6-(6-((22r,23r,24s)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена в синтезе конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином

6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-ТЕТРАГИДРОКСИ-24-МЕТИЛ-5-ХОЛЕСТ-6 ИЛИДЕНАМИНООКСИ)АЦЕТАМИДО)ГЕКСАНОВАЯ КИСЛОТА В КАЧЕСТВЕ ГАПТЕНА В СИНТЕЗЕ КОНЪЮГАТА КАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ Изобретение относится к области органической химии, а именно новому химическому соединению 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-илиденаминоокси) ацетамидо)гексановой кислоте, которое может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам. Задачей настоящего изобретения является 6(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена (конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином). Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают взаимодействием N-сукцинимидного эфира 6O-карбоксиметилоксима кастастерона взаимодействием последнего с -аминокапроновой кислотой, выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 014348 Изобретение относится к области органической химии, а именно к новому химическому соединению 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоте (далее гаптен кастастерона) со структурной формулой 1 Заявляемое соединение может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - 10-5-10-9% и менее. В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг/га посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является брассинолид, что делает актуальным разработку методов его анализа, а также анализа его химического и биохимического предшественника кастастерона (далее 24S-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода авторами предложен метод иммуноферментного определения 24S-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые, в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены. В настоящее время известен гаптен на основе кастастерона - соединение формулы 2, который предложен авторами для получения конъюгата с белком (бычьим сывороточным альбумином) для выработки антител, использованных в радиоиммуноанализе брассиностероидов [8]. Однако синтезированный таким образом конъюгат не позволил получить антитела, специфичные к группе 24S-метилбрассиностероидов, для анализа которых он был предназначен - показатели перекрестных реакций с другими брассиностероидами составляли от 20 до 50%. Известен также гаптен брассинолида формулы 3 который представляет собой эфир янтарной кислоты по C3-гидроксильной группе брассинолида [9]. Синтезированный на его основе конъюгат с мышиным альбумином также не позволил получить антитела, специфичные к исходным 24S-метилбрассиностероидам. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает конъюгат на его основе нестабильным [9]. Задачей настоящего изобретения является 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24 метил-5-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином. Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают из-аминокапроновой кислотой и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.-1 014348 Пример 1. 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-Тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота. Растворяют 8 мг (0,015 ммоль) 6-О-карбоксиметилоксима (2) в 1 мл безводного диоксана и добавляют 1,8 мг (0,016 ммоль) N-оксисукцинимида. Охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 2,63 мг (0,013 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,3 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 15 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 9 мг (90%) N-сукцинимидного эфира. Без дополнительной очистки 9 мг (0,015 ммоль) N-сукцинимидного эфира растворяют в 1 мл безводного диоксана и добавляют 1,9 мг (0,017 ммоль) -аминокапроновой кислоты в 1 мл 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривают, остаток экстрагируют этилацетатом. Хроматографируют на силикагеле. Получают 7 мг (71%) гаптена (1). Т.пл. 155-158 С (метанол). ИК-спектр (вазелиновое масло), (см-1): 1710 (С=O), 2500-3000 (ОН), 3600 (ОН). 1 Н ЯМР (CD3OD) , м.д.: 0,65 с (3H, 18-Ме), 0,88 с (3H, 19-Ме), 0,99 д (3H, 26 Me, J=6,6 Гц), 1,01 д(3H, 27-Ме, J=6,7 Гц), 1,06 д (3H, 24-Ме, J=6 Гц), 1,08 д (3H, 21-Ме, J=6,6 Гц), 2,68 дд (1H, С 5-Н,J1=2,5 Гц, J2=12,5 Гц), 3,42 м (2 Н, СН 2), 3,94 д (1H, С 22-Н, J=8,4 Гц), 4 б 08 м (2 Н, С 2- и С 23-Н), 4 б 46 м (1H,С 3-Н), 4,86 дд (2 Н, J1=3,4 Гц, J2=0,2 Гц). Синтезированный гаптен используют для получения конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином (БСА), что подтверждается приведенным ниже примером 2. Пример 2. Конъюгат гаптена кастастерона (1) с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Растворяют 50 мг (0,08 ммоль) гаптена (1) и 12 мг (0,1 ммоль) N-оксисукцинимида в 5 мл безводного диоксана, охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 17,4 мг (0,084 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 3 мл безводного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 17 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4,упаривают. Без дополнительной очистки растворяют 35 мг (0,055 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира в 10 мл безводного диоксана и добавляют 52 мг (0,86 мкмоль) БСА в 10 мл смеси 9 мл дистиллированной воды и 1 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Перемешивают реакционную смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Образовавшуюся массу подвергают диализу при 20 С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем против 1%-ной суспензии активированного угля в воде в течение 20 ч, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляет 24 моль гаптена на 1 моль белка. Полученный конъюгат используют для получения антител,специфичных к 24S-метилбрассиностероидам (брассинолид и кастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 3. Получение антител. Группу из 10 кроликов иммунизируют конъюгатом кастастерон-БСА с плотностью посадки 24 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли(рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 3 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ka). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ.-2 014348 Таблица 1 Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом кастастерона с БСА (I) Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало, что ее разбавление в 100000 (A1) или 10000 (А 2) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как кастастерона, так и брассинолида, проявивших, как и ожидалось, сравнимые параметры связывания с антителами. Специфичность. Перекрестная реакция антител к кастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2. Таблица 2 Кросс-реактивность антисыворотки A1 с различными стероидами,параметры связывания с антителами Таким образом, полученные антитела обладают специфичностью (определяется кастастерон и брассинолид) и чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида, в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг БС в 50 мкл образца.-3 014348 Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука i тэхнiка, 1993. 288 с. 2. Патент РБ 2806. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения. / Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н.//Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. -2 (26). - С. 159. 3. Патент РБ 3488.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля./Хрипач В.А.,Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И.,Вакуленко В.В.//Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. -3 (27). - С. 74. 4. Патент РБ 3400. Способ защиты картофеля от фитофтороза./Хрипач В.А., Жабинский В.Н.,Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В.,Титова С.Н.//Оф. Бюл. Белгос-пат. -2000. -2(25). - С. 75. 5. Патент РБ 5168. Способ защиты ячменя от листовых болезней/Хрипач В.А., Литвиновская Р.П.,Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е.,Морозик Г.В.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003.2 (37). - С. 95 6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г.,Хрипач В.А.,Жабинский В.Н.,Завадская М.И.,Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2 (37). - С. 93. 7. Патент РБ 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля/ Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. 2003. - 4 (39).- С. 88. 8. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. Radioimmunoassay for brassinosteroidsplant growth regulating compound//Plant Physiol. (Suppl.) - 1988. - Vol. 86. - P. 113. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-Тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота со структурной формулой в качестве гаптена для получения иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином.