Способ получения конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом

011717 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к биологической и фармацевтической химии и может быть использовано при разработке и создании новых фармацевтических препаратов. Уровень техники Известно использование диальдегиддекстрана для получения конъюгата с таким лекарственным средством, как изониазид, с целью получения эффективного противотуберкулезного препарата. Из документа RU 2087146 известен способ получения конъюгата изониазида (гидразида изоникотиновой кислоты) с диальдегиддекстраном, включающий выделение фракций декстрана с молекулярной массой 20-40 кДа из коммерческого препарата Реополиглюкин путем осаждения этанолом, окисление декстрана периодатом натрия, остановку реакции окисления этиленгликолем, осаждение диальдегиддекстрана охлажденным этанолом, получение конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом путем смешивания их водных растворов при комнатной температуре, последующей стабилизации оснований Шиффа конъюгата боргидридом натрия, осаждения конъюгата из раствора охлажденным этанолом, очистки от примесей путем диализа против дистиллированной воды, лиофильной сушки полученного продукта. Недостатком известного способа является наличие в диальдегиддекстране примесей, которые обладают токсическим действием (йодной кислоты и этиленгликоля) и препятствуют эффективному связыванию диальдегиддекстрана с изониазидом, вследствие чего полученные конъюгаты являются нестойкими при хранении. Из RU 2143900 известен способ получения конъюгата изониазида с диальдегидцекстраном, включающий окисление декстрана путем облучения тормозным гамма-излучением в дозах 2,5-3,5 Мрад на ускорителе электронов ЭЛВ-2, добавление к раствору активированного (окисленного) декстрана изониазида в концентрации 0,4-4% (по массе) с последующим нагреванием смеси до 100C, охлаждение смеси,удаление несвязанного изониазида из смеси диализом или методом хроматографии. Выход целевого продукта составляет 98% от расчетного по диальдегиддекстрану. Недостатком способа является использование сложного и дорогостоящего оборудования типа ускорителя электронов, которое является весьма энергоемким (потребляемая мощность при работе ускорителя электронов составляет более 100 кВт). Другим недостатком известного способа является содержание в облученном продукте органических и неорганических перекисей, образующихся при радиолизе водных растворов, которые значительно снижают стабильность как диальдегиддекстрана, так и его конъюгата с изониазидом. Кроме того, под действием перекиси водорода разрушается гидразидная группировка гидразида изоникотиновой кислоты, отвечающая за специфическую противотуберкулезную активность изониазида. Другим недостатком известного метода является использование для удаления несвязанного гидразида изоникотиновой кислоты сложных, дорогостоящих и низкопроизводительных методов очистки, таких как диализ и хроматография. Известен способ получения конъюгата изониазида с диальдегиддекстраном, включающий окисление коммерческого декстрана с молекулярной массой 65-75 кДа периодатом натрия, остановку реакции окисления путем связывания окислителя этиленгликолем, удаление непрореагировавшего периодата натрия и других примесей с помощью диализа смеси против дистиллированной воды, осаждение диальдегиддекстрана этанолом (путем добавления охлажденного до 4-6 С этанола в течение 24 ч), очистку полученного диальдегиддекстрана путем трехкратного промывания ацетоном с последующим переосаждением, получение конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом путем добавления к водному раствору диальдегиддекстрана уксусной кислоты, сухого изониазида, доведения pH смеси до 8,0, последующей стабилизации оснований Шиффа конъюгата боргидридом натрия; очистку конъюгата от примесей путем диализа против дистиллированной воды, осаждение конъюгата из раствора охлажденным этанолом,промывание ацетоном, лиофильную сушку полученного продукта. Общий выход конъюгата - 32,4% от теоретического в расчете на декстран, 60% - в расчете на диальдегиддекстран. Конъюгат устойчив при 46C в течение 1,5 лет. Данный способ описан в документах RU 2163120, RU 2168994 и RU 2185166 Недостатком известного способа является многостадийность, длительность процедуры, обусловленные необходимостью отделения целевого вещества от токсичного периодата натрия и иных примесных компонентов. В документе RU 2168994 также приведены сведения о методах анализа конъюгата и исследования его структуры. Наиболее близким к заявленному является описанный в RU 2125451 способ получения конъюгата изониазида с диальдегиддекстраном, включающий окисление декстрана периодатом натрия,удаление непрореагировавшего периодата натрия и других примесей с помощью диализа, осаждение диальдегиддекстрана охлажденным до 4-6C этанолом, очистку полученного диальдегиддекстрана путем промывания ацетоном с последующим переосаждением, проведение конъюгации путем внесения изониазида в сухом виде в раствор диальдегиддекстрана в количестве, обеспечивающем его концентрацию 0,3 моль/л, стабилизацию оснований Шиффа конъюгата боргидридом натрия, очистку конъюгата от примесей путем диализа, осаждение конъюгата из раствора охлажденным этанолом, промывание его ацетоном и высушивание. Общий выход конъюгата составляет 32,4% от теоретического в расчете на декстран и 60% - в расчете на диальдегиддекстран. Недостатком этого способа является его трудоемкость (многостадийность), длительность процедуры, недостаточный выход конечного продукта. Многостадийность-1 011717 процесса обусловлена введением соединений, инактивирующих избыток периодата для остановки окислительной декструкции и регулирования глубины окисления декстрана, необходимостью удаления йодсодержащих примесей, которые обладают токсическим действием. Раскрытие изобретения Задачей, на решение которой направлено изобретение, является предложение простого способа получения конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом, не содержащего токсичных йодсодержащих примесей, с высоким выходом целевого продукта. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом, включающем окисление декстрана, удаление примесей из раствора диальдегиддекстрана,получение конъюгата путем внесения изониазида в раствор диальдегиддекстрана, стабилизацию конъюгата, его осаждение из раствора этанолом и высушивание, окисление декстрана проводят перманганатом калия в кислой среде при нагревании, примеси удаляют путем нагревания реакционной смеси до образования осадка и его удаления, стабилизацию конъюгата проводят путем нагревания. Предпочтительно окисление декстрана проводят при нагревании до 80-100C в присутствии слабой органической кислоты при pH 3,0-5,0. Кроме того, изониазид добавляют в раствор диальдегиддекстрана в количестве 0,04-0,36 моль/л. Предпочтительно стабилизацию конъюгата проводят путем нагревания реакционной смеси до температуры 80-100C. Преимущественно осаждение конъюгата из раствора осуществляют 1-2-кратным объемом этанола при температуре 50-80C. В соответствии с настоящим изобретением в качестве окислителя декстрана используют перманганат калия. Использование перманганата калия вместо периодата натрия приводит к получению продукта,не загрязненного соединениями йода. Кроме того, при окислении декстрана перманганатом калия образуется нерастворимый осадок диоксида марганца, который в ходе образования захватывает примесные компоненты, подлежащие удалению. По отношению к способу-прототипу это позволило исключить протяженную во времени стадию диализа окисленной смеси, предназначенную для отделения непрореагировавшего периодата и иных примесей, и отделить примеси путем отделения жидкости, содержащей диальдегиддекстран, от осадка, содержащего диоксид марганца. В качестве исходного продукта может быть использован любой декстран, однако, предпочтительно использовать декстран с молекулярной массой 20-75 кДа в виде 5-15% водного или водно-солевого раствора. Декстран является доступным соединением, например, таким как коммерческий препарат Реополиглюкин, представляющий собой водно-солевой раствор декстрана с молекулярной массой 20-40 кДа с содержанием основного вещества 10% (по массе) или коммерческий препарат декстрана с молекулярной массой 40 кДа ("Fluka", Швейцария), или декстран с молекулярной массой 65-75 кДа (производство Сигма, США) и др. Преимущественно декстран используют в виде водного или водно-солевого раствора. Перманганат калия следует использовать в количестве, достаточном для полного окисления декстрана до целевого продукта, которое легко может быть определено специалистом в данной области техники. Окисление декстрана перманганатом калия проводят в слабокислой среде, где образуется осадок диоксида марганца. Предпочтительно стадию окисления проводят при pH 3,0-5,0. Для создания требуемой величины pH могут быть использованы любые кислоты, предпочтительно используют органические кислоты или их смесь. Так, например, при использовании в качестве исходного декстрана 10%-го водного раствора декстрана к нему последовательно добавляют слабокислую органическую кислоту в концентрации 5-35% и в количестве 0,5-2,0% от исходного объема раствора декстрана и 2%-ный раствор перманганата калия в количестве от 1 до 6% от объема исходного раствора декстрана. При pH 3,0 может происходить частичная кислотная деструкция полимера, что приведет к снижению его молекулярной массы, в то же время выход карбонильных групп будет таким же, как в диапазонеpH 3,0-5,0. При увеличении pH в нейтральную и щелочную сторону, количество карбонильных групп при окислении перманганатом калия снижается, особенно в области нейтрального значения pH. Кроме того, при увеличении pH растворимость двуокиси марганца, ввиду ее амфотерности, увеличивается, что соответственно может вызвать загрязнение окисленного декстрана растворимыми солями марганца. При нейтральных и, особенно, щелочных значениях pH осаждение окисленного декстрана этанолом сильно замедляется, ввиду формирования тонкодисперсной трудно осаждаемой взвеси. В используемом диапазоне pH 3,0-5,0 не происходит деструкции декстрана, карбонильная емкость окисленного декстрана максимально высока и он легко осаждается этанолом. Окисление декстрана перманганатом калия проводят при нагревании, так как увеличение температуры реакции увеличивает ее скорость. Преимущественно температура на стадии окисления декстрана составляет 80-100C, однако, может быть использована и иная температура. Специалист в данной области техники может без труда подобрать рабочие значения температуры стадии окисления. Диальдегиддекстран, который находится в водной фазе, отделяют от осадка диоксида марганца любым известным специалисту методом, например центрифугированием, фильтрованием, декантированием и т.д.-2 011717 Конъюгат диальдегиддекстрана с изониазидом получают путем внесения в раствор диальдегиддекстрана изониазида до конечной концентрации 0,04-0,36 моль/л (от 5 до 50 мг/мл). При концентрации изониазида ниже 5 мг/мл его взаимодействие с окисленным декстраном происходит медленно и не полностью, а концентрация изониазида 50 мг/мл является верхней границей, выше которой растворимость изониазида в растворе окисленного декстрана снижается, что может привести к выпадению его в осадок, снижению выхода конечного продукта. Стабилизацию конъюгата осуществляют путем нагревания смеси в течение 10-15 мин при температуре 80-100C. Конъюгат изониазида с диальдегидекстраном осаждают добавлением 1-2-кратного объема этанола при температуре 50-80C. Отделяют осажденный конъюгат от жидкой фазы, с которой удаляется несвязанный изониазид. Целевой продукт высушивают. Под стабилизацией коньюгата подразумевается реакция конденсации карбонилсодержащего окисленного декстрана с изониазидом, имеющим в составе гидразидной группировки первичную аминогруппу, т.е. образование Шиффова основания между гидразидом изоникотиновой кислоты и диальдегиддекстраном. Указанных температурных и временных параметров достаточно, чтобы реакция конденсации прошла полностью. Ход реакции легко контролировать, так как продукт конденсации окрашен в желтый цвет, т.е. по интенсивности окраски раствора смеси изониазида и окисленного декстрана в зависимости от температуры и времени можно судить о полноте протекания реакции. При времени реакции менее 10 мин и температуре ниже 80C реакция протекает не полностью, что ведет к снижению выхода конечного продукта, а при температуре свыше 100C и времени более 15 мин интенсивность окраски раствора,содержащего изониазид и диальдегиддекстран, не увеличивается, что соответственно не приводит к увеличению выхода конечного продукта. Выбранный температурный режим осаждения коньюгата диальдегиддекстрана с изониазидом подобран экспериментально и является оптимальным для получения готового продукта. Если осаждение коньюгата вести при температуре ниже 50C, то он будет осаждаться в виде тонкодисперсной взвеси,которую очень трудно отделить от раствора без потери готового продукта. При осаждении в заявленном диапазоне температур конъюгат осаждается в виде маслянистой жидкости или расплава, который очень легко отделяется от раствора, содержащего непрореагировавший свободный изониазид простой декантацией. В связи с тем, что изониазид плохо растворим в спирте, то сочетание повышенной температуры и небольшого избытка (1-2-кратного) этанола позволяет при декантации раствора полностью удалить непрореагировавший изониазид. Если использовать меньший избыток этанола, особенно в сочетании с более низкой температурой, чем заявляемая, то часть конъюгата может раствориться, что приведет к снижению выхода готового продукта. Если увеличить кратность добавления этанола, при снижении температуры ниже заявляемой, то в растворе будет присутствовать этанол в концентрациях, при которых свободный несвязанный с декстраном изониазид плохо растворим, что соответственно приведет к выпадению его в осадок и загрязнению конечного продукта конденсации, находящегося в нижней фазе. Конъюгат изониазида с диальдегиддекстраном имеет чистоту более 95%, представляет собой аморфный порошок желтого цвета, хорошо растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях. Выход целевого продукта составляет 78-83% (в расчете на декстран). Осуществление изобретения Пример 1. 100 мл коммерческого препарата Реополиглюкина (10% раствор декстран с молекулярной массой 20-40 кДа) нагревают на кипящей водяной бане до температуры 100C, добавляют к нему 35%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 0,5% от объема раствора Реополиглюкина для получения pH 4,5,смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в объеме 1% от исходного объема Реополиглюкина. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка двуокиси марганца. Затем смесь выдерживают при комнатной температуре до обесцвечивания раствора и фильтруют, например, через бумажный фильтр. В полученный раствор диальдегиддекстрана вносят 5 мг/мл сухого изониазида и нагревают раствор на кипящей водяной бане в течение 15 мин при температуре 100C. В процессе нагревания раствор окрашивается в желтый цвет. Для осаждения конъюгата после охлаждения раствора до 50C к нему прибавляют 1-кратный объем 95%-ного раствора этанола, перемешивают и выдерживают на водяной бане при температуре 50 С втечение 20 мин. В процессе выдержки формируется желтый аморфный осадок, надосадочная жидкость становится более прозрачной. По окончании времени выдержки реакционную смесь охлаждают, надосадочную жидкость удаляют, осадок промывают 10 мл 95%-го раствора этанола и высушивают, например, в термостате при температуре 50C. Выход целевого продукта по массе составляет 78% (от декстрана). Пример 2. 10%-й раствор декстрана с молекулярной массой 40 кДа ("Fluka", Швейцария) нагревают на кипящей водяной бане до температуры 80C, прибавляют к нему 5%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 2,0% от объема исходного раствора декстрана для получения pH 4,0, смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 3% от объема исходного раствора декстрана. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка. Затем смесь выдерживают при-3 011717 комнатной температуре до обесцвечивания раствора и фильтруют, например, через бумажный фильтр. В полученный раствор диальдегиддекстрана вносят 50 мг/мл сухого изониазида и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин при температуре 100C. В процессе нагревания раствор окрашивается в желтый цвет. После охлаждения раствора до 60C к нему прибавляют 2-кратный объем 95%-го раствора этанола, смесь перемешивают и выдерживают на водяной бане при температуре 50-80C 15 мин. В процессе выдержки формируется желтый аморфный осадок, надосадочная жидкость становится более прозрачной. По окончании времени выдержки реакционную смесь охлаждают, надосадочную жидкость удаляют, осадок промывают 10 мл 95%-го раствора этанола и высушивают на воздухе. Выход целевого продукта по массе составляет 83% (от декстрана). Пример 3. 10%-й раствор декстрана с молекулярной массой 65-76 кДа (производство Сигма, США) нагревают на кипящей водяной бане до температуры 90C, прибавляют к нему 5%-ный раствор муравьиной кислоты в количестве 2,0% от объема исходного раствора декстрана для получения pH 4,0, полученную смесь перемешивают и прибавляют 2%-ный раствор перманганата калия в количестве 6% от объема исходного раствора декстрана. Реакционную смесь нагревают до выпадения коричневато-черного осадка,охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, например, через бумажный фильтр. В полученный раствор диальдегиддекстрана вносят 25 мг/мл сухого изониазида и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин при температуре 80C. В процессе нагревания раствор окрашивается в желтый цвет. После охлаждения раствора до 60C к нему прибавляют 2-кратный объем 95%-го раствора этанола, смесь перемешивают и выдерживают на водяной бане при температуре 50-80C 20 мин. В процессе выдержки формируется желтый аморфный осадок, надосадочная жидкость становится более прозрачной. По окончании времени выдержки реакционную смесь охлаждают, надосадочную жидкость удаляют, осадок промывают 10 мл 95%-го раствора этанола и высушивают, например, в термостате при температуре 50C. Выход целевого продукта по массе составляет 83% (от декстрана). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения конъюгата диальдегиддекстрана с изониазидом, включающий окисление декстрана, удаление примесей из раствора диальдегиддекстрана, получение конъюгата путем внесения изониазида в раствор диальдегиддекстрана, стабилизацию конъюгата, его осаждение из раствора этанолом и высушивание, отличающийся тем, что окисление декстрана проводят перманганатом калия в кислой среде при нагревании, примеси удаляют осаждением путем нагревания реакционной смеси до образования осадка и его отделения, стабилизацию конъюгата проводят путем нагревания. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что окисление декстрана проводят при нагревании до 80100C в присутствии слабой органической кислоты при pH 3,0-5,0. 3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что изониазид добавляют в раствор диальдегиддекстрана в количестве 0,04-0,36 моль/л. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что стабилизацию конъюгата проводят путем нагревания реакционной смеси до температуры 80-100C. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что осаждение конъюгата из раствора осуществляют 1-2-кратным объемом этанола при температуре 50-80C.