Полиоболочечная вирусная вакцина против вируса иммунного дефицита человека (вич), способ генерации гуморального и/или клеточного иммунного ответа у млекопитающих на вич и бифункциональная плазмида

1 Эта работа была поддержана частично грантом Национального Института Рака R01CA57419-03 и основным грантом поддержки Центра по раку Р 30-СА 21765, грантами Национального института здоровья - Национального института аллергии и инфекционных заболеваний AI-32529 и P01-AI31596-04. Таким образом,правительство США имеет определенные права на это изобретение. Область изобретения Настоящее изобретение относится к полиоболочечным вирусным вакцинам против вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ),состоящим из смеси, как минимум, 4-40 и до 10000 рекомбинантных вирусов коровьей оспы,каждый из которых экспрессирует различный вариант белка оболочки ВИЧ. Вакцины пригодны для вакцинации млекопитающих, включая людей, с целью обеспечения неожиданно усиленного клеточного и/или гуморального иммунного ответа на заражение ВИЧ. Кроме этого,изобретение относится к способам получения и применения таких рекомбинантных вирусов коровьей оспы и полиоболочечных вирусных вакцин. Предпосылки к созданию изобретения Похоже, что вирус СПИД унесет десятки миллионов жизней к 2000 г., что делает заботу о здоровье во всем мире высшим приоритетомVirology, стр. 1529-1543, и Hirsch и др. в Virology, стр. 1545-1570]. Создание эффективной вакцины против ВИЧ представляет определенный вызов иммунологам, так как вовлеченный в репликацию ВИЧ фермент обратная транскриптаза имеет высокую степень ошибки. Это приводит в результате к многим мутантным штаммам ВИЧ, имеющим в наружном слое или оболочке белки с различными последовательностями. Эти различные белки оболочки часто распознаются как различные антигены иммунной системой млекопитающего, которая продуцирует более 109 новых лимфоцитов в день с единственной целью противодействовать чужеродным антигенам. В- и Т-лимфоциты составляют, соответственно, гуморальные и клеточные компоненты иммунного ответа. Хороший пример качественной силы таких иммунных ответов показан на инфицированных ВИЧ больных и макаках, инфицированных обезьяним вирусом иммунодефицита. В каждом случае проходят последовательные раунды инфицирования, иммунитета и получения различных вирусов иммунного дефицита человека и обезьян [Wrin и др., J. Acquir. Immune Defic.Topics Microbial Immunol. 188: 185-219 (1994)]. С каждым циклом возрастает многообразие антигенных детерминант ВИЧ (и соответствую 002390 2 щих иммунных ответов) таким образом, что эти иммунные ответы нейтрализуют широкий круг вариантов ВИЧ и вируса иммунного дефицита обезьян, и суперинфекция в значительной степени ингибируется. Однако у больных СПИД развивается компромиссные иммунные ответы, которые становятся недостаточными для предотвращения заражения ВИЧ из-за ослабления иммунной системы больного. Это может быть частично из-за образования вариантов ВИЧ, различные белки оболочек которых не узнаются иммунной системой больного и, таким образом, избегают деструкции (Sci. Amer., август 1995). В таких случаях, даже если иммунный ответ способен предотвратить инфекцию de novo (например, устойчивая мутация вируса в привилегированных секвестрованных сайтах), заражение ВИЧ может полностью преодолеть иммунный ответ больного [Pantaleo и др., Nature 362: 355-358 (1993);Embretson и др., Nature 362: 359-362 (1993)]. Идентификация антигенных детерминант В- и Т-лимфоцитов среди белков ВИЧ остается неполной. Белок оболочки ВИЧ был охарактеризован как имеющий вариабельный (V1-V5) и постоянный (С 1-С 5) участки. Пептид, представитель участка V3, был назван главной нейтрализующей детерминантой (ГНД) [Javaherian и др., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768-6772(1989)], хотя другие участки белка оболочки могут также быть вовлечены в возбуждение иммунного ответа. Белок оболочки ВИЧ полной длины содержит от около 850 до 900 аминокислот с вариацией по длине вследствиe гипермутации [Starcich и др., Cell 45: 637 (1986)]. Первые вакцины против ВИЧ, оцененные в клинических испытаниях, были созданы для представления белков одной оболочки или их частей иммунной системе. Однако нейтрализующие ответы по отношению к белкам одной или нескольких оболочек не узнавали различные изоляты ВИЧ, и отдельные индивидуумы не были защищены от заражения [Belshe и др., J.Am. Med. Assoc. 272: 431 (1994); патент США 5.169.763; публикация РСТ международной заявки на патент 87/06262; Zagury и др., Nature 332: 728-731 (1988); Kieny и др., Int. Conf. AIDS 5: 541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7: 88(1994); Fauci, Science 264: 1072-1073 (май 1994)]. Соответственно, имеется давно назревшая неотложная необходимость открыть вакцины и способы, вызывающие иммунный ответ, достаточный для лечения или предотвращения заражений ВИЧ. 3 Краткое описание изобретения Настоящее изобретение предполагает преодоление одного или более недостатков в родственных областях. В частности, полиоболочечная вакцина по настоящему изобретению преимущественно обеспечивает более сильный иммунный ответ. Достоинство настоящего изобретения заключается в его способности пополнять В-лимфоциты, Т-хелперы и компартменты цитотоксических Т-лимфоцитов (Тc-лимфоцитов) иммунного ответа для эффективного гуморального и клеточного иммунитета. Например, настоящее изобретение способствует большей широте активности специфичных к ВИЧ антител. Опыты по нейтрализации ВИЧ показывают,что вызванные антитела обладают превосходным качеством. Удивительно, но согласно изобретению генерируются иммунные ответы против не подвергнутых какому-либо воздействию штаммов ВИЧ, т.е. штаммов ВИЧ, для которых белки оболочки не включены в полиоболочечную смесь. Для обеспечения более эффективных вакцин против ВИЧ настоящее изобретение представляет полиоболочечные вирусные вакцины,состоящие из смесей, как минимум, от 4 до около 10000, предпочтительно от 4 до около 1000 и наиболее предпочтительно от около 10 до около 100 различных рекомбинантных вирусов, каждый из которых экспрессирует различный вариант белка оболочки ВИЧ (или существенную его часть), который включает и константный, и вариабельный участки оболочечного белка. Предпочтительно, каждый из экспрессированных вариантов белка оболочки имеет строение и/или иммуногенность, подобные таковым для белка оболочки нативного ВИЧ, существующего в инфицированной клетке или липидном двойном слое ВИЧ, таком как в олигомерной форме. Также представлены способы получения и применения таких рекомбинантных вирусов и полиоболочечных вирусных вакцин. При их использовании в качестве вакцины каждый из различных белков оболочки предпочтительно индуцирует различную субпопуляцию В- и/или Тлимфоцитов, каждая субпопуляция отвечает различным белкам оболочки и, следовательно,множественным вариантам ВИЧ. Смесь такого числа, типа и/или структуры белков оболочки составляет основу открытого в настоящее время способа вызова сильного, продолжительного,специфического к ВИЧ иммунного ответа с широким спектром нейтрализующей активности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы выбираются из группы, состоящей из вируса коровьей оспы, вируса канареечной оспы, аденовируса и аденоассоциированного вируса (ААВ). В специальном примере ниже вирус коровьей оспы используется для получения полиоболочечной вирусной вакцины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина с 4 рекомбинантным вирусом коровьей оспы по изобретению вводится подкожно. Другим преимуществом изобретения является то, что подкожное введение вируса коровьей оспы не приводит к образованию повреждения, таким образом избегается выделение заразной коровьей оспы, которая является потенциальной угрозой иммунокомпромиссной популяции. Предпочтительно полиоболочечная вирусная вакцина из рекомбинантных вирусов по изобретению содержит лизат инфицированных вирусом ростовых клеток, например, клетокVero, который содержит экспрессированные варианты белков оболочки в дополнение к инфекционному вирусу. Включение вариантов белков оболочки лизата, что содействует иммунному ответу, составляет особое отличие настоящего изобретения, так как обычно вирус удаляют при очистке из лизата ростовых клеток. В вакцинах по изобретению вариант нуклеотида оболочки может быть выделен у больных, инфицированных вирусом иммунного дефицита человека из географически ограниченного района или различными вариантами ВИЧ или из лабораторных изоляторов ВИЧ. Обнаружено, что полиоболочечные вирусные вакцины настоящего изобретения вызывают неожиданно усиленные иммунные ответы путем экспрессии и/или презентирования множественных вариантов белков оболочки, каждый из которых содержит как константные, так и вариабельные участки, предпочтительно имея строение, которое в значительной степени подобно строению белка оболочки нативного ВИЧ. Усиленные иммунные ответы распознают штаммы ВИЧ в дополнение к штаммам, экспрессирующим белки оболочки, предоставляемые в полиоболочечной вирусной вакцине. Таким образом, задачей такой вакцины является обеспечение усиленных иммунных ответов на широкий круг штаммов ВИЧ, такие иммунные ответы пригодны для лечения или предупреждения заражения (или продолжительной инфекции вследствие мутации) различными штаммами вируса. Настоящее изобретение также обеспечивает оболочечный вариант нуклеиновой кислоты,кодирующей (или комплементарной ей), как минимум, одну антигенную детерминанту варианта белка оболочки. Вариант белка оболочки предпочтительно кодируется рекомбинантным вирусом, что далее обеспечивается полиоболочечной вирусной вакциной настоящего изобретения. Вариант нуклеиновой кислоты включает,как минимум, одну мутацию, которая представляет различающиеся антигенные свойства, или трехмерную структуру кодируемому варианту белка оболочки. Представленное изобретение обеспечивает состав вакцины, включающий полиоболочечную вирусную вакцину по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носи 5 тель или разбавитель. В состав вакцины может дополнительно входить адъювант и/или цитокин, который усиливает иммунный ответ от полиоболочечной вирусной вакцины на, как минимум, один штамм ВИЧ при введении вакцины млекопитающему. Полиоболочечная вирусная вакцина настоящего изобретения способна индуцировать иммунный ответ, включающий, как минимум, один из гуморального иммунного ответа (например, антитела) и клеточного иммунного ответа (например, активация Влимфоцитов, Т-хелперов и Тc-лимфоцитов). Настоящее изобретение также обеспечивает способ вызова иммунного ответа на инфицирование ВИЧ у млекопитающего, который является профилактическим против заражения ВИЧ,способ включает введение млекопитающему композиции, включающей полиоболочечную вирусную вакцину представленного изобретения, которая защищает млекопитающего против клинической, связанной с ВИЧ патологии, вызванной заражением, как минимум, одним штаммом ВИЧ. Настоящее изобретение также обеспечивает способ вызова иммунного ответа на заражение ВИЧ у млекопитающего для лечения заражения ВИЧ. Способ предусматривает введение млекопитающему композиции, содержащей инактивированную или ослабленную полиоболочечную вирусную вакцину по настоящему изобретению, эта композиция вызывает у млекопитающего усиленный иммунный ответ относительно контроля против клинической вирусной патологии, вызванной заражением, как минимум, одним штаммом ВИЧ. В другом варианте осуществления изобретения профилактический или терапевтический способ вызова иммунного ответа на ВИЧ включает введение эффективного количества другой(например, второй) полиоболочечной вирусной вакцины, содержащей, как минимум, от 4 до около 10000 различных рекомбинантных вирусов, в которой рекомбинантные вирусы являются вирусами другого вида, нежели рекомбинантные вирусы предыдущей вакцины, и каждый из рекомбинантных вирусов полиоболочечной вирусной вакцины экспрессирует определенный белковый вариант белка оболочки ВИЧ. Специфичный к ВИЧ иммунный ответ, генерируемый полиоболочечной вакциной из рекомбинантных вирусов настоящего изобретения, может быть далее усилен праймированием или активированием гуморального или клеточного иммунного ответа, или обоих, путем введения эффективного количества, как минимум,одного рекомбинантного белка оболочки ВИЧ,или вакцины с ДНК, или обоих. Предпочтительно рекомбинантный белок или вакцина с ДНК является также полиоболочечной вирусной вакциной. Любая из стратегий с использованием вакцины, предусмотренная здесь, может быть осуществлена в любом порядке. Например, 002390 6 субъект может быть первоначально вакцинирован полиоболочечной вакциной из рекомбинантных вирусов, а затем реиммунизирован вакциной с ДНК с конечной дополнительной иммунизацией вакциной из рекомбинантных белков. Предпочтительно рекомбинантный белок оболочки ВИЧ находится в смеси с адъювантом. В специальном варианте осуществления изобретения, пример см. ниже, рекомбинантный белок оболочки ВИЧ вводится внутримышечно. Предпочтительно, что ДНК-вектор вводят методикой выстреливания генов. Вышеописанные способы изобретения обеспечивают стимул к генетическому конструированию нового плазмидного вектора. Так, в результате, настоящее изобретение представляет бифункциональную плазмиду, которая может служить вакциной с ДНК и рекомбинантным вирусным вектором, включающую ксеногенный сайт инсерции под контролем как экспрессионной контрольной последовательности животного, так и вирусной экспрессионной контрольной последовательности. Предпочтительно экспрессионной контрольной последовательностью у животного является предранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ) и вирусной экспрессионной контрольной последовательностью является ранний промотор вируса коровьей оспы,поздний промотор вируса коровьей оспы или оба. Другие объекты, черты, преимущества, использования и осуществления вариантов настоящего изобретения будут очевидны квалифицированным практикам из следующего ниже подробного описания и примеров, относящихся к настоящему изобретению. Краткое описание фигур Фиг. 1 - схематическое представление ориентации гена ВИЧ-1 в геноме вируса коровьей оспы. Ген оболочки ВИЧ-1 располагается между правым и левым сегментами локуса тимидинкиназы. Сайт HindIII существует при С-конце гена оболочки ВИЧ-1. Подходящая инсерция дает фрагмент HindIII размером примерно 7 Т.н Саузерн-блоты с этим примером подтвердили положение и правильную ориентацию гена оболочки ВИЧ-1. Фиг. 2 - графическое представление данных, показывающих, что ответ специфичного к ВИЧ антитела является длительным на моделях млекопитающих. Показаны результаты образцов мышиных сывороток, исследованных с помощью ELISAтеста на специфичные к ВИЧ антитела. Каждый образец разбавляли 1:100 (полностью окрашенные полосы), 1:1000 (заштрихованные полосы) и 1:10000 (неокрашенные полосы) перед анализом на планшетах для ELISA-теста, покрытых ВИЧ-1. Исследуемых мышей отбирали в различное время (1 месяц, 4 месяца и 6 месяцев) после инъекции 107 бляшкообразующих единиц(pfu) конструкции вируса коровьей оспы, экспрессирующей один белок оболочки ВИЧ-1. Контрольную мышь подвергали иммунизации вирусом коровьей оспы, не содержащим оболочечной последовательности. Показаны полосы,соответствующие стандартным ошибкам. Фиг. 3 - графическое представление данных, показывающих, как доза вируса коровьей оспы влияет на индукцию, как минимум, одного иммунного ответа, включая продукцию специфичных к ВИЧ антител. Образцы мышиной сыворотки исследовали с помощью ELISA-теста на покрытых ВИЧ-1 планшетах. Образцы сыворотки брали у мышей,инъецированных 105, 106 и 107 pfu вируса коровьей оспы, экспрессирующего белок оболочки ВИЧ-1. Образцы сыворотки исследовали примерно через три недели после инъекции. Каждый образец разбавляли 1:100 (полностью окрашенные полосы), 1:1000 (заштрихованные полосы) и 1:10000 (неокрашенные полосы) перед анализом на планшетах для ELISA-теста,покрытых ВИЧ-1. Показаны полосы, соответствующие стандартным ошибкам. Фиг. 4 - графическое представление данных, показывающих, что смешивание конструкций вируса коровьей оспы не ставит под угрозу вызов специфичного к ВИЧ антитела у инъецированных млекопитающих. Образцы мышиной сыворотки исследовали с помощью ELISA-теста примерно через 2 месяца после инъекции 107 pfu вируса коровьей оспы, экспрессирующего белок (белки) оболочки ВИЧ-1. "Один" указывает на образец от мыши, которая получала один вирус коровьей оспы. "Смесь" представляет образец от мыши,которая получала смесь вирусов коровьей оспы,экспрессирующих пять отдельных белков оболочки. Каждый образец разбавляли 1:100 (полностью окрашенные полосы), 1:1000 (заштрихованные полосы) и 1:10000 (неокрашенные полосы) перед анализом на покрытых ВИЧ-1 планшетах для ELISA-теста. Представлены полосы,соответствующие стандартным ошибкам. Фиг. 5 - продукция новой рекомбинации вируса коровьей оспы путем замены продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) последовательностями BH10 pEvenv4. Показан способ замены последовательности. Продукты ПЦР заменяли соответствующими оболочечными последовательностями BH10 при особых ферментных сайтах рестрикции КрnI и BsmI. После разрезания плазмиды и лигирования с продуктами ПЦР новые плазмиды были подвергнуты рекомбинации с помощью вируса коровьей оспы (VV) дикого типа для создания экспрессирующих векторов VV. Фиг. 6 - ответы после иммунизации, исследованные с помощью ELISA-теста (наборы для ELISA от фирмы Эббот). Сыворотки четырех шимпанзе исследовали с помощью клинического анализа фирмы 8 Эббот (см. материалы и методы ниже). Результаты для образца каждой сыворотки (ось Y) записаны для каждой исследованной даты (ось X). Сильные ответы наблюдались у шимпанзе, иммунизированных смешанной вакциной с оболочками вируса коровьей оспы. Фиг. 7 - карта бифункциональной плазмиды, которая может действовать и как вакцина с ДНК, и как вектор рекомбинации вируса коровьей оспы. Присутствие предраннего промотора цитомегаловируса (ЦМВ) и позднего и раннего промоторов вируса коровьей оспы (VV) дает возможность экспрессировать чужеродный ген и в клетках млекопитающих, и в инфицированных вирусом коровьей оспы клетках. Подробное описание изобретения Обнаружение неожиданно усиленных иммунных ответов на смешанные полиоболочечные вирусные вакцины против ВИЧ. Ранее предпринятые попытки обеспечить вакцины против различных штаммов ВИЧ фокусировались на одном или нескольких вариабельных участках gp 120 или gp 160. Ожидалось, что такие вариабельные участки, представленные в вакцине, смогли бы обеспечить широкую защиту против заражения ВИЧ. Однако такие вакцины не имели успеха, в этих случаях индуцированный вакциной иммунный ответ не распознавал многие различные штаммы ВИЧ. Поэтому существует неотложная необходимость обеспечить вакцины, которые вызывают иммунные ответы на многие штаммы ВИЧ, так, чтобы вакцины годились для лечения и/или предотвращения заражения ВИЧ. В представленном изобретении найдено,что неожиданно усиленные первичные и вторичные (реиммунизация) иммунные ответы могут быть индуцированы против некоторых или многих различных штаммов ВИЧ при применении полиоболочечных вирусных вакцин, которые содержат смесь, как минимум, от 4 до 1000 и возможно до 10000 рекомбинантных вирусов,каждый из которых экспрессирует определенный вариант белка оболочки. Вакцины могут также содержать варианты белков оболочек,экспрессированные вирусами, например, продуцированные в клетках организма-хозяина, используемых для продуцирования вируса. Термины праймирование или первичный и усиливать или реиммунизация используются здесь, чтобы обозначить начальную или последующие иммунизации, соответственно, т.е. в соответствии с определениями, которые эти термины обычно имеют в иммунологии. Кодирующая вариант белка оболочки нуклеиновая кислота (оболочечный вариант нуклеиновой кислоты) может быть выделена из той же или другой популяции (например, географической) людей, инфицированных ВИЧ. Альтернативно различные оболочечные варианты нуклеиновых кислот могут быть получены из любо 9 го источника и выбраны, основываясь на скрининге последовательностей для различий в кодирующей последовательности, или путем оценки в вызванном гуморальном и/или клеточном иммунных ответах на множественные штаммы ВИЧ, in vitro или in vivo, в соответствии с известными способами. Первоначально изобретение относилось к вакцинам из рекомбинантных вирусов коровьей оспы. Однако как легко может оценить специалист в данной области, любой рекомбинантный вирус может быть использован для экспpессии полиоболочечных вирусных антигенов для вакцины по изобретению. Более того, использование вакцин из многих вирусов может предотвратить противовирусные иммунные ответы,что может делать реиммунизацию вирусной вакциной менее эффективной (вследствие возможного потенцирования мощного противовирусного ответа). Как уже понятно специалисту, далее было обнаружено, что реиммунизация рекомбинантным белком оболочки ВИЧ или белками, предпочтительно белками, дополнительно усиливает действие способов иммунизации данного изобретения. Белок или белки оболочек ВИЧ могут соответствовать белкам оболочки ВИЧ, экспрессированным в полиоболочечной вирусной вакцине, или они могут быть другими белками оболочки ВИЧ. Подобным же образом, как могут оценить специалисты, способы иммунизации по настоящему изобретению улучшаются при использовании вакцины с ДНК. Вакцина с ДНК может быть использована как поддержка, например,как описано выше по отношению к рекомбинантным белкам ВИЧ. Альтернативно, вакцина с ДНК может быть использована, чтобы стать затравкой для иммунитета, вместе с рекомбинантной вирусной вакциной или вакцинами,используемыми для усиления иммунного ответа против ВИЧ. Как и в случае усиливающей вакцины с рекомбинантным белком оболочки, вакцина с ДНК может содержать один или более векторов для экспрессии одного или более env генов ВИЧ. В дополнение, env гены ВИЧ могут соответствовать генам, экспрессированным вакциной из рекомбинантных вирусов, или они могут отличаться. В предпочтительном варианте осуществления изобретения векторы получают для экспрессии в вакцине из рекомбинантных вирусов и в клетках млекопитающих после трансфекции как часть вакцины с ДНК. Показано, что такой иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный) эффективен для более широкого ряда штаммов инфицирующего вируса, как, например, ВИЧ, и не ограничивается вирусными штаммами, экспрессирующими специфические варианты белков оболочек, предоставляемые полиоболочечной вирусной вакциной. Настоящее изобретение, таким образом,обеспечивает многочисленные варианты белков 10 оболочек, кодируемые рекомбинантной вирусной вакциной, которые неожиданно вызывают усиленные иммунные ответы на многочисленные штаммы ВИЧ. Полиоболочечные вирусные вакцины и вакцинация Настоящее изобретение, таким образом,обеспечивает, с одной стороны, полиоболочечные вирусные вакцины, использующие смеси,как минимум, от 4 до около 10000 различных рекомбинантных вирусов коровьей оспы, каждый из которых экспрессирует различный вариант белка оболочки, или его антигенную часть. Как легко может оценить специалист, могли быть использованы от 4 до около 1000 или предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 различных рекомбинантных вирусов. Обычному специалисту также понятно, что и другие вирусы могут использоваться для вакцин. Примеры подходящих вирусов, которые могут действовать как рекомбинантные вирусыхозяева для вакцин, в дополнение к вирусу коровьей оспы включают вирус канареечной оспы,аденовирус и аденоассоциированный вирус. Также предоставляются способы получения и применения таких полиоболочечных вирусных вакцин. Полиоболочечная вирусная вакцина по настоящему изобретению индуцирует, как минимум, один из гуморального или клеточного иммунный ответ у млекопитающего, которому вводили полиоболочечную вирусную вакцину,но ответ на вакцину субклинический, или вакцина эффективна для усиления, как минимум,одного иммунного ответа на, как минимум,один штамм ВИЧ, так что введение вакцины подходит для целей вакцинации. Вирусные вакцины. Различные полученные методом генной инженерии вирусы-хозяева("рекомбинантные вирусы") могут быть использованы для получения полиоболочечных вирусных вакцин для введения полиоболочечных антигенов ВИЧ. Вирусные вакцины имеют особое преимущество, так как вирусный инфекционный компонент способствует сильному иммунному ответу, который нацелен на активацию Влимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов (Тс-лимфоцитов). Многочисленные виды вирусов могут быть использованы как рекомбинантные вирусы-хозяева для вакцин данного изобретения. Предпочтительным рекомбинантным вирусом для вирусной вакцины является вирус коровьей оспы [международная заявка на патент 87/06262, октябрь 22, 1987, Moss и др., Cooney и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-6(1993); Graham и др., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992); McElrath и др., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)]. В другом варианте осуществления изобретения может быть использован рекомбинантный вирус канареечной оспы [Pialoux и др., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 373-81(1995)]. Другим из возможных вирусов является дефектный аденовирус или аденовирус [GilardiHebenstreit и др., J. Gen. Virol. 71: 2425-31(1990); Lubeck и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763-7 (1989); Xiang и др., Virology 219: 2207 (1996)]. Другие подходящие вирусные векторы включают ретровирусы, которые уложены в клетках с амфотропным рядом хозяев [см.Miller, Human Gene Ther. 1: 5-14 (1990); Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology,9],и ослабленный вирус или вирус с дефектной ДНК, такой как, но и не только, вирус простого герпеса (ВПГ) [см., например, Kaplitt и др., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330 (1991)], вирус папилломы, вирус Эпштейна-Барра (ЭБВ), аденоассоциированный вирус (ААВ) [см., например,Samulski и др., J. Virol. 61: 3096-3101 (1987);Samulski и др., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989)] и им подобные. Вакцины из ДНК. Альтернативу традиционной вакцине, содержащей антиген и адъювант, составляет прямое in vivo введение кодирующей антиген ДНК в ткани субъекта для экспрессии антигена клетками ткани субъекта. Такие вакцины здесь упоминаются как "вакцины с ДНК" или "вакцины, основывающиеся на нуклеиновой кислоте". Вакцины с ДНК описываются в опубликованных международных заявках на патенты 95/20660 и 93/19183. Способность непосредственно инъецированной ДНК, кодирующей вирусный белок, вызвать защитный иммунный ответ была продемонстрирована в многочисленных экспериментальных системахSci., 90: 4156-4160(1993); Xiang и др., Virology,199: 132-140 (1994)]. В исследованиях по применимости этой стратегии для нейтрализации вируса гриппа были использованы и оболочечные, и внутренние вирусные белки для индуцирования выработки антител, но в особенности сосредоточили внимание на белке вирусного гемагглютинина (ГА) [Fynan и др., DNA Cell.Natl. Acad. Sci., 90: 11478-11482 (1993B); Robinson и др., Vaccine, 11: 957, (1993); Webster и др.,Vaccine, 12: 1495-1498 (1994)]. Вакцинация путем прямого введения ДНК,кодирующей белок оболочки ВИЧ, для вызова защитного иммунного ответа вырабатывает и опосредованные клетками, и гуморальные ответы. Это аналогично результатам, полученным с живыми вирусами [Raz и др., Proc. Natl. Acad.Sci., 91: 9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, см. выше; Wang, 1993, см. выше; Xiang, 1994, см. выше]. Исследования на африканских хорьках показывают, что вакцины с ДНК против сохраненных внутренних белков вируса гриппа вместе с гликопротеинами поверхности более эффективны против антигенных вариантов вируса гриппа, чем и инактивированные, и субвирионные вакцины [Donelly и др., Nat. Medicine, 6: 583-587(1995)]. Действительно, воспроизводимые иммунные ответы на ДНК, кодирующую нуклеопротеид, которые длятся, по существу, в течение времени жизни животного, были описаны для мышей [Yankauckas и др., DNA Cell Biol, 12: 771-776 (1993)]. Хорошо известно в данной области, что большое число факторов может влиять на эффективность экспрессии антигенных генов и/или на иммуногенность вакцин с ДНК. Примеры таких факторов включают воспроизводимость инокуляции, построение плазмидного вектора, выбор промотора, используемого для управления экспрессией антигенного гена, и стабильность вставленного гена в плазмиде. В зависимости от происхождения промоторы различаются специфичностью к ткани и эффективностью в инициировании синтеза мРНК [Xiang и др., Virology, 209: 564-579 (1994); Chapman и др., Nucle, Acids Res., 19: 3979-3986 (1991)]. До настоящего времени большинство вакцин с ДНК в системах млекопитающих полагались на вирусные промоторы, производные цитомегаловируса. Они обладали хорошей эффективностью при инокуляции и в мышцу, и в кожу у ряда видов млекопитающих. Другим фактором, который, как известно, неблагоприятно воздействует на иммунный ответ, вызванный иммунизацией ДНК, является способ доставки ДНК, парентеральные пути могут привести к низким скоростям переноса гена и вызывают значительную изменчивость генной эксперссии [Montgomery,1993, см. выше]. Высокоскоростная инокуляция плазмид, методом "выстреливания генов", усиливала иммунные ответы мышей [Fynan, 1993B,см. выше; Eisenbraun и др., DNA Cell Biol., 12: 791-797 (1993)], вероятно благодаря большей эффективности трансфекции ДНК и более эффективной презентации антигена дендритными клетками. Векторы, содержащие основанную на нуклеиновой кислоте вакцину по изобретению,могут также быть введены в желаемый организм-хозяин другими способами, известными для этого, например, путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции,слияния клеток, с помощью диэтиламиноэтилдекстрана (ДЭАЭ-декстран), путем осаждения фосфатом кальция, липофекции (слияние лизосом) или с помощью транспортра вектора ДНК[см., например, Wu и др., J. Biol. Chem. 267: 963967 (1992); Wu и Wu, J. Biol. Chem. 263: 1462114624 (1988); Harmut и др., канадская заявка на патент 2.012.311, подана 15 марта 1990 г.]. 13 Бифункциональные плазмиды для вирусных вакцин и вакцин с ДНК. Предпочтительный аспект настоящего изобретения касается конструирования бифункциональных плазмид, которые могут служить в качестве вакцины с ДНК и рекомбинантного вирусного вектора. Прямое инъецирование очищенной плазмидной ДНК,т.е. в виде вакцины с ДНК, вызовет иммунный ответ на антиген, экспрессированный плазмидой в исследуемых объектах. Плазмида будет также полезной в живых рекомбинантных вирусах в качестве векторов для иммунизации. Бифункциональная плазмида настоящего изобретения предоставляет ксеногенный ген или сайт встраивания для ксеногенного гена под контролем двух различных экспрессионных контрольных последовательностей: экспрессионная контрольная последовательность животного и вирусная экспрессионная контрольная последовательность. Термин "под контролем" употребляется в обычном смысле, т.е. действенно или оперативно связанный с чем-то, в том смысле, что экспрессионная контрольная последовательность, как, например, промотор, обеспечивает экспрессию ксеногенного гена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессионной контрольной последовательностью у животного является промотор млекопитающего (обезьяньи промоторы также рассматриваются настоящим изобретением); в специальном варианте осуществления изобретения промотором является предранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ) (см. фиг. 7). В другом характерном варианте осуществления изобретения вирусным промотором является ранний промотор вируса коровьей оспы, или поздний промотор вируса коровьей оспы, или предпочтительно оба (фиг. 7). Субъекты могли быть вакцинированы с помощью многоярусных схем, с введением бифункциональной плазмиды как ДНК и в различное время, но в любом порядке в виде вакцины из рекомбинантных вирусов. Изобретение рассматривает отдельные или многократные введения бифункциональной плазмиды в виде вакцины с ДНК, или в виде вакцины из рекомбинантных вирусов, или обеих. Схемы вакцинации могут дополняться введением вакцин с рекомбинантными белками(ниже) или могут применяться дополнительные носители вакцины. Специалист в данной области правильно поймет, что бифункциональные плазмиды данного изобретения могут использоваться в виде векторов полиоболочечных вирусных вакцин. Так путем встраивания, как минимум, от 4 до около 10000, предпочтительно от 4 до 1000, а более предпочтительно от 10 до 100 различныхenv генов ВИЧ в бифункциональные плазмиды готовят таким образом соответствующий набор бифункциональных плазмид, используемых в качестве полиоболочечной вирусной вакцины. 14 Вакцины из рекомбинантных белков. Активный иммунитет, вызванный при вакцинации оболочечным белком или белками ВИЧ по настоящему изобретению, может инициировать или усилить клеточный или гуморальный иммунный ответ. Белок или белки оболочки ВИЧ или их антигенные фрагменты могут быть получены в смеси с адъювантом для приготовления вакцины. Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которое усиливает иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить тканевым депо, которое медленно высвобождает антиген, а также активатором лимфатической системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood и др., Immunology, второе издание, 1984, изд. Benjamin/Cummings: Менло Парк, Калифорния, стр. 384). Часто первичная провокационная проба только антигеном в отсутствии адъюванта не вызовет гуморальный или клеточный иммунный ответ. Адъюванты включают, но не ограничиваются только этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели,например, гидроокись алюминия, поверхностноактивные вещества, например, лизолецитин,плюроновые полиолы, полианионы, пептиды,масляные или углеводородные эмульсии, прочно связывающиеся по принципу "ключ-замок" гемоцианины, динитрофенол и потенциально пригодные человеческие адъюванты, как, например, BCG (бацилла Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum. Выбор адъюванта зависит от объекта вакцинации. Предпочтительно используют фармацевтически приемлемый адъювант. Например, в вакцине для человека следует избегать адъюванты в виде масляной или углеводородной эмульсии, включая полный и неполный адъювант Фрейнда. Примером адъюванта, подходящего для применения у людей,являются квасцы (алюмогель). В отдельном варианте осуществления изобретения, ниже, рекомбинантный белок оболочки ВИЧ вводится внутримышечно в квасцах. Альтернативно, вакцина из рекомбинантного белка оболочки ВИЧ может быть введена подкожно, внутрикожно,внутрибрюшинно или другими принятыми для введения вакцины путями. Введение вакцины. В соответствии с изобретением иммунизацию против ВИЧ можно осуществить с помощью только одной вакцины из рекомбинантных вирусов по изобретению или в комбинации с вакциной, содержащей ДНК, или с вакциной из рекомбинантных белков, или с обеими. В специальном варианте осуществления изобретения рекомбинантный белок оболочки ВИЧ в квасцах вводится внутримышечно для усиления иммунного ответа. Каждая доза вирусной вакцины может содержать те же от 4 до 10000, предпочтительно от 4 до 1000 и более предпочтительно от 10 до 100 различных рекомбинантных вирусов, каж 15 дый из которых экспрессирует различный env ген ВИЧ. Альтернативно вирусы в последующих вакцинах могут экспрессировать различныеenv гены ВИЧ. Еще в одном варианте осуществления изобретения последующие полиоболочечные вирусные вакцины могут содержать некоторые вирусы общие, а другие могут содержать вирусы, отличающиеся от вирусов более ранней вакцины. Например, первичная вакцина может содержать вирусы коровьей оспы, экспрессирующие белки оболочек ВИЧ, обозначенные произвольно 1-10. Вторая (для реиммунизации) вакцина может содержать вирусы коровьей оспы (или предпочтительно другой вирус, например, вирус канареечной оспы, или аденовирус), экспрессирующие белки оболочки ВИЧ 6-15 или 11-20, и т.д. Вакцина с ДНК или из рекомбинантного белка может иметь единственный антиген белка оболочки ВИЧ или многочисленные антигены. Предпочтительно вакцина с ДНК или из рекомбинантного белка для использования согласно изобретению включает более одного антигена белка оболочки ВИЧ. Что касается последующих вирусных вакцин, белок оболочки ВИЧ,или белок вакцины ДНК, или вакцина из рекомбинантного белка может соответствовать белку оболочки ВИЧ, экспрессированному в полиоболочечной вирусной вакцине, или он может отличаться от любого из белков оболочек полиоболочечной смеси. Обычно, предпочтительный вариант осуществления изобретения предусматривает обеспечение огромнейшего разнообразия возможных при каждой вакцинации протоколов, чтобы подвергнуть реципиента действию наибольшего числа оболочечных белков ВИЧ и таким способом обеспечить наибольшую возможность для нейтрализации перекрестной реактивности неподвергнутым какому-нибудь воздействию изолятом ВИЧ. Варианты белков оболочки Как отмечено выше, вариант белка оболочки для использования в вакцинах может быть получен из географически локализованных изолятов или ветвей, или из географически разных изолятов, т.е. различных ветвей. Как легко может оценить специалист в данной области,получение нуклеотидов оболочки (т.е. генов) из природных изолятов имеет многочисленные преимущества: изоляты легко доступны, варианты белков оболочки соответствуют встречающимся в природе белкам, к которым желателен иммунитет, и мутации ВИЧ могут быть быстро добыты из новых изолятов. Вариант белка оболочки также включает полипептиды, обладающие иммуногенной активностью, вызванной аминокислотной последовательностью варианта белка оболочки в виде, как минимум, одного эпитопа или антигенной детерминанты. Эта аминокислотная последовательность, по существу, соответствует, как 16 минимум, одному из 10-900 аминокислотных фрагментов и/или общей типичной последовательности известного варианта белка оболочки ВИЧ. Такой вариант белка оболочки может иметь общую гомологию или идентичность, как минимум, в 50% известной аминокислотной последовательности белка оболочки, например,50-99% гомологии, или любой ряд или значение в этих пределах, когда вызывает иммуногенный ответ против, как минимум, одного штамма ВИЧ. Процент гомологии может быть определен, например, при сравнении информации о последовательности, используя компьютерную программу GAP, версия 6.0, имеющуюся в Компьютерной группе по генетике Университета штата Висконсин (UWGCG). Программа GAP использует способ выстраивания в ряд (Needlman и Wunsch) [J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], проверенный Smith и Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]. Если коротко, программа GAP определяет подобие как число выстроенных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются похожими, деленное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP включают: (1) унитарную матрицу сравнения(содержащую значение 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov и Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), как описано Schwartz и Dayhoff,редакторы, в кн. "Атлас последовательности белка и структура", издательство Нэшенл Байемедикел Рисрч Фаундейшн, Вашингтон, округ Колумбия (1979), стр. 353-358; (2) штраф 3.0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0.10 для каждого символа в каждом гэпе и (3) без штрафа для концевого гэпа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант белка оболочки по настоящему изобретению является вариантом формы, как минимум, одного белка оболочки ВИЧ. Предпочтительно вариант белка оболочки включает gp120 и домен олигомеризации gp41, а также gp140 [Hallenberger и др., Virology 193:510-514 (1993)]. Известные белки оболочки ВИЧ содержат примерно от 750 до 900 аминокислот. Примеры таких последовательностей вполне доступны из коммерческих и институционных баз данных последовательностей ВИЧ, как, например, банк генов, или как опубликованные составленные справочники, например, Myers и др., редакторы,"Человеческие ретровирусы и СПИД. Статистические данные и анализ последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот, т. I и II,издательство Theoretical Biology and Biophysics,Лос Аламос, штат Нью-Мексико (1993). Замены или вставки варианта белка оболочки для получения дополнительного варианта белка оболочки, кодируемого нуклеиновой кислотой, для использования в вакцине из рекомбинантного вируса или полиоболочечной вирусной вакцине настоящего изобретения могут включать замены или вставки, как минимум, одного аминокислотного остатка (например, аминокислоты 125). Альтернативно, как минимум, одна аминокислота (например, аминокислоты 1-25) может быть удалена из последовательности варианта белка оболочки. Предпочтительно, такие замены, вставки или удаления идентифицируются на основе определения последовательности белков оболочки, полученных при нуклеотидном секвенировании кодирующей, как минимум, один вариант белка оболочки нуклеиновой кислоты от больного, зараженного ВИЧ. Нелимитирующие примеры таких замен,вставок или удалений предпочтительно осуществляют при амплификации последовательностей оболочечных ДНК или РНК от больных,зараженных ВИЧ-1, которые могут быть определены рутинными методами для обеспечения модифицированных структурных и функциональных свойств белка оболочки или варианта белка оболочки. Полученные таким образом варианты белков оболочки предпочтительно 18 имеют отличные от первоначального варианта белка оболочки антигенные свойства. Такие антигенные различия могут быть определены с помощью подходящих анализов, например, при испытании с помощью панели моноклональных антител, специфичных к белкам оболочки ВИЧ,в ELISA-тесте. Любые замены, вставки или удаления могут осуществляться, пока образующийся в результате вариант белка оболочки вызывает антитела, которые связываются с белками оболочки ВИЧ, но вариант белка оболочки которого имеет другой набор, чем антитела, вызываемые вторым вариантом белка оболочки. Каждая из упомянутых выше замен, вставок или каждое из удалений могут также включать модифицированные или необычные аминокислоты, например, как представлено в 37 C.F.R.1.822(стр.)(2). В следующей далее табл. 1 представлены нелимитирующие примеры альтернативных вариантов белков оболочек вирусов иммунного дефицита человека, которые могут кодироваться рекомбинантным вирусом согласно настоящему изобретению. Таблица 1 Варианты белков оболочек ВИЧ Соответственно, основываясь на приведенных выше примерах специфических замен,альтернативные замены могут быть проведены путем рутинного эксперимента для обеспечения альтернативных вариантов белка оболочки по настоящему изобретению, например, при осуществлении одной или более замен, вставок или одного или более удалений в белках оболочек или вариантах белка оболочек, которые вызывают характерные иммунные ответы. Изменения аминокислотных последовательностей в варианте белка оболочки настоящего изобретения могут быть осуществлены,например, путем мутаций в ДНК. Такие варианты белка оболочек включают, например, удаления, вставки или замены нуклеотидов, кодирующих различные аминокислотные остатки внутри аминокислотной последовательности. Очевидно, что мутации, которые будут проведены в нуклеиновой кислоте, кодирующей вариант белка оболочки, не должны помещать последовательность вне рамки считывания и предпочтительно не будут создавать комплементарные домены, которые могли бы продуцировать вторичные структуры мРНК [см., например, Ausubel (1995, обзор), ниже; Sambrook(1989), ниже]. Кодирующая вариант белка оболочки нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть получена путем амплификации или сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК или РНК, кодирующей белок оболочки или вариант белка оболочки, и, соответственно,синтезирующей или обратно транскрибирующей кодирующую ДНК для получения ДНК или РНК, кодирующей вариант белка оболочки [см.,например, Ausubel (1995, обзор), ниже; Sambrook (1989), ниже], основываясь на доктринах и руководстве, представленных здесь. Рекомбинантные вирусы, экспрессирующие варианты белков оболочек настоящего изобретения, рекомбинантные варианты белков оболочек или векторы нуклеиновых кислот, кодирующих их, включают ограниченный набор последовательностей, кодирующих вариант оболочечного белка, в виде заменяющих нуклеотидов, которые могут быть легко получены специалистом в этой области без чрезмерного экспериментирования, основываясь на положениях и руководстве, приведенных здесь. Для детального описания химии белка и структуры см. книгу Schulz, G.E. и др., "Принципы строения белка", издательство Springer-Verlag, НьюЙорк, штат Нью-Йорк (1978), и книгу Creighton,Т.Е., "Белки: структура и молекулярные свойства", издательство W.H. FreemanCo., СанФранциско, Калифорния (1983). Для представления замен нуклеотидных последовательностей, как, например, предпочтение кодонов, см. кн. Ausubel и др., редакторы, "Современные протоколы в молекулярной биологии", издательство Greene Publishing Assoc., Нью-Йорк,штат Нью-Йорк (1987, 1988, 1989, 1990, 1991,1992, 1993, 1994, 1995) (ниже, "Ausubel (1995 обзор)") вА.1.1-А. 1.24, и Sambrook, J. и др.,в кн. "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство", второе издание, издательствоCold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, штат Нью-Йорк (1989), в приложениях С и D. Таким образом, обычный специалист, используя положения и руководство, представленные здесь, поймет, как заменить другие остатки аминокислот в других положениях с помощью оболочечной ДНК или РНК для получения альтернативных вариантов белков оболочек,включающих замещающие, делеционные или инсерционные варианты. Скрининговые исследования активности против ВИЧ Для скрининга активности против ВИЧ сывороток или клеток от индивидуума, иммунизированного вакциной по изобретению может быть использован любой известный и/или подходящий скрининговый анализ, применяемый в таких исследованиях. Например, известные анализы ВИЧ включают испытания вирусной инфективности [см., например, Chesebro и др., J.(1994)]; анализы периферических одноядерных клеток [см., например, Arduino и др., Antimicrob.Agents Chemother. 37: 1095-1101 (1990)] и анализы Тс-лимфоцитов [см., например, Hammond и др., J. Exp. Med. 176: 1531-1542 (1992); McElrath и др., J. Virol. 68: 5074-5083 (1994); Walker и др., Cell Immunol. 119: 470-475 (1989); Weinhold и др., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 1373 (1992)]. Другие подходящие виды активности, по отдельности или в комбинации, включают, но не ограничиваются этим, количественное и/или качественное измерение транскрипции, репликации, трансляции, включения вириона, вирулентности, вирусного выхода и/или морфогенеза. Специальный вариант осуществления изобретения: рекомбинантный вирус коровьей оспы, кодирующий варианты белков оболочек, полиоболочечные вирусные вакцины и способы их получения и применения Общее представление. Рекомбинантные вирусы коровьей оспы (VV), экспрессирующие белки оболочки ВИЧ (например, gp41, gp120 и/или gp160 или часть их), предоставляют материалы, пригодные для получения и изучения смешанных вакцин, которые индуцируют, как минимум, один из гуморального или клеточного иммунный ответ против вируса, так же, как и для анализов детерминант В-лимфоцитов и Тслимфоцитов. Полиоболочечная вирусная вакцина настоящего изобретения состоит из смеси n различных рекомбинантных вирусов коровьей оспы, где n является целым числом от 4 до 10000(или любой интервал, или значение между этими величинами), в которой каждая векторная конструкция вируса коровьей оспы экспрессирует вариант белка оболочки ВИЧ-1 (например,gp41, gp120 или gp160). Рекомбинантный вирус коровьей оспы функционально кодирует вариант белка оболочки и его получают путем рекомбинации VV дикого типа с плазмидой. Многочисленные различные плазмиды, кодирующие вариант белка оболочки, могут быть получены путем замены одной кодирующей вариант белка оболочки последовательности другой, например, используя рестрикционный фрагмент или мутагенез. Получение рекомбинантных вирусов коровьей оспы. Способы получения индивидуальных плазмид (каждая из которых экспрессирует единственную в своем роде последовательность белка ВИЧ) могут использовать амплификацию ДНК или РНК для замещения изолированных последовательностей варианта белка оболочки в вектор (например, pVenv4 или pVenv1 [Hallen 002390berger и др., Virology 193: 510-514 (1993)], который кодирует известную последовательность белка оболочки ВИЧ (например, имеющуюся в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний, программа "Исследование СПИД и стандартные реагенты", Роквилл, Мэриленд). Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в этой области и могут быть использованы согласно настоящему изобретению без чрезмерного экспериментирования, основываясь на доктрине и руководстве, представленных здесь. Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются только этим, полимеразную цепную реакцию(ПЦР) и родственные амплификационные процессы (см., например, патенты США 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, Mullis и др.; 4,795,699 и 4,921,794, Tabor и др.; 5,142,033, Innis; 5,122,464 Wilson и др.; 5,091,310, Innis; 5,066,584, Gyllensten и др.; 4,889,818, Gelfand и др.; 4,994,370, Silver и др.; 4,766,067, Biswas; 4,656,134, Ringold), и опосредованную РНК амплификацию, которая использует антисмысловую РНК к последовательности-мишени в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5,130,238, Malek и др., с фирменным названиемNASBA). Например, конструкции рекомбинантных вирусов коровьей оспы, полученные этим способом, могут применяться для иммунизации и вызова специфичных к ВИЧ ответов Т- и/или Влимфоцитов. Затравки используют консервативные последовательности ВИЧ и таким способом успешно амплифицируют env гены из многих разнотипных образцов от пациентов с ВИЧ-1. Основные методики, описанные здесь,могут аналогично использоваться с ПЦР или другими типами амплификационных затравок для того, чтобы заменить меньшие или большие куски оболочечной последовательности изолятов участков на те, которые найдены в векторах,кодирующих белок оболочки ВИЧ. См., например, Ausubel, далее; Sambrook, далее. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант белка оболочки. Метод начинается с выделения ДНК из инфицированных ВИЧ клеток и амплификации оболочечных последовательностей с помощью ПЦР. Продукты ПЦР или другие продукты амплификации обеспечивают простейшие средства для выделения последовательностей ВИЧ, но могут быть применены и любые другие подходящие и известные способы, как, например, клонирование и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант белка оболочки или белки (см. Ausubel ниже;Sambrook ниже). Сайты рестрикции ферментами предпочтительно включаются в ПЦР или другие амплификационные последовательности затравок для облегчения генного клонирования. 27 Выделенные ДНК для ПЦР могут быть получены из многочисленных вирусных источников, охватывающих свежую или замороженную цельную кровь больных ВИЧ и клетки, которые были инфицированы in vitro изолятами вирусов. Для продуцирования новых оболочечных конструкций ВИЧ предпочтительно используется ПЦР для амплификации 100-2700 пар нуклеотидов env гена из каждого различного образца ВИЧ больного. Затравки для ПЦР могут представлять хорошо сохраненные последовательности ВИЧ, которые годятся для амплификации env генов от известных образцов env генов, выделенных вирусов иммунного дефицита человека или различных образцов ВИЧ больных. Амплифицированная ДНК предпочтительно содержит участок, кодирующий 10-900 (например, 100-400, 400-600 или 600-900, или любой интервал значений внутри них) аминокислот gp120 и gp41 (оба составляют gp160). Один или более вариабельных участков оболочки(V1-V5) и постоянных участков (С 1-С 5) предпочтительно включены в продукты ПЦР, более предпочтительно большинство из участков V1,C1, V2, С 2, V3, С 3, V4, С 4 и V5. Дополнительно амплифицированные последовательности могут кодировать 1-200 аминокислот вне сайта расщепления для gp120/gp41. Предпочтительно амплифицируется большая часть или весь целыйenv ген. Амплифицированная последовательность, кодирующая gp160, может являться недостающей частью или полной последовательностью из последовательностей, кодирующих трансмембранный домен и/или цитоплазматический домен "хвоста" [см., например, Hallenberger и др., (1993)]. Затравки ПЦР могут быть так сконструированы, что сайты рестрикционных ферментов фланкируют последовательность env гена в плазмиде вируса коровьей оспы так, что они включаются в амплифицированные ДНКпродукты. При использовании хорошо известных методик клонирования замещения производные плазмиды вируса коровьей оспы, которые экспрессируют последовательности вариантов белков оболочек от 1-10000 больных, могут быть генерированы при замене части последовательности, кодирующей вариант белка оболочки больного, на соответствующий участок оболочечной последовательности в плазмиде вируса коровьей оспы, например, используя для замещения рестрикционные фрагменты. Например, плазмиду pVenv4 и продукты ПЦР обрабатывают KpnI и BsmI для получения последовательности, кодирующей "укороченный" gp160 аминокислот 1-639, в котором отсутствует и трансмембранный домен, и цитоплазматический домен "хвоста" gp41 [см., например, Hallenberger и др. (1993)]. После лигирования продукта ПЦР и 28 помощью любого из ряда способов, хорошо известных для этого, включая, например, электропорацию, и рекомбинантные колонии собирают и исследуют путем секвенирования. Конструкции рекомбинантного вируса коровьей оспы, кодирующие белки оболочки ВИЧ. Кодирующий вариант белка оболочки вирус коровьей оспы затем рекомбинируется с вирусом дикого типа в клетке-хозяине, и экспрессирующие вариант белка оболочки вирусные бляшки собираются и делаются запасы вирусов. Запасы вирусов в виде VVenv, каждый из которых содержит кодирующую различный вариант белка оболочки последовательность, затем смешивают, используя, как минимум, 4-40 и до примерно 10000 различных рекомбинантных вирусов, для образования полиоболочечной вирусной вакцины настоящего изобретения. Плазмиды рекомбинантных вирусов коровьей оспы, содержащие последовательности вариантов белков оболочек, затем могут (необязательно) подвергаться секвенированию или скринингу с помощью антител, специфичных к белку оболочки ВИЧ, для идентификации различных вариантов белков оболочек. Предпочтительно секвенирование по способу Сэнгера с дидезоксицепной терминацией. Методика предпочтительно переделывается по сравнению с описанными ранее способами [Sambrook и др.(1989) ниже; United States Biochemical. Секвеназная версия 2.0 - набор для расшифровки последовательности ДНК, девятое издание, издательство Amersham Life Science, Inc., (1994)] и должна считывать примерно 50-300 П.н. от положения затравки. Способы продукции экспрессирующих векторов VV хорошо известны в данной области(1993), Ausubel и др. ниже, в 16.15-16.19]. Ранее описанный вектор pSC11 [Chakrabarti, S. и др., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)] может быть предпочтительно использован для создания еnv-кодируемой плазмиды, как, например,pVenv4. Как вирусный вектор вирус коровьей оспы имеет ряд полезных характеристик, включая способность, позволяющую клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК (более 20 Т.п.н.), сохранение инфективности после встраивания чужеродной ДНК, широкий ряд хозяев, относительно высокий уровень синтеза белка и подходящие транспорт, секрецию, процессинг и посттрансляционные модификации,как диктуется первичной структурой экспрессированного белка и использованием типа клеткихозяина. Например, N-O-гликозилирование,фосфорилирование, миристилирование и рас 29 щепление, а также сборка экспрессированных белков осуществляются достоверным способом. Было разработано несколько вариаций вектора вируса коровьей оспы, которые подходят для использования в настоящем изобретении (например, см. Ausubel и др., ниже,16.15-16.19). Обычно после получения запаса вирусов (Ausubel, ниже в 16.16) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант белка оболочки, ставится под контроль промотора вируса коровьей оспы и интегрируется в геном вируса коровьей оспы так, чтобы сохранить инфективность (Ausubel и др., ниже в 16.17). Альтернативно, можно добиться экспрессии путем трансфекции плазмиды, содержащей контролируемый промотором вируса коровьей оспы ген, кодирующий вариант белка оболочки, в клетку, инфицированную вирусом коровьей оспы дикого типа. Предпочтительно клетка-хозяин и вектор вируса коровьей оспы подходят и одобрены для применения при вакцинации млекопитающих и людей. Эти рекомбинантные вирусы затем охарактеризовывают, применяя различные известные способы (Ausubel и др., ниже в 16.18). Ещ в другом варианте цепь РНК-полимеразы бактериофага Т 7 может быть интегрирована в геном вируса коровьей оспы так, что кодирующие вариант белка оболочки последовательности будут экспрессированы под контролем промотора Т 7 либо в плазме после трансфекции,плазмиде, либо в рекомбинантном вирусе коровьей оспы. Применение промоторов вируса оспы предпочтительно, так как клеточные или другие вирусные промоторы обычно не распознаются транскрипционным аппаратом вируса коровьей оспы. Составной ранний/поздний промотор предпочтительно используется в рекомбинантном вирусе коровьей оспы для полиоболочечных вирусных вакцин, так как желательно экспрессировать вариант белка оболочки в виде антигена, который представляется в инфицированной рекомбинантным вирусом коровьей оспы клетке-хозяине в ассоциации с главным комплексом гистосовместимости (ГКГ) I или II. Такой связанный с ГКГ белок оболочки ВИЧ будет затем образовывать Тс-лимфоцитные мишени и служить затравкой у вакцинированных млекопитающих для ответа Тс-лимфоцитов и/или гуморального ответа против экспрессированных вариантов белков оболочек ВИЧ. Именно из-за способности векторов вируса коровьей оспы индуцировать представление ГКГ в клетках-хозяевах для этого типа антигена появляется возможность уменьшить запаздывание в стадии заражения. Рано созданные транскрипты будут присоединяться после последовательности TTTTTNT и приводить к неадекватной презентации ГКГ. Альтернативно, любые такие терминационные мотивы внутри кодирующей последова 002390 30 тельности гена могут быть изменены мутагенезом, если применяется ранний промотор вируса оспы, чтобы повысить представление ГКГ антигенов белка оболочки в клетках-хозяевах (Earl и др., ниже, 1990). Чтобы имитировать мРНК вирусов коровьей оспы, нетранслированные лидерная и 3'-концевая последовательности обычно сохраняются короткими, если они используются в плазмидах вируса коровьей оспы, включающих последовательности, кодирующие вариант белка оболочки ВИЧ. Предпочтительно плазмида, используемая для получения конструкций вируса коровьей оспы согласно настоящему изобретению, была создана с помощью сайтов рестрикционных эндонуклеаз для встраивания env гена по ходу транскрипции промотора вируса коровьей оспы(Ausubel и др., ниже,16.17). Более предпочтительно, когда плазмида уже содержит кодирующую вариант белка оболочки последовательность, где сайты рестрикции находятся исключительно около каждого из начала и концов последовательности, кодирующей белок оболочки. Такой же рестрикционный фрагмент кодирующей вариант белка оболочки последовательности может затем заменить соответствующую последовательность в плазмиде. В этих случаях основная часть кодирующей вариант белка оболочки последовательности может быть встроена после удаления большей части или всей кодирующей белок оболочки последовательности из плазмиды. Предпочтительно полученная в результате конструкция вируса коровьей оспы (содержащая кодирующую вариант белка оболочки последовательность и промотор вируса коровьей оспы) фланкируется ДНК вируса коровьей оспы, чтобы обеспечить гомологичную рекомбинацию,когда плазмида подвергается трансфекции в клетки, которые были ранее инфицированы вирусом коровьей оспы дикого типа. Фланкирующая ДНК вируса коровьей оспы выбирается так,чтобы рекомбинация не мешала основному гену вируса. Без селекции отношение рекомбинанта к родительскому вирусу коровьей оспы обычно составляет около 1:1000. Хотя эта частота достаточно высока, чтобы обеспечить применение гибридизации бляшек (см. Ausubel и др., ниже в 6.3 и 6.4) или иммуноскрининга (Ausubel и др., ниже в 6.7), чтобы собрать рекомбинантные вирусы, были использованы различные способы для облегчения идентификации рекомбинантных вирусов. Нелимитирующие примеры методик такой селекции или скрининга известны в этой области (см. Ausubel и др., ниже в 16.17). Обычно экспрессионная кассета фланкируется сегментами генов тимидинкиназы (ТК) вируса коровьей оспы таким образом, что рекомбинация приводит в результате к инактивации ТК. Вирус с фенотипом ТК можно затем 31 отличить от вируса с фенотипом ТК+ путем инфицирования линии клеток ТК в присутствии 5 бром-дезоксиуридина, который должен быть фосфорилирован с помощью ТК, чтобы летально встраиваться в вирусный геном. Альтернативно или дополнительно рекомбинантные вирусы могут быть отобраны путем со-экспрессии устойчивого к бактериальным антибиотикам гена, например, к ампициллину, (аmр), или гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt). И другой пример, со-экспрессия гена lac Z Escherichia coli делает возможным со-скрининг рекомбинантных вирусных бляшек с Xgal (Ausubel, ниже,16.17). Рекомбинантные вирусы коровьей оспы,экспрессирующие вариант белка оболочки по настоящему изобретению, могут быть необязательно ослаблены или инактивированы известными способами, как, например, нагревание,обработка параформальдегидом, ультрафиолетовое облучение, обработка пропиолактоном,образование гибрида и химеры, или другими известными способами [см., например, Zagury и др., Nature 332: 728-731(1988); Ito и др., CancerGrundwald-Bearch и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 561-567 (1991)]. Например, инактивация при нагревании при 60 С значительно понизит титр вируса. Такие методики ослабления используются при исследованиях с осторожностью, так как неполная инактивация может привести к смерти больного [Dorozynski и Anderson,Science 252: 501-502 (1991)]. Такой ослабленный или инактивированный рекомбинантный вирус коровьей оспы используется в том случае, когда больной может иметь поставленную под угрозу иммунную систему, поскольку осложнения или смерть могут произойти, когда вводится живой вирус коровьей оспы. Фармацевтические композиции Фармацевтические препараты настоящего изобретения, подходящие для инокуляции, или для парентерального, или орального введения,включают полиоболочечную вакцину из рекомбинантных вирусов, содержащую, как минимум,от 4 и до около 10000, предпочтительно от 4 до 1000 и более предпочтительно от 10 до около 100 различных рекомбинантных вирусов в виде клеточного лизата, связанной с мембраной фракции, в частично очищенной или очищенной форме. Предпочтительно полиоболочечная вирусная вакцина включает содержащий рекомбинантные вирусы клеточный лизат (или его связанные с мембраной фракции), который дополнительно содержит варианты белков оболочек,уже экспрессированных рекомбинантными вирусами. Включение экспрессированных вариан 002390 32 тов белков оболочек сейчас и раскрывается,чтобы усилить первичный ответ антител. Композиция полиоболочечной вирусной вакцины может быть в виде стерильных водных или неводных растворов, суспензий или эмульсий и может также содержать вспомогательные агенты или наполнители, известные в этой области. Каждый из, как минимум, примерно 4-40 до 10000 различных вирусов кодирует и экспрессирует различный вариант белка оболочки,как представлено здесь, ДНК, кодирующая варианты белков оболочек, может быть отобрана,чтобы представить варианты белков оболочек,существующие у специфической изолированной общности больных СПИД. Например, вакцина могла представлять последовательности из Мемфиса, штат Теннесси, и быть предназначена для использования в Мемфисе, Теннеси. Вакцины, составленные для представления географически ограниченных районов, могут быть также пригодны для использования у сообществ за пределами намеченной общности. Альтернативно, ДНК, кодирующие варианты белков оболочек, могут быть отобраны для представления географически отдаленных сообществ, городов и стран, как, например, ветви. Например, множественные клоны могут быть представлены в одной полиоболочечной вирусной вакцине. Композиция полиоболочечной вирусной вакцины может дополнительно включать иммуномодуляторы, например, цитокины,которые усиливают иммунный ответ на вирусное заражение. См., например, Berkow и др.,редакторы, Справочник фирмы Мерк, 15 издание, изд. Merck and Co., Равей, штат НьюДжерси (1987); Goodman и др., редакторыPractice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, третье издание, издательство ADIS Press,LTD., Williams и Wilkins, Балтимор, штат Мериленд (1987) и Katzung, редактор, "Основная и клиническая фармакология", пятое издание, издательство Appleton and Lange, Норуолк, Коннектикут (1992), на которые здесь ссылаются,которые цитируются и которые показывают состояние исследований в данной области. Как ясно любому рядовому специалисту в данной области, если полиоболочечная вирусная вакцина предназначается для индивидуума,она должна иметь состав, который может дополнительно содержать, как минимум, одну из солей, один из буферов, адъювантов или другие вещества, желательные для улучшения эффективности композиции. Адъюванты являются такими веществами, которые могут быть использованы, чтобы специфически усилить, как минимум, один иммунный ответ. Обычно адъювант и композиция смешиваются до представления иммунной системе или представляются от 33 дельно, но в тот же самый участок иммунизируемого субъекта. Адъюванты могут быть свободно разделены на несколько групп в зависимости от их состава. Эти группы включают масляные адъюванты, минеральные соли (например, алюминиевокалиевые квасцы, алюминиевонатриевые квасцы, аммониевоалюминиевые квасцы, двуокись кремния, каолин и уголь), полинуклеотиды (например, полиинозилцитидиловые и полиаденилуридиновые нуклеиновые кислоты) и некоторые природные вещества (например, воск D из Mycobacterium tuberculosis,вещества, найденные в Corynebacterium parvum или Bordetella pertussis, и члены рода Brucella). Среди этих веществ особенно пригодны как адъюванты сапонины (например, Quil А., фирма Суперфос А/С, Дания). Примеры материалов,подходящих для использования в композициях вакцин, описываются, например, в сборникеSciences, издательство Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания (1980), стр. 1324-1341. Фармацевтические композиции полиоболочечных вирусных вакцин настоящего изобретения могут дополнительно содержать, как минимум, одно противовирусное химиотерапевтическое соединение. Нелимитирующие примеры могут быть выбраны из, как минимум, одной группы, состоящей из гамма-глобулина, амантадина, гуанидина, гидроксибензимидазола, интерферона, -интерферона, -интерферона,интерлейкина-16 (IL-16; Kurth, Nature, 8 декабря, 1995), тиосемикарбазонов, метисазона, рифампина, рибвирина, аналога пиримидина (например, 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин и/или тимидил-тимидил-тимидилцитидин), пуринового аналога, фоскарнета, фосфоуксусной кислоты, ацикловира, дидезоксинуклеозидов, ингибитора протеазы (например, саквинавира (фирма Хоффманн-Ля Рош), индинавира (фирма Мерк),ритонавира (фирма Эббот Лэбс), AG 1343 (фирма Егурон Фармесьютиклс), VX-2/78 (фирма Глаксо Велкем), хемокинов, как, например,RANTES, МIР 1 или MIP1 [Science 270:15601561 (1995)], или ганцикловира. См., например,Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8: 10651071 (1992); Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33: 149-164 (1993); Antimicrob. Agents Chemother. 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994); Katzung (1992), ниже, и ссылки, процитированные там на страницах 798-800 и 680-681, соответственно. Фармацевтическое использование Введение полиоболочечной вирусной вакцины (или антисывороток, которые она выявляет) может проводиться либо для профилактической, либо для лечебной цели, предпочтительно для профилактических целей. Когда используют профилактически, композиция с живой полиоболочечной вирусной вакциной вводится до любого обнаружения или симптома заражения 34 ВИЧ, или заболевания СПИД. Профилактическое введение соединения (соединений) служит для предупреждения или ослабления любого последующего заражения ВИЧ. Когда применяют с лечебной целью, полиоболочечную вирусную вакцину дают по выявлении симптома действительного заражения. Введение живой полиоболочечной вирусной вакцины после заражения ВИЧ осуществляется только там, где установлено, что иммунная система больного способна ответить на введение живой полиоболочечной вирусной вакцины без существенного риска нежелательных осложнений или смерти, где введение живого вируса обеспечивается в требуемой дозировке, которая служит для ослабления любого фактического заражения ВИЧ. Альтернативно там, где иммунный ответ больного ставится под угрозу, терапевтическое введение предпочтительно включает использование композиции с ослабленной или инактивированной полиоболочечной вирусной вакциной,где рекомбинантные вирусы ослаблены или инактивированы, как представлено выше. См.,например, Berkow (1987), ниже, Goodman(1992), ниже, Dorozynski и Anderson, Science 252: 501-502(1991). Говорят, что композиция "фармацевтически приемлема", если е введение может переноситься получающим е больным. Говорят, что такой-то агент вводят в "терапевтически или профилактически эффективном количестве",если введенное количество физиологически важно. Вакцина или композиция по настоящему изобретению физиологически важная, если е присутствие приводит в результате к поддающемуся обнаружению изменению в физиологии получающего е больного, предпочтительно в виде усиления гуморального или клеточного иммунного ответа на ВИЧ. Не требуется, чтобы обеспечиваемая "защита" была абсолютной, т.е. не требуется, чтобы заражение ВИЧ или заболевание СПИДом было полностью предотвращено или ликвидировано при условии, если имеется статистически значительное улучшение относительно контрольной популяции. Защита может быть ограничена смягчением тяжести или быстроты наступления симптомов заболевания. Фармацевтическое введение Вакцина настоящего изобретения может придать невосприимчивость к одному или более штаммам ВИЧ. Настоящее изобретение, таким образом, относится к средству и обеспечивает средство для предотвращения или ослабления заражения, как минимум, одним штаммом ВИЧ. Как здесь указывается, вакцина предотвращает или ослабляет заболевание, если е введение индивидууму приводит или к полному, или к частичному ослаблению (т.е. подавлению) симптома или состояния заболевания, или к полно 35 му или частичному иммунитету индивидуума к заболеванию. Как минимум, одна полиоболочечная вирусная вакцина настоящего изобретения может вводиться любыми способами, позволяющими достигнуть намеченную цель, используя фармацевтическую композицию, описанную здесь. Например, введение такой композиции можно проводить различными парентеральными способами, как, например, подкожно, внутривенно, интрадермально, внутримышечно,внутрибрюшинно, внутриназально, трансдермально или внутриротовыми способами. Предпочтительно подкожное введение. Парентеральное введение может осуществляться путем болюсной инъекции или путем постепенной перфузии в дополнительное время. См., например,Berkow (1987), ниже, Goodman (1990), ниже,Avery (1987), ниже, и Katzung (1992), ниже. Типичный режим для предотвращения, подавления или лечения заболевания или состояния, которое может быть облегчено клеточным иммунным ответом при активной специфической клеточной иммунотерапии, включает введение эффективного количества композиции вакцины, как описано выше, один раз или с повторениями в виде усиливающих дозировок или дозировок для активной иммунизации в течение периода, доходящего до и включающего от одной недели до примерно 24 месяцев. Согласно настоящему изобретению эффективным количеством композиции с вакциной является такое количество, которого достаточно для достижения желаемого биологического эффекта, в данном случае, как минимум, одного из клеточного или гуморального иммунного ответа на BИЧ. Понятно, что эффективная доза будет зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и веса реципиента, вида сопутствующего лечения,если проводится, частоты лечения и природы желаемого эффекта. Интервалы эффективных доз, указанные ниже, не имеют целью ограничить изобретение и представляют предпочтительные интервалы доз. Однако наиболее предпочтительная дозировка будет подбираться для отдельного субъекта, что понятно и может быть определено специалистом без лишнего экспериментирования. См., например, Berkow (1987),ниже, Goodman (1990), ниже, Avery (1987), ниже, Ebadi, кн. "Фармакология", издательство(1985), и Katsung (1992), ниже. В общих чертах, дозировка для взрослого человека будет от примерно 105-109 бляшкообразующих единиц (pfu)/кг или колониеобразующих единиц (CFU)/кг на дозу, предпочтительно 106-108. Какая бы доза ни применялась,она должна быть безопасным и эффективным количеством, как установлено известными способами и также описано здесь. 36 Субъекты Реципиентами вакцины по настоящему изобретению могут быть любые млекопитающие, которые могут приобрести специфический иммунитет через клеточный или гуморальный иммунный ответ на ВИЧ, где клеточный ответ опосредуется белком класса I или класса II ГКГ. Среди млекопитающих предпочтительными реципиентами являются млекопитающие отряда приматов (включая человека, шимпанзе, человекообразных обезьян и обезьян). Наиболее предпочитаемые реципиенты люди. Субъeкты предпочтительно инфицируются ВИЧ или обеспечивают модель заражения ВИЧ [например, Нu и др., Nature 328: 721-723 (1987)]. После общего описания изобретения последнее будет легко понято с помощью следующих примеров, которые приводятся как иллюстрация и не рассматриваются как ограничивающие представленное изобретение. Примеры Пример 1. Получение векторов вируса коровьей оспы для экспрессии белка оболочки ВИЧ. Номенклатура. При упоминании, на конструкцию рекомбинантного вируса коровьей оспы альтернативно ссылаются как на конструкциюVVenv со специфическими конструкциями вируса коровьей оспы, обозначенными по больному или по хранилищу (например, Американская коллекция типовых культур /АКТК/ или банк генов как источник оболочечной ДНК в конструкции). Например, VVenv-Doe будет относится к векторной конструкции вируса коровьей оспы,имеющей оболочечные последовательности от больного Doe, a VVenv-U28305 будет относится к вектору вируса коровьей оспы, имеющему оболочечные последовательности, найденные в банке генов подU28305. Полиоболочечная вирусная вакцина состоит из 4-100 различных рекомбинантных вирусов коровьей оспы, каждый из которых экспрессирует единственный в своем роде белок оболочки ВИЧ-1. При ссылках каждый индивидуальный вирус обозначается как VVenv, а на конечную вирусную смесь ссылаются как на полиоболочечную. При получении каждого VVenv используют плазмиду, обозначенную pVenv4, и вирус коровьей оспы дикого типа, обозначенныйNYCDH, описанный ниже. Для дополнительных подробностей см. Ryan и др., "Получение и использование векторов вируса коровьей оспы для экспрессии белка ВИЧ и иммунизации" в кн.(1996). Векторы и клетки-хозяева. Описанный ранее вектор pSC11 [Chakrabarti, S. и др., Mol.Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)] может быть применен для рекомбинации множественных генов ВИЧ в геном VV. Элементы плазмиды pSC11 37 включают ген lacZ. (репортрный ген, с помощью которого трансформированные бактерии и рекомбинанты VV могут быть легко идентифицированы как обладающие -галактозидазной активностью), участок гена, кодирующий тимидинкиназу (ТК), и ген устойчивости к ампициллину (атр). Гены, клонированные в pSC11,вставляются в геном VV путем гомологичной рекомбинации между геном ТК вируса дикого типа и участками гена ТК, содержащимися вpSC11. Включение плазмидной ДНК в локус вирусной ТК инактивирует вирусный ген таким образом, что рекомбинантные вирусы могут быть легко отобраны на фоне вируса ТК+ по росту в бромдезоксиуридине. Для того чтобы рекомбинантному вирусу ТК+ пережить такой отбор, их следует выращивать в клетках, которые не поставляют активный фермент ТК, как,например, линия клеток ТК 143, которая является обедненным ТК производным человеческой линии клеток R970-5, линия клеток остеосаркомы (Rhim, J.S. и др., Int. J. Cancer 15: 23-29(1975, которая поддерживает рост W [Weir и др., ниже (1982)]. Воспроизводство экспрессии сегмента гена ВИЧ может осуществляться при вставлении полного гена в сайт SmaI вектораpSC11. Гены полной длины могут быть экспрессированы под контролем промотора Р 7.5 К. В качестве альтернативы клонированию полных генов ВИЧ можно заменить частичные генные последовательности генами ВИЧ, которые уже были клонированы в pSC11. Например,конструкция под названием pYenvl была получена из pSC11, она экспрессирует env ген, кодирующий белок оболочки ВИЧ с последовательностью ВН 10 [Hallenberger и др., ниже, (1993);(1987)]. Конструкция может быть использована как родительский вектор, чтобы заменить и экспрессировать вариабельные участки белка оболочки из изолятов участков ВИЧ. Аналогично,чтобы экспрессировать белок оболочки с последовательностью ВН 10, был сконструирован изpSC11 вектор, названный pVenv4, укороченный,чтобы исключить трансмембранный и цитоплазматический домен хвоста, кодирующий последовательности gp41, в то же время сохраняющий домен олигомеризации [Hallenberger и др. (1993), ниже]. Как может понять квалифицированный специалист, термин "домен олигомеризации" используется функционально, чтобы сослаться на участок gp41, позволяющий осуществить олигомеризацию белков оболочки, т.е. имеется достаточная структура для олигомеризации. Вектор pVenv4 кодирует укороченный gp 160 (также: gp160t, gp140), который, как было обнаружено, образует третичную структуру,подобную таковой для процессированного олигомера gp41/gp120 (димер, тример, или тетрамер), как представлено на клеточной поверхности инфицированных ВИЧ клеток. Третичная структура сохраняется и в секретированной, и в 38 связанной с мембраной форме [Hallenberger и др., (1993)]. Этот вектор предпочтительно используется как родительский вектор для замены альтернативных выделенных оболочечных последовательностей. В этом примере, получение каждой конструкции VVenv включает применение pVenv4 и вируса коровьей оспы NYCDH дикого типа, и подходящих клеток-хозяев, как подробно описано ниже.pVenv4. Вектор pVenv4 был ранее получен путем вставки последовательности, кодирующей оболочку ВИЧ-1, в рекомбинантный вектор вируса коровьей оспы pSC11 [Hallenberger и др.,Virology 193: 510-514 (1993); Chakrabarti и др.,Mol. Cell Biology 5: 3403-3409 (1985)]. Последовательность ВИЧ-1 была получена из лабораторного запаса живых вирусов. Последовательность была названа ВН 10 [Ratner и др., Nature 313: 277-284 (1985)]. При использовании методик ПЦР могут быть амплифицированы уникальные последовательности оболочки от больных, зараженных ВИЧ-1, и применены для замены в оболочечной последовательности ВН 10 для создания новых векторов. Например, следующие затравки могут быть использованы для ПЦР.TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG. Эти затравки записываются от 5 до 3. Сайты рестрикции подчеркнуты (пронумерованные положения базируются на последовательности ВН 10) [Ratner и др., Nature 313: 277-284 (1985)]. Стратегия ПЦР. Чтобы продуцировать новые оболочечные конструкции ВИЧ-1, используется ПЦР для амплификации 1800 П.н. гена оболочки из 40 различных образцов от больных,зараженных ВИЧ-1. Затравки ПЦР представляют хорошо сохраненные последовательности ВИЧ-1 и, следовательно, успешно амплифицированные env гены из различных образцов от зараженных ВИЧ-1 больных. Амплифицированная ДНК охватывает полный белок gp120, за исключением примерно 10 высоко сохраненных аминокислот при концевой аминогруппе белка. Все вариабельные участки оболочки (V1-V5) 39 включены в продукты ПЦР. В дополнение, амплифицированные последовательности кодируют примерно 100 аминокислот за пределами сайта расщепления для gp120/gp41. Затравки ПЦР, несущие рестрицированныеKpnI и BsmI сайты, которые в pVenv4 раcполагаются рядом с последовательностью гена, кодирующего последовательность ВН 10 оболочки,включаются в амплифицированные ДНКпродукты. Первый круг ПЦР. В пробирке для микроцентрифугирования емкостью 500 мкл смешивают 1 мкл затравки А (поcл.1), 300 нг/мкл; 1 мкл затравки Б (поcл.2), 300 нг/мкл; 2,5 мкл 10 мМ каждого из 4 дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов; 1 мкг ДНК; 10 мкл 10 х буфер для ПЦР и ВЭЖХ Н 20 до 99 мкл. Встряхивают исходную Taq и прибавляют 1 мкл в ПЦР. Хорошо перемешивают. Покрывают минеральным маслом. Реакцию с помощью датчика термических циклов проводят следующим образом: инкубируют при 95 С, 3 мин, чтобы расплавить ДНК; проводят 40 циклов: 95 С, 1 мин; 45 С, 2 мин; 72 С, 3,5 мин. Второй круг ПЦР. Подготавливают реакцию ПЦР, как указано выше, но с затравками В и Г (поcл.3 и 4, соответственно) и без ДНК. Доводят объем конечного раствора до 95 мкл. Покрывают сверху минеральным маслом. С помощью наконечника для взятия пробы удаляют 5 мкл из первой ПЦР (из-под масла). Примешивают образец во вторую реакцию ниже масляного слоя и начинают проведение циклов,как описано выше. Обычно достаточно тридцати циклов. Может быть желательным анализировать продукт путем отбора 2 мкл для анализа с использованием геля после каждых 10 циклов,пока в прозрачном слое не идентифицируют примерно 1800 П.н. Используя хорошо известную методику замещающего клонирования, были генерированы производные pVenv4, экспрессирующие оболочечную последовательность от одного из 40 больных вместо оболочечной последовательности ВН 10. Вкратце, плазмида pVenv4 и продукты ПЦР затем разрезаются с помощью KpnI и BsmI, разрезанную pVenv4 пропускали через агарозный гель и выделяли большой фрагмент. Малый фрагмент (фрагмент 1800 П.н.) оболочечной последовательности ВН 10 отбрасывали. Также выделяли разрезанный продукт ПЦР и лигировали с большим фрагментом pVenv4 для создания химерной оболочечной последовательности, содержащей теперь 1800 П.н. варианта оболочки от ДНК больного. После лигирования продукта ПЦР и продуктов pVenv бактериальные клетки-хозяева трансформируются 40 лигированной смесью по одному из хорошо известных способов в данной области, включая,например, электропорацию, и рекомбинантные колонии собираются и изучаются путем секвенирования. Плазмида pVenv4 или рекомбинанты, полученные с помощью pVenv4, облегчают включение генов в геном вируса коровьей оспы путем гомологичной рекомбинации между геном тимидинкиназы (ТК) вируса дикого типа и последовательностями ТК внутри плазмиды. Включение ДНК pVenv4 в вирусный ТК-локус приводит к вирусу коровьей оспы с геном оболочки ВИЧ-1, экспрессированным под контролем раннего/позднего промотора Р 7.5 К. Вирус имеет сниженную ростовую активность в результате разрушения локуса ТК-локуса. Дополнительным элементом pVenv4 является ген lacZ,кодирующий активность -галактозидазы. Активность lacZ может быть использована для отбора рекомбинантов вируса коровьей оспы (см. ниже). Ген оболочки, экспрессированный pVenv4,укорачивают для исключения трансмембранной/С-концевой последовательности gp41. Вектор экспрессируется как олигомерная структура,которая находится внутри клеток и в секретированной форме. Вирус коровьей оспы NYCDH. Каждая новая замещенная плазмида индивидуально рекомбинируется вирусом коровьей оспы дикого типа NYCDH. Вирус был получен из АКТК (инвентарный номер VR-325) и очищен от бляшек до использования (Buck, С., и Paulino, M.S., редакторы, "Каталог вирусов животных и антисывороток, хламидий и риккетсий Американской коллекции типовых культур", 6 издание, АКТК,Роквилл, Мэриленд (1990), стр. 138). Бактериальные клетки-хозяева. Плазмида может быть выращена на любом подходящем организме-хозяине, как известно в данной области [см., например, Ausubel, ниже (1995, обзор),16.15-16.19]. В нелимитирующем примере это клетки DH5. Клетки с недостатком ТК. Трансформацию и замещение вируса коровьей оспы проводят на человеческой линии клеток ТК 143 В, которая является обедненным ТК производным человеческой линии клеток R970-5, линия клеток остеосаркомы [Rhim и др. (1975), ниже], которая поддерживает рост VV [Weir и др. (1982), ниже]. Каждый рекомбинант вируса коровьей оспы, содержащий единственную в своем роде последовательность еnv гена ВИЧ, отбирается,основываясь на экспрессии гена lacZ (вирусные бляшки покрывались 5-броминдолилDгалактопиранозидом и отбирались по галактозидазной активности, о чем судили по развитию синей окраски). Было проведено два круга ПЦР. 41 Пример 2. Получение полиоболочечной вирусной вакцины. Клетки Vero. Последний этап получения заключается в выращивании n VVenv-конструкций на клетках Vero, недавно приобретенных в АКТК (инвентарныйCCL81 или Х 38),клонированных и размноженных для роста вируса. Линия клеток Vero была одобрена Всемирной организацией здравоохранения для разработки вакцин [Hay, R. и др., редакторы, "Каталог линий клеток и гибридом Американской коллекции типовых культур", 7 издание, АКТК,Роквилл, Мэриленд (1992), стр. 48]. Клетки Vero выращивают на модифицированной Дюльбекко среде Игла (фирма БайеВиттекер) с добавлением глутамина (БайеВиттекер) и инактивированной при нагревании околоплодной сыворотки теленка (фирма Хайклон, Инк.). Альтернативно, может быть использована среда без сыворотки. Каждая конструкция VVenv инокулируется на отдельном сливном слое клеток Vero и собирается, когда клетки проявляют цитопатические эффекты вследствие заражения вирусом. Клеточные экстракты интенсивно промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР)(Байе-Виттекер) после сбора клеток и перед замораживанием. Клетки затем вскрывают путем замораживания-оттаивания, обработки ультразвуком или центрифугирования при низкой скорости в центрифуге (необязательно). Аликвоты надосадочной жидкости затем хранят при -70 С. Белок оболочки присутствует в лизате в концентрациях, достаточных, чтобы вызвать специфичное к белку оболочки ВИЧ антитело (определяется с помощью ELISA-теста) на моделях млекопитающих, даже если VV аттенуируется,например, препарат нагревается до 60 С 1 ч. Продукт в виде вакцины. Каждая вирусная(конструкция VVenv) популяция от клеток Vero замораживается индивидуально, затем титруется и испытывается на безопасность. После завершения тестов аликвоты каждого вируса смешивают, чтобы получить исходную вакцину в 108 общего количества бляшкообразующих единиц (рfu)/мл. Если используется 40 конструкций VVenv, каждая VVenv представлена предпочтительно одинаково, каждая использованная VVenv с титром 2,5106 pfu/мл в продукте в виде вакцины. Это должно дать всего 1108 бляшкообразующих единиц. Оценка полиоболочечной вакцины Мыши. Мыши могут быть инфицированы путем внутрибрюшинной инъекции о. 1107pfu экспрессирующего оболочку VV. Антитело может быть идентифицировано при ELISAтесте ВИЧ или при нейтрализационных пробах,как описано выше, через три недели после инъекций VV. Прежде чем готовить полиоболочечную вирусную вакцину для применения на людях, 002390 42 подобную группу вирусов получали для того,чтобы исследовать вакцину на мышах. Эти вирусы вводили мышам либо внутрибрюшинно,либо подкожно. Затем исследовали специфичное к ВИЧ-1 антитело сыворотки на активность в ELISA-тесте. Этот анализ включал пассирование всего разрушенного ВИЧ-1 (НТLVIIIB) на планшетах для ELISA-теста и блокирование планшетов бычьим сывороточным альбумином. Образцы сыворотки затем прибавляли в разведениях 1:100, 1:1000 и 1:10000 в ЗФР. Пробу проявляли с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой козьего антитела против мышиного иммуноглобулина и п-нитрофенилфосфата. Цветную реакцию тормозили раствором гидроокиси натрия, и оптическую плотность определяют при 405 нм с помощью считывающего с планшета для ELISA-теста устройства. Как показано на фиг. 2, единственная инокуляция с препаратом клеточного лизата 106-108pfu вируса коровьей оспы (содержащего одну последовательность, кодирующую белок оболочки ВИЧ-1, и связанный мембраной экспрессированный белок оболочки) вызывала сильный ответ антител на ВИЧ-1, который поддерживался в течение времени эксперимента в 6 месяцев. Такой ответ антител был значительно выше, чем описанные ранее с применением других иммунизаций. Высокий ответ антител может объясняться присутствием связанного с мембраной белка оболочки в препарате вакцины. Как показано на фиг. 3, эти ответы зависели от дозы. Более слабые ответы наблюдались у млекопитающих, получавших дозу в 106 pfu, чем у млекопитающих, получавших дозу в 107 pfu. Были также получены смеси вирусов коровьей оспы, экспрессирующие различные белки оболочек ВИЧ-1. Если мыши получали 107pfu смеси 5 вирусов, их ответы были в основном идентичны по силе ответам, генерированным против 107 pfu одного рекомбинанта вируса коровьей оспы (фиг. 4). Смешивание многочисленных экспрессирующих оболочку вирусов коровьей оспы в больших количествах не было описано, и ожидается, что это обеспечит широкий спектр нейтрализующего антитела. Люди. Испытания смешанной вирусной культуры проводят до клинических исследований, первое из которых проводится с целью выяснения возможности повышения доз и изучения безопасности. Клинические исследования будут предусматривать изучение повышения доз, включая комбинацию четырех групп добровольцев. Каждая группа получает одну из следующих доз вакцины: 43 Каждый доброволец получает смешанную вирусную вакцину в 0,5 мл физиологического раствора, введенную при подкожной инъекции. Пример 3. Индукция первичного нейтрализующего изолят иммунитета у шимпанзе с помощью многооболочечной вакцины против ВИЧ-1 на основе вируса коровьей оспы. Популяция изолятов ВИЧ-1 имеет в арсенале сложный набор оболочечных белков. Белки оболочек являются единственными кодируемыми вирусом наружными белками и мишенями нейтрализующей активности антител, хотя антитела, вызванные против одного изолята, необязательно будут нейтрализовать другой. Исходя из этого, была получена смешанная вакцина против ВИЧ-1, полиоболочечная, экспрессирующая многочисленные оболочечные белки. Приготовление вакцины начинали с получения тридцати различных рекомбинантов VV, каждый из которых экспрессирует определенный оболочечный белок. Затем VVenv испытывали индивидуально или в комбинации (полиоболочечная смесь) на модели шимпанзе. Четырех шимпанзе иммунизировали подкожно тремя инъекциями одного VVenv (шимпанзе 1 и 2) или полиоболочечной смесью (шимпанзе 3 и 4), а затем делали внутримышечную инъекцию рекомбинантным белком gp120/gp41 в квасцах. Безопасность проверяли на всех четырех животных, только у двух наблюдались признаки изъязвления в месте инъекции. Образцы сыворотки проверялись многочисленными тестами на связывание ВИЧ и нейтрализацию. Антитела шимпанзе 3 и 4 продемонстрировали высочайшую степень активности антител. Нейтрализующая функция была продемонстрирована как против лабораторного изолята, так и против первичного изолята ВИЧ-1, ни один из которых не был специфически представлен в вакцине. Таким образом, праймирование лимфоцитов смешанными белками оболочек представляет в результате перспективный способ, с помощью которого могут быть вызваны высококачественные антитела против разнотипных ВИЧ-1. Материалы и методы Р Venv4, вектор рекомбинации VV. РанееpVenv4 был получен путем введения останавливающего кодона в оболочечную последовательность ВН 10 и включения модифицированного по оболочечной последовательности ВН 10 генаenv в pSC11. Вектор pVenv4 экспрессировал продукт в виде белка оболочки, который был укорочен при аминокислоте 640 и был способен и к секреции, и к олигомеризации. Получение рекомбинантного VV, Vvenv4, экспрессирующего этот белок с укороченной оболочечной последовательностью ВН 10, было описано ранее [Hallenberger и др., Virology 193: 510-514(1993)]. ПЦР для амплификации оболочечных последовательностей от индивидуумов, зараженных ВИЧ-1. ПЦР применяли для амплификации 44 оболочечных последовательностей ВИЧ. Обычно образцы получали из крови зараженных ВИЧ-1 индивидуумов при отборе крови для первой диагностики ВИЧ. Остальные образцы были от индивидуумов с клиническими симптомами СПИД или из материалов, предоставляемых при исследованиях СПИД и из хранилища эталонных реагентов. В случае образцов крови ДНК сначала получали при прибавлении по каплям крови или инфицированных клеток в буфер для клеточного лизиса на основе додецилсульфата натрия и инкубировании при 65 С в течение 30 мин. Прибавляли проназу в концентрации 0,5 мг/мл и лизат инкубировали дальше при 45 С в течение ночи. После двух экстракций фенолом осаждали этиловым спиртом и ДНК повторно суспендировали в воде. Стандартными способами осуществляли два круга ПЦР со всеми образцами ДНК. Последовательности затравок выбирались на основе опубликованной последовательности ВН 10[Ratner и др., Nature 313:277-284 (1985)]. Для получения фрагментов, включающих последовательности всех вариабельных участков и участка gp41, использовали затравки ПЦР, как описано в примере 1. Продукты ПЦР были последовательно клонированы путем замещения в вектор pVenv4 при использовании стандартных способов. Секвенирование было осуществлено на новых плазмидах по методу Сэнгера при использовании затравки ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg (поcл.5). Получение VVenv. Новые рекомбинантыVV (VVenv) получали при трансфекции клеток,инфицированных VV (NYCDH, АКТК), заново замещенными рекомбинантными плазмидами(см. выше). Для облегчения трансфекции были использованы трансфектам (фирма Промега) и липофектамин (фирма Гибко, Бразилия) в соответствии с рекомендациями производителя. VV затем очищали от бляшек. Иммунизация. Инфицированные VVenv клеточные лизаты вводили шимпанзе путем подкожных инъекций. VVenv использовались либо поодиночке, либо в комбинации. Общие количества VV по бляшкообразующим единицам были одинаковые в каждой инъекции (примерно 107 pfu) на животное. Внутримышечные инъекции делали смесью примерно 40 мкг(адсорбирующий гель гидроокиси алюминия для повторной сорбции, фирма Интерген Ко.,Партчиз, штат Нью-Йорк) на инокулят.ELISA-тесты. Пять ELISA-тестов были проведены следующим образом. ELISA1: набор для клинического ELISA-теста фирмы Эббот был приобретен в Эббот-лабораториях, и тест был проведен как иммуноферментативный анализ согласно рекомендациям производителейELISA2: ELISA-тесты проводились при засевании рекомбинантного Mn-gp160 (фирма Кволити Байелоджикал, Инк., Гайтерсбург,штат Мэриленд) в количестве 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и тесты проводили путем трехкратных серийных разведении сывороток. Планшеты затем промывали и проводили подсчет с помощью конъюгированного со щелочной фосфатазой античеловеческого IgG. ELISA3: планшеты для ELISA-теста покрывали 1 мг/мл LAI-gp120 (белок из яичника китайского хомячка /СНО/, фирма Интрасел). Образцы сыворотки засевали после разведения 1:100 и проводили подсчет с помощью конъюгированного со щелочной фосфатазой античеловеческогоIgG1 (мышиный античеловеческий IgG1-АР,по каталогу 9050-04, фирма Саузерн Байелоджикал Ассосиэйтс, Инк., Бирмингем, Алабама) и п-нитрофенилфосфата. Показания оптической плотности снимали при 405 нм. ELISA4:ELISA-тест проводили, как в опыте 3, за исключением того, что планшеты покрывались 1 мкг/мл IIIB-gp120 (белок, происходящий от бакуловируса, фирма Интрасел,по каталогу 12001, Кеймбридж, Массачусетс). ELISA5:ELISA-тест проводили, как в опыте 3, за исключением того, что планшеты покрывали 1 мкг/мл лизата вируса IIIB (фирма Органон Текника Ко., Дарем, штат Нью-Йорк). Опыты по нейтрализации. Опыты по нейтрализации проводили с лабораторными или первичными изолятами [Montefiori и др., J. Clin.Microbiol. 26: 231-237 (1988); Montefiori и др.,Journal of Infectious diseases 173: 60-67 (1996)]. Лабораторные изоляты: вирус смешивали с разведением 1:20 каждого образца сыворотки и высевали на клетки МТ-2 или СЕМ-х 174. Для оценки жизнеспособности клеток использовали нейтральный красный краситель. Уменьшение гибели клеток на 35-40% по сравнению с контролем было определено как положительный сдвиг. Первичные изоляты: вирус смешивали с разведением 1:4 каждого образца сыворотки и засевали на стимулированную фитогемагглютинином связанную с белком смешанную культуру (РВМС). В опытах подсчитывали р 24. Для положительного результата требовалось сокращение инфективности, как минимум, на 75% по сравнению с контрольными культурами. Результаты Получение новых рекомбинантных вирусов коровьей оспы (VVenv). Для получения новых рекомбинантов VV (VVenv), каждый из которых экспрессирует единственный в своем роде оболочечный белок ВИЧ-1, первой из образцов ВИЧ-1 выделяли ДНК. Большинство ДНК были из крови отдельных субъектов, у которых не наблюдались внешние признаки заболевания и у которых, вероятно, впервые диагностировали заражение ВИЧ-1. Дополнительные ДНК были от больных СПИД или из вирусов, 002390 46 предоставленных Центром по исследованию СПИД и хранилищем эталонных реагентов. ПЦР проводили с помощью пар затравок, охватывающих сайты рестрикции KpnI и BsmI. Фрагменты затем вставляли для замены в векторpVenv4, изображенный на фиг. 5 (pVenv4 первоначально экспрессировал укороченный белок ВИЧ-1, последовательность ВН 10), при сайтах рестрикции KpnI и BsmI. Таким путем последовательности gp120 (V1-V5) и gp41 от ВН 10 были перемещены с помощью соответствующих последовательностей в продукты ПЦР. С помощью каждой замещенной плазмиды был получен новый рекомбинантный вирус коровьей оспы (VVenv). Этот способ предоставляет простое средство, с помощью которого большое разнообразие оболочечных последовательностей могло быть включено в единственные в своем роде рекомбинанты VV (VVenv). Интересно, что большинство последовательностей были продуктивны, что подтверждалось тем, что оболочечные последовательности в провирусных геномах (от которых происходило большинство продуктов ПЦР) редко были дефектными. Огромное разнообразие существует среди VVenv,используемых в вакцинной смеси. Иммунизация шимпанзе одним или смешанным VVenv. Брали четырех шимпанзе для испытания вакцин из одного вируса или из смеси рекомбинантов VV. Схемы иммунизации показаны в табл. 2. Первые три инъекции содержали VV, в то время как последняя инъекция содержала комбинацию gp120, gp41 и квасцов,вводимую внутримышечно. Шимпанзе 1 и 2 получали только один вирус коровьей оспы и соответственный белок оболочки, даваемый в каждой из первых трех инъекций. Шимпанзе 3 и 4 получали смесь 10 рекомбинантных VV (и соответствующих оболочек /Env/ в первой инъекции), десять дополнительных оболочек во второй инъекции и десять дополнительных единственных в своем роде оболочек при последней иммунизации, что составляло всего 30 различных векторов до активной иммунизации белком. Все шимпанзе получали одинаковые количества общего вируса коровьей оспы в бляшкообразующих единицах и одинаковые количества всех рекомбинантных белков. Таблица 2 График иммунизации шимпанзе смешанными рекомбинантами VV Шимпанзе 1 и 2 47 Рекомбинантный VVenv может быть введен без патологического высыпания. У всех четырех шимпанзе наблюдали за признаками системного заболевания и патологических образований в местах инъекции. Животных ежедневно проверяли на диарею, ринорею, кашель, чихание, учащенное дыхание, вялость, ограниченность движений и потерю аппетита. Ни один из признаков не обнаружили ни у одного животного в течение какого-либо времени. Фотографии мест инъекции через определенные промежутки времени после первой иммунизации VV указывали на очевидную припухлость у всех четырех животных. Легкие повреждения, типичные для прививки оспы, появлялись в местах инъекций у шимпанзе 1 и 3, в то же время у шимпанзе 2 и 4 не наблюдали повреждений. Никакие симптомы болезни, припухлости или повреждения не были очевидны при второй, третьей или четвертой инъекциях ни у одного животного, что указывает на то, что специфичный к VV иммунитет был вызван при первой инокуляции. Инъекции Vvenv, сопровождаемые активными иммунизациями белком, приводили к позитивному в ELISA-тесте антителу. Специфичные к ВИЧ антитела контролировались при проведении схемы иммунизации путем пяти различных ELISA-тестов. Тесты ELISA использовали для измерения относительного, а не абсолютного, количества антител у каждого животного. В большинстве случаев тесты проводились с фрагментами вирусов, которые не обладали трехмерной и олигомерной структурой,типичной для нативной оболочки. В этих случаях в ELISA-тестах возможно было ожидать связывания только субпопуляции специфичных к ВИЧ антител. Результаты, полученные в ELISAтесте (фирма Эббот), представлены на фиг. 6. У шимпанзе 3 был превышен отрезок, указывающий на позитивность, после первой иммунизации VV, в то время, как у шимпанзе 4 превышение отрезка наблюдали после второй иммунизации VVenv. Ответы шимпанзе 3 и 4 в конце иммунизационной схемы намного превышали ответы шимпанзе 1 и 2. В ELISA2 с MN gp160 только шимпанзе 3 была высоким респондером. Этот ответ имел место до реиммунизации белком и не возмущался при инъекции активатором. Ответ на СНО-LAI, связанный на планшете для ELISA-теста ( 3) с использованием того же антигена, который применялся для подпитки очищенным белком, оказался сильным только у шимпанзе 3. В ELISA4 с связанным на планшете IIIB-gp120 шимпанзе 2 показала высокий фон и, вероятно, благодаря высокому фону, наивысшую из всех животных величину ответа. Ответы в пятом ELISA-тесте, лизат вирусаIIIВ фирмы Органон Текника, были положительны с сыворотками от всех четырех животных. 48 Нейтрализационные ответы против первичных и лабораторных изолятов. Анализы нейтрализации были проведены с сыворотками от каждого животного против лабораторных и первичных изолятов. Первый анализ был проведен на линии Т-лимфоцитов, в то время как последний анализ был проведен на серонегативной стимулированной фитогемагглютинином РВМС. Во всех случаях изоляты не подходили представленным в вакцинах против ВИЧ-1. Как показано в табл. 3, образцы от шимпанзе 2, шимпанзе 3 и шимпанзе 4 вызывали положительный сдвиг (35-40% ингибирования роста вируса) против лабораторного изолятаMN в Т-лимфоцитах. Опыты с двумя другими лабораторными вирусами (один IIIB [Lockey и др., Aids Res. Hum. Retroviruses 12: 1297-1299(1996)] и один линии SF2) не давали положительного результата ни с одним образцом. Показаны результаты анализов нейтрализации[Montefiori и др., 1988, выше; Montefiori и др.,1996, выше] четырьмя первичными изолятами при испытании на стимулированной фитогемагглютинином РВМС. Считается, что вирус трудно нейтрализовать в таких испытаниях, так как сыворотки больных часто дают отрицательные результаты, даже когда используют разведения 1:2 [Fenyo и др., AIDS 10: 97-106 (1996);Moore и Но, AIDS 9: 117-136 (1995); Montefiori и др., 1996, выше]. Интересно, что разведение 1:4 сыворотки шимпанзе 4 было способно нейтрализовать один из испытываемых первичных изолятов. Эта ситуация отличалась от опытов в других случаях с оболочечными вакцинами, так как в большинстве этих предыдущих случаев сыворотки от иммунизированных оболочечным белком индивидуумов давали отрицательные результаты в опытах нейтрализации первичных изолятов [Steele, Journal of NIH research 6: 40-42(1994); Moore, Nature 376: 115 (1995)]. Таблица 3 Нейтрализация антисыворотками шимпанзе вирусов,не специфически представленных в вакцине Шимпанзе Шимпанзе Шимпанзе Шимпанзе 1 2 3 4 ЛабораПоложиПоложиПоложиторный тельный тельный тельный штамм MN сдвиг сдвиг сдвиг Первичный 1 Первичный 2 ПоложиПервичтельный ный 3 Первичный 4 Изолят Смешанные VVenv способствуют более высокому качеству специфичных к ВИЧ-1 антител, чем единственный VVenv. РезультатыELISA-тестов и опытов по нейтрализации представлены в табл. 4, указываются те шимпанзе,чьи сыворотки приводили к более сильным ответам в описанных выше семи испытаниях. Как 49 можно видеть из таблицы, шимпанзе 3 и 4 обнаруживали положительные результаты в пяти из семи испытаний, в то время как у шимпанзе 1 и 2 наблюдались положительные результаты только в трех из семи случаев. Этот результат 50 может указывать на более высокое качество антител, вызываемых полиоболочечными вакцинами по сравнению с однооболочечными вакцинами. Таблица 4 Суммарные данные ELISA-тестов и анализов нейтрализации Более высокие ответы у шимпан- Более высокие ответы у шимпанзе,Испытание зе, получавших единственный VV получавших смешанные VV Эббот (IIIB-gp41) - ELISA 1 Шимпанзе 3 и шимпанзе 4LAI-gp120-CHO-ELISA4 Шимпанзе 3 Вирусный лизат IIIb ELISA5 Шимпанзе 1 и шимпанзе 2 Шимпанзе 3 и шимпанзе 4 Лабораторный изолят - нейтраШимпанзе 2 Шимпанзе 3 и шимпанзе 4 лизация (сдвиг) Первичный изолят - нейтралиШимпанзе 4 зация Дискуссия Эксперименты, описанные в этом примере,предназначались для испытания безопасности вакцины против ВИЧ-1 на основе вируса коровьей оспы и сравнения эффективности праймирования смесями оболочек и однооболочечными вакцинами. Результаты показали, вопервых, что вирус коровьей оспы мог быть использован в качестве иммуногена без индуцирования открытого повреждения и, во-вторых, что большая широта специфической к ВИЧ-1 активности могла вызываться смесью оболочек. На модели шимпанзе удалось исследовать безопасность полиоболочечной вакцины у приматов. Особенно интересно было определить степень образования открытого повреждения,так как вакцинация VV могла представлять угрозу переноса живого вируса неиммунизированным индивидуумам. В случае ВИЧ это серьезное опасение, поскольку больной СПИД может быть не в состоянии блокировать заражениеVV. Чтобы справиться с этим, исследовали применение подкожных вакцинаций на шимпанзе, выясняя, можно ли избежать открытого повреждения. Действительно, только у двух из четырех шимпанзе наблюдались открытые повреждения. Похожие результаты наблюдали,когда использовали подкожные прививки вируса коровьей оспы штамма NYCDH в клинических испытаниях вакцины против оспы [Connor и др., Journal of Infectious diseases 135: 167-175(1977); Benenson и др., Journal of Infectious diseases 1355: 135-144 (1977)]. По-видимому, при дополнительном внимании к процедуре инъекции и последующем наблюдении места инъекции во всех случаях можно избежать открытых повреждений. Эти результаты показывают, что соображения безопасности не должны препятствовать использованию вируса коровьей оспы в качестве вектора вакцины против ВИЧ-1. Оболочечные смеси испытывались в экспериментах на мышах (пример 2) и кроликах. В экспериментах на мышах антитела против ВИЧ контролировались после одной инъекцииVVenv, в то время как у кроликов VVenv использовали для усиления ответов, вызванных ДНК. Эксперименты показали, что специфичные к ВИЧ-1 антитела могли быть вызваны или активно поддержаны с помощью VVenv и что первичные изоляты могли быть нейтрализованы при ответе антител. Для изучения возможностей смешанных VVenv (полиоболочечные смеси) шимпанзе разделяли на две группы. Первые две шимпанзе получали только один VVenv, в то время как шимпанзе 3 и 4 получали смеси, состоящие всего из тридцати различных VVenv. После иммунизации вирусом коровьей оспы все четыре шимпанзе подвергались активной иммунизации с помощью одной белковой смесиgp120/gp41 в квасцах. Сыворотки от каждой из четырех шимпанзе исследовали в пяти различных ELISA-тестах, в каждом из которых использовался различный фрагмент и/или конфигурация оболочки. Интересно, что у шимпанзе 1 и 2 как популяции наблюдались сильные ответы только в одном из этих ELISA-тестов, тогда как сыворотки от шимпанзе 3 и 4 как популяции обеспечивали сильные ответы в 4 таких тестах. Поскольку в каждом анализе измерялась только фракция специфичного к ВИЧ-1 антитела для каждого животного, результаты, вероятно, отражали наибольшую широту активности связывающей активности антител, вызванной смешанной вакциной. Опыты по нейтрализации проводили также как против лабораторных, так и против первичных изолятов. Интересно, что положительный ответ против первичного изолята был отмечен у шимпанзе 4, хотя первичный изолят не был специфически представлен в вакцинной смеси. И опять, эти результаты демонстрировали боль 51 шую широту антител, вызванных полиоболочечной смесью для вакцинации. Следует ожидать, что повышение сложности антигена вакцины может привести к возросшему разнообразию ответов лимфоцитов и соответствующих антител. Тот факт, что нейтрализующие антитела могут быть вызваны против первичного изолята,не представленного в вакцине, демонстрирует,что линейно различные белки имеют одинаковые конформационные структуры. Это наблюдение также демонстрируется иммунными ответами инфицированных ВИЧ-1 больных, поскольку любые два индивидуума, доступные действию бесчисленных взаимоисключающих вирусов, обычно защищены от суперинфекции,когда происходит перекрестное воздействие. Применение полиоболочечных смесей представляет первую попытку имитировать на шимпанзе ситуацию больных ВИЧ-1. Дело в том,что нейтрализующие антитела вызываются не единственным, а огромным множеством оболочечных белков. Итак, была исследована на модели шимпанзе смешанная вакцина против ВИЧ-1 на основе вируса коровьей оспы, названная полиоболочечной вирусной вакциной. Этот пример показал: 1) VV может быть использован как вакцина, не вызывая открытого повреждения кожи; 2) эта вакцина может вызвать большую широту активности антител, специфичных к ВИЧ-1, и 3) смесь оболочечных конструкций (полиоболочечная смесь) вызывает образование специфичных к ВИЧ антител высшего качества по сравнению с однооболочечной конструкцией. Давно известно, что вирус коровьей оспы является активной вакциной как в виде вируса дикого типа, так и в рекомбинантной форме. Сила VV заключается в его способности пополнять В- и Тс-лимфоцитные компартменты иммунного ответа. VV входит в состав единственной вакцины, способной ликвидировать заболевание (оспу) у людей. Данные этого примера показывают, что рекомбинантные векторы VV будут способствовать будущему контролю ВИЧ-1. Пример 4. Получение бифункциональной плазмиды. Было показано, что вакцины с ДНК вызывают сильные ответы антител и Тс-лимфоцитов в некоторых различных системах (грипп, ВИЧ-1 и т.д.). Основанные на ДНК вакцины против гриппа и ВИЧ-1 находятся уже на клинических испытаниях с участием взрослых здоровых добровольцев. Вирус коровьей оспы также служит мощной основой программ по вакцинации. Действительно, вирус коровьей оспы явился единственной вакциной, способной ликвидировать заболевание (оспу) у людей. Многочисленные рекомбинантные вирусы коровьей оспы вызы 002390 52 вали защитные иммунные ответы, что показано в исследованиях на животных. Приведенные выше данные указывают на эффективность полиоболочечной вирусной вакцины и комбинаций стратегий вакцинирования, например, вакцины с ДНК и вирусные вакцины. Строится бифункциональная плазмида, которая может действовать и как вакцина с ДНК, и как рекомбинантный вектор VV. На фиг. 7 показана карта этой плазмиды, которая включает промотор ЦМВ для экспрессии в клетках млекопитающих, а также ранний и поздний промоторы коровьей оспы для получения рекомбинантного вируса коровьей оспы. Прямая инъекция очищенной плазмидной ДНК может быть использована для вызова иммунных ответов против белка оболочки ВИЧ у исследуемых субъектов. Плазмида может быть также использована для получения и тестирования живых рекомбинантных вирусов коровьей оспы в качестве векторов иммунизации оболочечными белками ВИЧ. Субъекты могут быть потенциально вакцинированы с помощью многоярусной схемы,включающей как вакцинацию (вакцинации) ДНК, так и иммунизацию (иммунизации) рекомбинантными вирусами коровьей оспы в любом порядке в виде одной или многократных инъекций и/или в сочетании с дополнительными вакцинными векторами. Представленное изобретение не следует ограничивать рамками специфических вариантов осуществления изобретения, описанных здесь. Действительно, специалистам будут понятны, исходя из представленных выше описаний и сопровождающих рисунков, различные модификации изобретения в дополнение к описанному здесь. Имеется в виду, что такие модификации находятся в рамках заявленных пунктов формулы изобретения. Следует далее понять, что все величины оснований или аминокислот и все значения молекулярных весов или молекулярных масс, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приближенными и представлены для описания. Ниже приведены различные публикации,на которые очень подробно ссылаются. ЛитератураViruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae,6-oe издание, Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд (1990);Hybridomas, 7-ое издание, Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд(i) Заявитель: Ст. Джууд Чилдренс Рисрч Хоспитл 332 Ноорс Лодердейл Почтовый ящик 318 Мемфис, Теннесси 38101-0318 Соединенные Штаты Америки Заявители/авторы изобретения: Гурвитц Джулия Л., Коулклаф Кристофер, Овенс Рандалл Дж., Слобод Карен(ii) Название изобретения: Получение и применение вирусных векторов для вакцин из смешанных белков оболочек против вируса иммунного дефицита человека(Е) План почтовых зон (США): 07601(v) Форма компьютерного представления данных:(vi) Текущие данные подачи заявки: ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полиоболочечная вирусная вакцина, содержащая, по меньшей мере, от примерно 4 до примерно 10000 различных рекомбинантных вирусов, каждый из которых экспрессирует определенный вариант белка оболочки (env) вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ), причем указанный вариант содержит как вариабельные, так и константные участки белка оболочки ВИЧ и данная вакцина способна вызывать у млекопитающего, по меньшей мере, клеточный и гуморальный иммунный ответ против штамма ВИЧ. 2. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что содержит от примерно 10 до примерно 100 различных рекомбинантных вирусов, экспрессирующих определенный вариант оболочки ВИЧ. 3. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что рекомбинантные вирусы выбраны из группы, состоящей из вируса коровьей оспы, аденовируса и аденоассоциированного вируса (ААВ). 4. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что определенный вариант белка оболочки ВИЧ включает gp120 и участок gp41, достаточный для обеспечения олигомеризации белков оболочки. 5. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.4, отличающаяся тем, что вариант белка оболочки ВИЧ кодируется полинуклеотидом,включающим рестрикционный Крn-BsmI фрагмент. 6. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что вариант белка оболочки ВИЧ принадлежит вирусу, полученному от больных, инфицированных ВИЧ из географически ограниченного района или вариантами ВИЧ. 59 7. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно включает варианты белков оболочки ВИЧ, экспрессируемых рекомбинантными вирусами. 8. Полиоболочечная вирусная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и противовирусный химиотерапевтический агент. 9. Способ генерации гуморального и/или клеточного иммунного ответа у млекопитающих на вирус иммунного дефицита человека (ВИЧ),включающий введение млекопитающему вакцины в эффективном количестве, отличающийся тем, что в качестве вакцины используют полиоболочечную вакцину по любому из пп.1-8. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что если рекомбинантным вирусом является вирус коровьей оспы, то полиоболочечную вирусную вакцину вводят подкожно. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что используют две полиоболочечные вирусные вакцины по любому из пп.1-8, в которых рекомбинантные вирусы принадлежат к различным типам. 12. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает праймирование или усиление гуморального и/или клеточного иммунного ответа путем (а) введения эффективного количества, по меньшей мере, одного рекомбинантного белка оболочки ВИЧ и/или (б) эффективного количества, по меньшей мере, одно 002390 60 го ДНК-вектора, обеспечивающего экспрессию рекомбинантного белка оболочки ВИЧ, причем ДНК-вектор может быть введен до, после или одновременно с рекомбинантным белком оболочки ВИЧ. 13. Способ по п.9, отличающийся тем, что рекомбинантный белок оболочки ВИЧ перед введением смешивают с адъювантом. 14. Способ по п.9, отличающийся тем, что рекомбинантный белок оболочки ВИЧ вводят внутримышечно. 15. Способ по п.9, отличающийся тем, что рекомбинантный белок оболочки ВИЧ смешивают с адъювантом и вводят внутримышечно. 16. Способ по п.9, отличающийся тем, что ДНК-вектор вводят методикой выстреливания генов. 17. Бифункциональная плазмида, используемая для получения рекомбинантных вирусов,входящих в состав вакцины по п.1 формулы,содержащая ксеногенный ген, кодирующий вариант белка оболочки ВИЧ, включающий как вариабельные, так и константные участки указанного белка, причем данный ген находится под контролем регулирующих экспрессию последовательностей двух типов, а именно, последовательности предраннего промотора цитомегаловируса и последовательности раннего промотора вируса коровьей оспы и/или позднего промотора вируса коровьей оспы.