Система трансфекции днк для получения инфекционного вируса гриппа
Формула / Реферат
1. Экспрессионная плазмида, содержащая промотор РНК-полимеразы I (pol I) и последовательности терминатора pol I, которые инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (pol II) и сигналом полиаденилирования.
2. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что промотор pol I проксимален к сигналу полиаденилирования, а последовательность терминатора pol I проксимальна к промотору pol II.
3. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что промотор pol I проксимален к промотору pol II, а последовательность терминатора pol I проксимальна к сигналу полиаденилирования.
4. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанная плазмида соответствует плазмиде, которая имеет карту, выбранную из группы, включающей pHW2000, pHW11 и pHW12.
5. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что содержит также сегмент вирусного гена РНК вируса с отрицательной цепью, инсертированный между промотором и сигналом терминации pol I.
6. Экспрессионная плазмида по п.5, отличающаяся тем, что РНК вирус с отрицательной цепью является членом семейства вирусов Orthomyxoviridae.
7. Экспрессионная плазмида по п.6, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа A.
8. Экспрессионная плазмида по п.7, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует ген, выбранный из группы, содержащей белок комплекса вирусной полимеразы, M белок и NS белок, при этом гены получают из штамма, хорошо адаптированного к росту в клеточной культуре, и/или из ослабленного штамма.
9. Экспрессионная плазмида по п.6, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа В.
10. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из pHW241-PB2, pHW241-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M и pHW248-NS.
11. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из pHW181-PB2, pHW181-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M и pHW188-NS.
12. Экспрессионная плазмида по п.7, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует ген, выбранный из группы, состоящей из гена гемагглютинина (HA) гриппа и гена невраминидазы (NA).
13. Экспрессионная плазмида по п.12, отличающаяся тем, что ген вируса гриппа получают из патогенного штамма вируса гриппа.
14. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из pHW244-HA, pHW246-NA, pHW184-HA, pHW186-NA.
15. Система, основанная на минимальном количестве плазмид, для получения инфекционных РНК-вирусов с отрицательной цепью из клонированной вирусной кДНК, содержащей набор плазмид, отличающаяся тем, что каждая плазмида содержит один автономный вирусный геномный сегмент, а также тем, что вирусная кДНК, соответствующая автономному вирусному геномному сегменту, инсертирована между последовательностями промотора и терминатора РНК-полимеразы I (pol I), что приводит к экспрессии вРНК, которые, в свою очередь, инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (pol II) и сигналом полиаденилирования, вызывая при этом экспрессию вирусной мРНК.
16. Система, основанная на минимальном количестве плазмид по п.15, отличающаяся тем, что промотор pol I проксимален к сигналу полиаденилирования, а последовательность терминатора pol I проксимальна к промотору pol II.
17. Система, основанная на минимальном количестве плазмид по п.15, отличающаяся тем, что промотор pol I проксимален к промотору pol II, а последовательность терминатора pol I проксимальна к сигналу полиаденилирования.
18. Система, основанная на плазмидах по п.15, отличающаяся тем, что РНК вирус с отрицательной цепью является членом семейства вирусов Orthomyxoviridae.
19. Система, основанная на плазмидах по п.18, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа A.
20. Система, основанная на плазмидах по п.18, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа B.
21. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует белок, выбранный из группы, содержащей белок комплекса вирусной полимеразы, M белок и NS белок, при этом указанные гены получают из штамма, хорошо адаптированного к росту в клеточной культуре, и/или из ослабленного штамма.
22. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что вирусные геномные сегменты содержат гены, которые кодируют белок, выбранный из группы, состоящей из гемагглютинина и гена невраминидазы или их обоих, при этом указанные гены получают из патогенного вируса гриппа.
23. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что указанная система содержит одну или несколько плазмид, имеющих карту, выбранную из группы, состоящей из pHW241-PB2, pHW241-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M и pHW248-NS.
24. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что указанная система содержит одну или несколько плазмид, имеющих карту, выбранную из группы, состоящей из pHW181-PB2, pHW181-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M и pHW188-NS.
25. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.15.
26. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.18.
27. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.19.
28. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.22.
29. Способ получения вириона РНК вируса с отрицательной цепью, включающий культивирование клетки-хозяина по п.25 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
30. Способ получения вириона Orthomyxoviridae, включающий культивирование клетки-хозяина по п.26 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
31. Способ получения вириона вируса гриппа, включающий культивирование клетки-хозяина по п.27 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
32. Способ получения патогенного вириона гриппа, включающий культивирование клетки-хозяина по п.28 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
33. Способ получения вакцины, специфической для РНК вируса с отрицательной цепью, включающий очистку вириона, полученного способом по п.29.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что включает также инактивацию вириона.
35. Способ по п.33, отличающийся тем, что вирус РНК с отрицательной цепью является ослабленным вирусом.
36. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК вируса с отрицательной цепью, включающий введение указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
37. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК вируса с отрицательной цепью, включающий внутримышечную инъекцию указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
38. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК вируса с отрицательной цепью, включающий интраназальное введение указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
39. Способ получения ослабленного РНК вируса с отрицательной цепью, включающий
а) мутирование одного или нескольких вирусных генов в системе, основанной на плазмидах по п.15, и
б) определение, являются ли инфекционные РНК вирусы, полученные в указанной системе, ослабленными.
40. Состав, содержащий вирион РНК вируса с отрицательной цепью, отличающийся тем, что вирусные внутренние белки вириона получают из вирусного штамма, хорошо адаптированного к росту в культуре, или из ослабленного штамма, или из них обоих, а вирусные антигенные белки вириона получают из штамма патогенного вируса.
41. Состав, содержащий вирион РНК вируса с отрицательной цепью, полученный способом по п.29.
Текст
006311 Настоящая заявка основана на предварительной патентной заявке США 60/200.679, зарегистрированной 28 апреля 2000 г. и полностью приведенной здесь в качестве ссылки. Исследования, которые привели к настоящему изобретению, были поддержаны грантами АI95357,АI29680, АI08831, AI29559 и AI29680 на исследования в системе здравоохранения, выданными Национальным институтом аллергических и инфекционных заболеваний. В соответствии с этим правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права на данное изобретение. Область изобретения Настоящее изобретение относится к разработке минимальной плазмидной системы для получения инфекционных РНК-вирусов, предпочтительно вирусов гриппа, из клонированной ДНК. В частности,данная pol I - pol II система с использованием нескольких плазмид способствует получению как рекомбинантных, так и реассортированных вирусов. В предпочтительных вариантах реализации изобретение содержит систему из восьми плазмид pol I - pol II для получения вирусов гриппа. Она может также применяться для получения других РНК-вирусов исключительно из клонированной кДНК. Жизненный цикл РНК-вирусов Геномы РНК-вирусов имеют различные конфигурации, в том числе мономолекулярные или сегментированные, однонитевые с (+) или (-) полярностью или двухнитевые. Однако вирусы должны удовлетворять двум важным общим требованиям: (1) геномные РНК должны в достаточной степени копироваться в форму, которую можно эффективно использовать для соединения в частицы вирусов потомства,и (2) должны синтезироваться мРНК, которые можно эффективно транслировать в вирусные белки. В общем случае РНК-вирусы (за исключением ретровирусов) кодируют и/или переносят РНК-зависимую РНК-полимеразу, чтобы катализировать синтез новой геномной РНК (для сборки в вирусные частицы потомства) и мРНК (для трансляции в вирусные белки). Поскольку эукариотическая клетка-хозяин обычно не содержит механизма для репликации РНК-матрицы или для трансляции полипептидов с отрицательной цепи или двухнитевой РНК-матрицы, вирусы, содержащие такие нуклеиновые кислоты в своих геномах, должны переносить белок РНК-полимеру в вирусных частицах. По этой причине депротеинизированные молекулы РНК-вирусов, несущих отрицательные одно- или двухнитевые РНК (в которых отсутствует ассоциированная РНК-полимераза), являются неинфекционными. В отличие от этого, депротеинизированная РНК из генома РНК-вируса, несущего положительную цепь, обычно является инфекционной, поскольку кодируемые вирусные белки могут транслироваться механизмом клетки-хозяина. РНК вирусного генома должны быть упакованы в вирусные частицы, чтобы обеспечивать передачу вирусов. Некоторые капсиды РНК-вирусов имеют оболочку из липидных мембран от инфекцированных клеток-хозяев, а другие имеют наружную оболочку из вирусного белка без липидного бислоя. Независимо от этих различий между вирусными капсидами способ сборки вирусных частиц потомства и белок-белковые взаимодействия в процессе сборки являются сходными. Вирусные белки в целом классифицируют как структурные и неструктурные. В общем случае неструктурные белки участвуют в репликации генома, регуляции транскрипции и упаковке. Структурные белки обычно выполняют три типа функций, включая (1) связывание с геномной РНК (т.е. белок нуклеокапсида для вируса гриппа А), (2) образование связей между упакованной РНК и наружными белками (т.е. белком матрикса) и (3) формирование наружного слоя вируса(т.е. поверхностные белки, такие как гемагглютинин). Сборка в вирусные частицы обеспечивает эффективный перенос РНК-генома от одной клетки-хозяина к другой в одном или нескольких организмах-хозяевах. Вирус гриппа Вирус гриппа A, Orthomyxoviridae, является РНК-вирусом, несущим антисмысловую цепь РНК с сегментированным геномом. Геномные РНК содержат одну или несколько открытых рамок считывания,по обе стороны которых на 5'- и 3'-концах располагаются некодирующие последовательности (Desselbergeret al., Gene 1980, 8:315). Вирусные РНК связаны с вирусным нуклеопротеином (НП) и полимеразными белками (РВ 1, РВ 2 и РА) в вирионах и в инфицированных клетках с образованием рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов (Hsu et al., Proc. Natl. Sci. USA 1987, 84:8140). Генетический состав позволяет этому вирусу развиваться путем реассортации сегментов генов из различных штаммов; такая реассортация создает новые варианты, для которых вновь инфицированный организм не имеет предсуществующей иммунной реакции. Известно, что из 15 подтипов гемагглютинина (НА) и 9 подтипов невраминидазы (NA) вируса гриппа, циркулирующих у водоплавающих птиц, три подтипа вызывают пандемии у человека (Webster et al., Microbiol. Rev. 1992, 56:152). Есть указания о том, что свиньи могут служить в качестве промежуточного хозяина ("смесительный сосуд") для получения новых штаммов, которые являются патогенными для человека (Scholtisek et al., Virology 1985,147:287). Вспышка эпидемии гриппа А, вызванная подтипом H5N1 в Гонконге в 1997 г., показала, что высокопатогенные вирусы гриппа А также могут передаваться человеку непосредственно от птиц (ClaasShortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1):S26-S29). Потенциальные возможности вирусов гриппа А производить новые патогенные штаммы из огромного количества штаммов, циркулирующих в природном резервуаре, указывает на то, что для контроля над даным заболеванием необходимо обеспечить мониторинг этих вирусов и разработать усовершенствованные противовирусные терапевтические средства и вакцины. Скорость, с которой развиваются новые штаммы, требует оперативной организации такого монито-1 006311 ринга и привлечения всех возможностей современной технологии для производства достаточного количества вакцины против каждого нового идентифицированного патогенного штамма, чтобы предотвращать эпидемии или пандемии. Для вируса гриппа А системы с использованием обратной генетики позволили манипулировать вирусным геномом (Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neumann and Kawaoka; Adv. VirusRes. 1999, 53:265). В отличие от вирусов с положительной цепью (т.е. полиовирусов) антисмысловые вирусные РНК (вРНК) вирусов гриппа А не являются инфекционными. Только молекулы вРНК, заключенные в капсид с четырьмя вирусными комплексными белками полимеразы (РВ 1, РВ 2, PA, NP), способны инициировать цикл вирусной репликации и транскрипции. После того как рибонуклеопротеины(РНП) проникают в ядро клетки, эти ассоциированные белки начинают транскрибировать (-) вРНК в мРНК и смысловые комплементарные РНК - (+), кРНК. Эти кРНК служат в качестве матриц для синтеза вРНК. Первой системой с использованием обратной генетики, которая была разработана для вируса гриппа А, был способ РНК-трансфекции (Luytjies et al., Cell 1989, 59:1107; Enami et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1990, 87:3802). После транскрипции in vitro вирусоподобной вРНК РНК-полимеразой фага Т 7 и восстановления молекул вирусного рибонуклеопротеина (вРНП) генетически измененные сегменты РНП путем трансфекции вводили в эукариотические клетки. Заражение вирусом-помощником приводило к получению вирусов, процессирующих ген, полученный из клонированной кДНК. Однако присутствие вируса-помощника в способах РНК и ДНК трансфекции жестко ограничивает практическую ценность этих методик, поскольку для устранения вируса-помощника требуется эффективная система селекции. Разработка способа синтеза молекул вРНК in vivo под контролем РНК-полимеразы I (pol I) обеспечила внутриклеточное получение комплексов РНК (Neumann and Hobom, Virology 1994, 202:477). В этой системе вирусоподобную кДНК встраивали между последовательностями промотора и терминатора pol I(Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607). В отличие от транскриптов мРНК, синтезированных РНКполимеразой II (pol II), у РНК, образованных pol I, отсутствовали как 5'-кэп, так и 3'-поли (А) хвост. Молекулы функциональных вРНП можно было получать путем инфицирования вирусом-помощником или с помощью контрасфекции экспрессионными плазмидами, кодирующими белки РВ 1, РВ 2, РА или NPal., Virology 1998, 246:83). Последние исследования показали, что плазмидная экспрессия всех восьми вРНК из промотора pol I и коэкспрессия белков полимеразного комплекса приводят к образованию инфекционного вируса гриппа А(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Vitrol. 1999, 73:9679). Поскольку образование вируса гриппа А, вызываемое только плазмидами, не требует инфекции вирусом-помощником, не возникает необходимости в какой-либо системе селекции, поэтому всеми генными сегментами можно манипулировать без технических ограничений. В этой системе, разработанной Neumann et al. (см. выше), восемь кДНК встраивали между последовательностью промотора pol I человека (407 bp) и последовательностью терминатора мыши (174 bp). Экспрессию четырех РНП-комплексных белков проводили с использованием промотора цитомегаловируса человека. Трансфекция 12 плазмид в 106 293 Т клеток привела к получению вируса в количестве более чем 103 pfu; этот выход можно увеличить до 5 х 107 pfu после трансфекции 17 плазмид. Fodor et al. (см. выше) разработали систему, в которой восемь кДНК встраивали между последовательностью промотора pol I человека (250 bp) и геномной рибозимной последовательностью вируса гепатита дельта, чтобы обеспечить точный 3'-конец вРНК. Для экспрессии генов полимеразного комплекса использовали плазмиды, содержащие основной поздний промотор аденовируса типа 2. После трансфекции 12 экспрессионных плазмид в клетки Vero из 106 трансфецированных клеток получили только одну или две инфекционные вирусные частицы. Однако система, не содержащая вирусов-помощников, описанная Neumann et al. (см. выше) и содержащая промоторы pol I и pol II с кДНК вируса гриппа на различных плазмидах, требует конструкции и котрансфекции по меньшей мере 12 плазмид для получения вируса и 17 плазмид для эффективного получения вируса. Трансфекция клеток таким большим количеством плазмид может ограничивать применение этой системы только клеточными линиями, которые имеют высокую эффективность трансфекции. Для того чтобы получать вирус из различных типов клеток, можно увеличить выход вируса за счет усиления репликации вируса гриппа А в этих клетках и увеличения набора клеток, пригодных для получения вакцин (Govorkova et al., J. Virol. 1996, 70:5519). Таким образом, существует потребность в более эффективном способе получения рекомбинантных вирусов гриппа. Кроме того, существует дополнительная потребность в эффективном получении реассортированных вирусов для получения вакцин против новых идентифицируемых вирусных штаммов. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других потребностей в данной области путем создания систем, в которых синтез как отрицательных сегментов геномных вирусных РНК (вРНК),так и вирусных мРНК, происходит из одной матрицы, что позволяет минимизировать количество плазмид,необходимых для получения вирусов, и обеспечивает эффективную и прогнозируемую реассортацию. Вирусы Reoviridae Вирусы семейства Reoviridae, в том числе вирусы рода Rotavirus, содержат двухнитевой сегментированный геном РНК. Ротавирус человека является самым распространенным вирусным агентом тяже-2 006311 лой детской диареи в Соединенных Штатах, вызывающей около 50000 случаев госпитализации и от 20 до 50 смертей в год, вызывая примерные ежегодные затраты более 1 миллиарда долларов. В развивающихся странах считается, что ротавирус ответственен за одну треть всех случаев госпитализации, связанных с диареей, и вызывает примерно 850000 смертей в год. Существует двойная система обозначения серотипов ротавируса вследствие того, что реакция нейтрализации вызывается двумя вирусными белками (VP), VP7 и VP4. Серотипы VP7 обозначают как Gтипы, а серотипы, полученные из V4, описывают как Р-типы. В настоящее время у человека обнаружены по меньшей мере 10 серотипов G и 7 серотипов Р. Поскольку гены VP4 и VP7 сегрегируют раздельно,новые ротавирусы образуются путем реассортации. В Соединенных Штатах наиболее часто встречаются серотипы от Р 1 до Р 4 и от G1 до G4; о других комбинациях поступали сообщения из таких стран, как Индия и Египет. Первая лицензированная вакцина против ротавируса человека была получена для серотип-специфичной защиты от четырех распространенных серотипов G1-G4. Однако эту вакцину изъяли из-за установленной связи между вакцинацией и увеличением степени инвагинации у вакцинированных реципиентов. Таким образом, существует потребность в получении антиротовирусной вакцины, представляющей все подтипы G и Р и не вызывающей нежелательных побочных эффектов. Настоящее изобретение обеспечивает векторы (предпочтительно плазмиды), способы и клетки-хозяева, которые можно использовать для получения ротавирусов исключительно из клонированной кДНК. Определили 13 основных генных продуктов. Чтобы свести к минимуму перепутывания и обеспечить сравнение с белками, имеющими аналогичные функции других видов Reoviridae, использовали следующую номенклатуру: в соответствии с их миграцией при анализе SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), начиная с самого крупного белка, структурным белкам давали префикс "VP", а неструктурным белкам - префикс "NSP" и указывали в скобках функцию каждого белка. Так, например, аббревиатура VP1(Pol) показывает, что самым крупным белком в частицах вируса является РНК-зависимая РНК-полимераза. Семь структурных белков соединяются в вирусные частицы,которые содержат три слоя структуры: (1) внутреннее вирусное ядро, содержащее dsPHK-геном, включает три белка, ассоциированных с ним, два из которых (VP1(Pol) и VP3(Cap асоциированы с геномом непосредственно, в то время как третий (VP2(T2 образует оболочку ядра, (2) средняя белковая оболочка вириона, образованная 780 молекулами VP6(T13), расположенными в 260 триметрических блоках, и(3) VP4 и VP7 образуют наружную оболочку. Структура белка выступов VP4 содержит сайт расщепления трипсином, который является важным для разрезания на VP5 и VP8, поскольку такое расщепление повышает инфекционность. Предполагается, что две формы VP7, VP7(1) и VP7(2), полученные из различных рамок считывания, включаются в вирионы. Гораздо меньше известно о функциях шести неструктурных белков. Предполагают, что аналогично другим РНК-вирусам неструктурные белки играют важную роль в репликации вирусов, транскрипции,трансляции вирусных РНК и упаковке. Действительно, на основании анализов чувствительных к воздействию температуры в сегменте 8 вирусов можно предположить, что NSP2(ViP) играет непосредственную роль в репликации вирусов. Считают, что NSP3 связывается с консервативными последовательностями на 3'-конце вирусных мРНК и с клеточным кэп-связывающимся белком elF4G и таким образом дополнительно регулирует трансляцию мРНК-ротавируса, которые содержит 5'-кэп структуры, но не содержит хвостов 3'-поли A. NSP1 является несущественным, однако, он, вероятно, играет активную роль в репликации ротавируса в клеточной культуре. Предполагают, что NSP4 участвует в вирусном морфогенезе. Два неструктурных белка, NSP5 и NSP6, кодируются двумя различными рамками считывания из сегмента 11, однако, их функция в жизненном цикле вирусов неизвестна. Цикл репликации завершается в течение 10-12 ч при 37 С. Современные данные позволяют предположить, что вирусы могут проникать в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза,однако, для попадания в клетки может существовать и альтернативный механизм. После попадания в клетку-хозяина наружная вирусная оболочка высвобождает транскрипционно активную частицу с двойной оболочкой в цитоплазму инфицированной клетки. Ферменты, связанные с вирионами, вырабатывают 5'-кэппированные неполиаденилированные мРНК, которые представляют собой полноразмерные транскрипты с отрицательной цепи каждого сегмента вирионного генома. Вирусные мРНК, полученные из каждого сегмента, выполняют две функции: во-первых, они транслируются для получения вирусных белков, кодируемых сегментом, и, во-вторых, вирусные мРНК также являются матрицами для репликации генома. Сборка сегмента генома происходит в результате отбора различных вирусных мРНК, которые требуются для получения предварительного ядра RI. За сборкой из 11 мРНК следует синтез отрицательной цепи, который происходит в "ядре RI" и VP6(T13)-RI, присутствующих в "вироплазмах", которые находятся в цитоплазме инфицированной клетки. Следующие стадии морфогенеза вирионов потомства являются уникальными для ротавирусов и включают отпочковывание двуслойных частиц в эндоплазматический ретикулум в процессе, который происходит с участием NSP4. Это приводит к тому, что частицы получают временную оболочку, которая разрушается на заключительных стадиях развития, когда добавляется наружная оболочка вирионов VP4 и VP7. Сегментированный геном, высокоорганизованная структура генома и комплексный цикл репликации представляют собой основные трудности для разработки обратной генетической системы, предна-3 006311 значенной для получения ротавирусов. Однако настоящее изобретение можно использовать для простого и удобного способа получения ротавируса. Противогриппозные вакцины Противогриппозные вакцины, лицензированные в настоящее время органами здравоохранения для применения в Соединенных Штатах и Европе, являются противогриппозными вакцинами с применением инактивированных вирусов. Вирусы, представляющие собой эпидемиологически важные штаммы А и В вируса гриппа, выращивают в куриных яйцах с зародышем, а затем очищают вирусные частицы и инактивируют их с помощью химических средств. Всемирная организация здравоохранения ежегодно выбирает подтипы, циркуляция которых является наиболее вероятной: в настоящее время это два штамма вируса гриппа А (H1N1) и (H3N2), а также штамм В. Для получения безопасной и эффективной вакцины важно, чтобы выбранные для вакцины штаммы имели близкое родство с циркулирующими штаммами, чтобы антитела могли нейтрализовать антигенно сходный вирус у вакцинированного населения. Однако не все вирусы, имеющие близкое родство, пригодны для получения вакцины, поскольку они плохо воспроизводятся в куриных яйцах. Поэтому представляется желательным получение реассортированного вируса с высокой степенью роста, чтобы обеспечить сочетание высокого выхода вируса лабораторного штамма (A/PR/8/34) (H1N1) с антигенными характеристиками ожидаемого патогенного штамма. К сожалению, совместное инфицирование двумя вирусами гриппа, содержащими восемь сегментов, теоретически приводит к образованию 28=256 различных вариантов вирусов потомства. Для получения вируса с высокой степенью роста и требуемыми гликопротеиновыми антигенами необходим способ отбора, обеспечивающий удаление соответствующих генных сегментов из родительского лабораторного штамма с высокой степенью роста. Процедура отбора для получения вируса с соответствующими гликопротеинами и проверкой совокупности генов является обременительной и трудоемкой. Хотя система RPN-трансфекции (Lutjesd et al., Cell 1989, 59:1107) снижает возможное количество вирусов потомства, хороший метод отбора все-таки необходим. Вакцины живого ослабленного вируса гриппа, вводимые интраназально, вызывают местный, мукозальный, клеточно-опосредованный и гуморальный иммунитет. Адаптированные к холоду (са) реассортированные (CR) вирусы, содержащие шесть внутренних генов живого ослабленного гриппа A/Ann Arbor/6/60(H2N2) или B/Ann Arbor/1/66, a также гемагглютинин (НА) и невраминидазу (NA) современных вирусов гриппа дикого типа, оказываются надежно ослабленными. Такая вакцина эффективна для детей и молодежи. Однако она может оказаться слишком ослабленной, чтобы стимулировать идеальную иммунную реакцию у пожилых людей, которые составляют основную группу из 20-40 тысяч индивидуумов, ежегодно умирающих в США от заражения гриппом. Хотя последовательности внутренних генов са-вирусов описаны, вклад каждого сегмента в ослабленный фенотип определен недостаточно. Такую информацию можно получить только путем введения в вирус последовательностей специфических, определенных ослабляющих мутаций. Хотя способ RNP-трансфекции позволяет вводить мутацию в геном вируса гриппа, потребность в системе отбора и технические трудности восстановления вирусных RNP в искусственных условиях ограничивают применение этого способа для манипулирования внутренними генами. Таким образом, существует потребность в разработке рекомбинантных противогриппозных вакцин,которые не используют вируса-помощника, хорошо вырастают в культуре (куриные яйца или клеточная культура), надежно обеспечивают получение реассортированных вирусов, которые можно размножить для разработки новых вакцин, а также обеспечивают возможность систематического мутирования для получения штаммов живых ослабленных вирусов для интраназальной вакцинaции. Настоящее изобретение решает эти и другие известные в данной области задачи. Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает получение экспрессионной плазмиды, содержащей промотор РНК-полимеразы I (pol I) и последовательности терминатора pol I, которые встроены между промотором РНК-полимеразы II (pol II) и сигналом полиаденилирования. Экспрессионная плазмида называется в данном описании pol I-pol II системой, экспрессионной системой с двойным промотором или экспрессионной плазмидой с двойным промотором. Такая плазмида оптимально содержит сегмент вирусного гена РНК-вируса, встроеннный между промотором pol I и сигналом терминации. РНК-вирус предпочтительно является вирусом гриппа (например, вирусом гриппа А или гриппа В). Изобретение включает две системы на основе плазмидного вектора для получения инфекционных РНК-вирусов из клонированных генов или кДНК. В одной системе (двунаправленная система) ген или кДНК располагают между промотором pol II в обратном направлении и промотором pol I в прямом направлении. Транскрипция гена или кДНК с промотора pol II образует кэппированную смысловую вирусную мРНК, а транскрипция с промотора pol I образует антисмысловую некэппированную вРНК. В другой системе (однонаправленная система) ген или кДНК располагают в прямом направлении от промоторов pol I и pol II. С pol II промотора образуется кэппированная смысловая вирусная мРНК, а с промотораpol I образуется некэппированная смысловая вирусная кРНК. Система согласно изобретению, основанная на минимальном количестве плазмид, позволяет получать инфекционные РНК-вирусы из клонированной вирусной кДНК. Такая система содержит набор плазмид, при этом каждая плазмида содержит один автономный вирусный геномный сегмент РНК-4 006311 вируса. В каждой плазмиде вирусная кДНК, соответствующая автономному вирусному геномному сегменту, встроена между последовательностями промотора и терминатора РНК-полимеразы I (pol I), тем самым обеспечивая экспрессию вРНК, которые, в свою очередь, встроены между промотором РНКполимеразы II (pol II) и сигналом полиаденилирования, что приводит к экспрессии вирусной мРНК. Таким образом, данная система использует технологию двунаправленных плазмид и обеспечивает эффективную реассортацию для получения РНК-вирусов, соответствующих текущим циркулирующим патогенным штаммам, например, для генов гриппа NA и НА, в фоновом штамме, хорошо адаптированном для роста в культуре клеток, и/или из ослабленного штамма. Указанным вирусом предпочтительно является вирус гриппа А или вирус гриппа В. Изобретение обеспечивает клетки-хозяина, содержащие систему на основе плазмидного вектора,для получения инфекционных вирусов и способы получения вирионов РНК-вируса, включающие выращивание клеток-хозяев при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК. Система на основе плазмидного вектора, клетки-хозяина и способ получения вирионов особенно пригодны для изготовления вакцины, специфичной по РНК-вирусам. Такие способы включают очистку вирионов. Очищенные вирионы можно инактивировать или ослабить. Вакцины согласно изобретению можно использовать для вакцинации против инфекции РНК-вирусов. Так, например, защитную дозу вакцины, содержащей инактивированные вирионы, можно вводить путем внутримышечной инъекции. Альтернативным способом защитную дозу вакцины, содержащей ослабленные вирионы, можно вводить субъекту интраназально. Кроме того, изобретение включает вирионы реассортирующих вирусов и составы вакцин, содержащие такие вирионы, в том числе инактивированные и ослабленные вирионы. В другом полезном варианте реализации изобретение обеспечивает способ получения ослабленного РНК-вируса. Этот способ включает мутацию одного или нескольких вирусных генов в системе, основанной на плазмидном векторе, с последующим определением, являются ли инфекционныe РНК-вирусы, созданные системой, ослабленными. Такие ослабленные вирусы можно использовать для разработки интраназальных вакцин, включая интраназальные вакцины с повышенной эффективностью, вызывающие защитный иммунитет у престарелых и иных лиц, на которыe не действуют известные ослабленные вакцины. Описание прилагаемых фигур Фиг. 1. Схематическое представление транскрипционной системы pol I-pol II, предназначенной для синтеза вРНК и мРНК. кДНК каждого из восьми сегментов вируса гриппа инсертирована между промотором pol I (pIh) и терминатором (tI) pol I. По обеим сторонам от этой единицы транскрипции pol I находятся промотор (pIICMV) pol II цитотмегаловируса человека и сигнал (aIIBGH) полиаденилирования гена,кодирующего гормон роста быка. После трансфекции восьми экспрессионных плазмид синтезировалось два типа молекул. С промотора человека pol I клеточной pol I синтезировалась антисмысловая вРНК. Синтезированная вРНК содержит некодирующую область (NCR) на 5'- и 3'-концах. Транскрипция посредством pol II приводит к образованию мРНК со структурами 5' кэпа и 3' поли (А) хвостами; эти мРНК транслируются в вирусные белки. ATG кодон вирусной кДНК является первым ATG в прямом направлении от сайта инициации транскрипции pol II. Фиг. 2. Система из восьми плазмид pol I-pol II для получения вируса гриппа А. Восемь экспрессионных плазмид, содержащих восемь вирусных кДНК, инсертированных между промотором pol I человека и промотором pol II (см. фиг. 1), трансфецировали в эукариотические клетки. Поскольку каждая плазмида содержит два различных промотора, клеточные pol I и pol II транскрибируют плазмидную матрицу,предположительно в различных ядерных компартментах, что приводит к синтезу вирусных мРНК и вРНК. После окончания синтеза вирусных белков полимеразного комплекса (РВ 1, РВ 2, PA, NP) начинается цикл вирусной репликации. В конечном счете, соединение всех вирусных молекул, прямо (транскрипция pol II) или косвенно (транскрипция pol I и вирусная репликация) полученных в результате действия клеточных механизмов транскрипции и трансляции, приводит к взаимодействию всех синтезированных молекул (вРНП иструктурных белков НА, NA, М 1, М 2, NS2/NEP) с образованием инфекционного вируса гриппа А. Фиг. 3 А и 3 В. Схематическое изображение способа, разработанного для конструкции и трансфекции восьми экспрессионных плазмид с целью получения вируса A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). А. Вирусную РНК экстрагировали из вирусных частиц. RT-PCR провели с праймерами, содержащими сегмент-специфические нуклеотиды и последовательности для рестрикционных эндонуклеаз типаpHW2000 (линеаризованную BsmBI). Такая инсерция привела к образованию восьми экспрессионных конструктов, в которых вирусные кДНК точно слиты с промотором и терминатором pol I (в черных прямоугольниках показаны вирусные концевые последовательности AGC-ACT для сегмента РВ 2). В. Восемь экспрессионных плазмид с промотором pol I и промотором pol II содержат по одной копии каждого из восьми сегментов вирусных кДНК. По обеим сторонам от открытых рамок считывания для 10 вирусных белков находятся сегмент-специфические некодирующие области (серые прямоугольники). Поскольку используемый промотор pol I человека проявляет высокую активность только в клеточных линиях человека или родственных видов, клетки 293 Т человека культивировали совместно со-5 006311 стандартной линией клеток, используемой для гриппа А (клетки MDCK). Вирусы, полученные в клетках 293 Т после трансфекции, могут затем инфицировать клетки MDCK и реплицироваться. Фиг. 4 А и 4 В. Идентификация полученных посредством RT-PCR вирусов. А. РНК экстрагировали из вирусных частиц после двух пассирований супернатанта трансфецированных клеток (см. табл. 1 и 2) на клетках MDCK. RT-PCR провели с праймерами, специфичными для сегмента гена NS, и с вРНК, экстрагированной из вирионов. Используемые праймеры NS не были специфичными по штамму и поэтому обеспечивали амплификацию любого сегмента NS гриппа А. Продукты реакции подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле. Для того чтобы обеспечить получение амплифицированных фрагментов ДНК с вРНК, а не с плазмидной ДНК, переносимой из трансфецированных клеток, одну реакцию проводили без добавления обратной транскриптазы (RT) (-). Дорожки 1 и 2,рекомбинантный А/Tеаl/НК/W/312/97 (табл. 1); дорожки 3 и 4, М-реассортация (табл. 2); дорожки 5 и 6,NS-реассортация (табл. 2); дорожки 7 и 8, рекомбинантный вирус A/WSN/33 (табл. 1); дорожки 9 и 10,четырехкратная реассортация (табл. 2). В. Nсоl расщепление фрагментов, показанных на фиг. А. Идентичность фрагментов NS также проверяли с помощью анализа последовательности амплифированного продукта (не показано). Фиг. 5. Однонаправленная транскрипционная система РНК pol I-pol II. В однонаправленной транскрипционной системе РНК pol I-pol II вирусную кДНК вводят с положительной ориентацией между промотором (pIh) pol I человека и последовательностью терминатора (tI). По обеим сторонам от всего этого транскрипционного блока pol I находятся промотор pol II (pIICMV: предранний промотор цитомегаловируса человека) и сайт полиаденилирования гена, кодирующего гормон роста быка (aIIBGH). После трансфекции ожидается синтез двух типов транскриптов РНК. Смысловая кРНК с трифосфатной группой на ее 5'-конце, синтезированная pol I, и смысловая мРНК, синтезированная pol II, со структурой 5'кэп, и поли (А) хвостом на ее 3'-конце. Для эффективной трансляции мРНК требуются оба элемента. Фиг. 6. Вектор клонирования pHW11 с промоторами pol I и pol II, расположенными последовательно. Плазмида содержит 225 bp промотора РНК pol I человека (pIh) и 33 bp терминатора мыши (tI). С обеих сторон последовательностей промотора и терминатора pol I находятся промотор (pIICMV) РНК-полимеразы II мегаловируса человека и сигнал полиаденилирования гена, кодирующего гормон роста быка(aIIBGH). Для вставки вирусной кДНК между промотором и терминатором pol I ввели два рестрикционных сайта BsmBI (показаны подчеркиванием). В результате рестрикции вектора BsmBI получили векторный фрагмент с липкими, но некомплементарными выступающими концами. Конструкция этого вектора позволяет выполнять точное слияние вирусной кДНК в положительной ориентации относительно промотора и терминатора pol I. Для размножения в Е. соli плазмида имеет точку инициации репликации(ori), а для отбора в среде, содержащей ампициллин, плазмида содержит ген бета-лактамазы (blа). Фиг. 7 А и 7 В. Система с двойным промотором для получения инфекционных РНК-вирусов. Поскольку РНК-вирусы функционируют как клеточные паразиты, им приходится оптимизировать стратегию использования клеток-хозяев для экспрессии своей генетической информации. Все РНК-вирусы должны синтезировать мРНК, которые способны транслироваться в белки. В общем случае синтезированные белки требуются для репликации, транскрипции и получения новых частиц вирусного потомства. Для эффективной репликации геномных РНК необходимо образование РНК-транскриптов с точно определенными 5' и 3' концами. Данная система содержит наружный и внутренний транскрипционные блоки. Внутренний транскрипционный блок содержит промотор (р(+РНК) или р(-РНК, предпочтительно промотор роl I. кДНК РНКвирусов состоят из одной или нескольких открытых рамок считывания (ORF), с обеих сторон от которых находятся некодирующие области (NCR). Последовательности между вирусной кДНК и промотором предпочтительно отсутствуют. Отсутствие таких промежуточных последовательностей очень важно,поскольку концы 5' и 3' геномной вРНК обычно содержат последовательности, распознаваемые вирусными белками, необходимыми для транскрипции и репликации; дополнительные невирусные последовательности обычно мешают эффективному распознаванию и репликации вРНК вирусными белками. Отсутствие промежуточных последовательностей позволяет вирусным полимеразным белкам эффективно использовать транскрибируемую (-) цепь РНК (А) или (+) цепь РНК (В). Наружный транскрипционный блок имеет промотор (р(мРНК, предпочтительно промотор роl II, который управляет транскрипцией мРНК с кДНК; мРНК включает 5' последовательности (например, метил G-кэпы) и 3' последовательности (например,поли А хвосты), которые требуются для инициации трансляции и получения вирусных белков. Поскольку способ трансляции допускает наличие дополнительных последовательностей между промотором наружного транскрипционного блока и вирусной кДНК, присутствие промежуточных последовательностей из внутреннего транскрипционного блока не вносит существенного ухудшения трансляции мРНК. Эту систему можно модифицировать и усовершенствовать для РНК-вирусов, отличных от вируса гриппа, путем использования различных промоторов во внутреннем блоке транскрипции (например, роlII, pol III, T3, SP6, Т 7 или какой-либо другой промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы) и терминаторов или рибозимов для внутриклеточного синтеза вирусной РНК с точно определенными 5' и 3' концами (см. ниже). Hammerhead рибозимы или рибозимы вируса гепатита дельта (HDV) можно использо-6 006311 вать для получения вирусной РНК с точно определенными кoнцами (Schnell et al., EMBO J. 1994,13:4195; Pleschka et al., J. Virol. 1996, 70:4188; Herold, J. et al., J. Virol 2000, 74(14):6394-400). Наружный транскрипционный блок может содержать промотор pol I или III, промотор РНК-полимеразы фага Т 7, промотор РНК-полимеразы фага T3, промотор РНК-полимеразы SP6 или какой-либо иной промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Если промотор в наружном транскрипционном блоке управляет синтезом транскрипта, у которого отсутствует метил G-кэп, внутренний сайт посадки рибосом (IRES) можно поместить на 5' конце кодирующей последовательности кДНК, чтобы обеспечить инициацию трансляции (см. ниже). Следует отметить, что вектор pHW2000 содержит промотор Т 7 между промотором CMV и сайтом терминации. Транскрипты pol II синтезируются в ядре, при этом транскрипты Т 7 синтезируются в цитоплазме клеток, экспрессирующих РНК-полимеразу Т 7. Поэтому транскрипты, происходящие из нескольких промоторов наружного транскрипционного блока, можно получить в виде различных мРНК. Таким образом, экспрессионные плазмиды, полученные из pHW2000, позволяют быстро оценить, является ли промотор pol II, или Т 7, или сочетание их обоих оптимальным для синтеза мРНК-вирусов с положительной цепью, которые содержат внутренний сайт посадки рибосом (IRES). Фиг. 8. Система с двойным промотором для получения РНК-вирусов с (+) цепью. Настоящее изобретение можно использовать также для получения вирусов, содержащих мономолекулярный геном из положительной цепи, в частности вируса гепатита С. В этом варианте реализации кДНК, содержащую геном вируса гепатита С (примерно 9500 нуклеотидов), встраивают в конструкт, который позволяет производить эффективную внутриклеточную транскрипцию кДНК в мРНК и полноразмерную отрицательную РНК (двунаправленная система) или мРНК и полноразмерную положительную РНК (однонаправленная система). кДНК состоит из одной открытой рамки считывания (ORF), с обеих сторон от которой находятся некодирующие области (NCR). На фигуре показана экспрессионная плазмида, содержащая двунаправленную систему. Полноразмерную кДНК встраивают между последовательностями промотора(pI) и терминатора (tI) pol I, что после трансфекции обеспечивает синтез полноразмерной (-) цепи РНК. Внутренний транскрипционный блок окружен наружным транскрипционным блоком, который содержит промотор (р(мРНК, управляющий синтезом мРНК. Этим промотором предпочтительно является промотор pol II. Однако, если синтезированная РНК имеет внутренний сайт посадки рибосом (IRES),промотор pol II можно заменить промотором pol I, pol III, SP6, Т 7 или Т 3 (применение промоторов Т 3 или Т 7 требует, чтобы белки полимераз Т 3 или Т 7 были экспрессированы либо при котрансфекции плазмиды, кодирующей полимеразы, либо применением стабильной клеточной линии, экспрессирующей полимеразы). На 3' конце наружного транскрипционного блока используют сигнал поли А или встроенную последовательность поли А, чтобы обеспечить поли А хвост для синтезированной мРНК. Полученная мРНК транслируется в большой полипротеин-предшественник, который расщепляется в процессе трансляции и после нее, образуя отдельные структурные и неструктурные вирусные белки. Неструктурные белки NS5a и NS5b, которые являются РНК-зависимыми РНК-полимеразами, используют в качестве матрицы (-) РНК, синтезируемую внутренним транскрипционным блоком, чтобы инициировать цикл вирусной репликации/транскрипции. Таким образом, получается (+) РНК/мРНК, которая используется для трансляции в белок. В конечном счете образуются инфекционные вирусы, которые содержат (+) РНК вместе с вирусными структурными белками. Фиг. 9. Система роl I-роl II для получения вируса III парагриппа человека. Настоящее изобретение можно использовать для получения вируса III парагриппа, который содержит мономолекулярный геном из отрицательной цепи, РНК. Вирусную кДНК можно встраивать в систему роl I-роl II в смысловой или антисмысловой ориентации. На фигуре представлена однонаправленная система. Промотор pol I управляет синтезом кРНК, а промотор pol II управляет синтезом мРНК. В этом варианте реализации промоторpol II создает полицистронную мРНК, с которой первая открытая рамка считывания эффективно транслируется в белок нуклеокапсида (NP). Этот белок требуется для репликации. Плазмиды, кодирующие Lи Р-белки, также важные для репликации и транскрипции (но которые неэффективно транслируются с полицистронной мРНК), приготавливают и совместно трансфецируют на отдельных экспрессионных плазмидах. По сравнению с обратной генетической системой, разработанной Durbin, A.P. et al., Virology 1997, 235 (2):323-332, система pol I-pol II имеет несколько преимуществ. За счет экспрессии NP с той же самой кДНК эта система с минимальным количеством плазмид требует конструкции и трансфекции всего трех вместо четырех плазмид для получения вируса III парагриппа только из клонированной кДНК. В отличие от обратных генетических систем, основанных нa in vivo транскрипции с промотора Т 7, системаpol I-pol II полностью управляется эукариотическими ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые находятся в каждой клетке. Кроме того, инфицирование вирусом коровьей оспы, который управляет экспрессией РНК-полимеразы Т 7, требует применения клеток, которые допускают воздействие вируса коровьей оспы (клетки HeLa или их производные, в частности клетки Нер-2), но не являются оптимальными для роста вируса парагриппа человека, что ограничивает полезность такого подхода к получению инфекционных вирусов. Тяжелые цитопатические воздействия вируса коровьей оспы и правила безопасности,которые необходимо соблюдать при применении инфицирующих агентов, являются нежелательными особенностями этой системы. Применение системы pol I-pol II устраняет требование инфекции вирусом и-7 006311 позволяет использовать клетки LLC-MK2 для трансфекции и выращивания вируса III парагриппа человека,что обеспечивает технологию получения ослабленных вирусов более простым и безопасным способом. Фиг. 10. Система на основе плазмидного вектора для получения ротавируса из клонированной кДНК. Эту систему можно использовать для получения вирусов с геномами сегментированных двухнитевых РНК (например, ротавируса). Ее можно использовать, например, для вирусов, которые являются членами семейства Reoviridae (10, 11, 12 сегментов dsPHK) или Birnaviridae (2 сегмента sPHK). В настоящее время для вирусов семейства Reoviridae нет обратных генетических систем. Эта фигура показывает, как ротовирусы, которые содержат 11 сегментов dsPHK, можно получить с помощью настоящего изобретения, однако, аналогичные системы можно использовать для членов семейств Orbivirus (10 сегментов dcPHK) или Orthoreoviruses (12 сегментов dsPHK). Следующее обсуждение иллюстрирует способ получения ротавируса A/SA11 только из клонированной кДНК. Определены все 11 сегментов генома ротавируса обезьяны с двухнитевой РНК. ДлинаdsPHK в геноме составляет от 3302 bp до 663 bp, а размер всего генома составляет 18550 bp. Сегменты генома пронумерованы от 1 до 11 в порядке возрастания подвижности, определенной PAGE анализом(электрофорез в полиакриламидном геле). Сегменты являются полностью спаренными по основаниям, и положительная цепь содержит 5' концевую кэп-структуру (m7GpppGmGPy), но не содержит сигнала полиаденилирования возле ее 3' конца. Все геномные сегменты обладают короткими консервативными 5' и 3' концевыми элементами с 10 нуклеотидным консенсусным элементом на 5' конце и 8 нуклеотидным консенсусным элементом на 3 конце. Непосредственно внутрь от этих концевых областей в каждом гене имеется вторая консервативная область по меньшей мере из 30-40 нуклеотидов, которые являются сегмент-специфическими. 5'-нетранслируемые области (NTR) имеют различную длину, однако, все они менее 50 нуклеотидов, и во всех сегментах за NTR следует по меньшей мере одна длинная открытая рамка считывания после первого AUG. Сегменты 9 и 11 кодируют два белка. 3' NTR имеют длину в пределах от 17 нуклеотидов (сегмент 1) до 182 нуклеотидов (сегмент 10). кДНК ротавируса клонируют в систему с двойным промотором, предпочтительно в систему pol Ipol II. После трансфекции полученных плазмид в соответствующую клетку-хозяина образуются вирусные РНК и белки, что приводит к образованию инфекционного ротавируса. Для получения ротавируса предпочтительно используют однонаправленную транскрипционную систему. Данный поход приводит к внутриклеточному синтезу 11 молекул (+) РНК ротовирусного генома, которые содержат трифосфаты на 5' концах. Экспрессия вирусоподобной мРНК приводит к экспрессии вирусных белков. Вирусный белокVP3 (кэп), который обладает гуанилтрансферазной и метилтрансферазной активностью, катализирует добавление 5'-кэп структур ко всем 11 ротавирусным (+) РНК (Chen D., et al., Virology 1999, 265:120130). Действительно, ранее было показано, что очищенный VP4 (кэп) вируса bluetogue (BTV), аналогVP3 (кэп) ротавируса, может добавлять кэп-структуры в вирусоподобные (+) РНК in vitro (Ramadevi N.,et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95(23): 13537-42). Ожидается, что in vivo транскрипция кДНК и внутриклеточная экспрессия VP3 (кэп) белка приводят к образованию кэппированных РНК для всех 11 ротавирусных геномных сегментов. Эти мРНК транслируются в вирусные белки или упаковываются в предварительное ядро RI. После образования частиц VP6(13)-RI положительная смысловая мРНК используется в качестве матрицы для синтеза (-) РНК. В конечном счете, добавление VP4 и VP7 в процессе морфогенеза приводит к образованию инфекционных вирионов потомства. Поскольку эффективная инициация репликации и морфогенеза может зависеть от оптимальной концентрации каждого вирусного белка, может оказаться предпочтительным получение отдельных плазмид для синтеза РНК и экспрессии белка. Однако уровень экспрессии белка можно оптимизировать за счет изменения количества плазмид в клетке-хозяине или за счет использования различных промоторов для синтеза мРНК, поэтому для большинства генов применение двух плазмид для одного сегмента, вероятно, не будет необходимым. Поскольку (+) РНК синтезируется с (-) РНК, внутриклеточная экспрессия (-) РНК и белка может приводить к созданию единиц, пригодных для репликации, которые образуют вирусную мРНК. Таким образом, cистема с двойным промотором позволяет использовать систему с минимальным количеством плазмид, которая содержит значительно меньше плазмид, чем 22, необходимых в случае, если плазмиды, экспрессирующие РНК и белок, находятся на отдельных плазмидах. Получение ротавируса можно выполнить аналогично тому, как получают вирус гриппа А. Фиг. 11A-D. Репликация и синтез мРНК геномов РНК-вирусов. А. мРНК синтезировали с помощью вирусных полимеразных белков во время инфицирования вирусов с (-) цепью: одну или две мРНК для сегментированных РНК-вирусов или несколько мРНК для вирусов с мономолекулярными геномами. Механизмы антитерминации приводят к синтезу полноразмерных (+) цепей, которые можно копировать в (-) геномную РНК.B. Сегментированные геномы РНК-вирусов с РНК любой ориентации копируются с образованием одной мРНК, в то время как вторая РНК синтезируется комплементарно.C. В клетках, инфицированных вирусами с двухнитевой РНК, предварительно синтезированные мРНК могут быть транслированы в белок или служить в качестве матриц для синтеза (-) цепей, образуя двухнитевую геномную РНК.D. Для вирусов с (+) цепью геномная РНК также является мРНК и копируется в (-) цепь РНК, которую можно копировать в (+) геномную РНК. мРНК некоторых (+) РНК-вирусов не содержат поли А хвоста. В некоторых семействах образуются одна или несколько субгеномных РНК. Подробное описание изобретения Жизненный цикл всех РНК-вирусов включает синтез РНК и сборку вирусных частиц после окончания синтеза белка; эти функции обеспечивают концептуальную основу обратных генетических систем согласно настоящему изобретению, которые можно использовать для получения РНК-вирусов из клонированной кДНК. Настоящее изобретение упрощает и усовершенствует известные обратные генетические системы путем создания системы с двойным промотором для получения сегментированных вирусов с отрицательной цепью (например, грипп А, грипп В, Bunyaviridae), несегментированных вирусов с отрицательной цепью РНК (например, Paramyxovidae, Mononegavirales) и вирусов с положительной цепью РНК (например, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Togaviridae). Поскольку система согласно настоящему изобретению использует одну вирусную кДНК для синтеза белка и синтеза геномной РНК, эта система уменьшает количество плазмид, которое требуется для получения вирусов, и позволяет быстро и экономично разрабатывать вакцины. Если с помощью настоящего изобретения требуется получить вирус, содержащий сегментированный геном РНК, вирусную кДНК, соответствующую каждому гену в целевом геноме, вводят в экспрессионную плазмиду согласно изобретению. Изобретение включает двунаправленную систему экспрессии на основе плазмидного вектора и однонаправленную систему экспрессии на основе плазмидного вектора,в которых вирусную кДНК встраивают между промотором и терминатором ДНК-полимеразы I (pol I)(внутренний транскрипционный блок). По обеим сторонам всего этого транскрипционного блока pol I находятся промотор и сайт полиаденилирования РНК-полимеразы II (pol II) (наружный транскрипционный блок). В однонаправленной системе промоторы pol I и pol II расположены в прямом направлении к кДНК, и с них образуется некэппированная смысловая кРНК (с промотора pol I) и кэппированная смысловая мРНК(с промотора pol II). Промотор pol I, терминатор pol I, промотор и сигнал полиаденилирования pol II в однонаправленной системе можно назвать имеющими "ориентацию сверху вниз". В двунаправленной системе промоторы pol I и pol II располагают по обеим сторонам от кДНК, при этом выше (upstream) расположенный промотор pol II дает кэппированную смысловую мРНК, а ниже (downstream) расположенный промотор pol I дает антисмысловую некэппированную вирусную РНК (вРНК). Такие системыpol I-роl II начинают с инициации транскрипции двух клеточных ферментов РНК-полимеразы из своих собственных промоторов, предположительно в разных компартментах ядра. Промотор pol I и терминаторpol I в двунаправленной системе можно назвать имеющими "ориентацию снизу вверх" (downstream-toupstream), в то время как промотор роl II и сигнал полиаденилирования в двунаправленной системе можно назвать имеющими "ориентацию сверху вниз" (upstream-to-downstream). Если интересующий вирус содержит сегментированный РНК-геном с положительной цепью, промотор pol I предпочтительно располагают выше от кДНК во внутреннем транскрипционном блоке (однонаправленная система). В этом варианте реализации получают РНК с положительной цепью для непосредственного включения в новые вирусы. Однако настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых с помощью однонаправленной системы получают вирусы, содержащие сегментированные РНК-геномы с отрицательной цепью. Если интересующий вирус содержит сегментированный РНК-геном с отрицательной цепью, промотор pol I предпочтительно располагают ниже кДНК во внутреннем транскрипционном блоке (двунаправленная система). В этом варианте реализации получают РНК с отрицательной цепью для непосредственного введения в новые вирусы. Однако настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых с помощью двунаправленной системы получают целевые вирусы, содержащие сегментированные геномы РНК с положительной цепью. Настоящее изобретение можно использовать также для получения вирусов, содержащих инфекционные или неинфекционные несегментированные РНК геномы (однонитевые или двухнитевые). В общем случае простое введение инфекционных вирусных геномных РНК в клетку-хозяина является достаточным для того, чтобы вызывать инициацию вирусного цикла жизни в клетке и конечного получения полных вирусов. Так, например, простое введение пикорнавирусной геномной РНК в клетку-хозяина достаточно для получения полных пикорнавирусов. Инициация жизненного цикла вируса, содержащего неинфекционную геномную РНК, обычно требует дополнительного введения других вирусных белков,которые обычно переносятся в вирусной частице вместе с геномом. Так, например, вирус III парагриппа переносит РНК-зависимую РНК-полимеразу, наличие которой требуется во вновь инфицированной клетке-хозяине для начала репликации вирусной геномной РНК и транскрипции вирусных мРНК; при отсутствии полимеразы геномная РНК парагриппа III не инфекционна. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых получают вирусы, содержащие инфекционные, несегментированные геномные РНК, простое введение двойной экспрессионной плазмиды согласно изобретению, которая переносит нуклеиновую кислоту, включающую вирусный геном, в соответствующую клетку-хозяинa, является достаточным, чтобы вызвать образование полных вирусов. В вариантах реализации, в которых получают вирусы, содержащие неинфекционную, несегментированную геномную РНК, может также потре-9 006311 боваться введение в клетку-хозяина дополнительных экспрессионных плазмид наряду с двойной экспрессионной плазмидой, переносящей вирусный геном. Дополнительная плазмида должна экспрессировать один или несколько белков, которые необходимы для инициации жизненного цикла вируса и которые обычно вводятся в клетку-хозяина при инфекции (например, РНК-зависимые РНК-полимеразы). В вариантах реализации, в которых получают пикорнавирус, содержащий инфекционный несегментированный геном РНК, кДНК, содержащую полный вирусный геном, встраивают в экспрессионную плазмиду с двойным промотором согласно изобретению. Промотор, расположенный выше в наружном транскрипционном блоке, предпочтительно промотор роl II, управляет синтезом мРНК с положительной цепью, содержащей полный вирусный геном - полипротеин, транслируется с мРНК, и отдельные белки отщепляются и выделяются из полипротеина (например, протеазой в составе полипротеина). Поскольку вирусный геном содержит РНК с положительной цепью, второй расположенный выше во внутреннем транскрипционном блоке промотор (однонаправленная система), предпочтительно роl I, управляет синтезом копии генома в виде положительной цепи. Если вирусный геном содержит РНК с отрицательной цепью, второй промотор, расположенный ниже во внутреннем транскрипционном блоке (двунаправленная система), предпочтительно роl I, управляет получением копии генома в виде отрицательной цепи. Варианты реализации, в которых несегментированные РНК-вирусы с отрицательной цепью РНК получают с помощью однонаправленной системы, включаются в данное изобретение. Аналогично этому варианты реализации, в которых несегментированные РНК-вирусы с положительной цепью получают с помощью двунаправленной системы, также включаются в данное изобретение. Настоящее изобретение позволяет также получать вирусы, содержащие неинфекционные несегментированные РНК-геномы, в которых полипротеин не образуется. Так, например, данную систему можно использовать для получения вирусов rhabdoviridae или вирусов paramyxoviridae, предпочтительно вирусов III парагриппа, жизненный цикл которых обычно включает получение ряда моноцистронных мРНК с геномных РНК с отрицательной цепью под воздействием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы,при этом отдельные белки экспрессируются с моноцистронных мРНК. В этих вариантах реализации наружный транскрипционный блок, содержащий промотор, предпочтительно промотор роl II, управляет получением полицистронной копии вирусного генома с положительной цепью, из которой обычно транслируется только первый ген (NP). Кроме того, внутренний транскрипционный блок, содержащий промотор, предпочтительно промотор роl I, управляет экспрессией РНК копии генома, предназначенной для введения в новые вирусы. Поскольку вирусный геном парагриппа III содержит РНК в виде отрицательной цепи, промотор внутреннего транскрипционного блока располагают предпочтительно ниже(downstream) от кДНК (двунаправленная система). Если вирусный геном содержит РНК в виде положительной цепи, промотор внутреннего блока транскрипции располагают предпочтительно выше от кДНК(однонаправленная система). Варианты реализации, в которых вирусы, содержащие геном РНК с положительной цепью, получают с помощью двунаправленной системы, и варианты реализации, в которых вирусы, содержащие геном РНК с отрицательной цепью, получают с помощью однонаправленной системы, включаются в настоящее изобретение. Для транскрипции и репликации вируса требуются дополнительные вирусные белки (L и Р) (отличные от белка, экспрессируемого с полицистронной мРНК), и эти белки поставляются индивидуально на отдельных экспрессионных плазмидах. Изобретение может также включать варианты реализации, в которых получают вирусы, содержащие сегментированные геномы двухнитевых РНК. В этих вариантах реализации плазмиду, несущую каждый ген, из генома интересующего вируса вводят в экспрессионную плазмиду с двойным промотором согласно изобретению. Плазмида может представлять собой однонаправленную или двунаправленную плазмиду. Промотор в наружном транскрипционном блоке, предпочтительно промотор роl II, управляет экспрессией транскрипта мРНК каждого гена, который транслируется в кодированный белок. Промотор во внутреннем транскрипционном блоке, предпочтительно промотор роl I, управляет транскрипцией положительной цепи (однонаправленная система) или отрицательной цепи (двунаправленная система). Следовательно, первая образующаяся цепь может действовать как матрица для создания комплементарной цепи вирусной РНК-полимеразой. Полученный продукт двухнитевой РНК включается в новые вирусы. Получение двух вирусов гриппа А, а именно A/WSN/33 (H1N1) и A/Teal/HK/W312/07 (H6N1), из системы, основанной на минимальном количестве плазмид, определяет полезность этой системы. Получение неразличимого по фенотипу штамма A/PR/8/34 (H1N1), который является стандартным для изготовления инактивированной вакцины против гриппа А, определяет полезность данной системы для разработки вакцин. Через 72 ч после трансфекции восьми экспрессионных плазмид в совместно культивированные клетки 293 Т и MDCK выход вирусов в супернатанте трансфецированных клеток составлял от 2 х 105 до 2 х 107 инфекционных вирусов на мл. Эту восьмиплазмидную систему использовали также для получения одинарно и четырежды реассортированных между A/Teal/HK/W312/07 (H6N1) и A/WSN/33 (H1N1) вирусов и получения вирусов и A/WSN/33 из последовательно ориентированной системы (которая создает кРНК и мРНК). Благодаря тому, что система pol I-pol II способствует образованию и получению как рекомбинантных, так и реассортированных вирусов гриппа А, ее можно использовать также для получения других РНК-вирусов только из клонированной кДНК. Хотя кДНК является предпочтительной для применения в настоящем изобретении, любой другой тип нуклеиновой кислоты, которая кодирует вирусный ген, под-10 006311 лежащий экспрессии, можно использовать, если сохраняются основные элементы изобретения. Так, например, можно использовать амплифицированные PCR продукты или рестрикционные фрагменты, содержащие вирусные гены. Кроме того, гены, экспрессиованные в системе, основанной на плазмидном векторе, согласно изобретению могут присоединяться к другим генам или метиться ими, в частности,метками очистки/обнаружения (например, глютатион-S трансфераза, полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, метки mуc и метки FLAG). Настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых в данной системе в плазмидах используются частичные последовательности генов. В следующей таблице приведен неограничительный список РНК-вирусов с отрицательной цепью,которые можно получить с помощью настоящего изобретения.-11 006311 Настоящее изобретение также частично основано на разработке двунаправленной транскрипционной конструкции, которая содержит вирусную кДНК, кодирующую РВ 2, РВ 1, РА, НА, NP, NA, М илиNS и расположенную между промотором РНК-полимеразы I (pol I) для синтеза вРНК и промотором РНК-полимеразы II (pol II) для синтеза вирусной мРНК. Полезность такого подхода доказана получением вируса после трансфекции конструкта pol I/pol II-промотор-РВ 1 вместе с вРНК-конструктом и конструкциями экспрессии белка для семи остальных сегментов. Поскольку такой подход уменьшает количество плазмид, которое требуется для образования вируса, он также уменьшает трудоемкость клонирования, повышает эффективность получения вирусов и расширяет возможности применения обратной генетической системы для клеточных линий, для которых невозможно осуществить эффективную совместную трансфекцию 17 плазмид. Кроме того, изобретение включает однонаправленную транскрипционную конструкцию, содержащую промоторы pol I и pol II, которые расположены выше (upstream) от последовательности, кодирующей вирусную кДНК. Оба промотора имеют общую выше-ниже (upstream-todownstream) ориентацию по отношению к гену. Хотя двунаправленная система обеспечивает более высокий титр вируса гриппа А, однонаправленная система полезна для других областей применения (например, для получения других вирусных штаммов с отрицательной цепью). Промотор, терминатор или сигнал полиаденилирования находятся "выше" (upstream) от гена, если они расположены ближе к началу гена (например, стартовому кодону) и дальше от конца гена (например,терминирующего кодона). Промотор, терминатор или сигнал полиаденилирования находятся "ниже"(downstream) от гена, если они расположены ближе к концу гена и дальше от начала гена. Промоторы в плазмидах согласно изобретению, которые функционально связаны с геном, ориентированы таким образом, чтобы обеспечить транскрипцию смысловой или антисмысловой цепи гена. Используемый в настоящем описании термин "экспрессионная плазмида" означает вектор ДНК, содержащий "внутренний транскрипционный блок" и "наружный транскрипционный блок". Как указано выше, экспрессионные плазмиды можно использовать для получения РНК-вируса любого типа, предпочтительно РНК-вирусов с положительной или отрицательной цепью, РНК-вирусов с сегментированным или несегментированным геномом или РНК-вирусов с двойной цепью. Наружный транскрипционный блок содержит промотор, предпочтительно промотор pol II, который управляет транскрипцией с вирусной кДНК - мРНК, которая может затем транслироваться. Наружный транскрипционный блок может содержать промотор РНК-полимеразы фага Т 7, промотор РНК-полимеразы фага Т 3, промотор РНКполимеразы SP6 или другой промотор или сочетание генетических элементов, способных обеспечивать экспрессию транслируемого РНК продукта. Так, например, наружный транскрипционный блок может содержать промотор pol I или ро 1 II, если вирусная кДНК, которая подлежит экспрессии с плазмиды,генетически изменена таким образом, что включает сигнал полиаденилирования на 3' конце транскрибируемой РНК. Это можно реализовать путем инсерции цепи А нуклеотидов в 3' конец последовательности, кодирующей кДНК, непосредственно перед терминирующим кодоном. Кроме того, вирусную кДНК можно генетически изменить так, чтобы она включала внутренний сайт посадки рибосом (IRES) на 5' конце кДНК для облегчения начала трансляции с транскрибированной РНК. "Внутренний транскрипционный блок" в экспрессионных плазмидах согласно изобретению расположен внутри наружного транскрипционного блока и содержит промотор, предпочтительно промотор pol I, способный управлять транскрипцией вирусной кДНК, которая может реплицироваться с помощью вирусного механизма и включаться в новые вирусы. Промотор во внутреннем транскрипционном блоке предпочтительно транскрибирует РНК, которая не содержит избыточных, невирусных внешних последовательностей на 5' и 3' концах, предпочтительно путем точного слияния вирусной кДНК с промотором и терминатором pol I. Однако изобретение включает варианты реализации, в которых блок внутренней транскрипции содержит промотор, управляющий образованием транскриптов РНК, содержащих дополнительную невирусную последовательность на 5' и 3' концах (например, промоторы pol II, промоторы pol III, промотор Т 7 РНКполимеразы, промоторы Т 3 РНК-полимеразы или промоторы SP6 РНК-полимеразы). В этих вариантах реализации дополнительные последовательности могут быть включены в экспрессионную плазмиду,благодаря которой РНК, полученная из внутреннего транскрипционного блока, не включает лишней невирусной последовательности. Так, например, экспрессионная плазмида может быть генетически изменена таким образом, чтобы включать рибозимные последовательности на концах транскриптов, полученных из внутреннего транскрипционного блока, при этом рибозимные части транскрибированной РНК расщепляют транскрипт, обеспечивая образование последовательностей 5' и 3' концов РНК, как имеющиеся в вирусной РНК. Кроме того, экспрессионные плазмиды могут быть генетически изменены таким образом, что включают терминаторные последовательности, которые вызывают терминацию транскрипции в конце последовательности, кодирующей вирусную кДНК, предотвращая при этом введение лишних нетранслируемых последовательностей в 3' конец транскрибированной РНК. "Экспрессионная плазмида" предпочтительно представляет собой ДНК вектор, использующий систему pol I-pol II. Таким образом, указанная плазмида содержит промотор РНК-полимеразы I (pol I) и терминатор pol I, которые инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (pol II) и сигналом полиаденилирования. В двунаправленной системе промотор РНК-полимеразы I регулирует экспрессию геномной некэппированной антисмысловой РНК (обозначаемой здесь как "вРНК") кДНК, которая инсертирована в антисмысловой-12 006311 ориентации между данными промотором и терминатором. Промотор РНК-полимеразы II регулирует экспрессию матричной РНК; сегмент кДНК вирусного гена, введенный в "смысловом" между промоторомpol II и сигналом полиаденилирования, приводит к экспрессии кэппированной вирусной смысловой мРНК. В однонаправленной системе вирусную кДНК вводят ниже от промоторов pol I и pol II в смысловой ориентации. Промотор pol II обеспечивает экспрессию кэппированной смысловой вирусной мРНК, а промотор pol I обеспечивает экспрессию некэппированной смысловой вирусной кРНК. Плазмида может содержать "практически все" от другой основной плазмиды, если все гены и функциональные некодирующие участки основной плазмиды имеются в наличии. Так, например, плазмида,полученная простым удалением части полилинкера и введением чужеродного гена, содержит практически все от основной плазмиды."Вирус РНК с отрицательной цепью" представляет собой вирус, в котором вирусный геном представляет собой РНК в виде отрицательной цепи. РНК с отрицательной цепью является комплементарной по отношению к мРНК и в общем случае должна копироваться для трансляции белков в комплементарную мРНК с положительной цепью. Обычно эти вирусы содержат РНК-зависимую РНК-полимеразу для образования мРНК после инфицирования клетки-хозяина. Семейства РНК-вирусов с отрицательной цепью включают без ограничения Orthomyxoviridae, Arenaviridae и Bunyaviridae. Вирусный геном предпочтительно относится к членам семейства вирусов Orthomyxoviridae и в оптимальном случае содержит сегментированный геном. Члены семейства вирусов Orthomyxoviridae включают без ограничения вирусы гриппа А, гриппа В, Thogotovirus, кори и свинки (Paramyxovirus) или вирус Rhabies (рабдовирус)."Вирус РНК с положительной цепью" представляет собой вирус, содержащий РНК-геном в виде положительной цепи. Примеры РНК-вирусов с положительной цепью включают полиовирус (пикорнавирус), тогавирусы и флавивирусы. Геномная РНК этих вирусов имеет такое же направление, как мРНК и может функционировать как мРНК. Эти вирусы могут содержать сегментированный или несегментированный геном."Вирус с двухнитевой РНК" содержит геном в виде двухнитевой РНК. Реовирусы являются вирусами с двухнитевой РНК. Вирусный геном может быть также сегментированным или несегментированным (мономолекулярным). Сегментированный геном содержит не менее двух нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует один или несколько вирусных генов. Сегментированный геном предпочтительно содержит отдельную нуклеиновую кислоту для каждого вирусного гена. Ортомиксовирусы (вирус гриппа А, В или С), буньявирусы и аренавирусы содержат сегментированные РНК-геномы. Несегментированный геном содержит одну нуклеиновую кислоту, включающую все вирусные гены. Мононегавирусные вирусы, рабдовирусы, вирусы Flaviviridae, вирусы Picornaviridae,вирусы Coronaviridae, вирусы Togaviridae и парамиксовирусы содержат несегментированный РНК геном. Двухнитевую РНК можно сокращенно обозначить "dsPHK". Однонитевую РНК можно сокращенно обозначить "ssPHK". Однонитевую РНК в виде отрицательной цепи можно сокращенно обозначить "- ssPHK". Однонитевую РНК в виде положительной цепи можно сокращенно обозначить "+ ssPHK"."Сегмент вирусного гена" предпочтительно представляет собой клонированную кДНК, соответствующую молекуле геномной РНК из генома РНК-вируса. Этот термин может также включать ген или сегмент гена (например, продукт PCR или рестрикционный фрагмент), который содержит ген, полученный из РНК-вируса."Система, основанная на минимальном количестве плазмид" представляет собой систему, в которой имеется экспрессионная плазмида, как указано выше, содержащая все автономные вирусные геномные сегменты из РНК-вируса. Таким образом, суммарное количество плазмид, которые содержат вирусные геномные последовательности, не будет превышать суммарное количество генных сегментов из исходного РНК-вируса. Изобретение включает варианты реализации, в которых другие плазмиды, не содержащие вирусных последовательностей, могут быть котрансфецированы в клетки-хозяева. Это является важным достоинством, поскольку ограничивает суммарное количество плазмид, необходимых для создания системы в клетке-хозяине, устраняет потребность в вирусе-помощнике, устраняет потребность в процессе отбора и позволяет эффективно воспроизводить реассортированные вирусы. Определенные вирусные гены в системе, основанной на минимальном количестве плазмид согласно изобретению, можно получать из вирусного штамма, хорошо адаптированного для выращивания в культуре клеток, в частности штамма PR/8/34 (H1N1) или WSN/33 (H1N1), или из ослабленного штамма, в частности A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) или для гриппа В/Аnn Arbor/1/66. Ослабленный штамм предпочтительно должен быть также хорошо адаптирован к выращиванию в культуре клеток. В частности, для гриппа А предпочтительные генные сегменты вируса в системе, основанной на плазмидном векторе, кодируют вирусные белки полимеразного комплекса, М белки и/или N/S белки из штамма, хорошо адаптированного к выращиванию в структуре клеток, и/или из ослабленного штамма. Эти белки называются здесь "вирусными внутренними белками" или вирусным "негликопротеином". Геном вируса гриппа А обычно кодирует 10 различных белков: РВ 2, который считают транскриптазой, РВ 1, который считают транскриптазой, РА, который считают транскриптазой, НА, который считают гемагглютинином, NP, который считают нуклеопротеином, связывающимся с РНК, NA, который счита-13 006311 ют невраминидазой, М 1/М 2, которые считают белками матрикса и интегральным белком наружной мембраны, соответственно, и NS1/NS2, которые считают неструктурными белками, способными влиять на процессинг и транспорт РНК. РВ 1, РВ 2, NP и РА рассматривают как часть транскрипционного полимеразного комплекса вируса гриппа. Термин "культивирование в клетках" (cell cultutre), используемый в настоящем описании, предпочтительно относится к реализуемому в промышленных масштабах способу размножения вируса для производства вакцины, например, в куриных яйцах с зародышем, а также к выращиванию в клетках in vitro в клетке-хозяине (см. Furminger, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenca, Chapter 24,pp. 324-332, particularly pp. 328-329). Аналогично этому система на основе плазмидного вектора включает генные сегменты для антигенов, которые требуются для создания защитной иммунологической реакции. "Защитная иммунологическая реакция" содержит гуморальный (антитело) и/или клеточный компонент, достаточный для устранения вирионов и инфицированных клеток у иммунизированного (вакцинированного) субъекта. Таким образом, защитная иммунная реакция может предотвратить или устранить инфекцию РНК-вируса, например вируса гриппа. Антигены предпочтительно являются "поверхностными антигенами", т.е. экспрессированными на поверхности вириона или на поверхности инфицированных клеток. Более предпочтительно поверхностные антигены являются гликопротеинами. Для гриппа основными гликопротеиновыми антигенами являются гемагглютинин (НА или Н) и невраминидаза (NA или N). Используемый здесь термин "иммуногенный" означает, что полипептид способен вызывать гуморальную или клеточную иммунную реакцию, предпочтительно обе из них. Иммуногенный компонент является также антигенным. Иммуногенный состав представляет собой такой состав, который при введении животному вызывает гуморальную и/или клеточную иммунную реакцию. Молекула является "антигенной", если она может специфически взаимодействовать с молекулой распознания антигена в иммунной системе, в частности с иммуноглобулином (антитело) или Т-лимфоцитным антигенным рецептoром. Антигенный полипептид содержит эпитоп, который включает по меньшей мере около 5, а предпочтительно по меньшей мере около 10 аминокислот. Антигенная часть полипептида, также называемая здесь эпитопом, может представлять собой ту часть, которая является иммунодоминантной для распознавания антителом или Т-лимфоцитным рецептором, или она может быть той частью, которую используют для получения антитела к молекуле путем конъюгации антигенной части к полипептидному носителю для иммунизации. Молекула, которая является антигенной, не обязательно должна быть иммуногенной, т.е. способной вызывать иммунную реакцию без носителя. Термин "патогенный вирусный штамм" используется в данном описании для обозначения вирусного штамма, способного вызывать заболевание; этот вирус предпочтительно содержится в действующем перечне вирусов, циркулирующих с определенной вероятностью, который публикует Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Центры контроля и предотвращения заболеваний (CDC) или другие органы здравоохранения. Такие вирусы могут включать членов семейства вирусов гепатита, семейства реовирусов, семейства ортомиксовирусов, семейства парамиксовирусов, семейства filoviridae, семействаbornaviridae, семейства bunyaviridae, семейства arenaviridae, семейства coronaviridae, семейства полиовирусов или семейства рабдовирусов. Одним из достоинств изобретения является обеспечение возможности введения генов основных антигенов из таких штаммов в систему на основе плазмидного вектора, в которой остальные вирусные гены обладают желаемыми характеристиками культивирования и/или ослабленности, чтобы таким образом получить определенное количество вируса соответствующего антигенного фона для производства вакцины. Так, например, гены парамиксовируса, вируса III парагриппа человека (ген нуклеокапсида, ген фосфопротеина, ген матрикса, ген, отвечающий за слияние, ген белка гемагглютинин-полимеразы и большой ген) можно легко расположить в плазмидах согласно изобретению для получения вирионов вируса III парагриппа. Предпочтительный "реассортированный" вирус согласно изобретению представляет собой вирус, в котором генные сегменты, кодирующие антигенные белки из штамма патогенного вируса, сочетаются с генными сегментами, кодирующими вирусный полимеразный комплекс или иные аналогичные гены(например, неглюкопротеиновые гены, включая М-гены и N/S-гены) из вирусов, адаптированных к росту в культуре (или ослабленных вирусов). При этом реассортированный вирус переносит желаемые антигенные характеристики в фоновую среду, которая обеспечивает эффективное воспроизводство в клеткехозяине, как описано выше. Такой реассортированный вирус является желаемым "вирусным посевом" для получения вирионов, предназначенных для производства вакцины (см. Furminger, выше). Термин "клетка-хозяин" означает клетку любого организма, которую выбирают, модифицируют,трансформируют, выращивают, используют или с которой манипулируют каким-либо образом с целью выработки указанной клеткой рекомбинантных РНК вирионов, предпочтительно вирионов с сегментированной РНК в виде отрицательной цепи. Примеры клетки-хозяина включают без ограничения MadinDarby почечные клетки собаки (MDCK), клетки VERO, клетки CV1, клетки COS-1 и COS-7, а также клетки ВНК-1. В специфическом варианте реализации для получения вирионов предпочтительным является временное совместное культивирование. Выращивание в комбинированной культуре обеспечивает-14 006311 эффективную трансфекцию рецептивной клетки, в частности клетки 293 Т, с последующей инфекцией пермиссивной клетки, в частности клетки MCDK, для роста вирусов. Термин " вирионы РНК-вирусов " относится к вирусным частицам, которые вначале являются полностью инфекционными, при получении из клеток-хозяев способом трансфекции или котрансфекции системой, основанной на плазмидном векторе согласно изобретению. Такая система вырабатывает вРНК и вирусные белки (из трансляции вирусной мРНК), которые приводят к образованию инфекционных вирусных частиц (вирионов). Используемый в данном описании термин "вакцина, специфичная к РНК-вирусу" относится к составу, который при введении субъекту может вызывать защитный иммунитет к РНК-вирусу. Термин"вакцина" относится к составу, содержащему вирус, инактивированный вирус, ослабленный вирус, расщепленный вирус или вирусный белок, т.е. поверхностный антиген, который можно использовать для того, чтобы вызывать защитный иммунитет у реципиента (см. Furminger, выше). Следует отметить, что вакцина согласно изобретению, чтобы быть эффективной, может вызывать иммунитет у части населения,в то время как у некоторых индивидуумов не возникает устойчивая или защитная иммунная реакция, а в некоторых случаях вообще какая-либо иммунная реакция. Такая неспособность может быть следствием генетического фона индивидуума, или состоянием иммунодефицита (приобретенного или врожденного),или иммунодепрессии (например, при лечении иммунодепрессивными препаратами для предотвращения отторжения органа или подавления аутоиммунного состояния). Эффективность вакцины можно установить на модели животного."Защитная доза" вакцины представляет собой количество отдельной вакцины или в сочетании с адьювантом, достаточное для того, чтобы вызывать защитную иммунную реакцию у реципиента. Защитная доза может также зависеть от типа введения, например внутримышечно (предпочтительно для инактивированной вакцины) или интраназально (предпочтительно для ослабленной вакцины). Термин "субъект", используемый в данном описании, относится к живому организму, который поддерживает инфекцию РНК-вирусом, включая без ограничения организм водоплавающих птиц, цыплят,свиней и человека. Данный термин относится, в частности, к организму человека."Адьювант" - это молекула или состав, которые усиливают (потенциируют) иммунную реакцию иммуногена. Адьювант является "допустимым для введения человеку", если он фармацевтически допустим, как указано ниже. Примеры адьювантов приведены ниже. Используемый в данном описании термин "выделенный" (изолированный) означает, что указанный материал удален из его нативной среды, например из клетки. Таким образом, выделенный биологический материал может не содержать некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых нативный материал появляется естественным путем (например, цитоплазменный или мембранный компонент). Материал считается выделенным, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. В случае молекул нуклеиновой кислоты выделенная нуклеиновая кислота включает продуктPCR, выделенную мРНК, кДНК или рестрикционный фрагмент. В другом варианте реализации выделенная нуклеиновая кислота предпочтительно вырезана из хромосомы, в которой она может находиться, а более предпочтительно больше не присоединена или не приближена к некодирующим областям (однако она может быть присоединена к своим нативным регуляторным областям или их частям) или к другим генам, расположенным "выше" или "ниже" относительно гена, содержащегося в молекуле выделенной нуклеиновой кислоты, когда она еще находилась в хромосоме. Еще в одном варианте реализации в выделенной нуклеиновой кислоте отсутствуют один или несколько интронов. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот включают последовательности, инсертированные в плазмиды, космиды, искусственные хромосомы и т.п., то есть, когда они образуют часть структуры химерной рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Таким образом, в специфическом варианте реализации рекомбинантная нуклеиновая кислота является выделенной нуклеиновой кислотой. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками и/или нуклеиновыми кислотами, с которыми он соединяется в клетке, или с клеточными мембранами, если это мембранно-ассоциированный белок. Выделенная органелла, клетка или ткань является удаленной из анатомического участка, в котором она находится в организме. Выделенный материал может быть очищенным, но не обязательно является таковым. Термин "очищенный", используемый в настоящем описании, относится к материалу, выделенному при условиях, которые уменьшают или устраняют присутствие чужеродных материалов, т.е. загрязнений, в том числе нативных материалов, из которых получен данный материал. Так, например, очищенный вирион предпочтительно практически не содержит компонентов клетки-хозяина или культуры,включая ткань культуры или белки яйца, неспецифические патогены и т.п. Используемый здесь термин"практически не содержит" используется в контексте аналитического контроля материала. Очищенный материал, который практически не содержит загрязнений, имеет чистоту предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Чистоту можно определить способами хроматографии, электрофореза в геле, иммунологического анализа, композиционного анализа, биологического анализа и другими способами, известными специалистам. Способы очистки также хорошо известны специалистам. Вирусные частицы можно очистить способами ультрафильтрации или ультрацентрифугирования, предпочтительно длительного центрифугиро-15 006311 вания (см. Furminger, выше). Другие способы также возможны и принимаются во внимание. Очищенный материал может содержать менее 50%, предпочтительно менее 75% и наиболее предпочтительно менее 90% клеточных компонентов, среды, белков или иных нежелательных компонентов или загрязнений (в соответствии с требованиями в каждом конкретном случае), с которыми он был ассоциирован в исходном состоянии. Термин "практически чистый" указывает на самую высокую степень чистоты, которую можно обеспечить с помощью обычных способов очистки, известных специалистам. В каждом конкретном варианте реализации термин "около" или "приблизительно" означает в пределах 20%, предпочтительно 10% и более предпочтительно 5% от данной величины или диапазона. Альтернативно, с учетом логарифмических терминов, применяемых в биологии, термин "около" может означать в пределах одного порядка величины данного значения, а предпочтительно в пределах половины порядка величины данного значения. Генная инженерия систем, основанных на плазмидном векторе В соответствии с настоящим изобретением можно использовать способы обычной молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные специалистам. Такие способы подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, FritschManiatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yourk (далее "Sambrook(1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc. (1994). Эти обычные способы можно использовать для получения плазмидных pol I-pol II систем, выделения кДНК клонов вирусных генных сегментов, вставки таких ДНК в плазмиды и трансфекции клеток плазмидой или системой на основе плазмидного вектора согласно изобретению. В частности, обычные способы сайт-управляемого мутагенеза или модификации генов позволяют модифицировать вирусные РНК гены, предпочтительно вирусные гены, представленные сегментированной РНК с отрицательной цепью, для получения ослабленного вируса, как указано ниже, или вирусных белков, которые включают новые эпитопы, например, стебель невраминидазы или для создания дефектных вирусов. Термин "амплификация" ДНК, используемый в данном описании, относится к применению полимеразной цепной реакции (PCR) для увеличения содержания определенной последовательности ДНК в смеси последовательностей ДНК. Описание PCR см. Sanki et al., Science 1988, 239:487."Молекула нуклеиновой кислоты" означает полимерную форму фосфатного эфира рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; "молекулы РНК"), или деоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксинуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; "молекулы ДНК"), или их фосфоэфирные аналоги, в частности фосфоротиоаты и тиоэфиры в однонитевой форме или в форме двойной спирали. "Молекула рекомбинантной ДНК" является молекулой ДНК, подвергнутой молекулярно-биологической манипуляции."Полинуклеотид" или "нуклеотидная последовательность" - это ряд нуклеотидных оснований (также называемых "нуклеотидами") в ДНК и РНК и означает цепь из двух или нескольких нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность обычно переносит генетическую информацию, включая информацию,которую использует клеточный механизм для производства белков. При этом полинуклеотиды могут быть окружены гетерологичными последовательностями, включая промоторы, внутренние сайты посадки рибосом (IRES; Ghattas, et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991) и другие последовательности сайтов посадки рибосом, энхансеров, респонсорных элементов, суппрессоров, сигнальных последовательностей, последовательностей полиаденилирования, интронов, 5'- и 3'некодирующих областей и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть также модифицированы множеством известных способов. Неограничительные примеры таких модификаций включают метилирование, образование "кэпов", в частности 5'-7-метил-С(5')ррр(5')N кэпов, замещение аналогом одного или нескольких естественных нуклеотидов и модификации нуклеотидов. Полинуклеотиды могут содержать одну или несколько ковалентно связанных дополнительных групп, в частности белков (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), интеркаляторов (например, акридин, псорален и т.д.), хелатирующих групп (например, металлы, радиоактивные металлы, железо, металлические окислители и т.д.) и алкилирующих групп. Полинуклеотиды могут преобразоваться путем образования метилового или этилового фосфотриэфира или алкилфосфорамидатной связи. Кроме того, полинуклеотиды можно также модифицировать с помощью метки, способной обеспечивать прямо или косвенно распознаваемый сигнал. Примеры меток включают радиоизотопы, флуоресцентные молекулы, биотин и т.п."Кодирующая последовательность" или последовательность, "кодирующая" продукт экспрессии, в частности полипептид, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, будучи экспрессированной, приводит к получению указанного полипептида, т.е. нуклеотидная последовательность кодирует последовательность аминокислот для указанного полипептида. Кодирующая последовательность для белка может включать инициирующий кодон (обычно ATG) и терминирующий кодон.-16 006311 Термин "ген", также называемый "структурным геном", означает последовательность ДНК, которая кодирует определенную последовательность аминокислот или соответствует этой последовательности,содержащей полностью или частично один или несколько полипептидов, и может включать или не включать регуляторные последовательности ДНК, в частности промоторные последовательности, которые определяют, например, условия экспрессии гена. Кроме того, настоящее изобретение позволяет использовать различные мутанты, консервативные варианты последовательностей и функционально консервативные варианты генных сегментов РНКвирусов, предпочтительно генных сегментов РНК-вирусов с отрицательной цепью, при условии, что все указанные варианты сохраняют необходимый иммунозащитный эффект. Действительно, одним из достоинств изобретения является возможность применения мутагенеза для получения ослабленных вирусных штаммов на систематической основе. Термины "мутант" и "мутация" означают любое обнаруживаемое изменение в генетическом материале, например в ДНК, или любой процесс, механизм или результат такого изменения. Они включают мутации генов, в которых изменяется структура (например, последовательность ДНК) гена, ген или ДНК, получающиеся в результате процесса мутации, а также продукт экспрессии (например, белок), экспрессированный модифицированным геном или последовательностью ДНК. Термин "вариант" также может быть использован для указания модифицированного или измененного гена, последовательности ДНК, фермента, клетки и т.д., т.е. любого вида мутанта. Мутации можно вводить способами неспецифического мутагенеза или с помощью сайт-управляемого мутагенеза, включая модификацию последовательности с помощью PCR. Как отмечено выше и подробно описано далее, мутагенез одного или нескольких отдельных сегментов генов РНК-вируса (например, РНК-вируса с сегментированной отрицательной цепью) позволяет получать ослабленные вирусы, а также выяснить механизм ослабления. Кроме того, система, основанная на плазмидном векторе, согласно изобретению не имеет недостатков, присущих предшествующим попыткам получить ослабленные вирусы с помощью мутагенеза, в частности ограничений, связанных с эффективной системой селекции (см. Bilsel and Kawaoka, In: Nicholson, Webster"Вариантами, консервативными по последовательности", являются такие варианты, в которых изменение одного или нескольких нуклеотидов кодона в данной позиции не приводит к изменению аминокислоты, кодированной в данной позиции. Аллельные варианты могут быть вариантами, консервативными по последовательности."Функционально-консервативными вариантами" являются такие варианты, в которых данный остаток аминокислоты в белке или ферменте изменен без изменения общей конформации и функции полипептида, включая без ограничения замену одной аминокислоты на другую с аналогичными свойствами(например, полярностью, потенциалом водородных связей, кислотностью, основностью, гидрофобностью, ароматичностью и т.п.). Некоторые аллельные изменения приводят к образованию функциональноконсервативных вариантов, в которых замена аминокислоты не приводит к резкому изменению функции белка. Аналогично этому гомологичные белки могут представлять собой функционально-консервативные варианты. Аминокислоты со сходными свойствами хорошо известны специалистам. Так, например,аргинин, гистидин и лизин являются гидрофильно-основными аминокислотами и могут быть взаимозаменяемыми. Аналогично этому изолейцин, гидрофобная аминокислота, может быть заменен лейцином,метионином и валином. Предполагают, что такие изменения оказывают небольшое влияние или не влияют на среднюю молекулярную массу или изоэлектрическую точку белка или полипетида. Аминокислоты, отличные от названных консервативными, могут различаться в белке или ферменте, поэтому процентное сходство последовательности белка или аминокислоты двух различных белков с аналогичной функцией может отличаться и составлять от 70 до 99%, что определяется схемой сравнительного анализа первичной структуры, в частности кластерным методом, при этом сходство основано на алгоритме MEGALIGN. "Функционально-консервативный вариант" включает также полипептид или фермент, который имеет идентичность аминокислот по меньшей мере 60% по определению алгоритмамиBLAST или FASTA, в которых параметры выбирают таким образом, чтобы обеспечить максимальное соответствие между проверяемыми последовательностями по всей длине базовой (reference) последовательности, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, и который имеет такие же или практически аналогичные свойства или функции, как нативный или родительский белок или фермент, с которым его сравнивают. Используемый в настоящем описании термин "гомологичный" во всех его грамматических формах и вариантах написания относится к родству между белками, которые имеют "общее эволюционное происхождение", включая белки из суперсемейств (например, суперсемейство иммуноглобулина) и гомологичные белки из различных видов (например, миозин с легкой цепью, и т.д.) (Reeck, et al., Cell 50 667,1987). Такие белки (и их кодирующие гены) имеют гомологию последовательностей, что отражается сходством их последовательностей как с точки зрения процентного сходства, так и присутствия специфических остатков или структур. В соответствии с этим термин "сходство последовательностей" во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между нуклеиновой кислотой или аминокислотны-17 006311 ми последовательностями белков, которые могут иметь или не иметь общее эволюционное происхождение (см. Reeck, et al., выше). Однако в общеупотребительном смысле и для данного применения термин"гомологичный", видоизмененный наречием, в частности "высоко", может относиться к сходству последовательностей и может быть связан или не связан с общим эволюционным происхождением. В специфическом варианте реализации две последовательности ДНК являются "практически гомологичными" или "практически сходными", если достаточное количество нуклеотидов соответствует на определенной длине последовательностей ДНК, позволяющей отличать указанные последовательности от других последовательностей согласно алгоритмам сравнения последовательностей, в частностиBLAST, FASTA, DNA Stricter и другим, где параметры выбирают таким образом, чтобы обеспечить максимальное соответствие между проверяемыми последовательностями по всей длине базовой последовательности. Последовательности, которые являются практически гомологичными, можно идентифицировать путем сравнения последовательностей с помощью стандартного программного обеспечения, содержащегося в базе данных последовательностей, или в эксперименте по Southern гибридизации, например,при жестких условиях, определенных для конкретной системы. Такие жесткие условия известны специалистам и описаны в Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Неограничительным примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) примерно при 45 С с последующей одной или двумя промывками в 0,2 ХSSC, 0,1% SDS при 50 С, предпочтительно при 55 С и более предпочтительно при 60 или 65 С. Аналогично этому в конкретном варианте реализации две последовательности аминокислот являются "практически гомологичными" или "практически сходными", если достаточное количество аминокислот идентично или аналогично (функционально идентично) на определенной длине для отличия одних последовательностей от других последовательностей. Аналогичные или гомологичные последовательности предпочтительно идентифицируют путем сравнительного анализа первичной структуры с помощью, например, блочной программы GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCGPackage, Version 7, Мэдисон, Висконсин) или одной из вышеуказанных программ (BLAST, FESTA и т.д.). Следующая литература по алгоритму BLAST включена в данное описание в качестве ссылки: АЛГОРИТМЫ BLAST: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215:403-410,1990; Gish, W.States, D.J., Nature Genet, 3:266-272, 1993; Madden, Т.L., Tatusov, R.L.Zhang, J., Meth.Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.,Lippman, D.J., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang, J.Madden, T.L., Genome Res. 7:649-656,1997; Wootton, J.C.Federhen, S., Comput. Chem. 17:149-163, 1993; Hancock, J.M.Armstrong, J.S.,Comput. Appl. Biosci. 10:67-70, 1994; СИСТЕМЫ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ: Dayhoff, M.О, Schwartz, R.M.Orcutt, В.С. (1978)M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J. Mol. Biol. 219:555-565,1991; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F., Methods 3:66-70, 1991; Henikoff, S.Henikoff, J.G.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992; Altschul, S.F., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; СТАТИСТИКА СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ: Karlin, S.Altschul, S.F., Proc."Промоторная последовательность" представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию последовательности. Для определения в рамках настоящего изобретения промоторная последовательность, которая расположена выше кДНК, ограничена на ее 3' конце сайтом инициации транскрипции и продолжается в обратном направлении (в направлении 5') для включения минимального количества оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, которые обнаруживаются по превышению фона. Промоторная последовательность, которая расположена ниже кДНК (для экспрессии (-) РНК), ограничена на ее 5' конце сайтом инициации транскрипции и проходит в прямом направлении (в направлении 3') для включения минимального количества оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, которые обнаруживаются по превышению фона. Двунаправленная система согласно изобретению включает промоторы прямого и обратного направления (выше и ниже расположенные); однонаправленная система включает только промоторы прямого направления (выше расположенные). В промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции (обычно определяемый, например, картированием с нуклеазой S1), а также домены,связывающие белки (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Любой известный промотор можно использовать в настоящем изобретении при условии сохранения существенных элементов изобретения. Так, например, промоторы pol II, которые могут быть использованы для регулирования экспрессии гена, включают без ограничения цитомегаловирусный (CMV) промотор (патент США 5.385.839 и 5.168.062), участок раннего промотора SV40 (Benoist and Chambon,Nature 290:304-310, 1981), промотор, содержащийся в длинном 3' концевом повторе вируса саркомы Рауса(Yamamoto, et al., Cell 22:787-797, 1980), промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1985), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster,et al., Nature 296:39-42, 1982); промоторы РНК-полимеразы Т 7; промоторы РНК-полимеразы Т 3; промоторы РНК-полимеразы SP6 и другие промоторы, эффективные в клетке-хозяине, представляющей интерес. Промоторы pol I для экспрессии некэппированных РНК находятся во всех эукариотах и включают РНК-полимеразу I человека (см. Molecular Cell Biology, Darnell et al., eds 1986, pp.311, 365-6). Промоторы РНК-полимеразы III также могут быть использованы в настоящем изобретении. Кодирующая последовательность находится "под управлением", "функционально ассоциирована" или "оперативно ассоциирована" с последовательностями, управляющими транскрипцией и трансляцией(например, промотор pol I или pol II) в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует данную кодирующую последовательность в РНК, например мРНК или вРНК. Термины "экспрессировать" или "экспрессия" означают пропускание или создание информации в гене или последовательности ДНК, которая обеспечивает их проявление, например получение РНК(включая кРНК, вРНК и мРНК-вируса) или белка путем активирования клеточных функций, участвующих в транскрипции и трансляции соответствующего гена или последовательности ДНК. Последовательность ДНК экспрессируется в клетке или клеткой для получения "продукта экспрессии", в частности белка. Сам продукт экспрессии, например полученный белок, также можно назвать "экспрессированным" клеткой. Термин "трансфекция" означает введение чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина таким образом, чтобы клетка-хозяин экспрессировала введенный ген или последовательность для получения желаемого полипептида, кодированного введенным геном или последовательностью. Введенный ген или последовательность, которые можно также назвать "клонированным" или " чужеродным" геном или последовательностью, могут включать регуляторные и управляющие последовательности, в частности старт-, стоп-, промоторные, сигнальные секреторные последовательности, или другие последовательности, используемые генетическими механизмами клетки. Указанные ген или последовательность могут включать нефункциональные последовательности или последовательности, не обладающие известной функцией. Клетка-хозяин, которая получает и экспрессирует введенную ДНК или РНК, "трансформируется" и представляет собой "трансформант" или "клон". ДНК или РНК, введенная в клетку-хозяина, может поступать из любого источника, включая клетки того же самого рода или вида, что и клетка-хозяин,или другого рода или вида. Термины "вектор", "клонирующий вектор" или "экспрессионный вектор" означают средство переноса, с помощью которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген), можно ввести в клетку-хозяина, чтобы трансформировать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) введенной последовательности. Согласно изобретению предпочтительными векторами являются плазмиды. Векторы обычно содержат трансмиссивную ДНК агента, в который инсертирована чужеродная ДНК. Общий способ вставки одного сегмента ДНК в другой сегмент ДНК включает применение ферментов, которые называют рестрикционными и которые расщепляют ДНК в специфических сайтах (специфических группах нуклеотидов), называемых рестрикционными сайтами. Термин "кассета" относится к кодирующей последовательности ДНК или сегменту ДНК, кодирующему продукт экспрессии, который может быть инсертирован в вектор в определенных рестрикционных сайтах. Кассетные рестрикционные сайты предназначены для обеспечения вставки кассеты в соответствующую рамку считывания. Как правило, чужеродную ДНК вставляют в один или несколько рестрикционных сайтов вектора ДНК, а затем переносят вектором в клетку-хозяина вместе с трансмиссивной ДНК вектора. Сегмент или последовательность ДНК, содержащие вставленную или добавленную ДНК, в частности экспрессионный вектор,можно назвать также "конструкцией ДНК" (ДНК конструктом). Общим типом вектора является "плазмида", которая обычно представляет собой автономную молекулу двухнитевой ДНК, обычно бактериального происхождения, которая может легко принимать дополнительную (чужеродную) ДНК и которую можно легко вводить в соответствующую клетку-хозяина. Плазмидный вектор часто содержит кодирующую ДНК и ДНК промотора и имеет один или несколько рестрикционных сайтов, пригодных для вставки чужеродных ДНК. Кодирующая ДНК - это последовательность ДНК, которая кодирует конкретную последовательность аминокислот для конкретного белка или фермента. ДНК промотора - это последовательность ДНК, которая инициирует, регулирует, управляет или иным образом участвует в экспрессии кодирующей ДНК. ДНК промотора и кодирующая ДНК могут быть из одного или разных генов, а также могут быть из одного или разных организмов. Рекомбинантные клонирующие векторы часто включают одну или несколько систем репликации для клонирования или экспрессии одного или нескольких маркеров для селекции в хозяине, например резистентности к антибиотиками, и одну или несколько экспрессионных кассет. Термин "система экспрессии" означает клетку-хозяина и совместимый вектор при соответствующих условиях, например, для экспрессии белка, кодированного чужеродной ДНК, которая переносится вектором и вводится в клетку-хозяина.-19 006311 Термин "гетерологичный" относится к сочетанию элементов, которое не встречается в естественных условиях. Так, например, гетерологичной ДНК называют ДНК, которая в естественных условиях не находится в клетке или в сайте хромосомы клетки. Гетерологичная ДНК предпочтительно включает ген,чужеродный клетке. Гетерологичный элемент, регулирующий экспрессию, - это такой элемент, который оперативно связан с геном, отличным от того гена, с которым этот элемент связан в естественных условиях. В контексте настоящего изобретения ген, кодирующий полипептид, содержащий последовательность из библиотеки последовательностей, является гетерологичным для ДНК вектора, в который он вставлен для клонирования или экспрессии, и гетерологичен для клетки-хозяина, содержащей такой вектор, в которой он экспрессируется. Как отмечено выше, изобретение позволяет получать реассортированные вирусы с помощью гетерологичных вирусных генов. Кроме введения генов для вирусных антигенов в генетический фон вирусного штамма, адаптированного для хорошего выращивания в культуре, изобретение позволяет создавать межвидовые реассортации, например антиген гриппа В в фенотипе гриппа А. Вакцины Как указано выше, настоящее изобретение обеспечивает эффективную и экономичную стратегию получения вакцин для лечения или предотвращения инфекций РНК-вирусов, предпочтительно инфекций РНК-вирусов с отрицательной цепью. Система, основанная на минимальном количестве плазмид, согласно изобретению устраняет необходимость селекции и обеспечивает строгий контроль вариантов реассортированных вирусов. Для получения инактивированной вакцины гриппа шесть плазмид, содержащих негликопротеиновые сегменты (например, РВ 1, РВ 2, PA, NP, М и NS), из штамма с высоким выходом (например, PR/8/34 (H1N1 можно котрансфецировать с двумя экспрессионными плазмидами, содержащими НА и NA кДНК рекомендованного субтипа вакцины. Поскольку вирус-помощник не требуется, полученный вирус является вирусом гриппа с желаемой генной структурой. Аналогичным подходом можно воспользоваться для получения любого вида инактивированного реассортированного РНК вируса для применения в вакцине. Экспрессионные плазмиды, содержащие сегменты вирусных генов для интересующего вируса (например, негликопротеиновые сегменты), могут быть котрансфецированы с другими экспрессионными плазмидами, кодирующими белки, которые соответствуют данному субтипу инфекционного вируса (например, вирусному субтипу, который в текущее время циркулирует среди населения). Вирус, полученный в соответствии с изобретением, можно использовать в традиционных или новых подходах к вакцинации (см. Bilsel and Kawaoka In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook ofInfluenza, Chapter 32, pp. 422-434), в особенности в разработке живых ослабленных вакцин (более подробно рассматривается ниже). Настоящее изобретение, в частности, устраняет недостатки известной технологии, которые касаются разработки реассортированных вирусов с ограниченным кругом хозяев или непрогнозируемым ослаблением (там же). Множество попыток было предпринято для разработки противогриппозных вакцин (см. Wood andWilliams, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 23, pp. 317-323). Хотя основная часть данного раздела относится к противогриппозным вакцинам, настоящее изобретение включает все вакцины РНК-вирусов, предпочтительно вакцины вирусов РНК с сегментированной отрицательной цепью, и в частности к вакцинам против Orthomyxoviridae. В настоящее время существует три типа инактивированных противогриппозных вакцин: цельновирионные, субъединичные и поверхностно-антигенные вакцины (см. Wood, In: Nicholson, Webster andMay (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 25, pp. 333-345). Поскольку настоящее изобретение обеспечивает быстрое развитие желаемого реассортированного вируса с приемлемыми характеристиками роста в культуре, оно позволяет изготовителю вакцины получать достаточное количество вакцины, чтобы удовлетворять потребностям здравоохранения, и обеспечивает стандартизацию, что является важным требованием для производства вакцины в клинически необходимых количествах, обычно за период от 8 до 9 месяцев (см. выше, Wood, p. 333). Безопасность вакцины тажке является важной задачей (см. Wiselka In: Nicholson, Webster and May(eds.), Textbook of Influenza, Chapter 26, pp. 346-357). Поскольку вакцины согласно изобретению можно получать в системах определенных клеточных культур, они не содержат неспецифических патогенов,бактерий и аллергенных белков, которые могут присутствовать в промышленных вакцинах, получаемых в куриных яйцах с зародышем. С вакцинами (в частности, с противогриппозными вакцинами) используют адъюванты (см. выше,Wood and Williams). Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунную реакцию на антиген. Адъювант может служить в качестве тканевого депо, которое медленно выделяет антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, которая неспецифически усиливает иммунную реакцию (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California,p. 384). Часто первичное контрольное заражение одним антигеном при отсутствии адъюванта не вызывает гуморальной или клеточной иммунной реакции. Адъюванты включают без ограничения полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, в частности гидроксид алюминия,поверхностно-активные вещества, в частности лизолецитин, плуроновые высокомолекулярные спирты,полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии и адъюванты, потенциально полезные-20 006311 для человека, в частности BCG (bacille Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum. Примером предпочтительного синтетического адъюванта является QS-21. В качестве адъюванта можно использовать альтернативно или дополнительно иммуностимулирующие белки, как описано ниже, с целью увеличения иммунной реакции на вакцину. Предпочтительно адъювант является фармацевтически допустимым. Термин "фармацевтически допустимый" относится к молекулярным структурам и составам, которые приемлемы физиологически и при введении человеку обычно не вызывают аллергической или сходной неблагоприятной реакции, в частности желудочного расстройства, головокружения и т.п. Используемый в настоящем описании термин "фармацевтически допустимый" предпочтительно означает разрешенный компетентным органом федерального правительства или правительства штата или включенный в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею в качестве препарата, разрешенного для введения в живой организм, и более конкретно в организм человека. Термин "носитель" относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят данное соединение. В качестве носителей, особенно в случае растворов для инъекций, предпочтительно используют стерильную воду или водные физиологические растворы, а также водный раствор декстрозы и растворы глицерина. Пригодные фармацевтические носители описаны Е.W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences". Эффективность вакцинации можно повысить путем совместного введения с вакциной, в частности с векторной вакциной, иммуностимуляторной молекулы (Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. 1998,68:122), например иммуностимуляторного, иммунопотенциирующего или противовоспалительного цитокина, лимфокина или хемокина. Так, например, можно использовать цитокины или гены цитокинов, в частности интерлейкин IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13, гранулоцитомакрофаг-(GМ) - колониестимулирующий фактор (CSF) - и другие колониестимулирующие факторы, воспалительный фактор макрофагов,лиганд Flt3 (Lyman, Curr. Opin. Hematol., 5:192, 1998), а также некоторые ключевые костимуляторные молекулы или их гены (например, В 7.1, В 7.2). Эти иммуностимуляторные молекулы можно вводить системно или локально, в виде белков или путем экспрессии вектора, который кодирует экспрессируемые молекулы. Направленная доставка препарата в дендритные клетки Вакцинацию можно проводить путем направленной доставки препарата в дендритные клетки(Steinmann, J. Lab. Clin. Med., 128-531, 196; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996; Taite et al., Leukemia,13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, 1999; DiNicola et al., Cytokines Cell Mol. Ther., 4:265, 1998). Дендритные клетки играют ключевую роль в активации Т-лимфоцитзависимого иммунитета. Пролиферирующие дендритные клетки можно использовать для того, чтобы in situ захватить антигены белков в иммуногенной форме, а затем представить эти антигены в такой форме, которую могут распознать и стимулировать Т-лимфоциты (см., например, Steinman, Exper. Hematol. 24:859-862, 1996; Inaba, et al., J. Exp.Med., 188:2163-73, 1998 и патент США 5.851.756). Для ex vivo стимуляции дендритные клетки высевают в планшете с культурой и подвергают воздействию вирионов (кратковременному) в достаточном количестве и в течение достаточного периода времени, чтобы обеспечить связь вирусных антигенов с дендритными клетками. После этого прошедшие обработку клетки можно снова трансплантировать субъекту, подвергающемуся лечению, например путем внутривенной инъекции. Предпочтительно используют аутологические клетки, т.е. дендритные клетки, полученные от субъекта, подвергаемого лечению, однако, возможно использовать дендритные клетки, соответствующие МНС (главный комплекс гистосовместимости)-класс II, которые можно получить от донора соответствующего типа или путем генной инженерии дендритных клеток для экспрессии желаемых молекул МНС (и предпочтительно подавления экспрессии нежелательных молекул МНС). Дендритные клетки предпочтительно используют в качестве мишеней в живом организме для поглощения вируса или вирусных субблоков. Существуют различные стратегии для направленной доставки препарата в дендритные клетки в живом организме за счет использования рецепторов, которые обеспечивают представление антигенов, в частности DEC-205 (Swiggard et al., Cell. Immunol., 165:302-11, 1995;Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996) и рецепторов Fc. Инактивированные вакцины Вакцины инактивированных вирусов успешно применяют для вакцинации против инфекции РНКвируса (например, вируса гриппа) (см. Nichol, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza,Chapter 27, pp. 358-372). Для получения инактивированного вируса трансфецированный вирус выращивают в клеточной культуре или в куриных яйцах с зародышами. Вирус можно инактивировать путем обработки формальдегидом, бета-пропиолактоном, эфиром, эфиром с детергентом (например, Tween-80),цетилтриметилбромидом аммония (СТАВ) и Triton N101, дезоксихолатом и три(н-бутил)фосфатом (см. выше, Furminger; Wood and Williams). Инактивацию можно проводить после или до осветления аллантоиновой жидкости (от вируса, выращенного в куриных яйцах); вирионы выделяют и очищают путем центрифугирования (см. выше, Furminger, p. 326). Чтобы определить эффективность вакцины, можно использовать пробу на простую радиальную иммунодиффузию (SRD) (Schild et al., Bull. World HealthOrgan. 1975, 52:43-50 and 223-31 Mostow et al., J. Clin. Microbiol. 1975, 2:531). Доза, необходимая для получения удовлетворительной иммунной реакции, стандартизирована и составляет 15 мкг НА/штамм/доза. Инактивированную вакцину можно вводить внутримышечно с помощью инъекции.-21 006311 Живые ослабленные противогриппозные вакцины Ослабленные, адаптированные к холоду живые вакцины РНК-вирусов (противогриппозные вакцины) являются известными (см. Keitel and Piedra, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza,Chapter 28, pp. 373-390; Ghedon, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 29,pp. 391-399). Возможность образования вирусов гриппа всего из восьми плазмид позволяет регулировать ослабление штамма вакцины и получать штамм вакцины, оптимально подходящий для вакцинируемой части населения (см. Bilsel and Kawaoka, выше). Поскольку штаммы гриппа A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) илиB/Ann Arbor/1/66 в настоящее время используют для получения живых ослабленных вакцин, можно вводить каждую из шести кДНК внутренних генов (РВ 2, РВ 1, PA, NP, M, NS) в плазмиду, в частности вpHW2000. Две плазмиды, содержащие гликопротеины НА и NA соответствующего штамма гриппа, конструируются и котрансфецируются с шестью главными плазмидами, кодирующими негликозилированные белки гриппа. Предполагается, что генетическая модификация кодирующей или некодирующей области внутренних генов повышает безопасность, инфицирующую способность, иммуногенность и защитную эффективность вакцины, а также обеспечивает получение ослабленного вируса. Манипуляция геном НА также может увеличивать безопасность штамма вакцины. Так, например,удаление основных аминокислот, содержащихся в соединительном пептиде гликопротеинов Н 5 или Н 7 высокопатогенных вирусов гриппа А птиц, может увеличивать безопасность вакцины. Вакцинация через слизистую оболочку Стратегия вакцинации через слизистую оболочку особенно эффективна для множества патогенных вирусов, поскольку инфекция часто проникает через слизистую оболочку. Слизистая оболочка накапливает дендритные клетки, которые являются важными мишенями для вакцин EBNA-1 и иммунотерапии. Таким образом, рассматривается стратегия вакцинации через слизистую оболочку инактивированными и ослабленными противовирусными вакцинами. Поскольку вакцину можно вводить в слизистую оболочку локально, используют различные стратегические подходы для доставки иммуногенных белков в слизистую оболочку. В специфическом варианте реализации вакцину можно вводить в смеси или в качестве конъюгата или химерного белка слияния с холерным энтеротоксином, в частности с холерным энтеротоксином В или химерой холерного энтеротоксина А/В (Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling andHolmes, Infect. Immun., 60:4915-24, 1992). Вакцины для введения в слизистую оболочку на основе применения субъединицы холерного энтеротоксина В описаны в литературе (Lebens and Holmgren, Dev. Biol.Stand. 82:215-27, 1994). В другом варианте реализации примесь с термолабильным энтеротоксином (LT) можно получить для вакцинации через слизистую оболочку. Другие стратегические подходы к иммунизации через слизистую оболочку включают инкапсуляцию вируса в микрокапсулы (патенты США 5.075.109,5.820.883 и 5.853.763) и использование иммунопотенциирующего мембранного носителя (WO 98/0558). Иммуногены, вводимые иммуногенетически или перорально, можно усилить с помощью красных кровяных телец (rbc) или гемолизированных эритроцитов (патент США 5.643.577), а также путем применения антигена blue tongue (патент США 5.690.938). Примеры Настоящее изобретение поясняется следующими примерами, которые иллюстрируют изобретение,не ограничивая его. Пример 1. "Амтисмысловой" подход к получению вируса гриппа А: синтез вРНК и мРНК с одной матрицы. На первом этапе уменьшения количества плазмид данный пример описывает конструкцию и трансфекцию плазмид, содержащих промотор pol I и роl II на одной и той же плазмиде, и подтверждает, что эта система позволяет выполнять экспрессию вРНК и белка с одной матрицы. Этот пример опубликован в литературе (Hoffmann et al., Virology 2000, 267:310). Материалы и методики Клонирование плазмид. Все реакции клонирования и PCR выполняли согласно стандартным протоколам. Вкратце, экспрессионные плазмиды для генов полимеразного комплекса A/WSWN/33 получали из pcDNA3 (Invitrogen), содержащей предранний промотор для цитомегаловируса (CMV) человека и поли(А)-сайт гена, кодирующего гормон роста быка (BGH). Вирусные кДНК получали из плазмид pWNP143, pWSNPA3, pWSNPB2-14,pGW-PB1, чтобы получить экспрессионные конструкции pHW25-NP, pHW23-РА, pHW21-PB2, pHW22-PB1.pHW12 получали путем вставки промотора pol I человека и последовательностей терминатора между промотором pol II и поли(А)-сайтом. Плазмиду pHW52 получали из pHW12 вначале путем вставки олигонуклеотидов, содержащих некодирующую область РВ 1, расширенную сайтами HindIII и XhoI, а затем путем вставки в эти сайты РВ 1-кодирующей области из pHW22-PB1. Плазмиду pHW82-PB1 получали изpHW52-PB1 путем удаления последовательностей промотора CMV. Кодирующую область для энхансерного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) в репортерной конструкции pHW72-EGFP получили после PCR-амплификации с помощью pEGFP-N1 (Clontech) в качестве матрицы и вставки кДНК после-22 006311 разрезания SacII/XhoI в плазмиду pHW72, содержащую промотор pol I человека и терминатор мыши, а некодирующую область М-сегмента отделили сайтами SacII/XhoI. pHW127-M и pHW128-NS конструировали путем амплификации RT-PCR вирусной РНК с праймерами, содержащими сегмент-специфические последовательности и сайты BsmBI для вставки в вектор pHH21, ферментированный BsmBI (Е.Sci. USA 1999, 96:9345). Конструкция плазмид pPOII-WSN-PB1; pPOII-WSN-PB2, pPOII-WSN-PBA,pPOII-WSN-NP; pPOII-WSN-HA, pPOII-WSN-NA, pEWSN-HA и pCAGGS-WNA15 широко описана (см. выше, Neumann et al.). Культура и трансфекция клеток. Клетки почек собаки Madin-Darby (MDCK) поддерживали на модифицированной среде Игла(MEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), почечные клетки эмбриона человека 293 Т выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) и содержащей 10% FBS.TransIT LT-1 (Panvera, Мэдисон, Висконсин) использовали согласно инструкциям изготовителя для трансфекции 1 х 106 клеток 293 Т. Различное количество плазмид (табл. 1) смешивали с TransIT LT-1 (2 мклTransIT LT-1 на 1 мкг ДНК), выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляли к клеткам. Через 6 ч трансфекционную смесь ДНК заменяли на Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland),содержащую 0,3% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 0,01% FBS. Через 48 ч после трансфекции кондиционированную среду, содержащую вирус, титровали в клетках MDCK. Выделение РНК и RT-PCR. Вирусную РНК выделяли из вирусных частиц с помощью набора Rneasy-Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния) согласно инструкциям изготовителя. Для характеризации рекомбинантных вирусов гриппа использовали набор Access RT-PCR (Promega, Мэдисон, Висконсин) согласно представленному протоколу. Следующие праймеры использовали в экспериментах с RT-PCR: Seq PB11: 5'-AGG ATG GGA ТТС СТС AAG G-3' (SEQ ID NO:1); Seq PB12: 5'-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3' (SEQ ID NO:2); BmPB1-1: 5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCAGGC A-3' (SEQ ID NO:3); Bm-PB1-2341R: 5'-ATATCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT -3' (SEQ ID NO:4). Эксперименты с RT-PCR проводили с помощью установки РТС-200 DNA (MJ Research, Уотертаун, Массачусетс). Программу амплификации начинали с 1 цикла при 48 С в течение 45 мин (синтез первой цепи кДНК) и 1 цикла при 94 С в течение 2 мин (инактивация обратной транскриптазы AMV и денатурация кДНК). За этими циклами следовали 40 циклов при 94 С в течение 20 с, 52 С в течение 30 с и 72 С в течение 30 с (амплификацияPCR); программу завершал один цикл при 72 С в течение 5 мин. Продукты PCR анализировали способом электрофореза в агарозном геле и секвенировали с праймером Seq-PB11 или Seq-PB12. Проточная цитометрия. Через 48 ч после трансфекции клетки 293 Т промыли фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), осадили центрифугированием и ресуспендировали в PBS плюс 5% FBS. Анализ способом проточной цитометрии проводили с помощью проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson) и анализировали данные с помощью комплекта программного обеспечения CellQuest. Для анализа экспрессии EGFP использовали излучение с длиной волны 530 нм (FL1), чтобы обеспечить высокую чувствительность для определения EGFP по флуоресценции. Результаты и обсуждение Конструкция и характеристики клонирующего вектора pHW12, содержащего два эукариотических промотора. Вирусы гриппа А являются сегментированными вирусами, которые содержат молекулы РНК с отрицательной полярностью. Во время цикла репликации распознавание структур 5'- и 3' концов восьми сегментов вРНК белками рибонуклеопротеинового комплекса (РВ 2, РВ 1, PA, NP) приводит к репликации и транскрипции генов вирусов гриппа. Поскольку элементы концевой последовательности являются чрезвычайно консервативными, транскрибируемая искусственная РНК должна иметь такие же последовательности на 5' и 3' концах (Luo et al., J. Virol. 1991, 65:2861; Flick et al., RNA 1996, 2:1046). Клонирующий вектор pHW12 сконструировали таким образом, чтобы обеспечить вставку представляющих интерес последовательностей между промотором и терминатором pol I с помощью рестрикционной эндонуклеазы BsmBI. С обеих сторон от транскрипционного блока pol I расположены промотор pol II из цитомегаловируса (CMV) и сигнал полиаденилирования гена, кодирующего бычий гормон роста. Промотор CMV, поли(А)-сайт и каркас плазмиды получают из клонирующего вектора pcDNA3. Экспрессия белка РВ 1 в двунаправленной транскрипционной системе pol I/pol II. Для испытания плазмидной транскрипционной системы кДНК гена РВ 1 вируса A/WSN/33 инсертировали в клонирующий вектор pHW12 для получения плазмиды pHW52-PB1. Рестрикционные сайтыHindIII и XhoI инсертировали в некодирующие 5' и 3' области этого гена. Эти генетические метки были включены, чтобы обеспечить возможность идентификации полученного рекомбинантного вируса приRT-PCR. Мы ожидали, что клетки человека, трансфецированные этой плазмидой, образуют два типа РНК: РВ 1-вРНК, синтезированную клеточным pol I, и мРНК со структурой 5'-кэп, синтезированную pol II. Трансляция мРНК приводит к синтезу белка РВ 1.-23 006311 Чтобы проверить, образуется ли белок РВ 1 из этой конструкции, мы испытали репликацию и транскрипцию искусственной вРНК путем конструирования плазмид pHW21-PB2, pHW23-PA и pHW25NP, которые содержат кДНК, кодирующие белки РВ 2, РА и NP от A/WSN/33 под управлением промотора CMV. Для in vivo синтеза искусственной вРНК мы сконструировали репортерную плазмиду pHW72EGFP, содержащую EGFP кДНК, с обеих сторон от которой находятся некодирующая область М-сегмента и промотор pol I человека и терминатор мыши. 5 плазмид (2 мкг pHW21-PB2, 2 мкг pHW52-PB1 (конструкция промотора pol I/pol II), 2 мкг pHW23-PA, 2 мкг pHW25-NP и 1 мкг pHW72-EGFP) трансфецировали в клетки 293 Т. Через 24 и 48 ч после трансфекции клетки анализировали способом флуоресцентной микроскопии. Через 24 ч наблюдали флуоресцирующие клетки. Этот результат показывает, что в течение 24 ч полимеразные белки синтезируются в концентрации, достаточной для того, чтобы обеспечить распознавание специфических концов EGFP-вРНК вируса гриппа. Эти белки синтезируют МРНК, которая транслируется в EGFP. Для оценки эффективности такой системы мы провели проточный цитометрический анализ, чтобы рассчитать количество флуоресцентных клеток. Через 48 ч после трансфекции пяти плазмид 18,72% популяции клеток проявили флуоресценцию. Без добавления плазмиды pHW52-PB1 наблюдали только фоновый уровень флуоресцентных клеток (0,06%); этот результат согласуется с проведенными ранее исследованиями, которые показали, что все четыре комплексных белка RNP необходимы для амплификации вРНК (Huang et al., J. Virol. 1990, 64:5669). Полученные результаты показывают, что транскрипция РВ 1-кДНК и концентрация образующегося белка РВ 1 вместе с другими белками RNP комплекса достаточна для инициации процесса вирусной транскрипции/репликации. Получение рекомбинантного вируса гриппа А. Для получения инфекционного вируса гриппа А необходимо, чтобы плазмида pHW52-51 обеспечивала получение не только мРНА РВ 1 и белка, но и достаточного количества вРНК РВ 1, которую можно упаковать в вирус потомства. Для остальных семи вРНК мы использовали плазмиды, которые содержат кДНК для полноразмерных РНК вируса A/WSN/33, находящиеся между промотором pol I человека и терминатором мыши. Трансфекция этих плазмид должна приводить к синтезу всех восьми вирусных РНК, которые реплицируются и транскрибируются полимеразными белками, образующими новые vRNP. После синтеза структурных белков RNP упаковываются в новые вирусные частицы. Мы трансфецировали клетки 293 Т различным количеством плазмиды pHW52-PB1 (0, 2, 4 мкг) вместе с плазмидами pPoll-WSN-PB2, pPoll-WSN-PA, pPoll-WSN-HA, pPoll-WSN-NP, pPoll-WSN-NA,pHW127-M, pHW128-NS (пo 1 мкг каждой). Экспрессионные плазмиды для белков pHW21-PB2 (1 мкг),PHW23-PA (0,1 мкг), pHW25-NP (1 мкг), pEWSN-HA (1 мкг) и pCAGGS-WNA15 (1 мкг) были котрансфецированы. Экспрессионные плазмиды для гемагглютинина (НА) и невраминидазы (NA) включили для увеличения выхода трансфектантного вируса. Через 48 ч после трансфекции супенатант первично трансфецированных клеток 293 Т перенесли в клетки MDCK. Во всех опытах по трансфекции, в которых добавляли плазмиду pHW52-PB1, через 24 ч после пассирования мы наблюдали вирусно-индуцированный цитопатический эффект. Если плазмиду,экспрессирующую РВ 1, не включали в трансфекционную реакцию, цитопатический эффект отсутствовал. Вирусный титр определяли путем титрования супернатанта трансфецированных клеток на клеткахMDCK; при этом определили, что супернатант содержит 2 х 104-2 х 105 pfu/мл. Этот результат показывает,что после трансфекции плазмиды PB1-pol I/pol II-промотор (вместе с экспрессионными плазмидами) в клеточной линии 293 Т человека синтезируются вРНК РВ 1 и белок РВ 1 на уровне, достаточном для получения инфекционных вирусов гриппа А. В опытах по контрафекции с плазмидами, содержащими РВ 1 кДНК, разделенные между двумя плазмидами (pHW82-РВ 1 и pHW22-PB1), титр вируса получили равным 2 х 104 pfu/мл; аналогичный опыт с использованием плазмид с последовательностями РВ 1 дикого типа (pPol I-WSN-PB1 и pHW22-PB1) дал результат титра вируса 3 х 106 pfu/мл. В отличие от экспрессионной конструкции с промотором pol II, которую использовали в предшествуем исследовании (Neuman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345), мы применили плазмидуpHW52-PB1, которая содержит последовательности, полученные из транскрипционного блока pol I и инсертированные между промотором CMV и сайтом полиаденилирования. Экспрессия репортерного гена EGFP показывает, что общая экспрессия белка РВ 1 в этой системе достаточна для образования комплексов EGFP-RNP. Хотя область промотора/терминатора pol I содержит последовательности распознавания специфических факторов транскрипции и терминации pol I (Beckmann et al., Science 1995,270:1506; Bell et al., Science 1998, 241:1192; Kuhn et al., EMBO J. 1994, 13:416), эти ДНК связывающие белки, видимо, не препятствуют транскрипции посредством pol II. Эти результаты согласуются с результатами, согласно которым pol I специфичные ДНК связывающие белки более изобильно представлены в ядрышке, т.е. в компартменте, в котором происходит транскрипция клеточной рДНК (Evers et al., EMBOJ. 1995, 14:1248). Эти результаты показывают, что после трансфекции pol I/pol II промоторной конструкции в клетку некоторые плазмиды доставляются в ядрышко, где происходит транскрипция посредствомpol I, а другие остаются в ядре, где они транскрибируются РНК-полимеразой II. Поскольку репортерная структура pHW52-PB1 содержала дополнительные последовательности, не относящиеся к вирусу гриппа (рестрикционные сайты) в некодирующей области перед инициирующим-24 006311 кодоном и после терминирующего кодона, нас заинтересовал вопрос, сохраняется ли стабильность этих последовательностей в РВ 1 сегменте вирусной РНК. Поэтому мы выделили вРНК после второго пассирования вируса трансфектанта на клетках MDCK и провели анализ с помощью RT-PCR. Амплификация вРНК с РВ 1-специфическими праймерами привела к образованию фрагментов кДНК с ожидаемыми размерами. При использовании тех же самых вирусной ДНК и праймеров, но без добавления обратной транскриптазы, продукт амплификации не образовывался; отсюда следует, что из супернатанта трансфецированных клеток переносится кРНК, полученная из вирусной РНК, а не из плазмидной ДНК. Секвенирование продуктов PCR показало, что обе последовательности рестрикционного сайта присутствуют в молекуле РНК. Полученные результаты показывают, что система транскрипции pol I/ pol II позволяет получать инфекционный рекомбинантный вирус и что вирус с чужеродными последовательностями в некодирующей области гена РВ 1 является жизнеспособным. Этот модифицированный сегмент РВ 1 все-таки реплицируется, транскрибируется и упаковывается в вирусные частицы. Предварительно изменили некодирующую область сегментов вируса гриппа А за счет использования системы трансфекции RNP. Путем замены некодирующей области гена NA соответствующей последовательностью сегмента NS трансфектанта гриппа В получили вирусы гриппа (Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88:5177; Bergmabb and Muster, J. Gen. Virol. 1995, 76:3211). Этот тип вируса с химерным сегментом NA показал ослабленный фенотип у мышей и защищал мышей, инокулированных нелетальной дозой, от заражения инфекцией вируса гриппа дикого типа. Эти результаты показывают, что генетическое изменение некодирующей области сегмента РНК может менять биологические свойства трансфектантного вируса. Здесь мы впервые сообщаем о том, что даже чужеродные вирусу гриппа последовательности могут быть инсертированы в некодирующую область сегмента РВ 1. С помощью транскрипционной системой pol I/pol II теперь стало возможным систематически модифицировать эти элементы последовательностей в некодирующей области сегмента РВ 1 и оценивать,приводят ли эти генетические манипуляции к изменениям биологических свойств рекомбинантных вирусов. Действительно, низкий выход вирусов с мутированным сегментом РВ 1 по сравнению с вирусом дикого типа указывает на то, что инсертированные последовательности оказывают отрицательное влияние на рост вируса. Разработанная недавно система на основе плазмидного вектора (см. выше, Neumann et al.) является чрезвычайно эффективной для получения вируса гриппа, однако, она требует клонирования 14-17 плазмид. В данном исследовании мы снизили до 13 количество плазмид, необходимых для эффективного получения штамма вируса A/WSN/33 гриппа. Уменьшение количества плазмид, которое обеспечивает данный подход, обещает увеличение эффективности трансфекции клеточных линий, отличных от клеток 293 Т, что позволяет доставлять гены в такие клеточные линии, в которые затруднена эффективная доставка 14 плазмид. Fodor et al. (J. Virol. 1999, 73:9679) смогли получить вирус гриппа после трансфекции 12 плазмид, однако, выход вируса в этом эксперименте составил всего 1-2 частицы инфекционного вируса на 106 трансфецированных клеток Vero. Пример 2. Конструирование рекомбинантных вирусов гриппа А из системы с минимальным количеством плазмид. Данный пример описывает применение трансфекционной системы на основе плазмидного вектора для получения вируса гриппа А исключительно из клонированной кДНК. В отличие от известных систем на основе плазмидного вектора эта система для получения вируса гриппа А использует конструкцию и трасфекцию всего восьми экспрессионных плазмид, каждая из которых содержит одну копию отличной вирусной кДНК, соответствующей сегменту вирусного гена. Такая обратная генетическая система уменьшает количество плазмид, необходимое для получения вирусов гриппа А, и позволяет выполнять прогнозируемое и эффективное воспроизведение реассортированных вирусов. Материалы и методики Клонирование плазмид. Плазмиду pHW2000 (фиг. 3 А) получили из pHW12 (пример 1). Клонирующий вектор pHW2000 содержит 225 bp промотора pol I человека и 33 bp терминатора мыши, отделенные двумя сайтами BsmBI. Элементы промотора pol I и терминатора находятся между процессированным предранним промотором цитомегаловируса человека (начиная примерно на 350 bp выше начального сайта траснкрипции, как вpcDNA3, Invitrogen, Карлсбэнд, Калифорния) и сигналом полиаденлирования гена, кодирующего гормон роста быка. Восемь плазмид, содержащих кДНК вируса A/WSWN/33 (H1N1) (pHW181-PB2, pHW181PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M и pHW188-NS), сконструировали путем вставки фрагментов Apal-SalI (с вирусной кДНК и последовательностями промотора и терминатора pol I) плазмид pPoll-WSN-РВ 2, pPoll-WSN-PB1, pPoll-WSN-PA, pPoll-WSN-NP, pPoll-WSN-HA, pPollWSN-NA (Neumann et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 1999, 96:9345), pHW127-M и pHW128-NS (пример 1) во фрагмент вектора Apal-SalI pHW2000. Восемь плазмид, содержащих кДНК A/Teal/HK/W312/97pHW248-NS) сконструировали с помощью амплификации вирусной РНК ПЦР с обратной транскриптазой(RT-PCR). Праймеры, используемые в реакции PCR, содержали сегмент-специфические последовательности на 3' конце и последовательности рестрикционных сайтов SsmBI или SsaI на 5' конце. После разре-25 006311 зания продуктов PCR с помощью BsmBI или BsaI фрагменты клонировали в вектор pHW2000 (фиг. 3 А). Последовательности праймеров, используемые для амплификации генома вируса A/teal/HK/W312/97(H6N1), приведены ниже. Праймеры показаны слева направо, что соответствует 5' и 3' концам. Специфические нуклеотиды вируса гриппа А подчеркнуты. Реакцию RT проводили с праймером 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO:21). Для проверки того,что вирусные кДНК, полученные в результате амплификации RT-PCR в экспрессионных плазмидах, не содержат нежелательных мутаций, инсертированные кДНК секвенировали. Вирусы и клеточная культура. Вирусы гриппа A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) культивировали в 10-дневных куриных яйцах. Клетки почек собак Madin-Darby (MDCK) поддерживали в модифицированной среде Игла (MEM), содержащей 10% FBS. Клетки почек эмбриона человека 293 Т культивировали в Opti-MEM L (Life Technologies, Гайтесбург, Мериленд), содержащей 5% FBS. Для опытов по трансфекции использовали планшеты с шестью лунками для культуры тканей. Накануне трансфекции конфлюэнтные клетки 293 Т и MDCK во флаконе объемом 75 см 2 обработали трипсином и 10% каждой клеточной линии смешали в 18 мл OptiMEM I; 3 мл этой клеточной суспензии высеяли в одну из шести лунок планшета. Совместно культивируемые клеткиMDCK и 293 Т (0,2-1 х 106 клеток каждого типа в лунке) использовали в опытах по трансфекции. Для трансфекции клеток использовали TransIT LT-1 (Panvera, Мэдисон, Висконсин) согласно инструкциям изготовителя. Вкратце, смешали 2 мкл TransIT LT-1 на 1 мкг ДНК, вырастили при комнатной температуре в течение 45 мин и добавили к клеткам. Через 6 ч трансфекционную смесь заменили на OptiMEM I. Через 30 ч после трансфекции к клеткам добавили 1 мл Opti-MEM I, содержащей ТРСК-трипсин; это добавление привело к конечной концентрации ТРСК-трипсина, равной 0,5 мкг/мл, в клеточном супернатанте. Вирусный титр клеточного супернатанта определяли титрованием супернатанта на клетках MDCK. Выделение РНК и RT-PCR. Вирусные РНК выделяли из вирусных частиц с помощью набора Rneasy-Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния), который использовали согласно инструкциям изготовителя. Для характеризации рекомбинантных вирусов гриппа использовали набор Access RT-PCR (Promega, Мэдисон, Висконсин) согласно представленному протоколу. Следующие праймеры использовали в экспериментах по RT-PCR: Bm-NS1-26 006311 помощью установки РСТ-200 DNA (MJ Research, Уотертаун, Массачусетс). Программу амплификации начинали с 1 цикла при 48 С в течение 45 мин и 1 цикла при 94 С в течение 2 мин. За этими циклами следовали 40 циклов при 94 С в течение 20 с, 52 С в течение 30 с и 72 С в течение 40 с; программу завершал один цикл при 72 С в течение 5 мин. Продукты PCR анализировали способом электрофореза в агарозном геле и секвенировали с праймером Bm-NS11. Последовательность матрицы ДНК определяли в Центре биотехнологии детской исследовательской больницы Сент-Джуда с помощью наборов реактивов для секвенирования с использованием терминационного цикла с родамином или красителем dRodamin, АmрliTagДНК-полимеразой FS (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc.(PE/ABI), Фостер Сити, Калифорния) и с синтетическими олигонуклеотидами. Образцы подвергали электрофорезу, детекции и анализу на ДНК секвенаторах PE/ABI модели 373, модели 373 Stretch или модели 377. Результаты Применение системы pol I-pol II для получения вируса A/WSN/33 (H1N1). Поскольку вирус гриппа А содержит восемь сегментов, обоснованно предположили, что вставка всех восьми кДНК вируса гриппа между промотором pol I и промтором pol II должна приводить к транскрипции восьми вРНК во все вирусные РН, и к синтезу всех 10 вирусных белков (фиг. 1). После сборки всех вирусных рибонуклеопротеинов со структурными белками должен образовываться инфекционный вирус гриппа А (фиг. 2). Для проверки возможности получения вируса гриппа А с помощью такой кДНК-двунаправленной транскрипционной системы сконструировали восемь экспрессионных плазмид (pHW181-PB2, pHW181PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M и pHW188-NS), содержащих восемь кДНК вируса A/WSN/33 (H1N1). Восемь плазмид (1 мкг каждой плазмиды) котрансфецировали в кратковременно совместно культивированные клетки 293T-MDCK. Обе клеточныe линии совместно культивировали в одной лунке для клеточной культуры накануне трансфекции, чтобы обеспечить условия для высокой эффективности трансфекции ДНК (клетки 293 Т) и эффективной репликации (клеткиMDCK) вирусов гриппа А. Через 48 и 72 ч клетки MDCK проявили вирусно-индуцированный цитопатический эффект, однако, после трансфекции экспрессионой конструкции из семи плазмид без РВ-1 (табл. 1) цитопатического эффекта не наблюдали. Вирусный титр супернатанта определяли через различные периоды времени после трансфекции путем титрования в клетках MDCK. Через 24 ч после трансфекции клеточный супернатант содержал 1 х 103 вирусов в мл; 2 х 107 инфекционных вирусов в мл получили через 72 ч после трансфекции (табл. 1). Полученные вирусы 2 раза пассировали на клетках MDCK. Для проверки того, что полученный вирус действительно является предполагаемым вирусом A/WSN, получили кДНК для гена NS с помощью RT-PCR (фиг. 4 А, дорожка 8). Получение двух фрагментов после разрезания рестрикционной эндонуклеазой NcoI (фиг. 4 В, дорожка 8) и анализ последовательностей амплифированного фрагмента подтвердили, что полученный вирус действительно представлял собой предполагаемый вирус A/WSN. Эти результаты показывают, что синтез вРНК и мРНК под действием pol I-pol II с восьми матриц приводит к образованию инфекционного вируса гриппа А. Таблица 1 Наборы плазмид, используемых для получения вирусов A/WSN/33 (H6N1) и А/Tеаl/HK/W312/97 (H6N1) Количество инфекционных вирусных частиц, содержащихся в 1 мл супернатанта трансфецированных клеток через 24, 48 и 72 ч после трансфекции.В совместно культивированных клетках MDCK наблюдали цитопатический эффект. Получение вируса A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) путем контрафекции восьми плазмид Вирус гриппа A/WSN/33 (H1N1), первоначально полученный из пандемического штамма гриппа человека в 1918 г. (Goto and Kawaoka, Proc. Acad. Sci. USA 1998, 95:1022; Reid et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1999, 96:1651), был перенесен в мозг мыши и хорошо адаптировался к росту в клеточной культуре. Для того чтобы оценить эффективность восьмиплазмидной системы с точки зрения получения вируса из клонированной кДНК, которая еще не адаптирована для роста в клеточной культуре, попробовали получить вирус А/Tеаl/НК/W312/97 (H6N1) только из клонированной кДНК. Этот вирус H6N1 выделили у мертвого чирка во время вспышки инфекции H5N1 в Гонконге в 1997 г. Генетический анализ этого вируса выявил наличие у него семи сегментов с нуклеотидной гомологией более 97% относительно штаммов патогенного вируса H5N1. РНК экстрагировали из инфицированной аллантоиновой жидкости и инсертировали RT-PCR-амплифицированные кДНК в pHW2000; эта инсерция привела к образованию восьми экспрессионных плазмид (фиг. 3). Через 72 ч после трансфекции pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA,pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M и pHW248-NS (1 мкг каждого) в совместно культивированные клетки 293T-MDCK в клетках MDCK наблюдали вирусно-индуцированный цитопатический эффект (табл. 1). Выход вирусов составил 2 х 105 инфекционных вирусов на мл супернатанта трансфецированных клеток. Как показано на фиг. 4 (А и В, дорожка 2), идентичность полученного вируса проверили путем характеризации сегмента NS. Эти результаты показывают, что данная плазмидная система требует клонирования всего восьми кДНК каждой в один плазмидный вектор и что трансфекция восьми экспрессионных плазмид позволяет получать вирус гриппа А, при этом антигенность вируса еще не адаптирована к росту в клетках млекопитающих. Получение реассортированных вирусов гриппа А. Испытали полезность восьмиплазмидной системы для получения реассортированных вирусов. Поскольку эта система трансфекции ДНК не требует никакой селекционной системы, получение реассортированных вирусов возможно путем соответствующих комбинаций экспрессионных плазмид в реакциях трансфекции. Семь экспрессионных плазмид, содержащих кДНК вируса A/Teal/HK/W312/97 (H6N1),контрафецировали одной экспрессированной плазмидой, содержащей кДНК вируса A/WSN/33 (H1N1)(табл. 2). Высокий выход вируса получили для реассортированных вирусов, содержащих семь сегментов вируса чирка и М сегмент или NS сегмент вируса WSN. Более низкий выход вируса получили для вирусов, реассортированных по NA и НА (табл. 2). Поскольку одиночно-реассортированные вирусы получили с помощью восьмиплазмидной системы, следующим шагом было определение возможности выделения вируса с реассортацией нескольких сегментов, полученных из одного вируса. Для этого четыре экспрессионныe плазмиды, содержащиe кДНК RNP-комплексных генов вируса H6N1 (pHW241-PB2,pHW242-PB1, pHW243-PA и pHW245-NP), трансфецировали вместе с плазмидами pHW184-HA,pHW186-NA, pHW187-M и pHW188-NS, содержащими кДНК вируса WSN (табл. 2). В результате получили 4 х 106 вирусов в мл клеточного супернатанта. Как показано на фиг. 4 (дорожка 10), амплифицированный сегмент NS четырехкратно реассортированного вируса расщеплен NcoI; таким образом, сегментNS образуется из вируса WSN. Эти результаты показывают, что восьмиплазмидная система трансфекции позволяет получать однократно и четырехкратно реассортированныe вирусы. Таблица 2 Получение реассортированных вирусов гриппа А, промежуточных между вирусами A/Teal/HK/W312(H6N1) и A/WSN/33 (H1N1), путем контрафекции восьми плазмид Плазмиды, содержащие кДНК вируса A/WSN/33 (H1N1), выделены полужирным шрифтом.Количество инфекционных вирусных частиц, содержащихся в 1 мл супернатанта трансфецированных клеток через 72 ч после трансфекции. Обсуждение Возможность получать вирус гриппа после трансфекции восьми экспрессионных плазмид, содержащих кДНК вирусов A/Teal/HK/W312 (H6N1) или A/WSN/33 (H1N1), доказывает, что транскрипционная система pol I-pol II обеспечивает достаточное количество вРНК и вирусных белков для образования инфекционного вируса гриппа А. При этом синтезируются два типа мРНК, которые отличаются своими некодирующими областями (фиг. 1). Один тип мРНК, кодирующий все вирусные белки, непосредственно транскрибируется pol II. Кроме последовательностей некодирующих областей (NCR) вируса гриппа-28 006311 эти мРНК содержат последовательности промотора pol I и терминатора мыши. Важно, что разработанная экспрессионная pol I-pol II система содержит только 33 bр терминатор мыши. Предшествующие исследования с использованием репортерных генов хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и зеленым флуоресцентным белком (GFP) показали, что 174-bр последовательность области терминатора снижала экспрессию белка посредством pol II (Hoffmann, E., Ph. D. Thesis 1997, Justus Liebig University, Giessen, Germany). Второй тип вРНК формируется после инициации процесса вирусной репликации и транскрипции (фиг. 2). Эта мРНК синтезируется вирусными полимеразными белками и содержит структуру 5-кэп, полученную из клеточных РНК путем захвата кэпов перед некодирующими последовательностями вируса гриппа. Структурные белки, траслированные с обеих мРНК, соединяются с комплексами RNP, образуя новые вирусные частицы. После отпочковывания трансфектантных вирусов полученные частицы вирусов могут реплицироваться в клетках 293 и в культивированных совместно с ними клетках MDCK. В отличие от подходов, рассмотренных выше в начале описания, способ согласно данному изобретению использует восемь кДНК в восьми плазмидах, которые содержат 225 bp последовательности экспрессии четырехкратно реассортированного промотора pol I и 33 bp последовательности терминатора. В системе pol I-pol II все 10 вирусных белков экспрессируются с усеченного предраннего промотора цитомегаловируса человека. Тот факт, что экспрессия всех структурных белков с 17-плазмидной системой (Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96:9345) и с 8-плазмидной системой (данное исследование) повышаeт эффективность получения вирусов по сравнению с контрафекцией плазмид,экспрессирующих белки RNP комплекса (Neumann et al., supra; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679), подтверждает идею о том, что образование инфекционного вируса гриппа А интенсифицируется за счет появления белков НА, NA, М 1, М 2 и NS2 сразу после трансфекции. Цикл вирусной репликации включает комплексное взаимодействие вирусных белков друг с другом и с клеточными факторами (Ludwig et al., Virol. Immuol. 1999, 12:175). Таким образом, для образования инфекционного вируса синтез вирусных молекул, управляемый плазмидами, должен обеспечивать оптимальные концентрации вирусных белков для инициации репликационного цикла и для образования вирусоподобных частиц. Хотя восьмиплазмидная система доказала свою эффективность, возможно дополнительное увеличение эффективности производства вирусов. Было показано, что соотношение трансфецированных плазмид, экспрессирующих комплексные белки RNP, и белка М 1 оказывает влияние на активность транскриптазы (Pleschka et al., J. Virol., 1996, 70:4188; Perez and Donis, Virology 1998, 249:52). Эффективность образования вирусоподобных частиц также зависит от концентрации структурных вирусных белков (Меnа et al., J. Virol. 1996, 70:5016; Gomez-Puertas et al., J. Gen. Virol., 1999, 80:1635; Neumannet al., J. Virol. 2000, 74:547). Поэтому эффективность получения инфекционного вируса с системой pol Ipol II можно дополнительно повысить путем изменения концентраций плазмид, используемых в реакции трансфекции, или за счет применения экспрессионных плазмид с различными pol II промоторами. Поскольку эффективность сплайсинга, определяемая клеточными факторами, оказывает влияние на способность к репликации вируса гриппа A (Lau and Scholtissek, Virology 1995, 212:225), применение клеточных линий, отличных от 293 Т, может увеличивать выход вирусов для определенных штаммов гриппа А. Высокий выход четырехкратно реассортированного вируса (табл. 2) согласуется с тем, что быстрая репликация вируса A/WSN/33 (H1N1) в культивированных клетках обеспечивается сегментами НА, NA и М (Goto and Kawaoka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:10224; Schulman and Palese, J. Virol. 1997,24:170; Yesuda et al., J. Virol. 1994, 68:8141). Образование жизнеспособных реассортированных вирусов (табл. 2), промежуточных между вирусом птиц H6N1 и вирусом человека H1N1, указывает на то, что этот вирус H6N1 может получать генные сегменты от дальних родственных вирусов. Генетический анализ дает основания полагать, что патогенные вирусы H5N1 образуются за счет реассортации (Хu et al., Virology 1999, 261:15). Генные сегменты,подобные H5N1, найдены в субтипах H6N1 и H9N2 (Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9363),этот результат указывает на то, что такие вирусы могут быть предшественниками патогенных вирусовH5N1. Реассортация, которая может создавать новые патогенные вирусы гриппа, может быть реализована и в будущем. Однако возможность получать эти вирусы и манипулировать с ними упрощенным способом, разработанная в настоящем изобретении, поможет исследователям лучше понимать биологические свойства этих новых вирусов и создавать эффективные вакцины для защиты населения от них. Длительность периода времени между появлением нового патогенного штамма и получением вакцины является критической переменной для оценки эффективности программы вакцинации. Возможность получения вирусов клонированием всего восьми плазмид сокращает время, необходимое для создания потенциальных кандидатов для вакцины, и совершенствует существующие обратно-генетические системы за счет упрощения процесса создания вирусов и снижения общей стоимости производства вакцины. Концепцию введения вирусной кДНК между промотором pol I и промотором pol II в эукариотические клетки для получения вируса можно использовать также для получения других членов семействаOrthomyxoviridae. Для вируса гриппа В эта стратегия потребует конструкции и котрансфекции восьми плазмид, для гриппа С - семи, а для Thogotovirus - шести. Транскрипция in vivo 5'-кэппированной мРНК,а также вРНК с той же самой кДНК матрицы тоже может упростить системы на основе плазмидных век-29 006311 торов для других РНК-вирусов или даже способствовать образованию систем pol I-pol II для вирусов из других семейств (например, Arenaviridae, Bunyaviridae). Пример 3. Система pol I/pol II РНК для получения вируса гриппа В исключительно из клонированной ДНК. Каждый из вирусов гриппа А и В содержит восемь сегментов однонитевой РНК с отрицательной полярностью (см. Lamb and Krug, "Orthomyxoviridae: viruses and their replication", in Fields (Ed.), Virology;p. 1353-1395). В отличие от гриппа А восемь сегментов гриппа В кодируют 11 белков. Три самых больших гена кодируют компоненты РНК-полимеразы, РВ 1, РВ 2 и РА, сегмент 4 кодирует гемагглютинин. Сегмент 5 кодирует нуклеопротеин, главный структурный компонент, связанный с вирусной РНК, сегмент 6 кодирует невраминидазу (NA) и белок NB. Оба белка, NB и NA, транслируются с перекрывающихся рамок считывания бицистронной мРНК. Сегмент 7 гриппа В также кодирует два белка: ВМ 1 и ВМ 2. Самый миниатюрный сегмент кодирует два продукта: NS1 транслируется из непроцессированной РНК, в то время как NS2 транслируется из мРНК, подвергнутой сплайсингу. Для конструирования экспрессионных плазмид, содержащих кДНК гриппа В, используют такую же стратегию, как описано для получения вируса гриппа A A/teal/HK/W312/97 (H6N1). Первые РНК выделили из частиц вируса, полученных из инфицированной аллантоиновой жидкости, например B/Lee/40. На основе консервативных последовательностей некодирующей области приготовили праймеры для RTPCR и использовали их для синтеза кДНК. На 5' конце эти праймеры содержат последовательности для рестрикции эндонуклеазами BsmBI или BsaI. Разрезание продуктов PCR BsmBI или SsaI позволяет получать вставку в клонирующий вектор pHW2000 (или pHWH), линеаризованный BsmBI. Для уверенности в том, что кДНК в плазмидах не содержат нежелательных мутаций вследствие ошибок, внесенных полимеразой в процессе PCR, конструкции должны быть секвенированы. Котрансфекция совместно культивированных клеток 293-MDCK (или клеток COS-1-MDCK) и добавление трипсина приводят к образованию инфекционного вируса гриппа В. Затем супернатанты трансфецированных клеток пассируют на новых клетках MCDK. Титры полученного вируса можно определить стандартными способами, например с помощью анализа НА или анализа бляшкообразования.RT-PCR, выполненные со специфическими праймерами для каждого генного сегмента, позволяют проводить амплификацию РНК из рекомбинантного вируса гриппа В. Секвенирование продуктов подтверждает, что полученный вирус действительно является желаемым вирусом гриппа В. Пример 4. Восьмиплазмидная система получения исходного вакцинного штамма вируса гриппа А. Для определения промышленной полезности такой системы на основе плазмидного вектора для производства вакцин мы получили основной вакцинный штамм A/PR/8/34 (H1N1), используемый в настоящее время для получения инактивированной вакцины, исключительно из клонированной кДНК, как описано в примере 2. Выход вируса согласно анализу НА после прохождения рекомбинантного вируса в куриные яйца был таким же высоким, как выход родительского вируса дикого типа. Эти результаты доказывают, что полученный рекомбинантный вирус имеет такие же характеристики роста, как родительский вирус, выращенный в куриных яйцах, и указывают, что способ восьмиплазмидной трансфекции может усовершенствовать применяемые в настоящее время способы получения вакцинных вирусов. Материалы и методики Вирусы и трансфекция. Вирус гриппа A/PR/8/34 (H1N1) получили из хранилища детской исследовательской больницы Сент-Джуда и вырастили в 10-дневных куриных яйцах с зародышем. Клетки почки собаки Madin-Darby выдерживали в MEM, содержащей 10% FBS. Клетки почки эмбриона человека 293 Т и клетки VERO культивировали в среде Opti-MEM I (Life Technologies, Гайтерсбург, Мэриленд), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Для опытов по трансфекции использовали планшеты для культуры тканей с шестью лунками. Для этих опытов использовали совместно культивированные клетки MDCK и 293 Т (0,21 х 106 клеток каждого типа в одной лунке). Для трансфекции клеток применяли TransIT LT-1LT-1 с 1 мкг ДНК, выращивали при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляли к клеткам. Через 6 ч ДНК-траснфекционную смесь заменили на Opti-MEM I. Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавили 1 мл среды Opti-MEM I, содержащей ТРСК-трипсин, эта добавка привела к окончательной концентрации ТРСК-трипсина 0,5 мкг/мл в клеточном супернатанте. Титр вируса определяли путем пассирования клеточного супернатанта на клетках MDCK с помощью анализа бляшкообразования (plaqueRT-PCR и конструкция плазмид. Вирусную РНК экстрагировали из 200 мкл аллантоиновой жидкости куриного яйца с зародышем с помощью набора Qiagen RNeasy. Двухстадийную RT-PCR использовали для амплификации всех вирусных генных сегментов. Вкратце, РНК транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазыAMV (Roche Diagnostic, Германия) согласно предоставленному протоколу, а затем амплифицировали с помощью системы Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostic, Германия). Программа амплификации начиналась с одного цикла при 94 С в течение 2 мин, затем следовали 30 циклов при 94 С в течение 20 с,54 С в течение 30 с и 72 С в течение 3 мин; программу завершал один цикл при 72 С в течение 5 мин.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/145, C12N 15/85, C07K 14/11
Метки: гриппа, система, вируса, днк, инфекционного, получения, трансфекции
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-6311-sistema-transfekcii-dnk-dlya-polucheniya-infekcionnogo-virusa-grippa.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Система трансфекции днк для получения инфекционного вируса гриппа</a>
Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины
Номер патента: 6136
Опубликовано: 27.10.2005
Авторы: Пау Мария Грация, Схаутен Говерт Йохан, Ийтдехаг Альфонсус Герардус Корнелис Мария
МПК: C07K 14/11, A61P 31/12, A61K 39/145...
Метки: получения, вируса, способ, вирусного, вакцины, белка
Формула / Реферат:
1. Способ получения вируса или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, для применения в качестве вакцины, включающий в себя введение в клетку последовательности, кодирующей по меньшей мере один продукт гена E1 аденовируса или его функциональное производное, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вирус и/или вирусные белки, культивирование указанной клетки в подходящей среде, обеспечение возможности экспрессии вируса и/или...
Способ получения ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека.
Номер патента: 637
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Россен Кай, Рейдер Пол Дж., Сейджер Джесс В., Аскин Дэвид, Волант Ральф П.
МПК: C07D 401/06
Метки: иммунодефицита, человека, способ, протеазы, получения, вируса, ингибиторов
Формула / Реферат:
1. Способ получения соединения (I) где R выбирают из водорода, C1-10 алкоксикарбонила или незамещенного или замещенного C1-10 алкила, где указанным заместителем является арил или гетероарил; и R2 представляет собой C1-10 алкил или арил, отличающийся тем, что включает (а) взаимодействие соединений (А), (В), (Е) и (D) для получения соединения (F) где (А) представляет собой H2N-(CH2)2-NHR, где R принимает значения, определенные выше; ...
Синтез 1,3-оксаселеноланнуклеозидов, их активность против вируса иммунодефицита человека и против вируса гепатита-b
Номер патента: 1920
Опубликовано: 22.10.2001
Авторы: Ду Джинфа, Шинази Раймонд Ф., Чу Чунг К.
МПК: A61P 31/12, A61K 31/505, C07D 421/04...
Метки: синтез, гепатита-b, 1,3-оксаселеноланнуклеозидов, против, активность, иммунодефицита, вируса, человека
Формула / Реферат:
1. 1,3-Оксаселеноланнуклеозид формулы где В обозначает пуриновое или пиримидиновое основание, a R обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты стабилизированный фосфат или остаток липида, или их фармацевтически приемлемая соль, где нуклеозиды характеризуются показателем EC50 менее чем 10 микромоль в отношении ВИЧ-инфицированных клеток РВМ. 2. 1,3-Оксаселеноланнуклеозид по п.1, где В обозначает пиримидиновое основание....
Синтез 1,3 – оксаселеноланнуклеозидов, обладающих активностью против вируса иммунодефицита человека и против вируса гепатита-b
Номер патента: 5097
Опубликовано: 28.10.2004
Авторы: Шинази Раймонд Ф., Чу Чунг К., Ду Джинфа
МПК: A61P 31/18, C07D 329/00, A61K 31/513...
Метки: синтез, иммунодефицита, против, обладающих, человека, вируса, гепатита-b, активностью, оксаселеноланнуклеозидов
Формула / Реферат:
1. 1,3-Оксаселеноланлактон формулы где R обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Способ получения 1,3-оксаселеноланлактона формулы где R обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий a) получение димера селенола...
Композиция (варианты) и способ лечения или профилактики инфекции гриппа у млекопитающего
Номер патента: 3989
Опубликовано: 25.12.2003
Авторы: Ким Чанг Ю., Уильямс Метью Э., Милз Роджер Г., Хичкок Майкл Дж.М., Дал Теренс К., Бишофбергер Норберт У., Лиу Хонгтао, Лью Уиллард
МПК: A61K 31/396, A61K 31/215, A61K 31/33...
Метки: варианты, профилактики, млекопитающего, композиция, лечения, инфекции, гриппа, способ
Формула / Реферат:
1. Композиция для лечения или профилактики инфекции гриппа, содержащая эффективное количество соединения общей формулы где E1 означает -CO2R5, -CO2R5aW5 или -CO2W5; G1 означает -N(R5)2, -N(R11)C(N(R11))(N(R11)2) или -C(R11)2-N(R11)2; T1 означает -NH(C(O)CH2F) или -NH(C(O)CHF2); U1 означает -SR4, -NHR4 или -N(R4)2; каждый R1 независимо означает водород или алкил, содержащий от 1 до 12 атомов углерода; каждый R2 независимо означает R3 или R4,...
Предыдущий патент: Ассоциированные с ганглиозидами рекомбинантные антитела и их применение в диагностике и лечении опухолей
Следующий патент: Применение соли щелочного металла поли(пара-дигидроксифенилен) тиосульфокислоты в составах для ванн и способ лечения и профилактики заболеваний
Случайный патент: Градирня