Конъюгат кастастерона с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена

КОНЪЮГАТ КАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона с бычьим сывороточным альбумином, который может быть использован в качестве иммуногена для получения антител, специфичных к 24Sметилбрассиностероидам. Целью изобретения является конъюгат кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифические антитела к 24Sметилбрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, который получают взаимодействием Nоксисукцинимидного эфира 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест 6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Хрипач Владимир Александрович, Свиридов Олег Васильевич, Литвиновская Раиса Павловна, Прядко Андрей Георгиевич,Драч Светлана Васильевна, Новик Татьяна Валентиновна, Жабинский Владимир Николаевич (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 014349 Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы (I) где БСА - бычий сывороточный альбумин, который может быть использован в качестве белканосителя для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10-5-10-9%. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является брассинолид, что делает актуальным разработку методов его анализа, а также анализа его химического и биохимического предшественника кастастерона (далее 24S-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 24S-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые (конъюгаты), в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены. Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы (II) в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу [8]. К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего, связывание (маскировку) 3-гидроксигруппы,которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает этот конъюгат нестабильным [9]. Наиболее близким к заявляемому является конъюгат кастастерона с БСА формулы (III) который предложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов [10]. Конъюгат получен на основе 24S-метилбрассиностероида - кастастерона, но не позволил получить антитела, специфичные к этой группе брассиностероидов - показатели перекрестных реакций с изученными авторами брассиностероидами составляли от 20 до 50%.-1 014349 Целью изобретения является конъюгат кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифичные антитела к 24S-метилбрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым соединением (I), которое получают взаимодействиемN-оксисукцинимидного эфира 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6 илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой образовавшегося конъюгата путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Растворяют 50 мг (0,08 ммоль) 6-(6-22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест 6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) и 12 мг (0,1 ммоль) N-оксисукцинимида в 5 мл безводного диоксана, охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 17,4 мг(0,084 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 3 мл безводного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 17 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Без дополнительной очистки растворяют 35 мг (0,055 ммоль)N-оксисукцинимидного эфира в 10 мл безводного диоксана и добавляют 52 мг (0,86 мкмоль) БСА в 10 мл смеси 9 мл дистиллированной воды и 1 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Перемешивают реакционную смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Образовавшуюся массу подвергают диализу при 20 С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем против 1%-ной суспензии активированного угля в воде в течение 20 ч, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляет 24 моль гаптена на 1 моль белка. Заявляемый конъюгат получают с количественным выходом и высокой степенью "посадки" гаптена, что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза, так очистки и выделения. Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам (брассинолид, кастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2. Группу из десяти кроликов иммунизируют конъюгатом кастастерон-БСА с плотностью посадки 24 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли(рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 3 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ. Таблица 1 Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом кастастерона с БСА (I) Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало, что ее разбавление в 100000 (A1) или 10000 (А 2) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как кастастерона, так и брассинолида, проявивших, как и ожидалось, сравнимые параметры связывания с антителами. Таким образом, тест-система обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг БС в 50 мкл образца.-2 014349 Специфичность Перекрестная реакция антител к кастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2. Таблица 2 Кросс-реактивность антисыворотки A1 с различными стероидами,параметры связывания с антителами Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, обладает стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет получать антитела,специфичные к брассинолиду и кастастерону. Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука i тэхнiка, 1993. 288 с. 2. Патент РБ 2806. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения/Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н.// Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. -2 (26). - С. 159. 3. Патент РБ 3488.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля/Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Вакуленко В.В.// Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. -3 (27). - С. 74. 4. Патент РБ 3400. Способ защиты картофеля от фитофтороза/Хрипач В.А., Жабинский В.Н.,Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н.// Оф. Бюл. Бел-гос-пат. - 2000. -2(25). - С. 75. 5. Патент РБ 5168. Способ защиты ячменя от листовых болезней/Хрипач В.А., Литвиновская Р.П.,Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е.,Морозик Г.В.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2(37). - С. 95. 6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна/Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2(37). - С. 93. 7. Патент РБ 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля/Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. 4(39). - С. 88. 8. Schlagnhaufer C.D., Arteca R.N. and Phillips A.T. Monoclonal antibodies against brassinosteriod a newGrowth Regul. - 1990. - Vol. 9. - P. 151. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Конъюгат кастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы где БСА - бычий сывороточный альбумин - в качестве иммуногена.