Ковалентные конъюгаты α,α-двузамещенного глицинового эфира и модулятора активности внутриклеточного фермента или рецептора

КОВАЛЕНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ,-ДВУЗАМЕЩЕННОГО ГЛИЦИНОВОГО ЭФИРА И МОДУЛЯТОРА АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ФЕРМЕНТА ИЛИ РЕЦЕПТОРА В изобретении представлены ковалентные конъюгаты ,-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, в которых эфирная группа конъюгата способна к гидролизу под действием одного или более внутриклеточных ферментов карбоксилэстераз с образованием соответствующей кислоты и ,-дизамещенный глициновый эфир сопряжен с модулятором в положении, удаленном от поверхности связывания между ингибитором и целевым ферментом или рецептором, и попадает в клетки, где накапливается активный кислотный продукт гидролиза. Драммонд Алан Гастингс, Дэвидсон Алан Хорнсби, Моффат Дэвид Фестус Чарльз, Дональд Элистейр Дэвид Грэм, Дэвис Стивен Джон (GB) Дементьев В.Н. (RU) Данное изобретение относится к способу повышения или пролонгирования активности соединения,которое модулирует активность внутри клеточного фермента или рецептора путем ковалентного конъюгирования ,-фрагмента дизамещенного глицинового эфира с модулятором. Это изобретение относится также к модуляторам, с которыми фрагмент ,-дизамещенного глицинового эфира ковалентно конъюгирован, и к способу идентификации таких конъюгатов, имеющих превосходные свойства относительно родительского неконъюгированного модулятора. Далее настоящее изобретение относится к применению модуляторов, содержащих фрагменты ,-дизамещенного глицинового эфира, которые обеспечивают селективное накопление конъюгатов аминокислот в клетках линий моноцитов-макрофагов. Предпосылки создания изобретения Многие внутриклеточные ферменты и рецепторы являются мишенями для фармацевтически полезных лекарств, которые модулируют их активность при связывании с их активными сайтами. Примеры приведены в табл. 1 ниже. Для того чтобы достичь целевых ферментов и рецепторов, модуляторы должны, конечно, пересечь клеточную мембрану из плазмы/внеклеточной жидкости. В общем, нейтральные модуляторы пересекают клеточную мембрану легче, чем заряженные молекулы. Затем устанавливается динамическое равновесие, когда модулятор находится в состоянии равновесия между плазмой и внутренней частью клетки. Как результат равновесия, время пребывания внутри клетки и концентрации многих модуляторов внутриклеточных ферментов и рецепторов часто очень невелико, особенно в случаях,когда модулятор быстро удаляется из плазмы. Активности модуляторов поэтому невелики, несмотря на их высокое сродство к связыванию с целевым ферментом или рецептором. Международная заявка WO 2006/117567 раскрывает способ повышения внутриклеточной концентрации данного модулятора внутри клеточного фермента или рецептора путем конъюгирования с фрагментом эфира -аминокислоты, который гидролизуется одной или несколькими внутриклеточными карбоксилэстеразами hCE-1, hCE-2 и hCE-3. Это приводит к повышенной активности за счет пролонгирования пребывания модулятора внутри клетки и приводит к улучшенным фармакокинетическим и фармакодинамическим свойствам. Могут быть достигнуты более стойкое воздействие и применение меньших доз. Достигается и другое преимущество, когда фрагмент эфира -аминокислоты сопрягается с модулятором таким образом, что лекарство попадает в конкретные целевые клетки, отвечающие за их терапевтическое действие, уменьшая системное воздействие и проявление побочных эффектов. Конъюгаты эфира -аминокислоты, описанные в международной заявке WO 2006/117567, все являются монозамещенными у -углерода. Эта публикация не предполагает, что конъюгаты ,дизамещенного глицинового эфира могут гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами. В действительности, оказывается, что способность внутриклеточных карбоксилэстераз, в основном hCE-1,hCE-2 и hCE-3, гидролизоавать ,-дизамещенный глициновый эфир не была ранее исследована. Сущность изобретения Данное изобретение основано на обнаружении нового явления, что конъюгаты ,-дизамещенных глициновых эфиров могут гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами и, таким образом,способы и преимущества, описанные в заявке WO 2006/117567, также могут быть достигнуты с такими конъюгатами. Такие преимущества включают внутриклеточное накопление продуктов кислотного гидролиза и в некоторых случаях селективное накопление в клетках конкретного типа. Как и в заявке WO 2006/117567, данное изобретение имеет преимущество в том, что липофильные (низкая полярность нейтральных молекул) молекулы проходят через клеточную мембрану и попадают в клетки довольно легко,а гидрофильные (с большей полярностью, заряженные) молекулы - нет. Следовательно, если липофильный фрагмент присоединен к данному модулятору, позволяя модулятору попасть в клетку, и если этот фрагмент превращается в клетке во фрагмент с большей полярностью, ожидается, что модулятор с присоединенным фрагментом с большей полярностью будет накапливаться внутри клетки. При условии, что такой фрагмент присоединен к модулятору таким образом, при котором не изменяется его связывание с целевым ферментом или рецептором, ожидается, что накопление модулятора с присоединенным фрагментом с большей полярностью приведет к пролонгированной и/или повышенной активности. Как и в случае заявки WO 2006/117567, данное изобретение использует тот факт, что имеются ферменты карбоксилэстеразы в клетках, которые могут применяться для гидролиза фрагмента ,дизамещенного глицинового эфира, присоединенного к данному модулятору родительской кислоты. Следовательно, модулятор может быть введен как ковалентный конъюгат с ,-дизамещенным глициновым эфиром, в виде которого он легко попадает в клетку, где он эффективно гидролизуется одной или несколькими внутриклеточными карбоксилэстеразами и полученный конъюгат ,-дизамещенный глицин-модулятор накапливается в клетке, повышая общую активность и/или время активного пребывания. Было также обнаружено, что путем модификации фрагмента ,-дизамещенного глицинового эфира или способа, которым было достигнуто конъюгирование, модуляторы могут быть нацелены на моноциты и макрофаги. В данной заявке, если только "моноцит" или "моноциты" не конкретизированы, термины"макрофаг" или "макрофаги" применяются для обозначения макрофагов (включая макрофаги, ассоциируемые с опухолями) и/или моноцитов. Настоящее изобретение относится к ковалентному конъюгату ,-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа конъюгата селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам, содержащим hCE-2 или hCE-3, но не hCE-1;,-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором; указанный ,-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом,где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках U937; (b) анализа ингибирования фосфорилирования MAPKAP2, проводимого на раковых клетках U937; и (с) анализа стимулирования LPS, проводимого на клетках ТНР-1. В другом варианте осуществления изобретение относится к ковалентному конъюгату ,дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, где эфирная группа селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам, содержащим hCE-2 или hCE-3, но не hCE-1;,-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора; указанный ,-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом,где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках U937; (b) анализа ингибирования фосфорилирования MAPKAP2, проводимого на раковых клетках U937; и (с) анализа стимулирования LPS, проводимого на клетках ТНР-1. В предпочтительном варианте осуществления -заместители в ,-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, независимо выбраны из фенила и групп формулы -CRaRbRc, в которых каждый из Ra, Rb и Rc независимо обозначает водород, (С 1-С 6)алкил, (С 2-С 6)алкенил, (С 2 С 6)алкинил, фенил(С 1-С 6)алкил, (С 3-С 8)циклоалкил; или Rc обозначает водород, Ra и Rb независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N и О, такой как пиридил; или Rc обозначает водород, (С 1-С 6)алкил, (С 2-С 6)алкенил, (С 2-С 6)алкинил, фенил(С 1-С 6)алкил или (С 3-С 8)циклоалкил, Ra и Rb вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8 членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из S, N и О; или Ra, Rb и Rc вместе с атомом углерода, к которому они присоединены,образуют адамантил; илиRa и Rb, каждый независимо, обозначают (С 1-С 6)алкил, (С 2-С 6)алкенил, (С 2-С 6)алкинил, фенил(С 1 С 6)алкил или группу, определение которой дано ниже для Rc, отличающуюся от водорода, или Ra и Rb вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8-членный циклоалкил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N и О, и Rc обозначает водород, -ОН, -SH, галоген, -CN, -СО 2 Н, (C1-С 4)перфторалкил, -СН 2 ОН, -О(С 1-С 6)алкил, -О(С 2 С 6)алкенил, -S(C1-С 6)алкил, -SO(С 1-С 6)алкил, -SO2(С 1-С 6)алкил, -S(С 2-С 6)алкенил, -SO(C2-С 6)алкенил,-SO2(С 2-С 6)алкенил или группу -Q-W, где Q обозначает связь или -О-, -S-, -SO- или -SO2- и W обозначает фенил, фенил(С 1-С 6)алкил, (С 3-С 8)циклоалкил, (С 3-С 8)циклоалкилалкил, (С 4-С 8)циклоалкенил, (C4 С 8)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N и О, или гетероарил(С 1-С 6)алкил, в котором гетероарильная группа представляет собой моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N и О, причем группа W может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -CN, -CONH2,-CONH(С 1-С 6)алкила, -CONHС 1-С 6)алкил)2, -СНО, -СН 2 ОН, (C1-С 4)перфторалкила, -О(С 1-С 6)алкила,-S(С 1-С 6)алкила, -SO(С 1-С 6)алкила, -SO2(С 1-С 6)алкила, -NO2, -NH2, -NH(С 1-С 6)алкила, -NC1-C6)алкил)2,-NHCO(С 1-С 6)алкила, (С 1-С 6)алкила, (С 2-С 6)алкенила, (С 2-С 6)алкинила, (С 3-С 8)циклоалкила, (С 4 С 8)циклоалкенила, фенила или бензила. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения -заместители ,дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, вместе с самим -атомом углерода образуют 3-6-членное насьщенное циклоалкильное или гетероциклическое кольцо или по меньшей мере один из указанных -заместителей является С 1-С 6-алкильным заместителем. В другом предпочтительном варианте осуществлении изобретения один из -заместителей ,дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является C1-С 6-алкильным заместителем, а другой выбран из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- и третбутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения один из -заместителей ,дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является метилом, а другой является метилом, этилом или н- или изопропилом или указанные -заместители вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропильное, циклобутильное, циклопентильное или циклогексильное кольцо. Настоящее изобретение также относится к способу повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающему структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему ,-дизамещенного глицинового эфира в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам, содержащим hCE-2 или hCE-3, но не hCE-1; и указанный ,дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его -аминогруппу таким образом,что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где положение конъюгирования является удаленным, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности, по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках U937; (b) анализа ингибирования фосфорилирования MAPKAP2, проводимого на раковых клетках U937; и (с) анализа стимулирования LPS, проводимого на клетках ТНР-1. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающему структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему ,-дизамещенного глицинового эфира таким образом, что характер связывания конъюгированного модулятора и соответствующей кислоты с целевым ферментом или рецептором является таким же, как и в случае неконъюгированного модулятора, при этом эфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам, содержащим hCE-2 или hCE-3, но не hCE-1; и указанный ,-дизамещенный глициновый эфир конъюгирован с модулятором через его -аминогруппу таким образом, что азот указанной аминогруппы не связан непосредственно с карбонилом; где характер связывания является тем же самым, когда конъюгат имеет активность в анализе клеточной активности,по меньшей мере, такую же высокую, что и у неконъюгированного модулятора в том же анализе, где анализ клеточной активности выбран из (а) анализа ингибирования клеток, проводимого на раковых клетках U937; (b) анализа ингибирования фосфорилирования MAPKAP2, проводимого на раковых клетках U937; и (с) анализа стимулирования LPS, проводимого на клетках ТНР-1. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации ковалентного конъюгата ,дизамещенного глицинового эфира данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, причем конъюгат обладает повышенной или пролонгированной клеточной активностью по сравнению с данным модулятором, включающему:(i) идентификацию положения или положений в молекуле данного модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора или множества данных модуляторов активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора с тем же самым характером связывания с целевым ферментом или рецептором, при этом положение или положения являются удаленными от поверхности связывания между модуляторами и целевым ферментом или рецептором;(ii) ковалентную модификацию модулятора (модуляторов) путем присоединения радикала ,дизамещенного глицинового эфира или ряда различных радикалов ,-дизамещенного глицинового эфира в одном или более положениях, идентифицированных на стадии (i);(iii) испытание модулятора (модуляторов), конъюгированного с -аминокислотой, полученного на стадии (ii), с целью определения его активности в отношении целевого фермента или рецептора, и на основании данных, полученных на стадии (iii), выбор одного или нескольких испытанных ,дизамещенных глициновых эфиров, конъюгированных с данным модулятором (модуляторами), которые вызывают модуляцию активности фермента или рецептора в клетках, превращаются в клетках в соответствующие карбоновые кислоты, которые накапливаются в клетках, содержащих внутриклеточную карбоксилэстеразу hCE-1, и которые обладают повышенной или пролонгированной клеточной активностью. Подробное описание изобретения Таким образом, согласно одному широкому аспекту данное изобретение предусматривает ковалентный конъюгат ,-дизамещенного глицинового эфира и модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, при этом эфирная группа конъюгата селективно гидролизуется клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам,содержащим hCE-2 или hCE-3, но не hCE-1; а ,-дизамещенный глициновый эфир ковалентно присоединен к модулятору в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевым ферментом или рецептором и/или конъюгирован с модулятором таким образом, что связывание конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевым ферментом или регулятором является таким же, как связывание неконъюгированного модулятора. Кроме того, данное изобретение предусматривает способ повышения или пролонгирования внутриклеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора, включающий структурную модификацию модулятора путем ковалентного присоединения к нему ,-дизамещенного глицинового эфира в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевыми ферментом или рецептором и/или осуществляемом таким образом, что связывание конъюгированного модулятора и указанной соответствующей кислоты с целевыми ферментом или рецептором является таким же, как связывание неконъюгированного модулятора, при этом сложноэфирная группа конъюгата способна к селективному гидролизу клетками, содержащими внутриклеточный фермент карбоксилэстеразу hCE-1 по отношению к клеткам, содержащим hCE-2 илиhCE-3, но не hCE-1. При ковалентном присоединении эфирной части ,-дизамещенного глицина к модулятору таким образом, что характер связывания модулятора с целевым ферментом или рецептором сохраняется, и эфирный конъюгат, и соответствующий конъюгат кислого ,-дизамещенного глицина сохраняют активность родительского неконъюгированного модулятора. Абсолютные ингибирующие активности фермента или агониста рецептора либо антагонизирующие активности конъюгатов эфира и кислоты не должны быть такими высокими, как соответствующие активности неконъюгированного модулятора, так как внутриклеточный гидролиз эфирного конъюгата с кислым конъюгатом приводит к накоплению последнего внутри клетки, и получающаяся концентрация кислого конъюгата в клетке выше, чем концентрация, достигаемая с неконъюгированным модулятором, что компенсирует при этом любую присущую более низкую активность первого по сравнению с последним. Поэтому является очевидным, что стратегия присоединения согласно данному изобретению отличается от традиционного подхода с применением"пролекарств". Согласно этому традиционному подходу модулятор-родитель модифицируют путем конверсии производного, которое получается in vivo с высвобождением исходного модулятора, и именно это высвобождение исходного модулятора ответственно за конечную активность. Согласно стратегии по изобретению исходный модулятор модифицируют таким образом, что возможная активность является комбинированным результатом внутриклеточной активности благодаря конъюгату ,-дизамещенного глицина и модулятора и накоплению этого конъюгата ,-дизамещенного глицина и модулятора. Активным агентом является конъюгат, а не исходный неконъюгированный модулятор. Как указывалось выше, данное изобретение касается модификации модуляторов внутриклеточных ферментов или рецепторов. Хотя принцип данного изобретения является общим, не ограниченным химической природой модулятора или природой целевого фермента или рецептора, является предпочтительным, чтобы модулятор был таким, который проявляет свое действие путем обратимого связывания с целевыми ферментом или рецептором в противоположность тем, чье действие обусловлено ковалентным связыванием с целевым ферментом или рецептором. Так как для практического применения требуется, чтобы гидролизуемый карбоксилэстеразой конъюгат сохранял внутриклеточную связывающую активность родительского модулятора с целевыми ферментом или рецептором, присоединение эфирного фрагмента должно учитывать это требование, которое будет выполнено, если гидролизуемый карбоксилэстеразой эфирный фрагмент ,-дизамещенного глицина присоединен к модулятору таким образом, что характер связывания соответствующего продукта гидролиза при помощи карбоксилэстеразы (то есть соответствующей кислоты) с целью практики является таким же, как у неконъюгированного модулятора. В общем, это достигается путем ковалентного присоединения эфирного фрагмента карбоксилэстеразы к модулятору в положении, удаленном от поверхности связывания между модулятором и целевыми фрагментом или рецептором. Таким образом, фермент располагается, простираясь в растворитель, не вмешиваясь в характер связывания. Кроме того, эфирный фрагмент ,-дизамещенного глицина, очевидно, должен быть субстратом для карбоксилэстеразы, если первый должен подвергаться гидролизу последней в клетке. Оказывается,что способность внутриклеточных карбоксилэстераз не зависит от очень строгих структурных требований к субстрату, ,-дизамещенному глициновому эфиру. Отсюда большинство способов ковалентного конъюгирования эфирного фрагмента ,-дизамещенного глицина с модулятором позволяют осуществить гидролиз. Присоединение гибкой цепи линкера обычно является таким способом. Известно, что любая химическая модификация лекарства может неуловимо менять геометрию его связывания и химический подход для связывания эфирного фрагмента ,-дизамещенного глицина может вовлекать дополнительное взаимодействие при связывании с мишенью или может заменять одну или несколько таких реакций. Отсюда требование, что характер связывания гидролизованного конъюгата с мишенью должен быть таким же, как у неконъюгированного модулятора, следует понимать как требование, заключающееся в том, что не должно быть значительного изменения характера связывания, другими словами, в том, что характер связывания практически должен быть таким же, как у неконъюгированного модулятора. Когда это требование выполняется, основные характеристики связывания родительского модулятора сохраняются, и модифицированные, и немодифицированные модуляторы имеют полный общий набор характеристик связывания. Термины "одинаковый характер связывания" и "удаленное присоединение" являются подобными, так как, как указано выше, обычный способ достижения "одинакового характера связывания" должен обеспечивать присоединение фрагмента карбоксилэстеразы в таком месте молекулы модулятора, которое удалено от поверхности связывания ингибитора и целевыми фрагментом или рецептором. Однако следует отметить, что эти требования не означают, что конъюгат и/или его соответствующая кислота должны обладать одной и той же in vitro и in vivo модулирующей активностью,как родительский модулятор. Однако, в общем, является предпочтительным, чтобы гидролизованная эстеразой карбоновая кислота имела активность, определенную методом анализа in vitro связывания фермента или рецептора, не менее одной десятой активности родительского модулятора, определенной этим же методом, и чтобы эфир имел активность, определенную методом анализа клеточной активности,по меньшей мере, такую же высокую, как активность родительского модулятора, определенную указанным методом. Хотя традиционные методы картирования отношения структура-активность в медицинской химии вполне способны идентифицировать стратегию присоединения для того, чтобы отвечать требованиям"такого же характера связывания" и "удаленного присоединения", современные методы, такие как ЯМР и рентгеновская кристаллография, способствовали прогрессу, когда стал обычно известным характер связывания известного модулятора фермента или рецептора или этот характер стал определяемым. Такая информация в большинстве случаев является общедоступной или может быть смоделирована с применением компьютерных методов моделирования, таких как докинг (стыкование) лиганда и моделирование гомологии, основанных на известных способах связывания структурно подобных модуляторов или на известной структуре активного сайта целевых фермента или рецептора. Зная характер связывания модулятора, достигнутого такими методами, можно определить подходящее место присоединения эфирного фрагмента карбоксилэстеразы, обычно (как указывалось выше) в таком месте модулятора, которое удалено от поверхности связывания ингибитора и целевых фермента или рецептора. Внутриклеточные ферменты карбоксилэстеразы, способные гидролизовать сложноэфирную группу конъюгированной -аминокислоты с получением соответствующей кислоты, включают три известные человеческие карбоксилэстеразы (hCE): изотипы фермента hCE-1 (известен как CES-1), hCE-2 (известен как CES-2) и hCE-3 (Drug Disc. Today, 2005, 10, 313-325). Хотя они рассматриваются как основные ферменты, но другие карбоксилэстеразы, такие как бифенилгидролаза (ВРН), также могут играть роль в гидролизе конъюгатов. Анализ расщепленной клетки, описанный ниже, представляет собой простой метод подтверждения того, что данный конъюгат модулятора и ,-дизамещенного глицинового эфира или данный ,дизамещенный глициновый эфир, которые подвергаются анализу на предмет их использования, гидролизуются, как это требуется. Эти ферменты могут также легко подвергаться экспрессии с применением рекомбинантных методов, а рекомбинантные ферменты могут быть использованы для определения или подтверждения факта гидролиза. Признаком данного изобретения является то, что желаемый конъюгат сохраняет ковалентно связанный кислотный фрагмент ,-дизамещенного глицина, когда он гидролизуется карбоксилэстеразой(ами) в клетке, так как именно полярная карбоксильная группа этого фрагмента предотвращает или уменьшает клиринс гидролизованного конъюгата из клетки и тем самым вносит вклад в его накопление в клетке. В действительности, клеточная активность модифицированного модулятора в основном обусловлена накоплением кислоты и ее модуляцией активности мишени (хотя негидролизованный сложный эфир также проявляет свою активность по отношению к мишени до тех пор, пока он остается негидролизованным). Поскольку клетки, в общем, содержат несколько типов пептидазных ферментов, предпочтительно,чтобы конъюгат или в особенности гидролизованный конъюгат (соответствующая кислота) не являлся субстратом для таких пептидаз. В частности, особенно предпочтительно, чтобы эфирная группа ,дизамещенного глицина не была С-концевой группой дипептидного фрагмента в конъюгате. Однако несмотря на это ограничение метода ковалентного присоединения, эфирная группа ,-дизамещенного глицина может быть ковалентно присоединена к модулятору через аминогруппу или через один из заместителей. В некоторых случаях модулятор будет содержать место присоединения, удобное для эфирного фрагмента карбоксилэстеразы, а в других случаях для его присоединения должна быть разработана стратегия синтеза. Было обнаружено, что клетки, которые только экспрессируют карбоксилэстеразы hCE-2 и/или hCE3, и рекомбинантные формы этих ферментов будут только гидролизовать эфиры ,-дизамещенного глицина с получением их кислот, если атом азота аминогруппы ,-дизамещенного глицинового эфира является или незамещенным, или непосредственно связанным с карбонильной группой (то есть аминогруппа образует часть амидного фрагмента), в то время как клетки, содержащие hCE-1 (то есть макрофаги) или рекомбинантный hCE-1, могут гидролизовать ,-дизамещенные глициновые эфиры с широким набором групп у атома азота. Это требование селективности hCE-2 и hCE-3 может стать преимуществом,когда требуется, чтобы модулятор был нацелен на ферменты или рецепторы только в некоторых типах клеток. Относительные количества этих трех карбоксилэстеразных ферментов меняются у различных типов клеток (см. фиг. 1 заявки WO 2006/117567 и базу данных http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas (в этой базе данных hCE3/CES3 обозначена символом FLJ21736. Если модулятор предназначен для действия только в тех типах клеток, где обнаружен hCE-1, присоединение эфирного фрагмента ,дизамещенного глицина в карбоксилэстеразе таким образом, что аминогруппа не присоединена непосредственно к карбонилу, приводит к образованию гидролизованного конъюгата модулятора, накапливающегося предпочтительно в клетках с эффективными концентрациями hCE-1. Иными словами, специфическое накопление кислоты, полученной из конъюгата модулятора в клетках, экспрессирующих hCE1, может быть достигнуто при связывании эфирной группы аминокислоты с модулятором таким образом,что атом азота в эфире аминокислоты не связан непосредственно с карбонилом или остается незамещенным. Известно, что макрофаги играют ключевую роль в развитии воспалительных расстройств путем высвобождения цитокинов, в частности TNF- и IL-1 (Van Roon et al., Arthritis and Rheumatism, 2003, 12291238). В случае ревматоидного артрита они играют основную роль при воспалении суставов и при разрушении суставов (Conell, N. Eng. J. Med., 2004, 350, 2591-2602). Макрофаги принимают также участие в процессе роста и развития опухолей (Naldini and Carraro, Curr. Drag Targets Inflamm. Allergy, 2005, 3-8). Следовательно, агенты, которые селективно нацелены на клетки макрофагов, могут иметь значение при лечении рака, воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Таргетирование специфических типов клеток, как ожидается, приведет к уменьшению проявления побочных эффектов. Данное изобретение предусматривает способ таргетирования (нацеливания) модуляторов на макрофаги, который основан на указанном выше наблюдении, что путь, которым эфирный фрагмент ,-дизамещенного глицина карбоксилэстеразы связан с модулятором, определяет, осуществился ли его гидролиз специфическими карбоксилэстеразами и отсюда, накапливается ли полученная кислота в различных типах клеток или нет. Конкретно, как описано в заявке WO 2006/117567, было установлено, что макрофаги содержат человеческую карбоксилэстеразу hCE-1, в то время как другие типы клеток ее не содержат. В других конъюгатах по изобретению, когда атом азота сложноэфирного фрагмента замещен, но не связан непосредственно с карбонильной группой, эфир будет только подвергаться гидролизу под действием hCE-1 и,следовательно, только гидролизованные эстеразой конъюгаты модулятора будут накапливаться в макрофагах. Кроме того, конъюгаты ,-дизамещенного глицина по изобретению вообще более активны в клетках, содержащих карбоксилэстеразу НСЕ-1 (то есть в макрофагах), чем в клетках, которые содержат только карбоксилэстеразы НСЕ-2 и НСЕ-3. Кроме того, было установлено, что конъюгаты по изобретению, в которых эфирный фрагмент ,дизамещенного глицина связан с модулятором через один из -заместителей ,-дизамещенного глицинового эфира, являются в общем более активными в клетках, содержащих карбоксилэстеразу НСЕ-1 (то есть в макрофагах), чем в клетках, которые содержат только карбоксилэстеразы НСЕ-2 и НСЕ-3. Активный гидролизованный кислотный конъюгат поэтому накапливается не селективно в случае таких (в общем) С-связанных конъюгатов. Конъюгаты по изобретению, в которых эфирный фрагмент ,-дизамещенного глицина связан с модулятором через атом азота ,-дизамещенного глицинового эфира, в общем, гидролизуются клетками, содержащими любую из НСЕ-1, НСЕ-2 или НСЕ-3. Активный гидролизованный кислотный конъюгат поэтому накапливается не селективно в случае таких N-связанных конъюгатов. Терминология. Применяемый в данной заявке термин ",-дизамещенный глицин" или ",-дизамещенная глициновая кислота" означает соединение формулы H2N-C(R2R3)-СООН, где R2 и R3 являются заместителями (которые, конечно, не являются атомами водорода) и ",-дизамещенный глициновый эфир" представляет собой такое соединение, в котором карбоксильная группа этерифицирована. Термин"эфир" или "этерифицированная карбоксильная группа" означает группу R9O(C=O)-, в которой R9 является группой, характеризующей эфир, на основе спирта R9OH. Применяемый в данной заявке термин "(Ca-Cb)алкил", где а и b целые числа, относится к линейному или разветвленному алкильному радикалу, содержащему от а до b атомов углерода. Так, например, когда а равен 1 и b равен 6, термин включает метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил,трет-бутил, н-пентил и н-гексил. Термин "двухвалентный (Ca-Cb)алкиленовый радикал", где а и b целые числа, относится к насыщенной углеводородной цепи, содержащей от а до b атомов углерода и две ненасыщенные валентности. Применяемый термин "(Ca-Cb)алкенил", где а и b целые числа, относится к линейному или разветвленному алкенилу, содержащему от а до b атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь в Еили Z-стереохимии, если это возможно. Например, этот термин включает винил, аллил, 1- и 2-бутенил и 2-метил-2-пропенил. Термин "двухвалентный (Ca-Cb)алкениленовый радикал" означает углеводородную цепь, содержащую от а до b атомов углерода, по меньшей мере одну двойную связь и две ненасыщенные валентности. Используемый в данной заявке термин "(Ca-Cb)алкинил", где а и b целые числа, относится к линейным или разветвленным углеводородным группам, содержащим от двух до шести атомов углерода и,кроме этого, одну тройную связь. Этот термин включает, например, этинил, 1-пропинил, 1- и 2-бутинил,2-метил-2-пропинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4-пентинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил и 5 гексинил. Термин "двухвалентный (Ca-Cb)алкиниленовый радикал", где а и b целые числа, относится к двухвалентной углеводородной цепи, содержащей от двух до шести атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь. Термин "карбоциклический" относится к моно-, мостиковому моно-, ди- или трициклическому радикалу, содержащему до 16 атомов в кольце, все из которых представляют собой атомы углерода, и включает арил или циклоалкил. Термин "циклоалкил" относится к моноциклическому насыщенному карбоциклическому радикалу,содержащему от 3 до 8 атомов углерода, он включает, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооклил и норборнил. Не имеющий точного определения термин "арил" относится к моно-, мостиковому моно-, ди- или трициклическому карбоциклическому ароматическому радикалу и включает радикалы, содержащие два моноциклических карбоциклический ароматических кольца, которые связаны ковалентной связью. Примеры таких радикалов включают фенил, бифенил и нафтил. Не имеющий четкого определения термин "гетероарил" относится к моно-, мостиковому моно-, би-,или трициклическому ароматическому радикалу, содержащему один или несколько гетероатомов, выбранных из S, N и О, и включает радикалы, содержащие два таких моноциклических кольца или одно такое моноциклическое кольцо и одно моноциклическое арильное кольцо, которые соединены ковалентной связью. Примеры таких радикалов включают тиенил, бензтиенил, фурил, бензофурил, пирролил,имидазолил, бензимидазолил, тиазолил, бензтиазолил, изотиазолил, бензизотиазолил, пиразолил, оксазолил, бензоксазолил, изоксазолил, бензизоксазолил, изотиазолил, триазолил, бензтриазолил, тиадиазолил,оксадиазолил, пиридинил, пиридазиниил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, индолил и индазолил. Не имеющий также четкого определения термин "гетероциклил" или "гетероциклический" включает "гетероарил", определение которого дано выше, и в его неароматическом значении относится к моно-,мостиковому моно-, би- или трициклическому неароматическому радикалу, содержащему один или несколько гетероатомов, выбранных из S, N и О, и к группам, состоящим из моноциклического ароматического радикала, содержащего один или несколько таких гетероатомов, который ковалентно соединен с другим таким радикалом или с моноциклическим карбоциклическим радикалом. Примеры таких радикалов включают пирролил, фуранил, тиенил, пиперидинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил,тиадиазолил, пиразолил, пиридинил, пирролидинил, пиримидинил, морфолинил, пиперазинил, индолил,морфолинил, бензофуранил, пиранил, изоксазолил, бензимидазолил, метилендиоксифенил, этилендиоксифенил, малеимидные и сукцинимидные группы. Если иное не указано в контексте описания, термин "возможно замещенная", применяемый в данной заявке в отношении любой группы, означает замещение совместимыми заместителями в количестве до четырех, каждый из которых может представлять собой, например, (C1-C6)алкил, (C1-C6)алкокси, гидрокси, гидрокси(C1-C6)алкил, меркапто, меркапто(C1-C6)алкил, (C1-C6)алкилтио, фенил, галоид (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-CN), оксо, -СООН, -COORA, -CORA,-SO2RA, -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -SO2NHRA, -CONRARB, -SO2NRARB, -NH2, -NHRA, -NRARB,-OCONH2, -OCONHRA, -OCONHRARB, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHSO2ORA, -NRBSO2OH,-NRBSO2ORA, -NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHRB, -NRACONHRB, -NHCONRARB или -NRACONRARB,где RA и RB независимо обозначают (C1-C6)алкил, (С 3-С 6)циклоалкил, фенил или моноциклический гетероарил, содержащий 5 или 6 атомов в кольце, или RA и RB, присоединенные к одному и тому же атому азота, образуют циклическую аминогруппу (например, морфолино, пиперидинил, пиперазинил или тетрагидропирролил). "Возможный заместитель" может быть одной из указанных замещающих групп. Термин "боковая цепь природной или неприродной -аминокислоты" относится к группе R1 природной или неприродной аминокислоты формулы NH2-CH(R1)-COOH, отличающейся от глицина, где R1 означает водород. Примеры боковых цепей природных -аминокислот включают боковые цепи аланина, аргинина,аспарагина, аспартовой кислоты, цистеина, цистина, глутаминовой кислоты, гистидина, 5-7 019838 гидроксилизина, 4-гидроксипролина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина,серина, треонина, триптофана, тирозина, валина, -аминоадипиновой кислоты, -амино-н-масляной кислоты, 3,4-дигидроксифенилаланина, гомосерина -метилсерина, орнитина, пипеколовой кислоты и тироксина. Природные -аминокислоты, которые содержат функциональные заместители, например аминогруппу, карбоксил, гидрокси, меркапто, гуанидин, имидазолил или индолил, в их боковых цепях включают аргинин, лизин, глутаминовую кислоту, аспартовую кислоту, триптофан, гистидин, серин, треонин,тирозин и цистеин. Когда один или оба из -заместителей в ,-дизамещенном глициновом эфире в соединениях по изобретению является одной из этих боковых цепей, функциональный заместитель может быть защищенной группой. Термин "защищенный", используемый в отношении функционального заместителя в боковой цепи природной -аминокислоты, означает производное такого заместителя, которое не является функциональным. Например, карбоксильные группы могут быть этерифицированы (например, в виде (C1C6)алкилового эфира), аминогруппы могут быть превращены в амидные (например, в виде NHCOC1-C6 алкиламида) или карбаматные (например, в виде NHC(=O)OC1-C6-алкил- или NHC(=COCH2Phкарбамата), гидроксильные группы могут быть превращены в группы простого эфира (например, в видеOC1-C6-алкилового или O(C1-C6-алкил)фенилового эфира) или в сложноэфирные группы (например, в виде OC(=O)C1-C6-алкилового эфира) и тиольные группы могут быть превращены в тиоэфирные (например, в виде трет-бутилового или бензилового тиоэфира) или в группы сложного тиоэфира (например, в виде SC(=O)C1-C6-алкилового тиоэфира). Имеется много возможных сложноэфирных групп, которые, в принципе, могут находиться в эфирном фрагменте ,-дизамещенного глицина карбоксилэстеразы для присоединения к модулятору. Точно также имеется много ,-дизамещенных глицинов, различающихся -заместителями R2 и R3, которые могут применяться в качестве сложных эфиров в эфирном фрагменте карбоксилэстеразы. Некоторые,-дизамещенные глициновые эфиры быстро гидролизуются одной или несколькими из изотипов клеток hCE-1, hCE-2 и hCE-3 или клетками, содержащими эти ферменты, в то время как другие гидролизуются медленнее или гидролизуются только в очень небольшой степени. В общем, если карбоксилэстераза гидролизует свободный ,-дизамещенный глициновый эфир с получением родительской кислоты,она будет, с учетом N-карбонильной зависимости hCE-2 и hCE-3, описанной выше, гидролизовать также сложноэфирный мотив, будучи ковалентно конъюгированной с модулятором. Следовательно, анализ расщепленных клеток и/или анализ изолированной карбоксилэстеразы, описанные в данной заявке,обеспечивают прямой, быстрый и простой первый скрининг сложных эфиров, которые имеют требуемый профиль гидролиза. Сложноэфирные фрагменты, выбранные таким образом, затем снова могут быть подвергнуты анализу методом анализа карбоксилэстеразы, будучи конъюгированными с модулятором,выбранным методом конъюгирования, для подтверждения того, что они все еще являются субстратом для карбоксилэстеразы. Сложноэфирная группа. Как указано выше, внутриклеточные ферменты карбоксилэстеразы, способные гидролизовать сложноэфирную группу соединения по изобретению в соответствующую кислоту, включают три известные изотипа человеческого фермента hCE-1, hCE-2 и hCE-3. Хотя они считаются основными ферментами, другие ферменты, такие как бифенилгидролаза (ВРН), также могут играть роль в гидролизе сложного эфира. В общем, если карбоксилэстераза гидролизует свободный эфир аминокислоты с получением родительской кислоты, она будет также гидролизовать сложноэфирный фрагмент, будучи ковалентно конъюгированной с ингибитором. Поэтому методы анализа расщепленной клетки и/или изолированной карбоксилэстеразы, описанные в данной заявке, обеспечивают прямой, быстрый и простой первый скрининг сложных эфиров, которые имеют требуемый профиль гидролиза. Эфирные фрагменты, выбранные этим методом, затем снова могут подвергаться анализу тем же методом анализа карбоксилэстераз, будучи конъюгированными с ингибитором выбранным методом для подтверждения того, что они все еще являются субстратом для карбоксилэстеразы. С условием требования, что эфирные группы должны гидролизоваться внутриклеточными карбоксилэстеразами, можно привести примеры конкретных сложноэфирных групп в эфирном фрагменте ,дизамещенного глицина карбоксилэстеразы, которые включают группы формулы -(C=O)OR14, где R14 обозначает R8R9R10C-, где:(i) R8 обозначает водород или возможно замещенный (C1-C3)алкил-(Z1)а-[(C1-C3)алкил]b- или (C2C3)алкенил-(Z1)а-[(C1-C3)алкил]b-, где а и b независимо обозначают 0 или 1 и Z1 обозначает -О-, -S- или-NR11-, где R11 обозначает водород или (C1-C3)алкил; и R9 и R10 независимо обозначают водород или (C1C3)алкил;(ii) R8 обозначает водород или возможно замещенный R12R13N-(C1-C3)-алкил, где R12 обозначает водород или (C1-С 3)алкил и R13 обозначает водород или (С 1-С 3)алкил; или R12 и R13 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют возможно замещенное моноциклическое гетероциклическое кольцо с 5 или 6 атомами в кольце или бициклическую гетероциклическую кольцевую систему с 8-10 атомами в кольце; и R9 и R10 обозначают независимо водород или (C1-C3)алкил; или(iii) R8 и R9 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют возможно замещенное моноциклическое или мостиковое моноциклическое карбоциклическое кольцо с 3-7 атомами в кольце или мостиковую моноциклическую карбоциклическую кольцевую систему из 8-10 атомов в кольце и-Заместители. Примеры -заместителей R2 и R3 в ,-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, могут быть выбраны из боковых цепей природных или неприродных -аминокислот, в таких боковых цепях любая функциональная группа может быть защищена. Например, -заместители R2 и R3 в ,-дизамещенном глициновом эфире, конъюгированном с модулятором, включают фенил и группы формулы -CRaRbRc, в которых каждый из RaRbRc независимо обозначает водород, (C1-C6)алкил, (C1-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил,фенил(C1-C6)алкил, (C3-C8)циклоалкил; илиRc обозначает водород и Ra и Rb независимо обозначают фенил или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N или О, такой как пиридил; илиRc обозначает водород, (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, фенил(C1-C6)алкил или (C3C8)циклоалкил и Ra и Rb вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-8 членный циклоалкил или 5-6-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбранных из S, N или О; илиRa и Rb, каждый независимо, обозначают (C1-C6)алкил, (C2-C6)алкенил, (C2-C6)алкинил, фенил(C1C6)алкил или группу, определение которой дано ниже для Rc, отличающуюся от водорода, или Ra и Rb вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкильное кольцо или моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический или неароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N или О, и Rc обозначает водород, -ОН, -SH, галоген, -CN, -СО 2 Н, (C1-C4)перфторалкил, -СН 2 ОН, -O(C1-С 6)алкил, -О(С 2 С 6)алкенил, -S(C1-C6)алкил, -SO(C1-C6)алкил, -SO2(C1-C6)алкил, -S(С 2-С 6)алкенил, -SO(С 2-С 6)алкенил,-SO2(С 2-С 6)алкенил или группу -Q-W, где Q обозначает связь или -О-, -S-, -SO- или -SO2- и W обозначает фенил, фенил(C1-C6)алкил, (C3-C8)циклоалкил, (С 3-C8)циклоалкилалкил, (С 4-C8)циклоалкенил, (C4C8)циклоалкенилалкил, моноциклический, моноциклический с внутренним мостиком или бициклический ароматический радикал, содержащий один или более гетероатомов, выбранных из S, N или О, или гетероарил(C1-C6)алкил, причем группа W может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из гидроксила, галогена, -CN, -CONH2, -CONH(C1-C6)алкила,-CONH(C1-C6-алкила)2, -СНО, -СН 2 ОН, (C1-C4)перфторалкила, -О(C1-C6)алкила, -S(C1-C6)алкила, -SO(C1C6)алкила, -SO2(C1-C6)алкила, -NO2, -NH2, -NH(C1-C6)алкила, -NC1-C6)алкила)2, -NHCO(C1-C6)алкила,(C1-C6)алкила, (C2-C6)алкенила, (С 2-С 6)алкинила, (С 3-C8)циклоалкила, (C4-C8)циклоалкенила, фенила или бензила. Или же -заместители R2 и R3 ,-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, взятые вместе с самим -углеродом, могут образовать 3-6-членное насыщенное циклоалкильное кольцо, такое как циклопропил, циклопентил или циклогексил, или гетероциклическое кольцо, такое как пиперидин-4-ильное кольцо. В некоторых случаях по меньшей мере один из -заместителей R2 и R3 ,-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является C1-С 6-алкильным заместителем, например метилом, этилом или н- или изопропилом. Согласно некоторым вариантам один из -заместителей R2 и R3 ,-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором, является C1-C6-алкилом, например метилом, этилом или н- или изопропилом, а другой выбирается из группы, состоящей из метила, этила, н- и изопропила, н-, втор- или трет-бутила, фенила, бензила, тиенила, циклогексила и циклогексилметила. Предпочтительными являются случаи, когда один из R2 и R3 является метилом и другой представляет собой метил, этил или н- или изопропил; или когда R2 и R3 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил. В конкретном случае -заместители R2 и R3 ,-дизамещенного глицинового эфира, конъюгированного с модулятором,каждый, представляет собой метил. Конъюгирование. Как указано выше, ,-дизамещенный глициновый эфир может быть конъюгирован с модулятором через свою аминогруппу или через один из -заместителей. Между эфирным фрагментом карбоксилэстеразы и модулятором может находиться радикал линкера. Структура радикала, соединяющего эфирный фрагмент карбоксилэстеразы с остальной частью модулятора, очевидно, зависит от стратегии, выбранной для получения такой связи. Ясно, что стратегия химического подхода к такому сочетанию может меняться в широких пределах, и поэтому возможны многие структуры этого соединения. Точная комбинация переменных такого соединения между эфирной группой аминокислоты и остальной частью молекулы часто не будет иметь отношения к основному методу связывания соединения в целом. С другой стороны, химический метод образования связи в некоторых случаях может привести к дополнительным реакциям связывания с ферментом, тем самым способствуя связыванию. Следует отметить, что преимущества эфирного фрагмента ,-дизамещенного глицина, описанные выше (легкое попадание в клетку, гидролиз карбоксилэстераз в клетке и накопление в клетке активного продукта гидролиза, карбоновой кислоты), получаются легче, когда соединение между эфирной группой аминокислоты и остальной частью молекулы не является субстратом для активности пептидазы в клетке,которая может привести к отщеплению аминокислоты от молекулы. Конечно, стабильность к действию внутриклеточных пептидаз легко определяется путем инкубирования соединения с разрушенным содержимым клетки и анализа каждого такого расщепления. Например, ,-дизамещенный глициновый эфир (формулы H2N-C(R2R3)-СООН) может быть конъюгирован с модулятором как:R1 обозначает гидролизуемую карбоксилэстеразой сложноэфирную группу;R2 - боковая цепь природной или неприродной -аминокислоты;-S(=O)2NR4-, где R4 обозначает водород или возможно замещенный C1-C6-алкил;L1 обозначает двухвалентный радикал формулы -(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-, где m, n и р независимо равны 0 или 1;Q обозначает (i) возможно замещенный двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце или (ii) в случае, когда р равен 0, двухвалентный радикал формулы -Q1-X2-, где X2 обозначает -О-, -S- или NRA-, где RA обозначает водород или возможно замещенный двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал, содержащий 5-13 членов в кольце;Alk1 и Alk2 независимо обозначают возможно замещенные двухвалентные С 3-C7-циклоалкильные радикалы или возможно замещенные линейные или разветвленные C1-C6-алкилен, C2-C6-алкенилен илиC2-C6-алкинилен, которые могут содержать или заканчиваться или (-О-), тиоэфирную группу (-S-) или аминогруппу (-NRA)-, где RA обозначает водород или возможно замещенный C1-C3-алкил;-S(=O)2NR7-, где R7 и R8 независимо обозначают водород или возможно замещенный C1-C6-алкил;z равен 0 или 1. Ниже будут рассмотрены переменные в связующем радикале по очереди:z может равняться 0 или 1, поэтому метиленовый радикал, соединенный с модулятором, является необязательным. Предпочтительные примеры Y включают связь, -(C=O)NH- и -(С=О)О-. Однако в случае специфичности hCE-1, когда эфир -аминокислоты конъюгирован с ингибитором в виде радикала формулы (IA), Y должен быть связью. В радикале L примеры Alk1 и Alk2, когда они имеются, включают -СН 2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-,CH2CH2CH2CH2-, -СН=СН-, -СН=СНСН 2-, -СН 2 СН=СН-, -СН 2 СН=СНСН 2-, -CС-, -CCCH2-, СН 2 СС- и СН 2 СССН 2. Другие примеры Alk1 и Alk2 включают -CH2W-, -CH2CH2W-, -CH2CH2WCH2-,-CH2CH2WCH(CH3)-, -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2- и -WCH2CH2-, где W обозначает -O-, -S-,-NH-, N(CH3)- или -CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-. Другие примеры Alk1 и Alk2 включают двухвалентные циклопропильный, циклопентильный и циклогексильный радикалы. В L1, когда n равен 0, радикал представляет собой углеводородную цепь (возможно замещенную и содержащую простую эфирную, тиоэфирную или аминогруппу). Предпочтительно, чтобы в L1 не было необязательных заместителей. Когда и m, и р равны О, L1 представляет собой двухвалентный моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце (возможно замещенными). Когда n равен 1 и по меньшей мере один из m и р равен 1, L1 обозначает двухвалентный радикал, включающий углеводородную цепь или цепи и моно- или бициклический карбоциклический или гетероциклический радикал с 5-13 атомами в кольце (возможно замещенными). Когда содержится Q,этот радикал может быть, например, двухвалентным фенильным, нафтильным, циклопропильным, цик- 10019838 лопентильным или циклогексильным радикалом или моно- или бициклическим гетероциклическим радикалом, содержащим 5-13 атомов в кольце, таким как пиперидинил, пиперазинил, индолил, пиридил,тиенил или пирролил, но предпочтительным является 1,4-фенилен. Согласно некоторым вариантам изобретения m и p могут равняться 0, когда n равен 1. Согласно другим вариантам m, n и p могут все быть равны 0. По другим вариантам m может быть равен 0, n может быть равен 1, когда Q обозначает моноциклический гетероциклический радикал, и р может равняться 0 или 1. Alk1 и Alk2, когда они имеются, могут быть выбраны из -СН 2-, -СН 2 СН 2-, а также -СН 2 СН 2 СН 2- иQ может быть 1,4-фениленом. Модуляторы внутриклеточных ферментов и рецепторов. Принципы данного изобретения могут быть применены к модуляторам широкого круга внутриклеточных мишеней, которые участвуют в развитии широкого круга заболеваний. Как было обсуждено выше, способы связывания известных модуляторов с их мишенями стали широко известными сразу же после того, как стали известными сами модуляторы. Кроме того, современные методы, такие как рентгеновская кристаллография и ЯМР, способны обнаружить такие топологии и геометрии связывания, как традиционные методы медицинской химии, характеризующие отношения структура-активность. Обладая таким знанием, можно идентифицировать, когда в структуре данного модулятора эфирный фрагмент карбоксилэстеразы может быть присоединен без разрушения связывания модулятора с ферментом или рецептором с применением структурных данных. Например, в табл. 1 перечислены некоторые внутриклеточные ферменты и рецепторы, для которых опубликованы данные о структуре кристаллов. Таблица 1 Для целей иллюстрации делается ссылка на известные ингибиторы пяти вышеуказанных внутриклеточных мишеней, метод связывания которых с мишенью известен. Эти примеры показывают, как такие структурные данные могут применяться для определения соответствующих положений для присоединения эфирного фрагмента ,-дизамещенного глицина. Показана схема активных сайтов вместе с примерами ингибиторов. В общем, положения, удаленные от поверхности связывания между модулятором и мишенью, и, следовательно, удаление от поверхности связывания фермента в растворитель являются подходящими местами для прикрепления сложноэфирного фрагмента, они показаны на диаграмме. Похожий подход может также быть применен для других примеров, показанных в табл. 1. Способ увеличения клеточной активности и/или времени пребывания модулятора активности целевого внутриклеточного фермента или рецептора в клетке может включать несколько стадий. Стадия 1. Идентификация положения или положений в одной или многих молекулах модулятора,которые делят один и тот же метод связывания целевого фермента или рецептора, удаленных от поверхности связывания между модуляторами и целевым ферментом или рецептором. Обычно такие положения идентифицируют по структуре со-кристаллов, определенной рентгеновским методом (или методом ЯМР) для целевого фермента или рецептора с известным модулятором (и его близким структурным аналогом), связанным с ферментом или рецептором, путем выявления структуры. Или же структура кристаллов целевого фермента или рецептора с модулятором, помещенным в активный сайт фермента или рецептора, модулируется компьютерными графическими методами, и затем рассматривают эту модель. Предположение, что структурная модификация модулятора в положениях,удаленных от поверхности связывания, вряд ли значительно влияет на связывание модулятора с активным сайтом фермента или рецептора. Подходящие положения обычно определяются из структуры сокристалла или модели, которая должна ориентироваться по направлению к растворителю. Стадия 2. Ковалентная модификация модулятора(ов) путем присоединения эфирного радикала ,дизамещенного глицина или ряда различных эфирных радикалов ,-дизамещенного глицина в одном или нескольких положениях, идентифицированных на стадии 1. Присоединение сложноэфирных радикалов ,-дизамещенного глицина (то есть возможных фрагментов карбоксилэстеразы) может происходить через имеющуюся группу ковалентного сочетания в модуляторе(ах) или через подходящую группу, специально введенную для этой цели. Фрагменты карбоксилэстеразы могут быть отделены от основанного объема молекулы спейсерным или линкерным элементом, чтобы поместить этот фрагмент глубже в растворитель и тем самым уменьшить любое небольшое влияние фрагмента на метод связывания модулятора, и/или обеспечить доступность фрагмента на метод связывания модулятора, и/или обеспечить доступность фрагмента для карбоксилэстеразы путем уменьшения стерического вмешательства, которое может появиться от основной массы молекулы модулятора. Осуществление стадии 2 приводит к получению одного или обычно небольшой библиотеки потенциальных модуляторов, каждый из которых ковалентно модифицирован относительно его родительского ингибитора путем введения различных сложноэфирных радикалов ,-дизамещенного глицина в одной или нескольких точках присоединения, идентифицированных на стадии 1. Стадии 3. Испытание конъюгата модулятора(ов) с ,-дизамещенным глициновым эфиром, полученного на стадии 2, для определения его активности в отношении целевого фермента или рецептора. Как обычно принято в медицинской химии, варианты фрагментов карбоксилэстеразы в родительском(их) модуляторе(ах), полученных в результате осуществления стадий 1 и 2, предпочтительно испытывают с применением методов анализа, пригодных для определения ожидаемого сохранения активности модулятора и степени сохранения этой активности и профиля активности. В соответствии с целями изобретения, которые состоят в создании накопления активности модулятора в клетках, подходящие методы анализа обычно включают анализ клеточных линий для оценки степени клеточной активности и профиля активности модифицированных модуляторов. Другие методы анализа, которые могут быть применены на стадии 3, включают in vitro определение модулирования фермента или рецептора с целью оценки активности, присущей модифицированному модулятору и его продукту гидролиза карбоксилэстеразы; метод анализа для определения скорости конверсии модифицированных модуляторов в соответствующую карбоновую кислоту или действие карбоксилэстераз и методы определения скорости и/или степени накопления продукта гидролиза карбоксилэстеразы (карбоновой кислоты) в клетках. В таких методах анализа можно использовать клетки моноцитов и не-моноцитов и/или панель изолированных карбоксилэстераз с целью идентификации соединений, которые проявляют селективность в отношении клеток. Если это необходимо или желательно, стадия 3 может быть повторена с другим набором потенциальных версий родительского модулятора, конъюгированного с эфиром -аминокислоты. Стадия 4. Выбор одного или нескольких вариантов испытанных родительских модуляторов, конъюгированных с ,-дизамещенным глициновым эфиром, которые вызывают модуляцию активности фермента или рецептора внутри клеток и превращаются и аккумулируются как соответствующие карбоновые кислоты внутри клеток и которые обладают пролонгированной клеточной активностью. Описанные выше стадии 1-4 представляют общий алгоритм для осуществления принципов данного изобретения. Синтез. Существуют многие способы синтеза соединений, которых касается данное изобретение, все они основаны на известных химических реакциях, очевидных для химика-органика. Так, соединения формулы (I) могут быть синтезированы способами, описанными в обычной литературе и хорошо известными из уровня техники. Типичными литературными источниками являются "Advanced organic chemistry", 4thEdition (Wiley), J. March, "Comprehensive Organic Transformation", 2th Edition (Wiley), R.C. Larock "Handbook of Heterocyclic Chemistry", 2th Edition (Pergamon), A.R. Katritzky), обзорные статьи в "Synthesis","Acc. Chem. Res", "Chem. Rev." или первичные источники, которые можно найти в процессе поиска online или во вторичных источниках, таких как "Chemical Abstracts" или "Beilstein". Соединения по изобретению могут быть получены различными способами, описанными ниже и более конкретно в примерах, приведенных далее. При осуществлении реакций, показанных ниже, может быть необходимым защитить реакционноспособные функциональные группы, например гидроксильную,аминогруппу и карбоксильную группу, когда их наличие желательно в конечном продукте, чтобы избежать их нежелательного участия в реакциях (см., например, Green Т.W. "Protecting Groups in Organic Synthesis" John Wiley and Sons, 1999). Могут быть применены обычные защитные группы в соответствии с обычной практикой. В некоторых случаях снятие защиты может быть конечной стадией синтеза соединений формулы (I) и способы согласно изобретению, описанные ниже, следует понимать как охватывающие такое удаление защитных групп. Соединения по изобретению могут быть получены в соответствии со следующими примерами. Все температуры указаны в С. Используются следующие сокращения:NH4Cl=хлорид аммония,KHMDS=бис-(триметилсилил)амид калия,Pd/С=палладий-на-угле,MgSO4=сульфат магния,EDC=гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид,EtO2=диэтиловый эфир,NaBH(OAc)3=триацетоксиборгидрид натрия,HOBt=1-гидроксибензотриазол,TFA=трифторуксусная кислота,TLC=тонкослойная хроматография,mL=мл,г=грамм(ы),мг=миллиграмм(ы),mol=моль,mmol=миллимоль(и),LCMS=жидкостная хроматография высокого разрешения/масс-спектроскопия,NMR=ядерный магнитный резонанс,RT=комнатная температура. Коммерчески доступные реагенты и растворители (HPLC сорт) применяли без дальнейшей очистки. Растворители удаляли в роторном выпаривателе Бучи или в сушилке VirTis Benchtop SLC Freeze-dryer. Микроволновое излучение получали, используя синтезатор Biotage Initiator Eight microwavesynthesizer. Очистку соединений методом флэш-хроматографии на колонке проводили, используя силикагель, размер частиц 40-63 мкм (230-400 меш), полученный в Fluorochem. Очистку соединений методом препаративной хроматографии осуществляли в системах Gilson, используя колонки Axia prep. LunaC18 (10 мкм, 10021,2 мм), градиент 0-100% В (А=вода+0,05% TFA, В=ацетонитрил ) в течение 10 мин,скорость потока=25 мл/мин, УФ с длиной волны, равной 254 нм. Спектры 1H NMR снимали на спектрометре Bruker 300 MHz AV в дейтерированных растворителях. Химические сдвиги указаны в м.д. Тонкослойную хроматографию (TLC) проводили на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck) с использованием УФ-света. Аналитическую HPLC/MS осуществляли на системе Agilent HP 1100 LC с применением колонки с обращенной фазой Luna C18 (3 мкм, 504,6 мм), градиент 5-95% В (А=вода+0,1% муравьиной кислоты,В=ацетонитрил+0,1% муравьиной кислоты) в течение 2,25 мин, скорость потока=2,25 мл/мин, УФспектры записывали при длине волны 220 и 254 нм, используя детектор G1315B DAD. Масс-спектры получали в интервале m/z от 150 до 800 на детекторе LC/MSD SL G1956B. Данные интегрировали и обрабатывали с использованием ChemStation и программ ChemStation Data Browser. Примеры 1-6. Соединения 6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-фенил-1 Н-пиридин-2-он. являются известными ингибиторами внутриклеточного фермента киназы р 38 MAP (WO 03/076405). Примеры 1, 3 и 5 ниже относятся к ковалентному конъюгированию фрагментов эстеразы с дизамещением у -углерода эфира аминокислоты с этими соединениями в положении, удаленном от поверхности связывания между ингибитором и целевым ферментом (см. комментарии выше, касающиеся метода связывания ингибитора в модели киназы р 38 MAP). Примеры 2, 4 и 6 ниже относятся к продукту гидролиза эстеразы, карбоновой кислоте, полученной в примерах 1, 3 и 5 соответственно. Синтез в примерах 1-6. Промежуточное соединение 1. 4-Хлорфенил-3-(2,4-дифторфенил)-3-оксопропанимидотиоат Промежуточное соединение 1 может быть получено по методу, описанному в WO 200376405. Промежуточное соединение 2. 4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)ил]фенилацетальдегид 4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2H)-ил]фенилацетальдегид получали способами, показанными на схеме 1 ниже. Схема 1 Стадия 1. 2-(4-[3-(2,4-Дифторфенил)-3-оксопропанимидоил]аминофенил)этилацетат. 4-Хлорфенил-3-(2,4-дифторфенил)-3-оксопропанимидотиоат (промежуточное соединение 1) (69,7 г,192 ммоль) суспендировали в ледяной уксусной кислоте (700 мл) и добавляли 2-(4-аминофенил)этанол(27,71 г, 202 ммоль, 1,05 экв.). Смесь нагревали при 80 С в течение 2,5 ч до последующего охлаждения при комнатной температуре и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали с Et2O(500 мл) и промывали Et2O (2250 мл) с получением белого твердого продукта, который суспендировали в насыщенном NaHCO3 (700 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. После фильтрации и промывки водой получали бежевый твердый продукт, который сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения (64,12 г, выход 92%).CDI (43,26 г, 267 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в безводном THF (1 л) в атмосфере азота и охлаждали до 0 С. По каплям добавляли пропионовую кислоту (16,43 мл, 257 ммоль, 1,5 экв.), давали смеси нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Добавляли суспензию 2-4-(2,4 дифторфенил)-3-оксопропанимидоил]аминофенил)этилацетата (64,12 г, 178 ммоль) в безводном THF(500 мл) и смесь нагревали при 80 С в течение 6 ч, затем перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученный остаток отделяли путем фильтрации, промывали Et2O и сушили при пониженном давлении, получая целевое соединение в виде бледно-желтого продукта (39,56 г). Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением коричневого масла, которое растирали с EtOAc(500 мл), затем путем фильтрации получали вторую порцию продукта (7,21 г). Обе партии соединяли с получением целевого соединения в виде твердого продукта желтого цвета (46,77 г, выход 64%).(1H, d, J=9,6 Гц), 4,30 (2 Н, t, J=6,9 Гц), 3,01 (2 Н, t, J=6,9 Гц), 2,04 (3 Н, s). Стадия 3. 6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-[4-(2-гидроксиэтил)фенил]пиридин-2(1H)-он. 2-4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2H)-ил]фенилэтилацетат (46,77 г, 113 ммоль) суспендировали в 6 N водной HCl (500 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. Осадок, образовавшийся при охлаждении при комнатной температуре, который выделяли путем фильтрации, суспендировали в насыщенном водном NaHCO3 (1000 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. После фильтрации, промывки водой (2500 мл) и сушки при пониженном давлении получали целевое соединение в виде твердого продукта неправильного белого цвета (40,11 г, выход 96%).(1H, d, J=9,9 Гц), 4,69 (1H, t, J=5,3 Гц), 3,71 (2H, m), 2,84 (2H, d, J=6,9 Гц). Стадия 4. 4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2H)-ил]фенилацетальдегид. К суспензии 6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-[4-(2-гидроксиэтил)фенил]пиридин-2(1H)-она (15,00 г, 40,5 ммоль) в безводном DCM (750 мл) при температуре 0 С добавляли частями периодинан ДессаМартина (20,62 г, 48,6 ммоль, 1,32 экв.). Смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч, затем выливали в насыщенный водный раствор NaHCO3 (400 мл) и насыщенный водный раствор Na2S3O3 (400 мл) и энергично перемешивали в течение 30 мин. Водный слой отделяли и экстрагировали DCM (2500 мл), органические экстракты соединяли и сушили над MgSO4. После фильтрации и концентрации при пониженном давлении получали целевое соединение в виде сырого твердого продукта бледно-желтого цвета, который применяли без дальнейшей очистки (15,13 г). Промежуточное соединение 3 синтезировали, применяя способ, показанный на схеме 2 ниже. Схема 2(60 мг, 0,49 ммоль), реакционную смесь нагревали до RT и перемешивали в течение 18 ч. DCM удаляли под вакуумом с получением прозрачного масла. Сырой остаток растворяли в EtOAc (100 мл) и промывали водой, 1 М NaHCO3 и рассолом. Органическую фазу высушивали (MgSO4) и концентрировали под вакуумом. Сырой экстракт очищали методом хроматографии на колонке (10% EtOAc в гептане) с получением желаемого продукта в виде прозрачного масла (0,254 г, выход 20%). 1 Н NMR (300 МГц, CDCl3)5,25-5,17 (1H, m), 5,04 (1H, br s), 1,93-1,54 (8 Н, m), 1,49 (6 Н, s), 1,45 Циклопентил-N-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилаланинат (0,254 г, 0,93 ммоль) растворяли в THF (5 мл) и обрабатывали 4 М HCl/диоксан (2 мл) и перемешивали реакционную смесь при RT в течение 24 ч. Сырую смесь концентрировали при пониженном давлении и растирали с Et2O с получением белого осадка. Этот осадок промывали Et2O с получением желаемого продукта в виде белого порошка (0,16 г, выход 82%). 1 Промежуточное соединение 4 синтезировали методом, показанным на схеме 3 ниже. Схема 3 К раствору N-[(бензилокси)карбонил]-2-метилаланина (1 г, 4,21 ммоль) в DCM (безводный, 10 мл) и циклогексана (10 мл) при температуре 0 С в атмосфере азота добавляли диэтилэфират трифторида бора(7,7 мкл, катализатор). Затем медленно добавляли в течение 30 мин трет-бутил-2,2,2-трихлорацетимидат(1,51 мл, 8,43 ммоль) в циклогексане (10 мл), затем давали нагреться до RT. Реакционную смесь перемешивали при RT в течение 16 ч. К сырой реакционной смеси добавляли 190 мг NaHCO3 и отфильтровывали. Маточник концентрировали под вакуумом. Сырой экстракт очищали методом хроматографии на колонке (10% EtOAc в гептане) с получением желаемого продукта (0,863 г, выход 70%). 1 Н NMR (300 МГц, CDCl3)7,39-7,31 (5 Н, m), 5,46 (1H, br s), 5,10 (2 Н, s), 1,54 (6 Н, s), 1,45 (9 Н, s). Стадия 2. трет-Бутил-2-метилаланинат (промежуточное соединение 4).(20 мл) добавляли 100 мл катализатора Pd/C. Подсоединяли вакуум и перемешивали смесь в атмосфере водорода в течение 18 ч, отфильтровывали (через целит), промывали EtOAc и концентрировали под вакуумом. Полученный продукт выделяли в виде желтого масла (0,45 мг, 96%), содержащего следы EtOAc. Полагали, что продукт является летучим, поэтому нужна была предосторожность во время выпаривания под вакуумом. Промежуточное соединение 5 получали по методу, показанному на схеме 4 ниже. Схема 4 Стадия 1. Циклопентил-1-аминоциклопентанкарбоксилат. К раствору 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (2,58 г, 19,97 ммоль) в циклопентаноле (20 мл) добавляли концентрированную серную кислоту (2,15 г, 21,97 ммоль) и перемешивали смесь в течение ночи при 70 С. Реакционную смесь охлаждали до RT и удаляли циклопентанол при пониженном давлении. Остаток растворяли в EtOAc (30 мл) и промывали насыщенным раствором NaHCO3 (30 мл) и водой(320 мл). Затем высушивали (MgSO4), отфильтровывали и концентрировали под вакуумом, получая масло темно-желтого цвета. После очистки методом колоночной хроматографии (15% 1,2 М NH3/MeOH в EtOAc) получали желаемый продукт (1,97 г, выход 50%). 1 Промежуточное соединение 6 синтезировали методом, показанным на схеме 5 ниже. Схема 5(60 мл) медленно добавляли Na2CO3 (12,3 г, 116 ммоль), затем бензилхлорформиат (3,6 мл, 25,5 ммоль) и смесь перемешивали при RT в течение ночи. Реакционную смесь осторожно подкисляли до рН, равного 2, при помощи 1 М HCl, затем экстрагировали EtOAc (330 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (30 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением бледно-желтого масла. LCMS и NMR показали, что сырой продукт представляет собой смесь желаемого продукта и соответствующего бензилового эфира. Сырой продукт растворяли в смеси 1:1THF/вода (60 мл) и обрабатывали гидроокисью лития (2,67 г, 116 ммоль). Смесь перемешивали при RT в течение ночи, затем промывали Et2O (330 мл), подкисляли до рН, равного 2, и экстрагировали EtOAc(330 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (30 мл), сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, получая целевое соединение (4,76 г, 78%).LCMS: m/z 264 (М+Н)+. Стадия 2. трет-Бутил-1-[(бензилокси)карбонил]аминоциклопентанкарбоксилат. трет-Бутил-1-[(бензилокси)карбонил]аминоциклопентанкарбоксилат получали способом, похожим на способ на стадии 1 (схема 3) получения промежуточного соединения 4.LC/MS: m/z 320 (М+Н)+. Стадия 3. трет-Бутил-1-аминоциклопентанкарбоксилат. трет-Бутил-1-аминоциклопентанкарбоксилат получали по способу стадии 2 (схема 3) получения промежуточного соединения 4. 1 В этом примере соединения по изобретению циклопентилэфирную группу диметилглицина ковалентно конъюгировали с родительским ингибитором киназы р 38 МАР через аминогруппу циклопентилового эфира диметилглицина и через линкерный радикал -СН 2-СН 2-. Соединение получали, используя промежуточные соединения 2 и 3, как описано ниже. К раствору промежуточного соединения 2 (189 мг, 0,514 ммоль) в безводном THF (4 мл) добавляли гидрохлорид циклопентил-2-метилаланината (промежуточное соединение 3) (160 мг, 077 ммоль, 1,5 экв.) и NaBH(OAc)3 (326 мг, 1,54 ммоль, 3 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и затем резко охлаждали водой (20 мл). Водный слой обрабатывали EtOAc (320 мл) и объединенные органические экстракты промывали рассолом (40 мл), сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали методом препаративной HPLC с получением целевого соединения (130 мг, выход 48%). Этот пример относится к продукту гидролиза соединения, полученного в примере 1. Соединение получали с применением промежуточных соединений 2 и 4, как показано на схеме 6. Схема 6 Стадия 1. трет-Бутил-N-(2-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]фенилэтил)-2-метилаланинат. К раствору промежуточного соединения 2 (180 мг, 0,489 ммоль) в THF (3 мл) добавляли трет-бутил 2-метилаланинат (промежуточное соединение 4) (117 мг, 0,73 ммоль), перемешивали в течение 30 мин и затем добавляли NaBH(OAc)3 (310 мг, 1,467 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч,разбавляли EtOAc и органический слой промывали насыщенным NaHCO3, рассолом, сушили (MgSO4),фильтровали и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом препаративной HPLC с получением целевого соединения (120 мг, выход 48%).N-(2-4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]фенилэтил)-2 метилаланин. К раствору трет-бутил-N-(2-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)ил]фенилэтил)-2-метилаланината (100 мг, 0,19 ммоль) в DCM (3 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали с Et2O, фильтровали и сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения в виде твердого продукта неправильного белого цвета (50 мг, выход 56%). Соединение по примеру 3 синтезировали с применением промежуточных соединений 2 и 5, как описано в примере 1. Соединение по примеру 4 получали, применяя промежуточные соединения 2 и 6, как описано в примере 2.(1H, td, J=2,3, 10,0 Гц), 7,34 (1H, dd, J=2,5 и 9,8 Гц), 7,24 (1H, td, J=2,3, 8,5 Гц), 7,03 (2H, d, J=10,2 Гц),5,74 (1H, d, J=9,8 Гц), 5,23-5,19 (1H, m), 4,13-4,07 (2H, m), 1,97-1,83 (5H, m), 1,70-1,57 (7H, m), 1,45 (3 Н,s). Чистота LCMS=95%; m/z 576 (М+H)+. Соединение по примеру 5 получали методом, показанным на схеме 7. Схема 7(362 мг, 3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч для завершения реакции. Полученную реакционную смесь разбавляли DCM, промывали 1 М HCl, насыщенным NaHCO3, рассолом, сушили (MgSO4) и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом колоночной хроматографии(20% EtOAc/гептан) с получением целевого соединения в виде твердого продукта белого цвета (8,48 г,выход 71%).m/z 406 (М+H)+. Стадия 2. 5-Бензил-1-циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамат. К раствору 5-бензил-1-циклопентил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата (8,48 г, 21 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли ди-трет-бутилкарбонат (13,69 г, 63 ммоль) и DAMP (255 мг, 2,1 ммоль). Смесь нагревали до 50 С и перемешивали в течение ночи перед охлаждением до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Сырой остаток растворяли в EtOAc и промывали 1 МHCl, насыщенным NaHCO3 и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла. Очистка методом колоночной хроматографии(10-20% EtOAc/гептан) привела к получению целевого соединения в виде бесцветного масла (10,16 г,выход 96%).m/z 506 (М+Н)+. Стадия 3. (4S)-4-[бис-(трет-Бутоксикарбонил)амино]-5-(циклопентилокси)-5-оксопентановая кислота. К раствору 5-бензил-1-циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата (10,16 г, 20,1 ммоль) в EtOAc (200 мл) добавляли Pd/C (1 г). Смесь перемешивали в атмосфере Н 2 в течение 19 ч,фильтровали через слой целита и концентрировали под вакуумом с получением целевого соединения в виде бледно-желтого масла (8,28 г, выход 99%).(4S)-4-[бис-(трет-Бутоксикарбонил)амино]-5-(циклопентилокси)-5-оксопентановую кислоту (8,28 мг, 20 ммоль) растворяли в THF (80 мл) и охлаждали на ледяной бане. Добавляли NMM (3,3 мл, 30 ммоль) с последующим введением по каплям изобутилхлорформиата (3,6 мл, 28 ммоль). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1,5 ч перед фильтрацией и осадок промывали THF. Маточник охлаждали снова до 0 С и частями добавляли NaBH4 (1,51 г, 40 ммоль), перемешивали в течение 3 ч. Реакционную смесь обрабатывали водой (80 мл) и экстрагировали EtOAc (3100 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили (MgSO4) и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла. После очистки на хроматографической колонке (40% EtOAc/гептан) получали целевое соединение в виде бесцветного масла (4,34 г, выход 54%).m/z 402 (М+Н)+. Стадия 5. Циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-[трет-бутил(диметил)силил]окси-Lнорвалинат. Циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-L-норвалинат (4,34 г, 10,8 ммоль) растворяли в ацетонитриле (45 мл) и охлаждали на ледяной бане. Добавляли DBU (1,7 мл, 11,3 ммоль) с последующим введением TBDMSCl (1,71 г, 11,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и затем концентрировали под вакуумом. Сырой остаток растворяли в EtOAc и промывали 1 М HCl, насыщенным NaHCO3 и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла. После очистки методом колоночной хроматографии (20% EtOAc/гептан) получали целевое соединение в виде бесцветного масла (3,82 г,выход 69%).m/z 516 (М+Н)+. Стадия 6. Циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-[трет-бутил(диметил)силил]окси-2 метилнорвалинат. К раствору циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-[трет-бутил(диметил)силил]окси-Lнорвалината (3,82 г, 7,4 ммоль) в THF (50 мл) при температуре -78 С в атмосфере азота добавляли 0,91 MKHMDS в THF (16,3 мл, 14,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -78 С в течение 1 ч перед добавлением метилиодида (0,92 мл, 14,8 ммоль). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали насыщенным NH4Cl и экстрагировали водный слой EtOAc (250 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом, сушили (MgSO4) и концентрировали под вакуумом с получением желтого масла, которое применяли без дальнейшей очистки (3,50 г, выход 89%).m/z 530 (М+Н)+. Стадия 7. Циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-2-метилнорвалинат. Циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-[трет-бутил(диметил)силил]окси-2-метилнорвалинат растворяли в уксусной кислоте (45 мл), THF (15 мл) и воде (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при 30 С в течение 20 ч для завершения реакции. Реакционную смесь затем разбавляли EtOAc и промывали насыщенным NaHCO3 и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом, получая густое желтое масло, которое применяли без дальнейшей очисткиNBS (3,95 г, 22,2 ммоль) суспендировали в DCM (30 мл) и добавляли трифенилфосфин (5,44 г, 20,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин перед добавлением пиридина (0,94 мл, 8,9 ммоль). Затем добавляли циклопентил-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-5-гидрокси-2-метилнорвалинат(3,08 г, 7,4 ммоль) в виде раствора в DCM (30 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла, которое очищали методом хроматографии на колонке (15% EtOAc/гептан) с получением целевого соединения в виде бесцветного масла (1,05 г, выход 30% на двух стадиях).m/z 479 (М+Н)+. Стадия 9. Циклопентил-5-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5 дифторфенокси-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат. 6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-1-(2,6-дифтор-4-гидроксифенил)пиридин-2(1H)-он (пример 51 WO 03/076405) (500 мл, 1,32 ммоль) и циклопентил-5-бром-N,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-2 метилнорвалинат (696 мг, 1,45 ммоль) смешивали вместе в DMF (10 мл). Затем добавляли карбонат калия (365 мг, 2,64 ммоль) и иодид натрия (396 мг, 2,64 ммоль), перемешивая смесь при 40 С в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли EtOAc (50 мл) и промывали водой и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением твердого продукта желтого цвета, который очищали методом хроматографии на колонке (30-40% EtOAc/гептан) с получением целевого соединения в виде твердого продукта белого цвета (604 мг, 59%).m/z 776 (М+H)+. Стадия 10. Циклопентил-5-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5 дифторфенокси-2-метилнорвалинат. Циклопентил-5-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5-дифторфеноксиN,N-бис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат (604 мг) растворяли в TFA (10 мл) и DCM (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением коричневого масла. Сырой продукт разбавляли EtOAc (50 мл) и промывали насыщенным NaHCO3, водой и рассолом. Органический слой сушили над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением твердого продукта бледно-желтого цвета, полученного в примере 5 (387 мг, выход 46%). Пример 6. 5-4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5-дифторфенокси-2 метилнорвалинLCMS=95%; m/z 508 (М+Н)+. Соединение по примеру 6 получали способом, показанным на схеме 8. Схема 8 Стадия 1. 5-Бензил-1-трет-бутил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глютамат. К раствору Nтрет-бутоксикарбонил-L-глутамовой кислоты -трет-бутилового эфира (5 г, 16,5 ммоль) в DCM (50 мл) добавляли бензиловый спирт (3,4 мл, 33 ммоль), EDC (3,48 г, 18 ммоль) и DMAP(201 мг, 1,16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч до завершения реакции. Смесь разбавляли DCM, промывали 1 М HCl, насыщенным NaHCO3, рассолом, сушили (MgSO4) и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали методом хроматографии на колонке (20% EtOAc/гептан) с получением целевого соединения в виде бесцветного масла (5,98 г, выход 92%).m/z 416 (М+Na)+. Стадии 2-9 повторяют тот же метод, который описан в примере 5 (схема 7). Стадия 10. 5-4-[6-Амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5-дифторфенокси-2 метилнорвалин. трет-Бутил-4-[6-амино-5-(2,4-дифторбензоил)-2-оксопиридин-1(2 Н)-ил]-3,5-дифторфенокси-N,Nбис-(трет-бутоксикарбонил)-2-метилнорвалинат (70 мг) растворяли в TFA (2 мл) и DCM (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом с получением масла розового цвета. Сырой остаток затем растирали с диэтиловым эфиром с получением твердого вещества неправильного белого цвета (23 мг, выход 40%), которое отфильтровывали и сушили под вакуумом с получением соединения по примеру 6 в виде соли TFA. Соединение IV. (N-Гидрокси-3-фенилпропионамид) Соединение IV получали, как показано на схеме 9 ниже. Схема 9N-(1-Изобутоксиэтокси)-3-фенилпропионамид. Гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC) (151 мг) и 4-диметиламинопиридин (катализатор) добавляли к перемешиваемому раствору гидрокоричной кислоты (100 мг), защищенного гидроксиламина (WO 2008/040934) (136 мкл) и дихлорметана (5 мл) при RT в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч и затем выливали в воду (50 мл). Затем смесь обрабатывали дихлорметаном (250 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия и удаляли под вакуумом растворитель. Остаток очищали методом хроматографии на колонке, применяя в качестве элюента от 0 до 100% этилацетата в гептанах с получением продукта в виде бесцветного масла (58 мг). Соединение IV. 14-Гидрокси-3-фенилпропионамид.N-(1-Изобутоксиэтокси)-3-фенилпропионамид (58 мг) растворяли в DCM (2 мл) и МеОН (0,5 мл) и перемешивали при RT в атмосфере азота. К раствору добавляли 4 М HCl в диоксане (275 мкл) и перемешивали смесь в течение 2 ч. Затем удаляли растворитель под вакуумом, очищали остаток методом HPLC с получением твердого продукта розового цвета (9 мг).m/z 166 (М+Н)+. 1H NMR (300 МГц, DMSO-d6)10,37 (1H, br s), 7,21 (5 Н, m), 2,81 (2 Н, t, J=7,5 Гц),2,61 (1H, m), 2,58 (2 Н, t, J=7,5 Гц). Синтез соединений по примерам 7-10. Эти соединения получали с применением промежуточных соединений и способов, описанных ниже. Промежуточные соединения. Промежуточное соединение 7. (2 Е)-3-(5-Формилпиридин-2-ил)-N-(1-изобутоксиэтокси)акриламид К 1-аминоциклогексанкарбоновой кислоте (4,2 г, 29 ммоль) в циклогексане (250 мл) добавляли циклопентанол (50 мл) и п-толуолсульфокислоту (5,89 г) и полученную суспензию нагревали с обратным холодильником в приборе Дина-Старка в течение 72 ч. При охлаждении до комнатной температуры полученный продукт белого цвета собирали фильтрацией, промывали циклогексаном (2100 мл) и сушили при пониженном давлении с получением целевого соединения (4,1 г) в виде бесцветного твердого продукта. Раствор (R,S)метиллейцина (500 мг, 3,44 ммоль) в циклопентаноле (1 мл) и конц. H2SO4 (0,36 мл) нагревали при 80 С в течение 28 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток распределяли между насыщенным NaHCO3 (водн.) (20 мл) и дихлорметаном (20 мл). Органический слой сушили (MgSO4) и выпаривали с получением желаемого продукта (650 мг) в виде масла светло-коричневого цвета, который применяли без дальнейшей очистки. К раствору промежуточного соединения 8 (208 мг, 0,68 ммоль) и промежуточного соединения 5(184 мг, 0,68 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (430 мг, 2,04 ммоль) и уксусную кислоту (47 мкл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем обрывали реакцию путем добавления насыщенного NH4Cl. Реакционную смесь обрабатывали дихлорметаном (250 мл) и объединенные органические слои высушивали (MgSO4) и концентрировали под вакуумом. Полученный остаток растворяли в 4 М HCl в диоксане (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию обрывали NaHCO3 и экстрагировали этилацетатом(2150 мл). Объединенные органические слои сушили (MgSO4) и выпаривали. Остаток очищали методомHPLC, получая целевое соединение (80 мг) в виде бесцветного продукта. Циклопентил-1-(4-[3-гидроксиамино)-3-оксопропил]бензиламино)циклопентанкарбоксилат (пример 7) (40 мг) перемешивали с гидроокисью лития (40 мг, 15 ммоль) в THF (1 мл) и воде (1 мл) при температуре 45 С в течение 36 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали методом HPLC Gibson. Очищенное производное карбоновой кислоты перемешивали в смеси дихлорметан:TFA (1 мл, 1:1 об./об.) в течение 1 ч при комнатной температуре и концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Целевое соединение выделяли в виде бесцветного твердого продукта. 1 Н NMR (300 МГц, MeOD)7,47 (2 Н, d, J=7,9 Гц), 7,36 (2 Н, d, J=8,1 Гц), 4,18 (2 Н, s), 3,01-2,95 (2 Н,t, J=7,5 Гц), 2,38 (4 Н, m), 1,97-1,59 (6 Н, m). Пример 9. Циклопентил-N-4-[3-(гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил-2-метил-D,L-лейцинат Это соединение получали способом, аналогичным способу по примеру 7, с применением промежуточного соединения 8 (209 мг, 0,68 ммоль) и промежуточного соединения 10 (146 мг, 0,61 ммоль), получали целевое соединение в виде бесцветного твердого вещества.m/z 391,51 (М+H)+. 1H NMR (300 МГц, MeOD)7,44 (2 Н, d, J=8,1 Гц), 7,35 (2 Н, d, J=8,1 Гц), 5,385,33 (1H, m), 4,21 (1H, d, J=12,8 Гц), 4,06 (1H, d, J=12,8 Гц), 2,98 (2H, t, J=7,6 Гц), 2,41 (2H, t, J=7,6 Гц),2,04-1,72 (11H, m), 1,68 (3H, s), 0,99 (6H, t, J=7,6 Гц). Следующий пример проводили, как получение соединения примера 8, используя пример 9. Пример 10. N-4-[3-(Гидроксиамино)-3-оксопропил]бензил-2-метил-D,L-лейцин К раствору промежуточного соединения 7 (386 мг, 1,83 ммоль) и промежуточного соединения 9(902 мг, 3,02 ммоль) в THF (20 мл) добавляли порошкообразные молекулярные сита 4 (100 мг) и полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 12 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли боргидрид натрия (317 мг, 85 ммоль) и продолжали перемешивание еще 20 мин. Реакцию обрывали насыщенным NH4Cl (50 мл) и затем экстрагировали дихлорметаном (3100 мл). Объединенные органические слои высушивали (MgSO4) и концентрировали под вакуумом и полученный остаток очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, 5% метанола в DCM). Очищенный продукт растворяли в дихлорметане (20 мл), добавляли 4 М HCl в диоксане и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию обрывали NaHCO3 и экстрагировали этилацетатом (2150 мл). Объединенные органические слои сушили (MgSO4) и выпаривали. Остаток очищали HPLC, получая целевое соединение (80 мг) в виде бесцветного твердого продукта.(1H, t J=5,3 Гц), 4,16 (2H, br s), 2,15-2,30 (2H, m), 1,16-1,96 (16H, m). Биологическая активность. Активность в отношении гистон-деацетилазы. Способность соединений ингибировать активность гистон-деацетилазы определяли с применением метода флуоресцентного анализа активности коммерчески доступной HDAC, Biomol. Вкратце, субстратFluor de Lys, лизин с эпсилон-аминоацетилированием, инкубируют с источником активности гистондеацетилазы (ядерный экстракт HeLa) в присутствии или в отсутствие ингибитора. Деацетилирование субстрата сенсибилизирует субстрат к проявителю Fluor de Lys, который продуцирует флуорофор. Таким образом, инкубирование субстрата с источником активности HDAC приводит к увеличению сигнала,который уменьшается в присутствии ингибитора HDAC. Результаты выражали в % от контрольной величины, измеренной в отсутствие ингибитора, с фоновым сигналом, полученным от всех образцов, следующим образом:So обозначает сигнал в присутствии субстрата, фермента и наполнителя, в котором растворяется ингибитор; В обозначает фоновый сигнал, измеренный в отсутствие фермента. Величины IC50 определяли методом нелинейного регрессионного анализа после подставления результатов восьми величин в уравнение сигмоидального ответа на дозу с различным наклоном (% активности в зависимости от log концентрации соединения), применяя программу Graphpad Prism. Для скрининга использовали величины активности гистон-деацетилазы из сырого ядерного экстракта из клеток HeLa. Препарат, приобретенный в 4 С (Seneffe, Belgium), готовили из клеток HeLa, собранных на фазе экспоненциального роста. Ядерный экстракт готовили по методу, описанному J.D. Dignam, Nucl. Acid. Res., 1983, 11, 1475-1489, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре-80 С. Конечная концентрация буфера представляла собой 20 мМ Hepes, 100 мМ KCl, 0,2 мМ EDTA, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ PMSF и 20% (об./об.) глицерина. Определение ингибирования клеток U937 и HUT. Клеточные линии раковых клеток (U937 и HUT), растущие в log-фазе, собирали и высевали с концентрацией 1000-2000 кл/лунку (конечный объем 100 мкл) в 96-луночные планшеты. Через 24 ч клетки обрабатывали испытуемым соединением. Затем планшеты снова выдерживали еще 72-96 ч перед проведением анализа жизнеспособности клеток WST-1 в соответствии с инструкциями поставщиков (RocheApplied Science). Полученные данные выражали в % от ингибирования контрольного образца в отсутствие ингибитораSo обозначает сигнал в присутствии DMSO. Кривые зависимости ответа от дозы получали для 8 величин концентраций (конечная концентрация 10 мкМ с 3-х кратным разбавлением), используя шесть реплик. Величины IC50 определяли методом нелинейного регрессионного анализа после подставления результатов восьми величин в уравнение сигмоидального ответа на дозу с различным наклоном (% активности в зависимости от log концентрации соединения), применяя программу Graphpad Prism. Определение активности в отношении фермента киназы р 38 МАР. Способность соединений ингибировать активность киназы р 38 МАР определяли методом анализа[-33 Р-АТР] (специфическая активность примерно 500 спм/пмол, концентрация требующаяся). Реакцию инициируют путем добавления смеси Mg ATP. После выдержки в течение 40 мин при комнатной температуре реакцию останавливают путем добавления 5 мкл 3%-ного раствора фосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси помещают на фильтр Р 30 и три раза промывают в течение 5 мин в 75 мМ фосфорной кислоты и один раз в метаноле до сушки и измерения сцинтилляционных параметров. Повторные данные получали при ряде 1/3 log разбавлений исходного раствора в DMSO. Проводили девять стадий разбавления от наибольшей концентрации 10 мкМ, включали также контрольную пробу"без соединения". Осуществляли стандартный радиометрический метод связывания на фильтрах с концентрацией АТР, равной Km или близкой к ней. Измеряли величины импульсов сцинтилляции и подвергали их непараметрическому анализу с помощью программы Prism. На основании построенной кривой определяли концентрацию, приводящую к 50%-ному ингибированию. Клеточная активность киназы р 38 МАР: ингибирование фосфорилирования MAPKAP2. Клетки U937 или HUT78 помещали в среду RPMI 1640 и инкубировали при температуре 37 С, 5% СО 2 в течение 18 ч. 10-мМ исходные растворы соединений разбавляли средой/0,1% DMSO с получением серии логарифмических и полулогарифмических разбавлений. Лунки "без обработки" и "с анизомицином" обрабатывали только 0,1% DMSO. Клетки инкубировали при температуре 37 С, 5% СО 2 в течение 30 мин. Планшеты выдержали во время сбора клеток на льду и все последующие стадии проводили при температуре 4 С. Клетки гранулировали при скорости 1000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 С, среда отсасывалась и гранулы промывали холодным PBS. Гранулы подвергали лизису в 120 мкл лизисного SDS буфера (62,5 мМ Tris, рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 50 мМ DTT с ингибиторами протеазы и ингибиторами фосфатазы, добавленными в соответствии с рекомендациями производителей). После выдержки в течение 30 мин на льду образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 с перед центрифугированием со скоростью, равной 13000 об/мин, при температуре 4 С в течение 10 мин для удаления остатков клеток. 10 мкл полученного геля выгружали на линию с гелями NOVEX 4-12% бис-TrisMOPS. Мембраны после вестерн-передачи гелей блотировали антифосфо-MAPKAP2, антифосфо-HSP27 и анти-GAPOH согласно инструкциям производителей. Сигнал проявляли с применением HRPсвязанных антител антикролика или антимыши, ECL реагента и ECL пленки. Величины IC50 для различных соединений определяли по полученным фотографическим изображениям, используя и сдвиги полос,и интенсивность сигналов.LPS-стимулирование клеток ТНР-1. ТНР-1 клетки помещали в лунки планшета с объемом 100 мкл с плотностью 4104 клеток/лунку 96 ти луночного планшета с V-образным дном, обработанным тканевой культурой, и инкубировали при 37 С 5% СО 2 в течение 16 ч. Через 2 ч после добавления ингибитора в 100 мкл культуральной тканевой среды клетки стимулировали LPS (штамм Е. coli 005:В 5, Sigma) с конечной концентрацией 1 мкг/мл и инкубировали при 37 С в 5% СО 2 в течение 6 ч. Уровень TNF- определяли в надосадочных жидкостях,не содержащих клеток, методом сэндвич-ELISA (R and D SystemsQTA00B). Анализ карбоксилэстеразы НСЕ-1. Гидролиз сложных эфиров с получением карбоновых кислот под действием hCE-1 может быть определен с применением следующей процедуры. В момент времени 0 100 мкл рекомбинантной hCE-1 с концентрацией 6 мкг/мл в фосфатном буфере для анализа (K2PO4 100 мМ, KCl 40 мМ, рН 7,4) добавляли к равному объему буфера для анализа, содержащего 5 мкМ эфирного субстрата. После тщательного перемешивания трипликаты образцов инкубировали в течение 0, 20 или 80 мин при температуре 37 С. В нужное время гидролиз останавливали путем добавления 600 мкл ацетонитрила. Для образцов, отобранных в момент времени 0, ацетонитрил добавляли до фермента. Образцы анализировали на наличие сложного эфира и его соответствующей карбоновой кислоты при комнатной температуре, используяLCMS (Sciex API 3000, насос двойного действия HP 1100, СТС PAL). Хроматографию проводили с применением колонки MeCN (752,1 мм) и мобильной фазы, состоящей из 5-95% ацетонитирила в воде/0,1% муравьиной кислоты. Содержание продукта гидролиза, кислоты через 80 мин выражали в нг/мл. Определение карбоксиэстеразы в распавшихся клетках. Любое соединение по изобретению, содержащее сложноэфирный конъюгат, может быть испытано для определения соответствия этого соединения требованию гидролиза под действием внутриклеточных эстераз следующим методом. Приготовление клеточного экстракта. Опухолевые клетки U937 или НСТ 116 (109) промывали 4 объемами среды Dulbeccos PBS (1 л) и гранулировали (525 г) в течение 10 мин при температуре 40 С. Эту процедуру повторяли дважды и полученную клеточную гранулу вновь суспендировали в 35 мл холодного гомогенизирующего буфера (Trisma 10 мМ, NaCl 130 мМ, CaCl2 0,5 мМ, рН 7,0 при 25 С). Гомогенаты получали путем кавитации азотола(700 фунт/дюйм 2 в течение 50 мин при температуре 4 С). Гомогенат выдерживали на льду и дополняли коктейлем ингибиторов при конечных концентрациях После осветления клеточного гомогената путем центрифугирования (525 г) в течение 10 мин полученную надосадочную жидкость использовали в качестве источника активности эстеразы и хранили до применения при температуре -80 С. Определение расщепления эфира. Гидролиз эфиров с получением соответствующих карбоновых кислот может быть проанализирован с применением клеточного экстракта, полученного, как описано выше. Для этой цели клеточный экстракт (30 мкг/общий объем 0,5 мл) инкубировали при температуре 37 С в буфере, содержащем Tris-HCl 25 мМ, 125 мМ NaCl, pH 7,5 при температуре 25 С. В момент времени 0 добавляли сложный эфир (субстрат) с конечной концентрацией 2,5 мМ и выдерживали образцы при температуре 37 С в течение нужного времени (обычно 0 или 80 мин). Реакцию останавливали путем добавления 3 объемов ацетонитрила. В момент времени 0 ацетонитрил добавляли до введения эфира. После центрифугирования (12000 г) в течение 5 мин образцы анализировали на содержание эфира и соответствующей карбоновой кислоты при комнатной температуре методом LCMS (Sciex API 3000, бинарный насос HP 1100, СТС PAL). Хроматографию проводили на колонке с MeCN (752,1 мм) с мобильной фазой 5-95% ацетонитрила в воде/0,1% муравьиной кислоты. Скорость гидролиза выражалась в пг/мл/мин. Определение накопления в клетках. Клетки (8104/мл) инкубировали при температуре 37 С в культуральной среде, содержащей 6 мкМ соединения, в атмосфере с 5% (об./об.) СО 2. Реакцию обрывали через 6 ч путем центрифугирования аликвот клеточной суспензии объемом 25 мл при 300 г в течение 5 мин при температуре 4 С. Образцы надосадочных жидкостей культуральной среды объемом 0,2 мл добавляли к 4 объемам ацетонитрила (Sigma-Aldrich). После декантирования надосадочной жидкости оставшиеся гранулы клеток (2106 клеток) экстрагировали 1 мл ацетонитрила. Затем образцы анализировали на наличие эфира и его метаболита при комнатной температуре методомLC/MS/MS (Sciex API 3000). Хроматографию проводили на колонке с MeCN (752,1 мм) с мобильной фазой 5-95% ацетонитрила в воде/0,1% муравьиной кислоты. В момент времени 0 клеточную суспензию охлаждали и центрифугировали сразу же после добавления эфира и затем экстрагировали ацетонитрилом, как описано выше. Содержание веществ в клетках выражалось в нг/мл.