарата выбраны в соответствии со ссылками, распространяемыми Всемирной организацией здравоохранения, таким образом, что они адаптированы к штамму вируса гриппа, который циркулирует в год ревакцинации. Антиген вируса гриппа или антигенная композиция, используемая при ревакцинации, предпочтительно содержит адъювант или эмульсию масло в воде, подходящим образом, как описано выше. Адъювант может представлять собой адъювант на основе эмульсии масло в воде, как описано выше, которая предпочтительно возможно содержит дополнительными адъювант, такой как TLR-4 лиганд, такой как 3D-МФЛ или сапонин, или может представлять собой другой подходящий адъювант, такой как квасцы или альтернативы квасцов, такие как, например полифосфазен. Предпочтительно ревакцинация вызывает любой из ответов, предпочтительно два или все из следующих:(1) улучшенный CD4 ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или(2) улучшенный ответ на основе B-клеточной памяти, или(3) улучшенный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом, вызываемым после первой вакцинации неадъювантным вирусом гриппа или его антигенным препаратом. Предпочтительно иммунологические ответы, вызываемые после ревакцинации адъювантным вирусом гриппа или его определенным здесь антигенным препаратом, более высокие по сравнению с соответствующим ответом, вызываемым после ревакцинации неадъювантной композицией. Предпочтительно иммунологические ответы, вызываемые ревакцинацией неадъювантным, предпочтительно убиквиторным вирусом гриппа, являются более высокими в популяции, сначала вакцинированной адъювантной,предпочтительно убиквиторной противогриппозной композицией по сравнению с соответствующим ответом в популяции, сначала вакцинированной неадъювантной, предпочтительно субъединичной противогриппозной композицией. Как показали заявители, ревакцинация субъектов сенсибилизирующей композицией, содержащей вирус гриппа и адъювант на основе эмульсии масло в воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и определенный выше эмульгатор, демонстрирует более высокий титр антитела по сравнению с соответствующими значениями для группы людей, сначала вакцинированной неадъювантной композицией и сенсибилизированной неадъювантной композицией. Эффект адъюванта при усилении ответа в виде антител на ревакцинацию особенно важен в популяции пожилых людей, которая, как известно, имеет низкий ответ на вакцинацию или инфекцию вирусом гриппа. Преимущество,ассоциирующееся с адъювантной композицией, также очевидно с точки зрения улучшенияCD4 T-клеточного ответа после ревакцинации. Адъювантная композиция по изобретению способна вызывать более хорошую перекрестную ответную реакцию против дрейфующего штамма (штамма вируса гриппа в следующий сезон вируса гриппа) по сравнению с защитой, обеспечиваемой контрольной вакциной. Указанная перекрестная ответная реакция демонстрирует более высокую персистенцию по сравнению с обеспечиваемой неадъювантным препаратом. Преклинические данные, приведеные в примере 3, например, демонстрируют способность композиции по изобретению защищать против гетеротипичной инфекции вирусом гриппа и заболеваний, что оценивают в соответствии с измерениями температуры организма. То же самое заключение справедливо для данных клинических испытаний, полученных в исследованиях ревакцинации. Штаммы вируса гриппа и его антигены. Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат подходящим образом является моновалентным или мультивалентным, таким как бивалентный, или тривалентный, или квадривалентный. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат является тривалентным или квадривалентным,имеющим антиген из трех различных штаммов вируса гриппа. Возможно, по меньшей мере один из штаммов ассоциируется с пандемической вспышкой или обладает потенциалом ассоциироваться с пандемической вспышкой. В соответствии с предшествующим уровнем техники во время межпандемических периодов вирусы гриппа циркулируют, что связано с вирусами из предшествующих эпидемий. Вирусы распространяются среди людей с различными уровнями иммуннитета от инфекций, ранее проявляющимися в течение жизни. Такое распространение в течение периода обычно 2-3 лет способствует отбору новых штаммов, которые достаточно изменены для того, чтобы вновь вызвать эпидемию в общей популяции; этот процесс назван антигенный дрейф. Дрейфующие варианты могут обладать различными воздействиями в различных сообществах, областях, странах или континентах в какой-либо год, хотя в течение нескольких лет их общее воздействие часто схоже. Другими словами, пандемии вируса гриппа возникают, когда появляется новый вирус гриппа, против которого популяция людей не обладает иммунитетом. Типичные эпидемии гриппа вызывают увеличение частоты явлений и уменьшение частоты респираторных заболеваний, о чем свидетельствует увеличение уровней госпитализации или смертности. Пожилые люди или люди, имеющие фон хронических заболеваний, наиболее вероятно сталкиваются с такими осложнения- 13011393 ми, однако дети также могут страдать от тяжелого заболевания. С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа с ключевым поверхностным антигеном, гемагглютинином, имеющим подтип, в общем отличающимся от подтипов, циркулирующих в предшествующий сезон. В этом случае получающиеся в результате антигены могут изменяться на 2050% относительно соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали среди людей. Это может привести в результате к вирусу, который может избежать групповой иммунитет и вызвать пандемии. Это явление названо антигенным сдвигом. Полагают, что, по меньшей мере, в последнее время пандемии возникают, когда вирус гриппа из различных видов, таких как обезьяний вирус гриппа или вирус гриппа свиньи, пересекает видовой барьер. Если такие вирусы обладают потенциалом передаваться от индивида к индивиду, они могут распространяться в мире в течение от месяцев до года, приводя в результате к пандемии. Например, в 1957 году (пандемия Asian Flu) вирусы подтипа H2N2 заместили вирусы H1N1, которые циркулировали в человеческой популяции по меньшей мере с 1918 года, когда вирус впервые был выделен. Н 2HA и N2NA претерпели антигенный дрейф между 1957 и 1968 гг. до того, как HA был замещен в 1968 году (пандемия Hong-Kong Flu) появлением подтипа H3N2 вируса гриппа, после чего N2NA продолжал дрейфовать вместе с Н 3 НА (Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106,383-395). Особенности штамма вируса гриппа, которые обеспечивают ему потенциал вызывать пандемический исход, представляют собой следующее: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином циркулирующих в настоящее время штаммов, что может сопровождаться или не сопровождаться изменением нейраминидазного подтипа; он способен горизонтально переноситься в человеческой популяции и он патогенен для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не был обнаружен в человеческой популяции в течение длительного периода времени, возможно множества десятилетий, такой как Н 2. Или он может представлять собой гемагглютинин, который не циркулировал в человеческой популяции ранее, например Н 5, Н 9, Н 7 или Н 6, которые найдены у птиц. В любом случае большинство,или по меньшей мере значительная доля, или даже вся популяция ранее не сталкивались с антигеном и иммунологически не подвергнуты его воздействию. Некоторые группы, как правило, имеют увеличенный риск инфицирования вирусом гриппа в случае пандемии. Особенно восприимчивы пожилые люди, хронически больные и дети младшего возраста, но риск имеют также многие молодые и явно здоровые люди. Для вируса гриппа Н 2 часть популяции, рожденной после 1968 года, имеет увеличенный риск. Важно, чтобы эти группы были эффективно защищены по возможности быстро и простым путем. Другую группу людей, которая имеет увеличенный риск, представляют собой путешественники. В настоящее время люди путешествуют больше, чем ранее, и области, где возникают самые новые вирусы,а именно Китай и юго-восточная Азия, в течение последних лет превратились в популярные места для путешествий. Это изменение картины путешествий дает новым вирусам возможность распространиться по всему миру в течение недель, нежели чем месяцев или лет. Таким образом, для этих групп людей существует конкретная потребность в вакцинации для защиты от вируса гриппа в случае пандемии или потенциальной ситуации пандемии. Подходящие штаммы представляют собой: H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1, но не ограничиваются ими. Возможно, композиция может содержать более чем три валентности, например два непандемических штамма плюс пандемический штамм. Альтернативно композиция может содержать три пандемических штамма. В еще одном воплощении изобретение относится к схеме вакцинации, в которой первую вакцинацию осуществляют убиквиторной противогриппозной композицией, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально может вызывать пандемический исход, а ревакцинацию осуществляют циркулирующим штаммом, пандемическим штаммом или классическим штаммом.CD4 эпитоп в HA. Антигенный дрейф в основном происходит в областях эпитопов поверхностных вирусных белков гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Известно, что какое-либо различие в CD4 и B-клеточных эпитопах между различными штаммами вируса гриппа, используемыми вирусом для ухода от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, играет основную роль в противогриппозной вакцинации.CD4 T-клеточные эпитопы, принадлежащие различным штаммам вируса гриппа, идентифицированы у человека (см., например: Gelder C. et al., 1998, Int/ Immunol., 10(2):211-22; Gelder C.M. et al., 1996, J.Virol., 70(7):4787-90 и Gelder C.M. et al., 1995, J. Viroi., 69(12):7497-506). В специфическом воплощении ревакцинацию осуществляют с использованием сенсибилизирующей композиции, которая содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который несет общиеCD4 T-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, изобретение относится к применению иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии масло в- 14011393 воде, содержащей метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, при приготовлении первого компонента вакцинации мультидозовой вакцины, где мультидозовая вакцина дополнительно содержит в качестве сенсибилизирующей дозы вирус гриппа или его антигенный препарат,который несет общие CD4 T-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным вирусным препаратом дозы, вводимой при первой вакцинации. Способы вакцинации. Композиция по изобретению может быть введена при помощи какого-либо подходящего пути доставки, такого как внутрикожный, внутрислизистый, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный. Другие пути доставки хорошо известны в области техники. Внутримышечный путь доставки предпочтителен для адъювантной противогриппозной композиции. Внутрикожная доставка представляет собой другой подходящий путь. Для внутрикожной доставки может быть использовано какое-либо подходящее устройство, например устройства с короткой иглой,такие как устройства, описанные в US 4886499, US 5190521, US 5328483, US 5527288, US 4270537,US 5015235, US 5141496, US 5417662. Вакцины для внутрикожного введения также могут быть введены при помощи устройств, которые ограничивают глубину эффективного проникновения иглы в кожу, таких как устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, включенных здесь путем ссылки, и их функциональных эквивалентах. Также подходящими являются устройства для струйной инъекции, которые доставляют жидкие вакцины в дерму при помощи жидкостного струйного инъектора или через иглу,которая прокалывает роговой слой и продуцирует поток, достигающий дерму. Устройства для струйной инъекции описаны, например, в US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912,US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627,US 5064413, US 5520639, US 4596556 US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 иWO 97/13537. Также подходящими являются устройства для баллистической доставки порошка/частиц, в которых используется газ под давлением для ускорения вакцины в порошкообразной форме через внешние слои кожи в дерму. Дополнительно, обычные шприцы могут быть использованы в классическом способе Манту внутрикожного введения. Другой подходящий путь введения представляет собой подкожный путь. Какое-либо подходящее устройство может быть использовано для подкожной доставки, например классическая игла. Предпочтительно используют безыгольный струйный инъектор, такой как опубликованный в WO 01/05453,WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637,WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Предпочтительнее указанное устройство предварительно заполняют жидким вакцинным препаратом. Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Типично, вакцину вводят местно в носоглотку,предпочтительно без ингаляции в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинный препарат в носоглотку без, или по существу без, его проникновения в легкие. Предпочтительные устройства для интраназального введения вакцины по изобретению представляют собой распыляющие устройства. Подходящие и имеющиеся в продаже устройства для назального распыления включают Accuspray (Becton Dickinson). Небулайзеры продуцируют очень тонкодисперсный спрей, который можно легче ингалировать в легкие и таким образом эффективно не достигает слизистой оболочки носа. Таким образом, небулайзеры не являются предпочтительными. Предпочтительные распыляющие устройства для интраназального применения представляют собой устройства, в которых производительность не зависит от давления, прикладываемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с порогом давления. Жидкость высвобождается из форсунки только тогда, когда применяют пороговое давление. Эти устройства позволяют легче достичь распыления капель постоянного размера. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения в настоящем изобретении, известны в области техники и описаны, например в WO 91/13281 и EP 311863 В иEP 516636, включенных здесь путем ссылки. Такие устройства имеются в продаже от Pfeiffer GmbH и также описаны в Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept. 1999. Предпочтительные устройства для интраназального введения продуцируют капли (измеренные с использованием воды в качестве жидкости) в диапазоне от 1 до 200 мкм, предпочтительно от 10 до 120 мкм. Меньше 10 мкм существует риск ингаляции, таким образом, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капель с размером меньше 10 мкм. Капли с размером больше 120 мкм не распределяются столь же хорошо, как меньшие капли, таким образом, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капель, имеющих размер больше 120 мкм. Доставка двойной дозы представляет собой дополнительную предпочтительную особенность системы для интраназального введения при применении вакцины по изобретению. Устройства с двойной дозой содержат две субдозы единичной дозы вакцины, одна субдоза предназначена для введения в каждую из ноздрей. Как правило, две субдозы находятся в одной камере, и конструкция устройства дает возможность для эффективной доставки одной субдозы единовременно. Альтернативно, для введения вак- 15011393 цины по изобретению может быть использовано однодозовое устройство. Альтернативно, также в настоящем изобретении рассмотрен путь эпидермальной или трансдермальной вакцинации. В специфическом аспекте настоящего изобретения адъювантная иммуногенная композиция для первичного введения может быть введена внутримышечно, а сенсибилизирующая композиция, являющаяся адъювантной или неадъювантной, может быть введена различными путями, например внутрикожно, подкожно или интраназально. В еще одном специфическом воплощении композиция для первичного введения может содержать стандартное количество HA 15 мкг на штамм вируса гриппа, а сенсибилизирующая композиция может содержать низкую дозу HA, т.е. меньшей 15 мкг, и в зависимости от пути введения может быть введена в меньшем объеме. Популяции для вакцинации. Целевая популяция для вакцинации может представлять собой людей с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом, как правило, обладают меньшей способностью отвечать на антиген,в частности на антиген вируса гриппа, по сравнению со взрослыми людьми. Предпочтительно целевая популяция представляет собой популяцию, которая непримирована против вируса гриппа, являясь наивной (такой как партнер-пандемический штамм), или которой ранее не удалось сформировать ответ на инфекцию вирусом гриппа или противогриппозную вакцинацию. Предпочтительно целевую популяцию составляют пожилые люди, подходящим образом в возрасте 65 лет и старше, взрослые с высоким риском (т.е. в возрасте от 18 до 64 лет), такие как люди, работающие в системе здравоохранения, или молодые взрослые, имеющие фактор риска, такой как сердечно-сосудистое и легочное заболевание, или сахарный диабет. Другая целевая популяция представляет собой всех детей в возрасте от 6 месяцев и выше, особенно детей в возрасте 6-23 месяцев, которые сталкиваются с относительно высоким связанным с вирусом гриппа уровнем госпитализации. Предпочтительно целевую популяцию составляют пожилые люди в возрасте выше 65 лет. Схемы вакцинации, дозировка и дополнительные критерии эффективности. Подходящим образом иммуногенные композиции по настоящему изобретению в большинстве случаев представляют собой стандартные инъецируемые дозы по 0,5 мл и содержат 15 мкг гемагглютининового антигенного компонента из каждого штамма вируса гриппа, измеренные при помощи простой радиальной иммунодиффузии (SRD) (J.M. Wood et al., J. Biol. Stand., 5 (1977), 237-247; J.M. Wood et al., J.Biol. Stand., 9 (1981), 317-330). Подходящим образом объем дозы вакцины составляет от 0,5 до 1,0 мл, в частности стандартно объем дозы вакцины составляет 0,5 или 0,7 мл. Легкая адаптация объема может быть осуществлена стандартно в зависимости от концентрации HA в образце исходной партии. Подходящим образом указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу HA антигена,например любую из 1-14 мкг HA на штамм вируса гриппа. Подходящая низкая доза 25 HA составляет от 1 до 7,5 мкг HA на штамм вируса гриппа, подходящим образом от 3,5 до 5 мкг, такую как 3,75 мкг HA на штамм вируса гриппа, типично приблизительно 5 мкг HA на штамм вируса гриппа. Благоприятно, доза вакцины по изобретению, в частности низкая доза вакцина, может быть предложена в меньшем объеме, чем для обычных инъецируемых split flu вакцин, для которых объем, как правило, составляет приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Низкий объем дозы по изобретению предпочтительно меньше 500 мкл, предпочтительнее меньше 300 мкл и наиболее предпочтительно не больше чем приблизительно 200 мкл или меньше на дозу. Таким образом, предпочтительный низкий объем дозы вакцины в соответствии с одним из аспектов изобретения представляет собой дозу с низкой дозой антигена в малом объеме, например приблизительно 15 мкг, или приблизительно 7,5 мкг, или приблизительно 3,0 мкг HA (на штамм) в объеме приблизительно 200 мкл. Противогриппозное лекарственное средство по изобретению предпочтительно удовлетворяет определенным международным критериям, предъявляемым к вакцинам. Стандарты применяют во всем мире для измерения эффективности противогриппозных вакцин. Официальные критерии Евросоюза в отношении эффективной вакцины против вируса гриппа представлены в табл. 1. Теоретически, для того чтобы удовлетворять требованиям Евросоюза, противогриппозные вакцины должны удовлетворять только одному из критериев, указанных в таблице, для всех штаммов вируса гриппа, включенных в вакцину. Композиции по настоящему изобретению подходящим образом удовлетворяют по меньшей мере одному из таких критериев. Тем не менее, на практике необходимо, чтобы были удовлетворены по меньшей мере два или все три критерия для всех штаммов, особенно для новой вакцины, такой как новая вакцина для введения различными путями. В некоторых случаях могут быть достаточны два критерия. Например, может быть приемлемо, чтобы два из трех критериев удовлетворялись всеми штаммами, хотя третий критерий удовлетворялся некоторыми, а не всеми штаммами (например, двумя из трех штаммов). Требования различны для взрослой популяции (18-60 лет) и популяции пожилых людей (старше 60 лет). Уровень сероконверсии определяют как процент вакцинированных пациентов, которые имеют по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров гемагглютининового ингибирования (HI) после вакцинации для каждого вакцинного штамма. Переводной коэффициент определяют как кратное увеличение сывороточных среднегеометрических титров (СГ) HI после вакцинации для каждого вакцинного штамма. Уровень защиты определяют как процент вакцинированных пациентов с сывороточным титром HI, равным или больше чем 1:40 после вакцинации(для каждого вакцинного штамма), и обычно его принимают как показатель защиты. В еще одном аспекте в изобретении предложен способ разработки вакцины для заболеваний, которые, как известно, излечивают или лечат путем CD4+ T-клеточной активации, включающий: 1) выбор антигена, содержащего CD4+ эпитопы, и 2) объединение указанного антигена с адъювантом на основе эмульсии масло в воде, как определено выше, где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна вызывать усиленный CD4 T-клеточный ответ у указанного млекопитающего. Содержание всех ссылок в заявке на изобретение, включающих заявки на патенты и выданные патенты, полностью включено сюда путем ссылки. Для того чтобы избежать неопределенности, авторы настоящего изобретения предполагают, что использованные здесь термины содержащий, содержат и содержит в каждом случае возможно заменяемы терминами соответственно состоящий из, состоят из и состоит из. Альтернативные воплощения. В альтернативном воплощении может быть использован любой адъювант на основе эмульсии масло в воде, в частности, но не единственно, когда используют с убиквиторным антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом. Соответственно, следующие специфические воплощения также рассмотрены в контексте настоящего изобретения. 1. Применение:(а) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции, вызывающей по меньшей мере один из ответов: 1) улучшенный CD4 T-клеточный ответ,2) улучшенный ответ на основе B-клеточной памяти против указанного антигена или его убиквиторного вирусного антигенного препарата у человека. 2. Применение.(в) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата и(г) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человека с ослабленным иммунитетом или популяция, такой как взрослые с высоким риском или пожилые люди, против вируса гриппа. 3. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата, адъювантного или неадъювантного, в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде. Предпочтительно ревакцинацию осуществляют субъектам, которые вакцинированы в предшествующий сезон против вируса гриппа. Типично ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первичной вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, предпочтительнее приблизительно через 10-12 месяцев. 4. Предпочтительно, предложено применение:(а) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата, и(б) адъюванта на основе эмульсии масло в воде в приготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде. 5. Применение:(д) убиквиторного вируса гриппа или его убиквиторного вирусного антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и(е) адъюванта на основе эмульсии масло в воде- 17011393 в приготовлении иммуногенной композиции для защиты против инфекций вирусом гриппа, вызванных штаммом вируса гриппа, который представляет собой вариант указанного первого штамма вируса гриппа. 6. В еще одном специфическом воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат, который несет общие CD4 T-клеточные эпитопы с убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. 7. Способ вакцинации человека с нарушением иммунной системы или популяции, такой как взрослые с высоким риском или пожилые люди, иммуногенной композицией, содержащей убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат и адъювант на основе эмульсии масло в воде, как определено выше. 8. Способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных убиквиторным вирусом гриппа или его убиквиторным вирусным антигенным препаратом и адъювантом на основе эмульсии масло в воде,включающий введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа с адъювантом или без адъюванта. 9. Способ вакцинации человеческой популяции или индивида против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против варианта штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку:(1) первой композиции, содержащей убиквиторный вирус гриппа или его убиквиторный вирусный антигенный препарат на основе первого штамма вируса гриппа и адъювант на основе эмульсии масло в воде, и(2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариант штамма вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. 10. Способ разработки противогриппозной вакцины, включающий: 1) выбор антигена вируса гриппа, содержащего CD4+ эпитопы, и 2) объединение указанного антигена вируса гриппа с эмульсией масло в воде, как определено выше, где указанная вакцина после введения млекопитающему способна вызывать усиленный CD4 ответ у указанного млекопитающего. В специфическом воплощении иммуногенная композиция дополнительно способна вызывать улучшенный CD4 T-клеточный ответ и улучшенный ответ на основе B-клеток памяти по сравнению с получаемым при использовании антигена или антигенной композиции без адъюванта. Во всех этих воплощениях указанный адъювант на основе эмульсии масло в воде подходящим образом содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет масляные капли, по меньшей мере 70% по интенсивности из которых имеют диаметры меньше 1 мкм. Изобретение далее описано со ссылкой на следующие не ограничивающие его объем примеры. Пример I описывает иммунологические способы считывания, используемые в исследованиях на мышах, хорьках и людях. Пример II описывает приготовление и характеристику эмульсии масло в воде и адъювантных препаратов, используемых в примерах исследований. Пример III описывает клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный вирусный антигенный препарат и адъювант AS03. Пример IV описывает второе клиническое испытание - исследование ревакцинации - в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант AS03. Пример V демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозных вакцин у хорьков (исследование I и исследование II). Измеряли температуру, выделение вируса иCD4 T-клеточный ответ. Пример VI демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозных вакцины у наивных и примированных мышей C57BI/6. Пример VII демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной убиквиторной и субъединичной противогриппозной вакцин у мышей C57BI/6, примированных гетерологическими штаммами. Пример VIII описывает клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий адъювантAS03, адъювант AS03+МФЛ, или отсутствие экзогенного адъюванта. Пример IX демонстрирует преклиническую оценку адъювантной и неадъювантной противогриппозной вакцин у хорьков (исследование III). Измеряли температуру, выделение вируса и титры HI. Пример X демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий AS03 с адъювантом МФЛ или без него: данные по персистентности иммуногенности на 90- и 180 день.- 18011393 Пример XI демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа, содержащий AS03 с адъювантом МФЛ. Пример XII демонстрирует клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный вируса гриппа, содержащий AS03 с адъювантом МФЛ в двух концентрациях. Пример I. Способы иммунологического считывания.I.1.1. Тест ингибирования гемагглютинации. Процедура теста. Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (HI). Принцип HI теста основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (RBC) цыплят гемагглютинином вируса гриппа (HA). Инактивированные теплом сыворотки крови предварительно обрабатывали каолином и RBC цыплят для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сывороток крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыплят и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:20, необнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 10. Статистический анализ/ Статистический анализ осуществляли на титрах HI после вакцинации с использованием UNISTAT. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, кратко может быть описан в соответствии со следующим: логарифмическое преобразование данных; тест Шапиро-Вилка для каждой популяции (группы) для подтверждения нормальности распределения групп; тест Кокрана для подтверждения гомогенности дисперсии между различными популяциями (группами); двусторонний дисперсионный анализ проводили в группах; тест Tukey HSD для множественных сравнений.I.1.2. Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Этот способ дает возможность для количественной оценки антигенспецифических T-лимфоцитов на основе продукции цитокинов: эффекторные T-клетки и/или эффекторные/памяти T-клетки продуцируют IFN- и/или центральные T-клетки памяти продуцируют IL-2. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) собирают на 7 день после иммунизации. Лимфоидные клетки рестимулируют in-vitro в присутствии ингибитора секреции (Brefeldine). Эти клетки затем обрабатывали при помощи обычного способа иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующих антител (CD4, CD8, IFN- и IL-2). Результаты выражены в виде частоты цитокинположительных клеток среди CD4/CD8 T-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов вT-клетах осуществляли на МКПК через 7 дней после второй иммунизации. Кровь собирали у мышей и объединяли в гепаринизированной среде RPMI+Add. Для крови RPMI+Add-разбавленные суспензии лимфоцитов периферической крови (ЛПК) наносили на градиент Lympholyte-Mammal в соответствии с рекомендуемым протоколом (центрифугирование в течение 20 мин при 2500 об./мин и комнатной температуре (к.т Мононуклеарные клетки с границы раздела удаляли, дважды промывали RPMI+Add и суспензии МКПК доводили до 2106 клеток/мл в RPMI 5% фетальной телячьей сыворотке. Антигенную стимуляцию МКПК in-vitro осуществляли с конечной концентрацией 1107 клеток/мл(пробирка FACS) с Whole FI (1 мкг HA/штамм) и затем инкубировали в течение 2 ч при 37 С с добавлением антител против CD28 и антител против CD49d (1 мкг/мл для обоих). После стадии антигенной рестимуляции МКПК инкубируют в течение ночи при 37 С в присутствии Brefeldin (1 мкг/мл) при 37 С для ингибирования цитокиновой секреции. ОкрашиваниеIFN-/IL-2/CD4/CD8 осуществляли в соответствии со следующим: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкг ФБР 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS), содержащей 2% Fc блокирующий реагент (1/50; 2.4G2). После инкубации в течение 10 мин при 4 С 50 мкл смеси антител противCD4 PE (2/50) и антител против CD8 добавляли perCp (3/50) и инкубировали в течение 30 мин при 4 С. После промывки в ФБР 1% у FCS клеток нарушали проницаемость мембраны путем ресуспендирования в 200 мкл Cytofix-Cytoperm (набор BD) и инкубировали в течение 20 мин при 4C. Клетки затем промывали Perm Wash (набор BD) и ресуспендировали с 50 мкл смеси антител против IFN- антигенпрезентирующих клеток (APC) (1/50) + антител против IL-2 флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) (1/50), разведенных в Perm Wash. После инкубации, минимум в течение 2 ч, максимум в течение ночи при 4 С, клетки промывали Perm Wash и ресуспендировали в ФБР 1% FCS + 1% параформальдегид. Анализ образцов- 19011393 осуществляли при помощи флуоресцентного метода разделения клеток лимфоцитов (FACS). Живые клетки собирали (FSC/SSC) и осуществляли считывание приблизительно на 20000 событиях (лимфоцитах) или 35000 событиях на CD4+T-клетках. Процент IFN-+ или IL2+ рассчитывали в популяциях CD4+ и CD8+.I.2.1. Тест ингибирования гемагглютинации (HI). Процедура теста. Титры антител против гемагглютинина для трех штаммов вируса гриппа определяли с использованием теста ингибирования гемагглютинации (HI). Принцип теста HI основан на способности специфических антител к вирусу гриппа ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (RBC) цыпленка гемагглютинином вируса гриппа (HA). Сыворотки крови сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы(RDE) и инактивировали теплом для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратное разведение сыворотки крови инкубировали с 4 единицами гемагглютинации для каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали как обратную величину наибольшего разведения сыворотки крови, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Поскольку первое разведение сыворотки крови составляло 1:20, не обнаруживаемый уровень оценивали как титр, равный 5. Статистический анализ. Статистический анализ осуществляли на титрах HI (день 41, перед контрольным заражением) с использованием UNISTAT. Протокол, применяемый для анализа дисперсии, кратко может быть описан в соответствии со следующим: логарифмическое преобразование данных; тест Шапиро-Вилка для каждой популяции (группы) для подтверждения нормальности распределения групп; тест Кокрана для подтверждения гомогенности дисперсии между различными популяциями (группами); тест взаимодействия односторонний ANOVA; тест Tukey HSD для множественных сравнений.I.2.2. Контроль температуры организма. Индивидуальные температуры контролировали в течение периода контрольного заражения при помощи датчиков и при помощи телеметрической регистрации. Все имплантаты проверяли и обновляли и новую калибровку осуществляли путем DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TCTilburg, The Netherlands) перед помещением во внутрибрюшинную полость. Во время этих измерений всех животных индивидуально содержали в отдельных клетках. Температуры регистрировали каждые 15 мин в течение от 4 дней перед контрольным заражением до 7 дня после контрольного заражения.I.2.3. Назальные смывы. Назальные смывы осуществляли путем введения 5 мл ФБР в обе ноздри пришедших в сознание животных. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнер для образца на сухом льду. Титрование вируса в назальных смывах. Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры Spin X (Costar) для удаления каких-либо бактериальных примесей. 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных промывок переносили в микротитрационные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток MDCK (2,4105 клеток/мл) и инкубировали при 35 С в течение 5-7 дней. После 5-7 дней инкубации культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл 1/20 WST-1, содержащей среду, и инкубировали в течение еще 18 ч. Интенсивность желтого формазанового окрашивания, продуцируемого после восстановленияWST-1 живыми клетками, пропорциональна количеству живых клеток, находящихся в лунке к концу анализа вирусного титрования, и количественно оценивали путем измерения абсорбции в каждой лунке при подходящей длине волны (450 нм). Отсечение определяют как среднюю оптическую плотность (OD) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 OD (0,3 OD соответствует +/- 3 Ст.Откл. OD для неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда OD меньше отсечения,и наоборот отрицательную оценку определяют, когда OD больше отсечения. Титр высвобожденных вирусов определяли путем "Reed and Muench" и выражали как Log TCID50/мл.I.3. Анализы для оценки иммунного ответа у людей.I.3.1. Анализ ингибирования гемагглютинации. Иммунный ответ определяли путем измерения HI антител с использованием способа, описанногоWHO Collaborating Centre для вируса гриппа, Centres for Disease Control, 25 Atlanta, USA (1991). Измерения титра антител осуществляли на замороженных образцах сыворотки крови, подвергнутых размораживанию, со стандартизированным и полностью признанным микрометодом с использованием- 20011393 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 HIU) соответствующих антигенов и 0,5% суспензией эритроцитов кур. Неспецифические ингибиторы сыворотки крови удаляли путем тепловой обработки и при помощи фермента, разрушающего рецептор. Полученные сыворотки крови оценивали в отношении уровней HI антител. Начиная с исходного разведения 1:10, готовили серии разведений (с фактором 2) до конечного разведения 1:20480. Конечную точку титрования взяли в качестве наивысшей стадии разведения, что демонстрирует полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух параллелях.I.3.2. Анализ ингибирования нейраминидазы. Анализ осуществляли в микротитрационных планшетах, покрытых фетуином. Готовили 2-кратные серии разведений антисывороток и смешивали со стандартизированным количеством вируса гриппа AH3N2, H1N1 или вирусом гриппа B. Тест основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты -D-галактоза-N-ацетилгалактозамин демаскировали. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (HRP) агглютинин арахиса из Arachis hypogaea, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связавшегося агглютинина может быть обнаружено и количественно оценено в реакции субстрата с тетраметилбензидином (TMB). Наивысшее разведение антитела,которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, указано как титр NI.I.3.3. Анализ нейтрализующего антитела. Измерения нейтрализующего антитела осуществляли на замороженных образцах сыворотки крови,подвергнутых размораживанию. Нейтрализацию вируса антителами, содержащимися в сыворотке крови,определяли в анализе микронейтрализации. Сыворотки крови использовали без дополнительной обработки в анализе. Каждый образец сыворотки крови тестировали в трех параллелях. Стандартизированное количество вируса смешивали с сериями разведений сыворотки крови и инкубировали для того, чтобы дать возможность для связывания антител с вирусом. Клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток MDCK, затем добавляли к смеси вируса и антител и инкубировали при 33C. После периода инкубации репликацию вируса визуализировали путем гемагглютинации эритроцитов цыплят. 50% нейтрализующий титр сыворотки крови рассчитывали с использованием способа Reed and Muench.I.3.4. Опосредованный клетками иммунитет оценивали путем цитокиновой проточной цитометрии(ЦПЦ). Антигенспецифические CD4 и CD8 T-клетки периферической крови могут быть рестимулированыin-vitro для продукции IL-2, CD40L, TNF- и IFN при инкубации с соответствующим антигеном. Затем антигенспецифические CD4 и CD8 T-клетки могут быть подсчитаны путем проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также внутриклеточной продукции цитокинов. В настоящем исследовании антиген противогриппозной вакцины, а также пептиды, полученные из специфического белка вируса гриппа, использовали как антиген для рестимуляции специфических в отношении вируса гриппа T-клеток. Результаты выражены в виде частоты цитокин(ы)положительных CD4 или CD8 T-клеток в CD4 или CD8 T-клеточной субпопуляции.I.3.5.1. Первичные конечные результаты. Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией вызванных локальных и общих сигналов и симптомов в течение 7-дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 6 последующих дней) после вакцинация. Процент, интенсивность и взаимосвязь с вакцинацией вызванных локальных и общих сигналов и симптомов в течение 21 дневного последующего периода (т.е. день вакцинации и 20 последующих дней) после вакцинация. Проявление серьезных отрицательных явлений в течение всего исследования.I.3.5.2. Вторичные конечные результаты. Для гуморального иммунного ответа. Обнаруженные переменные: на 0 и 21 день: сывороточные титры, ингибирующие гемагглютинацию (HI), и титры NI антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антитела против H1N1, антитела против H3N2 и антитела против В); на 0 и 21 день: титры нейтрализующих антител тестировали отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине. Переменные-производные (с 95% доверительными интервалами): среднегеометрические титры (ГСТ) сывороточных HI антител с 95% доверительными интервалами- 21011393 серопротективные уровни с 95% ДИ на 21 день; ГСТ сывороточного NI антитела (с 95% доверительными интервалами) во все моменты времени; Уровень сероконверсии, определенный в виде процента вакцин, которые вызывали меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма. Фактор превращения, определенный как кратное увеличение ГСТ сывороточных HI на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма. Уровень защиты, определенный в виде процента вакцин с сывороточным титром HI 40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), обычно принимаемым как показатель защиты. Для опосредованного клетками иммунного (КОИ) ответа. Обнаруженная переменная. На 0 и 21 день: частота цитокин-положительных CD4/CD8 клеток на 106 клеток в различных тестах. Каждый тест количественно оценивает ответ CD4/CD8 T-клеток на пептидный антиген (pf) вируса гриппа (точная природа и происхождение этих антигенов должны быть указаны/объяснены); убиквиторный антиген (sf) вируса гриппа; полный антиген (wf) вируса гриппа. Переменные-производные: клетки, продуцирующие по меньшей мере два различных цитокина (CD40L, IL-2, IFN-, TNF-); клетки, продуцирующие по меньшей мере CD40L и другой цитокин (IL-2, TNF-, IFN-); клетки, продуцирующие по меньшей мере IL-2 и другой цитокин (CD40L, TNF-, IFN-); клетки, продуцирующие по меньшей мере IFN- и другой цитокин (IL-2, TNF-, CD40L); клетки, продуцирующие по меньшей мере TNF- и другой цитокин (IL-2, CD40L, IFN-).I.3.5.3. Анализ иммуногенности. Анализ иммуногенности основан на общей вакцинированной группе. Для каждой обрабатываемой группы рассчитывали следующие параметры (с 95% доверительными интервалами): среднегеометрические титры (ГСТ) HI и титры NI антител на 0 и 21 день; среднегеометрические титры (ГСТ) нейтрализующих антител на 0 и 21 день; фактор превращения на 21 день; уровни сероконверсии (СК) на 21 день, определенные в виде процента вакцин, которые вызывают по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 день по сравнению с 0 днем; уровни защиты на 21 день, определенные в виде процента вакцин с сывороточным титром HI 1:40; частота CD4/CD8 Т-лимфоцитов, секретируемых в ответ, суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинируемой группы в каждый момент времени (день 0, день 21) и для каждого антигена(пептид вируса гриппа (pf), убиквиторный вирус гриппа (sf) и полный вирус гриппа (wf; описательная статистика индивидуальных различий между ответами в момент времени (после-до) для каждой вакцинируемой группы и каждый антиген (pf, sf, и wf) для каждого из 5 различных тестов; непараметрический тест (тест Крушкалла-Валлиса) использовали для сравнения различий по расположению между 3 группами, и статистическое р-значение рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 различных тестов. Все тесты значимости были двусторонними. Р-значения меньше или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые. Пример II. Приготовление и характеристика эмульсии масло в воде и адъювантных препаратов. Если не указано иначе, эмульсия масло в воде, используемая в последующих примерах, состоит из органической фазы, приготовленной из 2 масел (альфа-токоферол и сквален), и водной фазы ФБР, содержащего Tween 80 в качестве эмульгатора. Если не указано иначе, готовили препараты с эмульсией масло в воде в качестве адъюванта, используемые в последующих примерах, содержащие следующий компонент эмульсии масло в воде (приведены конечные концентрации): 2,5% сквален (об./об.), 2,5% альфа-токоферол (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитана моноолеат (об./об.) (Tween 80), см. WO 95/17210. Эту эмульсию, обозначенную AS03 в последующих примерах, готовили в соответствии со следующим в виде двукратного концентрата.Tween 80 растворяют в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФБР), с получением 2% раствора в ФБР. Для получения 100 мл эмульсии с двукратной конентрацией 5 г DL альфатокоферола и 5 мл сквалена смешивают на вортексе для тщательного перемешивания. Добавляют 90 мл раствора ФБР/Tween и тщательно смешивают. Получающуюся в результате эмульсию затем пропускают через шприц и в заключение микроожижают с использованием аппарата для микроожижения M110S. Получающиеся в результате капли масла имеют размер приблизительно 120-180 нм (выраженный как средняя Z величина, измеренная при помощи ФКС). В эмульсию при простом смешивании добавляют другие адъюванты/антигенные компоненты.II.1.2. Масштабируемое приготовление. Приготовление эмульсии SB62 осуществляют путем смешивания при сильном встряхивании масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (-токоферол и сквален), и одной фазы, содержащей водорастворимые компоненты (Tween 80 и ФБР-модиф. (модифицированный), рН 6,8). При перемешивании масляную фазу (1/10 общего объема) переводят в водную фазу (9/10 общего объема) и смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Получающуюся в результате смесь затем подергают воздействию усилий сдвига, ударных и кавитации в камере для взаимодействия микроожижителя (103,421106 Па (15000 фунт/кв.дюйм) - 8 циклов) с получением субмикронных капель (распределение от 100 до 200 нм). Получающийся в результате рН составляет 6,8 0,1. Эмульсию SB62 затем стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную партию эмульсии хранят охлажденной в контейнерах Cupac при 2-8 С. Стерильный инертный газ (азот или аргон) продувают в мертвый объем контейнера с окончательной партией эмульсии SB62 в течение по меньшей мере 15 с. Конечная композиция эмульсии SB62 является следующей:II.2. Измерение размера капель масла путем динамического светорассеяния.II.2.1. Введение. Размер диаметра капель масла определяют в соответствии со следующем способом и в следующих экспериментальных условиях. Измерение размера капель приведено как измерение интенсивности и выражено в виде средней z величины, измеренной путем ФКС.II.2.2. Приготовление образца. Измерения размера осуществляют в адъюванте на основе эмульсии масло в воде: SB62, приготовленной в соответствии с масштабируемым способом, AS03 и AS03+МФЛ (50 мкг/мл), последние два готовят непосредственно перед применением. Композиция образцов приведена ниже (см. раздел II.2.4). Образцы разбавляли 4000 х-8000 х в ФБР 7,4. В качестве контроля стандарты размера частиц PL-Nanocal 100 нм (кат.6011-1015) разбавляли в 10 мМ NaCl.II.2.3. Измерения размера с использованием Malvern Zetasizer 3000HS Все измерения размера осуществляли с использованием Malvern Zetasizer 3000HS. Образцы измеряли в пластиковой кювете для анализа Malvern при подходящем разбавлении (обычно при разбавлении 4000-20000 в зависимости от концентрации образца) и с двумя оптическими моделями: реальный показатель преломления частиц 0 и мнимый показатель преломления частиц 0 или реальный показатель преломления частиц 1,5 и мнимый показатель преломления частиц 0,01 (адаптированная оптическая модель для эмульсии в соответствии со значениями, обнаруженными в литературе). Технические условия: длина волны лазерного излучения: 532 нм (Zeta3000HS); мощность лазера: 50 мВт (Zeta3000HS); детекция рассеянного света при 90 (Zeta3000HS); температура: 25 С; длительность: автоматическое определение при помощи программного обеспечения; количество: 3 последовательных измерения; средний z-диаметр: путем кумулятивного анализа; распределение частиц: при помощи способа Contin или автоматического способа. В автоматическом алгоритме Malvern используют комбинацию кумулятивных значений, алгоритмыContin и алгоритмы неотрицательных наименьших квадратов (НОНК). Распределение интенсивности может быть преобразовано в объемное распределение благодаря теории Mie. Готовили в соответствии со следующим: Вода для инъекций, ФБР 10 концентрированный, 250 мкл эмульсии SB62 и 25 мкг МФЛ вместе смешивают с достижением конечного объема 280 мкл. Средний z-диаметр (CZД) оценивают по количеству света, рассеянного частицами каждого из размеров в образце. Это значение связано с мономодальным анализом образца и в основном используется для задач воспроизводимости. Интенсивность импульсов (ИИ) представляет собой меру рассеянного света: он соответствует тысячам фотонов в секунду. Индекс полидисперсности (Poly) представляет собой ширину распределения. Он представляет собой безразмерную величину ширины распределения. Анализ Contin и автоматический анализ. Готовили два других препарата SB62 (AS03 с двукратной концентрацией) и оценивали в соответствии со способом, разъясненным выше со следующими минорными модификациями. Образцы измеряли в пластиковой кювете для анализа Malvern с двумя разведениями, определенными для получения оптимальных значений интенсивности импульсов: 10000 и 20000 для Zetasizer 3000HS, те же самые оптические модели, что и использованные в вышеприведенном примере. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3"-" полученные значения не были связанными. Схематическое представление этих результатов представлено на фиг. 1 для препарата 1023. Как можно видеть, подавляющее большинство частиц (например, по меньшей мере 80%) имеют диаметр меньше чем 300 нм по интенсивности.II.2.5. Общее заключение. Препарат SB62 измеряли с различными разведениями с использованием аппарата Malvern Zetasizer 3000HS и двух оптических моделей. Размер частиц CZД (т.е. среднее значение интенсивности в соответ- 24011393 ствии с кумулятивным анализом) в препаратах, оцененных выше, составлял приблизительно 150-155 нм. Когда использовали кумулятивный алгоритм, авторы изобретения обнаружили отсутствие влияния разбавления на CZД и полидисперсность.II.3.1. Приготовление жидкой суспензии МФЛ. Жидкую партию МФЛ (МФЛ, используемый в данном изобретении, представляет собой сокращение 3D-МФЛ, т.е. 3-О-деацилированный монофосфориллипид А) готовили из лиофилизированного порошка MPL. Жидкая партия МФЛ представляет собой стабильную концентрированную (приблизительно 1 мг/мл) водную дисперсию неочищенного материала, который готов для приготовления препарата вакцины или адъюванта. Схематическое представление способа приготовления представлено на фиг. 2. Для максимального размера партии 12 г приготовление жидкой партии МФЛ осуществляют в стерильных стеклянных контейнерах. Дисперсия МФЛ состоит из следующих стадий: суспендируют порошок МФЛ в воде для инъекции разрушают какие-либо крупные агрегаты путем нагревания (термическая обработка); уменьшают размер частиц до 100-200 нм путем микроожижения; предварительно фильтруют препарат на префильтре Sartoclean, 0,8/0,65 мкм; подвергают препарат стерильной фильтрации при комнатной температуре (Sartobran P, 0,22 мкм). Порошок МФЛ лиофилизируют путем микроожижения, что приводит в результате к стабильной коллоидной водной дисперсии (размер частиц МФЛ меньше чем 200 нм). Лиофилизированный порошок МФЛ диспергируют в воде для инъекции с получением грубой суспензии 10 мг/мл. Суспензия затем претерпевает температурную обработку при перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры способ микроожижения начинают для уменьшения размера частиц. Микроожижение осуществляют с использованием аппрата Microfluidics М 110 ЕН путем непрерывной циркуляции дисперсии через камеру взаимодействия микроожижителя при определенном давлении при минимальном количестве пропусканий (количество циклов: nмин). Длительность микроожижения,представляющая количество циклов, рассчитывают на основе измеренной скорости потока и объема дисперсии. На заданном оборудовании при заданном давлении получающаяся в результате скорость потока может варьировать от одной камеры взаимодействия к другой и в течение жизненного цикла конкретной камеры взаимодействия. В настоящем примере используемая камера взаимодействия имеет типF20Y Microfluidics. Поскольку эффективность микроожижения связана с парой давление, скорость потока, время обработки может варьировать от одной партии к другой. Время, требующееся для 1 цикла, рассчитывают на основе скорости потока. Под скоростью потока рассматривают скорость потока, измеренную с водой для инъекции непосредственно перед введением МФЛ в аппарат. Один цикл определяют как время (в минутах), необходимое для однократного пропускания общего объема МФЛ через аппарат. Время, необходимое для получения n циклов рассчитывают в соответствии со следующим:nколичество МФЛ для обработки (мл)/скорость потока (мл/мин)/ Таким образом, соответственно адаптируют количество циклов. Минимальное количество циклов для проведения (nмин) описано для предпочтительного оборудования и используемых камер взаимодействия. Общее количество циклов для проведения определяют по результату измерения размера частиц,проведенному после nмин циклов. Предел размера частиц (dлим) определяют на основе исторических данных. Измерение осуществляют при помощи способа фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) иdлим выражают как одномодальный результат (Zсреднее). При таком ограничении микроожижение может быть остановлено после nмин циклов. Выше этого предела микроожижение продолжают до получения удовлетворительного уменьшения размера частиц, максимально еще для 50 циклов. Если фильтрация не осуществляется непосредственно сразу после микроожижения, диспергированный МФЛ хранят при 2-8C, ожидая переноса в область фильтрации. После микроожижения дисперсию разбавляют водой для инъекции и подвергают стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм при плоском потоке. Конечная концентрация МФЛ составляет 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл).II.3.2. Приготовление вакцины с AS03+МФЛ в качестве адъюванта: подход с 1 виалой. К препарату адъюванта AS03 добавляют МФЛ в конечной концентрации от 10 до 50 мкг на дозу вакцины. 10-кратную концентрацию ФБР (рН 7,4 при однократной концентрации), а также смесь SB62, содержащую Tween, Triton X-100 и VES (сукцинат витамина E), добавляют к воде для инъекции. Количества принимают во внимание детергент, представленный в штаммах вируса гриппа для того, чтобы достичь целевую конечную концентрацию 750 мкг/мл Tween 80, 110 мкг/мл Triton X-100 и 100 мкг/мл VES. После перемешивания в течение 5 мин добавляют по 15 мкг каждого интересующего штамма вируса гриппа (например, штамма H1N1, H3N2 и В в классической тривалентной вакцине). После перемешивания в течение 15 мин добавляют 250 мкл эмульсии SB62 и затем 25 или 50 мкг МФЛ.- 25011393 Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 3. Конечная композицияAS03, содержащая МФЛ, на дозу для человека приведена в табл. 4. Таблица 4II.3.3. Приготовление вакцины с AS03+МФЛ в качестве адъюванта: подход с 2 виалами. Тот же самый препарат может быть приготовлен в подходе с 2 виалами путем смешивания антигена или антигенного препарата в 2 концентрации с адъювантом AS03 (SB62 250 мкл) или AS03+МФЛ(SB62 250 мкл+25 мкг или 50 мкг МФЛ). В этом случае это осуществляют в соответствии со следующим. Приготовление AS25-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий. 1) Приготовление тривалентной конечной партии (2 концентрация) без адъюванта и заполнение в антигенный контейнер. 2) Приготовление адъюванта AS03+МФЛ. 3) Растворение AS03+МФЛ убиквиторной адъювантной вирусной вакцины непосредственно перед применением. 1) Приготовление тривалентной конечной партии без адъюванта и заполнение в антигенный контейнер. Объемы трех одновалентных партий основаны на содержании HA, измеренном для каждой моновалентной партии перед приготовлением, и с целевым объемом 1100 мл. Концентрированный физиологический раствор, забуференный фосфатом, и предварительную смесь Tween 80, Triton X-100 и(A/New Caledonia, A/New York, B/Jiangsu) затем последовательно разбавляют в получающемся в результате физиологическом растворе,забуференном фосфатом/Tween 80-TritonKH2PO4, 990 мкг/мл Tween 80, 150 мкг/мл Triton X-100 и 130 мкг/мл -токоферилгидросукцинат) для получения конечной концентрации 39,47 мкг HA А штаммов (H1N1, H3N2) на 1 мл тривалентной конечной партии (15 мкг HA/А штамм/380 мкл тривалентной конечной партии) и 46 мкг HA В штамма(17,5 мкг HA/В штамм/380 мкл тривалентной конечной партии). Между добавлениями каждой одновалентной партии смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. После добавления последней моновалентной партии и перемешивания в течение 15-30 мин рН контролируют и доводят до 7,20,2 с HCl или NaOH. Тривалентную конечную партию антигенов асептически заполняют в 3-мл стерильные стеклянные виалы I типа (Ph. Eur.). Каждая виала содержит объем 470 мкл (380 мкл+90 мкл переполнение). 2) Приготовление партии адъюванта AS03/МФЛ и заполнение в адъювантный контейнер. Адъювант AS03/МФЛ получают путем смешивания двух компонентов: эмульсия SB62 (способ в разделе II.1.2) и МФЛ (способ в разделе II.3.1). ФБР-модиф. в однократной концентрации (приготовленный путем разведения 10 концентрированного ФБР-модиф. в воде для инъекции) с партией SB62 и жидкой партией МФЛ в концентрации 1 мг/мл. Концентрацию МФЛ определяют таким образом, чтобы достичь конечного содержания от 10 до 50 мкг, подходящим образом приблизительно 25 мкг на конечную- 26011393 дозу вакцины для человека. Смесь перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре и рН доводят до 6,80,1 с использованием NAOH (0,05 или 0,5 M)/HCl (0,03 или 0,3 M). После другого перемешивания в течение 5-30 мин при комнатной температуре смесь стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм. Продувание стерильным инертным газом (азотом) осуществляют с получением инертного головного пространства в заполненных контейнерах в течение минимум 1 мин. Стерильный адъювант AS03+МФЛ хранят при 2-8C до асептического заполнения в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы I типа (Ph. Eur.). Каждый шприц содержит средний объем 80 мкл (320 мкл+80 мкл переполнение). В момент инъекции содержимое предварительно заполненного шприца, содержащего адъювант,инъецируют в виалу, содержащую концентрированные тривалентные инактивированные убиквиторные антигены вириона. После смешивания содержимое отбирают в шприц и иглу заменяют на иглу для внутримышечного введения. Одна доза разведенной противогриппозной вакцины-кандидата с адъювантомII.4. Приготовление иммуногенных композиций, содержащих антиген вируса гриппа и возможно МФЛ в препарате эмульсии масло в воде. К эмульсии SB62 по II.1 добавляли равный объем дважды концентрированного убиквиторного антигена вируса гриппа (Fluarix) (15 мкг HA на штамм) и перемешивали. Его комбинировали, когда подходит, с 50 мкг/мл МФЛ с получением конечного препарата. Пример III. Клиническое испытание в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет вакцины, содержащей убиквиторный антигенный препарат вируса гриппа и адъювант AS03 (Explo-Flu-001). Открытое рандомизированное исследование I фазы проводили в популяции пожилых людей в возрасте больше 65 лет в 2003 году для оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозных вакцин-кандидатов GlaxoSmithKline Biologicals, содержащих адъювант AS03. Гуморальный иммунный ответ (т.е. антитела против гемагглютинина, титры нейтрализующих антител и антител против нейраминидазы) и опосредованный клетками иммунный ответ (CD4 и/или CD8 T-клеточные ответы) измеряли через 21 день после внутримышечного введения одной дозы AS03 адъювантной вакцины или WV вакцины.III.1. План исследования. Три группы субъектов в параллели внутримышечно получали следующую вакцину: одна группа из 50 субъектов получала одну дозу восстановленной и адъювантной противогриппозной вакцины SV (FluAS03); одна группа из 50 субъектов получала одну дозу противогриппозной вакцины на основе полного вируса (FluWVV); одна группа из 50 субъектов получала одну дозу Fluarix (Fluarix) = контрольная схема вакцинации: одна инъекция противогриппозной вакцины на 0 день, отбор образца крови, анализ считывания на 21 день (определение HI антитела, определение NI антитела, определение нейтрализующих антител и КОИ анализ) и завершение исследования. Стандартная тривалентная убиквиторная противогриппозная вакцина Fluarix, используемая в этом исследовании, представляет собой имеющуюся в продаже вакцину, с 2003 года разработанную и производимую GlaxoSmithKline Biologicals.III.2.1. Вакцинный препарат. Противогриппозная вакцина с адъювантом AS03. Кандидат противогриппозной вакцины с адъювантом AS03 представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных тривалентных инактивированных убиквиторных антигенов вириона, представленных в стеклянной виале I типа (335 мкл) (антигенный контейнер), и из предварительно заполненного стеклянного шприца I типа, содержащего эмульсию SB62 (335 мкл) (адъювантный контейнер). В момент инъекции содержимое антигенного контейнера удаляют при помощи шприца,предварительно заполненного эмульсией SB62, с последующим осторожным смешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсии SB62 с вакцинными антигенами разбавляет адъювант AS03. Перед инъекцией используемую иглу заменяют на внутримышечную иглу и объем корректируют до 500 мкл. Одна доза восстановленной противогриппозной вакцины с адъювантом.AS03 соответствует 0,5 мл, содержит 15 мкг HA каждого штамма вируса гриппа как в зарегистрированной вакцине Fluarix/-Rix и содержит 10,68 мг сквалена, 11,86 мг DLтокоферола и 4,85 мг полисорбата 80 (Tween 80). Приготовление. Приготовление противогриппозной вакцины с адъювантом AS03 состоит из трех основных стадий. 1) Приготовление тривалентной конечной партии без адъюванта и заполнение антигенного контейнера. Объемы трех одновалентных партий основаны на содержании HA, измеренном в каждой одновалентной партии перед приготовлением и при целевом объеме 800 мл.- 27011393 Концентрированный физиологический раствор, забуференный фосфатом, и предварительно приготовленную смесь Tween 80, Triton Х-100 и -токоферилгидросукцината разбавляют в воде для инъекции. Три концентрированных моноштамма (штамм A/New Caledonia-, штамм A/Panama- и штаммB/Shangdong-) затем последовательно разбавляют в получающемся в результате физиологическом растворе, забуференном фосфатом/Tween 80-Triton Х-100-раствор -токоферилгидросукцината (рН 7,4,137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, 1500 мкг/мл Tween 80, 220 мкг/мл Triton Х-100 и 200 мкг/мл -токоферилгидросукцината) для получения конечной концентрации 60 мкг HA А штаммов на 1 мл тривалентной конечной партии (15 мкг HA/А штамм/250 мкл тривалентной конечной партии) и 70 мкг HA В штамма (17,5 мкг HA/В штамма/250 мкг тривалентной конечной партии). Между добавлениями каждой одновалентной партии смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной партии и перемешивания в течение 15 мин рН контролируют и доводят до 7,20,1 с использованием HCl или NaOH. Тривалентную конечную партию антигенов асептически заполняют в 3-мл стерильные стеклянные виалы I типа. Каждая виала содержит 34% объемный избыток (общий объем 335 мкл). 2) Приготовление стерильной партии эмульсии SB62 и заполнение в адъювантный контейнер. Водная фаза: при перемешивании 902 мл Tween 80 смешивают с 44105 мл ФБР-модиф. буфера(рН 6,8 после доведения с использованием HCl). Масляная фаза: при перемешивании 2550 мл сквалена добавляют к 2550 мл -токоферола. Смешивание водной и масляной фаз: при перемешивании 5000 мл масляной фазы (1/10 общего объема) переносят в 45007 мл водной фазы (9/10 общего объема). Смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Эмульгация: получающуюся в результате смесь подергают воздействию усилий сдвига, ударных и кавитации в камере для взаимодействия микроожижителя (103,421106 Па (15000 фунт/кв.дюйм) - 8 циклов) с получением субмикронных капель (распределение от 100 до 200 нм). Получающийся в результате рН составляет 6,80,1. Стерильная фильтрация: эмульсию SB62 стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную партию эмульсии хранят охлажденной в контейнерах Cupac при 2-8 С. Стерильный инертный газ (азот или аргон) продувают в мертвый объем контейнера с окончательной партией эмульсииSB62 в течение по меньшей мере 15 с. Все указанные количества ингредиентов приведены для препарата 50 л эмульсии и указаны в объемах. На практике количества взвешены, принимая во внимание плотности ингредиентов. Плотность ФБР рассматривают равной 1. Конечная композиция эмульсии SB62 является следующей. Таблица 5 Стерильную партию эмульсии SB62 затем асептически заполняют в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы I типа. Каждый шприц содержит 34% излишек объема (общий объем 335 мкл). 3) Восстановление убиквиторной вирусной вакцины с адъювантом AS03 непосредственно перед применением. В момент инъекции содержимое виалы, содержащей концентрированные тривалентные инактивированные убиквиторные антигены вириона, удаляют из виалы при помощи шприца, содержащего эмульсию SB62, с последующим осторожным смешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсииSB62 с вакцинными антигенами разбавляет адъювант AS03. Вакцины вводили внутримышечно в дельтовидную область недоминантной руки. За вакцинами наблюдали сразу в течение по меньшей мере 30 мин, с подходящей медицинской обработкой, легкодоступной в случае редкой анафилактической реакции после введения вакцины.III.3. Результаты исследования на популяции. В общей сложности 148 субъектов были вовлечены в это исследование: 49 субъектов в группеFluAS03, 49 субъектов в группе Fluarix и 50 субъектов в группе FluWVV. Средний возраст общей вакцинированной группы в момент вакцинации составлял 71,8 лет со стандартным отклонением 6,0 лет. Распределение среднего возраста и пола для субъектов в трех группах вакцин было похожим.III.4. Заключения по безопасности. Введение противогриппозной вакцины с адъювантом AS03 является безопасным и клинически хорошо переносится в исследуемой популяции, т.е. пожилых людей в возрасте больше 65 лет.II1.5. Результаты иммуногенности. Анализ иммуногенности осуществляли в общей вакцинированной группе.III.5.1. Гуморальный иммунный ответ. Для оценки гуморального иммунного ответа, вызванного вакциной с адъювантом AS03, следующие параметры (с 95% доверительными интервалами) рассчитывали для каждой обрабатываемой группы: среднегеометрические титры (ГСТ) HI и титры NI антитела на 0 и 21 день; среднегеометрические титры (ГСТ) нейтрализующих антител на 0 и 21 день; уровни сероконверсии (СК) на 21 день, определенные в виде процента вакцин, которые вызывают по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 день по сравнению с 0 днем; факторы превращения на 21 день, определенные в виде кратного увеличения сывороточных ГСТ HI на 21 день по сравнению с 0 днем для каждого вакцинного штамма; уровни защиты на 21 день, определенные в виде процента вакцин с сывороточным титром HI 1:40.III.5.1.1 Ответ в виде антител против гемагглютинина. а) Среднегеометрические титры (ГСТ) HI. ГСТ для HI антител с 95% ДИ представлены в табл. 7 (ГСТ для антитела против HI). ГСТ антител в момент перед вакцинацией для всех вакцинных штаммов находился в том же самом диапазоне для трех групп. После вакцинации уровни антител против гемагглютинина значительно увеличивались. После вакцинации существовала тенденция более высоких ГСТ HI антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах FluAS03 и Fluarix, хотя имелось некоторое перекрывание 95% ДИ между группой Fluarix и группой FluWVV.N = количество субъектов, для которых имеются результаты; 95% ДИ = 95% доверительный интервал; НП = нижний предел; ВП = верхний предел; МИН/МАКС = минимальный/максимальный; Пре = перед вакцинацией на 0 день; ПВ (21 день) = после вакцинации на 21 день. б) Факторы превращения титров антител против HI, серопротективные уровни и уровни сероконверсии (коррелируют с защитой у человека). Результаты представлены в табл. 8. Факторы превращения представляют кратное увеличение сывороточных ГСТ HI для каждого вакцинного штамма на 21 день по сравнению с 0 днем. Фактор превращения варьирует от 6,1 до 13,6 в соответствии с штаммом вируса и вакциной. Этот фактор превращения значительно превышает 2-кратное увеличение ГСТ, которое требуется европейскими регулирующими органами. Серопротективные уровни представляют долю субъектов, имеющих сывороточный титр HI 540 на 21 день. В начале исследования половина субъектов (диапазон 34,0-69,4%) во всех группах имела защитные уровни антител для всех штаммов на 21 день, серопротективные уровни в трех группах находились в диапазоне от 88,0 до 100% для различных штаммов вируса. В терминах защиты это означает, что более чем 88% субъектов имеет сывороточный титр HI не менее 40 после вакцинации и полагают, что они защищены против трех штаммов. Этот уровень значительно превосходит серопротективный уровень 60%, требующийся для популяции в возрасте не менее 60 лет европейскими регулирующими органами. Уровни сероконверсии представляют долю субъектов, имеющих по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 день по сравнению с 0 днем. Общие уровни ответа для трех штаммов были, по существу, эквивалентыми для трех групп. Для того чтобы рассматриваться как эффективная и в соответствии с Евросоюзом, вакцина должна индуцировать уровень сероконверсии больше 30% в популяции людей в возрасте 60 лет. В этом исследовании уровень сероконверсии был больше чем 50% для трех групп.