Модуляторы связанного с рецептором tnf фактора (traf), их получение и применение.

1 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим белки, способные связываться с TRAF2, белкам, кодируемым ими, и использованию этих белков и последовательностей ДНК в лечении или предупреждении патологического состояния, связанного с индукцией NF-В или с любой иной активностью, опосредованной TRAF2 или другими молекулами, с которыми связывается этот белок. Уровень техники Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли/фактора роста нерва (TNF/NGF) определяется структурной гомологией между внеклеточными доменами его членов (Bazan,1993; Beutler and van Huffel, 1994; Smith et al.,1994). Кроме двух рецепторов, TNF-рецептора р 55 и Fas/AP01, различные члены этого семейства рецепторов не обнаруживают явного сходства структуры в их внутриклеточных доменах. Тем не менее, имеется большое сходство в функции между этими рецепторами, указывающее, что они имеют общие пути передачи сигналов. Одним примером такого сходства является способность некоторых рецепторов семейства TNF/NGF активировать фактор транскрипции NF-В. Эту общую способность приписывали способности цитоплазматического белка,который активирует NF-В, связанного с рецептором TNF фактора 2 (TRAF2), связываться со структурно непохожими внутриклеточными доменами некоторых рецепторов семействаTNF/NGF. Посредством каких механизмов действует в действительности TRAF2 и как координируется его чувствительность к различным рецепторам, с которыми он связывается, неизвестно.TRAF2 является членом описанного недавно семейства белков, называемых TRAF,которое включает в себя несколько белков,идентифицированных, например, как TRAF1,TRAF2 (Rothe, M., Wong, s.c., Henzel, W.J. andGoeddel, D. (1994) Cell 78:681-692; PCT published application WO 95/33051), TRAF3 (Cheng,G. et al. (1995 и TRAF6 (см. Cao et al., 1996a). Все белки, принадлежащие к семейству TRAF,имеют высокую степень идентичности аминокислот в их С-концевых доменах, тогда как ихN-концевые домены могут не быть родственными. Как показано в схематической иллюстрацииTRAF2 (фиг. 1), эта молекула содержит мотивTFIIIA-подобных мотива "цинковых пальцев" при их С-концевой зоне. С-концевая половина молекулы включает район, известный как"TRAF-домен", содержащий потенциальный район лейциновой молнии, расположенный между аминокислотами 264-358 (называемый NTRAF), и другую часть в направлении карбокси 004309 2 конца домена между аминокислотами 359-501(называемую C-TRAF), которая ответствена за связывание TRAF с рецепторами и с другими молекулами TRAF с образованием гомо- или гетеродимеров. Активация фактора транскрипции NF-В является одним из проявлений каскада передачи сигнала, инициируемого некоторыми из рецепторов TNF/NGF и опосредованного (медиируемого) TRAF2. NF-В включает члены семейства образующих димеры белков с гомологией относительно Rel-онкогена, которые, в их димерной форме, действуют как факторы транскрипции. Эти факторы являются широко распространенными и участвуют в регуляции экспрессии многочисленных генов. Хотя первоначально идентифицированный как фактор, который конститутивно присутствует в В-клетках на стадии экспрессии легкой цепи Igk, NF-В известен прежде всего из-за его действия в качестве индуцируемого активатора транскрипции. В большинстве известных случаев NF-В ведет себя как первичный фактор, а именно, индукция его активности является скорее активацией предсуществующих молекул, присутствующих в клетке в их неактивной форме, чем синтезом его de novo, которая, в свою очередь, основана на индуцируемых факторах транскрипции, которые включают ген NF-В. Эффекты NF-В являются в высокой степени плейотропными. Большинство этих многочисленных эффектов имеют общие черты, заключающиеся в том, что они быстро индуцируются в ответ на внеклеточный стимул. Большинство активирующих NF-В агентов являются индукторами иммунной защиты, включающими в себя компоненты вирусов и бактерий,цитокины, регулирующие иммунный ответ, УФсвет и другие. Поэтому многие гены, регулируемые NF-В, способствуют иммунной защитеand Henkel, 1994, обзоры). Одной из главных особенностей NF-Врегуляции является то, что этот фактор может существовать в цитоплазматической не связывающей ДНК форме, которая может индуцироваться для перемещения в ядро, связывания ДНК и активации транскрипции. Эта двойственная форма белков NF-В регулируется семейством белков I-В, которые содержат повторы домена, который был первоначально замечен в белке эритроцитов анкирине (Gilmore andMorin, 1993). В нестимулированной форме димер NF-В существует в связи с молекулой I-В В, которая заставляет его находиться в цитоплазме и препятствует его взаимодействию с последовательностью ДНК, связывающей NFВ, и активации транскрипции. Диссоциация IВ от димера NF-В является решающей стадией его активации многими из индуцирующих его агентов (DiDonato et al., 1995). Знание меха 3 низмов, которые участвуют в этой регуляции,все еще является ограниченным. Также очень мало понятен путь, по которому определяется специфичность клеток в плане чувствительности к различным индуцирующим NF-В агентам. Одним из наиболее сильнодействующих индуцирующих агентов NF-В является цитокин фактор некроза опухолей (TNF). Существуют два различных TNF-рецептора, рецепторы р 55 и р 75. Уровни их экспрессии варьируют независимо среди различных клеток (Vandenabeele et al., 1995). р 75-рецептор отвесает преимущественно на связанную с клеткой формуTNF (TNF экспрессируется как в виде бетатрансмембранного белка, так и в виде растворимого белка), тогда как р 55-рецептор отвечает так же эффективно на молекулы растворимогоTNF (Grell et al., 1995). Внутриклеточные домены этих двух рецепторов структурно неродственны и связывают различные цитоплазматические белки. Тем не менее, по меньшей мере часть эффектов TNF, в том числе цитоцидное действие TNF и индукция NF-В, могут индуцироваться обоими рецепторами. Эта особенность является клеткоспецифической. Рецептор р 55 способен индуцировать цитоцидный эффект или активацию NF-В во всех клетках, которые обнаруживают такие эффекты в ответ на TNF.p75-R может иметь такие эффекты только в некоторых клетках. Другие, хотя и экспрессирующие высокие уровни p75-R, обнаруживают индукцию этих эффектов только в ответ на стимуляцию p55-R (Vandenabeele et al., 1995). Кроме TNF-рецепторов, различные другие рецепторы семейства TNF/NGF: CD30 (McDonald et al.,1995), CD40 (Berberich et al., 1994; LalmanachGirard et al., 1993), бета-рецептор лимфотоксина и, в немногочисленных типах клеток, Fas/APO1(Rensing-Ehl et al., 1995), также способны индуцировать активацию NF-В. Рецептор IL-1 типаI, также эффективно запускающий активациюNF-В, имеет также большинство эффектовTNF-рецепторов, несмотря на тот факт, что он не имеет структурного сходства с ними. Активация NF-В при запуске этих различных рецепторов является результатом фосфорилирования связанных с ним молекул I-В. Это фосфорилирование действует на I-В до деградации, которая, наиболее вероятно, происходит в протеасоме. Природа киназы, которая фосфорилирует I-В, и ее механизм активации при запуске рецептором все еще неизвестны. Однако, в последние два года были получены некоторые знания в отношении идентичности трех связанных с рецептором белков, которые,по-видимому, принимают участие в инициации фосфорилирования (см. иллюстрацию в виде диаграмм на фиг. 2 а и 6). По-видимому, белок,названный TRAF2, исходно клонированный D. рает центральную роль в активации NF-В различными рецепторами семейства TNF/NGF. Этот белок, который при экспрессии при высоких уровнях сам может запускать активациюNF-В, связывается с активированным TNFрецептором р 75 (Rothe et al., 1994), бетарецептором лимфотоксина (Mosialos et al., 1995),CD40 (Rothe et al., 1995a) и CD-30 (неопубликованные данные) и медиирует индукцию ими NFВ. TRAF2 не связывается с TNF-рецептором р 55 и с Fas/APO1, но он может связываться со связанным с рецептором р 55 белком, названнымTRADD, a TRADD обладает способностью связываться со связанным с Fas/APO1 белок названнымMORT-1 (или FADD - см. Boldin et al., 1995b и 1996). Другой взаимодействующий с рецептором белок, названный RIP (см. Stanger et al.,1995), также способен взаимодействовать сRIP связывали с индукцией клеточной цитотоксичности (смерти клеток), его способность взаимодействовать с TRAF2 подразумевает также его участие в активации NF-В и он, кроме того, может также участвовать в увеличении взаимодействия между Fas/APO1, MORT-1,TNF-рецептором р 55 и TRADD с TRAF2 в пути,ведущем к активации NF-В. Эти связи, повидимому, позволяют TNF-рецептору р 55 иal., 1995; Boldin et al., 1995; Chinnalyan et al.,1995; Varfolomeev et al., 1996; Hsu et al., 1996). Запуск активации NF-В рецептором IL-1 имеет место независимо от TRAF2 и может происходить с участием недавно клонированной связанной с рецептором IL-1 протеинкиназы, на ванной IRAK (Croston et al., 1995). Неясно, по какому механизму действуетal., 1995b). Однако, информация об этих молекулах не дает ключа к пути, по которомуTRAF2, который сам не обладает никакой ферментативной активностью, запускает фосфорилирование I-В. Пока нет также информации о механизмах, которые определяют клеткоспецифический характер активации TRAF2 различными рецепторами, наблюдаемый для индукцииNF-В двумя TNF-рецепторами. Кроме вышеупомянутого, следует отметить, что из различных белков TRAF, TRAF2 связывается с р 55 (CD120a) и р 75 (CD120b)TNF-рецепторами, а также с несколькими другими рецепторами семейства TNF/NGF, либо непосредственно, либо опосредованно через другие адапторные белки, как отмечалось выше,например, со ссылкой на рецептор Fas/APO1 и адапторные белки MORT-1, TRADD и RIP. В таком (связанном) виде TRAF2 является решающим для активации NF-В (см. также Wal 5lach, 1996). Однако TRAF3 фактически ингибирует активацию NF-В некоторыми рецепторами семейства TNF/NGF (см. Rothe et al., 1995a),в то время как TRAF6 необходим для индукцииNF-В и ее значения в поддержании жизнеспособности клеток, многочисленные внутриклеточные пути, участвующие в этой активации, до сих пор полностью не выяснены, например, как непосредственно или опосредованно участвуют в них различные белки TRAF. Кроме того, как теперь известно, в отношении различных членов семейства рецепторовTNF/NGF и связанных с ними внутриклеточных путей передачи сигнала, включающих различные адапторные, медиаторные/модуляторные белки (см. краткие обзоры и ссылки, например,в ожидающих одновременного рассмотрения и совместных заявках Israel Patent Application Nos. 114615, 114986, 115319, 116588), TNF и лигандFas/APO1, например, могут оказывать благоприятные и неблагоприятные действия на клетки. Например, TNF способствует защите организма против опухолей и инфекционных агентов и способствует выздоровлению при повреждении путем индуцирования гибели опухолевых клеток и клеток, инфицированных вирусом,увеличения антибактериальных активностей гранулоцитов, и, следовательно, в этих случаях,индуцируемая TNF гибель клеток является желательной. Однако, избыток TNF может быть неблагоприятным, и известно, что сам TNF играет важную патогенетическую роль в ряде заболеваний, таких как септический шок, анорексия, ревматические заболевания, воспалительные реакции и реакции "трансплантат против хозяина". В таких случаях TNF-индуцируемая гибель клеток является нежелательной. ЛигандFas/APO1, например, также имеет нежелательные и неблагоприятные эффекты. Этот лигандFas/APO1 индуцирует через его рецептор гибель аутореактивных Т-клеток во время созревания Т-клеток, т.е. гибель Т-клеток, которые узнают аутоантигены, во время их развития, и тем самым препятствуют аутоиммунным заболеваниям. Кроме того, различные злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки несут на их поверхности рецептор Fas/APO1 и, следовательно, могут быть разрушены активацией этого рецептора его лигандом или специфическими к нему антителами, и, следовательно, активацией внутриклеточных путей гибели клеток (апоптоза), медиируемых этим рецептором. Однако рецептор Fas/APO1 может медиировать неблагоприятные действия, например, нерегулируемую гибель ткани, которая наблюдается при определенных заболеваниях, таких как острый гепатит,сопровождающийся разрушением клеток печени. 6 В связи с вышесказанным, а именно, с тем,что рецепторы семейства TNF/NGF могут индуцировать пути гибели клеток, с одной стороны,и могут индуцировать пути выживания клеток(через индукцию NF-В), с другой стороны, повидимому, существует тонкое равновесие внутри клетки между этими противоположными путями. Например, когда желательно достижение максимального разрушения раковых клеток или других инфицированных или патологических клеток, было бы желательно иметь TNF и/или лиганд Fas/APO1, индуцирующий только путь гибели клеток, без индукции NF-В. Напротив,когда желательно защитить клетки, например,при воспалении, реакциях "трансплантат против хозяина", остром гепатите, было бы желательно ингибировать индукцию гибели клеток TNF и/или лигандом Fas/APO1 и, вместо этого, усилить их индукцию NF-В. Подобным образом,при некоторых патологических обстоятельствах было бы желательно ингибировать внутриклеточные пути передачи сигнала, опосредованныеTNF-рецептором р 75 и рецептором IL-1, тогда как в других обстоятельствах было бы желательно усиление этих внутриклеточных путей. Сущность изобретения Целью данного изобретения является обеспечение новых белков, в том числе всех их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, которые способны связываться с белками,связанными с фактором некроза опухолей(TRAF). Поскольку белки TRAF участвуют в модулировании или медиировании активации фактора транскрипции NF-В, который инициируется некоторыми рецепторами TNF/NGF, а также другими, как отмечено выше, новые белки данного изобретения путем связывания с белками TRAF способны, следовательно, к влиянию (модулированию или медиированию) на внутриклеточные процессы передачи сигнала, инициируемые различными лигандами (например, TNF, лигандом FAS и другими), связывающимися с их рецепторами, такому как, например, их модулирование/медиирование активации NF-В через прямое или опосредованное взаимодействие с белками TRAF. Таким образом, новые белки данного изобретения представляют собой прямые модуляторы/медиаторы внутриклеточной активности белков TRAF (например, индукции активацииNF-В TRAF2 и TRAF6 и ингибирования активации NF-В TRAF3). Новые белки данного изобретения являются также непрямыми модуляторами/медиаторами внутриклеточной биологической активности многочисленных других белков, которые способны взаимодействовать с белкамиTRAF прямо или опосредованно (например,рецептора FAS/APO1, TNF-рецептора р 55, TNFрецептора р 75, IL-1-рецептора и связанных с 7 ними белков, таких как, например, MORT-1,TRADD, RIP). Другой целью данного изобретения является обеспечение антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ) по отношению к новым TRAF-связывающим белкам, в том числе к их изоформам, аналогам, фрагментам и производным, которые могут быть использованы для ингибирования процесса передачи сигнала или,более конкретно, для ингибирования активацииNF-В и его участия в процессах выживания клеток, когда это желательно. Подобным образом, когда TRAF-связывающие белки данного изобретения или белок TRAF, с которым они связаны (например, TRAF3) сами являются ингибирующими для активации NF-В, целью является обеспечение антагонистов к этим TRAFсвязывающим белкам для активации процесса передачи сигнала или, более конкретно, для блокирования ингибирования активации NF-В и, следовательно, вызывания усиленной активации NF-В, когда это желательно. Следующей целью данного изобретения является использование вышеупомянутых новых TRAF-связывающих белков, их изоформ,аналогов, фрагментов и производных, для выделения и характеристики дополнительных белков или факторов, которые могут участвовать в регуляции активности белка TRAF и/или вышеупомянутой рецепторной активности, например,других белков, которые могут связываться с белками TRAF и влиять на их активность, и/или для выделения и идентификации других рецепторов или других клеточных белков далее по ходу или ранее по ходу процесса (процессов) передачи сигнала, с которыми эти новые белки,аналоги, фрагменты и производные связываются и, следовательно, в функционировании которых они также участвуют. Еще одной целью данного изобретения является обеспечение ингибиторов, которые могут быть введены в клетки для связывания или взаимодействия с новыми TRAF-связывающими белками и их возможными изоформами, причем эти ингибиторы могут действовать путем ингибирования связанной с белком TRAF активности, например, в активации NF-В и, следовательно, если желательно, путем ингибирования активации NF-В; или которые могут действовать путем ингибирования ингибирующей связанной с TRAF активности (например, TRAF3) в активации NF-В и, следовательно, путем усиления активации NF-В. Кроме того, целью данного изобретения является применение вышеупомянутых новыхTRAF-связывающих белков, их изоформ и аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения к ним поликлональных и/или моноклональных антител. Антитела,в свою очередь, могут быть использованы, на 004309 8 пример, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии. Кроме того, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей, например, для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием клеточных эффектов, медиируемых непосредственно белками TRAF или опосредованных TNFрецептором р 55, рецептором FAS/APO1 или другими родственными рецепторами и их ассоциированными клеточными белками (например,MORT-1, TRADD, RIP), которые действуют прямо или опосредованно, модулируя/медиируя внутриклеточные процессы через взаимодействие с белками TRAF. Следующей целью данного изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих вышеупомянутые новые белки TRAF, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтических композиций, содержащих вышеупомянутые антитела или другие антагонисты. В соответствии с данным изобретением был выделен ряд новых TRAF-связывающих белков, в частности, ТRАF2-связывающих белков. Эти ТRАF2-связывающие белки имеют высокую специфичность связывания с TRAF2 (см. примеры ниже) и, следовательно, являются модуляторами или медиаторами внутриклеточной активности TRAF2. TRAF2 участвует в модулировании или медиировании по меньшей мере одного внутриклеточного пути передачи сигнала, являющегося путем, связанным с выживанием клеток или с жизнеспособностью клеток, в котором TRAF2 прямо участвует в активацииNF-В, который играет центральную роль в выживании клеток. Фактически, один из этих новых белков, называемый NIK ("индуцирующаяNF-В киназа"), связывается с TRAF2 и стимулирует активность NF-В. NIK является киназой, обладающей сходством последовательности с несколькими киназами МАРКК (см. ниже). Кроме того, TRAF2, будучи способным взаимодействовать прямо или опосредованно с вышеупомянутыми TNF-рецептором р 55, TNFрецептором р 75, рецепторами FAS/APO1 и их ассоциированными белками MORT-1, TRADD иRIP, является также медиатором или модулятором индукции или активации активности NFВ, связанной с этими рецепторами. Следовательно, TRAF2 является модулятором/медиатором путей выживания клеток (в противоположность путям гибели клеток), медиируемых этими рецепторами и их ассоциированными белками, и степень взаимодействия между этими рецепторами и/или белками с TRAF2, как таковая, является важным фактором в результирующей активности этих рецепторов (при активации их лигандами), а именно, в том, выживут или погибнут данные клетки. В соответствии с 9 этим, белки данного изобретения, например,NIK, играют ключевую роль во взаимодействииTRAF2 и других белков/рецепторов, с которыми взаимодействует TRAF2, так как белки, такие как NIK, путем специфического связывания сTRAF2 будут модулировать его активность и/или будут иметь модулированную активность в результате взаимодействия с TRAF2.TRAF-связывающие белки, такие как, например, TRAF2-связывающие белки, в том числе NIK, были выделены и клонированы с использованием двухгибридной системы, частично или полностью секвенированы и охарактеризованы и, как подробно описано ниже, являются,по-видимому,высокоспецифическимиTRAF2-связывающими белками и, следовательно, специфическими модуляторами/медиаторами TRAF2. В применении далее ко всему описанию,под активностью белка TRAF, например, под активностью TRAF2, подразумевают его активность в модулировании/медиировании пути выживания клеток, в частности, относящуюся к индукции/активации NF-В. Подобным образом, в применении ко всему описанию, под активностью TRAF-связывающих белков, в частности, под активностью ТRАF2-связывающего белка, имеют в виду модулирование/медиирование ими активности TRAF-, в частности,активности TRAF2, вследствие их специфического связывания с TRAF белками, в частности,с белком TRAF2, причем это модулирование/медиирование включает в себя модулирование/медиирование путей клеточного выживания, в частности, относящееся к активации/индукции NF-В, в которой белки TRAF, в частности, TRAF2, участвуют прямо или опосредованно, и TRAF- или TRAF2-связывающий белок как таковой может рассматриваться как опосредованный модулятор/медиатор всех вышеупомянутых белков и, возможно, других белков, которые участвуют в клеточном выживании, в частности, в активации/индукции NF-В,и с которыми TRAF2 (или другие белки) связываются или с которыми TRAF2 (или другие белки) взаимодействуют прямо или опосредованно. Поэтому, данное изобретение обеспечивает последовательность ДНК, кодирующую белок, способный связываться с молекулой связанного с рецептором фактора некроза опухолей(TRAF). Один вариант последовательности ДНК данного изобретения представляет собой последовательность, кодирующую белок, способный связываться с TRAF2. Другой вариант последовательности ДНК данного изобретения представляет собой последовательность, кодирующую белок, способный связываться по меньшей мере с аминокислотными остатками 222-501 аминокислотной последовательности TRAF2. 10 Еще один вариант последовательности ДНК данного изобретения включает:(a) последовательность кДНК указанного здесь клона 9, содержащую нуклеотидную последовательность, изображенную на фиг. 3 а;(b) последовательность кДНК указанного здесь клона 10, содержащую нуклеотидную последовательность, изображенную на фиг. 4;(c) последовательность кДНК указанного здесь клона 15, содержащую нуклеотидную последовательность, изображенную на фиг. 5 а;(d) фрагмент последовательности (а)-(с),который кодирует биологически активный белок, способный связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501(e) последовательность ДНК, способную гибридизоваться с последовательностью (a)-(d) при умеренно строгих условиях, кодирующую биологически активный белок, способный связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 TRAF2; и(f) последовательность ДНК, вырожденную в результате вырожденности генетического кода относительно последовательностей ДНК,определенных в (а)-(е), которая кодирует биологически активный белок, способный связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 TRAF2. Другие варианты вышеупомянутой последовательности ДНК данного изобретения включают: последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, содержащихся в указанных здесь клонах кДНК 9 и 15; последовательность ДНК, кодирующую белок, который также модулирует активностьNF-В; и последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, содержащихся в указанном здесь клоне кДНК 10. Дополнительным предпочтительным вариантом вышеупомянутых последовательностей ДНК данного изобретения является последовательность ДНК, содержащая последовательность, кодирующую белок NIK ("индуцирующую NF-В киназу"). Варианты вышеупомянутой последовательности ДНК данного изобретения, кодирующей белок NIK, включают:(i) последовательность ДНК, кодирующую белок NIK, его изоформы, фрагменты или аналоги, причем NIK, его изоформы, фрагменты или аналоги способны связываться с TRAF2 и способны модулировать активность NF-В;(ii) последовательность ДНК по п.(i) выше,выбранная из группы, состоящей из:(a) последовательности кДНК, полученной из кодирующего района нативного белка NIK; 11 умеренно строгих условиях и кодирующих биологически активный NIK;(c) последовательностей ДНК, которые являются вырожденными вследствие вырожденности генетического кода относительно последовательностей, определенных в (а) и (b) и которые кодируют биологически активный белок(iii) последовательность ДНК по (i) или(ii), содержащую по меньшей мере часть последовательности, изображенной на фиг. 6, и кодирующую по меньшей мере один активный белокNIK, изоформу, аналог или фрагмент NIK;(iv) последовательность ДНК по (iii), кодирующую белок NIK, изоформу, аналог или фрагмент NIK, имеющий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности,изображенной на фиг. 6. В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает белки или полипептиды, кодируемые вышеупомянутыми кодирующими последовательностями ДНК данного изобретения,изоформы, аналоги, фрагменты и производные этих белков и полипептидов, при условии, что они способны связываться с TRAF2, предпочтительно по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501 TRAF2. Варианты этих белков/полипептидов и их изоформ, аналогов, фрагментов и производных согласно данному изобретению включают:(a) белок, являющийся белком, кодируемым указанным здесь клоном 10;(b) белок, его изоформы, фрагменты, аналоги и производные, являющиеся белком NIK,его изоформами, аналогами, фрагментами и производными, кодируемыми вышеупомянутыми последовательностями ДНК, кодирующими этот белок NIK, его изоформы, аналоги, фрагменты и производные иNIK, его изоформами, аналогами, фрагментами и производными, кодируемыми вышеупомянутыми последовательностями ДНК, кодирующими этот белок NIK, его изоформы, аналоги,фрагменты и производные, причем этот белок,изоформы, фрагменты и производные имеют по меньшей мере часть аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6. Еще в одном аспекте, данное изобретение обеспечивает вектор, содержащий любую из вышеупомянутых последовательностей ДНК данного изобретения, которые способны экспрессироваться в клетках-хозяевах, выбранных из прокариотических и эукариотических клеток; и трансформированные прокариотические и эукариотические клетки, содержащие этот вектор. Данное изобретение обеспечивает также способ получения белка, изоформы, аналога,фрагмента или производного, кодируемых вышеупомянутыми последовательностями ДНК в 12 соответствии с данным изобретением, который предусматривает выращивание вышеупомянутых трансформированных клеток-хозяев в условиях, пригодных для экспрессии этого белка,изоформ, аналогов, фрагментов или производных, выполнение пост-трансляционной модификации, если необходимо, с получением этого белка, изоформ, аналогов, фрагментов или производных и выделение экспрессированного белка, изоформ, аналогов, фрагментов или производных. В следующем аспекте, данное изобретение обеспечивает антитела или их активные фрагменты или производные, специфические дляTRAF-связывающих белков, аналогов, изоформ,фрагментов или производных или специфические для белка, изоформы, аналога, фрагмента или производного NIK, упомянутых выше. В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает следующие способы скрининга:(i) способ скрининга лиганда, способного связываться с белком данного изобретения,описанным выше, в том числе с его изоформами, аналогами, фрагментами или производными, предусматривающий контактирование матрикса аффинной хроматографии, к которому присоединен этот белок, изоформа, аналог,фрагмент или производное, с клеточным экстрактом, в результате чего этот лиганд связывается с матриксом, и элюцию, выделение и анализ этого лиганда.(ii) способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с белком, изоформой, аналогом, фрагментом или производным данного изобретения,упомянутыми выше, предусматривающий применение дрожжевого двухгибридного способа, в котором последовательность, кодирующая этот белок, изоформу, аналог, производное или фрагмент, несет один гибридный вектор, а последовательности из библиотеки кДНК или геномной ДНК несут второй гибридный вектор,трансформацию дрожжевых клеток-хозяев этими векторами, выделение позитивно трансформированных клеток и экстракцию второго гибридного вектора для получения последовательности, кодирующей этот лиганд. Также обеспечен способ выделения и идентификации белков, изоформ, аналогов,фрагментов в соответствии с данным изобретением, упомянутых выше, способных связываться непосредственно с TRAF2, предусматривающий применение дрожжевой двухгибридной процедуры, в которой последовательность, кодирующая TRAF2, несет один гибридный вектор, а последовательность из библиотеки кДНК или геномной ДНК несет второй гибридный вектор, причем эти векторы затем используют для трансформации дрожжевых клеток-хозяев и позитивно трансформированные клетки выделяют с последующей экстракцией второго гибридного вектора для получения последователь 13 ности, кодирующей белок, который связывается с TRAF2. Еще в одном варианте данного изобретения обеспечен способ модулирования или медиирования в клетках активности NF-В или любой другой внутриклеточной активности передачи сигнала, модулируемой или медиируемой TRAF2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, изоформа, аналог,фрагмент или производное данного изобретения, причем этот способ предусматривает обработку этих клеток введением в клетки одного или нескольких белков, их изоформ, аналогов,фрагментов или производных в форме, пригодной для внутриклеточного введения, или введением в эти клетки последовательности ДНК,кодирующей один или несколько белков, их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, в форме пригодного вектора, несущего эту последовательность, причем этот вектор способен осуществлять введение этой последовательности в клетки таким образом, что эта последовательность экспрессируется в этих клетках. Варианты вышеописанного способа модулирования/медиирования в клетках активностиNF-В или любой другой внутриклеточной активности передачи сигнала, модулируемой или медиируемой TRAF2 или другими молекулами,включают:(i) способ, аналогичный описанному выше,в котором обработка клеток предусматривает введение в эти клетки последовательности ДНК,кодирующей белок, изоформу, фрагмент, аналог или производное, в форме подходящего вектора,несущего эту последовательность, причем этот вектор способен осуществлять введение этой последовательности в эти клетки таким образом, что эта последовательность экспрессируется в этих клетках.(ii) способ, аналогичный описанному выше, в котором обработка указанных клеток представляет собой трансфекцию клеток рекомбинантным вектором в виде вируса животного, предусматривающий следующие стадии:(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим поверхностным клеточным рецептором на поверхности обрабатываемых клеток,и вторую последовательность, кодирующую белок, выбранный из белка, изоформ, аналогов,фрагментов и производных данного изобретения,который при экспрессии в этих клетках способен модулировать/медии-ровать активность NF-В или любую другую внутриклеточную активность,модулируемую/медиируемую TRAF2 или другими молекулами; и(b) инфицирование клеток вектором (а). Подобным образом, данное изобретение обеспечивает также способ модулирования мо 004309 14 дулируемого/медиируемого TRAF2 действия на клетки, предусматривающий обработку этих клеток антителами или их активными фрагментами или производными, в соответствии с данным изобретением, как описано выше, причем эта обработка представляет собой применение подходящей композиции, содержащей эти антитела, их активные фрагменты или производные,к этим клеткам, причем, когда ТRАF2 связывающий белок или его части этих клеток экспонированы на внеклеточной поверхности,эту композицию готовят для внеклеточного применения, а когда TRAF2-связывающие белки являются внутриклеточными, эту композицию готовят для внутриклеточного применения. Другие способы данного изобретения для модулирования модулируемого/медиируемогоTRAF2 действия на клетки включают:(i) способ, предусматривающий обработку этих клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по меньшей мере для части последовательности ДНК, кодирующей TRAF2 связывающий белок, причем эта последовательность ДНК является любой из вышеупомянутых последовательностей данного изобретения, причем олигонуклеотидная последовательность способна ингибировать экспрессию ТRАF2 связывающего белка.(ii) способ по (i) выше, в котором указанную олигонуклеотидную последовательность вводят в клетки посредством вышеупомянутого рекомбинантного вируса, причем вторая последовательность этого вируса кодирует олигонуклеотидную последовательность.(iii) способ, предусматривающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор,кодирующий последовательность рибозима,способного взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей ТRAF2 связывающий белок, изоформу, аналог, фрагмент или производное, упомянутые выше, вводят в клетки в форме, позволяющей экспрессию последовательности рибозима в этих клетках, и в которой при экспрессии последовательности рибозима в клетках он взаимодействует с клеточной мРНК и расщепляет эту мРНК, приводя к ингибированию экспрессииTRAF2 связывающего белка в этих клетках. Следует отметить, что для всех вышеописанных способов данного изобретения белок данного изобретения, как указано, может быть конкретно белком NIK или по меньшей мере может быть выбран из его изоформ, аналогов,фрагментов или производных. В описанные выше способы и их варианты данного изобретения включен также способ предупреждения или лечения патологического состояния, связанного с индукцией NF-В или любой другой активности, медиируемой TRAF2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, изоформа, аналог, фрагмент или 15 производное согласно данному изобретению,причем этот способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества белка, изоформы, аналога,фрагмента или производного в соответствии с данным изобретением, или молекулы ДНК, кодирующей его, или молекулы, способной нарушать взаимодействие этого белка, изоформы,аналога, фрагмента или производного, с TRAF2 или любой другой молекулой, с которой связывается этот белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное. В этом способе изобретения белок, вводимый пациенту, может быть конкретно белком, кодируемым клоном 10, NIK,изоформой, аналогом, производным или фрагментом NIK, или молекулой ДНК, кодирующей их. Белок, кодируемый клоном 10, ингибирует индукцию NF-В, так же как и другие фрагменты NIK, тогда как NIK индуцирует активациюNF-В. В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для модулирования модулируемого/медиируемого TRAF2 действия на клетки,содержащая в качестве активного ингредиента по меньшей мере один из ТRАF2-связывающих белков данного изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси. Другие фармацевтические композиции или их варианты согласно данному изобретению включают:(i) фармацевтическую композицию для модулирования модулируемого/медиируемогоTRAF2 действия на клетки, содержащую активный ингредиент, рекомбинантный вектор-вирус животного, кодирующий белок, способный связываться с рецептором клеточной поверхности,и кодирующий по меньшей мере один ТRAF2 связывающий белок, изоформу, активные фрагменты или аналоги в соответствии с данным изобретением.(ii) фармацевтическую композицию для модулирования модулируемого/медиируемогоTRAF2 действия на клетки, содержащую в качестве активного ингредиента олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательности мРНК ТRАF2-связывающего белка в соответствии с данным изобретением. Следующим вариантом вышеописанной фармацевтической композиции является конкретно фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения патологического состояния, связанного с индукцией NF-В или любой другой активности, медиируемой TRAF2 или другими молекулами, с которыми связывается белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное согласно данному изобретению,причем эта композиция содержит эффективное количество белка, аналога, фрагмента или про 004309 16 изводного, в соответствии с данным изобретением, или молекулы ДНК, кодирующей их, или молекулы, способной нарушать взаимодействие этого белка, изоформы, аналога, фрагмента или производного, с TRAF2 или любой другой молекулой, с которой связывается этот белок, изоформа, аналог, фрагмент или производное. Еще в одном характерном варианте указанная фармацевтическая композиция содержит эффективное количество белка, кодируемого клоном 10,NIK, изоформы, аналога, производного или фрагмента NIK, или молекулы ДНК, кодирующей их. Еще в одном характерном варианте данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения патологического состояния, связанного с индукцией NF-В или любой другой активности,медиируемой TRAF2 или другими молекулами,с которыми связывается белок NIK, причем эта композиция содержит молекулу, способную противодействовать протеинкиназной активности NIK. В этой композиции противодействующей молекулой может быть эффективное количество NIK, мутированного в остатках активного сайта, причем этот мутированный NIK противодействует нативному NIK, в частности, киназной активности NIK. Одним известным состоянием, связанным с индукцией (аномальной) NF-В является СПИД, другими являются аутоиммунные заболевания, а также опухоли. Следующими аспектами и вариантами данного изобретения являются:(i) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую TRAF2,предусматривающий:a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть TRAF2, имеющую аминокислотные остатки 221-501 TRAF2;b) идентификацию и характеристику лиганда, иного, чем TRAF2 или части рецептора семейства рецепторов TNF/NGF, способного,согласно стадии скрининга, к упомянутому связыванию; иc) получение этого лиганда по существу в выделенной и очищенной форме.(ii) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую белком,изоформой, аналогом, фрагментом или производным, в соответствии с данным изобретением,предусматривающий:a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть последовательности NIK, изображенной на фиг. 6;c) получение этого лиганда по существу в выделенной и очищенной форме.(iii) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую NIK,предусматривающий:a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, содержащим по меньшей мере часть последовательности NIK, изображенной на фиг. 6;b) идентификацию и характеристику лиганда, иного, чем TRAF2 или части рецептора семейства рецепторов TNF/NGF, способного,согласно стадии скрининга, к упомянутому связыванию; иc) получение этого лиганда по существу в выделенной и очищенной форме.(iv) Способ идентификации и получения лиганда, способного прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую NIK, предусматривающий:c) получение этой молекулы по существу в выделенной и очищенной форме.(v) Способ идентификации и получения молекулы, способной прямо или опосредованно модулировать клеточную активность, модулируемую/медиируемую белком, изоформой,аналогом, фрагментом или производным данного изобретения, предусматривающий:a) скрининг молекулы, способной модулировать активности, модулируемые/медиируемые белком, изоформой, аналогом, фрагментом или производным данного изобретения;c) получение этой молекулы по существу в выделенной и очищенной форме. Также обеспечены другие аспекты и варианты данного изобретения как возникающие на основе подробного описания данного изобретения. Следует отметить, что во всем описании термины "модулирование/медиирование действия TRAF (или TRAF2) на клетки" и любое другое подобное "модулирование/медиирование",упоминаемые в описании, следует понимать как относящиеся к обработке in vitro, так и к лечению in vivo и, кроме того, эти термины включают в себя ингибирование или усиление/увеличение. Краткое описание рисунков Фиг. 1 - изображение в виде диаграммы структуры молекулы TRAF2; 18 фиг. 2A-B - схематические диаграммы, иллюстрирующие некоторые белки, участвующие в активации NF-В, в том числе новые TRAFсвязывающие белки данного изобретения (например, NIK), где (а) представляет собой частичную схему и (b) представляет собой более полную схему; фиг. 3A-D - нуклеотидная последовательность 5'-конца клона 9 (A-C) и расшифрованная аминокислотная последовательность, кодируемая ею (D); фиг. 4A-B - нуклеотидная последовательность клона 10; фиг. 5A-B - нуклеотидная последовательность клона 15 (A) и расшифрованная аминокислотная последовательность, кодируемая ею(B); фиг. 6A-G - нуклеотидная последовательность и расшифрованная аминокислотная последовательность NIK; и фиг. 7A-BB - сравнение первичной структуры последовательности белка NIK с последовательностью мышиной протеинкиназыmМЕКК (мышиной киназы МАРК или ERK киназы) и ряда других киназ. Отмечены районы,соответствующие консервативным мотивам I-XI в протеинкиназах. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим белки, способные связываться с молекулой фактора, связанного с рецептором фактора некроза опухолей(TRAF), и кодируемым ими белкам. В предпочтительном варианте, данное изобретение относится к последовательностям кДНК, названным здесь клоном 9, клоном 10 и клоном 15 (изображенным на фиг. 3 а, 4 и 5 а,соответственно), которые кодируют белки, способные связываться с TRAF2, и белкам, кодируемым этими последовательностями ДНК. В следующем предпочтительном варианте данное изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белок NIK, и к самому белку NIK. Последовательности ДНК и расшифрованные аминокислотные последовательности, упомянутые выше, представляют новые последовательности, они не встречаются в банках данных последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей "GENEBANK" или "PROTEIN BANK". В объеме данного изобретения находятся также фрагменты вышеупомянутых последовательностей ДНК и последовательности ДНК,способные гибридизоваться с этими последовательностями или их частью при умеренно строгих условиях, при условии, что они кодируют биологически активный белок или полипептид,способный связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501TRAF2. Данное изобретение относится также к последовательности ДНК, которая является выро 19 жденной вследствие вырожденности генетического кода относительно вышеупомянутых последовательностей ДНК и которая кодирует биологически активный белок или полипептид,способный связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501TRAF2. Что касается TRAF2, следует отметить, что некоторые члены семейства рецепторовNF-В прямым или опосредованным связыванием с TRAF2, который, следовательно, является адапторным белком для этих рецепторов и,таким образом, может рассматриваться также как модулятор/медиатор индукции активации активности NF-В этими рецепторами TNF/NGFTRAF2. Одним из вариантов предпочтительногоTRAF2-связывающего белка согласно данному изобретению является, белок NIK, который связывает TRAF2 очень специфическим образом и стимулирует активность NF-В. NIK представляет собой серин/треонин-киназу, имеющую сходство последовательности с несколькими киназами МАРКК (см. примеры ниже). Аналоги или мутеины NIK, получаемые в соответствии с данным изобретением (см. примеры), которые лишены киназной активности NIK, не могут стимулировать активацию NF-В, когда эти аналоги/мутеины экспрессируются в клетках. Далее, такие аналоги/мутеины NIK при экспрессии в клетках ингибируют индукцию NF-ВTNF, а также другими индуцирующими агентами, такими как бактериальный эндотоксин LPS,миристат-ацетат форбола (активатор протеинкиназы С) и белок TAX HTLV-1. TNF-индукция активности NF-кB осуществляется через любой из двух TNF-рецепторов (TNF-рецепторы р 55 и р 75) и, следовательно, можно думать, что, повидимому, мутеины/аналоги NIK ингибируют индукцию активации NF-В через эти рецепторы. Подобным образом, TNF и лиганд рецептора FAS/APO1 могут также индуцировать активность NF-В через соответствующий рецептор,рецептор FAS/APO1, индукция которого также ингибируется мутеинами/аналогами NIK. Кроме того, вышеупомянутые рецепторы имеют адапторные белки TRADD, RIP и MORT-1, которые могут также индуцировать активность NF-В,но эта индукция также ингибируется мутеинами/аналогами NIK. Кроме того, такие мутеины/аналоги NIK ингибируют также индукциюNF-В IL-1 (функционирующим через IL-1 рецептор). Таким образом, можно заключить,что NIK участвует в NF-В -индуци-рующем каскаде, который является обычным для рецепторов семейства TNF/NGF и для IL-1-рецептора. По-видимому, NIK также действует прямым путем в индукции активации NF-В, возможно,путем прямого усиления фосфорилирования I 004309 20 В. Это вытекает из полученных наблюдений,что вышеупомянутые аналоги/мутеины NIK,лишенные киназной активности (также называемые доминант-негативными мутантами), при экспрессии в клетках не влияют каким бы то ни было образом на TNF-индуцируемую активацию Jun киназы, что свидетельствует о том, чтоNIK действует специфически, усиливая фосфорилирование I-В, без влияния на киназу MAP,участвующую в фосфорилировании Jun. Таким образом, данное изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные TRAF-связывающие белки, например, ТRАF2-связывающие белки, такие как, например, NIK, а также его аналоги, фрагменты и производные, и аналогам,фрагментам и производным белков, кодируемым ими. Получение таких аналогов, фрагментов и производных представляет собой стандартные процедуры (см., например, Sambrook etal., 1989), в которых в кодирующих последовательностях ДНК один или несколько кодонов могут быть делегированы, добавлены или заменены другими с получением аналогов, имеющих по меньшей мере замену одного аминокислотного остатка относительно нативного белка. Приемлемыми являются аналоги, которые сохраняют по меньшей мере способность связывания с TRAF2 с медиированием или без медиирования любой другой связывающей или ферментативной активности, например, аналоги, которые связывают TRAF2, но не передают сигнал, т.е. не связываются с находящимся далее по ходу процесса передачи сигнала белком или иным фактором, или не катализируют сигнал-зависимую реакцию. Таким образом могут быть получены аналоги, которые имеют так называемое доминант-негативное действие, а именно, аналог, который является дефектным либо в связывании с TRAF2, либо в последующей передаче сигнала после такого связывания,как отмечалось выше. Такие аналоги можно использовать, например, для ингибирования эффектов CD40, р 55 TNF и р 75 TNF(FAS/APO1) и других родственных рецепторов,а также эффектов, медиируемых различными связанными с рецептором белками (адаптерами), как отмечалось выше, путем конкурирования с природными ТRАF2-связывающими белками. Подобным образом, могут быть получены так называемые доминант-позитивные аналоги,которые могли бы служить для усиления эффекта TRAF2. Они могли бы иметь те же самые или улучшенные ТRАF2-связывающие свойства и те же самые или улучшенные свойства передачи сигнала природных ТRАF2-связывающих белков. Аналогичным образом, могут быть получены биологически активные фрагменты клонов данного изобретения, как отмечалось выше в связи с получением этих аналогов. Пригодными являются последовательности ДНК данного 21 изобретения, которые кодируют белок или полипептид, сохраняющий ТRАF2-связывающую способность или способный медиировать любую другую связывающую или ферментативную активность, как отмечалось выше. Таким образом, могут быть получены фрагменты кодируемых белков данного изобретения, которые имеют доминант-негативное или доминантпозитивное действие, как отмечалось выше, относительно этих аналогов. Подобным образом,могут быть получены производные посредством стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков этих белков, их аналогов или фрагментов, или посредством конъюгирования этих белков, их аналогов или фрагментов с другой молекулой,например, с антителом, ферментом, рецептором и т.д., как хорошо известно в данной области. Из вышеупомянутых последовательностей ДНК данного изобретения, которые кодируютTRAF-связывающий белок (например, TRAF2 связывающий белок, такой как, например, NIK),изоформу, аналог, фрагмент или производное, в качестве варианта данного изобретения включены также последовательности ДНК, способные гибридизоваться с последовательностью кДНК,произведенной из кодирующего района нативного TRAF-связывающего белка, причем такую гибридизацию выполняют при умеренно строгих условиях и гибридизуемые последовательности ДНК кодируют биологически активныйTRAF-связывающий белок. Таким образом, эти гибридизуемые последовательности ДНК включают в себя последовательности ДНК, которые имеют относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК природных TRAFсвязывающих белков (например, с последовательностью кДНК ТRАF2-связывающего белка,такой как, например, последовательность кДНКNIK) и как таковые представляют подобныеTRAFсвязывающего белка; или производными природных последовательностей, кодирующих белки, принадлежащие к группе подобных TRAFсвязывающему белку последовательностей, кодирующими белок, имеющий активность TRAFсвязывающих белков (например, ТRAF2 связывающих белков, таких как, например,NIK). Далее, эти последовательности могут также включать, например, не встречающиеся в природе, синтетически полученные последовательности, которые подобны последовательности кДНК нативного TRAF-связывающего белка, но содержат ряд желательных модификаций. Такие синтетические последовательности включают, следовательно, все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные TRAF-связывающих белков (например, ТRАF2-связывающих белков, таких 22 как, например, NIK), которые все обладают активностью TRAF-связывающих белков. Для получения различных вышеупомянутых природновстречающихся подобных TRAFсвязывающему белку последовательностей могут быть использованы стандартные процедуры скрининга и выделения природных проб ДНК или РНК из различных тканей с использованием кДНК природного TRAF-связывающего белка или ее части в качестве зонда (см., например,стандартные процедуры, описанные в Sambrook et al., 1989). Подобным образом, для получения вышеупомянутых различных синтетических подобных TRAF-связывающему белку последовательностей, кодирующих аналоги, фрагменты или производные TRAF-связывающих белков(например, ТRАF2-связывающих белков, таких как, например, NIK) может быть использован ряд стандартных процедур, таких как описанные подробно ниже, касающиеся таких аналогов, фрагментов и производных. Полипептид или белок, "в основном соответствующий" TRAF-связывающему белку,включает не только TRAF-связывающий белок,но также полипептиды или белки, которые являются аналогами TRAF-связывающего белка. Аналоги, которые в основном соответствуют TRAF-связывающему белку, являются полипептидами, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательностиTRAF-связывающего белка были заменены другой аминокислотой, делегированы и/или вставлены, при условии, что полученный белок проявляет в основном такую же или более высокую биологическую активность, что и TRAFсвязывающий белок, которому он соответствует. Для того чтобы в основном соответствовать TRAF-связывающему белку, изменения в последовательности TRAF-связывающих белков, таких как изоформы, как правило являются относительно малыми. Хотя число изменений может быть более десяти, предпочтительно имеется не более десяти изменений, более предпочтительно не более пяти изменений и наиболее предпочтительно не более трех изменений. Хотя можно использовать любой способ для нахождения биологически активных белков,которые в основном соответствуют ТRAFсвязывающим белкам, одним из таких способов является использование общепринятых способов мутагенеза ДНК, кодирующей этот белок,приводящих к небольшим модификациям. Белки, экспрессируемые такими клонами, могут быть затем подвергнуты скринингу на их способность связываться с белками TRAF (например, TRAF2) и модулировать активность белка"Консервативными" изменениями являются изменения, которые, как ожидается, не изме 23 няют активность белка, и обычно должны быть подвергнуты скринингу в первую очередь как изменения, которые, как ожидается, не должны изменять размер, заряд или конфигурацию белка и, следовательно, не должны изменять его биологических свойств. Консервативные замены ТRAFсвязывающих белков включают аналог, в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде был консервативно заменен отличающейся аминокислотой. Такие замены предпочтительно получают в соответствии со следующим ниже перечнем, представленным в таблице IA, и эти замены могут быть определены рутинным экспериментированием, с обеспечением модифицированных структурных и функциональных свойств молекулы синтезированного полипептида при сохранении биологической активности, характерной для TRAFсвязывающего белка. Таблица IA Исходный остаток Пример заменыTRAF-связывающего белка являются замены, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде был удален и на его место был введен отличающийся остаток, в соответствии со следующей табл. IB. Типы замен,которые могут быть произведены в полипептиде, могут основываться на анализе частот аминокислотных замен между гомологичными белками различных видов, таких, которые представлены в таблице 1-2 Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, NewFreeman and Co., San Francisco, CA 1983. На основе такого анализа альтернативные консервативные замены определены здесь как обмены в пределах одной из следующих пяти групп: Таблица IB 24 1. Небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly); 2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды:His, Arg, Lys; 4. Большие алифатические неполярные остатки:Met, Leu, Ile, Val (Cys); и 5. Большие ароматические остатки: Phe, Туr,Thr. Три аминокислотных остатка в скобках выше играют особую роль в архитектуре белков. Gly является единственным остатком, не имеющим боковой цепи, и, следовательно, он придает гибкость цепи. Однако, это ведет к усилению образования вторичной структуры, отличающейся от -спиральной. Pro, вследствие его необычной геометрии, прочно сдерживает цепь и, как правило, приводит к усилению образования структур типа -витка, хотя в некоторых случаях Cys может быть способным к участию в образовании дисульфидных связей, которое является важным в укладке белка. Отметим, чтоSchulz et al., supra, соединяют указанные выше Группы 1 и 2. Заметим, что Туr, вследствие его потенциала в образовании водородных связей,имеет значительное родство с Ser и Thr, и т.д. Консервативные замены аминокислот в соответствии с данным изобретением, например, такие как представленные выше, известны в данной области, и можно было бы ожидать,что они сохранят биологические и структурные свойства полипептида после замены аминокислот. Большинство делеций и замен в соответствии с данным изобретением представляют собой замены, которые не производят радикальных изменений в характеристике молекулы белка или полипептида. "Характеристика" определяется для определения как изменений во вторичной структуре, например, -спирали или -слоя,так и изменений биологической активности,например, связывания с белками TRAF и/или медиирования действия белков TRAF на гибель клеток. Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут использоваться для получения аналогов TRAF-связывающих белков для применения в данном изобретении, включают любые стадии известных способов, такие как представленные в U.S. patent RE 33 653, 4 959 314, 4 588 585 и 4 737 462 Mark et al.; 5 116 943 Koths et al., 4 965 195 Namen et al.; 4 879 111No. 4 904 584 (Shaw et al.). Кроме консервативных замен, рассмотренных выше, которые не должны значительно изменять активность TRAF-связывающего белка,любые консервативные замены или менее кон 25 сервативные или более произвольные замены,которые приводят к увеличению биологической активности аналогов TRAF-связывающих белков, находятся в сфере действия данного изобретения. Специалисту в данной области будет понятно, что при подтверждении точного действия замены или делении это действие замены (замен), делеции (делеций) и т.д. должно оцениваться при помощи рутинных (общепринятых) тестов связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием подобного стандартного теста не требует чрезмерного экспериментирования. На генетическом уровне, эти аналоги получают обычно сайт-направленным мутагенезом нуклеотидов в ДНК, кодирующей TRAFсвязывающий белок, с получением ДНК, кодирующей этот аналог, и последующим синтезом этой ДНК и экспрессией полипептида в культуре рекомбинантных клеток. Как правило, эти аналоги проявляют такую же или увеличенную качественную биологическую активность, что и природно-встречающийся белок, Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, GreeneLaboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Получение TRAF-связывающего белка в соответствии с данным изобретением или альтернативной нуклеотидной последовательности,кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие изменений, допускаемых известной вырожденностью генетического кода, может быть достигнуто сайт-специфическим мутагенезом ДНК, которая кодирует полученный ранее аналог или нативную версию TRAF-связывающего белка. Сайт-специфический мутагенез позволяет получать аналоги путем использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК желательной мутации, а также достаточного количества смежных нуклеотидов, с получением праймерной последовательности достаточного размера и достаточной вариабельности для образования стабильного дуплекса,пересеченного на обеих сторонах сочленения делеции. Как правило, предпочтительным является праймер длиной приблизительно 20-25 нуклеотидов, в котором 5-10 комплементарных нуклеотидов на каждой стороне изменены. В общих чертах, способ сайт-специфического мутагенеза хорошо известен в данной области, в качестве примера приводится публикацияAdelman et al., DNA 2:183 (1983), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Как должно быть понятно, сайтспецифический мутагенез обычно использует фаговый вектор, который существует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичные векторы, применимые в сайт 004309Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Эти фаги легко коммерчески доступны и их применение, как правило, хорошо известно специалистам в этой области. Альтернативно, для получения одноцепочечной ДНК могут использоваться плазмидные векторы, которые содержат одноцепочечное фаговое начало репликации(Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3, 1987). Как правило, сайт-направленный мутагенез согласно данному изобретению проводят путем получения сначала одноцепочечного вектора, который содержит в своей последовательности последовательность ДНК, которая кодирует соответствующий полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий желательную мутированную последовательность, получают синтетически при помощи автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотидов. Затем этот праймер отжигают с одноцепочечным содержащим последовательность для белка вектором и подвергают действию полимеризующих ДНК ферментов, таких как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli, для завершения синтеза несущей мутацию цепи. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут желательную мутацию. Этот гетеродуплексный вектор используют затем для трансформации подходящих клеток, таких как E.coliJM101, и отбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, несущие мутированную последовательность. После отбора такого клона мутированная последовательность TRAF-связывающего белка может быть удалена и помещена в подходящий вектор, обычно трансдуцирующий или экспрессирующий вектор такого типа, который может быть использован для трансфекции подходящего хозяина. Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие TRAF-связывающий белок,могут быть также детектированы, получены и/или модифицированы, in vitro, in situ и/или invivo, с использованием известных способов амплификации ДНК или РНК, таких как ПЦР и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличить в числе) специфические последовательности ДНК при помощи повторяемых ДНК-полимеразных реакций. Эта реакция может быть использована как замена клонирования; все, что требуется, это знание последовательности нуклеиновой кислоты. Для проведения ПЦР конструируют праймеры, которые комплементарны целевой последовательности. Затем эти праймеры получают автоматизированным синтезом ДНК. Поскольку могут быть сконструированы праймеры для гибридизации с любой частью гена, могут быть 27 созданы условия, при которых неправильные спаривания оснований могут переноситься (не препятствовать достижению цели). Амплификация этих неправильно спаренных районов может привести к синтезу мутагенизированного продукта, приводящего к образованию пептида с новыми свойствами (т.е. сайтнаправленному мутагенезу). См.также, например, Ausubel, supra, Ch.16. Также путем сочетания синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с применением обратной транскриптазы с ПЦР, РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина без клонирования. Кроме того, могут быть сконструированы праймеры ПЦР для включения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как терминирующие кодоны на концах амплифицируемого сегмента гена. Это помещение сайтов рестрикции при 5'- и 3'-концах амплифицируемой генной последовательности позволяет генным сегментам, кодирующим TRAFсвязывающий белок или его фрагмент, быть средством, сконструированным для лигирования других последовательностей и/или клонирующих сайтов в векторах. ПЦР и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в данной области и могут быть использованы в соответствии с данным изобретением без чрезмерного экспериментирования на основе разъяснений и руководства, представленных здесь. Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются ими, полимеразную цепную реакцию и родственные способы амплификацииGuide to Methods and Applications) и опосредованную РНК амплификацию, которая использует антисмысловую РНК в качестве последовательности-мишени для синтеза двухцепочечной ДНК (U.S. patent No. 5 130 238, Malek et al., с товарным названием NASBA); и иммуно-ПЦР,которая сочетает использование амплификации ДНК с мечением антител (Ruzicka et al., Science 260:487 (1993); Sano et al., Science 258:120(1992); Sano et al., Biotechniques 9:1378 (1991,полное содержание этих патентов и ссылок включено здесь в качестве ссылки. Аналогичным образом, биологически активные фрагменты TRAF-связывающих белковTRAF2 связывающих белков, таких как, например NIK) или их изоформы могут быть получены, как описано выше в связи с аналогами TRAFсвязывающих белков. Подходящими являются фрагменты TRAF-связывающих белков, кото 004309 28 рые сохраняют TRAF-связывающую способность белка и которые могут медиировать биологическую активность белков TRAF или других белков, связанных с белками TRAF прямо или опосредованно. Таким образом, могут быть получены фрагменты TRAF-связывающих белков,которые обнаруживают доминантнегативное или доминант-позитивное действие,описанное выше в связи с аналогами. Следует отметить, что эти фрагменты представляют особый класс аналогов данного изобретения, а именно, они определяют части TRAF-связывающих белков, произведенные из полной последовательности TRAF-связывающего белка(например, последовательности любого из ТRАF2-связывающих белков, такого как, например, NIK или его изоформы), причем такая часть или фрагмент имеют любую из описанных выше желательных активностей. Таким фрагментом может быть, например, пептид. Подобным образом, могут быть получены производные при помощи стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков TRAF-связывающего белка, его аналогов или фрагментов, или конъюгированием TRAF-связывающего белка, его аналогов или фрагментов с другой молекулой,например, антителом, ферментом, рецептором и т.д., как хорошо известно в данной области. Таким образом, термин "производные" в применении здесь охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые находятся в виде боковых групп на остатках, или N- или С-концевых групп способами, известными в данной области, и эти производные включены в данное изобретение. Производные могут иметь химические части молекул, такие как остатки углеводов или фосфатов, при условии, что такая фракция имеет ту же самую или более высокую биологическую активность, чем TRAF-связывающие белки. Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп,амиды карбоксильных групп, образованные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацилпроизводными или свободными аминогруппами аминокислотных остатков, образованными с ацильными группами (например, с алканоильной или карбоциклической ароильной группами), или O-ацилпроизводными свободной гидроксильной группы (например, серильного или треонильного остатка), образованными с ацильными группами. Термин "производные" включает только такие производные, которые не изменяют один остаток на другой из двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот.TRAF-связывающий белок представляет собой белок или полипептид, т.е. последовательность аминокислотных остатков. Полипептид, состоящий из более крупной последова 29 тельности, которая включает всю последовательность TRAF-связывающего белка, в соответствии с приведенными здесь определениями,также включен в понятие такого полипептида,при условии, что добавления не влияют на основные и новые характеристики данного изобретения, т.е., если они сохраняют или увеличивают биологическую активностьTRAFсвязывающего белка, или могут быть отщеплены, причем при отщеплении остается белок или полипептид, имеющий биологическую активность TRAF-связывающего белка. Так, например, данное изобретение включает слитые (гибридные) белки, образованные TRAF-связывающим белком с другими аминокислотами или пептидами. Как упоминалось выше, должно быть понятно,что описанные выше"TRAFсвязывающие" белки данного изобретения представляют собой белки, которые связывают внутриклеточно любой белок TRAF и медиируют/модулируют активность любого белкаTRAF. Конкретными примерами являются ТRАF2-связывающие белки, которые могут модулировать или медиировать ассоциированную с TRAF2 внутриклеточную активность передачи сигнала, как упоминалось выше, в частности,относительно участия TRAF2 в индукции активности NF-В, в частности, после взаимодействия между TRAF2 и различными членами семейства рецепторов TNF/NGF и/или их ассоциированными адапторными белками, как подробно описано выше и ниже. Характерным примером таких ТRАF2-связывающих белков является белок NIK и его различные аналоги,фрагменты и т.д. (см. примеры), которые, повидимому, связывают TRAF2 очень специфически и оказывают прямое действие в индукции активности NF-В, причем различные доминант-негативные аналоги/мутеины NIK ингибируют эту активность. Все вышеупомянутые модификации находятся в объеме данного изобретения при условии, что они сохраняют способность кодируемых белков или полипептидов или их аналогов и производных связываться по меньшей мере с аминокислотной последовательностью 222-501TRAF2. Все белки и полипептиды данного изобретения вследствие их способности связываться сTRAF2 рассматриваются как медиаторы или модуляторы передачи сигнала TRAF2. Как таковые, эти молекулы данного изобретения играют роль, например, в процессе передачи сигнала, в котором связывание лиганда TRAF2 с(LT-), р 55 или р 75 TNF-рецепторами, а также с другими рецепторами и адапторными белками,описанными выше, приводит к активации фактора транскрипции NF-В. Особенно интересным является белок NIK и частичный белокNIK, кодируемый клоном 10 данного изобретения; подробный анализ последовательности NIK и кодируемого клоном 10 белка (первоначально названного NMPI) обнаружил кодируемые аминокислотные последовательности, соответствующие консервативным мотивам I-XI, характерным для Ser/Thr протеинкиназ, определяющие, таким образом, функцию этого белка. Белки новых клонов, их аналоги, фрагменты и производные имеют ряд возможных применений, например:(i) они могут быть использованы для имитации или усиления активности NF-В, функции TRAF2 и рецепторов, с которыми они связываются, в ситуациях, когда желательна усиленная функция, например, в противоопухолевых или иммуностимуляторных приложениях,где желательны индуцируемые TRAF2 эффекты. В этом случае белки данного изобретения, их аналоги, фрагменты или производные, которые усиливают эффекты TRAF2 или рецепторов,могут быть введены в клетки при помощи стандартных процедур, известных per se. Например,поскольку белки, кодируемые клонами ДНК данного изобретения, являются внутриклеточными и они должны вводиться только в клетки,в которых желателен эффект TRAF2, необходима система специфического введения этих белков в клетки. Одним способом для этого является создание рекомбинантного вируса животного, например, произведенного из вируса коровьей оспы, в ДНК которого вводят следующие два гена: ген, кодирующий лиганд, который связывается с поверхностными белками клетки, специфически экспрессируемым этими клетками,например, такими как белок gp120 вируса СПИДа (ВИЧ), который связывается специфически с некоторыми клетками(CD4 лимфоцитами и родственными лейкозными клетками), или любой другой лиганд, который связывается специфически с клетками, несущими рецептор, который связывает TRAF2, так что рекомбинантный вирусный вектор будет способен связывать такие клетки; и ген, кодирующий белки данного изобретения. Таким образом,экспрессия связывающегося с поверхностью клетки белка на поверхности этого вируса будет нацеливать вирус специфически на опухолевую клетку или другую несущую рецептор клетку,после чего последовательности, кодирующие эти белки, будут введены в клетки через этот вирус и при экспрессии в клетках приведут к усилению эффекта рецептора или TRAF2, что приведет к желательному иммуно-стимулирующему эффекту в этих клетках. Конструирование такого рекомбинантного вируса животного выполняют согласно стандартным процедурам (см., например, Sambrook et al., 1989). Другой возможностью является введение последовательностей кодируемых белков в форме олигонуклеотидов, которые могут адсорбироваться клетками и экспрессироваться в них;(ii) они могут быть использованы для ингибирования активности NF-В, эффектовTRAF2 или рецептора, который связывает его,например, в таких случаях, как повреждение тканей, например, при СПИДе, септический шок или реакция трансплантат против хозяина(отторжение трансплантата), в которых желательно блокирование внутриклеточной передачи сигнала. В этой ситуации можно, например,вводить в клетки, при помощи стандартных процедур, олигонуклеотиды, имеющие антисмысловую кодирующую последовательность для белков данного изобретения, которая могла бы эффективно блокировать трансляцию мРНК,кодирующих эти белки и тем самым ингибировать их экспрессию и приводить к ингибированию нежелательного эффекта. Альтернативно,могут быть использованы другие олигонуклеотиды; олигонуклеотиды, которые сохраняют их способность связываться с TRAF2 таким образом, что это препятствует связыванию других молекул с этим белком, но в то же время не медиируют какую-либо активацию или модулирование этой молекулы. Обладая этими характеристиками, эти молекулы могут разрушать взаимодействие TRAF2 с его природным лигандом, действуя, следовательно, в качестве ингибиторов, способных снимать эффекты, медиируемые TRAF2, например, такие как активацияNF-В. Такие олигонуклеотиды могут быть введены в клетки при помощи описанного выше подхода с применением рекомбинантного вируса, причем второй последовательностью, которую несет этот вирус, является олигонуклеотидная последовательность. Другой возможностью является использование антител, специфических для белков данного изобретения, для ингибирования внутриклеточной активности передачи сигнала. Еще одним путем ингибирования нежелательного эффекта является недавно разработанный рибозимный подход. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, которые специфически расщепляют РНК. Рибозимы могут быть сконструированы для расщепления выбранных РНК-мишеней, например,мРНК, кодирующих белки данного изобретения. Такие рибозимы должны иметь последовательность, специфическую для мРНК этих белков, и должны быть способны взаимодействовать с ней (комплементарное связывание) с последующим расщеплением этой мРНК, приводя к уменьшению (или полной утрате) экспрессии этих белков, причем уровень сниженной экспрессии зависит от уровня экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для введения рибозимов в выбранные клетки (например, в клетки, несущие ТRAF2-связывающие белки) можно использовать любой подходящий вектор, например, плазмидный вектор, вирусный (ретровирусный) вектор животного, которые обычно ис 004309 32 пользуют для этой цели (см. также (i) выше, где этот вирус имеет в качестве второй последовательности кДНК, кодирующую выбранную рибозимную последовательность). (В отношении обзора, способов и т.д., касающихся рибозимов,см. Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993);(iii) они могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков, которые способны связываться с ними,например, других белков, участвующих в процессе внутриклеточной трансдукции сигнала,которые находятся далее по ходу процесса отTRAF2. Например, последовательности ДНК,кодирующие белки данного изобретения, могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе, в которой кодируемые белки будут использоваться как "приманка" для выделения,клонирования и идентификации из библиотек кДНК или геномной ДНК других последовательностей ("добычи"), кодирующих белки, которые могут связываться с белками этих клонов. Таким же образом можно также определить,могут ли белки данного изобретения связываться с другими клеточными белками, например,другими рецепторами суперсемейства рецепторов TNF/NGF;(iv) кодируемые белки, их аналоги, фрагменты или производные могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. белков, связывающихся с TRAF2, или с функционально родственными белками, и участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала. В этом применении может быть использована вышеупомянутая дрожжевая двухгибридная система или может быть использована недавно разработанная система, использующая гибридизацию при нестрогих условиях с последующим ПЦР клонированном (Wilks et al.,1989);(v) еще одним подходом для использования кодируемых белков данного изобретения,их аналогов, фрагментов или производных является их использование в способах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они способны связываться, например, белков, родственных TRAF2 или другим белкам или факторам, участвующим в процессе внутриклеточной передачи сигнала. В этом применении белки, их аналоги, фрагменты или производные данного изобретения могут быть индивидуально присоединены к матриксам аффинной хроматографии и затем приведены в контакт с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, как предполагается, участвуют в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После процедуры аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые связываются с этими белками, их аналогами, фрагментами или производными, могут быть элюированы,выделены и охарактеризованы;(vi) как отмечалось выше, белки, их аналоги, фрагменты или производные данного изобретения могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Эти антитела могут быть также использованы для целей очистки белков данного изобретения либо из клеточных экстрактов, либо из линий трансформированных клеток, продуцирующих их, их аналоги или фрагменты. Далее, эти антитела могут быть использованы в диагностических целях для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием рецепторной системы, в которой они функционируют, например, при сверхактивных или недостаточно активных индуцируемых TRAF2 клеточных эффектах. Так, если такие нарушения связаны с нарушением функционирования внутриклеточной системы передачи сигнала, в которой участвуют белки данного изобретения, то такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента. Термин "антитела" включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), химерные антитела,антиидиотипические (anti-Id) антитела к антителам, которые могут быть мечеными, в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, такие как, например, фрагменты Fab иF(ab')2, лишенные фрагмента Fc интактного антитела, которые способны связывать антиген;(vii) антитела, в том числе фрагменты антител, применимые в данном изобретении, могут быть использованы для количественного или качественного детектирования клонов данного изобретения в пробе или для детектирования присутствия клеток, которые экспрессируют клоны данного изобретения. Это может быть выполнено при помощи способов иммунофлуоресценции, использующих флуоресцентно меченые антитела, в сочетании с микроскопическим (световой микроскоп), проточноцитометрическим или флуорометрическим детектированием. Антитела (или их фрагменты), применимые в данном изобретении, могут быть использованы гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для обнаружения in situ клонов данного изобретения. Детектирование in situ может быть выполнено путем взятия гистологического образца из пациента и предоставления меченого антитела данного изобретения такому образцу. Антитело (или фрагмент) предпочтительно предоставляется нанесением или наложением меченого антитела (или его фрагмента) на биологическую пробу. Посредством использования такой процедуры можно определить не только присутствие клона, но также его распределение на испытуемой ткани. Специалисты с обычной квалификацией в данной области легко поймут, что с использованием данного изобретения любые из большого разнообразия гисто 004309 34 логических способов (такие как процедуры окрашивания) могут быть модифицированы для достижения детектирования in situ. Такие тесты для клонов данного изобретения обычно предусматривают инкубирование,биологической пробы, такой как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты,или клетки, которые инкубировались в культуре ткани, в присутствии детектируемо меченого антитела, способного идентифицировать кодируемые белки, и детектирование антитела любым из ряда способов, хорошо известных в данной области;(viii) кодируемые белки данного изобретения могут быть также использованы в качестве непрямых модуляторов ряда других белков,благодаря их способности связываться с другими внутриклеточными белками, причем другие внутриклеточные белки непосредственно связывают еще и другие внутриклеточные белки или внутриклеточный домен трансмембранного белка. С целью модулирования этих других внутриклеточных белков или внутриклеточных доменов трансмембранных белков белки данного изобретения могут вводиться в клетки рядом путей, упомянутых здесь выше. Следует отметить, что выделение, идентификация и характеристика белков данного изобретения может выполняться с применением хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одной из таких процедур является дрожжевая двухгибридная процедура,которую использовали для идентификации белков данного изобретения. Могут быть также применены другие процедуры, такие как аффинная хроматография, процедуры гибридизации ДНК и т.д., такие, которые хорошо известны в данной области, для выделения, идентификации и характеристики белков данного изобретения или для выделения, идентификации и характеристики дополнительных белков, факторов, рецепторов и т.д., которые способны связываться с белками данного изобретения. Кроме того, было обнаружено, что белки,которые связываются с белками данного изобретения, могут сами использоваться аналогично использованию белков данного изобретения,описанному выше и ниже, для выделения, идентификации и характеристики других белков,факторов и т.д., которые способны связываться с белками, связывающими белки данного изобретения, и которые могут представлять собой факторы, участвующие далее по ходу процесса трансдукции сигнала или которые могут иметь собственные активности передачи сигнала и,следовательно, могли бы представлять собой белки, участвующие в отличающемся процессе передачи сигнала. Последовательности ДНК и кодируемые белки данного изобретения могут быть получе 35 ны любой стандартной процедурой с применением рекомбинантных ДНК (см., например,Sambrook et al., 1989), в которой подходящие эукариотические или прокариотические клеткихозяева трансформируют подходящими эукариотическими или прокариотическими векторами, содержащими последовательности, кодирующие эти белки. Таким образом, данное изобретение относится также к таким экспрессирующим векторам и трансформированным хозяевам для получения белков данного изобретения. Как упоминалось выше, эти белки включают также их биологически активные аналоги,фрагменты и производные и, следовательно,векторы, кодирующие их, также включают векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, и трансформированные хозяева включают хозяев, продуцирующих такие аналоги и фрагменты. Производные этих белков являются производными, получаемыми стандартной модификацией белков или их аналогов или фрагментов, продуцируемых трансформированными хозяевами. Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям для модулирования эффектов, опосредованных TRAF2. Эти фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента любой один или несколько компонентов из следующих: (i) одну или несколько последовательностей ДНК данного изобретения или их частей, субклонированных в подходящий экспрессирующий вектор; (ii) белок данного изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси; (iii) рекомбинантный вирусный вектор (вирус животного), кодирующий белок данного изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги или производные. Фармацевтические композиции вводят в соответствии с подлежащим лечению заболеванием и в количествах, благоприятных для пациента, в зависимости от веса тела и других факторов, определяемых врачом. Как отмечалось выше, одним из характерных вариантов TRAF-связывающих белков данного изобретения является ТRАF2 связывающий белок NIK. На основе открытий данного изобретения, что NIK специфически связывается с TRAF2 и в связанном виде является медиатором/модулятором TRAF2 и может,следовательно, медиировать/модулировать активность TRAF2 в активации NF-В и, следовательно, его возможную роль в путях выживания клеток, в которых TRAF2 функционирует независимо или в сочетании с другими белками (например, TNF-рецепторами р 55 и р 75, рецептором FAS/APO1, MORT-1, RIP и TRADD), важным является создание лекарственных средств,которые могут усиливать или ингибировать по желанию взаимодействие TRAF2-NIK. Например, в случае, когда желательно увеличение клеточной цитотоксичности, индуцируемойTNF, было бы желательно ингибировать индукцию NF-В путем ингибирования взаимодействия TRAF2-NIK или путем специфического ингибирования TRAF2 или NIK. Подобным образом, например, в случае, когда желательно ингибирование клеточной цитотоксичности, индуцируемой TNF, было бы желательно усилить индукцию NF-В путем усиления взаимодействия TRAF-NIK или путем усиления TRAF2 и/или NIK-специфической индукции NF-В. Имеется много болезней, в которых подобные лекарственные средства могут оказать большую помощь. Среди прочих, (см. также обсуждение выше) находятся острый гепатит, в котором острое повреждение печени отражает, повидимому,опосредованную рецепторомFAS/APO1 гибель клеток печени после индукции лигандом FAS; аутоиммунную гибель клеток, такую как гибель -клеток Лангерганса поджелудочной железы, приводящую к диабету; гибель клеток при отторжении трансплантата(например почки, сердца и печени); гибель олигодендроцитов в мозгу при множественном склерозе и ингибируемый СПИДом суицид Тклеток, который вызывает пролиферацию вируса СПИДа и, следовательно, заболевание СПИД. В таких случаях было бы желательно ингибирование медиируемого рецепторомFAS/APO1 индукции NF-В через TRAF2 и взаимодействие TRAF2-NIK. Одним путем для этого было бы увеличение количества NIK в этих клетках или увеличение количества TRAF2 и NIK таким образом, чтобы NIK- или TRAF2NIK-медиируемая индукция активации NF-В увеличилась, обеспечивая высокие уровни активации NF-В и, следовательно, выживания клеток; или таким образом, чтобы прямое или опосредованное взаимодействие рецептораFAS/APO1 и TRAF2 (или TRAF2-NIK) увеличилось, приводя к уменьшению взаимодействий рецептора FAS/APO1 с медиаторами клеточной цитотоксичности (например, с МАСН, см. схему на фиг. 2b), для обеспечения увеличения индукции активации NF-В и выживания клеток. Напротив, в случае, например, опухолей и инфицированных клеток (см. также обсуждение выше) было бы желательно увеличение медиируемой рецептором FAS/APO1 клеточной цитотоксичности для индукции усиленной гибели этих клеток. В этом случае было бы желательно ингибирование взаимодействий рецепторFAS/APO1-TRAF2 (или -TRAF2-NIK) и/или прямое ингибирование NIK и тем самым снижение индукции активности NF-кB. Возможно, что NIK или одна или несколько из его изоформ, один или несколько из его аналогов или фрагментов могут служить в качестве "природных" ингибиторов самого NIK или взаимодействия NIK-TRAF2 и в таком качестве 37 служить в качестве ингибиторов индукции активации NF-В. Такие ингибиторы могут, следовательно, применяться в качестве описанных выше специфических ингибиторов, например,ингибиторов, которые можно использовать, когда это желательно, для увеличения клеточноцитотоксических эффектов TNF или лиганда рецептора FAS/APO1 для увеличения гибели клеток. В самом деле, как описано в примерах ниже, различные аналоги и мутеины NIK были выделены в соответствии с данным изобретением, которые являются киназа-недостаточными аналогами/мутеинами и которые способны ингибировать индукцию активации NF-В, опосредованную рецепторами TNF, рецепторомTRADD, RIP и MORT-1; а также опосредованной рецептором IL-1 (который активируется через NIK, но независимо от TRAF2), а также опосредованную бактериальным эндотоксиномTAX HTLV-1. Подобным образом другие вещества, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т.д., также могут быть подвергнуты скринингу для получения специфических лекарственных средств, которые способны ингибировать взаимодействие TRAF2-NIK или активность NIK. Подобным образом, когда желательно увеличение активации NF-В в различных ситуациях, описанных выше, можно, например, увеличить количество NIK и/или TRAF2 в клетках различными стандартными способами, указанными здесь выше (например, введением ДНК,кодирующей NIK и/или TRAF2, в клетки для индукции увеличенной экспрессии или получением подходящих препаратов, содержащих NIK и/или TRAF2, для прямого введения в клетки,или любым другим путем, известным специалистам в данной области). Подобным образом,другие вещества, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т.д., также могут быть подвергнуты скринингу для получения специфических лекарственных средств, которые способны усиливать активность NIK или усиливать взаимодействие TRAF2-NIK. Неограничительный пример того, как могли бы быть сконструированы и подвергнуты скринингу пептидные ингибиторы взаимодействия NIK-TRAF2, основан на предшествующих исследованиях пептидных ингибиторов ICE илиICE-подобных протеаз, субстратной специфичности ICE и стратегий анализа эпитопов при помощи синтеза пептидов. Было обнаружено,что минимальным требованием для эффективного расщепления пептида ICE является участие четырех аминокислот слева от сайта расщепления с сильным предпочтением в отношении аспарагиновой кислоты в положении P1 и с метиламином справа от положения P1 (Sleath et al.,1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992).(тетрапептид),ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4 метилкумарил-7-амид), в аббревиатуре AcDEVD-AMC, соответствует последовательности в поли(АDР-рибоза)-полимеразе (PARP), которая, как было найдено, расщепляется в клетках вскоре после стимуляции FAS-R, а также других процессов апоптоза (Kaufmann, 1989; Kaufmannet al., 1993; Lazebnik et al., 1994), и расщепляется эффективно СРР 32 (членом семейства протеазCED3/ICE) и протеазами МАСН. Поскольку Asp в положении P1 этого субстрата, по-видимому, является важным, тетрапептиды, имеющие Asp в качестве четвертого аминокислотного остатка и различные комбинации аминокислот в первых трех положениях остатков, могут быть подвергнуты быстрому скринингу на связывание с активным сайтом протеаз с применением, например, способа, разработанного Geysen (Geysen, 1985; Geysen et al.,1987), где большое число пептидов на твердых подложках подвергали скринингу на специфические взаимодействия с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфическими пептидами может быть детектировано многочисленными хорошо известными способами в пределах квалификации специалистов в данной области,такими как радиоактивное мечение и т.д. Было показано, что этим способом Geysen можно тестировать по меньшей мере 4000 пептидов за каждый рабочий день. Подобным образом может быть выяснен точный район связывания или район гомологии,который определяет взаимодействие междуTRAF2 и NIK (или между любым другим TRAFбелком и TRAF-связывающим белком), и затем могут быть подвергнуты скринингу пептиды,которые могут участвовать в ингибировании этого взаимодействия, например, синтезированные пептиды, имеющие последовательность,сходную с последовательностью района связывания или комплементарную ей, которые могут конкурировать с природным NIK (или TRAFсвязывающим белком) за связывание с TRAF2(или TRAF). Поскольку может быть выгодным конструирование пептидных ингибиторов, которые селективно ингибируют взаимодействияTRAF2-NIK (или взаимодействие TRAF-TRAFсвязывающий белок) без вмешательства в процессы физиологической смерти клеток, в которых участвуют другие члены пути внутриклеточной передачи сигнала, например, МАСН протеазы пути смерти клеток, которые являются членами семейства протеаз CED3/ICE, пул пептидов, связывающихся с TRAF2 (или TRAF) илиNIK (TRAF-связывающие белки) в таких тестах,как описанный выше тест, может быть синтезирован далее в виде флуорогенного субстратного пептида для тестирования избирательного связывания с такими белками для отбора только белков, специфических для TRAF2/NIK (илиTRAF/TRAF-связывающий белок). Пептиды,которые согласно этому тестированию являются, например, специфическими для TRAF2/NIK,могут быть затем модифицированы для увеличения проницаемости в клетку и ингибирования активности TRAF2 и/или NIK обратимо или необратимо. Thornberry et al., (1994) сообщил,что тетрапептид (ацилокси)метилкетон-Ас-ТуrVаl-Аlа-Аsp-СН 2OС(O) - [2,6-(СF3)2]Ph был сильнодействующим инактиватором ICE. Подобным образом, Milligan et al., (1995) сообщили, что тетрапептидные ингибиторы, имеющие хлорметилкетоновую (необратимо) или альдегидную (обратимо) группы, ингибировали ICE. Кроме того, было показано, что бензилоксикарбоксил-Аsp-СН 2OС(O)-2,6-дихлорбензол (DCB) ингибирует ICE (Mashima et al., 1995). Таким образом, аналогичным путем, тетрапептиды,которые избирательно связываются, например, сTRAF2 или NIK, могут быть модифицированы,например, альдегидной группой, хлорметилкетоновой,(ацилокси)метилкетоновой или СН 2 ОС(О)-DCB-группой с получением пептидного ингибитора активности TRAF2/NIK. Кроме того, для улучшения проницаемости пептиды могут быть, например, химически модифицированы или дериватизованы для повышения их проницаемости через клеточную мембрану и облегчения транспорта таких пептидов через мембрану и в цитоплазму. Muranishi et al. (1991) сообщили о получении производного тиротропин-высвобождающего гормона путем присоединения лауриновой кислоты с образованием липофильного лауроилпроизводного с хорошими характеристиками проницаемости через клеточные мембраны. Zacharia et al. (1991) также сообщил об окислении метионина до сульфоксида и замене пептидной связи ее кетометиленовым изоэфиром (СОСН 2) для облегчения транспорта пептидов через клеточную мембрану. Это лишь некоторые из известных модификаций и производных, которые хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, лекарственные средства или пептидные ингибиторы, которые способны ингибировать активность, например, NIK путем ингибирования взаимодействия NIK-TRAF2 и также взаимодействие между TRAF-белками иTRAF-связывающими белками, могут быть конъюгированы или комплексированы с молекулами, которые облегчают вхождение в клетку. В U.S. Patent 5 149 782 описано конъюгирование транспортируемой через клеточную мембрану молекулы с мембраноуплотняющим агентом, таким как образующие слитые белки(fusogenic) полипептиды, образующие ионные каналы полипептиды, другие мембранные полипептиды и жирные кислоты с длинной цепью,например, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота. Эти мембраноуплотняющие агенты вводят молекулярные конъюгаты в липидный 40 бислой клеточных мембран и облегчают их вхождение в цитоплазму.Low et al., U.S. Patent 5 108 921 дает обзор доступных способов для трансмембранной доставки молекул, таких как (но не ограниченных ими) белки и нуклеиновые кислоты, по механизму опосредованной рецепторами эндоцитотической активности. Эти рецепторные системы включают системы, узнающие галактозу, маннозу, маннозо-6-фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин, транскобаламин (витамин B12), 2-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (TGF). Low et al. утверждает, что рецепторы питательных веществ, такие как рецепторы биотина и фолата, могут быть с выгодой использованы для усиления транспорта через клеточную мембрану вследствие расположения и многочисленности рецепторов биотина и фолата на поверхностях мембран большинства клеток и опосредованных ассоциированным рецептором процессов трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованный между доставляемым в цитоплазму соединением и лигандом, таким как биотин или фолат, контактирует с клеточной мембраной,несущей рецепторы биотина или фолата, с инициацией опосредованного рецептором механизма трансмембранного транспорта и тем самым позволяет вхождение желательного соединения в клетку. Известно, что ICE обладает способностью выносить либеральные замены в положении Р 2 и эта толерантность к либеральным заменам была использована для создания сильной и высокоселективной аффинной метки, содержащей биотиновый "ярлык" (Thornberry et al., 1994). Затем,положение Р 2, а также, возможно, N-конец тетрапептидного ингибитора могут быть модифицированы или дериватизованы, например, присоединением молекулы биотина, для усиления проницаемости этих пептидных ингибиторов через клеточную мембрану. Кроме того, в данной области известно,что слияние желательной пептидной последовательности с лидерной/сигнальной пептидной последовательностью с образованием "химерного пептида" позволит такому "химерному пептиду" транспортироваться через клеточную мембрану в цитоплазму. Как должно быть понятно специалистам в области пептидов, пептидные ингибиторы взаимодействия TRAF-TRAF-связывающий белок,например, взаимодействия TRAF2-NIK, в соответствии с данным изобретением, включают пептидомиметические лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть также подвергнуты быстрому скринингу на связывание, например, с TRAF2/NIK для создания по возможности более стабильных ингибиторов. Также должно быть понятно, что те же самые средства для облегчения или усиления 41 транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, которые рассмотрены выше,применимы также к самим TRAF-связывающим белкам, например, NIK, его аналогам, фрагментам или его изоформам, а также к другим пептидам и белкам, которые проявляют их действие(эффекты) внутриклеточно. Что касается упоминаемых во всем описании антител, термин "антитело" включает поликлональные антитела, моноклональные антитела(anti-Id) антитела к антителам, которые могут быть мечеными, в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, обеспечиваемые любым известным способом, таким как (но не только) ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные способы. Поликлональные антитела являются гетерогенными популяциями молекул антител, полученными из сывороток животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит в основном гомогенную популяцию антител, специфическую в отношении антигенов, причем такая популяция содержит по существу одинаковые сайты связывания эпитопа. МАb могут быть получены согласно способам,известным специалистам в данной области. См.,например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495497 (1975); U.S. Patent No. 4 376 110, Ausubel etProtocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996),содержание которых включено здесь полностью в качестве ссылки. Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, в том числе IgG, IgM, IgE, IgA, GILD и к любому их подклассу. Гибридому, продуцирующуюmАb данного изобретения, можно культивировать in vitro, in situ или in vivo. Получение высоких титров mAb in vivo или in situ делает этот способ предпочтительным способом их получения. Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят из различных видов животных, такие антитела,как имеющие вариабельную область, произведенную из мышиного mAb, и константную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела используют первично для снижения иммуногенности в применении и для увеличения выходов в получении, например, когда мышиные mAb имеют высокие выходы из гибридом, но высокую иммуногенность в организме человека, применяют химерные человек/мышьmAb. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области (Cabilly et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984);(1985); Taniguchi et al., Европейская патентная заявка 171496 (опубликована 19 февраля 1985);Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494 (опубликована 5 марта 1986); Neubergeret al., PCT заявка WO 8601533, (опубликована 13 марта 1986); Kudo et al., Европейская патентная заявка 184187 (опубликована 11 июня 1986);LABORATORY MANUAL, supra. Эти ссылки включены здесь полностью в качестве ссылки. Антиидиотипическое (anti-Id) антитело представляет собой антитело, которое узнает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антитело Id может быть получено иммунизацией животного того же самого вида и генетического типа (например, штамма мыши), что и источник mAb, к которому получают anti-Id. Иммунизированное животное будет узнавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем образования антитела к этим идиотипическим детерминантам (антитело anti-Id). См., например, U.S. PatentNo. 4 699 880, который включен здесь полностью в качестве ссылки.Anti-Id антитело может также использоваться в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответа в еще одном другом животном, продуцирующем так называемое anti-antiId антитело. Anti-anti-Id антитело может быть эпитопно идентичным исходному mAb, которое индуцировало anti-Id. Таким образом, с использованием антител к идиотипическим детерминантам mAb можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Таким образом, mAb, образованные противTRAF-связывающих белков, их аналогов, фрагментов или производных, (например, NIK, его изоформ, аналогов, фрагментов или производных) данного изобретения могут быть использованы для индукции anti-Id антител в подходящих животных, таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки из таких иммунизированных мышей используют для получения anti-Id гибридом, секретирующих anti-Id mAb. Далее, antiId mAb могут быть связаны с носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH) и использованы для иммунизации других мышей BALB/c. Сыворотки из этих мышей будут содержать antianti-Id антитела, которые имеют связывающие свойства исходного mAb, специфического для эпитопа вышеупомянутого TRAF-связываю 43 щего белка или его аналогов, фрагментов и производных. Таким образом, anti-Id mAb имеют их собственные идиотипические эпитопы или "идиотопы", структурно одинаковые с оцениваемым эпитопом, таким как протеин-а GRB. Термин "антитело" включает также как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например, Fab и F(ab')2, которые способны связывать антиген. Fab- и F(ab')2-фрагменты лишены Fc-фрагмента интактного антитела,выводятся более быстро из кровообращения и могут иметь меньшее неспецифическое связывание, чем интактное антитело (Wahl et al., J.Nucl. Med. 24:316-325 (1983. Должно быть понятно, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, применимые в данном изобретении, могут быть использованы для детектирования и количественного определенияTRAF-связывающего белка в соответствии со способами, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно образуются при протеолитическом расщеплении с использованием таких ферментов, как папаин(для получения F(ab')2-фрагментов). Об антителе говорят, что оно "способно связывать" молекулу, если оно способно специфически реагировать с этой молекулой со связыванием этой молекулы с антителом. Термин"эпитоп" относится к части любой молекулы,способной связываться антителом, которая может также узнаваться этим антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда."Антиген" представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом, которая дополнительно способна индуцировать животное к образованию антитела, способного связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь более одного эпитопа. Термин специфическая реакция, использованный выше, предназначен для указания на то, что данный антиген будет реагировать высокоизбирательно с его соответствующим антителом, но не с множеством других антител,которые могут индуцироваться другими антигенами. Антитела, в том числе фрагменты антител,применимые в данном изобретении, могут быть использованы для количественного или качественного детектирования TRAF-связывающего белка (например, NIK) в пробе или для детектирования присутствия клеток, которые экспрессируют TRAF-связывающий белок данного изобретения. Это может быть выполнено иммунофлуоресцентными способами, использующими флуоресцентно меченое антитело (см. ниже), 004309 44 в сочетании с микроскопическим (световой микроскоп), проточно-цитометрическим или флуорометрическим детектированием. Антитела (или их фрагменты), применимые в данном изобретении, могут быть использованы гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для обнаружения in situ TRAFсвязывающего белка данного изобретения. Детектирование in situ может быть выполнено путем взятия гистологического образца из пациента и предоставления меченого антитела данного изобретения такому образцу. Антитело (или фрагмент) предпочтительно предоставляется нанесением или наложением меченого антитела(или его фрагмента) на биологическую пробу. Посредством использования такой процедуры можно определить не только присутствиеTRAF-связывающего белка, но также его распределение на испытуемой ткани. Специалисты с обычной квалификацией в данной области легко поймут, что с использованием данного изобретения любые из большого разнообразия гистологических способов (такие как процедуры окрашивания) могут быть модифицированы для достижения детектирования in situ. Такие тесты для TRAF-связывающего белка данного изобретения обычно предусматривают инкубирование биологической пробы, такой как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубировались в культуре ткани, в присутствии детектируемо меченого антитела, способного идентифицировать TRAF-связывающий белок, и детектирование антитела любым из ряда способов, хорошо известных в данной области. Биологическая проба может быть обработана твердофазным носителем или нанесена на твердофазную подложку, такую как нитроцеллюлоза, или обработана с применением другого твердого носителя или подложки, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой детектируемо меченым антителом данного изобретения, как упоминалось выше. Затем твердофазная подложка или носитель могут быть промыты второй раз буфером для удаления несвязанного антитела. Затем количество связанной метки на твердой подложке или носителе может быть детектировано общепринятыми средствами. Под "твердофазной подложкой", "твердофазным носителем", "твердой подложкой","твердым носителем", "подложкой" или "носителем" подразумевают любую подложку или носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлон-амилазы, 45 природные и модифицированные целлюлозы,полиакриламиды, gabbros и магнетит. Природа носителя может быть либо до некоторой степени растворимой, либо нерастворимой для целей данного изобретения. Материал подложки может иметь практически любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока связанная с ним молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, в виде гранулы, цилиндрической, в виде внутренней поверхности тест-пробирки или наружной поверхности стержня. Альтернативно,эта поверхность может быть плоской, такой как пластинка, тест-полоска и т.д. Предпочтительные подложки или носители включают гранулы из полистирола. Специалистам в данной области могут быть известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена или они смогут установить их при помощи рутинного экспериментирования. Связывающая активность приведенного разнообразия антител данного изобретения,описанного выше, может быть определена при помощи хорошо известных способов. Специалисты в данной области смогут определить рабочие и оптимальные тест-условия для каждого определения при помощи рутинного экспериментирования. Другие стадии, такие как промывание,встряхивание, фильтрование и т.п., могут быть присоединены к этим тестам, как это принято или необходимо для конкретной ситуации. Одним из способов, при помощи которого антитела данного изобретения могут быть детектируемо помечены, является способ соединения их с ферментом и использования в ферментном иммуно-анализе (EIA). Этот фермент,в свою очередь, при экспонировании позже с подходящим субстратом будет реагировать с субстратом таким образом, чтобы образовалась химическая частица, которая может быть детектирована,например,спектрометрическим,флуорометрическим способами или визуально. Ферменты, которые могут быть использованы для детектируемого мечения антитела, включают (но не ограничиваются ими) малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5 стероидизомеразы, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфаглицерофосфатдегидрогеназу,триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена,щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу,глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Детектирование может быть выполнено колориметрическими способами, которые используют хромогенный субстрат для фермента. Детектирование может быть также выполнено визуальным сравнением степени ферментативной реакции субстрата в сравнении с так же приготовленными стандартами. 46 Детектирование может быть выполнено при помощи любого из множества других иммуноанализов. Например, посредством радиоактивного мечения антител или фрагментов антител можно детектировать R-РТРазу при помощи радиоиммуноанализа (RIA). Хорошее описание РИА может быть найдено в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), конкретно в части, озаглавленной "An Introduction to Radioimmune Assay andRelated Techniques", Chard, Т., включенной здесь в качестве ссылки. Радиоактивный изотоп может быть детектирован с использованием счетчика или сцинтилляционного счетчика или авторадиографии. Можно также метить антитело, в соответствии с данным изобретением, флуоресцентным соединением. При экспонировании флуоресцентно меченого антитела на свету с правильно выбранной длиной волны его присутствие может быть затем определено по флуоресценции. Среди наиболее общепринятых соединений для флуоресцентного мечения находятся изотиоцианат флуоресцеина, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, офталевый альдегид и флуорескамин. Антитело может быть детектируемо помечено при помощи испускающих флуоресценцию металлов, таких как 152 Е или другие металлы ряда лантанидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу при помощи таких хелатирующих металл групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Антитело может быть детектируемо помечено соединением его с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно меченого антитела определяют затем детектированием присутствия люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно применимых хемилюминесцентно метящих соединений являются люминол,изолюминол, тероматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалатный эфир. Подобным образом для мечения антитела данного изобретения может быть использовано биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции,обнаруженным в биологических системах, в котором каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют детектированием присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекула антитела данного изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, известном также как "двухслойный" или "сэндвич"-анализ. В типичном иммунометрическом анализе некоторое 47 количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем и некоторое количество детектируемо меченого растворимого антитела добавляют для создания возможности детектирования и/или количественного определения тройного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом. Типичные или предпочтительные иммунометрические анализы включают "прямые" анализы, в которых антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактируют с испытуемой пробой для экстракции антигена из пробы посредством образования двойного комплекса твердофазное антитело-антиген. После подходящего периода инкубирования твердую подложку или носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы, включающей непрореагировавший антиген, если он имеется, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (который действует в качестве "репортерной молекулы"). После второго инкубационного периода для образования комплекса меченого антитела с антигеном, связанным на твердой подложке или твердом носителе через немеченое антитело,твердую подложку или носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченого антитела. В другом типе "сэндвич"-анализа, который может также применяться с антигенами данного изобретения, используют так называемые "одновременные" или "обратные" анализы. Одновременный анализ включает в себя единственную стадию инкубирования, так как антитело,связанное с твердой подложкой или носителем,и меченое антитело добавляют к тестируемой пробе в одно и то же время. После завершения инкубирования твердую подложку или носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы и не образовавшего комплекс меченого антитела. Присутствие меченого антитела, связанного с твердой подложкой или твердым носителем,определяют затем, как и в обычном "прямом" сэндвич-анализе. В "обратном" анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкой пробе с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или твердым носителем,после подходящего периода инкубирования. После второго инкубирования твердую фазу промывают общепринятым способом для освобождения ее от остатка тестируемой пробы и раствора непрореагировавшего меченого антитела. Определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, определяют, как в "одновременном" и "прямом" анализах. Как упоминалось выше, данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим рекомбинантные вирус 004309 48 ные векторы (вирус животного), кодирующие ТRAF-связывающие белки, причем этот вектор кодирует также поверхностный белок вируса,способный связывать поверхностные белки специфической клетки-мишени (например, раковых клеток), для нацеливания инсерции последовательностей ТRAF-связывающего белка в эти клетки. Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения содержат в качестве активного ингредиента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательностиTRAF-связывающего белка, или (b) лекарственные средства, которые ингибируют взаимодействие TRAF-связывающий белок-TRAF. Фармацевтические композиции в соответствии с данным изобретением включают достаточное количество активного ингредиента для достижения намеченной цели. Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку активных соединений в препараты, которые могут использоваться фармацевтически, и которые могут стабилизировать такие препараты,предназначенные для введения субъекту, нуждающемуся в таком введении, как хорошо известно специалистам в данной области. Предполагается, что TRAF-связывающий белок и его изоформы или изотипы экспрессируются в различных тканях при заметно отличающихся уровнях и, по-видимому, также с различными распределениями изотипов аналогично экспрессии различных других белков, участвующих в путях внутриклеточной передачи сигнала, как показано в перечисленных выше совместных и ожидающих одновременного рассмотрения патентных заявках. Эти различия могут, возможно, способствовать тканеспецифическим особенностям ответной реакции на лиганд FAS/APO1 и TNF. Как и в случае другихet al., 1995), авторы данного изобретения показали ранее (в вышеупомянутых патентных заявках) , что изоформы МАСН, которые содержат неполные районы CED3/ICE (например,МАСН 3), обладают, как было найдено, ингибирующим действием на активность коэкспрессируемых молекул МАСН 1 или МАСН 2; было обнаружено также, что они ингибируют индукцию гибели клеток FAS/APO1 и p55-R. Экспрессия таких ингибиторных изоформ может составлять механизм клеточной самозащиты против опосредованной FAS/APO1 и TNF цитотоксичности. Большая гетерогенность изоформ МАСН, которая сильно превышает гетерогенность, наблюдаемую для любой из других протеаз семейства CED3/ICE, должна сделать возможной особенно тонкую настройку функции активных изоформ МАСН. 49 В соответствии с данным изобретением были также выделены аналоги/мутеины одного из TRAF-связывающих белков, а именно ТRAF2-связывающего белка NIK. Эти аналоги/мутеины NIK (см. выше и см. примеры ниже) являются ингибирующими для опосредованнойNIK активации NF-В, а также ингибирующими для индукции активации NF-В, опосредованной TNF-рецепторами, рецептором FAS/APO1,затем родственными белками, рецептором IL-1 и другими агентами. Таким образом, как отмечалось выше, TRAF-связывающие белки или возможные изоформы могут иметь различающиеся эффекты в различных тканях в отношении их взаимодействия с TRAF-белками и их влияния тем самым на активность TRAF-белков или внутриклеточной передачи сигнала, опосредованного TRAF-белками. Возможно также, что возможные изоформы TRAF-связывающего белка обслуживают другие функции. Например, NIK или некоторые аналоги NIK или изоформы могут также действовать в качестве сайтов стыковки для молекул,которые участвуют в других, нетоксических эффектах, например, рецепторов FAS/APO1 иTRAF2 или даже независимо от TRAF2. Вследствие уникальной способности рецепторов FAS/APO1 и TNF вызывать смерть клеток, а также способности рецепторов TNF запускать другие повреждающие клетки активности, отклонения в функции этих рецепторов могло бы быть особенно пагубными для организма. В самом деле, было показано, что как избыточное, так и недостаточное функционирование этих рецепторов способствует патологическим проявлениям различных болезней (Vassalli, 1992; Nagata and Golstein, 1995). Идентификация молекул, которые участвуют в активности передачи сигнала этих рецепторов, и отыскание путей модулирования активности этих молекул могло бы указать путь к новым терапевтическим подходам. Ввиду предполагаемой важной роли белков TRAF, например, TRAF2, и,следовательно, взаимодействия TRAF-TRAFсвязывающего белка, например, TRAF2-NIK, в опосредованной FAS/APO1 и TNF активацииNF-В представляется особенно важным конструирование лекарственных средств, которые могут ингибировать взаимодействие TRAFTRAF-связывающий белок, например, взаимодействие TRAF2-NIK, когда это желательно для убивания клеток (путем ингибирования активации NF-В), и, наоборот, когда желательно сохранить клетки, это взаимодействие должно быть усилено (для усиления активации NF-В). Данное изобретение относится также к белкам или другим лигандам, которые могут связываться с TRAF-связывающими белками данного изобретения и тем самым модулировать/медиировать активность TRAF-связы 004309 50 вающих белков. Такие белки или лиганды могут быть подвергнуты скринингу, выделены и получены любым из вышеупомянутых способов. Например, может быть выделен ряд лигандов, в том числе белков, способных связываться с белками NIK данного изобретения (в такие новые белки/лиганды не входит известный TRAF2 и,возможно, I-В, если NIK действительно связывает I-В). Как подробно описано выше, такие новые белки/лиганды,связывающиеTRAFсвязывающий белок,например,NIKсвязывающие белки, могут служить, например,в качестве ингибиторов или усилителей опосредованной NIK активности или активности, опосредованной,например,взаимодействиемTRAF2-NIK, и в качестве таковых будут играть важную роль в разнообразных патологических и других ситуациях, описанных подробно выше. Другой функцией таких белков/лигандов, связывающих TRAF-связывающий белок, могло бы быть их функционирование в качестве специфических агентов для очистки TRAF-связывающих белков, например, аффинной хроматографией, причем эти новые связывающие белки/лиганды присоединяют к подходящим хроматографическим матриксам для образования твердого или аффинного носителя/матрикса,через который будет проходить раствор, экстракт или т.п., содержащий TRAF-связывающие белки, например, NIK, и для облегчения таким образом их очистки. Такие способы аффинной хроматографии в настоящее время хорошо известны и являются стандартными процедурами в данной области. Подобным образом все вышеупомянутыеTRAF-связывающие белки, аналоги, фрагменты,изоформы и производные данного изобретения могут быть использованы для очистки аффинной хроматографией различных TRAF-белков, с которыми они связываются. Например, TRAF2 связывающие белки, подобные NIK, и аналоги,фрагменты и мутеины NIK (см. примеры ниже) могут быть использованы для очистки TRAF2 аффинной хроматографией. Поэтому тем же самым способом, что и белок NIK, были выделены и получены аналоги/мутеины данного изобретения (см. примеры ниже), и при помощи этих способов и любых других равноценных способов, вполне очевидных для специалистов в данной области (как подробно описано выше),могут быть идентифицированы и получены любые другие ТRАF2-связывающие белки. Такой способ идентификации и получения этих TRAFсвязывающих белков, например, ТRАF2 связывающих белков, будет включать в себя стадию скрининга, в которой белок TRAF (например, TRAF2) или по меньшей мере его специфическую часть (например, часть TRAF2 между аминокислотами 222-501) используют в качестве субстрата или "приманки" для получе 51 ния белков или любого другого лиганда, способного связываться с ними; с последующими стадиями идентификации и характеристики полученных таким образом белков/лигандов; и затем получение таких белков/лигандов в по существу изолированных и очищенных формах. Все эти стадии хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны здесь выше и ниже. Теперь данное изобретение будет описано подробно в деталях в следующих далее неограничивающих примерах и сопутствующих рисунках. Следует отметить, что процедуры:(i) двухгибридного скрининга и двухгибридного теста экспрессии -галактозидазы;(v) Нозерн-анализ и секвенирование, а также другие процедуры, использованные в следующих примерах, были детально описаны в более ранних публикациях авторов данного изобретения в отношении других белков и путей внутриклеточной трансдукции сигналовBoldin et al., 1996). Эти процедуры описаны также в деталях в совместных ожидающих одновременного рассмотрения Israel ApplicationNo. PCT/US96/10521. Поэтому полные описания всех этих публикаций и патентных заявок включены здесь во всей их полноте и по меньшей мере настолько, насколько это касается подробных экспериментальных процедур. ПРИМЕРЫ Материалы и методыa) Библиотека кДНК В-клеток Использовали олиго dT-праймированную библиотеку, сконструированную из В-клеток человека (Durfee et al., 1993). кДНК этой библиотеки вводили в сайт XhoI вектора рSЕ 1107 на основе рАСТ в слитом виде с доменом активации GAL4.b) Библиотека кДНК яичка gt10 Использовали библиотеку кДНК яичка человека. Эта библиотека является праймированной произвольным гексануклеотидом библиотекой со средним размером вставки 200-400 п.н.ii) Штаммы дрожжей Для трансформации и скрининга использовали два штамма дрожжей в качестве штаммовхозяев: штамм HF7c, который использовали в двухгибридном скрининге, и штамм SFY526,который использовали в -галактозидазных тестах. Оба штамма несут ауксотрофные маркерыtrp1 и leu2, то есть эти штаммы дрожжей не мо 004309 52 гут расти в минимальной синтетической среде без триптофана и лейцина, если они не трансформированы плазмидой, несущей варианты дикого типа этих генов (TRP1, LEU2). Эти два штамма дрожжей несут делеционные мутации в их генах GAL4 и GAL80 (мутации ga14-542 иTRAF2 человека клонировали при помощи ПЦР из библиотеки кДНК HL60 (в отношении последовательности TRAF2 и других деталей см. Rothe et al., 1994; Rothe et al., 1995a; Cheng etCAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC, соответствующий кодирующей последовательности hTRAF2, начинающейся от кодона для первого метионина (подчеркнутого) и включающей линкер с сайтом BamHI,b) 32-мерный обратный праймерGGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG, который включает стопкодон гена hTRAF2(подчеркнутый) и сайт рестрикции SalI в его линкере. Программа ПЦР включала исходную стадию денатурации 2 мин при 94 С с последующими 30 циклами 1 мин при 94 С, 1 мин при 64 С и 40 с при 72 С. Затем амплифицированный ген TRAF2 человека вводили в сайтыiv) Двухгибридный скрининг библиотеки В-клеток Двухгибридный скрининг является способом(см. детали в вышеупомянутых публикациях и патентных заявках), применяемым для идентификации факторов, которые связаны с определенной молекулой, которая служит в качестве "приманки". В данном изобретении TRAF2, клонированный в вектор pGBT9, служил в качестве приманки.TRAF2 коэкспрессировали вместе со скринированной библиотекой кДНК В-клеток в штамме дрожжей HF7c. Клонированный ПЦР TRAF2 был рекомбинантным слитым белком с GAL4 ДНКсвязывающим доменом, а скринированную библиотеку кДНК сливали с доменом активации GAL4 в векторе pSE1107. Репортерный ген в HF7c былHIS3 слит с активирующей последовательностью против хода транскрипции (UAS) от промотораGAL1, которая чувствительна к активатору транскрипции GAL4. Трансформанты, которые содержали как плазмиду pGDT9, так и плазмиду pSE1107, 53 отбирали для выращивания на чашках без триптофана и лейцина. Во второй стадии позитивные клоны, которые экспрессировали два гибридных белка,которые взаимодействовали друг с другом, и, следовательно, активировали GAL1-HIS3, выскребали из чашек, не содержащих триптофана, лейцина и гистидина и содержащих 50 мМ 3-аминотриазолmanual (в отношении деталей см. вышеупомянутые публикации и патентные заявки). Вкратце,трансформантам давали расти при 30 С в течение 2-4 дней до достижения 2 мм в диаметре,затем их переносили на фильтры Whatman. Фильтры проходили через обработку замораживания/оттаивания для обеспечения проницаемости клеток, затем их замачивали в буфере (16,1 мг/мл Na2HPO47H2O; 5,5 мг/мл NaH2PO4H2O; 0,75 мг/мл KСl; 0,75 мг/мл МgSO47 Н 2 О, рН=7),содержащем 0,33 мг/мл Х-gal и 0,35 мМ меркаптоэтанол. Колонии наблюдали в отношении развития голубой окраски, которая является указанием на индукцию -галактозы.vi) Экспрессия клонированных кДНК Конструировали два типа экспрессирующих векторов:a) векторы на основе pUHD10-3, содержащие открытую рамку считывания (ORF) либо клона 9, 10, либо 15, слитую с эпитопом гемаглютинина (НА).b) вектор на основе pUHD10-3, в который была введена последовательность октапептида(в отношении этих клеток см. Gossen, М. andBujard, М. (1992 либо отдельно, либо котрансфицировали с FLAG/B6/TRAF2 при помощи стандартного кальций-фосфатного метода (Метод, например, в Current Protocols in Molecularvii) Люциферазный тест Обычно 5 х 105 трансфицированных клеток собирали промыванием три раза холодным РВУ и ресуспендированием в 400 мкл буфера для экстракции (0,1 М K2 НРO4/KН 2 РO4 рН=7,8; 1 мМ ДТТ). Лизис этих клеток получали трехкратным замораживанием в жидком азоте и оттаиванием. Остатки клеток удаляли центрифугированием (5 мин при 10000 х g). Для люциферазного теста к 50 мкл лизата добавляли 200 мкл люциферазного буфера (25 мМ глицилглицин,15 мМ K2HPO4/KH2PO4 рН=7,8; 15 мМ МgSO4, 4 мМ ЭГТА, 2 мМ АТФ, 1 мМ ДТТ). Затем к реакционной смеси добавляли 100 мкл 0,2 мМ Dлюциферина, 25 мМ глицилглицина, 1 мМ ДТТ. 54 Люциферазную активность определяли регистрацией эмиссии света при помощи Lumitron luminometer, установленного на 10-секундную интеграцию (см. вышеупомянутые публикации и патентные заявки в отношении дополнительных деталей). Пример 1. Клонирование новых клонов 9,10 и 15. Библиотеку кДНК, приготовленную из Вклеток, подвергали скринингу на белки, которые связываются с TRAF2, с использованием двухгибридного способа, описанного в разделе Материалы и методы (iv). Только в трансформантах, которые экспрессировали как TRAF2,так и белок, способный взаимодействовать с ним, GAL4 ДНК-связывающий домен и домен активации транскрипции были соединены вместе. Результатом была активация и экспрессия репортерного гена, в этом случае HIS3, слитого с UAS и ТАТА-частью промотора GAL1. Скрининг дал приблизительно 2000 клонов, которые были способны расти на чашкахTrp-, Leu-, His- 3AT. ДНК, полученная из 165 произвольно выбранных позитивных клонов,служила для временной котрансфекции штамма дрожжей SFY526 вместе с TRAF2, клонированным в вектор pGBT9. Тест на -галактозидазную активность выполняли на колониях трансформированных дрожжей SFY526, как описано в разделе Материалы и методы (v). Голубая окраска, которая развивалась, была указанием на колонии, которые содержат кДНК, кодирующую белок или полипептид, который связывается с TRAF2. Результаты двухгибридного скрининга,способность выбранных (выскребанием) клонов расти на чашках с 3 АТ и индуцировать LacZ,измеренные в цветном тесте, суммированы в табл. I. Из проверенных позитивных клонов два представляли кДНК, кодирующую известные белки; сам TRAF2, который способен самоассоциироваться и образовывать гомодимеры, и бета-рецептор лимфотоксина, внутриклеточные домены которого, как было показано, связываютTRAF2. Три из этих клонированных кДНК(клоны 9, 10 и 15) были новыми. Позитивные клоны проверяли далее в тесте специфичности связывания, а именно проверяли на их взаимодействие с не относящимися к делу приманками. Как показано в табл. II, клоны 9 и 10 взаимодействовали только с TRAF2 и не связывались ни с одним из ряда испытанных посторонних белков. С другой стороны, клон 15, не связывался с MORT-1 и с межклеточными доменами рецепторов TNF р 55 и р 75, но слабо связывался с Ламином и с Циклином D. Для сужения района на молекуле TRAF2,который взаимодействует с клонами 9, 10 и 15,были изготовлены две дополнительные конструкции. Одна конструкция содержала Nконцевую часть молекулы TRAF2, аминокислоты 1-221, которая включала мотивы Ring-пальца 55 и цинкового пальца. Вторая конструкция включала только С-концевую часть молекулы, аминокислоты 222-501, охватывающие "TRAFдомен" и дополнительные 42 аминокислоты. Эти две конструкции служили в качестве приманок в двухгибридных тестах. Результаты ясно показывают, что тогда как клоны 9, 10 и 15 не взаимодействовали с конструкцией, содержащей аминокислоты 1-221 молекулы TRAF2, все они действительно связывались с С-концевой конструкцией, содержащей "TRAF-домен", с той же эффективностью, с которой они связывались с полноразмерной молекулой TRAF2. Таблица I Суммирование результатов двухгибридного скрининга с использованием TRAF2 в качестве "приманки", в котором выскребали клоны 9, 10 и 15 Рост Цветной ID/название Число клона, опреде- независина 50 тест,ленное его сек- мых кломМ мин нов венированием 3 АТ+ 15 новый клон 5 15 Таблица II Тесты на специфичность (взаимодействие с посторонними приманками в двухгибридном тесте) клон приманка клон 9 клон 10 клон 15 Путем применения нескольких стадий ПЦР к клону 10 кДНК была клонирована полноразмерная кДНК из библиотек кДНК, полученных из РНК тканей человека. Этот белок был назван NIK (индуцирующая NF-В киназа), поскольку он содержит район протеинкиназы (см. ниже). Следует заметить, что при первоначальном анализе последовательности клона 10 (перед получением NIK при помощи ПЦР) было обнаружено, что она кодирует белок, первоначально названный NMPI (см. совместную, ожидающую рассмотрения заявку IL 117800). Было обнаружено, что этот NMPI или кодируемый клоном 10 белок имеет последовательности,соответствующие консервативным мотивам I004309XI, которые характеризуют Ser/Thr-протеинкиназы. Пример 2. Секвенирование новых клонов. Три из новых клонов кДНК (клоны 9, 10 и 15) были очищены, амплифицированы в E.coli и их ДНК была подвергнута анализу последовательности (секвенированию). Было обнаружено,что все три клона являются частичными клонами кДНК. Общие длины клонов 9, 10 и 15 были приблизительно 2000, 2700 и 1300 п.н., соответственно. Фиг. 3 и 5 показывают секвенированную часть клонов 9 и 15 и фиг. 4 показывает полную последовательность клона 10. Фиг. 5 а-b показывают полную нуклеотидную последовательность клона 15, секвенированную от обоих 5'- и 3'- концов (а) и расшифрованные кодируемые ею аминокислоты (b). Было обнаружено, что клон 15, который является частичным клоном кДНК, кодирует белок с длиной 172 аминокислоты. Клоны 9 и 15 являются частичными клонами, которые лишены их наиболее дальнего 5'конца кодирующих последовательностей ДНК. Расшифрованные аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 3b, 4b и 5b, все начинаются от первого нуклеотида соответствующего клона. Последовательность клона 10 (частичный клон кДНК), которая была наиболее основательно анализирована, кодирует белок, названный NMP1, как отмечалось выше, содержащий мотив Ser/Thr-протеинкиназы. Полноразмерный клон кДНК, полученный ПЦР с использованием клона 10, как отмечалось выше, выявил новуюTRAF2-связывающую киназу NIK, как упоминалось выше. Полная нуклеотидная последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность NIK показаны на фиг. 6, в которой инициирующий кодон ATG при нуклеотиде 232 подчеркнут и в которой стоп-кодон при нуклеотиде 3073 указан звездочкой. Полноразмерный клон NIK фиг. 6 имеет в длину 4596 нуклеотидов, внутри которых содержится кодирующая последовательность NIK, кодирующая белок NIK, состоящий из 947 аминокислотных остатков. Поиск в банках данных выявил, что новая аминокислотная последовательность NIK обнаруживает особенно высокую гомологию с группой киназ, о некоторых из которых известно,что они функционируют в качестве киназыMAP. Фиг. 7 показывает сравнение первичной молекулярной структуры: мышиной МЕKKK (S1),BYR2 (S2),Tp1-2 (S3),онкогена саркомы Ewing (S4), 57SS3 (S5), (STE11) (S6), (NPK1) (S7),(BCK1) (S8) и (NIK) (S9). Некоторые из этих киназ были идентифицированы благодаря онкогенной активности,которой они обладают в мутированном виде. Пример 3. Экспрессия клонированных кДНК и их коиммунопреципитация с TRAF2. КлеткиTRAF2, меченым FLAG, в экспрессирующем векторе на основе pUHD10-3 и конструкциями, содержащими ORF любого из клонов 9, 10 или 15,слитыми с эпитопом НА, как описано в разделе Материалы и методы (iv). Затем клетки выращивали в течение 24 ч в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ЭМЕМ) плюс 10% телячья сыворотка с добавленными 35S-метионином и 35S-цистеином. В конце этого периода инкубации клетки лизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (10 мМ Трис-НСl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonident P-40, 1% деоксихолат, 0,1% ДСН и 1 мМ ЭДТА; 1 мл/5 х 105 клеток) и лизат предварительно осветляли инкубированием с посторонней кроличьей антисывороткой и гранулами G-Sepharose протеином (Pharmacia,Sweden). Иммунопреципитацию проводили инкубированием в течение 1 ч при 4 С аликвот лизата с моноклональными антителами против FLAG(клон 12 СА 5 (Field, J. et al. (1988. Экспрессируемые белки анализировали при помощи электрофореза на геле ПААГ-ДСН с последующей авторадиографией. Результаты таких экспериментов показали,что частичные клоны кДНК 9, 10 и 15 кодировали белки с мол. массой приблизительно 50-65,45 и 26 кДа, соответственно. Не смогли определить взаимодействия клона 15 с TRAF2, но белки, кодируемые клонами 9 и 10TRAF2 и любым из этих двух клонов, и иммунопреципитировали либо антителами против FLAG,либо антителами против НА с последующим анализом при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН,как описано выше, показали три полосы в каждой дорожке: одну полосу, соответствующую белкам,кодируемым клоном 9 или клоном 10, и две другие полосы, представляющие собой дублет 42 и 44 кДа, соответствующий белку TRAF2. Пример 4. Функциональные тесты. Было обнаружено электрофоретическом анализом на замедление подвижности в геле,что NIK вызывает индукцию NF-В. В типичном случае 0,5-1x106 клеток 293 EBNA трансфицировали 10 мкг клона 10 в pcDNA3 (фиг. 7,дорожка 1), 3 мкг pcDNA3, содержащей кДНК для рецептора TNF р 75 (фиг. 7, дорожка 3) или клоном 10 (10 мкг) и рецептором TNF р 75 (3 мкг) (фиг.1, дорожка 2). В каждой из этих трансфекций общее количество трансфицированной ДНК доводили до 15 мкг "пустым" век 004309 58 тором pcDNA3. В качестве контроля служили клетки 293 EBNA, трансфицированные 15 мкг только вектора pcDNA3 (фиг.7, дорожка 4). Клетки выращивали в течение 24 ч в среде(Schreiber, E. et al. (1989. Пробы подвергали электрофорезу на 5% полиакриламидном геле.NF-В наблюдали с использованием набора 32 Ррадиоактивно меченых олигонуклеотидов, соответствующих сайту связывания NF-В в качестве зондов.NF-В даже более эффективно, чем TRAF2. С другой стороны, клон 10 вообще не имел этого эффекта. Анализ с репортерным геном выполняли следующим образом. Клетки 293 EBNA котрансфицировали вектором pcDNA3, содержащим HIV LTR, соединенный с люциферазным репортерным геном, вместе с плазмидой pcDNA3, содержащей кДНК только для TNF-рецептора р 75, плазмидой pcDNA3, содержащей только кДНК клона 10, или плазмидой pcDNA3, содержащей кДНК для TNF-рецептора р 75, и плазмидой pcDNA3,перечисленными в табл. III и IV. Результаты, приведенные в табл. IV, показывают, что:a) трансфекция клоном 10 не активирует индукцию NF-В, тогда как NIK сильно активирует,b) клон 10, а также NIK, в котором лизин активного сайта заменен аланином (NIK),сильно ингибировали индукцию NF-В кДНК,перечисленными в первом столбце табл. III. Делеция 3'-UTR NIK (NIK-3'UTR) сильно увеличивала его экспрессию, и вследствие этого его способность ингибировать индукцию NF-В при экспрессии в виде мутированной формы. Таблица III. Активация NF-В NIK. Электрофоретический анализ на замедление подвижности в геле. Числа представляют собой импульсы событий радиоактивного распада, детектируемые пластинкой "phosphoimager" ТрансфицироИмпульсы Площадь ванная кДНКND = не определяли Пример 5. Дополнительные характеристики NIK. Кроме тестов на специфичность примера 2 выше, дальнейшее двухгибридное тестирование связывающих свойств NIK выявило (результаты не приведены), что первоначально выделенный частичный клон NIK (NIK 624-947) связывается специфически с С-концевым районом TRAF2(C-TRAF-доменом), тогда как, в противоположность этому, полноразмерный NIK связывался как с C-TRAF-доменом, так и с районом против хода транскрипции от него (N-TRAF-доменом).NIK также не связывается с TRAF3. Далее, химерная молекула, содержащая C-TRAF-доменTRAF2 и N-концевую часть TRAF3, могла связывать частичную молекулу NIK (NIK 624-947),но не полноразмерный NIK, что указывало на то, что связывание полноразмерного NIK сFAS/APO1 (СD96-рецептора). NIK также не связывается с внутриклеточными белками, ассоциированными с этими рецепторами, такими как, например, TRADD, MORT-1 и RIP. Эти результаты коррелируют с результатами, показанными в табл. II выше, касающимися специфичностей связывания белков, кодируемых клонами 9, 10 и 15. Различные взаимодействия между различными рецепторами и белками изображены схематически на фиг. 2 а и 2, причем на фиг. 2b являются более полными. Нозерн-блот-анализ выявил, что имеется единственный транскрипт NIK, экспрессируемый в различных тканях при разных уровнях,который имеет размер приблизительно 5000 нуклеотидов, который по существу такой же,что и у клонированной кДНК NIK (как отмечалось выше, см. фиг. 6). Кроме того, как отмечалось выше в отношении белка, кодируемого клоном 10 (первона 60 чально названного NMPI), полноразмерный белокNIK имеет также серин/треонинпротеинкиназный мотив, сходный с несколькими киназами киназы киназы MAP (МАРККК),как это видно также из сравнений последовательностей, показанных на фиг. 7. Тестирование in vitro киназной активностиNIK выявило, что NIK может быть автофосфорилированным, но не в случае, когда лизин активного сайта и соседний лизин заменены аланином (аналог или мутеин N1K, обозначенныйNIK KK429-430AA, что указывает на замены лизинов в положениях 429 и 430 аланинами). Это также коррелирует с результатами, представленными выше в примере 4 и показанными в Таблице IV, в отношении NIК-мутеина. Как упоминалось выше, сверхэкспрессияNIK в клетках 293 EBNA индуцировала NF-В даже до более высокой степени, чем сверхэкспрессия TRAF2, но сверхэкспрессия частичногоNIK (NIK 624-947) не вызывала активации NFВ. Кроме того, вышеуказанный аналог/мутеинNIK NIK KK429-430AA также не вызывал активации NF-В при сверхэкспрессии в этих клетках. Таким образом, индукция NF-В NIK зависит от интактной киназной функции NIK. В противоположность этому, RIP (см. фиг. 2 а, b),который также имеет киназный домен, все еще может индуцировать активацию NF-В, когда его киназная активность устраняется мутацией. Активация NF-В при сверхэкспрессииNIK была неотличима от активации, производимой обработкой этих клеток TNF, и, как в случае сверхэкспрессии TNF или TRAF2, главными компонентами NIK-активированного NFВ были р 50 и р 65. Сверхэкспрессия NIK вызвала деградацию I-В и ингибирование этой деградации N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинолом(ALLN), приводившей (как в случае с TNF) к накоплению молекул I-В, имеющих более медленную подвижность при электрофорезе в ПААГ-ДСН, указывающую на присутствие фосфорилированного 1-В. Другие тесты выявили, что NF-В может активироваться в клетках 293 EBNA TNF, а также сверхэкспрессией рецепторов р 55 и р 75 или сверхэкспрессией TNF-рецептора р 55, в котором внутриклеточный доменFAS/APO1. NF-В может быть также активирован сверхэкспрессией TRAF2, TRADD, RIP илиMORT-1, но не делеционного мутанта MORT-1,лишенного района против хода транскрипции от"домена смерти" MORT-1. Как отмечалось выше, полноразмерный NIK, но не мутеин NIKNIK (NIK 624-947) в клетках 293-EBNA вместе с любым из указанных выше агентов, т.е. рецепторами или ассоциированными белками, приво