Пептид, происходящий из вируса гепатита с

Номер патента: 9782

Опубликовано: 28.04.2008

Авторы: Сата Митио, Ямада Акира, Итох Киого

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Пептид, происходящий из вируса гепатита С, содержащий HLA-связывающий мотив в своей последовательности и распознаваемый антителом, обнаруживаемым у пациента с инфекцией вируса гепатита С, где пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной любой из последовательностей SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 16, 20 и 38.

2. Пептид, происходящий из вируса гепатита С по п.1, отличающийся тем, что пептид дополнительно обладает свойством быть распознаваемым HLA-A2- или HLA-A24-специфичными цитотоксическими Т-клетками.

3. Нуклеотид, кодирующий пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2, или нуклеотид, имеющий последовательность, комплементарную с ним.

4. Антитело или вещество с антитело-подобной активностью, которое распознает пептид, происходящий из вируса гепатита С, заявленный в п.1 или 2.

5. Вектор, включающий вышеупомянутый нуклеотид по п.3.

6. Способ индуцирования цитотоксических Т-клеток путем применения пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.

7. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.

8. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием нуклеотида по п.3.

9. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.

10. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.

11. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.

12. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.

13. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.

14. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.

15. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.

16. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента нуклеотид по п.3.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4.

19. Фармацевтическая композиция по пп.16, 17 или 18, отличающаяся тем, что она представляет вакцину вируса гепатита С.

20. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.

21. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.

22. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.

23. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2.

24. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя нуклеотид по п.3.

25. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4.

 

Текст

Смотреть все

009782 Область техники Настоящее изобретение относится к пептиду вируса гепатита С (HCV), который полезен для диагностики инфекции вируса гепатита С и лечения гепатита С. Более конкретно, изобретение относится к HCV пептиду, полипептиду, содержащему HCV пептид,нуклеотиду, кодирующему HCV пептид или полипептид, антителу или веществу с антитело-подобной активностью, которое распознает пептид или полипептид, вектору, включающему в себя нуклеотид, способу индуцирования цитотоксических Т-клеток HCV пептидом или полипептидом, способу обнаружения вируса гепатита С и к способу диагностики, профилактики или лечения гепатита С, способу предсказания прогноза гепатита С с использованием HCV пептида, полипептида, нуклеотида, или антитела или вещества с антитело-подобной активностью, а также к фармацевтической композиции для лечения гепатита С, содержащей HCV пептид, полипептид, нуклеотид, или антитело или вещество с антителоподобной активностью. Предшествующий уровень техники Гепатит, вызываемый вирусами, включает гепатит А, вызываемый, главным образом, оральным заражением вирусом, гепатит В, вызываемый заражением через кровь, и гепатит С, вызываемый главным образом заражением при переливании крови. Гепатит С является одним из заболеваний, которые могут развиваться в хроническое заболевание, приводящее в результате к циррозу печени или раку печени при крайне высоком риске. Вирус гепатита С (HCV) является вирусом с одноцепочечной РНК, который принадлежит к семейству флавивирусов, и говорят, что вирусом гепатита С заражены 2 млн или более в Японии и 170 млн по всему миру. Для лечения гепатита С была разработана комбинационная терапия интерфероном и рибавирином,однако, она является эффективной только у 30-40% пациентов, и для большинства пациентов эффективная терапия не доступна. Соответственно, все еще существует сильная социальная потребность в немедленной разработке диагностических и терапевтических средств, которые являются безопасными, эффективными и простыми в использовании при низкой стоимости. Имеется доказательство, показывающее, что и клеточные, и гуморальные иммунные ответные реакции играют первостепенную роль в ингибировании HCV инфекции (WO 89/04669). На протяжении прошедших 10 лет был проведен ряд исследований по поиску HCV пептида с высокой иммуногенностью, и было обнаружено много HCV пептидов, которые могут вызывать клеточную или гуморальную ответную реакцию (Hunziker et al., Mol Immunol. 2001 Dec: 38 (6): 475-84). Однако ни один из данных пептидов не является клинически эффективным. Даже в настоящее время нет никаких эффективных средств для профилактики и лечения гепатита С, что, как считают, является, прежде всего, следствием плохой иммуногенности данных пептидов. В дополнение к сказанному настоящие изобретатели уже сообщали, что антигенный пептид, распознаваемый некоторыми цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), обладает способностью вызывать как клеточную, так и гуморальную иммунную реакции как in vitro, так и in vivo (Gohara et al., J Immunother. 2002 Сентябрь-Октябрь; 25 (5): 439-44, Mine et al., Clin Cancer Res. 2001 Декабрь; 7(12): 3950-62, Tanakaet al., J Immunother. 2003 Июль-Август; 26 (4): 357-66, Mine et al., Cancer Sci. 2003 Июнь; 94 (6): 548-56). Ожидается, что HCV пептид, распознаваемый как клеточными, так и гуморальными иммунными ответными реакциями, имеет более высокую иммуногенность, чем пептид, распознаваемый только клеточным иммунным ответом. Новым подходом в удовлетворении такой социальной потребности является идентификация HCV пептида, который может индуцировать и клеточный, и гуморальный иммунитет, поскольку накопленные знания продемонстрировали, что такой пептид обнаружил бы гораздо более высокую иммуногенность,чем пептид, индуцирующий только гуморальный иммунитет. Таким образом, благоприятным является идентификация или определение такого пептида и проверка, является ли такой пептид кандидатом в новые терапевтические и диагностические средства для HCV инфекции. Соответственно, настоящие изобретатели проверили, может ли IgG реакционноспособный по отношению к пептиду, распознаваемому HLA-A2- и HLA-A24-специфичными цитотоксическими Тлимфоцитами (CTL), детектироваться в сыворотке пациента, инфицированного HCV, и обнаружили, чтоHCV, независимо от их HLA класса типа I или HCV генотипа. Благодаря данному результату они нашли,что такой пептид может привести к новым профилактическим и терапевтическим средствам, использующим данный пептид. Соответственно, целью изобретения является предоставление HCV пептида, который распознается клеточным и гуморальным иммунитетом и является высокоиммуногенным. Раскрытие изобретения Настоящее изобретение предоставляет пептид, происходящий или получаемый из вируса гепатита С, содержащий HLA-связывающий мотив в своей последовательности, и распознается антителом, присутствующим в крови пациента, инфицированного вирусом гепатита С.-1 009782 Согласно предпочтительному воплощению пептид, происходящий из вируса гепатита С, имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из последовательностей SEQ ID NOS:1-8,16, 20 и 38 перечня последовательностей, или имеет аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере на 70% гомологию с аминокислотной последовательностью пептида HCV-происхождения,и обладает свойством распознавания HLA-A2- и HLA-A24-специфичными цитотоксическими Тклетками. Еще один аспект изобретения предоставляет полипептид, включающий в себя пептид, происходящий из вируса гепатита С. Согласно предпочтительному воплощению изобретение предоставляет также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере на 70% гомологию с аминокислотной последовательностью данного полипептида, и полипептид, дополнительно обладающий свойством быть распознаваемым HLA-A2- или HLA-A24-специфичными цитотоксическими Тклетками. Еще один аспект изобретения предоставляет нуклеотид, кодирующий пептид, происходящий из вируса гепатита С, или полипептид. Еще один аспект изобретения предоставляет антитело или вещество с антитело-подобной активностью, способное иммунологически распознавать пептид, происходящий из вируса гепатита С или полипептида. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет вектор, включающий вышеупомянутый нуклеотид. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ индуцирования цитотоксических Т-клеток путем использования нуклеотида, кодирующего пептид, происходящий из вируса гепатита С,или полипептида. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ детекции или обнаружения вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида,или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ диагностики заболевания, связанного с заражением HCV, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ лечения заболевания, связанного с заражением HCV, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С,полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного ингредиента пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид,нуклеотид, или антитело, или вещество с антитело-подобной активностью. Согласно предпочтительному воплощению фармацевтической композицией является вакцина вируса гепатита С. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ предсказания прогноза заболевания, связанного с заражением HCV, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью. Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет набор для диагностики гепатита С или предсказания прогноза гепатита С, содержащий пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид, нуклеотид, или антитело, или вещество с антитело-подобной активностью. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет график, показывающий результаты измерения уровня IgG в крови пациента,инфицированного HCV, по методу ELISA, в соответствии с настоящим изобретением. Фиг. 2 представляет график, показывающий результаты измерения уровня IgG в крови пациентов,инфицированных HCV, по методу ELISA, в соответствии с настоящим изобретением. Фиг. 3 представляет график, показывающий экспериментальные результаты абсорбции и элюирования характерного примера антитела, реакционноспособного к С-35 пептиду, присутствующему в сыворотке пациента, показанного на фиг. 1, согласно настоящему изобретению. Фиг. 4 представляет график, показывающий результаты CTL индуцирования 6 типами HLA-A24 связывающих пептидов ( 3, 12, 13, 25, 32 и 38), происходящих из HCV, согласно настоящему изобретению. Фиг. 5 представляет график, показывающий результаты CTL индуцирования HLA-A2 связывающими пептидами ( 40-57), происходящими из HCV, согласно настоящему изобретению. Фиг. 6 представляет график, показывающий характерные результаты цитотоксической активности стимулируемого пептидом PBMC в анализе высвобождения 51Cr согласно настоящему изобретению. Фиг. 7 представляет график, показывающий характерные результаты цитотоксической активности стимулируемого пептидом PBMC в анализе высвобождения 51Cr согласно настоящему изобретению. Фиг. 8 представляет график, показывающий HLA класс I рестрикции цитотоксичности, стимулируемого пептидом PBMC в анализе ингибирования анти-CD8 моноклональным антителом согласно настоящему изобретению.-2 009782 Фиг. 9 представляет график, показывающий обнаружение антипептида IgG в сыворотках пациентов, инфицированных HCV. Фиг. 10 представляет график, показывающий обнаружение антипептида IgG в сыворотках пациентов, инфицированных HCV. Фиг. 11 представляет график, показывающий результаты анализа в опыте по абсорбции специфичности антипептида IgG, присутствующего в сыворотках пациентов, инфицированных HCV. Фиг. 12 представляет график, показывающий результаты анализа в опыте по элюированию специфичности антипептида IgG в сыворотках пациентов, инфицированных HCV. Фиг. 13 представляет график, показывающий IFN- продуцирование стимулируемым пептидомPBMC. Фиг. 15 представляет график, показывающий цитотоксичность стимулируемого пептидом PBMC. Фиг. 16 представляет график, показывающий цитотоксичность стимулируемого пептидом PBMC. Фиг. 17 представляет график, показывающий CTL активность стимулируемого пептидом PBMC против NS5A-экспрессирующих клеток. Фиг. 18 представляет график, показывающий CTL активность стимулируемого пептидом PBMC против NS5A-экспрессирующих клеток. Фиг. 19 представляет график, показывающий CTL активность стимулируемого пептидом PBMC против NS5A-экспрессирующих клеток. Фиг. 20 представляет график, показывающий специфичность активности анти-NS5A-2132 IgG. Фиг. 21 представляет график, показывающий результаты анализа по ингибированию роста клеток с использованием анти-NS5A-2132 IgG. Фиг. 22 представляет график, показывающий результаты анализа ADCC активности анти-NS5A2132 IgG. Фиг. 23 представляет график, показывающий обнаружение анти-С-35 антитела и анти-NS5A-2132 антитела у пациентов с различными заболеваниями. Фиг. 24 представляет график, показывающий HLA или HCV генотипную рестрикцию антипептидных антител. Фиг. 25 представляет график, показывающий HLA или HCV генотипную рестрикцию антипептидных антител. Фиг. 26 представляет график, показывающий результаты измерения уровня анти-NS5A-2132 антитела в сыворотках пациентов. Фиг. 27 представляет график, показывающий результаты измерения уровня анти-NS5A-2132 IgG в сыворотках пациентов. Фиг. 28 представляет график, показывающий уровни анти-NS5A антител и HCV РНК в сыворотках пациентов. Фиг. 29 представляет график, показывающий обнаружение анти-С-35 антител и анти-NS5A-2132 антитела в групповом исследовании. Фиг. 30 представляет график, показывающий обнаружение анти-NS5A-2132 антитела в групповом исследовании. Фиг. 31 представляет график, показывающий результаты измерения уровня IgG в крови пациентов,зараженных HCV, с помощью анализа Luminex согласно настоящему изобретению. Фиг. 32 представляет график, показывающий результаты измерения уровня IgG в крови пациентов,зараженных HCV, с помощью анализа Luminex согласно настоящему изобретению. Фиг. 33 показывает курс лечения гепатита С с использованием пептидов настоящего изобретения. Фиг. 34 показывает курс лечения гепатита С с использованием пептидов настоящего изобретения. Подробное описание изобретения Пептид, происходящий из вируса гепатита С, изобретения представляет HCV пептид, который содержит HLA-связывающий мотив в своей последовательности и распознается антителами, присутствующими в крови пациентов, инфицированных вирусом гепатита С. Кроме того, HCV пептид согласно изобретению содержит HLA-связывающий мотив, т.е. HLA-A2 или HLA-A-24-связывающий мотив в своей последовательности. Данный HCV пептид характеризуется также тем, что имеет высокую иммуногенность, а также распознается клеточным и гуморальным иммунитетом. Примеры HCV пептида включают пептиды, перечисленные в табл. 1 и 3. Одним из особенно предпочтительных HCV пептидов изобретения является пептид, имеющий HLA-A2-связывающий мотив со следующей аминокислотной последовательностью: С-35: YLLPRRGPRL (SEQ ID NO:1). У пациента IgG антитело, реакционноспособное с данным пептидом, обнаруживается в значительном количественном соотношении у пациентов, инфицированных HCV со степенью детекции 93% и-3 009782 специфичностью к HCV заражению 100%. Далее, особенно предпочтительными HCV пептидами изобретения являются пептиды, имеющие HLA-A24-связывающий мотив с любой из следующих аминокислотных последовательностей:SFAIKWEYVL (SEQ ID NO:38). В частности, NS5A-2132 способен индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунитет у многих HLA-A24-положительных пациентов.HCV пептидом согласно изобретению может быть пептид, имеющий по крайней мере на 70%,предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более гомологию с аминокислотной последовательностью любого из пептидов, перечисленных выше.HCV пептид согласно изобретению может дополнительно содержать пептид, обладающий свойством быть распознаваемым HLA-A2- или HLA-A24-специфичными цитотоксическими T-клетками (CTL). Данный тип антигенного пептида, способного связываться с HLA, генерируется под действием внутриклеточного разрушения антигенного белка, продуцируемого в клетке, и имеет мотив последовательности для каждого HLA типа. Цитотоксическая Т-клетка (CTL) распознает комплекс антигенного пептида иHLA и вызывает повреждение HCV-инфицированной клетки. Полипептид согласно изобретению содержит в своей последовательности аминокислотную последовательность пептида изобретения, описанного выше, но общее число аминокислот особо не ограничивается. Кроме того, в полипептиде изобретения аминокислотная последовательность, иная, чем последовательность данного пептида, располагается по N-концевой стороне и/или С-концевой стороне, или по обеим сторонам аминокислот пептида. Поэтому такой полипептид имеет, по существу, ту же функцию и эффект, что и вышеупомянутый пептид. Когда здесь используется термин "пептид", следует понимать,что в данный термин включен также "полипептид", если не указывается иное. Пептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную выше, может быть получен с помощью стандартного химического синтеза, путем ферментативного расщепления белковой молекулы,или с помощью методики рекомбинантной ДНК с использованием хозяина, трансформируемого таким образом, чтобы экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую требуемую аминокислотную последовательность. В том случае, когда желаемый пептид получается с помощью химического синтетического метода,он может быть получен с помощью метода, который сам по себе хорошо известен и обычно используется в стандартной химии пептидов. Например, пептид может синтезироваться с помощью твердофазного метода синтеза с пептидным синтезатором. Сырой или неочищенный пептид, получаемый таким образом, может очищаться с помощью любого метода очистки, обычно используемого в химии белков, такого как высаливание, ультрафильтрация, хроматография с обращенной фазой, ионообменная хроматография и афинная хроматография. В случае, когда желаемый пептид получают с использованием метода рекомбинантной ДНК, желаемый пептид может быть получен, например, путем интегрирования ДНК фрагмента, кодирующего желаемую аминокислотную последовательность, описанного выше, в соответствующий экспрессионный вектор, трансформирования микроорганизма или животной клетки с использованием данного экспрессионного вектора и затем культивирования полученного таким образом трансформанта. Экспрессионный вектор, который может использоваться в изобретении, включает плазмиду, вирусный вектор и др., которые хорошо известны в данной области. Для трансформирования клетки-хозяина экспрессионным вектором по методу получения пептида,описанному выше, может соответствующим образом выбираться и использоваться любой из хорошо известных методов, таких как метод с хлоридом кальция, метод кальцийфосфатного соосаждения, DEAEдекстрановый метод, липофектиновый метод или электропорационный метод. Пептид может очищаться с помощью любого из упомянутых выше способов очистки от клеточного экстракта или культурального супернатанта, собранного из культуральной среды. Нуклеотид, который представляет один из других аспектов изобретения, включает олигонуклеотид или полинуклеотид, кодирующий вышеупомянутый пептид, происходящий из вируса гепатита С или упомянутый выше полипептид. Нуклеотид может включать в себя рибонуклеотид и дезоксинуклеотид. Нуклеотид может быть модифицированным хорошо известным в технике методом. Примеры модификации нуклеотида включают мечение, метилирование, "caps", замещение одного или более природных нуклеотидов аналогом и внутринуклеотидную модификацию, известные в данной области техники. Приме-4 009782 ры внутринуклеотидной модификации включают неионную модификацию (например, с использованием метилфосфоната, сложного фосфотриэфира, фосфорамидата и др.), ионную модификацию (например, с фосфортиоатом, форфордитиоатом и др.), модификацию с включением фрагмента боковой цепи, такой как белок (например, нуклеазы, токсина, антитела, сигнального пептида и др.), модификация хелатирующим агентом (например, металла, бора и др.). Упомянутая выше нуклеотидная последовательность дает возможность предоставления пептидной или полипептидной последовательности HCV антигена, кодируемого геномом HCV, также как и пептида, полезного для диагностического испытания или в качестве компонента вакцины. После того как получен нуклеотид изобретения, становится возможным конструировать нуклеотидный зонд и пептид, полезный для диагностики заболевания, связанного HCV инфекцией, или скрининга HCV инфекции в крови или препарате крови. На основе данной нуклеотидной последовательности можно синтезировать ДНК олигомер, имеющий, например, 24-30 нуклеотидов или даже более. Нуклеотид может также использоваться в качестве зонда для обнаружения HCV РНК в сыворотке субъекта, или для скрининга присутствия HCV в крови или продуктах крови. Более того, нуклеотидная последовательность дает возможность моделирования и получения HCVспецифического пептида, полезного в качестве реагента для испытания на присутствие антител противHCV. Антитело, направленное против очищенного пептида, имеющего данную последовательность, может использоваться для обнаружения HCV антигена у субъекта, зараженного HCV, и в продуктах крови,которые могли бы быть получены из крови лица, зараженного HCV. Согласно другим аспектам изобретения антитело включает в себя химерное антитело, модифицированное антитело, моновалентное антитело, Fab, F(ab')2, Fab', белок с одной цепью Fv (scFV) и антитело с одним доменом, которые являются реакционноспособными по отношению к пептиду, происходящему из вируса гепатита С, или к полипептиду. Данные антитела могут иммунологически распознавать пептид или полипептид. Согласно дополнительным аспектам изобретения вектор представляет конструкцию, содержащую нуклеотид, и может трансформировать выбранную клетку-хозяина для экспрессии в хозяине гетерологичных кодирующих последовательностей. Экспрессионным вектором может быть или клонирующий вектор, или вектор интеграционного типа. Клонирующий вектор может включать, например, плазмиду и вирус (такой как аденовирусный вектор). Клонирующий вектор представляет репликон, который может трансформировать хозяйскую клетку и обладает способностью реплицироваться в клетке (например, плазмиде, хромосоме, вирусе, космиде и аналогичных). Интеграционный вектор представляет вектор, который не служит как репликон в клетке-хозяина, но обладает способностью интегрировать ее содержимое в репликон (обычно хромосому) у хозяина, стабильно трансформируя хозяина. Еще один аспект изобретения обеспечивает способ индуцирования цитотоксических Т-клеток, нацеленных на HCV-зараженные клетки, с использованием пептида. Способ индукции изобретения может предусматривать, например, контактирование пептида с клеткой, экспрессирующей HLA-A2, для представления пептида в HLA-A2 молекуле, стимуляцию Т-клетки с клеткой, представляющей пептид, с помощью HLA-A2, и индуцирование Т-клетки в CTL. HLA-А 2-экспрессирующая клетка, используемая в данном способе, может собираться из крови HCV пациента, однако, она может также получаться путем введения гена, кодирующего HLA-A2, в клетку, которая не экспрессирует HLA-A2. Таким образом, пептид согласно изобретению полезен для обнаружения и диагностики HCV инфекции, а также полезен в виде фармацевтической композиции, такой как вакцина, для лечения заболеваний, связанных с вирусом гепатита С.CTL, индуцируемый данным образом, попадает в цель и поражает клетку, инфицированную HCV,поскольку CTL может быть также в качестве фармацевтической композиции для клеточной терапии. Согласно еще одному аспекту изобретения пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид, нуклеотид и/или антитело или вещество с антитело-подобной активностью полезны для обнаружения или диагностики HCV инфекции. Обнаружение или детекция HCV и диагностика заболевания, связанного с HCV, может осуществляться, например, путем детекции присутствия пептида, детекции присутствия или количества соответствующей нуклеотидной последовательности, определения биологического распространения пептида у индивидуума и/или определения количества пептида, присутствующего в пробе, взятой у индивидуума. В таком способе можно использовать взаимодействие и/или реакционноспособность с нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид. Другими словами, обнаружение HCV и диагностика заболеваний, связанных с HCV, может выполняться путем анализа пептида в качестве маркера. Анализ может осуществляться хорошо известным способом, например, с помощью реакционной системы антигенантитело, ферментной реакционной системы и PCR реакционной системы. Мониторинг эффекта лечения и предсказание прогноза заболевания, связанного с HCV, может осуществляться с помощью контролирования концентрации антитела реакционноспособного по отношению-5 009782 к пептиду, в крови субъекта с заболеванием, связанным с HCV. Особенно предпочтительным является измерение уровня анти-С-35 IgG или анти-NS5A-2132 IgG в крови субъекта. Согласно еще одному аспекту изобретения фармацевтическая композиция включает вакцину. Вакцина содержит пептид, получаемый из вируса гепатита С, полипептид и/или нуклеотид, и может необязательно содержать фармацевтически приемлемый адъювант и/или носитель. Адъювант может усиливать иммунную ответную реакцию, и он может включать неполный адъювант Фрейда или алюминийгидроксидный гель. Носитель может, например, включать разбавитель, такой как PBS или дистиллированная вода, физиологический раствор. Фармацевтическая композиция изобретения может вводиться орально, парентерально или трансдермально в зависимости от формы введения, например, с помощью внутривенного или подкожного введения. Примеры лекарственных форм включают таблетки, гранулы, мягкие капсулы, твердые капсулы,жидкости, масла и эмульсии. Доза такой фармацевтической композиции может подходящим образом выбираться в зависимости от симптомов у пациента, подвергаемого лечению. Обычно количество пептида может варьировать в пределах от 0,1 до 10 мг в день для взрослого, и композиция может вводиться один раз каждые несколько дней или несколько месяцев. Все содержание всех патентов и ссылочных документов, приведенных в настоящем описании,включено в описание в виде ссылки на них. Кроме того, все содержание, описанное в описании и чертежах японской патентной заявки 2003-330258, на основании которой, по данной заявке заявляется приоритет, также включено в настоящее описание путем ссылки на нее. Примеры Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры ниже. Данные примеры представлены для более подробной иллюстрации изобретения, но оно не ограничивается ими. Представлены следующие сокращения для аминокислот, используемых в следующих примерах. А обозначает аланин, С - цистеин; D - аспарагиновая кислота; E - глутаминовая кислота; F - фенилаланин; G - глицин; H - гистидин; I - изолейцин; K - лизин; L - лейцин; M - метионин; P - пролин; R аргинин; S - серин; T - треонин; V - валин; Y - тирозин. Пример 1. Обнаружение IgG, реакционноспособного к HCV пептиду, в сыворотках пациентов, инфицированных HCV. Пептид. В данном исследовании использовались синтетические пептиды, имеющие HLA-A2-связывающий мотив или HLA-A24-связывающий мотив из консервативной области 1b белка HCV генотипа (табл. 1). В качестве отрицательного контроля использовался пептид, происходящий от ВИЧ, имеющий HLA-A2 связывающий мотив. Все эти пептиды закупались у коммерческих поставщиков. Чистота анализировалась с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой, и было найдено,что она составляет 90% или выше.n - число. Величина отсечки составляет 1,83. Степень детекции вычислялась на основе количества положительных пациентов с вышеуказанной величиной отсечки (среднее 3 SD). Степени детекции NS-5A-2132 и С-35 составляют 0,202 и 0,13 соответственно. Статистический анализ осуществлялся с использованием 2-испытания.ELISA. Уровень пептид-специфического IgG в сыворотке измеряли с помощью метода ELISA. Сначала каждый пептид растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при -80C. Пептид разбавляли 0,1 М раствором смеси карбоната натрия/бикарбоната натрия, содержащим дисукцинимидилсуберат (DSS) в качестве сшивающего агента. Планшету ELISA покрывали 20 мкг/лунку пептида при 4 С в течение ночи. Лунки промывали три раза смесью 0,05% Твина 20/PBS (PBST), и планшету блокировали с помощью Block Асе (зарегистрированная торговая марка) и оставляли на ночь при 4 С. Образцы плазмы или сыворотки разбавляли в соотношении 1:100, 1:200 и 1:400 смесью 0,05% Твин 20/BlockAce, и 100 мкл каждого образца добавляли в каждую лунку. После того как образцы инкубировали при 37 С в течение 2 ч, планшету промывали 9 раз PBST, в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:1000 кроличьего античеловеческого IgG (-цепь специфического), и инкубировали при 37 С в течение 2 ч. Планшету промывали 9 раз PBST, и в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:100 мышиного антикроличьего IgG, конъюгированного с пероксидаза хрена-декстрановым полимером, и затем планшету инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. После промывания планшеты в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора тетраметилбензидинового субстрата. Реакцию останавливали добавлением 2,0M фосфорной кислоты. Величину отсечки вычисляли в виде средней 3 SD от величин оптической плотности контроля, полученных от здоровых доноров. Абсорбция и элюирование пептид-специфического IgG 100 мкл образца плазмы или сыворотки разбавленных 0,05% Твин 20/Block Ace (зарегистрированная торговая марка) добавляли в каждую лунку и оставляли абсорбироваться пептидом (20 мкг/лунку), нанесенным на лунку планшеты при 37 С в течение 2 ч. После того как данную процедуру повторяли 3 раза, уровень пептид-специфического IgG в супернатанте измеряли с помощью метода ELISA. Антитело, связанное с пептидом, нанесенным на планшету на первоначальной стадии адсорбции, элюировали 30 мкл/лунку 5 М NaCl/50 мкм цитратным буфером(pH 3,0) (нейтрализована 0,05% Твин 20/Block Ace, содержащей 1,0 М Tris-HCL (pH 7,5 и уровень пептид-специфического IgG в элюированной фракции измеряли с помощью ELISA. Анализ на пептид-специфический CTL. Пептид-специфический CTL детектировали с помощью метода, обычно используемого в данной области техники. PBMC добавляли в каждую лунку круглодонной 96-луночной планшеты для микрокультуры в количестве 1105 клеток на лунку, и клетки инкубировали в 200 мкл среды с 10 мкм пептида. Состав данной среды является следующим: 45% RPMI-1640, 45% AIM-V (зарегистрированная торговая марка), 10% плодная сыворотка теленка (FCS), 100 Ед/мл интерлейкина 2 (IL-2), и 1 ммоль MEM раствора несущественной аминокислоты. На 3, 6 и 9 день культивирования половину каждого раствора культу-8 009782 ры удаляли и заменяли свежей средой, содержащей соответствующий пептид (20 мкг/мл). На 12 день культивирования, культивируемые клетки собирали и анализировали на продуцирование гамма интерферона (IFN-) в ответ на CIR-A2402 клетку или Т 2 предварительно пульсируемую соответствующим пептидом или пептидом ВИЧ в качестве отрицательного контроля. Для каждого пептида использовали четыре лунки и анализ проводили дважды. Фон продуцирования IFN- в ответ на ВИЧ пептид вычитали из значения полученных данных. Для анализа ингибирования пептид-реакционноспособный CTL очищали с использованием изолирующего набора CD8 и анализировали на продуцирование пептид-специфическогоIFN- в присутствии 20 мкг/мл любого из моноклонального антитела анти-HLA класс I (W6/32, IgG2a),моноклонального антитела анти-CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a) и моноклонального антитела анти-HLA класс II(H-DR-1, IgG2a). Фоновое IFN- продуцирование вычитали из значения полученных данных. Статистика. Величины выражены в виде среднегоSD. Статистический анализ проводили с использованиемMann-Whitney U-теста и критерия хи-квадрата, а величину P меньше чем 0,05 считали статистически значимой. Обнаружение антитела против HCV пептида. Уровень IgG, который реагирует с каждым из 62 типов пептидов, измеряли в сыворотках от 12 пациентов, инфицированных HCV и 10 здоровых доноров (HDs) (табл. 1). Распространенность антител против каждого пептида показана в табл. 1. Было обнаружено множество пептидов, которые в высшей степени реагируют с IgG в крови от пациентов, инфицированных HCV, и изредка реагируют с сыворотками от здоровых доноров. Пептиды включают 3: NS5A-2132 (соответствующий пептиду в положении 2132-2140 HCV NS5A протеина, ниже приведен в сокращении аналогичным образом),11: NS3-1266,12: Е 2-488,13: Е 1-213,22: NS2947,25: NS3-1081,32: С-176,38 С-173,40: С-35 и 62 NS5B-2990. Характерные результаты измерения уровня IgG в крови от пациентов, инфицированных HCV, с помощью метода ELISA представлены на фиг. 1 и 2. В сыворотке пациента, показанной на фиг. 1, определяли антитело IgG против С-35. В сыворотке 4 пациентов, показанных на фиг. 2 (A)-(D), детектировали IgG антитела, реакционноспособные к NS5A-2132 (A), NS3-1081 (В), Е 2-488 и Е 1-213 (С) и С-176 и С-173 (D) соответственно. Специфичность пептидов данных пептид-реакционноспособных антител проверяли с помощью тестов абсорбции и элюирования. Фиг. 3 показывает характерный пример экспериментальных результатов абсорбции и элюирования антитела реакционноспособного к С-35 пептиду в сыворотке пациента, показанной на фиг. 1. Данное антитело абсорбировали С-35, но не нерелевантным (не относящимся к делу) пептидом NS5A-2252(верхний график на фиг. 3). Более того, антитело элюировали из С-35 адсорбируемой фракции (нижний график на фиг. 3). Среди антител, перечисленных в табл. 1, антитело, реакционноспособное к пептиду С-35, обнаруживали на 100% у пациентов, инфицированных HCV и на 0% у здоровых доноров, что указывает на то,что оно имеет высокую специфичность к HCV. Последовательность С-35 пептида HCV имеет частичную гомологию с пептидами различных вирусов, таких как tet белок (аминокислотная последовательность в положениях 54-58) или env белок (аминокислотные последовательности в положениях 5-9, 158-162 и 717-727) ВИЧ-1. Это так же показывает гомологию с различными белками HTLV-I (такими как pol 724755, rex 5-9, rex 310-313 и tax 70-74). Таким образом, антитело, реакционноспособное к С-35 пептиду, в дальнейшем исследовали в двойном слепом анализе (экспериментальные и контрольные образцы смешаны в группе) 156 случаев в целом, включая 60 случаев заболеваний, связанных с HCV инфекцией (22 случая хронического гепатита С, 20 случаев цирроза печени и 18 случаев рака печени), 24 случая субъектов, инфицированных вирусом гепатита В, 10 случаев реципиентов с вакциной от вируса гепатита В, 27 случаев здоровых доноров, 22 случая пациентов с аутоиммунным заболеванием, 10 случаев субъектов,инфицированных HTLV-I и 3 случая субъектов, инфицированных ВИЧ. Результаты показаны в табл. 2.HCV специфичность и степень детекции антитела, реакционноспособного к С-35 пептиду, составляли 88,5% и 93,3% соответственно. Индуцирование пептид-специфической CTL активности. Шесть типов HLA-A24 связывающих пептидов ( 3, 12, 13, 25, 32 и 38) и 18 типов HLA-A2 связывающих пептидов ( 40-57) инкубировали с моноядерными клетками периферийной крови (PBMCs),полученными от HLA-A24+ или HLA-A2+ HCV-инфицированных пациентов (5 пациентов в каждой группе). В качестве контроля PBMC инкубировали с пептидом ВИЧ. Затем инкубированные PBMC испытывали на их способность продуцировать IFN- в ответ на CIR-A2402 клетку или Т 2-клетку, пульсируемую соответствующим пептидом. Шесть типов HLA-A24 связывающих пептидов ( 3, 12, 13, 25, 32 и 38) могли индуцировать CTL из PBMC полученной от 10 HLA-A24+ HCV пациентов (фиг. 4). Более того, CTL мог индуцироваться HLA-A2 связывающими пептидами, происходящими из HCV ( 40-57) вPBMC, полученной от 5 HLA-A2+ HCV пациентов (фиг. 5). Цитотоксическую активность стимулируемых пептидом PBMC измеряли с помощью анализа высвобождения 51Cr. Характерные результаты показаны на фиг. 6 и 7. Фиг. 6 показывает цитотоксическую активность CTL индуцируемого в PBMC полученном от HLAA24+ HCV пациентов HLA-A24 связующими пептидами ( 3, 12, 13, 25, 32 и 38), происходящими изHCV. Цитотоксическая активность против C1R-А 2402 клеток, загруженных соответствующим пептидом(представлен C1RA2402 на чертеже), была значительно выше, чем активность против контрольных клеток C1R-A2402, загруженных пептидом ВИЧ (представлен C1RA2402 ВИЧ на чертеже). Фиг. 7 показывает цитотоксическую активность CTL, индуцируемого в PBMC периферической крови, полученном от HLA-А 2+ HCV пациентов HLA-A2 связующими пептидами ( 40 и 41), происходящими из HCV. Цитотоксическая активность против Т 2-клеток, загруженных соответствующим пептидом (представлен Т 2 на чертеже), была значительно выше, чем активность против контрольных клеток Т 2 по отношению к загруженным пептидом ВИЧ (представлен Т 2 ВИЧ на чертеже). Данные PBMC показали значительно более высокий уровень цитотоксической активности противC1R-A2420 клетки и Т 2-клетки, предварительно загруженной соответствующим пептидом (за исключением ВИЧ пептида в качестве отрицательного контроля). Рестрикцию цитотоксичности HLA класса I испытывали с помощью анализа ингибирования с использованием анти-CD8 моноклонального антитела (фиг. 8). Фиг. 8 показывает типичный пример ингибирования CTL активности анти-CD8 антителом. Цитотоксичность CTL, индуцируемого в PBMC, полученном от HLA-А 2+ HCV пациента, HLA-A2 связующим пептидом ( 40), происходящим из HCV, ингибировали антителом анти-CD8, но не антителом анти-CD4 или контрольным антителом анти-CD14. Пример 2. Детекция IgG, реакционноспособного к HCV пептиду, в сыворотках HLA-A2 4+ HCVинфицированных пациентов. Объект. Детекцию IgG, реакционноспособного к HCV пептиду, осуществляли более широко на HLA-A24+HCV-инфицированных пациентах. По данным иммуноаналитического теста второго поколения или третьего поколения было обнаружено, что шестьдесят HCV-1b+ пациентов являются сероположительными в отношении анти-HCV антитела (Ab). Генотип HCV, содержащегося в сыворотках пациентов, определяли с помощью RT-PCR. Пациентов диагностировали во время отбора проб сыворотки с помощью биохимического анализа, эхографии, компьютерной томографии и гистологического исследования. Результаты диагностики являются следующими: хронический гепатит (CH, n=24), цирроз печени (LC,n=18) и гепатоцеллюлярная карцинома (карцинома клеток печени) (HCC, n=18). Отрицательным контролем были образцы сыворотки от 20 здоровых доноров (HDs), у которых были нормальные функции печени и не было вирусного гепатита. Анализ пептида и пептид-реакционноспособного антитела. Использовали сорок четыре типа синтетических пептидов, которые получали из высококонсервативной области HCV-1b белка и выбирали на основе оценки высокого связывания с HLA-A24 молекулой(Bioinformatics and Molecular Analysis Section, NIH, Bethesda, MD). Пептид, получаемый из ВИЧ, который имеет HLA-A24 связующий мотив (RYLRDQQLLGI (SEQ ID NO:63 служил в качестве отрицательного контроля. Оценки связывания и последовательности пептидов показаны в табл. 3. Для скрининга реакционноспособности пептидов по отношению к сыворотке IgG, пептиды в обессоленной степени (70%) закупали у фирмы Biosynthesis (LewiSville, TX) или SynPep (Dublin, CA). В последующих экспериментах использовали очищенный пептид (90%). Уровень пептид-специфического IgG в плазме измеряли с помощью энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Специфичность антипептида IgG в образце плазмы испытывали с помощью абсорбции и элюирования пептид-реакционноспособного IgG. Анализ пептид-специфического CTL. Клетки пептид-специфического CTL предшественника обнаруживали с помощью метода, описанного в Hida et al. (Cancer Immunol Immunother 2002; 51:219-228). Для анализа ингибирования использовали моноклональные антитела 20 мкг/мл анти-HLA класса I (W6/32, IgG2a), анти-CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a),анти-CD4 (Nu-Th/I, IgG1b) и анти-HLA класса II (H-DR-1, IgG).CTL активность пептид-стимулируемого PBMC против клетки трансфицируемой NS5A геном. кДНК NS5A, HLA-A2402 и HLA-A2601 получали с помощью RT-PCR из Huh7 (NNU-50-1) клетки,C1R-A2402 клетки и KE4-CTL клетки, соответственно, и клонировали в экспрессионный вектор pCR3.1(Invitrogen, San Diego, CA). Клеточная линия Huh7 (NNU50-1) является клеточным репликоном, получаемым из клеточной линии, инфицированной HCV-1b, и экспрессирует белки от NS3 к NS5B (Kishine etal., Biochem Biophys Res Commun 2002; 293:993-999). Затем, 100 нг NS5A, HLA-A2402 или NS5a и HLAA2601 кДНК (в качестве отрицательного контроля) смешивали в 100 мкл Opti-MEM (Invitrogen), содержащим 0,6 мкл Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) и инкубировали в течение 30 мин. Затем, 100 мкл смеси добавляли к COS-7 клеткам (1104 клеток) и инкубировали в течение 6 ч. 100 мкл RPMI-1640 среды, содержащей 20% FCS добавляли к смеси и COS-7 клетки культивировали в- 10009782 течение 2 дней, с последующим добавлением NS5A 2132-2140-стимулируемых PBMC (2105 клеток/лунку). После инкубирования в течение 18 ч 100 мкл супернатанта (всплывающий слой) удаляли и с помощью анализа ELISA троекратно анализировали концентрацию IFN-. Для того чтобы приготовить стабильную клеточную линию трансфектанта, или pCR3.1-NS5A, или pCR3.1-HLA-A3101 (отрицательный контроль) трансфицировали в CIR-A2402 клетку с помощью электропорации с использованием GenePulser (BioRAD, Richmond, CA). Данные клетки культивировали в течение 30-40 дней в присутствии генетицина (G418) и затем собирали клетки, устойчивые к генетицину. Экспрессию NS5A белка в трансфектанте анализировали с помощью Вестерн-блотт анализа с использованием анти-NS5 поликлонального антитела (Abcam Limited, Cambridge, UK). Ингибирование роста и антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). Клеточную линию Huh7 инкубировали в лунке плоскодонной 96-луночной планшеты для микрокультур в присутствии различных сывороток в течение 24, 48 и 72 ч. После инкубирования Huh7 клетки подсчитывали с помощью набора-8 для подсчета клеток (10 мкл/лунку) (Dojindo, Japan). Для ADSS анализа, PBMC, заново выделенные из HLA-A24+ HD предварительно инкубировали в течение 1,5 ч в 10%FCS и RPMI-1640 среде, содержащей инактивированную сыворотку (56 С, 30 мин) от любого из разных пациентов и HD (в качестве отрицательного контроля). C1R-A2402 клетки или C1R клетки (в качестве отрицательного контроля) инкубировали в течение 2 ч с NS5A 2132-2140 пептидом (10 мкМ) радиометили Na251CrO4 в течение 1,5 ч, промывали и использовали в качестве клеток-мишеней. Пептидстимулируемые PBMC инкубировали в лунке круглодонной 96-луночной планшеты для микрокультур с клетками мишени при соотношении эффектора к клетке мишени (Е/Т) 40, 20 или 10:1. После инкубирования при 37 С в течение 6 ч, супернатант, свободный от клеток, собирали и анализировали активностьADCC (Shomura, et al., Br J Cancer 2004; 90:1563-1571). Статистика. Статистический анализ осуществляли с использованием t-теста Стьюдента и U-теста Mann-Whitney. Величины Р 0,05 считали статистически значимыми. Детекция гуморального ответа на HCV-пептид. Для скрининга гуморального ответа на пептиды анализировали уровень IgG реакционноспособного к каждому из 44 типов пептидов в плазме 12 пациентов, инфицированных HCV-1b. Плазму 10 здоровых доноров использовали в качестве отрицательного контроля. Уровень пептид-реакционноспособного IgG измеряли с помощью анализа ELISA для серийно разбавленных образцов плазмы и выражали величинами абсорбции (OD) каждого образца. Величину отсечки данных пептидов при разбавлении плазмы 1:100 устанавливали при 0,18 OD (значит (0,08)+2SD (0,052) от 10 здоровых доноров). Значительный уровень(0,18 OD при разбавлении плазмы 1:100) IgG реакционноспособного к NS5A-2132, С-176, Е 2-488, Е 1213, С-173 и NS3-1081 пептидам были детектируемыми в плазме 12, 11, 10, 9, 8 и 5 пациентов среди 12 пациентов соответственно (фиг. 9). Как и ожидалось, ни один из этих пептидов не был реакционноспособным к плазме от 10 здоровых доноров (HDs). Реакционноспособность пептидов к пептидспецифическому IgG приводится в табл. 3.a) Уровень пептид-специфического IgG в сыворотках 12 HCV-1b+ пациентов измеряли с помощью метода ELISA. Было определено, что величина отсечки составляет 0,18.b) Показатель связывания пептида с HLA-A24 молекулой определяли с использованием Bioinformatics и Molecular Analysis Section, NIH, Bethesda, MD (http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hlabind/). Каждый из 6 типов вышеупомянутых пептидов, имеющих чистоту 90% или более и отрицательный контрольный пептид испытывали на реакционноспособность к каждому из образцов сыворотки от 60HCV-1b+ пациентов (CH, n=24; LC, n=18 и HCC, n=18) и 20 HDs (фиг. 10). Значения для каждого из этих образцов при разбавлении 100:1 наносили на график. СреднееSDMann-Whitney. Средний уровень IgG, реакционноспособного к NS5A-2132, Е 2-488, Е 1-213 или С-173 был статистически значительно выше, чем уровень у здоровых доноров, однако, этого не было в случае сNS3-1081 или С-176. IgG, показывающий значительный уровень реакционноспособности (0,101 OD при разбавлении сыворотки 1:100) к NS5A-2132, Е 2-488, Е 1-213, С-173, NS3-1081 и С-176 пептидам обнаруживали в плазме у 57 пациентов (95%), у 44 (73%), 28 (47%), 23 (38%), 21 (35%) и 17 (28%) пациентов из 60 испытуемых пациентов соответственно. Наоборот, в любой из сывороток от 20 здоровых доноров не мог быть обнаружен значительный уровень IgG (фиг. 10). Пептид-специфичность IgG реакционноспособного к каждому из этих пептидов проверяли с помощью тестов абсорбции и элюирования. Каждый образец сыворотки абсорбировали или соответствующим пептидом или нерелевантным пептидом (ВИЧ; использовали в качестве отрицательного контроля) при 37 С 3 раза, и уровень пептид-специфического IgG измеряли с помощью метода ELISA (фиг. 11). В тесте элюирования молекулы IgG, связанные с пептид-иммобилизированной планшетой, элюировали или соответствующим пептидом или нерелевантным пептидом после первой абсорбции, и затем уровень пептид-специфического IgG в элюированной фракции измеряли с помощью метода ELISA. Характерные результаты среднегоSD величин OD от трех измерений показаны на чертеже (фиг. 12). Звездочки обозначают р 0,05 в двухстороннем t-испытании Стьюдента. Как ожидалось, каждый IgG в отношении 6 типов пептидов абсорбировали соответствующим пептидом, но не абсорбировали нерелевантным пептидом (ВИЧ пептид). Более того, данный IgG элюировали из связывающей фракции соответствующим пептидом, но не элюировали нерелевантным пептидом. Взятые вместе, данные результаты говорят о том, что IgG реакционноспособный к каждому пептиду,является специфичным к пептиду, получаемому из HCV-1b. Индуцирование пептид-специфического клеточного ответа.HCC пациента) и HLA-A24+ HDs (n=5) без HCV инфекции культивировали с каждым из 6 типов пептидов (чистота 90%) или контрольным ВИЧ пептидом в течение 13 дней, и проверяли на IFN продуцирование в ответ на C1R-A2402 клетку, пульсируемую соответствующим пептидом. PBMC от HLA-A2 4+HCV-1b+ пациентов (n=12) и HDs (n=5) стимулировали любым из 6 типов пептидов в 4 лунках(15104/лунку). На 14-й день культивирования пептид-стимулируемые PBMC (80-120104/лунку) отдельно отбирали из каждой лунки и делили на четверти. Из них две порции отдельно тестировали на способность к продуцированию IFN- в ответ на C1R-A2402 клетки, пульсируемые соответствующим пептидом. Остающиеся две порции испытывали с клетками с использованием в качестве отрицательного контрольного пептида (ВИЧ). Уровень IFN-, продуцируемый в ответ на ВИЧ пептид (50 пг/мл), вычитали как фон. Звездочки указывают р 0,05 в двухстороннем t-испытании Стьюдента.HCV пептиды С-173, С-176, E1-213, E2-488, NS3-1081 и NS5A-2132 вызывали продуцирование IFN при значительном уровне (р 0,05) у 1, 3, 4, 6, 2 и 7 из 12 пациентов (фиг. 13 и 14) и у 0, 0, 1, 1, 1 и 1 из 5HDs (данные не показаны) соответственно. Среди этих 6 типов пептидов, NS5A-2132 пептид распознавался клеточным иммунитетом и гуморальным иммунитетом в PBMC от 7 из 12 пациентов и в сыворотках 57 из 60 HCV-1b+ пациентов, подвергнутых тестированию. Цитотоксичность данных, стимулируемых пептидом PBMC, проверяли с помощью 6-часового анализа высвобождения 51Cr (фиг. 15). Пептид-стимулируемый PBMC, показывающий положительную ответную реакцию в анализе IFN- продуцирования (описанном выше), культивировали и выращивали invitro только с IL-2. Затем испытывали цитотоксичность против C1R-A2402 клеток, пульсируемых соответствующим пептидом или HIV (ВИЧ) пептидом (отрицательный контроль), с помощью стандартного 6-часового анализа высвобождения 51Cr при трех различных соотношениях Е/Т клеток. Характерные результаты показаны на чертеже. Величины или показатели выражаются как среднееSD процента специфичного лизиса. Звездочки указывают на р 0,05 в двухстороннем t-тесте Student's (Стьюдента). PBMC,стимулируемый NS5A-2132, Е 2-488, или Е 1-213 пептидом, показал значительный уровень цитотоксичности против C1R-A2402 клеток, предварительно нагруженных соответствующим пептидом, но не ВИЧ пептидом (фиг. 15). Стимулируемый пептидом PBMC, используемый в эксперименте, показанном на фиг. 15, испытывали на цитотоксичность против C1R-А 2402 клеток, пульсируемых соответствующим пептидом в присутствии 20 мкг/мл анти-HLA-класс I (W6/32, IgG2a), анти-HLA-класс II (H-DR-1, IgG2a), анти-CD8 (NuTs/c, IgG2a) или анти-CD4 (Nu-Th/i, IgG1) моноклонального антитела (mAb). Анти-CD14 (JML-H14,IgG2a) mAb использовали в качестве отрицательного контроля. 6-Часовой анализ высвобождения 51Cr осуществляли при трех различных соотношениях Е/Т. Показатели выражаются как среднееSD процента специфичной фитотоксичности (фиг. 16). Звездочки указывают на р 0,05 в двухстороннем t-тесте Стьюдента. Цитотоксичность против C1R-A2402 клеток, пульсируемых каждым из 3 типов пептидов, ингибировалась анти-HLA-класс I (W6/32) или CD8 моноклональным антителом (mAb), но не любым из других испытываемых mAb, указывая на то, что пептид-специфичная цитотоксичность опосредуется, главным образом, CD8+T клетками HLA-класс I рестрикцируемым образом (фиг. 16). Напротив, такая цитотоксичность не способна обнаруживаться в случае PBMC, стимулируемых остальными 3 типами пептидов- 13009782 Затем проверяли, распознают ли стимулируемые NS5A-2132 пептидом PBMC природно перерабатываемый пептид, с использованием COS-7 клетки, которую скоротечно совместно трансфицировалиNS5A и HLA-A2401 генами в качестве клетки мишени. В качестве отрицательного контроля использовали COS-7 клетку, которую совместно трансфицировали скоротечно NS5A и HLA-A2601 генами. Стимулируемые NS5A-2132 пептидом PBMC от пациентов 1 и 2 испытывали на их способность распознавать COS-7 клетки, совместно трансфицированной скоротечно NS5A и HLA-A2401 генами, в качестве клетки мишени для получения IFN-. В качестве отрицательного контроля использовали COS-7 клетку,которую совместно трансфицировали скоротечно NS5A и HLA-A2601 генами. Показатели выражаются как среднее значениеSD процента IFN- продуцирования в троекратно повторяемых анализах при Е/Т соотношении 20:1 (фиг. 17). Звездочки указывают на р 0,05 в двухстороннем t-тесте Стьюдента. Как ожидалось, стимулируемым пептидом PBMC от пациентов 1 и 2, показывающие CTL активность (фиг. 13), распознавали COS-7 клетку, которая совместно трансфицировалась NS5A и HLAА 2401 генами и продуцировали значительное количество IFN- (фиг. 17). Напротив, данные PBMC не взаимодействовали с COS-7 клеткой, имеющей NS5A и HLA-A2601 гены в качестве отрицательного контроля. Кроме того, стимулируемые пептидом PBMC от двух других пациентов ( 3 и 4), которые не показывали CTL активность, не давали значительных количеств IFN- путем распознавания COS-7 клетки, совместно трансфицированной NS5A и HLA-A2401 генами (данные не показаны). Далее испытывали цитотоксичность против C1R-2402 клетки, которую стабильно трансфицировалиNS5A геном и использовалась в качестве клетки мишени. Экспрессию HLA-A24 молекулы в C1R-A2402 клетке, которую стабильно трансфицировали NS5A геном, и экспрессия HLA-A31 молекулы в C1RA2402 клетке, которую стабильно трансфицировали HLA-A31 геном (отрицательный контроль) анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием FACScan (фиг. 18). Затем испытывали цитотоксичность с помощью 6-часового анализа высвобождения 51Cr с использованием C1R-A2402 клетки, которую стабильно трансфицировали NS5A геном в качестве клетки мишени. C1R-A2402 клетку, которую стабильно трансфицировали отрицательным контрольным геном (HLAA3101), использовали в качестве отрицательного контроля, a C1R-A2402 клетка, которую пульсировалиNS5A-2132 пептидом, использовали в качестве положительного контроля. 6-Часовой анализ высвобождения 51Cr осуществляли при трех различных Е/Т соотношениях. Величины выражали как среднееSD процента специфичного лизиса. Звездочки указывают на р 0,05 в двухстороннем t-тесте Стьюдента.PBMC, стимулируемый NS5A-2132 пептидом, показал более высокий уровень цитотоксичности, как против C1R-A2402 клетки, которую трансфицировали NS5A геном, так и нетрансфицированной C1RA2402 клетки, которую предварительно пульсировали соответствующим пептидом, по сравнению с цитотоксичностью против C1R-A2402 клетки, которую трансфицировали отрицательным контрольным геном (фиг. 19). Данные результаты говорят о том, что стимулируемый NS5A-2132 пептидом PBMC успешно распознает пептид, перерабатываемый и получаемый природно в HLA-A2402 молекуле HCV-1b+ клетки. Дополнительная проверка анти-NS5A-2132 IgG. Для того чтобы больше понять возможность биологической роли антипептида IgG, проверяли, распознает ли анти-NS5A-2132 IgG весь NS5A белок, в анализе абсорбции и элюции. NS5A-2132 и ВИЧ пептид использовали в качестве положительного контроля и отрицательного контроля соответственно(см. описание выше в отношении подробностей испытаний абсорбции и элюции). Антипептид IgG ни абсорбировали, ни элюировали целым NS5 белком (фиг. 20), что говорит о том, что данный пептид IgG не реагировал с целым NS5 белком. Затем, Huh7 клетки инкубировались до трех дней в присутствии сывороток от пациентов (сыворотки от 2 HCV-1b+ пациентов, сыворотки которых показывали высокий уровень анти-NS5A-2132 активности). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки от 2 HDs и FCS. Число Huh7(NNU50-1) клеток, которые могут выжить, подсчитывали с помощью Cell Count kit-8 (набор-8 для подсчета клеток) (10 мкл/лунку), и показаны средние значения от трех анализов. Ни одна из испытуемых сывороток не ингибировала рост Huh7 (NNU50-1) клеток в данных условиях культивирования (фиг. 21). Проверяли также, обладает ли анти-NS5A-2132 IgG способностью опосредовать ADCC активность.PBMC, вновь изолированный от HLA-A24+ HD, испытывали на цитотоксичность против C1R-2402 клетки, предварительно пульсируемой данным пептидом, в присутствии упомянутых выше 4 типов инактивированных сывороток. Однако ни одна из испытуемых сывороток не показала ADCC активность в данных условиях (фиг. 22). Пример 3. Предсказание прогноза пациентов, инфицированных HCV. Объекты. Сыворотки получали от 33 пациентов с заболеванием, связанным с HCV, в групповом исследовании, проводимом в период между 1995 и 2002 г. Результаты последующего обследования 33 пациентов показаны в табл. 4. В анализе использовали также сыворотки, полученные от пациентов с хроническим гепатитом (CH, n=68), циррозом печени (LC, n=43) и карциномой клеток печени (HCC, n=52). Данных- 14009782 пациентов диагностировали во время взятия первой пробы сыворотки с помощью биохимических и гистологических исследований, эхографии и компьютерной томографии. Анти-HCV антитело анализировали с использованием набора для ферментного иммуноанализа хемилюминисценции (CLEIA) (LumipulseII HCV, Fujirebio Inc., Токио, Япония) или ферментного иммуноанализа второго или третьего поколения(SRL, Токио, Япония). HCV-PHK в сыворотках обнаруживали с использованием RT-PCR (SRL, Токио,Япония). HCV генотип определяли с помощью непосредственного секвенирования HCV в сыворотках пациентов с помощью RT-PCR (SRL, Токио, Япония). Сыворотки получали также от субъектов, которые не были заражены HCV, и которые включали 24 пациента с аутоиммунным заболеванием (6 пациентов с системной красной волчанкой, один с болезнью Behcet's и 17 с атипическим дерматитом), 17 случаев заражения вирусом гепатита В (HBV) (положительные для HBV поверхностного антигена), 3 пациентов с вирусом иммунодефицита человека (HIV или ВИЧ) и 10 случаев заражения вирусом Т-клеточной лейкемии человека типа I (HTLV-1). В качестве отрицательного контроля испытывали сыворотки, полученные от 37 пациентов, у которых не было вирусного гепатита или вакцинирования HBV и которые имели нормальную функцию печени. Таблица 4 Результаты диагностики в 1995 и 2002 г.ASC: носитель асимптоматического здоровья. Пептид. Два пептида с чистотой 90% или более закупали у фирмы BIOSYNTHESIS (Lewisville, TX): HCV-1b сердцевинный белок 35-44 (YLLPRRGPRL (SEQ ID NO:1) способный индуцировать HLS-A2 рестрицированную CTL активность) и HCV-1b NS5A белок 2132-2140 (RYAPACKPL (SEQ ID NO:2),способный индуцировать HLA-A24-рестрицированную CTL активность). В качестве отрицательного контроля использовали пептиды, происходящие из ВИЧ с HLA-A2-связующим мотивом (SLYNTVATL(SEQ ID NO:64 и HLA-A24-связующим мотивом (RYLRDQQLLGI (SEQ ID NO:63. Анализ антитела, реакционноспособного к пептиду. Уровень пептид-специфического IgG измеряли с помощью фермент-связываемого иммуносорбентного анализа (ELISA). Вкратце, каждый пептид растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при -20C. Пептид(PIERCE, Rockford, IL) в качестве химического сшивателя, связывали с ELISA планшетой. Лунки промывали 3 раза смесью 0,05% Твин 20/PBS (PBST). Затем планшету блокировали на протяжении ночи при 4 С с помощью Block Асе (Yukijirushi, Токио, Япония). Образец сыворотки разбавляли 1:100, 1:200 или 1:400 смесью 0,05% Твин 20/Block Ace, и в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку образца. После того как образец инкубировали при 37C в течение 2 ч, планшету промывали 9 раз PBST, и дополнительно инкубировали при 37 С в течение 2 ч с 100 мкл/лунку 1:1000 разбавленного античеловечьего IgG кролика (-цепь специфического) (DAKO Glostrup, Дания). После того как планшету промывали 9 раз, в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку 1:100 разбавленного сопряженного или конъюгированного с антикроличьим IgG пероксидаза хрена-декстранового полимера (En Vision, DAKO), а затем планшету инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. После того как планшету промывали, добавляли 100 мкл/лунку тетраметилбензидинсубстратного раствора (KPL, Guildford. UK), и реакцию прекращали добавлением 1,0 М фосфорной кислоты.- 15009782 Статистика. Статистический анализ осуществляли с использованием 2-теста. Значения Р 0,05 считались статистически значимыми. Перекрестная реакционноспособность, рестрикция HLA и рестрикция генотипа. Проверяли перекрестную реакционноспособность двух антител, реакционноспособным к пептидам,происходящим из HCV-1b. Сыворотки, полученные от 60 HCV пациентов и пациентов, которые не включаются в групповое исследование (CH, n=22, LC, n=21 и HCC, n=17), проверяли на реакционноспособность к пептидам сердцевины 35-44 (С-35) и NS5A 2132-2140 (NS5A-2132). Сыворотки также получали от 24 субъектов с аутоиммунным заболеванием, 17 случаев инфекции HBV и 10 случаев инфекцииHTLV-1. Сыворотки, полученные от 37 HDs, использовали в качестве отрицательного контроля. Уровень пептид-реакционноспособного IgG, содержащегося в серийно разбавленных образцах сыворотки, измеряли с помощью ELISA. Результаты приводили по абсорбции (OD) каждого образца. Показаны характерные результаты OD при разведении сыворотки 100:1. Величину отсечки устанавливали на 0,093(среднее 2 SD OD от HDs). Статистический анализ осуществляли с использованием 2-теста. Значения Р 0,05 считали статистически значимыми. В результате, значительный уровень анти-С-35 IgG обнаруживался у 56 из 60 HCV-положительных пациентов (93,3%), и не было значительной разницы в уровне IgG среди 3 групп (CH, LC и HCC пациентов) (фиг. 23). За исключением HTLV-1 пациентов, сыворотки от различных групп не были положительными для анти-С-35 антитела. В сыворотках 8 из 10 случаев HTLV-1+ субъектов обнаружился низкий, но существенный уровень анти-С-35 IgG. Значительный уровень анти-NS5A-2132 IgG был обнаружен у 45 из 60 пациентов (75%). Уровень IgG был высоким у CH пациентов, промежуточным у LC пациентов и низким у HCC пациентов в 3 группах (р 0,05 против CH) (фиг. 23). Сыворотки от других групп были положительными, что касается анти-NS5A-2132 IgG, в большинстве испытанных случаев. Далее, сыворотки 3 из 37 HDs, что касается анти-NS5 А-2132 IgG, были положительными. Затем у 29 пациентов с заболеванием, связанным с HCV, проверяли корреляцией между HLA-классIA фенотипом и уровнем анти-С-35 IgG или анти-NS5A-2132 IgG. HLA-класс IA фенотип определяли стандартным серологическим методом. 9 пациентов были HLA-A2+, 13 пациентов были А 24+, и остальные 7 пациентов были А 2-А 24-. Уровни анти-С-35 и анти-NS5A-2132 измеряли стандартным методомELISA, и на чертеже показано значение OD каждого пациента при разведении сыворотки 100:1. Независимо от разницы в HLA-класс IA фенотипе, оба антитела обнаруживали у большинства пациентов, инфицированных HCV (фиг. 24). Проверяли также корреляцию между HCV генотипом и уровнем анти-С-35 IgG или анти-NS5A2132 IgG в двойном слепом исследовании у пациентов, инфицированных HCV-1b (n=29), HCV-2a (n=16) и HCV-2b (n=3). Генотип HCV определяли с помощью непосредственного секвенирования HCV в сыворотке пациента. Результаты всех субъектов при разведении 100:1 показаны на фиг. 25. Уровни анти-С-35 и анти-NS5A-2132 измеряли стандартным методом ELISA, и показано значение OD каждого пациента при разведении сыворотки 100:1. Величину отсечки устанавливали на 0,093 (среднее 2 SD OD от HDs). Анти-С-35 антитело обнаруживалось у 26 из 30 пациентов, инфицированных HCV-1b, 15 из 15 пациентов, инфицированных HCV-2a, и 3 из 3 пациентов, инфицированных HCV-2b, соответственно. Аналогично, анти-NS5A-2132 антитело обнаруживали в сыворотке 23 из 30 пациентов, инфицированныхHCV-1b, 10 из 16 пациентов, инфицированных HCV-2a, и 3 из 3 пациентов, инфицированных HCV-2b,соответственно (фиг. 25). Данные результаты указывают на то, что и анти-С-35 антитела, и анти-NS5A2132 антитела обнаруживали у HCV-положительных пациентов независимо от разницы в HLA-класс IA подтипе и в HCV-генотипе. Указанные выше результаты говорят о том, что уровень анти-NS5A-2132 антитела коррелирует с прогнозом индивидуума, инфицированного HCV, но не в случае с анти-С-35 антителом. Затем заново приготавливали сыворотки CH (n=24), LC (n=22), HCC (n=26) и HDs (n=9), и измеряли уровень анти-NS5A-2132 IgG (фиг. 26). Значения среднееSD для CH, LC, HCC и HD групп были 0,510,24, 0,270,20, 0,260,23 и 0,080,07 соответственно. Уровни анти-NS5A-2132 антитела у LC иHCC пациентов были значительно ниже, чем уровень у CH пациентов (р 0,05), но все же выше, чем уHDs. Для того чтобы сравнить данные результаты с результатами, измеренными с помощью стандартного анализа третьего поколения, для всех сывороток измеряли уровень анти-HCV антитела с использованием промышленно доступного набора (анализ третьего поколения, SRL). Уровень представлен экспонентой (левая колонка). Корреляция между анти-HCV уровнем и анти-NS5A-2132 уровнем, представленным экспонентой, показана в правой колонке. Уровни анти-HCV антитела, измеренные с использованием анализа третьего поколения, незначительно различали среди 3 групп (CH: 102,7, LC: 111,4, HCC: 111,1) (фиг. 27). Далее, измеряли HCV РНК уровень для всех сывороток с использованием промышленно доступного набора (SRL, Япония). Уровень HCV РНК HCC пациентов (360269,6) был ниже, чем уровень CH пациентов (610347,3) или LC пациентов (610246,4) (р 0,05) (фиг. 28). Однако не было никакой видимой корреляции между уровнем анти-NS5A антитела и уровнем HCV РНК (фиг. 28).- 16009782 Результаты группового исследования. Для того чтобы дополнительно исследовать корреляцию между анти-NS5A-2132 антителом и прогнозом HCV-положительного пациента при индивидуальном уровне, проверяли сывороточные уровни двух антител в образце от группового исследования, при котором ежегодно с 1990 до 2002 г. подвергались скринингу обитатели, инфицированные HCV. Данное исследование проводили в целом с 66 образцами сыворотки, которые получали от 33 пациентов и собирали от одних и тех же индивидуумов дважды в 1995 и 2002 г. Диагнозами данных 33 пациентов были CH (n=17), LC (n=1), асимптоматический носитель (ASC) (n=4), с прошлой историей HCV заражения (индивидуум, самопроизвольно выздоровевший)(n=11) в 1995 г., и CH (n=13), LC (n=4), HCC (n=2), асимптоматический носитель (ASC) (n=1), и прошлая история HCV заражения (n=13) в 2002 г. Другими словами, за период семи лет прогрессирование заболевания не наблюдалось у 26 пациентов, в то время как у остальных 7 пациентов прогресс наблюдался(табл. 4). На фиг. 29 показаны значения OD анти-С-35 антитела и анти-NS5A-2132 IgG у каждого пациента, измеренные при разведении сыворотки 100:1 в 1995 и 2002 г. Как и ожидалось, у большинства из 33 случаев уровни анти-С-35 антитела, измеренные в 1995 и 2002 г. были почти равными, несмотря на условия болезни. В противоположность этому уровень анти-NS5A антитела, измеренный в 1995 г., снижался по данным измерения в 2002 г. у всех 7 пациентов, заболевания которых прогрессировали, тогда как данные значения были почти равными значениям, измеренным в 2002 г., у большинства из 25 случаев, у которых болезнь не прогрессировала. Среднее значениеSD анти-NS5A-2132 антитела в сыворотке 7 пациентов, болезнь которых прогрессировала, измеренное в 1995 г. (0,670,13), было значительно выше, чем данное значение (0,270,11), измеренное в 2002 г. (р 0,05). Затем 33 субъекта подразделяли на 5 групп (CH, LC, HCC, пациент в прошлом с медицинской историей заражения HCV (выздоровевший индивидуум), и ASC) и наносили на график (фиг. 30) уровни двух антител при разбавлении сыворотки 100:1 в 2002 г. Статистический анализ осуществляли с использованием 2-испытания. Считали, что величины р 0,05 являются статистически значимыми. Уровень антитела анти-С-35 был высоким у любого из CH, LC и HCC пациентов, но он становился очень низким или недетектируемым у выздоровевших индивидуумов. С другой стороны, уровень антитела анти-NS5A2132 был высоким у пациентов CH, выздоровевшего индивидуума и ASC, промежуточным у LC и наиболее низким у пациентов HCC (р 0,05 против CH). Пример 4. Обнаружение IgG реакционноспособного к пептиду HCV в сыворотках HLA-A24+ HCVинфицированных пациентов с использованием анализа Luminex. Уровень IgG реакционноспособного к пептиду HCV в сыворотках HLA-A24+ HCVинфицированных пациентов измеряли таким же образом, как в примере 1, с использованием анализаLuminex, который считается более чувствительным, чем метод ELISA. Соединение пептида с микрошариками. Каждый пептид соединяли с микрошариками (производимыми фирмой Luminex Corporation, xMAPMultu-Analyte COOH шарики), которые кодировались с помощью классификационного кода на содержание каждого флуоресцентного красителя (называемые ниже кодированными цветом) согласно инструкции производителя. 100 мкл в неподготовленных кодированных цветом микрошариков помещали в каждую лунку фильтровальной планшеты и аспирировали, а затем промывали дважды промывочным буфером (забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) (pH 7,40,1), Твином (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о, и каждую лунку аспирировали в то же самое время. Затем добавляли 50 мкл 0,1MMES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) буфера (pH 7,0), и в каждую лунку добавляли 10 мкл гидрохлорида EDC (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (1 мг/мл/0,1 М MES буфера (pH 7,0. Несколько сот микролитров пептида (1 мг/мл, 0,1 М MES буфер, pH 7,0) смешивали с промытыми микрошариками в каждой лунке. После того как пептид и смешанные микрошарики подвергали реакции в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре, в каждую лунку добавляли 10 мкл EDC(1 мг/мл/0,1 М MES буфер (pH 7,0, и смесь оставляли реагировать в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре. Данный процесс повторяли дважды. После того как избыточный раствор аспирировали, в каждую лунку добавляли 100 мкл 1M Tris-HCl буфера (pH 7,0), и смесь оставляли реагировать в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем шарики в каждой лунке промывали 3 раза промывочным буфером, как описано выше, и собирали в растворе для хранения, содержащем 0,05% азида натрия в Block Асе (зарегистрированная торговая марка). Получение смеси микрошариков. Микрошарики для каждой лунки приготавливаются путем помещения раствора шариков, полученного путем связывания пептида с кодированными цветом микрошариками, таким образом, чтобы в каждой лунке фильтровальной планшеты содержалось около 5000 микрошариков (каждая лунка содержит около 1 мкл шариков одного типа). Смесь шариков приготавливали путем смешения равного количества десяти типов микрошариков, полученных таким же образом, и разбавления смеси с упомянутым выше промывочным буфером (PBS, ТВИН (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о так, чтобы дать общее количество около 25 мкл.- 17009782 Получение образца. В данном исследовании использовали сыворотку. Получали 100 мкл сыворотки каждого разведения путем разбавления сыворотки при соотношении 1:100 до 1:1000 реакционным буфером PBS (pH 7,40/1),Твином (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о), и бычьим сывороточным альбумином (BSA) 10 мг/мл. Анализ антипептидного антитела. В качестве вторичного антитела использовали биотинилированный козий античеловеческий IgG (цепь специфический), разбавленный реакционным буфером. Стрептавидин (1 мг/мл), меченный PE (фикоэритрином) (SRPE) разводили до 20 мкл (1/50 разведение) упомянутым выше реакционным буфером и использовали в качестве флуоресцентного меченного красителем стрептавидина. В каждую лунку фильтровальной планшеты помещали 100 мкл промывочного буфера, а затем удаляли аспирированием. Данную стадию промывки осуществляли два раза. Затем, 96-луночную фильтровальную планшету, содержащую 25 мкл вышеупомянутой смеси шариков в каждой лунке, промывали дважды промывочным буфером. После промывки во все лунки добавляли 100 мкл образца. Фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 2 ч при комнатной температуре и аспирировали. Затем в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированного вторичного антитела, т.е. биотинилированного козьего античеловеческого IgG (-цепь специфического), и фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. После аспирации в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза. Впоследствии в каждую лунку добавляли 100 мкл SRPE, и фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. После аспирации в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза. После этого в каждую лунку добавляли 100 мкл промывочного буфера и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в течение 2-3 мин, а затем 50 мкл образца, полученного таким образом, анализировали с помощью реометрической системы флуоресценции. Результаты показаны на фиг. 31 и 32 и в табл. 5. Таблица 5 Пример 5. Лечение HCV инфекции с использованием пептидной вакцины, происходящей из вируса гепатита С. Антивирусный эффект вакцины, включающей пептид, происходящий из вируса гепатита С, настоящего изобретения проверяли на HCV-инфицированных HLA-A2+ или HLA-A24+ субъектах. Всех субъектов инфицировали вирусом HCV-1b и они не показывали никакой ответной реакции на лечение интерфероном и рибавирином. Пептиды, получаемые из вируса гепатита С, С-35, NS5A-2132, Е 2-488,Е 1-213 и NS3-1081, синтезировали, очищали и хранили в виде лиофилизированного порошка согласно(1 мг/10-25 мкл), а Е 1-213 растворяли в 7% растворе бикарбоната натрия для инъекций (Meylon)(1 мг/15 мкл). Каждый раствор разбавляли физиологическим солевым раствором для инъекций(1-2 мг/мл) и стерилизовали с помощью фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Каждый из получающихся растворов смешивали с равным количеством адъюванта (Montanide ISA-51), давая эмульгируемые инъекционные растворы. Инъекционный раствор С-35 вводили 3 субъектам из HLA-A2+, а инъекционный раствор NS5A-2132 вводили 5 субъектам из группы HLA-A24+. Пептид вводили каждые две недели путем инъецирования эмульсии, содержащей 0,3 мг пептида на дозу, в латеральную область. Уровень HCV РНК и величины GOT, GPT, -GTP и AFP контролировали непрерывно. Результаты показаны на фиг. 33 и фиг. 34. Как видно из этих чертежей, уровень HCV РНК заметно снижался после введения вакцины, инициируемого у большинства анализируемых субъектов, демонстрируя, что пептиды настоящего изобретения являются эффективными в качестве анти-HCV вакцины.- 18009782 Промышленная применимость Пептид, получаемый из вируса гепатита С, согласно изобретению содержит в своей последовательности HLA-связывающий мотив. Он распознается антителом, реакционноспособным к вирусу гепатита С, а также имеет свойство быть распознаваемым HLA-A2-или HLA-A24-специфичными цитотоксическими Т-клетками. Соответственно, пептид, получаемый из вируса гепатита С, согласно изобретению мог бы быть эффективной вакциной от заболеваний, относимых за счет HCV инфекции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептид, происходящий из вируса гепатита С, содержащий HLA-связывающий мотив в своей последовательности и распознаваемый антителом, обнаруживаемым у пациента с инфекцией вируса гепатита С, где пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной любой из последовательностей SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 16, 20 и 38. 2. Пептид, происходящий из вируса гепатита С по п.1, отличающийся тем, что пептид дополнительно обладает свойством быть распознаваемым HLA-A2- или HLA-A24-специфичными цитотоксическими Т-клетками. 3. Нуклеотид, кодирующий пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2,или нуклеотид, имеющий последовательность, комплементарную с ним. 4. Антитело или вещество с антитело-подобной активностью, которое распознает пептид, происходящий из вируса гепатита С, заявленный в п.1 или 2. 5. Вектор, включающий вышеупомянутый нуклеотид по п.3. 6. Способ индуцирования цитотоксических Т-клеток путем применения пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2. 7. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2. 8. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием нуклеотида по п.3. 9. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием антитела или вещества с антителоподобной активностью по п.4. 10. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2. 11. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3. 12. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4. 13. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием пептида,происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2. 14. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3. 15. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента нуклеотид по п.3. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4. 19. Фармацевтическая композиция по пп.16, 17 или 18, отличающаяся тем, что она представляет вакцину вируса гепатита С. 20. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2. 21. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3. 22. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4. 23. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2. 24. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя нуклеотид по п.3. 25. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/53, A61K 39/395, C12Q 1/68, C07K 16/18, G01N 33/50, A61P 31/12, C07K 7/08, A61K 35/76, C12N 15/09

Метки: происходящий, гепатита, вируса, пептид

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-9782-peptid-proishodyashhijj-iz-virusa-gepatita-s.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Пептид, происходящий из вируса гепатита с</a>

Похожие патенты