Раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости и способы детектирования нуклеиново-кислотной мишени

011415 Данная заявка представляет заявку на патент США под номером 09/337325, поданную 21 июня 1999 г., которая представляет заявку на патент США под номером 09/218166, поданную 22 декабря 1998 г.,которая представляет заявку на патент США под номером 09/109076, поданную 2 июля 1998 г. Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки 60/068291, поданную 19 декабря 1997 г. Область изобретения Данное изобретение относится, например, к композициям, аппаратуре и способам для обеспечения одновременного проведения множества биологических или химических анализов с использованием повторяющихся совокупностей (матриц) зондов. Множество областей для каждой из них включает ряд близких якорных молекул. Якоря связаны с бифункциональными линкерами, каждый из которых содержит участок, специфичный, по меньшей мере, к одному из якорей, и участок, который представляет собой зонд для интересующей мишени. Полученная совокупность (матрица) зондов используется для анализа на присутствие одной или более молекул-мишеней, которые специфически взаимодействуют с зондами. Изобретение также относится к раствору для лизиса клеток или придания им проницаемости, который применяется в рамках указанных способов. Изобретение относится к различным областям, отличающимся природой молекулярного взаимодействия, включая, но не ограничиваясь разработкой фармацевтических препаратов, молекулярной биологией, биохимией, фармакологией и медицинской диагностической технологией. Предпосылки изобретения В различных биологических и химических анализах используется множество молекулярных зондов,расположенных на поверхности, или чипов. Анализы проводят для того, чтобы определить, взаимодействуют ли интересующие молекулы с одним из зондов. После воздействия зондов на молекулымишени в выбранных условиях тестирования с помощью детектирующих устройств определяют, взаимодействовала ли молекула-мишень с данным зондом. Данные системы пригодны для различных скрининговых методов с целью получения информации либо о зондах, либо молекулах-мишенях. Например, среди прочего их использовали для скрининга пептидов или потенциальных лекарственных препаратов, которые связываются с интересующими рецепторами; для скрининга проб, например, на наличие генетических мутаций, аллельных вариантов в популяции или конкретного патогена или штамма патогена среди многих других; для изучения экспрессии генов, например, для идентификации мРНК, экспрессия которой коррелирует с определенным физиологическим состоянием, стадией развития или болезненным состоянием и т.д. Описание изобретения Данное изобретение обеспечивает композиции, аппаратуру и способы для одновременного проведения множества биологических и химических анализов и позволяет проводить высокопроизводительный анализ множества проб, например, множества проб от пациентов для скрининга в диагностическом тесте или множества потенциальных лекарственных препаратов или лечебных средств для тестирования при разработке лекарственных препаратов. Изобретение также обеспечивает раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости, который применяется в рамках указанных способов. Обеспечивается комбинация, пригодная для детектирования одной или более мишеней в пробе. Данная комбинация содержит поверхность, включающую множество пространственно разобщенных областей, которые можно назвать тест-областями и которые могут представлять собой лунки, по меньшей мере две из которых в основном являются одинаковыми. Каждая поверхность включает по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере двадцать или более, например по меньшей мере 25, 50, 96, 864 или 1536 и т.д. подобных в основном одинаковых областей. Каждая тест-область определяет пространство для введения пробы, содержащей (или потенциально содержащей) одну или более мишеней и содержит биологическую или химическую совокупность. (Подобные фразы как проба, содержащая мишень или детектирование мишени в пробе не предназначены для исключения проб или определений (попыток детектирования), в которых не содержится или не детектируется мишень. В общем смысле данное изобретение включает совокупности для определения того, находится ли мишень в пробе, независимо от того, детектируется она или не детектируется). Данная совокупность (матрица) включает близкие якоря, каждый связанный с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который содержит зонд, специфичный по меньшей мере к одной из мишени(ей). Комбинацию по настоящему изобретению приводят в контакт с пробой, содержащей одну или более мишеней,которые необязательно взаимодействуют с детектирующей молекулой(ами), и затем определяют детектирующим устройством, которое детектирует реакции между молекулами-мишенями и зондами в тестобластях, тем самым получая результаты анализа. Изобретение обеспечивает способы и композиции, в частности, пригодные для постановки биологических анализов с высокой пропускной способностью. Изобретение обеспечивает раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости, который содержит формамид, додецилсульфата натрия (SDS) и SSC в качестве буфера. При этом концентрация формамида варьирует от приблизительно 8 до приблизительно 60% (об./об.), концентрация SDS составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5% (об./об.). Буфер представлен как 0,5-6 Х SSC. Использование такого раствора обеспечивает высвобождение мишени из клеток и не мешает проведению-1 011415 анализа по выявлению мишенной нуклеиновой кислоты. В особенно предпочтительных воплощениях изобретение можно использовать для высокопроизводительного скрининга при разработке лекарственных препаратов. Например, анализ с высокой пропускной способностью можно одновременно проводить на многих (например, 100) 96-луночных микропланшетах. Каждая лунка планшета может иметь, например, 36 различных тестов, проводимых в ней, с использованием совокупности (матрицы) из примерно 36 пар якорей и линкеров. То есть, на 100 96 луночных планшетах, и каждый с 36 тестами на лунку, можно в целом ставить 345000 тестов, например,каждый из 9600 различных потенциальных лекарственных препаратов можно одновременно тестировать на 36 различных параметров и тестов. Высокопроизводительные анализы обеспечивают значительно больше информации для каждого кандидата для лекарственного препарата, чем тесты, которые позволяют анализировать одновременно только один параметр. Например, возможно в одном первоначальном высокопроизводительном скрининговом тесте определить, является ли потенциальный лекарственный препарат избирательным, специфическим и/или нетоксичным. Для способов с низкой пропускной способностью требуется проведение обширных, следующих друг за другом тестов для определения таких параметров для каждого интересующего потенциального лекарственного препарата. Несколько типов высокопроизводительных скрининговых тестов описаны, например, в примерах 15-17. Способность одновременно проводить широкий ряд самых различных биологических анализов и одновременно ставить много тестов (т.е. с высокой пропускной способностью) является двумя важными преимуществами изобретения. В одном воплощении, например, с использованием 96-луночных планшетов для связывания ДНК(Corning Costar), сделанных из полистирола с дериватизированной поверхностью для связывания первичных аминов, таких как аминокислоты или модифицированные олигонуклеотиды, ряд из 36 различных олигонуклеотидов можно нанести на поверхность каждой лунки каждого планшета для функционирования в качестве якорей. Якоря могут быть ковалентно присоединены к дериватизированному полистиролу, и для всех скрининговых тестов можно использовать одни и те же 36 якорей. Для любого конкретного анализа можно использовать данный ряд линкеров для того, чтобы сделать поверхность каждой лунки специфической для 36 различных интересующих мишеней или тестов, и различные пробы для тестирования можно вносить в каждую из 96 лунок в каждом планшете. Тот же ряд якорей можно использовать многократно для перепрограммирования поверхности лунок для других интересующих мишеней и тестов или его можно использовать многократно с тем же набором линкеров. Подобная гибкость и возможность многократного использования представляют дополнительные преимущества изобретения. Одно воплощение изобретения представляет комбинацию, пригодную для детектирования одной или более мишени(ей) в пробе, которая включает перед добавлением указанной пробы:a) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область содержитb) по меньшей мере, восемь различных олигонуклеотидных якорей, каждый связанный сc) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанной мишени(ям). Другое воплощение изобретения представляет комбинацию, пригодную для детектирования одной или более мишени(ей) в пробе, которая включает перед добавлением указанной пробы:a) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область содержитb) по меньшей мере восемь различных якорей, каждый связанный сc) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который включает зонд, специфичный к указанной мишени(ям). Другое воплощение изобретения представляет способ детектирования по меньшей мере одной мишени, который включает контактирование пробы, которая может содержать мишень(и), с комбинацией,описанной выше, в условиях эффективных для связывания указанной мишени(ей) с указанной комбинацией. Другое воплощение изобретения представляет способ определения характера экспрессии РНК, который включает инкубацию пробы, содержащей в качестве мишени(ей) по меньшей мере две молекулы РНК, с комбинацией, описанной выше, где, по меньшей мере, один зонд комбинации представляет нуклеиновую кислоту (например, олигонуклеотид), который является специфичным (т.е. избирательным) по меньшей мере к одной из РНК-мишеней, в условиях, эффективных для специфической гибридизации РНК-мишени (ей) с зондом(ами). Другое воплощение представляет способ идентификации агента (или условия(ий, который модулирует характер экспрессии РНК, который представляет способ, описанный выше для определения характера экспрессии РНК, дополнительно включающий сравнение характера экспрессии РНК в присутствии указанного агента (или условия(ий с характером экспрессии РНК при различных условиях. В качестве примера на фиг. 1 и 2 представлена комбинация по изобретению и способ ее применения для детектирования мРНК-мишени. Поверхность по изобретению, представленная на фиг. 2, содержит 15 одинаковых тест-областей; и в особенно предпочтительном воплощении изобретения, каждая из этих тест-областей представляет лунку в титрационном микропланшете. Каждая из тест-областей содержит-2 011415 шесть различных якорей под номерами 1-6. На фиг. 1 схематично представлен один из подобных якорей,якорь 1, который в наиболее предпочтительном воплощении изобретения, представляет олигонуклеотид. К якорю 1 присоединена молекула линкера, линкер 1, который включает два участка. Первый участок,который является специфичным к якорю, на данной фигуре представляет олигонуклеотид, который специфически гибридизуется с якорем. Второй участок, который является зондом, специфичным к интересующей мишени, в данном случае мРНК-мишень 1, на данной фигуре представляет олигонуклеотид, который гибридизуется со своей мишенью. Несмотря на то, что это не представлено на фигуре, каждый из оставшихся пяти якорей может гибридизоваться с его собственным линкером через специфичный к якорю участок; каждый линкер включает участок зонда, специфичный, например, к мРНК, отличной от (или такой же) мРНК 1. Данную представленную на фигуре комбинацию можно одновременно использовать для анализа 15 различных проб на присутствие мРНК 1 (или одновременно 15 мРНК-мишеней, которые специфичны (запрограммированы) 5 другими зондами в совокупности). Для постановки теста каждую пробу, которая в данном примере может быть экстрактом РНК, например, из одной из 15 независимых клеточных линий, добавляют в небольшом объеме к одной из областей, или лунок, и инкубируют в условиях, эффективных для гибридизации зонда и мишени. Для того чтобы определить, присутствует ли мРНК 1 в пробе, используют детектирующее устройство, которое распознает типы и/или может обнаруживать специфические положения в каждой области на наличие сигнала. Если клеточные линии инкубируют в условиях, при которых метка включается в молекулу мРНК в условиях in vivo, и если мРНК 1 находится в пробе, то детектор обнаружит сигнал, исходящий от меченной мРНК в положении, определяемом комплексом якорь/зонд. 1. Альтернативно, в мРНК можно непосредственно ввести метку в условиях in vitro до или после добавления в области (лунки). Альтернативно, как представлено на фиг. 1, мРНК можно пометить опосредованно перед или после ее гибридизации с зондом, например, при инкубации РНК с меченым детектирующим-олигонуклеотидом (мишень-специфический олигонуклеотид-репортер), который является комплементарным к иной последовательности, чем та, которая распознается зондом. В представленном примере одновременно можно анализировать 15 проб. Поскольку по данному изобретению одновременно можно анализировать по меньшей мере 20 или более, например 1536 или более проб, то это аналитическая система с очень высокой пропускной способностью. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, мишень относится к соединению, чье присутствие, активность и/или количество желательно определить, и которое обладает аффинностью для данного зонда. Мишени могут быть искусственно полученными или природными соединениями. Также их можно использовать в неизмененном виде или в виде агрегатов с другими веществами. Мишени можно связать, ковалентно или нековалентно, со связывающим членом, либо непосредственно, либо с помощью специфического связывающего соединения. Примеры мишеней, которые можно использовать по данному изобретению, включают, но не ограничиваются рецепторами (на везикулах, липидах, клеточных мембранах или различными другими рецепторами); лигандами, агонистами или антагонистами, которые связываются со специфическими рецепторами; поликлональными антителами, моноклональными антителами и антисыворотками, реагирующими со специфическими антигенными детерминантами (такими,как на вирусах, клетках или других субстанциях); лекарственными препаратами, нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами (включая мРНК, тРНК, рРНК, олигонуклеотиды, ДНК, вирусную РНК или ДНК, EST, кДНК, амплифицированные с помощью ПЦР продукты, полученные из РНК или ДНК, и их мутанты, варианты или модификации); белками (включая ферменты такие, как ответственные за расщепление нейромедиаторов, протеазы, киназы и тому подобное); субстратами для ферментов; пептидами,кофакторами; лектинами; сахарами; полисахаридами; клетками (которые могут включать поверхностные антигены); клеточными мембранами; органеллами и т.д., а также другими молекулами или другими соединениями, которые могут находиться в виде комплекса, связанными ковалентными или поперечными связями и т.д. В том смысле, в котором они здесь используются, термины нуклеиновая кислота, полинуклеотид, полинуклеиновая кислота и олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми. Мишени также можно отнести к антизондам. В том смысле, в котором этот термин здесь используется зонд представляет соединение, например молекулу, которая может специфически распознаваться определенной мишенью. Типы потенциальных связывающихся компонентов зонд/мишень или мишень/зонд включают рецептор/лиганд; лиганд/антилиганд; взаимодействия нуклеиновых кислот (полинуклеотидов), включая ДНК/ДНК,ДНК/РНК, ПНК (пептид-нуклеиновая кислота)/нуклеиновая кислота; ферменты, другие катализаторы и другие соединения с субстратами, небольшими молекулами или эффекторными молекулами и т.д. Примеры зондов, которые предположительно входят в объем настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются органическими и неорганическими соединениями или полимерами, включая металлы, хелатообразующие агенты или другие соединения, которые специфически взаимодействуют с металлами,пластиками, агонистами и антагонистами клеточных мембранных рецепторов, токсинами и ядами, вирусными эпитопами, гормонами (например, опиоидными пептидами, стероидами и т.д.), рецепторами гормонов, липидами (включая фосфолипиды), пептидами, ферментами (такими, как протеазы или киназы), субстратами ферментов, кофакторами, лекарственными препаратами, лектинами, сахарами, нуклеи-3 011415 новыми кислотами (включая олигонуклеотиды, ДНК, РНК, ПНК, или модифицированные или замещенные нуклеиновые кислоты), олигосахаридами, белками, ферментами, поликлональными и моноклональными антителами, одноцепочными антителами или их фрагментами. Зонды-полимеры могут быть линейными или циклическими. С помощью зондов можно различить фосфорилированные и нефосфорилированные белки либо посредством дифференциальной активности, либо дифференциального связывания. С помощью зондов, таких как лектины, можно различить гликозилированные белки. В том смысле, в котором они здесь используются, термины нуклеиновая кислота, полинуклеотид, полинуклеиновая кислота и олигонуклеотид являются взаимозаменяемыми. Любое из соединений, описанных выше в качестве зондов, может также служить в качестве мишеней и тому подобное. Любую сочетаемую поверхность можно использовать по изобретению. Поверхность (обычно твердая) может быть из различных органических и неорганических материалов или их сочетаний, включая,только в качестве примера, пластмассы, такие как полипропилен или полистирол; керамика; силикон; окись кремния (плавления) кварц или стекло, которые могут иметь толщину, например, предметного стекла для микроскопии или покровного стекла; бумага такая, как фильтровальная бумага; диазотированная целлюлоза; фильтры из нитроцеллюлозы; нейлоновые мембраны; или полиакриламид или другой тип гелевых основ, например, аэроосновы или аэрогранулы, сделанные из аэрогеля, который является,например, высокопористым твердым веществом, включая пленку, которую готовят высушиванием сырого геля с помощью любого из самых разнообразных обычных, общепринятых в таких случаях методов. Когда при постановке способов применяются тесты с оптическим детектированием, то вполне применимы пропускающие свет субстраты. Поверхность может быть любой толщины или прозрачности, которые совместимы, например, с обычными методами детектирования. Например, поверхность может быть с толстым дном, прозрачным или непрозрачным планшетом. В предпочтительном воплощении поверхность является пластиковой поверхностью из множества лунок, например, для культивирования тканей,например, 24-, 96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночным планшетом (например, модифицированным планшетом, таким как планшет для связывания ДНК производства Corning Costar). Якоря могут быть присоединены, например связаны непосредственно с поверхностью, или могут быть присоединены к одному типу поверхности, например стеклу, которое, в свою очередь, приводят в контакт со второй поверхностью, например лункой из пластика в титрационном микропланшете. Форма поверхности не является решающей. Она может быть, например, плоской поверхностью такой, как квадрат, прямоугольник или окружность; изогнутой поверхностью или трехмерной поверхностью такой, как гранула, частица, нить, осадок, трубочка, сфера и т.д. Поверхность включает области, которые являются пространственно разобщенными и адресуемыми или идентифицируемыми. Каждая область включает ряд якорей. То, как разделены области, их физические свойства и их относительная ориентация по отношению друг к другу, не является решающим. В одном воплощении области можно отделить друг от друга любым физическим барьером, который устойчив для прохождения жидкостей. Например, в предпочтительном воплощении области могут представлять собой лунки в многолуночном планшете (например, для культивирования тканей), например, в 24-,96-, 256-, 384-, 864- или 1536-луночном планшете. Альтернативно, поверхность может быть стеклянной поверхностью с гравировкой, чтобы на ней находилось, например, 864 или 1536 раздельных мелких лунок. Альтернативно, поверхность может включать области без разделений или лунок, т.е., например,быть плоской поверхностью, например кусочком пластика, стекла или бумаги, и отдельные области можно дополнительно разделить лежащей сверху структурой (например, кусочком пластика или стекла),которая будет разделять отдельные области. Необязательно поверхность может уже включать одну или более совокупностей якорей или якорей, связанных с линкерами, перед разделением на отдельные области. В другом воплощении совокупности якорей внутри каждой области можно отделить друг от друга контрольными пространствами на поверхности, на которых отсутствуют якоря, или химическими линиями раздела такими, как воск или силиконы, для предупреждения растекания капель. В еще одном воплощении области можно выделить в виде трубочек или контролирующих жидкость каналов, например, предназначенных для проточных тестов, как раскрывается, например, у Beattie et al.(1995), Clin. Chem. 4, 700-706. Трубочки могут быть любого размера, например это могут быть капилляры или более широкие трубочки для того, чтобы могли протекать жидкости, или они могут быть частично или полностью заполнены гелем, например агарозой или полиакриламидом, по которым осуществляется транспорт соединений (проходят через, протекают через, проходят под давлением через), например,при электрофорезе; или по каналам с заполненным матриксом пространством, например линейными каналами, описанными, например, у Albota et al. (1998), Science 281, 1653-1656; Cumpston et al. (1998), Mat.Res. Soc. Symp. Proc. 488, 217-225; и/или Cumpston et al. (1999), Nature 398, 51-54. В подобном заполняющем пространство матриксе жидкость и/или молекулы могут двигаться не только в направлении,перпендикулярном стенкам трубочки, но также они могут диффундировать в латеральных направлениях. В предпочтительном воплощении трубочка заполнена гелем или заполняющим пространство матриксом; гель или заполняющий пространство матрикс активированы для связывания с якорями, и различные якоря проходят последовательно, что позволяет образоваться совокупности (например, линейной совокупности) якорей внутри геля; и линкеры, мишени и т.д. также проходят последовательно. Совокупность-4 011415 может быть линейной или 2- или 3-мерной. В одной трубочке можно поставить множество тестов. Например, одну совокупность якорей или якорей, связанных с линкерами, в трубочке можно использовать повторно (например, соскребать и использовать повторно, или перепрограммировать) в последовательных тестах с одинаковыми или разными пробами. В другом воплощении множество трубочек используют в одном тесте, например, интересующую пробу анализируют во множестве трубочек, содержащих различные совокупности. Якоря или комплексы якорь/линкер в трубочках могут представлять любой из типов, описанных здесь. Области внутри или на и т.д. поверхности можно отделить путем модификации самой поверхности. Например, поверхность из пластика может включать участки, сделанные из модифицированного или дериватизированного пластика, который может служить, например, в качестве сайтов для добавления специфических типов полимеров (например, ПЭГ можно связать с поверхностью из полистирола и затем дериватизировать по карбоксильной или аминогруппе, двойным связям, альдегидам и тому подобное). Альтернативно пластиковая поверхность может включать отлитые структуры, такие как выступы или выпуклости, которые могут выполнять роль площадок для добавления якорей. В другом воплощении области могут представлять собой гелевые основы, например основы из полиакриламидного геля или аэроосновы, которые располагаются в желаемом порядке на поверхности такой, как стекло, или их располагают между двумя поверхностями, например, такими как стекло и кварц. Якоря, линкеры и т.п.можно иммобилизовать на поверхности таких основ или можно погрузить внутрь. Специалисту в данной области, очевидно, будут понятны различные другие расположения гелевых основ на поверхностях, и которые можно получить обычными, общепринятыми в таких случаях методами. Тест-области могут располагаться в любой относительной ориентации, включая, но не ограничиваясь параллельными или перпендикулярными совокупностями внутри квадрата или прямоугольника, или другой поверхности, с радиальным распространением совокупностей внутри окружности или другой поверхности, или линейными совокупностями и т.д. Пространственно разобщенные области по изобретению находятся во множестве копий. То есть,имеется, по меньшей мере, две, предпочтительно по меньшей мере двадцать или по меньшей мере примерно 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025 или более, и т.д. в основном одинаковых, пространственно разобщенных (отдельных) областей. Возрастающее число повторяемых областей позволяет проводить анализы со значительно более высокой пропускной способностью. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, в основном одинаковые области относится к областям, которые включают одинаковые или в основном одинаковые совокупности якорей и/или комплексы якорь/линкер. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, в основном одинаковые означает, что совокупность или область предназначена для выполнения в основном такой же функции, что и другая совокупность или область в отношении анализа мишени по данному изобретению. Различия, не оказывающие существенного влияния на функцию, т.е. детектируемость мишеней, совместимы с небольшими изменениями нуклеотидов(пропусками/вставками/заменами) или изменениями олигонуклеотидов (слабое связывание с поверхностью) и т.д., что в значительной мере не влияет на результаты определения. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что не все области на поверхности должны быть идентичны друг другу. Например, если параллельно проводится тест с двумя различными рядами совокупностей, то может быть выгодным включить оба ряда совокупностей на одной поверхности. Например, два различных ряда совокупностей можно расположить в чередующемся порядке, в виде полос для облегчения сравнения между ними. В другом воплощении практикующему специалисту может быть желательно включить области, которые можно детектировать отличным от других областей на поверхности образом, и использовать их в качестве области(ей) регистрации. Например, область регистрации может включать олигонуклеотиды или пептиды, которые имеют различный тип флуоресцентных молекул, которые можно распознать сканирующим детектирующим устройством, в качестве стартовой точки для расположения областей на поверхности. Размер и физическое размещение тест-областей не ограничиваются. Типичные области имеют площадь примерно от 1 до 700 мм 2, предпочтительно от 1 до примерно 40 мм 2, и они располагаются на расстоянии от 0,5 до примерно 5 мм друг от друга, и обычно выбраны в зависимости от площади. В предпочтительном воплощении области расположены примерно на расстоянии 5 мм друг от друга. Например,каждая область может включать прямоугольную сетку, например, с 8 рядами и 6 колонками из грубо округлых пятен якорей, которые в диаметре составляют примерно 100 мкм, и находятся на расстоянии 500 мкм друг от друга; такая область будет занимать площадь примерно 20 мм 2. Включаются области с большей и меньшей площадью и расстоянием между собой. Области также можно дополнительно подразделить таким образом, что некоторые или все якоря области будут физически отделены от соседних якорей с помощью, например, впадин или углублений. Например, число подсекций (подобластей) в области может исчисляться в пределах примерно от 10 до примерно 100 или более или менее. В одном воплощении область, которая представляет лунку в 1536 луночном планшете, может дополнительно подразделяться на меньшие лунки, например, примерно от 4 до примерно 900, предпочтительно примерно от 16 до примерно 36 лунок, образуя, таким образом, совокупность лунок внутри лунок. См. фиг. 4. Подобная поверхность с углублениями уменьшает толерант-5 011415 ность, необходимую для физического размещения одного якоря (или группы якорей) в каждом планируемом пространстве (локусе), и размер областей, содержащих якоря, является более однородным, что облегчает детектирование мишеней, которые связываются с зондом. Термин якорь в том смысле, в котором он здесь используется, относится к любому веществу или соединению, например, молекуле, которая связывается (например, иммобилизуется на или присоединяется ковалентно или нековалентно) с поверхностью или участком такой поверхности (например, дериватизированным участком поверхности из пластика), и которая может специфически взаимодействовать или связываться с линкером или другим соединением, описанным выше. Участок якоря, который связывается, например, с молекулой линкера, может быть непосредственно присоединен к поверхности, или якорь может включать промежуточный спейсер. Подобный спейсер может быть любым веществом,например, любым из различных веществ, которые являются общепринятыми в данной области. В одном воплощении спейсер представляет линейную углеродсодержащую молекулу, имеющую, например, примерно 5-20 атомов С, предпочтительно 12 атомов С. В другом воплощении спейсер представляет нуклеиновую кислоту (любую из описанных здесь типов), которая специфически не взаимодействует или связывается, например, с молекулой линкера. Термин якорь в том смысле, в котором он здесь используется, также относится к группе, в основном, одинаковых якорей. Смотри, например, фиг. 7, на которой схематично представлена тест-область,включающая 3 якоря (А, В и С), каждый из которых находится в многочисленных копиях (группа). Положение каждой группы якорей называется здесь локусом. Как это хорошо известно специалистам в данной области, число отдельных якорных молекул, находящихся в локусе, ограничивается только физическими препятствиями, возникающими, например, в результате размера якорей. Например, локус, который имеет диаметр, например, примерно 25-200 мкм, может содержать миллионы якорей. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, комплекс якорь/линкер существует, если якорь и линкер соединены молекулярной связью специфическим образом. Взаимодействие с линкером может быть либо необратимым, таким, как посредством определенных ковалентных связей, либо обратимым таким, как посредством гибридизации нуклеиновых кислот. В предпочтительном воплощении якорь представляет нуклеиновую кислоту, которая может быть любой длины (например, олигонуклеотидом) или типа (например, ДНК, РНК, ПНК или продукт ПЦР молекулы РНК или ДНК). Нуклеиновую кислоту можно модифицировать или подвергнуть замещению(например, включить неестественные нуклеотиды такие, как инозин; соединить посредством известных связей таких, как сульфамат, сульфамид, фосфоротионат, метилфосфонат, карбамат и т.д. или получить полусинтетическую молекулу такую, как конъюгат ДНК-стрептавидин и т.д.). Предпочтительными являются одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Нуклеиновокислотный якорь может быть любой длины, совместимой с изобретением. Например,якорь может быть олигонуклеотидом длиной примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. В другом воплощении якорь может быть длиной примерно от 50 до примерно 300 нуклеотидов или быть более длинным или коротким, предпочтительно примерно от 200 до примерно 250 нуклеотидов. Например, якорь может включать примерно от 150 до примерно 200 нуклеотидов нуклеиновой кислоты-спейсера, как описано выше, и смежную со спейсером, более короткую последовательность,например, примерно из 10, 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов, которая предназначена для взаимодействия с молекулой линкера (линкер-специфическая последовательность). Такие спейсеры могут быть любой длины или типа нуклеиновой кислоты, и могут иметь любой состав оснований, который является функциональным для изобретения. В предпочтительном воплощении спейсеры каждого из якорей в локусе и/или якорей в различных локусах внутри области, в основном являются одинаковыми; так, якоря отличаются друг от друга в основном по их линкер-специфическим последовательностям. Спейсеры могут придавать якорям преимущество, позволяющее повысить их производительность. Например, линкер-специфические участки такого якоря находятся дальше от поверхности и, следовательно, они имеют меньшие физические препятствия и подвергаются меньшему стерическому затруднению, чем нежели, если бы они находились ближе к поверхности. Это облегчает, например, связывание множества различных линкеров (например, примерно от 2 до примерно 100), обладающих различной специфичностью к мишени, с якорями в данном локусе. Как будет более подробно обсуждаться ниже,отдельный якорь может включать (в дополнении к спейсеру) множество линкер-специфических последовательностей, расположенных, например, в линейном порядке; это позволяет множеству различных типов линкеров связываться по меньшей мере с одним подобным якорем в данном локусе. Также ниже более подробно обсуждается другой путь, при котором множество различных типов линкеров может быть связано с якорями в данном локусе: в смешанном локусе, где каждый из двух или более якорей связан с различным линкером, обладающим различной специфичностью к мишени. В результате физической гибкости якорей, включающих спейсеры, якоря в данном локусе могут легко связываться со множеством различных линкеров без физических затруднений со стороны молекул смежных якорей. Преимущество связывания множества линкеров с якорями в данном локусе заключается в том, что становится возможным детектировать большое число мишеней в определенном локусе. В одном воплощении множество-6 011415 линкеров, связанных в данном локусе, имеют зонды, которые специфичны для различных участков одной и той же интересующей мишеневой нуклеиновой кислоты (например, для различных олигонуклеотидных последовательностей внутри нуклеиновой кислоты). Это позволяет проводить амплифицированное детектирование мишени по сравнению с детектированием с одним зондом. В другом воплощении множество линкеров имеют зонды, которые являются специфическими к различным, не близким друг к другу мишеням. Это позволяет детектировать множество различных мишеней внутри определенного локуса. Дополнительным преимуществом якорей, включающих спейсеры, является то, что они могут легко включать линкеры, которые связаны с относительно крупными молекулами, например, такими, как белки, и/или которые связаны с относительно крупными мишенями, например, такими, как белки, мембраны или клетки. Состав оснований нуклеиновокислотного якоря строго не ограничивается. Подходящим является любой состав оснований якорей при условии, что якоря являются функциональными для целей изобретения. Например, якоря на основе одноцепочечной нуклеиновой кислоты в локусе или в различных локусах области могут включать частично или полностью произвольные последовательности (например,произвольно полученные последовательности, например, без ограничений по относительным количествам A, G, Т и/или С). В одном воплощении якоря не являются изомерами по последовательностям (например, произвольными изомерами по последовательностям), т.е. олигонуклеотидами, содержащими одинаковые количества G, С, А и Т, но которые расположены в различном относительном порядке. То есть якоря, например, в различных локусах области не удовлетворяют уравнению GnCnAmTm, где n и m целые числа. См., например, якоря, представленные в примере 1, которые не являются произвольными изомерами по последовательностям. В якорях по изобретению количество G и С не должно быть примерно одинаковым, как и относительные количества А и Т. Кроме того, суммарные относительные количества G, С, А и Т особым образом не ограничиваются. Например, состав оснований якорей в области может находиться в пределах от относительно высокого содержания GC (т.е. выше 50% G+C) до равного содержания G, С, А и Т, и до относительно высокого содержания AT (т.е. выше 50% А+Т). В одном воплощении якоря получают произвольно, например, без ограничений в отношении относительно высоких количеств G, С, А и Т. Якоря, включающие нуклеиновокислотный спейсер и один или более линкер-специфических участков, вряд ли будут согласовываться с любым конкретным ограничением в отношении состава оснований. Например, если якоря, расположенные в различных локусах в области, имеют спейсеры, которые в основном являются одинаковыми, например, представляют в основном одинаковый 25-мерный или 200 мерный олигонуклеотид, то каждый якорь обладает различной линкер-специфической группой (например, 25-мерной), даже, если линкер-специфические группы удовлетворяют определенным требованиям(например, число А и G является примерно одинаковым, число Т и С является примерно одинаковыми; олигонуклеотид соответствует уравнению GnCnAmTm; и/или содержание G+C удовлетворяет конкретному требованию), то в целом якоря не будут удовлетворять данным конкретным требованиям. Аналогично,даже если линкер-специфические группы якорей в различных локусах области в основном отличаются друг от друга (например, каждая линкер-специфическая группа имеет последовательность, которая отличается по меньшей мере примерно на 20 или 50%, или 80% от каждой другой линкер-специфической группы в области), то общая идентичность последовательностей якорей с учетом полной длины нуклеиновой кислоты может быть значительно меньше. Например, если каждый из якорей включает в основном одинаковый 25-мерный спейсер, и 25-мерную линкер-специфическую группу, которая на 100% отличается от каждой другой линкер-специфической группы в области, то якоря по-прежнему будут отличаться друг от друга только на 10%. Якорь может быть пептидом или белком. Например, он может быть поликлональным или моноклональным антителом или их фрагментом, или одноцепочечным антителом или его фрагментом, которые специфически связываются с участком линкера, представляющим антиген или антитело; дополнительно якорь может быть пептидом, и участок линкера, который связывается с ним, может быть антителом или тому подобное. В другом воплощении якорь может быть лектином (таким, как конканавалин А или агглютинины из организмов, таких как Limulus, земляной орех, золотистая фасоль, Phaseolus, зародыши пшеницы и т.д.), который является специфическим к определенному углеводу. В другом воплощении якорь может включать органическую молекулу, такую как модифицированный или дериватизированный пластиковый полимер, который может быть полезен, например, в качестве основы специфического твердофазового химического синтеза олигонуклеотида. В данном случае дериватизированный пластик может быть распределен в виде совокупности разобщенных, дериватизированных локусов, которые в целом образуют пластиковую поверхность комбинации в производственном процессе. В другом воплощении якорь обладает преимуществом специфического или предпочтительного связывания между ионами металлов, например, Ni, Zn, Ca, Mg и т.д. и определенными белками и хелатообразующими агентами. Например, якорь может быть полигистидином, и якорь-специфический участок линкера может быть никелем, который связывается с помощью хелатообразующего агента для никеля с мишень-специфическим зондом. Альтернативно хелатообразующий агент может быть якорем, и полигистидин - участком, входящим в состав зонда. Альтернативно якорь может включать неорганическое соединение. Например, он-7 011415 может включать металл, такой как кальций или магний, и якорь-специфический участок линкера может быть предпочтительным хелатообразующим агентом, таким как, соответственно, ЭДТА или ЭГТА, который связывается с мишень-специфическим зондом. Специалистам в данной области, очевидно, понятно,что широкий ряд других типов молекул может служить в качестве якорей как таковые общие типы, уже упомянутые в связи с зондами и мишенями. Якорь также может быть гибридной структурой, такой как ДНК-дуплекс или дуплекс, включающий, например, ДНК и белок, которые специфически взаимодействуют любым путем, описанным здесь. Например, основная группа якоря-дуплекса (участка, который непосредственно контактирует с поверхностью) может включать необязательно модифицированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту; предпочтительно основная группа также включает спейсер, например линейный углеродсодержащий спейсер, как описано выше. В одном воплощении вторая одноцепочечная нуклеиновая кислота связывается (например, гибридизуется) с данной основной группой с образованием якоря, который включает, по меньшей мере, частично двухцепочечную (дуплекс) нуклеиновую кислоту. Например, основная группа может включать линейный углеродсодержащий спейсер, который присоединен к поверхности по одному концу, и по другому концу связан с одноцепочечным ДНК-олигонуклеотидом примерно из 10-100 нуклеотидов, предпочтительно примерно из 25 нуклеотидов, и вторая группа дуплекса может включать последовательность, которая комплементарна, по меньшей мере, участку основной группы (например, примерно 40 концевым нуклеотидам), затем необязательный спейсер (например, примерно из 5-15, предпочтительно примерно из 10 нуклеотидов), затем линкер-специфическую последовательность (например,последовательность длиной примерно из 8-50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов, наиболее предпочтительно примерно 25 нуклеотидов). Относительная длина и состав оснований комплементарных участков якоря-дуплекса и его линкерспецифической последовательности(ей) могут быть различными для того, чтобы соответствовать требованиям теста, с использованием способов оптимизации, принятых в данной области. Например, последовательности можно выбрать таким образом, чтобы линкеры могли диссоциировать (например, отщепляться при плавлении) из дуплекса-якоря в условиях, при которых сами дуплекс-якоря остаются интактными. Затем оставшиеся совокупности дуплексов-якорей можно, если желательно, использовать повторно для гибридизации с таким же или другим линкерами. Альтернативно последовательности можно выбрать таким образом, чтобы как гибриды якорь/линкер, так и два комплементарных участка дуплексаякоря будут диссоциировать в одинаковых условиях, оставляя в контакте с поверхностью только основные группы. В одном воплощении все или в основном все основные группы в определенном локусе или во всех локусах области являются одинаковыми или в основном одинаковыми. Совокупности основных групп, оставшихся после подобной диссоциации, можно использовать повторно (например, для гибридизации с линкерами), только если возвращаются обратно комплементарные участки дуплекса-якорей, способом, для которого необходимо знать последовательность основной группы, которая принимает участие в образовании дуплекса. Возможность производства совокупностей якорей, которые можно или нельзя использовать повторно пользователем, которому неизвестна последовательность основных групп, представляет преимущество использования таких гибридных якорей. Например, изготовитель может предупредить неразрешенное повторное использование его совокупностей. Предупреждение такого повторного использования может, например, предотвратить проблемы снижения производительности или ненадежности, которые возникают в результате интенсивного использования. В одном воплощении группа якорей в данном локусе внутри области является в основном одинаковой (например, они специфичны к якорь-специфическому участку линкера одного типа или только для одной мишени). См., например, фиг. 7. В другом воплощении множество различных якорей, обладающих специфичностью ко множеству различных линкеров и/или ко множеству различных мишеней, может находиться в определенном локусе, называемом смешанным локусом, например, множество примерно из 2 до примерно 100, например по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 4 или, по меньшей мере 10. Преимущество смешанных локусов заключается в том, что при этом возможно детектирование большого числа различных мишеней в определенном локусе. В одном воплощении каждый смешанный локус содержит один якорь, который является одинаковым в каждом или по меньшей мере нескольких локусах. Например, якорь, который является одинаковым в более чем одном локусе, можно использовать для гарантии качества и/или контроля, или нормализации сигнала. Конечно, смешанные локусы также являются преимущественными для поверхностей, имеющих только одну (неповторяющуюся) область. Якоря в каждом из локусов подобной отдельной области могут взаимодействовать с линкерами или непосредственно с интересующими мишенями. Число якорей (т.е. групп якорей в отдельных локусах) в тест-области может составлять по меньшей мере два, предпочтительно в пределах примерно от 8 до примерно 900 (при большем или меньшем содержании), более предпочтительно примерно от 8 до примерно 300 и наиболее предпочтительно примерно от 30 до примерно 100 (например, примерно 64). В некоторых предпочтительных воплощениях имеется примерно 16, 36, 45 или 100 якорей/тест-область для поверхности с 96 тест-областями (например,лунками) или примерно 9, 16 или 25 якорей/тест-область для поверхности с 384 тест-областями (например, лунками). В наиболее предпочтительном воплощении каждый якорь в тест-области обладает раз-8 011415 личной специфичностью по сравнению с каждым другим якорем в совокупности. Однако два или более якорей могут обладать одинаковой специфичностью, и все якоря могут быть одинаковыми. В одном воплощении, в котором комбинация по изобретению включает очень большое число тест-областей (например, примерно 864, 1536 или выше) в результате чего можно одновременно обработать большое число тестируемых проб, то может быть интересным тестировать данные пробы только по ограниченному числу параметров (например, примерно 2, 4, 6 или 9). Другими словами, для комбинаций, включающих очень большое число областей, может быть преимущественным иметь только примерно 2-9 якорей на область. Физическое расположение и относительная ориентация якорей (т.е. групп якорей в отдельном локусе) в или на тест-области не ограничиваются. Как правило, расстояние между якорями составляет примерно от 0,003 до примерно 5 мм или меньше, предпочтительно примерно от 0,03 до примерно 1. Возможны большие и меньшие расстояния между якорями (и их площадями). Якоря можно расположить в любой ориентации относительно друг друга и границ области. Например, их можно расположить в двумерной ориентации, такой как квадратная, прямоугольная, шестиугольная или другая совокупность, или круговые совокупности с якорями, исходящими из центра в радиальных направлениях или в виде концентрических окружностей. Также якоря можно расположить в виде одномерной, линейной совокупности. Например, олигонуклеотиды можно гибридизовать со специфическими участками в последовательности ДНК или РНК с получением надмолекулярной совокупности или в линейном расположении в проточном геле или на поверхности проточного устройства или структуры внутри проточного устройства. Альтернативно, якоря могут быть углублены в полосоообразное образование (см. фиг. 6). Например, якоря могут быть в виде длинных полос, параллельных друг другу. Расстояние между или ширина каждой длинной линии может варьировать в регулярном порядке с получением простого, опознаваемого шаблона, напоминающего решетку, например, первая и третья линии могут быть в два раза длиннее остальных, линии могут быть пропущены и т.д. Дополнительную пустую линию можно поместить после последней линии для отделения одной тест-области, и решетка может повторяться в последующих тест-областях. Расположение якорей не должно быть в строгом соответствии с положением разделенных аналитических лунок (тест-областей) или отдельных аналитических капель. Термин аналитические положения будет использоваться по отношению к аналитической поверхности, куда наносятся пробы для анализа.(Таковые можно определить, например, по положению отдельных капель пробы для анализа или по положению лунок, или разделителей, определяющих отдельные лунки для анализа на многолуночном планшете). Сам характер расположения якорей (например, полосоообразный характер расположения олигонуклеотидных якорей) используется для определения того, где точно располагается каждый отдельный якорь по характеру узнавания, поскольку каждая линия решетки распознается по ее положению относительно остальных линий. Следовательно, не требуется, чтобы первый якорь находился на одном крае или в одном углу каждого аналитического положения. Первый якорь будет обнаружен характером узнавания в большей мере, чем по положению относительно аналитического положения. Поскольку площадь, используемая для каждого аналитического положения (например, площадь капли или площадь лунки), является достаточно большой для того, чтобы включать по меньшей мере одну цельную единицу повторяющихся совокупностей якорей, то затем в каждой точке анализа проба будет тестироваться по положению анализа для всех мишеней, определенных по (решетке) совокупности, где совокупность находится внутри площади аналитического положения. Не требуется, чтобы якоря располагались в строгом или даже фиксированном порядке внутри каждой тест-области. Например, каждый якорь может быть соединен с частицей, гранулой или тому подобное, которые принимают произвольное положение внутри тест-области. Положение каждого якоря можно определить при использовании, например, детектируемой метки. Например, в линкер, специфический для каждого типа якорей, можно ввести различную флуоресцентную, люминесцентную и т.д. метку, и можно определить положение частицы, содержащей определенную пару линкер/якорь, по природе сигнала, исходящего от линкера, например по спектру возбуждения или эмиссии. Специалисты в данной области могут приготовить ряд линкеров с различными такими прикрепленными метками, каждая имеющая различимый спектр. Альтернативно, якоря можно пометить непосредственно. Например, в каждый тип якорей можно ввести метку, которая будет флуоресцировать с характерным спектром, отличным от меток якорей других типов. Альтернативно частицы, гранулы или тому подобное могут различаться друг от друга по размеру или форме. Можно использовать любой метод мечения и детектирования, описанный здесь. Например, интенсивность флуоресценции можно определить при использовании системы для визуализации на основе ССД, с помощью сканирующего флуоресцентного микроскопа или клеточного сортера с возбуждением флуоресценции. Якорь может взаимодействовать или специфически связываться с одним участком - якорьспецифическим участком - линкера. В данном случае под терминами взаимодействовать или связываться понимается, что два вещества или соединения (например, якорь и якорь-специфический участок линкера, зонд и его мишень или мишень и мишень-специфический репортер) связываются (например,присоединяются, связываются, гибридизуются, совмещаются, подвергаются отжигу, ковалентно связы-9 011415 ваются или как-то соединяются иначе) друг с другом в достаточной мере для проведения предназначаемого анализа. В данном случае под термином специфический или специфически понимается, что два компонента (например, якорь и якорь специфическая область линкера, зонд и его мишень или мишень и мишень-специфический репортер) избирательно связываются друг с другом, и в отсутствии любой защиты, но, как правило, не с другими компонентами, не предназначенными для связывания с данными компонентами. Параметры, необходимые для специфических взаимодействий, можно определить обычными методами, например с использованием общепринятых в данной области методов. Специалист в данной области может определить экспериментально свойства нуклеиновых кислот(такие, как длину, состав оснований и степень комплементарности), которые будут способствовать тому,чтобы нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотидный якорь) гибридизовалась с другой нуклеиновой кислотой (например, якорь-специфическим участком линкера) в условиях выбранной жесткости,одновременно сведя до минимума неспецифическую гибридизацию с другими соединениями или молекулами (например, другими олигонуклеотидными линкерами). Как правило, ДНК или другая нуклеиновокислотная последовательность якоря, участка линкера или детектирующего олигонуклеотида будут обладать достаточной комплементарностью в отношении партнера по связыванию, способствующей гибридизации в выбранных жестких условиях гибридизации, и значение Tm будет составлять примерно на 10-20 С выше комнатной температуры (например, примерно 37 С). В основном олигонуклеотидный якорь может иметь длину в пределах примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно 15,20, 25 или 30 нуклеотидов. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, высоко жесткие условия гибридизации означают любые условия, при которых будет происходить гибридизация, когда имеется по меньшей мере 95%, предпочтительно от 97 до 100% комплементарность нуклеотидов (идентичность) между нуклеиновыми кислотами. Однако в зависимости от желаемой цели можно выбрать условия гибридизации, для которых потребуется меньшая комплементарность, например на уровне примерно 90, 85, 75, 50% и т.д. Параметрами реакции гибридизации, которые могут различаться, являются концентрация соли, буфер, значение рН, температура, время инкубации, количество и тип денатурирующего агента, такого как формамид и т.д. (смотри, например, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: AHybridization, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing,Inc., New York). Например, нуклеиновую кислоту (например, линкерные олигонуклеотиды) можно внести в тест-область (например, лунку многолуночного планшета - в предпочтительном воплощении 96 или 384-луночного или более планшета) в объеме в пределах примерно от 0,1 до примерно 100 мкл или более (в предпочтительном воплощении, примерно от 1 до примерно 50 мкл, наиболее предпочтительно примерно 40 мкл) при концентрации в пределах примерно от 0,01 до примерно 5 мкМ (в предпочтительном воплощении примерно 0,1 мкМ) в буфере, например, таком как 6 Х SSPE-T (0,9 М NaCl, 60 мМNaH2PO4, 6 мМ ЭДТА и 0,05% Тритона Х-100) и гибридизировать со связывающимся партнером (например, олигонуклеотидным якорем на поверхности) в течение примерно от 10 мин до примерно, по меньшей мере, 3 ч (в предпочтительном воплощении, по меньшей мере, в течение 15 мин) при температуре в пределах примерно от 4 до примерно 37 С (в предпочтительном воплощении примерно при комнатной температуре). Условия могут быть выбраны для получения высокой пропускной способности. В одном воплощении изобретения условия реакции можно приблизить к физиологическим условиям. Конструирование других типов соединений или молекул (например, полипептидов, лектинов и т.д.), которые могут служить, например, в качестве якорей или участков линкеров, и условия реакции,необходимые для достижения специфических взаимодействий со связывающимися партнерами, являются обычными и общепринятыми в данной области (например, как описано у Niemeyer et al. (1994), Nucl.Acids Res. 22, 5530-5539; Fodor et al. (1996), в патенте США 5510270; Pirrung et al. (1992), в патенте США 5143854). Параметрами инкубации являются буфер, концентрация соли, значение рН, температура, время инкубации, присутствие носителя и/или агентов или условий, способствующих уменьшению неспецифических взаимодействий и т.д. Например, в тест-область (например, лунку многолуночного планшета, в предпочтительном воплощении 96- или 384-луночного или более планшета), которая содержит в качестве якорей антитела, можно внести анти-антитела (например, антигены или антителоспецифические вторичные антитела) в объеме в пределах примерно от 0,1 до примерно 100 мкл или выше (в предпочтительном воплощении примерно от 1 до примерно 50 мкл, наиболее предпочтительно примерно 40 мкл) при концентрации в пределах примерно от 10 пкМ до примерно 10 нМ (в предпочтительном воплощении примерно 1 нМ) в буфере, например, таком, как 6 Х SSPE-T, PBS или физиологический раствор, и инкубировать с якорями на поверхности в течение примерно от 10 мин и до по меньшей мере примерно 3 ч (в предпочтительном воплощении по меньшей мере в течение 15 мин) при температуре в пределах от 4 до примерно 45 С (в предпочтительном воплощении примерно 4 С). Для якорей на основе пептидов предпочтительной является длина примерно от 5 до примерно 20 аминокислот. В некоторых воплощениях изобретения каждый якорь в совокупности может взаимодействовать с якорь-специфическим участком соответствующего ему линкера в основном в той же степени, что и другие якоря в совокупности, в выбранных условиях реакции. Это может гарантировать, что якоря точно обеспечивают в основном однородную совокупность линкеров и, следовательно, зондов.- 10011415 Якоря (т.е. группы якорей в отдельных локусах) внутри тест-области могут быть родственного ряда, т.е. каждый якорь которого может взаимодействовать с одним или более различными линкерами,имеющими участок, специфичный к подобному якорю, но различающиеся по участкам зонда; таким образом, одну совокупность родственных якорей можно использовать для программирования или определения различных рядов зондов. Гибкую природу такой родственной совокупности якорей можно увидеть при обращении к фиг. 1 и 2. На фиг. 2 представлена поверхность, включающая 15 тест-областей,каждая из которых содержит совокупность из 6 различных якорей, которые в данном примере являются олигонуклеотидами. На фиг. 1 представлен один из (олигонуклеотидных) якорей, якорь 1, который контактирует с линкером 1, включающим один участок, специфический к якорю 1, и второй участок, специфический к мРНК-мишени 1. Альтернативно, можно заменить, например, на линкер 2, который как и линкер 1, включает участок, специфический к якорю 1, но который включает второй участок, специфический к мРНК-мишени 2 вместо мРНК-мишени 1. Так, якорь 1 можно использовать для определения(или программирования, или установления, или определения) зондов для каждой из двух или более различных мРНК-мишеней. Способ получения и присоединения высокоразрешающего ряда (совокупности) олигонуклеотидов или пептидов может быть дорогостоящим, длительным по времени и/или физически трудно выполнимым. Возможность применять заранее определенную совокупность якорей для программирования широкого ряда совокупностей зондов является еще одним преимуществом данного изобретения. Несмотря на то, что родственные якоря, представленные на фиг. 2, определяют характер олигонуклеотидных зондов, совокупность одинаковых зондов можно также использовать для программирования совокупности различных зондов, например, рецепторных белков (см., например, фиг. 3). Понятно, что возможны многие пермутации, в результате которых получают ряд типов взаимодействий якорь/линкер,например, даже более сложных зондов типа сэндвич или многослойные, таких как комбинации белок/антитело. Например, в одном воплощении родственный ряд якорей можно связать (ковалентно или нековалентно) с рядом линкеров с получением модифицированной совокупности конъюгированных якорей, как более подробно представлено ниже. Таким образом, поверхность якорей по изобретению сама по себе предоставляет новые преимущества. В одном воплощении изобретения якоря могут взаимодействовать с линкерами обратимо, так, ряд близких якорей можно использовать повторно для программирования других рядов зондов. Например,олигонуклеотидный якорь можно отделить от олигонуклеотидного участка линкера, например, при нагревании, которое приводит к диссоциации двух олигонуклеотидов, и затем можно вновь связать его со вторым линкером. Способность повторного использования совокупностей якорей, получение которых может быть дорогостоящим, длительным по времени и/или физически трудно выполнимым, является еще одним преимуществом изобретения. Якорь необязательно должен взаимодействовать с линкером. Например, якорь можно связать (прямо или опосредованно) с детектируемой молекулой, такой как флуорохром, и тем самым он может служить для установления локализации пятна внутри сетки, например, в целях различения тест-поверхности и детектора. Альтернативно, в якорь можно ввести метку с известным количеством детектируемой молекулы, тем самым она будет служить в качестве внутреннего маркера для количественного определения,например, для калибровки. В том смысле, в котором он здесь используется, термин линкер относится к бифункциональному соединению, которое содержит первый участок (или группу, или область), который специфичен к выбранному (сконструированному) якорю или подгруппе якорей (якорь-специфический), и второй участок, который включает зонд, специфический к интересующей мишени (мишень-специфический). Два участка линкера могут быть соединены посредством ковалентной или нековалентной связи, и могут быть связаны непосредственно или посредством промежуточной группы (например, спейсера). Химическая природа якорь-специфического участка линкера, конечно, является функцией якоря или якорей, с которыми он взаимодействует. Например, если якорь представляет олигонуклеотид, то участок линкера, который с ним взаимодействует, может быть, например, пептидом, который специфически связывается с олигонуклеотидом, или нуклеиновой кислотой, которая может эффективно и специфически гибридизироваться с ним в выбранных жестких условиях гибридизации. Нуклеиновая кислота может быть, например, олигонуклеотидом, ДНК, РНК, ПНК, продуктом ПЦР или замещенной или модифицированной нуклеиновой кислотой (например, включающей неестественные нуклеотиды, например, такие как инозин; соединенной посредством различных известных связей, таких как сульфамат, сульфамид,фосфоротионат, метилфосфонат, карбамат; или полусинтетической молекулой, такой как конъюгат ДНКстрептавидин и т.д.). Предпочтительными являются одноцепочечные группы. Участок линкера, специфический к олигонуклеотидному якорю может иметь длину в пределах примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. Если якорь представляет антитело, то участок линкера, который взаимодействует с ним, может быть, например, анти-антителом, антигеном или более мелким фрагментом одной из этих молекул, которые могут специфически взаимодействовать с якорем. Соединения или молекулы, которые специфически взаимодействуют с другими типами якорей, описанными выше, и которые могут служить в качестве якорь-специфического участка линкера,- 11011415 являются хорошо известными в данной области, и могут быть получены с использованием общепринятых методов (например, см. выше). Химическая природа мишень-специфического участка линкера, конечно, является функцией мишени, для которой является зондом и с которым она взаимодействует. Например, если мишень представляет определенную мРНК, то мишень-специфический участок линкера может быть, например, олигонуклеотидом, который специфически связывается с мишенью, но не взаимодействует с РНК или ДНК в выбранных условиях гибридизации. Специалист в данной области с использованием общепринятых в данной области методов экспериментально определит свойства олигонуклеотида, который будет оптимально гибридизироваться с мишенью, при минимальной гибридизации с неспецифической мешающей ДНК или РНК (например, смотри выше). Как правило, длина олигонуклеотидного зонда, используемого для обнаружения мРНК-мишени, находящейся на фоне большого избытка немишеневой РНК, может составлять примерно от 8 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 18, 20, 22 или 25 нуклеотидов. Олигонуклеотидный зонд для применения в биохимическом анализе, при котором отсутствует значительный фон конкурентных мишеней, может быть короче. С использованием принятых в данной области методов (например, компьютерной программы BLAST) можно выбрать последовательности олигонуклеотидных зондов, которые взаимонесвязаны и отличаются от потенциально мешающих последовательностей в известной базе данных по генетике. Обычным образом можно выбрать условия гибридизации, позволяющие протекать специфической гибридизации олигонуклеотидного зонда с РНК с использованием общепринятых в данной области методов (например, смотри выше). Например, РНК-мишень(например, общую фракцию РНК или мРНК, выделенную из тканей и клеток, культивированных (и необязательно обработанных интересующим агентом) в любой емкости, такой как лунки многолуночного титрационного микропланшета (например, 96 или 384 лунок или более), вносят в тест-область, содержащую совокупность олигонуклеотидных зондов (смотри выше) в буфере таком, как 6 Х SSPE-T или других, необязательно содержащем агент для уменьшения неспецифического связывания (например, примерно 0,5 мг/мл разрушенной ДНК спермы сельди или лосося, или дрожжевой РНК) и инкубируют при определенной эмпирическим путем температуре в течение периода времени в пределах примерно от 10 мин и до по меньшей мере 18 ч (в предпочтительном воплощении примерно 3 ч). Жесткость условий при гибридизации может быть такой же или ниже, чем жесткость, используемая для связывания якорей с якорь-специфическим участком линкеров. Конструирование и применение других типов зондов также является обычным в данной области, например, как уже обсуждалось выше. В одном воплощении все или в основном все линкеры, связанные с якорями в данном локусе, содержат одинаковый (или в основном одинаковый) зонд, который является специфичным к отдельной,специфической интересующей мишени. В другом воплощении один или более линкеров, связанных с якорями в данном локусе, включает множество различных зондов и таким образом является специфичным к множеству различных мишеней. Данные зонды можно расположить в линкере в виде части разветвленной структуры или предпочтительно можно расположить в линейном порядке, и они могут представлять собой одно и тоже вещество (например, все являются нуклеиновой кислотой, или все представляют пептидные последовательности) или комбинации различных веществ. На практике наличие множества зондов в каждом линкере повышает число мишеней, которые можно детектировать в конкретном локусе. В одном воплощении во множестве зондов в данном линкере все являются специфичными к конкретной интересующей мишени (например, они специфичны к различным участкам отдельной интересующей мРНК или специфичны к защитным от нуклеаз фрагментам, соответствующим различным участкам этой мРНК); это повышает чувствительность анализа в отношении мишени, например, мишени,которая находится в пробе в низкой концентрации. Число зондов в линкере может составлять, например,примерно 2-50, предпочтительно примерно 2, 4 или 10. Конечно, линкеры, которые включают такое множество различных зондов, также являются преимущественными для применения с поверхностями, которые содержат одну (неповторяющуюся) область. Якорь-специфический и мишень-специфический участки линкера можно объединить (соединить,связать) посредством любой из различных ковалентных или нековалентных связей, природа которых не имеет значения для изобретения. Два участка можно соединить непосредственно или с помощью промежуточной молекулы. В одном воплощении, в котором оба участка линкера представляют олигонуклеотиды, их можно соединить ковалентными связями, такими как фосфодиэфирные связи с получением одной, колинеарной нуклеиновой кислоты. В другом воплощении, в котором якорь-специфический участок является олигонуклеотидом, и мишень-специфический участок представляет рецептор, например, рецепторный белок, то два участка можно соединить посредством взаимодействия молекул биотина и стрептавидина, пример представлен на фиг. 3. Известно много вариантов таких связей (например, смотри Niemeyer et al. (1994), NAR 22, 5530-5539). Альтернативно два участка можно соединить непосредственно,например, олигонуклеотид можно амидировать и затем непосредственно связать (например, сшить поперечными связями) с пептидом или белком по амидной связи, или присоединить к мембранному компоненту через амидную связь или присоединить к липиду. Способы образования таких ковалентных и нековалентных связей являются обычными, и специалист в данной области может легко их оптимизиро- 12011415 вать. Спейсерные последовательности (например, нуклеиновая кислота) также может находиться между якорь-специфическим и мишень-специфическим участками линкера. После связывания двух соединений (например, при инкубации двух нуклеиновых кислот, двух белков, белка плюс нуклеиновой кислоты или других) с образованием комплекса (такого, как, например,комплекс якорь/линкер), полученный комплекс можно необязательно обработать (например, промыть) для удаления несвязанных соединений (например, линкеров) с использованием условий, которые можно легко определить эмпирически, оставляя специфические взаимодействия интактными, но удаляя при этом неспецифически связанные вещества. Например, реакционные смеси можно промыть от одного до десяти раз или более в аналогичных или несколько более жестких условиях, которые использовались для получения комплекса (например, комплекса якорь/линкер). Специалисту в данной области, очевидно, понятно, что можно получить различные типы сэндвичей якорей и линкеров. Например, к совокупности якорей (например, из якорей, имеющих в основном одинаковые последовательности) можно присоединить первую группу линкеров, каждый из которых имеет первую группу, специфическую к якорю, и вторую группу, специфическую к одному из второй группы линкеров и так далее. На практике данный второй слой сэндвича позволяет превратить первую группу якорей (например, одинаковых олигонуклеотидов) в другую совокупность, имеющую другую группу специфичностей, конъюгированных якорей. Различные группы линкеров и якорей можно связать друг с другом ковалентно или нековалентно, как желательно. Комбинации по данному изобретению можно производить обычным образом с использованием общепринятой технологии. Некоторые поверхности, которые можно использовать по изобретению, являются промышленно доступными из различных источников. В предпочтительном воплощении поверхность представляет 96-,384- или 1536-луночный титрационный микропланшет такой, как модифицированные планшеты производства Corning Costar. Альтернативно, поверхность, включающая лунки, которые, в свою очередь, содержат впадины или углубления, которые можно сделать микрообработкой соединения, такого как алюминий или сталь, с получением формы, затем микроинъецировать пластик или аналогичный материал в форму с получением структуры, такой как представлена на фиг. 4. Альтернативно, можно собрать структуру такую, как представлена на фиг. 4 из стекла, пластика, керамики или тому подобное, например, из трех частей таких, как представлены на фиг. 5; первой секции, называемой луночным разделителем (фиг. 5 а), который будет образовывать разделения между лунками для проб; второй секции, называемой подразделителем (фиг. 5b), который будет образовывать подразделы или углубления внутри каждой тест-лунки и третьей секции, называемой основанием (фиг. 5 с), которая будет образовывать основание планшета и нижнюю поверхность тест-лунок. Разделителем может быть, например, кусочек материала, например, силикона с расположенными на нем отверстиями так, что каждое отверстие будет составлять стенки тест-лунки при соединении трех кусочков. Подразделителем может быть, например,тонкий кусочек материала, например, силикона, имеющий форму сита или мелкой сети. Основание может быть плоским кусочком из материала, например стекла, например, в форме нижней части обычного микропланшета, используемого для проведения биохимических анализов. Верхняя поверхность основы может быть плоской, как представлено на фиг. 5 с, или может иметь впадины, которые будут расположены с подразделителем для обеспечения подсекций, или лунок внутри каждой лунки для проб. Три части можно соединить обычными способами, например, способами, используемыми для сборки силиконовых облаток. Олигонуклеотидные якоря, линкеры или детекторы можно синтезировать с использованием общепринятой технологии, например, с помощью промышленно доступного синтезатора олигонуклеотидов и/или лигированием субфрагментов, которые были синтезированы таким образом. Нуклеиновые кислоты, которые являются слишком длинными для удобного синтеза с помощью таких способов, можно получить амплификацией, например, с помощью ПЦР при использовании общепринятых методов. В одном воплощении изобретения предопределенные нуклеиновокислотные якоря такие, как олигонуклеотидные якоря, можно расположить на или внутри поверхности тест-области с помощью любого из общепринятых в таких случаях методов, включая фотолитографию или химическое соединение, расположение с помощью чернил, капилляры, решетчатые или канальные чипы, электрохимию с использованием электродов, контактирование со штифтом или стержнем, или денатурацию с последующим облучением УФ на фильтрах (например, см. Rava et al. (1996), патент США 5545531; Fodor et al. (1996), патент США 5510270; Zanzucchi et al. (1997), патент США 5643738; Brennan (1995), патент США 5474796; заявку на патент WO 92/10092; заявку на патент WO 90/15070). Якоря можно поместить в верхней части поверхности тест-области, или, например, в случае основы из полиакриламидного геля их можно погрузить внутри поверхности так, чтобы некоторые якоря выступали из поверхности и были доступными для взаимодействия с линкером. В предпочтительном воплощении предопределенные олигонуклеотидные якоря дериватизируют по 5'-концу свободной аминогруппой; растворяют при концентрации, обычно легко определяемой эмпирически (например, примерно 1 мкМ) в буфере, таком как 50 мМ фосфатный буфер, рН 8,5 и 1 мМ ЭДТА и распределить с помощью пипетки-дозатора (Cartesian Technologies) в каплях объемом примерно 10,4 нанолитров в определенных положениях внутри тест-лунки, чья верхняя поверх- 13011415 ность представляет свежий планшет для связывания ДНК (Corning Costar). В зависимости от относительной скорости присоединения олигонуклеотида и испарения может быть необходимым контролировать влажность в лунках во время приготовления. В другом воплощении олигонуклеотидные якоря можно синтезировать непосредственно на поверхности тест-области с использованием общепринятых методов,таких как активированное снятие защиты с наращивающихся олигонуклеотидных цепей (например, в сочетании с использованием сайт-направленной маскировки) или распределением нанолитровых капель деактивирующего соединения с использованием пипетки-дозатора. Можно провести снятие защиты со всех наращивающихся последовательностей для получения, например, отдельного нуклеотида, и затем нуклеотид нанести на поверхность. В другом воплощении олигонуклеотидные якоря можно присоединить к поверхности через 3'-концы олигонуклеотидов с использованием обычной методологии. Пептиды, белки, лектины, хелатообразователи, пластики и другие типы якорей или линкеров также можно получить обычными способами, и якоря можно расположить на или внутри поверхностей с использованием подходящей доступной технологии (см., например, Fodor et al. (1996), патент США 5510270; Pirrung et al. (1992), патент США 5143854; Zanzucchi et al. (1997), патент США 5643738;Lowe et al. (1985), патент США 4562157; Niemeyer et al. (1994), NAR 22, 5530-5539). В некоторых воплощениях изобретения раскрытые комбинации используются в самых различных скрининговых способах и/или для получения информации об уровне, активности или структуре зондов или молекул-мишеней. Подобные тесты называются скрининговыми со множеством совокупностей на планшетах (MAPS) способами или анализами, и поверхности, содержащие совокупности якорей и якорей плюс зондов, которые используются для анализов, называются MAPS-тестами или MAPS-планшетами. Компоненты реакционной смеси, анализ или способ скрининга можно объединить в любом порядке. Например, якоря, линкеры и мишени можно объединить последовательно, или мишени и линкеры, в присутствии или отсутствии репортеров, можно объединить в растворе и затем привести в контакт с якорями. Одно воплощение изобретения относится к способу детектирования по меньшей мере одной мишени, включающему:a) контактирование пробы, которая может включать указанную мишень(и) с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичными к олигонуклеотидному якорю, и второй участок, содержащий зонд, специфичным к указанной мишени(ей) в условиях, эффективных для получения первого продукта гибридизации между указанной мишенью(ями) и указанным линкером;b) контактирование указанного первого продукта гибридизации с комбинацией в условиях, эффективных для получения второго продукта гибридизации между указанным первым продуктом гибридизации и указанной комбинацией, где указанная комбинация включает, перед добавлением указанного первого продукта гибридизации: 1) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область включает 2) по меньшей мере 8 различных олигонуклеотидных якорей;c) контактирование указанного первого продукта гибридизации или указанного второго продукта гибридизации с меченым детектирующим зондом иd) детектирование указанного детектирующего зонда. Каждый из анализов или способов, описанных ниже, можно проводить высокопроизводительным способом, при котором большое количество проб(например, примерно 864, 1036, 1536, 2025 или более, в зависимости от числа областей в комбинации) анализируют на каждом планшете или поверхности быстро и одновременно. Кроме того, многие планшеты или поверхности можно обработать одновременно. Например, при разработке лекарственных препаратов большое количество проб, каждая содержащая потенциальный лекарственный препарат (например, соединение из комбинаторной химической библиотеки, такой как варианты небольших молекул,пептидов, олигонуклеотидов, или других соединений) можно внести в отдельные области, описанной комбинации, или можно добавить в биологические или биохимические пробы, которые затем вносят в отдельные области комбинации и инкубируют с совокупностями зондов, находящихся в областях; и тесты можно проводить с каждой из проб. С учетом последних достижений и продолжающейся разработки микропланшетов с высокой плотностью, инструментов для нанесения ДНК и таких методов, как лазерная технология для получения и сбора данных даже от очень плотных микропланшетов, применения автоматики, усовершенствованных дозаторов, сложных современных детектирующих систем и программного обеспечения для обработки данных, способы по данному изобретению можно использовать для скрининга и анализа тысяч или десятков тысяч соединений в день. Например, в воплощениях, где зонды представляют олигонуклеотиды, анализ может быть скринингом с применением диагностической нуклеиновой кислоты или полинуклеотида (например, в тесте связывания или другом) большого числа проб на присутствие генетических вариаций или дефектов (например, полиморфизма или специфических мутаций, связанных с заболеваниями такими, как кистозный фиброз. Смотри, например, Iitia et al. (1992), Molecular and Cellular Probes 6, 505-512); патогенных микроорганизмов (таких, как бактерии, вирусы и простейшие, хозяевами которых являются животные, включая людей, или растения) или типов транскрипции мРНК, которые являются диагностическими для оп- 14011415 ределенных физиологических состояний или заболеваний. Совокупности нуклеиновокислотных зондов,включающих участки EST (включая полноразмерные копии), можно использовать для оценки характера транскрипции в клетках, из которых были получены EST (или другие). С помощью нуклеиновокислотных зондов также можно детектировать пептиды, белки или домены белков, которые специфически связываются с определенными нуклеиновокислотными последовательностями (и тому подобное). Аналогично в воплощениях, в которых зонды представляют собой антигенсвязывающие молекулы(например, антитела), тест может быть скринингом вариантных белков или типов экспрессии белков,которые являются диагностическими для определенных физиологических состояний или болезненных состояний. Смотри, например, фиг. 40 и 41, на которых представлены типы молекул, которые можно детектировать. В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для мониторинга биохимических реакций, например, при взаимодействии белков, нуклеиновых кислот, небольших молекул и тому подобное, например, в отношении эффективности или специфичности взаимодействия между антигенами и антителами, или рецепторами (таких, как очищенные рецепторы или рецепторы, связанные с клеточными мембранами) и их лигандами, агонистами или антагонистами, или ферментами (такими, как протеазы или киназы) и их субстратами, или увеличения или уменьшения количества субстрата, превращаемого в продукт, а также многого другого. Некоторые биохимические тесты можно применять для характеристики свойств зонда или мишени, или в качестве основы скринингового теста. Например, для проведения скрининга проб на присутствие определенных протеаз (например, протеаз, принимающих участие в свертывании крови, таких как протеазы Ха и VIIa), пробы можно тестировать на комбинациях,в которых зонды являются флуорогенными соединениями, специфическими к каждой интересующей протеазе. Если мишеневая протеаза связывается с и отщепляет субстрат, то субстрат будет флуоресцировать, обычно в результате, например, отщепления и разделения двух пар, переносящих энергию, и в результате сигнал можно детектировать. В другом примере для скрининга проб на присутствие определенной киназы(киназ), (например, Src, тирозинкиназы или ZAP70), пробы, содержащие одну или более интересующих киназ, можно подвергнуть анализу на комбинациях, в которых зонды представляют пептиды, которые можно избирательно фосфорилировать с участием одной из интересующих киназ. С использованием принятых в данной области, легко определяемых условий, пробы можно инкубировать с совокупностью субстратов в подходящем буфере и в присутствии необходимых кофакторов в течение эмпирически подобранного периода времени. (В некоторых тестах, например, при проведении биохимических исследований по факторам, которые регулируют активность интересующих киназ, концентрацию каждой киназы можно довести таким образом, чтобы каждый субстрат фосфорилировался с одинаковой скоростью). После обработки (например, промывания) каждой реакционной смеси в эмпирически подобранных условиях для удаления киназ и нежелательных компонентов реакции (не обязательно), можно детектировать фосфорилированные субстраты, например, при их инкубации с детектируемыми реагентами,такими как меченные флуоресцеином антитела к антифосфотирозину или антитела к антифосфосерину(например, в концентрации примерно 10 нМ или выше, или ниже), и в итоге можно детектировать сигнал. В другом примере можно поставить тесты связывания. Например, SH2-домены такие, как GRB2 SH2 или ZAP70 SH2, можно подвергнуть анализу на совокупности зондов из соответствующих фосфорилированных пептидов; или сыворотку крови можно подвергнуть скринингу на совокупности зондов из определенных рецепторов на наличие иммунодефицита. Кроме того, с использованием подобной совокупности можно провести иммуноферментный анализ. Комбинации по изобретению также можно использовать для обнаружения мутантных ферментов, которые являются более или менее активными по сравнению с аналогами дикого типа, или скрининга различных агентов, включая гербициды или пестициды. Конечно, MAPS-тесты можно использовать для количественного анализа (количественного определения) активной мишени в пробе, при условии, что зонд не является полностью занятым, т.е. не более чем примерно 90% доступных сайтов зонда связано (или реактивировано, или гибридизировано) с мишенью. В этих условиях можно количественно определить мишень, поскольку чем больше мишени, тем больше будет связан зонд. С другой стороны, в условиях, когда более чем примерно 90% доступных сайтов зонда связано, то при увеличении количества мишени не будет происходить увеличения количества мишени, связанной с зондом. Таким образом, можно количественно определять любую из вышеуказанных типов мишеней. Например, в примере 6 описано количественное определение олигонуклеотидных мишеней. Кроме того, там же показано, что даже если мишень находится в большом избытке (например,если она находится в таких больших количествах, что насыщает количество доступного зонда в MAPSсовокупности зондов), то при добавлении известных количеств не включающей метку мишени в смесь для связывания, можно сдвинуть чувствительность реакции для того, чтобы стало возможным количественно определить даже такие большие количества мишени. В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для скрининга агентов, которые модулируют взаимодействие мишени и данного зонда. Агент может модулировать взаимодействие мишень/зонд, взаимодействуя непосредственно или опосредованно либо с зондом, мишенью, либо с комплексом, образованным мишенью и зондом. Модуляция может принимать самые разнообразные формы, включая, но не ограничиваясь повышением или снижением аффинности связывания мишени с- 15011415 зондом, повышением или снижением скорости связывания мишени и зонда, конкурентным или неконкурентным ингибированием связывания зонда с мишенью или повышением или снижением активности зонда или мишени, что, в свою очередь, может привести к увеличению или снижению взаимодействия зонда/мишень. Такие агенты можно получить искусственно, или они представляют собой природные соединения. Кроме того, подобные агенты можно использовать в неизмененном виде, или в виде агрегатов с другими соединениями, и их можно соединить, ковалентно или нековалентно, со связывающим партнером либо непосредственно, либо с помощью специфического связывающего соединения. Например, для определения потенциальных агентов для разжижения крови или агентов, которые взаимодействуют с одним из каскадов протеаз, которые вызывают свертывание крови, смеси интересующих протеаз можно подвергнуть анализу с включением в него множества потенциальных агентов и затем тестировать на активность, как описано выше. Другие примеры агентов, которые можно использовать по изобретению являются очень разнообразными, и включают пестициды и гербициды. В примерах 16 и 17 описаны анализы с высокой пропускной способностью для агентов, которые избирательно ингибируют определенные киназы, или для избирательных ингибиторов взаимодействия SH2-доменов и фосфорилированных пептидов. В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для скрининга агентов, которые модулируют характер экспрессии генов. Совокупности олигонуклеотидов можно использовать,например, для обнаружения видов мРНК, чей тип экспрессии из группы генов коррелирует с определенным физиологическим состоянием или стадий развития, или с болезненным состоянием (коррелятивные гены, РНК или типы экспрессии). Под терминами коррелирует или коррелятивный понимается, что характер синтеза РНК связан с физиологическим состоянием клетки, но при этом совершенно необязательно, чтобы экспрессия данной РНК была ответственна за или являлась причиной определенного физиологического состояния. Например, можно идентифицировать небольшую подгруппу мРНК,которые экспрессируются, их экспрессия увеличивается и/или уменьшается в клетках, которые служат в качестве модели определенного болезненного состояния; данный измененный тип экспрессии по сравнению с таковым в нормальных клетках, в которых отсутствует патологический фенотип, может служить индикатором болезненного состояния (индикатором генов, РНК или типов экспрессии). Термины коррелятивный или индикатор можно использовать взаимозаменяемо. Например, клетки, обработанные опухолевым промотором, таким как форболмиристат, могут иметь тип экспрессии генов, который напоминает таковой на ранних стадиях роста опухолей. На другой модели опухолей, в клетках мышиной инсулиномы (например, клеточной линии TGP61) при заражении аденовирусом, происходит повышение экспрессии, например, c-Jun и MIP-2, в то время как экспрессия вспомогательных генов, таких как GAPDH и L32, в основном остается без изменений. Агенты, которые после контактирования с клеткой, происходящей из модели заболевания, либо непосредственно, либо опосредованно, и или в условиях in vivo, или in vitro (например, в культуре тканей),модулируют показатель экспрессии, могут функционировать в качестве лечебных средств или препаратов на уровне организма (например, у человека или животных, или растений), страдающих данным заболеванием. Такие агенты могут также модулировать экспрессию при прямом контактировании с нуклеиновой кислотой, например, в экспрессирующей системе in vitro (в пробирке). В том смысле, в котором этот термин здесь используется, модулировать означает вызывать увеличение или уменьшение количества и/или активности молекул или тому подобное, которые принимают участие в определяемой реакции. Комбинации по изобретению можно использовать для скрининга подобных агентов. Например,группы клеток (например, происходящих из модели заболевания) могут контактировать с группой агентов (например, в течение периода времени примерно от 10 мин до примерно 48 ч или более), и затем с использованием обычных, общепринятых в данной области методов (например, с помощью промышленно доступных наборов) готовят экстракты цельной фракции РНК или мРНК. Если желательно амплифицировать количество РНК, то можно использовать обычные методы амплификации, такие как RT-ПЦР(см., например, Innis et al. eds., (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press,New York). Экстракты (или амплифицированные из них продукты) контактируют (например, инкубируют) со множеством в основном одинаковых совокупностей, которые включают зонды для соответствующих индикаторных РНК, и можно обнаружить агенты, которые связаны с изменением типа экспрессии индикатора. В примере 15 описывается анализ с высокой пропускной способностью для скрининга соединений, которые могут изменять экспрессию генов, которые являются коррелятивными для болезненных состояний. Аналогично, можно идентифицировать агенты, которые модулируют типы экспрессии, связанные с конкретными физиологическими состояниями или стадиями развития. Подобные агенты могут быть искусственно полученными или природными соединениями, включая факторы внешней среды, такие как соединения, принимающие участие в эмбриональном развитии или регуляции физиологических реакций,или соединения, имеющие значение для сельского хозяйства, такие как пестициды или гербициды. Кроме того, подобные агенты могут использоваться в неизмененном состоянии или в виде агрегатов с другими соединениями; и их можно соединить, ковалентно или нековалентно, со связующим членом либо непосредственно, либо посредством специфического связывающего соединения.- 16011415 Другое воплощение изобретения представляет набор, пригодный для детектирования по меньшей мере одной мишени в пробе, включающий:a) поверхность, содержащую множество пространственно разобщенных областей, по меньшей мере две из которых являются в основном одинаковыми, где каждая область содержит по меньшей мере восемь различных якорей (олигонуклеотидов, или один из других типов, описанных здесь) иb) контейнер, включающий по меньшей мере один бифункциональный линкер, который имеет первый участок, специфичный по меньшей мере к одному указанному якорю(ям), и второй участок, который включает зонд, специфичный по меньшей мере к одной указанной мишени(ям). В одном воплощении обеспечивается поверхность, как указано в п.а) выше, и набор инструкций для соединения по меньшей мере одного якоря с бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный по меньшей мере к одному указанному якорю(ям), и второй участок, который включает зонд, специфичный по меньшей мере к одной мишени. Инструкции могут включать, например, (но не ограничиваясь этим) описание каждого якоря на поверхности, описание того, как много якорей находится, и где они расположены на поверхности, и протокол специфического присоединения (соединения,связывания) линкеров с якорями. Например, если якоря представляют собой олигонуклеотиды, то инструкции могут включать последовательность каждого якоря, с помощью которой практикующий специалист сможет сконструировать комплементарные якорь-специфические группы линкеров для специфического взаимодействия (например, гибридизации) с якорями; если якоря представляют пептиды, то в инструкции может входить информация, например, об антителах, которые будут специфически взаимодействовать с пептидами. Инструкции также могут включать протокол связывания якорей и линкеров, например, описание условий и реагентов для гибридизации (или другого типа соединения), таких как температура и продолжительность инкубации, условий и реагентов для удаления несвязавшихся молекул(например, растворы для промывания) и тому подобное. Кроме того, инструкции могут включать информацию о конструировании и применении любого из типов контрольных линкеров, уже обсужденных здесь, и о методах проведения, например, количественного определения, нормализации, тонкой настройки или калибровки с комбинациями. В инструкцию могут входить любой из параметров, условия или воплощения, раскрытые в данной заявке, которые все может выполнить специалист в данной области обычным образом с использованием общепринятых в данной области методов. Как обсуждается в данной заявке, практикующий специалист может присоединить к поверхности по изобретению, включающей данную совокупность (или совокупности) якорей, самые разно образные типы линкеров, тем самым программируя любую из широкого ряда совокупность зондов. Кроме того,практикующий специалист может удалить с поверхности по изобретению данную группу линкеров и добавить к ней другую группу линкеров (или такую же или отличную от первой группы), что дает возможность многократно использовать данную поверхность. Данная гибкость и возможность повторного использования составляют дополнительные преимущества изобретения. В другом воплощении комбинации по изобретению можно использовать для картирования EST(меток экспрессированных последовательностей). То есть, MAPS-тесты можно использовать для определения того, какая, если вообще таковая имеется, группа EST получена из различных (или частично перекрывающихся) участков одного и того же гена(ов), и какая, если вообще таковая имеется, является уникальной. На фигурах 18, 19, 20 и 21 представлен такой анализ, в данном примере показан тест для определения того, какие, если вообще таковые имеются, из 16 EST связаны с общим геном. Первой стадией теста (смотри фигуру 18) является сборка совокупностей, в которых каждая из EST, которые следует картировать, представлена по меньшей мере одним олигонуклеотидным зондом, который ей соответствует. Число совокупностей, равное (или выше) числу EST, которые следует картировать, распределяют на отдельные области (например, лунки) на поверхности; в представленном примере поверхность комбинации включает 16 лунок, каждая из которых включает совокупность из 16 различных EST-специфических олигонуклеотидов под номерами 1-16. Олигонуклеотид, который соответствует EST (является ESTспецифическим), представляет таковой, который в достаточной мере комплементарен EST так, что в выбранных жестких условиях гибридизации олигонуклеотид будет специфически гибридизоваться с данной EST, но не с другими, неблизкими EST. EST-соответствующий олигонуклеотид данного типа может специфически связываться (в оптимальных условиях) с кодирующей или некодирующей цепью кДНК, синтезированной из гена, из которого первоначально получена EST, или с мРНК, синтезированной из гена, из которого первоначально была получена EST. В настоящей заявке уже обсуждались факторы, которые следует учитывать при конструировании олигонуклеотидов, и параметры гибридизации для их оптимизации в целях получения специфической гибридизации. Для того чтобы собрать совокупности, готовят молекулы линкеров, каждая из которых включает группу, специфичную к одному из якорей родственной совокупности плюс группу, включающую олигонуклеотидный зонд, который соответствует одной из EST, которые подвергаются картированию; и линкеры соединяют с якорями, как уже обсуждалось в данной заявке. На следующей стадии аликвотную порцию пробы, содержащей смесь нуклеиновых кислот (например, мРНК, или одноцепочечной или денатурированной ДНК), которая может включать последовательности, комплементарные одному или более олигонуклеотидных зондов, вносят в каждую из областей (лунок), которая содержит совокупность зондов; затем смесь инкубируют в обыч- 17011415 ных, определенных как оптимальные, условиях, позволяя тем самым нуклеиновой кислоте связаться с комплементарными зондами. Если несколько EST-специфических зондов комплементарны различным участкам одной нуклеиновой кислоты, то эта нуклеиновая кислота будет связываться с каждым локусом в совокупности, в котором расположен один из данных зондов. На следующей стадии другой детектирующий олигонуклеотид (в представленном примере детекторы 1-16) вносят в каждую область (лунку)(смотри фиг. 19). Детектирующий олигонуклеотид конструируют для каждой из EST, которые подвергается картированию. Каждый EST-специфический детектор соответствует другому (по меньшей мере, частично неперекрывающемуся) участку EST, чем это делает зонд-олигонуклеотид так, что зонд и детектирующие олигонуклеотиды не мешают друг другу. Смотри,например, EST, представленные на фиг. 21, которые соответствуют EST 1, 2 и 6 на фиг. 18-20. На фиг. 21 показано, что обе EST 1 и 2 получены из гена X (они связаны), в то время как EST 6 получена из другого, неродственного гена. Если аликвотные порции пробы, содержащей смесь мРНК, включая полученную из гена X, инкубируют с совокупностями зондов, представленных на фигурах 18-20, то мРНК гена X будет, в оптимальных условиях, гибридизироваться в локусах с зондами 1 и 2, но не в них, в случае зонда 6. (Конечно, каждую мРНК следует добавлять в молярном избытке к суммарному количеству зондов, с которыми она может гибридизироваться.) Если детектирующий олигонуклеотид 1 вносят в область (лунку) 1, то он будет гибридизоваться с мРНК гена X, которая связана в локусах 1 и 2 совокупности зондов, но не в локусе 6. Аналогично, если детектирующий олигонуклеотид 2 вносят в другую лунку,например, лунку 2, то он также будет связываться в локусах 1 и 2, но не в локусе 6. Таким образом,можно определить при высокой пропускной способности, которые из EST связываются, т.е. код для участков одного и того же гена, и какие EST являются уникальными. Для гипотетического примера, представленного на фиг. 20, первые 3 EST кодируют участки одного и того же гена, в то время как последние 5 EST кодируют участки другого гена, и оказалось, что остальные EST не связаны. В данной заявке уже обсуждались условия гибридизации, необязательные стадии промывания, способы детектирования и тому подобное в отношении других MAPS-тестов. Для того чтобы подтвердить данные по связыванию,полученные в MAPS-тесте, можно поставить ПЦР с использованием пар EST-специфических олигонуклеотидных зондов в качестве смысловых и антисмысловых праймеров. Каждая пара связанных EST должна дать продукт ПЦР. Следует отметить, что данный ПЦР-тест по парному признаку можно провести для прямого определения связи без использования MAPS-анализа связи, однако, в данном случае будет необходима постановка многих реакций, и потребуется синтезировать каждый EST-праймер в качестве смысловой и антисмысловой цепей. В качестве показательного примера потребуется 180 подобных реакций. В одном аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества EST комплементарны к данной нуклеиновой кислоте, включающему:a) инкубацию иммобилизованной совокупности олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждой из указанных EST, с тестируемой пробой, которая может содержать указанную данную нуклеиновую кислоту, с получением продукта гибридизации указанных олигонуклеотидных зондов и указанной нуклеиновой кислоты;b) инкубацию указанного продукта гибридизации с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует EST, которой соответствует один из указанных олигонуклеотидных зондов, но который является специфичным к другому участку EST, чем указанный олигонуклеотидный зонд иc) детектирование того, в каком олигонуклеотидном зонде из указанной совокупности находится метка, внесенная с помощью указанного детектирующего олигонуклеотида,где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает: 1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых, областей,равный ряду EST, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает 2) ряд различных якорей, равный ряду EST, которые подвергаются исследованию, в сочетании с 3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфический к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий по меньшей мере одной из EST. В другом аспекте изобретение относится к вышеуказанному способу, где указанные EST могут быть комплементарны указанной нуклеиновой кислоте и где каждая из указанных EST включает две различных олигонуклеотидных последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий указанной EST, и вторая из которых определяет детектирующий олигонуклеотид, соответствующий указанной EST, включающему:a) контактирование пробы, которая включает молекулы указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной областью комбинации, где указанная область содержит совокупность олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждой из указанных EST;b) инкубацию указанной пробы с указанной областью, тем самым позволяя молекулам указанной нуклеиновой кислоты связываться с указанными EST-соответствующими олигонуклеотидными зондами,которые комплементарны участкам указанной нуклеиновой кислоты;c) инкубацию указанной области, включающей молекулы указанной нуклеиновой кислоты, связан- 18011415 ной с одним или более из указанных EST-соответствующих олигонуклеотидных зондов с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует EST, которой соответствует данный один из олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, тем самым связывая детектирующие олигонуклеотиды с молекулами нуклеиновой кислоты, которые связаны с указанным данным олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны указанной нуклеиновой кислоте;d) детектирование присутствия указанных детектирующих олигонуклеотидов, и тем самым идентификация таких EST-соответствующих олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с указанным данным ESTсоответствующим олигонуклеотидным зондом, тем самым идентификацию таких EST, которые комплементарны указанной данной нуклеиновой кислоте, где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает 1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых областей,равный ряду EST, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает 2) ряд различных якорей, равный ряду EST, которые подвергаются исследованию, в сочетании с 3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфичный к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий, по меньшей мере, одной из указанных EST. Компоненты теста для картирования EST можно объединить в любом порядке. Например, якоря,линкеры и EST можно объединить последовательно, или линкеры и EST в присутствии или отсутствии репортеров, можно объединить в растворе и затем добавить к якорям. В другом аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества EST комплементарны данной нуклеиновой кислоте, включающему:a) инкубацию группы бифункциональных олигонуклеотидных линкеров, каждый из которых включает первый участок, который представляет зонд, соответствующий по меньшей мере одной из указанных EST, и второй участок, специфичный к якорному олигонуклеотиду, с тестируемой пробой, которая может содержать указанную данную нуклеиновую кислоту, с получением первого продукта гибридизации указанных олигонуклеотидных зондов и указанной нуклеиновой кислоты;b) инкубацию указанного первого продукта гибридизации с иммобилизованной совокупностью якорных олигонуклеотидов, где каждый якорный олигонуклеотид соответствует якорь-специфическому участку по меньшей мере одного из указанных линкеров, с получением второго продукта гибридизации,включающего указанные якоря, указанные олигонуклеотидные зонды и указанную нуклеиновую кислоту иc) инкубацию либо указанного первого, либо указанного второго продукта гибридизации с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует EST, которой соответствует один из указанных олигонуклеотидных зондов, но который является специфичным к другому участку EST, чем указанный олигонуклеотидный зонд иd) детектирование, в какие олигонуклеотидные зонды указанной совокупности включилась метка с помощью указанного детектирующего олигонуклеотида, где указанная совокупность якорных олигонуклеотидов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает: 1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых областей,равный ряду EST, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает 2) ряд различных якорей, равный ряду EST, которые подвергаются исследованию. Конечно, вышеуказанные способы картирования EST можно использовать для картирования тестируемых последовательностей (например, полинуклеотидов) в любой интересующей нуклеиновой кислоте. Например, можно определить, относятся ли два или более клонированных фрагмента ДНК или кДНК к одной и той же геномной ДНК. Подобный способ может помочь, например, установлению структуры длинных сложных генов. Аналогичным образом, можно определить, относится ли одна или более сплайсированных последовательностей или кодирующих последовательностей к одной и той же геномной ДНК. Подобное определение можно использовать, например, в диагностическом тесте для того, чтобы различить нормальное и болезненное состояния, которые характеризуются различными типами сплайсинга. Специалистам в данной области, очевидно, станут понятными многие другие применения способа картирования. В другом аспекте изобретение относится к способу определения того, какие из множества полинуклеотидов являются комплементарными для данной нуклеиновой кислоты, где один или более указанных полинуклеотидов может быть комплементарным для указанной нуклеиновой кислоты, и где каждый из указанных полинуклеотидов включает две различных олигонуклеотидных последовательности, первая из которых определяет олигонуклеотидный зонд, соответствующий указанному полинуклеотиду, и вторая из которых определяет детектирующий олигонуклеотид, соответствующий указанному полинуклеотиду,включающемуa) контактирование пробы, которая включает молекулы указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной областью комбинации, где указанная область содержит совокупность олигонуклеотидных зондов, по меньшей мере один из которых соответствует каждому из указанных полинуклеотидов;b) инкубацию указанной пробы с указанной областью, тем самым позволяя молекулам указанной нуклеиновой кислоты связываться с указанными полинуклеотид-соответствующими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны участкам указанной нуклеиновой кислоты;c) инкубацию указанной области, включающей молекулы указанной нуклеиновой кислоты, связанной с одним или более из указанных полинуклеотид-соответствующих олигонуклеотидных зондов, с детектирующим олигонуклеотидом, который соответствует полинуклеотиду, которому соответствует данный один из олигонуклеотидных зондов указанной совокупности, тем самым связывание детектирующих олигонуклеотидов с молекулами нуклеиновой кислоты, которые связаны с указанным данным олигонуклеотидным зондом или с другими олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны указанной нуклеиновой кислоте;d) детектирование присутствия указанных детектирующих олигонуклеотидов, тем самым идентификацию таких полинуклеотид-соответствующих олигонуклеотидных зондов указанной совокупности,которые комплементарны участкам нуклеиновой кислоты, которая связывается с указанным данным олигонуклеотидным полинуклеотид-соответствующим зондом, тем самым идентификацию таких полинуклеотидов, которые комплементарны указанной данной нуклеиновой кислоте, где указанная совокупность олигонуклеотидных зондов иммобилизована в области комбинации, где указанная комбинация включает 1) поверхность, содержащую ряд пространственно разобщенных, в основном одинаковых областей,равный ряду полинуклеотидов, которые подвергаются исследованию, где каждая область включает 2) ряд различных якорей, равный ряду полинуклеотидов, которые подвергаются исследованию, где каждый якорь связан с 3) бифункциональным линкером, который имеет первый участок, специфический к якорю, и второй участок, который включает олигонуклеотидный зонд, соответствующий по меньшей мере одному из указанных полинуклеотидов. В другом аспекте изобретения вышеуказанные способы картирования EST или других полинуклеотидов дополнительно включают удаление несвязанных участков пробы между одной или более стадиями. В другом воплощении изобретения одну или более интересующих РНК-мишеней (например, мРНК или другие типы РНК) превращают в кДНК с помощью обратной транскриптазы, и затем данные кДНК гибридизируют с совокупностью зондов. Данный тип анализа схематично представлен на фиг. 8. Из клеток и тканей готовят экстракты РНК (или очищенную мРНК), как здесь уже было описано. Затем к пробе с РНК добавляют обратную транскриптазу и олигонуклеотидные праймеры, специфические к интересующей РНК и при использовании принятых в данной области условий и методов, которые можно легко определить и оптимизировать, получают первые цепи кДНК. Термин специфический праймер относится к таковому, в достаточной мере который является комплементарным к интересующей мРНК, чтобы связаться с ней в выбранных жестких условиях гибридизации, и распознаваться обратной транскрипцией, но который не связывается с нежелательной нуклеиновой кислотой (см. выше обсуждение подходящих условий реакции для достижения специфической гибридизации). Остаточные молекулы РНК мРНК, которые не были распознаны специфическими праймерами, и/или другие типы загрязняющих молекул РНК в экстракте РНК, такие как тРНК или рРНК, можно удалить с помощью любой из самых различных рибонуклеаз или химическими методами такими, как обработка щелочью, оставляя одноцепочечную кДНК, которую затем приводят в контакт с совокупностью MAPS-зондов. Применение в данном способе обратной транскриптазы сводит до минимума необходимость в интенсивной обработке РНК, которая может быть чувствительной к разрушению под действием нуклеаз, и что таким образом вызывает затруднения при работе с ней. Кроме того, дополнительная специфичность, возникающая в результате специфических праймеров обратной транскриптазы, вносит в способ дополнительную специфичность. Необязательно описанную выше кДНК можно амплифицировать перед гибридизацией с совокупностью зондов для повышения интенсивности сигнала. Описанные выше олигонуклеотидные праймеры обратной транскриптазы могут включать на их 5'-концах последовательности (которые могут быть длиной примерно 22-27 нуклеотидов), что делает специфичными сайты инициации для РНК-полимеразы(например, Т 7-, Т 3- или SP2-полимеразы и тому подобное). В примере, представленном на фиг. 8, последовательность Т 7-промотора добавляют к праймеру обратной транскриптазы. Сайт распознавания полимеразы становится включенным в кДНК, и затем он может играть роль сайта распознавания для многих циклов транскрипции с участием соответствующей РНК-полимеразы (транскрипции in vitro или IVT). Необязательно полученные таким образом молекулы мРНК можно дополнительно амплифицировать с использованием ПЦР и соответствующих праймеров, или саму кДНК можно амплифицировать. Таким образом, способы транскрипции и постановки ПЦР являются обычными и хорошо известны в данной области. Гибкость ПЦР позволяет вносить многие изменения в способы по изобретению. В одном воплощении один или оба праймера для ПЦР, которые используют для амплификации мишени, могут включать химическую модификацию, в результате которой продукт ПЦР, специфически или неспецифически,- 20011415 присоединяется к твердой подложке. Подобные химические модификации включают, например 5'амидирование, что позволяет связываться с поверхностями, такими как планшеты для связывания ДНК производства Costar (например, модифицированные N-оксисукцинимидэфиром, или покрытые малеиновым ангидридом планшеты, такие как планшеты Reacti-Bind производства Pierce, Rockford, IL). Способы получения олигонуклеотидов, включающих подобные химические модификации, являются обычными и общепринятыми в данной области. Продукт ПЦР, содержащий подобный модифицированный праймер,можно присоединить к любой желаемой подложке, включая твердую подложку, например внутренние стенки лунки на титрационном микропланшете, гранулу (например, немагнитную или магнитную гранулу) или любой тип поверхностей, описанных здесь. Конечно, праймер для ПЦР можно присоединить к подложке перед началом реакции ПЦР. Несколько циклов ПЦР можно повторить без промывания, но с избытком связанного праймера так, чтобы полученный продукт ПЦР оставался связанным с подложкой. Присоединение амплифицированной мишеневой последовательности к подложке может облегчить промывание (или очистку) мишени или перед ее контактом (например, гибридизацией) с поверхностью,включающей якоря и/или линкеры, или после контакта с ней и затем высвобождения из подобной поверхности. В другом воплощении один или более праймеров для ПЦР, используемых для амплификации мишени, могут включать один или более сайт рестрикции, что позволяет ввести сайты рестрикции, смежные с любым концом, или фланкирующие, интересующей последовательности-мишени. Сайты рестрикции можно добавить к амплифицированной ПЦР мишени либо перед, либо после контакта (например,гибридизацией) с поверхностью, включающей якоря и/или линкеры. Введенный таким образом сайт(ы) рестрикции могут, например, облегчить клонирование амплифицированной мишени обеспечением сайтов клонирования, которые фланкируют последовательность-мишень. Сайты рестрикции также могут облегчить очистку амплифицированной последовательности. Например, один или более сайтов рестрикции можно ввести в праймер для ПЦР между мишеневой специфической последовательностью и химической модификацией, что позволяет присоединиться к подложке. После амплификации мишени с помощью ПЦР с использованием модифицированного праймера для ПЦР и связывания с подложкой посредством химической модификации, ее можно отмыть и затем расщепить по сайту(ам) рестрикции,смежному с мишеневой последовательностью, тем самым высвобождая отмытую мишень. См., например, фиг. 23. Конечно, в способах, описанных выше, можно также использовать другие расщепляемые сайты,чем сайты рестрикции, например пептид можно расщепить специфической протеазой, или другой компонент, который можно расщепить и/или высвободить химически, физически или другими средствами. В другом воплощении один или оба праймера для ПЦР, используемые для амплификации мишени,могут включать последовательность (которая необязательно присутствует в мишени), специфическую,например, к мишень-специфическому репортеру или детектирующему линкеру. Конечно, вышеуказанные модификации праймеров можно использовать вместе в любой желаемой комбинации и можно добавить к амплифицированному продукту на любой стадии теста. В примерах 21 и 22 представлены протоколы, в которых несколько вышеописанных модификаций праймеров включают в амплифицированную мишень. Вышеописанные способы, в которых мРНК-мишени превращают в кДНК с помощью обратной транскриптазы и/или амплифицируют ПЦР перед анализом на MAPS-планшетах, можно использовать вместо обычного MAPS-анализа для любого вышеописанного анализа для РНК. Нуклеиновые кислоты, используемые в способах по изобретению, например, мишени, олигонуклеотиды, участвующие в детектировании мишени, или защитные от нуклеаз фрагменты (описанные здесь),можно амплифицировать с помощью любого из самых разнообразных ферментативных методов, включая ПЦР и реакции с участием лигазы. Одним из таких методов является опосредуемая транскрипцией амплификация (см., например, Abe et al. (1993), J. Clin. Microbiol. 31, 3270-3274). См. также пример 32 и фиг. 36-39 и 42. В другом воплощении изобретения одну или более интересующих нуклеиновокислотных мишеней гибридизируют со специфическими полинуклеотидными защитными фрагментами и подвергают методу защиты от нуклеаз, и данные защитные фрагменты, гибридизированные с интересующей мишенью(ями),анализируют на MAPS-планшетах. Конечно, подобные MAPS-планшеты могут включать якоря, которые не связаны с линкерами (например, которые могут непосредственно связываться с интересующей мишенью или защитным от нуклеаз фрагментом); преимущества защиты от нуклеаз при использовании в сочетании с любым типом совокупности зондов, станут, очевидно, понятными специалистам в данной области из настоящего описания и любого из его предшественников, для которых заявлено преимущество. Если представляющая интерес мишень является РНК, и защитный фрагмент представляет ДНК, то способ защиты от нуклеаз/MAPS (NPA-MAPS) может снизить необходимость в интенсивной обработке РНК, которая может быть чувствительной к разрушению под действием загрязняющих нуклеаз, и таким образом вызвать затруднения при работе с ней. Обработка пробы способом защиты от нуклеаз также создает возможность получить пробу с низкой вязкостью. Защита пробы от нуклеаз также позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость способа. См., например, пример 30, в котором показана- 21011415 чувствительность и воспроизводимость типичного анализа, в котором пробу обрабатывают способом защиты от нуклеаз. Преимущество изобретения заключается в том, что тесты могут быть в достаточной мере чувствительными, чтобы отпала необходимость в амплификации мишени (например, ПЦР) для детектирования сигнала. В NPA-MAPS-способе зонды в совокупности зондов являются олигонуклеотидами, имеющими то же число цепочек, что и представляющие интерес нуклеиновые кислоты-мишени, в большей степени, чем комплементарные им, как в стандартном MAPS-тесте. Один пример способа NPAMAPS схематично представлен на фиг. 9. В тесте NPA-MAPS интересующая мишень может быть нуклеиновой кислотой, например геномной ДНК, кДНК, вирусной ДНК или РНК, рРНК, тРНК, мРНК, олигонуклеотидами, фрагментами нуклеиновых кислот, модифицированными нуклеиновыми кислотами, синтетическими нуклеиновыми кислотами и тому подобное. В предпочтительном воплощении изобретения способ используется для анализа одной или более мРНК-мишеней, которые находятся в тканевом или клеточном экстракте РНК. Пробу, которая содержит интересующую мишень(и), вначале гибридизируют в выбранных жестких условиях (см. выше обсуждение, касающееся подходящих условий реакции для достижения специфической гибридизации) с избытком одного или более специфического защитного фрагмента(ов). Защитный фрагмент представляет полинуклеотид, который может быть, например, РНК, ДНК (включая продукт ПЦР) , ПНК, или модифицированной или замещенной нуклеиновой кислотой, специфичный к участку интересующей нуклеиновой кислоты-мишени. Под специфическим защитным фрагментом понимается полинуклеотид, который в достаточной мере является комплементарным по отношению к предназначаемому связывающему партнеру для связывания с ней в выбранных жестких условиях, но который не будет связываться с другими, непредназначенными для этого нуклеиновыми кислотами. Защитный фрагмент может быть длиной по меньшей мере из 10 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до примерно 100 или может представлять собой полноразмерную кДНК. В предпочтительном воплощении защитные фрагменты являются олигонуклеотидами на основе одноцепочечной ДНК. Защитные фрагменты, специфические в отношении 100 или более мишеней, можно включить в одну реакцию гибридизации. После гибридизации пробу обрабатывают смесью одной или более нуклеаз, для разрушения других нуклеиновых кислот чем защитный(ые) фрагмент(ы), гибридизированные с интересующей нуклеиновой кислотой(ами) и (необязательно) участком(ами) мишеневой нуклеиновой кислоты, гибридизированными и защищенными от действия нуклеаз во время проведения способа защиты от нуклеаз (находятся в дуплекс-гибриде). Например, если проба представляет клеточный экстракт, то нежелательные нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК,тРНК, рРНК и мРНК, т.е. иные, чем представляющие интерес, могут в основном разрушиться на данной стадии. Можно использовать любую из самых различных нуклеаз, включая, например, РНКазу из поджелудочной железы, нуклеазу из золотистой фасоли, S1-нуклеазу, РНКазу А, рибонуклеазу Т 1, экзонуклеазу III, экзонуклеазу VII, РНКазу CLB, РНКазу PhyM, РНКазу U2 и тому подобное в зависимости от природы гибридизированных комплексов и нежелательных нуклеиновых кислот, находящихся в пробе. РНКаза Н может быть особенно пригодной для расщепления остаточной РНК, связанной с защитным фрагментом ДНК. Условия реакции с участием данных фрагментов являются хорошо известными в данной области, и их можно эмпирически оптимизировать. Кроме того, можно использовать химические методы, например, щелочной гидролиз РНК. Если это необходимо, то затем пробы можно обработать с использованием хорошо известных в данной области способов для удаления негибридизированного вещества и/или инактивации, или удаления остальных ферментов (например, экстракцией фенолом, осаждением, колоночной фильтрацией и т.д.). Способ гибридизации, после расщепления нуклеазами и (необязательно) химического разрушения, называется способом защиты от нуклеаз; описано много самых разных способов защиты от нуклеаз (см., например, Lee et al. (1987), Meth. Enzymol. 152, 633-648. Zinn etal. (1983), Cell 34, 865-879). Пробы, обработанные защитой от нуклеаз, с последующей (необязательной) инактивацией нуклеаз, приводят в контакт с MAPS-совокупностью зондов и проводят обычные стадииMAPS-анализа. Связанные защитные фрагменты можно обнаружить, например, с помощью гибридизации мечеными мишень-специфическими репортерами, как здесь описано для стандартных MAPS-тестов,или защитные фрагменты можно пометить сами по себе, ковалентно или нековалентно, с помощью детектируемой молекулы. Если желательно, можно включить один или более контролей для нормализации способа NPAMAPS. Например, можно использовать один или более защитных фрагментов, соответствующих нуклеиновой кислоте, которая, как предполагается, находится в каждой серии проб в основном постоянном количестве (например, конститутивно продуцированная мРНК, участок геномной ДНК, тРНК или рРНК). Возможность детектировать или количественно определять внутренний контроль для нормализации, например, геномную ДНК в тесте определения нуклеиновых кислот, которые находятся в различных количествах (например, мРНК), представляет преимущество применения защитных фрагментов в тестах. Поскольку количество стандарта(ов) для нормализации может быть ниже, чем таковое интересующей экспрессированной мРНК, то тест можно довести таким образом, чтобы сигналы, соответствующие экспрессированным генам, не заглушали сигнал(ы), соответствующий стандарту(ам) нормализации. Способы доведения сигналов являются общепринятыми и, очевидно, понятны для специалистов в дан- 22011415 ной области. Например, можно использовать любой из способов, описанных здесь, для уравновешивания интенсивности сигналов (например, ослабление сигналов, тонкая настройка)(например, использование блокированных линкеров; введение метки в сигнальную группу, сконструированную для обнаружения стандарта нормализации на более высоком уровне по сравнению с предназначенным для детектирования мРНК; размещение локуса, предназначенного для детектирования стандарта нормализации, множества линкеров, специфических к различным участкам нуклеиновой кислоты для нормализации, или для защитных фрагментов, которые соответствуют различным участкам этой нуклеиновой кислоты и т.д.). Стандарт(ы) нормализации и нуклеиновые кислоты-мишени (например, мРНК), представляющие интерес, можно детектировать одновременно или последовательно, например, любым описанным здесь способом. В примерах 28 и на фиг. 29 представлен типичный опыт, в котором внутренние стандарты нормализации в виде ДНК используют при анализе мРНК. В предпочтительном воплощении в защитный фрагмент непосредственно вводят метку, например, в большей степени, чем при гибридизации с мишень-специфическим репортером. Например, репортер связывают с защитным фрагментом посредством взаимодействия лиганд-антилиганд, например комплекс стрептавидин-фермент добавляют к биотинилированному защитному олигонуклеотиду. В другом примере защитный фрагмент модифицируют химически (например, прямой конъюгацией с пероксидазой из хрена (HRP) или флуоресцентной краской), и детектируют данную химическую модификацию либо с участком нуклеиновой кислоты защитного фрагмента, либо без него (например, после отщепления модификации, например, в результате ферментативной или химической обработки). В любом из вышеуказанных способов защитный фрагмент можно пометить до или после гибридизации с соответствующей линкерной молекулой. Для контроля того, что способ защиты от нуклеаз функционирует правильно, т.е., что негибридизованные нуклеиновые кислоты расщепляются, как это и желательно, можно сконструировать один или более защитных фрагментов с включением выступающих (негибридизованных) сегментов, которые будут отщепляться под действием нуклеаз, если способ функционирует правильно. Присутствие или отсутствие выступающих фрагментов можно определить гибридизацией с комплементарным, меченым, детектирующим зондом, или выступающие участки защитного фрагмента можно пометить сами по себе, ковалентно или нековалентно, с помощью детектируемой молекулы. Данную контрольную операцию можно провести до того, как пробу приводят в контакт с совокупностью зондов, или она будет составной частью самого MAPS-теста. Пример такого контрольного теста описан в примере 15. Конечно, поскольку различные метки легко различаются (например, флуоресцентные краски с различными спектрами поглощения), в один анализ можно включить несколько по-разному меченых олигонуклеотидов. Кроме того, стандартный тест защиты от нуклеаз, при анализе электрофорезом в геле, можно использовать во время разработки анализа для подтверждения того, что, как и предполагается, защитные фрагменты обработаны. Специалистам в данной области, очевидно, станут понятны другие контроли правильного расщепления нуклеазами. Например, можно включить в анализ защитный от нуклеаз фрагмент, который, как заведомо известно, не обладает специфичностью к любой нуклеиновой кислоте в пробе (например, при анализе растительных нуклеиновых кислот, можно включить защитный фрагмент, специфический к гену животных, который, как заведомо известно, отсутствует в растениях). После детектирования мишеней сигнал детектирующего зонда (например, HRP-меченного) можно элиминировать (например, денатурировать, уничтожить, погасить, подавить, блокировать), планшеты промывают для удаления любых полученных реагентов, агентов или буферов, которые могут помешать на последующей стадии (например, денатурирующий реагент), и затем выступающий фрагмент можно детектировать другим детектирующим зондом (например, также HRP-меченным). Денатурацию сигнала с последующим добавлением другого детектирующего зонда с той же сигнальной группой можно использовать на различных стадиях анализа. Применение двух различных флуоресцентных зондов и двойное цветное детектирование можно использовать без денатурации или блокирования сигнала. Как отмечалось выше, в одном воплощении изобретения олигонуклеотидный зонд используют для скрининга нуклеиновой кислоты, которая включает один или более полиморфизмов. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота (например, ДНК, такая как геномная ДНК, или РНК, такая как мРНК) включает один или несколько SNP. Для постановки этого метода можно использовать обычные,общепринятые в данной области операции. Например, для скрининга ДНК, включающей известный SNP,или мРНК, экспрессированную из такой ДНК, SNP-специфический защитный фрагмент гибридизируют с пробой, содержащей нуклеиновые кислоты, которые могут включать такой SNP. Под SNPспецифическим защитным фрагментом в данном контексте понимается защитный фрагмент, который включает измененное основание SNP или, если анализу подвергается мРНК, то обратный комплемент такой последовательности. Затем пробу обрабатывают одной или более соответствующих нуклеаз, которые в подходящих, эмпирически подобранных условиях расщепляют негибридизированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту и расщепляют двухцепочечную (дуплекс) нуклеиновую кислоту (например, гибриды ДНК-ДНК, гибриды ДНК-РНК и тому подобное) по сайту ошибочного спаривания оснований (например, ошибочного спаривания одной пары оснований). Подходящие нуклеазы включают, на- 23011415 пример, S1 или РНКазу Н. Если в пробе находится нуклеиновая кислота, включающая SNP, и она гибридизирована с SNP-специфическим защитным фрагментом, то защитный фрагмент останется интактным при переваривании, и его можно подвергнуть MAPS-анализу и детектировать с помощью детектирующего зонда или детектирующего олигонуклеотида, который специфичен к последовательности защитного фрагмента. Нуклеиновые кислоты, не содержащие SNP, будут расщепляться по сайту ошибочного спаривания оснований между SNP-специфическим защитным фрагментом и соответствующей последовательностью дикого типа в нуклеиновой кислоте. Если желательно, то можно удалить участок защитного фрагмента, находящийся дистальнее или проксимальнее к сайту расщепления (например, денатураций при нагревании, ферментативным расщеплением и т.д.). Анализ можно построить таким образом, либо,чтобы расщепленные молекулы (или их участки) не связывались с линкерами, либо, чтобы подобные расщепленные молекулы, даже если их участок связывается с линкером, не детектировались с помощью соответствующим образом сконструированного детектирующего зонда или детектирующего олигонуклеотида. В примере 29 и на фиг. 30 и 31 показано, что при постановке тестов по изобретению можно детектировать ошибочное спаривание одной пары оснований в экспрессированном SNP. В примере 32(фиг. 41) показан тест детектирования SNP, который применим, например, для детектирования SNP в геномной ДНК. Тесты NPA-MAPS можно использовать для количественного определения мишени в пробе. Если защитный фрагмент добавлен в достаточно большом молярном избытке по сравнению с мишенью для проведения реакции гибридизации до конца, то количество защитного фрагмента, остающееся после проведения стадии защиты от нуклеаз, будет отражать, то как много мишени находилось в пробе. Пример подобной количественной реакции приведен в примерах 12 и 13. В одном воплощении изобретения различные типы мишеней в пробе, например, различные комбинации ДНК, РНК, внутриклеточных белков и секретированных белков, можно анализировать с помощью одной совокупности зондов. См. фиг. 40 и 41 для примеров таких тестов.NPA-MAPS-тесты можно применять для осуществления любого из способов, описанных выше, в которых используются обычные MAPS-тесты. В предпочтительном воплощении полинуклеотидные защитные фрагменты определяют на массспектрофотомере в большей мере, чем на MAPS-планшетах. В наиболее предпочтительном воплощении ни один из полинуклеотидов не присоединяется (прикрепляется) к твердой поверхности во время стадии гибридизации или расщепления нуклеазами. После гибридизации гибридизованную мишень можно разрушить, например, с помощью нуклеаз или химической обработкой, оставив при этом защитный фрагмент в прямой пропорции к количеству фрагмента, которое подверглось гибридизации с мишенью. Альтернативно, пробу можно так обработать, чтобы оставить (одну цепочку) гибридизированный участок мишени или дуплекс, образованный гибридизированной мишенью и защитным фрагментом, для проведения последующего анализа. Пробы, которые подвергаются анализу, отделяют от остальной смеси для гибридизации и обработки нуклеазами (например, осаждением этанолом или адсорбцией, или аффинной хроматографией и т.д.), элюируют или солюбилизируют, и вводят в масс-спектрофотометр с высокой пропускной способностью через инжекторную петлю. В предпочтительном воплощении пробы, которые анализируют (например, защитные фрагменты), адсорбируют на поверхности и анализируют лазерной десорбцией с использованием хорошо известных в данной области методов. Для получения высокой чувствительности можно использовать Fourier Transform Mass Spectrometry (FTMS)(или аналогичный современный метод), позволяющий детектировать каждый защитный фрагмент на уровне фемтомолей или ниже. Защитные фрагменты, которые следует детектировать в одной (или более) проб, можно сконструировать с получением уникального сигнала для используемого масс-спектрометра. В одном воплощении каждый защитный фрагмент имеет уникальную молекулярную массу после гибридизации и обработки нуклеазами, и их молекулярная масса и характерный тип ионизации и фрагментации будут достаточными для определения их концентрации. Для повышения чувствительности или упрощения анализа сложных смесей защитные фрагменты можно модифицировать (например, дериватизировать) химическими группами, придающими четкие уникальные сигналы. Например, каждый защитный фрагмент можно дериватизировать различными природными или неестественными аминокислотами, связанными через амидную связь с олигонуклеотидной цепочкой по одному или нескольким положениям по гибридизованному участку цепочки. На масс-спектрометре соответствующей энергии происходит фрагментация амидных связей, при этом высвобождается характерное соотношение аминокислот. Данный подход, при котором химические группы среднего размера (грубо с молекулярной массой 80-200) используют в качестве масс-спектрофотометрических меток, желателен, поскольку молекулы данного размера, как правило, легче детектировать. В другом примере химическая модификация представляет органическую молекулу с определенным масс-спектрафотометрическим сигналом, таким как группа тетраалкиламмония,которой можно, например, дериватизировать другую молекулу, такую как, например, аминокислота. В другом примере сигналы положительных или отрицательных ионов усиливают реакцией с любым из ряда агентов. Например, для повышения детектирования положительных ионов можно провести реакцию между солью пирилия (такой, как 2-4-дитенил, 6-этилпирилия тетрафторборат или многие другие) с- 24011415 амином с образованием соли пиридиния; можно использовать любые другие усиливающие агенты для образования других положительно заряженных функциональных групп (см., например, Quirke et al.(1994), Analytical Chemistry 66, 1302-1315). Аналогичным образом можно провести реакцию с любым из общепризнанных в данной области агентов с получением соединений, усиливающих отрицательные ионы. Химическую модификацию можно детектировать, конечно, либо после отщепления от нуклеиновой кислоты, либо в составе нуклеиновой кислоты. Имея возможность идентифицировать каждый защитный фрагмент различимым образом, становится возможным анализировать (например, подвергнуть скринингу) большое число различных мишеней (например, 2, 6, 10, 16 или более различных мишеней) в одном анализе. Многие подобные тесты можно провести быстро и легко. Следовательно, такой тест или группу тестов можно проводить с высокой пропускной способностью, как здесь определено. Независимо от того, детектируются ли олигонуклеотиды непосредственно по их массе, или используются уникальные молекулярные метки, сигналы для каждой молекулы, которая детектируется, можно полностью охарактеризовать с чистыми препаратами в известной концентрации. Это позволит точно замерять сигнал (определять, количественно определять). Для любой молекулы, которая детектируется масс-спектрометрией, невозможно точно предугадать интенсивность и профиль. Тенденция молекулы к ионизации, чувствительность всех химических связей внутри молекулы к фрагментации, степень с которой каждый фрагмент множественно заряжается или однократно заряжается, все это слишком сложно для того, чтобы делать какие-то прогнозы. Однако для данного прибора с фиксированной энергией и характеристики обработки проб интенсивность и профиль сигнала очень становятся воспроизводимыми. Следовательно, для каждого зонда можно охарактеризовать сигнал с чистыми стандартами и точно количественно интерпретировать экспериментальные сигналы. В одном аспекте изобретение относится к способу детектирования одной или более нуклеиновых кислот, представляющих интерес, включающему обработку пробы, содержащей интересующую нуклеиновую кислоту(ы), защитой от нуклеаз с одним или более защитным фрагментом, и детектирование гибридизованных дуплекс-молекул, или защищенной нуклеиновой кислоты, или защитного фрагмента,масс-спектрометрией. Методы анализа нуклеиновых кислот масс-спектрометрией хорошо известны в данной области. Смотри, например, Alper et al. (1998), Science 279, 2044-2045 и Koster, патент США 5605798. В дополнении к разнообразным высокопроизводительным способам, описанным здесь, специалистам в данной области, очевидно, станут понятными многие другие. Преимущество использования тестов со множеством зондов заключается в возможности включить ряд контрольных зондов в каждую совокупность зондов, которые подвергаются воздействию тех же условий реакции, что и действительно опытные зонды. Например, каждая область в совокупности может включать положительный и/или отрицательный контроли. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, положительный контрольный зонд означает контрольный зонд, который, как это известно, например, в основном взаимодействует с мишенью, или взаимодействует с ней количественно или качественно известным образом, тем самым функционируя в качестве (внутреннего) стандарта для взаимодействия зонд/мишень. Подобный зонд, например, может быть контролем эффективности гибридизации. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, отрицательный контрольный зонд означает контрольный зонд, который, как известно, в основном не взаимодействует с мишенью. Подобный зонд, например, может быть контролем специфичности гибридизации. В качестве примера типов контролей, которые можно использовать, рассмотрим тест, в котором совокупность олигонуклеотидных зондов используют для скрининга агентов, которые модулируют экспрессию группы коррелятивных генов для заболевания. Для внутреннего контроля нормализации переменных показателей таких, как число лизированных клеток в каждой пробе, извлечение мРНК или эффективность гибридизации, совокупность зондов может включать зонды, специфические к одному или более фоновому уровню или конститутивных вспомогательных генов, таких как структурные гены (например, актина, тубулина или других) или связывающихся с ДНК белков (например, факторы, регулирующие транскрипцию или другие), для которых не предполагается модуляция их экспрессии под действием тестируемых агентов. Кроме того, для определения того, вызывают ли тестируемые агенты нежелательные побочные эффекты, такие как гибель клеток или токсичность, совокупность зондов может включать зонды, специфичные к генам, которые, как известно, индуцируются, как составная часть апоптоза (запрограммированной гибели клеток),или которые индуцируются в условиях повреждения клеток (например, белки теплового шока) или токсического воздействия на клетки (например, гены р 450). В совокупность можно включить другие контрольные зонды для тонкой настройки чувствительности анализа. Например, рассмотрим тест для выявления агентов, которые модулируют продукцию мРНК, связанной с конкретным болезненным состоянием. Если в предшествующих анализах указывалось, что одна из коррелятивных мРНК (скажем, мРНК-А) в данной группе продуцируется в таких больших количествах по сравнению с другими, что ее сигнал заглушает таковые, исходящие от других мРНК, то линкеры можно подвести для тонкой настройки теста так, чтобы уравнять интенсивность сигналов. Блокированные линкеры, которые включают якорь-специфическую олигонуклеотидную последовательность, предназначенную для мРНК-А-мишени, но в которых отсутствует зонд- 25011415 специфическая последовательность, можно добавить для разбавления пула мишень-специфических линкеров и таким образом снизить чувствительность теста для данной мРНК. Специалисты в данной области могут определить подходящие соотношения блокированных и неблокированных линкеров простыми,общепринятыми в данной области методами. Тонкую настройку теста для конкретной мишени разбавлением активного элемента неактивным элементом можно также осуществить на других стадиях анализа. Например, ее можно провести на уровне детектирования разбавлением меченого, мишень-специфического репортера неактивным мишеньспецифическим репортером, например, таковым с такой же мишень-специфической группой (например,олигонуклеотидной последовательностью), но без сигнальной группы, или с инактивированной или неактивной формой сигнальной группы. В том смысле, в котором этот термин здесь используется сигнальная группа относится к метке, молекуле или другому соединению, которое испускает детектируемый сигнал, или способно генерировать такой сигнал, например флуоресцирующая молекула, люминесцирующий фермент или любая из самых различных сигнальных групп, раскрытых здесь). В особенно предпочтительном воплощении тонкую настройку можно провести на стадии контактирования содержащего мишень комплекса с детектирующим линкером (детектирующие линкеры описаны ниже, например, в разделе, касающемся сложных способов детектирования типа сэндвича, пример 23 и фиг. 24). Можно сконструировать группу детектирующих линкеров, например, для тонкой настройки чувствительности для анализа каждой отдельной мишени. Например, если известно, что определенная мишень находится в пробе в очень высокой концентрации, то детектирующий линкер для такой мишени можно разбавить эмпирически подобранным количеством блокированного детектирующего линкера, включающего мишень-специфическую группу (например, олигонуклеотидную последовательность), но в котором отсутствует группа, специфическая к репортеру, или включающего мишень-специфическую группу и репортер-специфическую группу, которая предварительно была связана с неактивным репортером. То есть, вместо включения группы, специфической к репортеру, эта группа может отсутствовать, или предупреждают (например, блокируют) ее взаимодействие (например, гибридизацию) с репортером. В некоторых случаях подобная тонкая настройка относится к ослаблению сигналов. На фиг. 28 представлен опыт, в котором проводят подобное ослабление сигналов. Пробы, которые подвергаются тестированию в анализах по изобретению, могут включать любую из мишеней, описанных выше, или другие. Жидкие пробы, подвергающиеся анализу, могут находиться в любом объеме, подходящем для размера тест-области, в пределах примерно от 100 нл до примерно 100 мкл. В предпочтительном воплощении жидкие капли объемом примерно 1 мкл вносят в каждую лунку 1536-луночного титрационного микропланшета. Пробы можно привести в контакт с совокупностью зондов самыми различными способами, подходящими для анализа с высокой пропускной способностью,например, с помощью пипеток, дозаторов или применением репликаторов. Пробы инкубируют в условиях (например, концентрация соли, значения рН, температура, продолжительность инкубации и т.д. - см. выше), эффективных для достижения связывания или другого стабильного взаимодействия зонда и мишени. Данные условия являются легко определяемыми. После инкубации пробы необязательно обрабатывают (например, промывают) для удаления несвязавшейся мишени с использованием условий, которые подбираются эмпирически так, чтобы оставить интактными специфические взаимодействия, но при этом удалить неспецифически связавшиеся вещества. Например, пробы можно промыть примерно от одного до десяти раз и более в одних и тех же или более жестких условиях по сравнению с теми, которые использовались для достижения связывания зонда/мишени. Пробы, содержащие РНК-мишень, например мРНК, рРНК, тРНК, вирусную РНК или общую фракцию РНК, можно приготовить любым различным методом. Например, культуры клеток in vitro, из которых следует экстрагировать мРНК, можно внести в области поверхности, такие как отдельные лунки титрационного микропланшета. Необязательно данные клетки после достижения желаемой клеточной плотности можно обработать интересующим агентом, таким как стимулятор или потенциальное терапевтическое средство, которое можно добавить к клеткам любым из различных способов, например, с помощью репликатора (такого, как 96- или 386-игольчатые репликаторы от Beckman), с помощью пипеток или дозаторов, и инкубировать с клетками в течение соответствующего периода времени, например,примерно от 15 мин до примерно 48 ч, в зависимости от анализа. Экстракты цельной фракции РНК,мРНК и т.д. из тканей или клеток из источника in vitro или in vivo можно получить с использованием обычных, общепринятых в данной области методов (например, с помощью промышленно доступных наборов). В одном воплощении клетки лизируют (или делают проницаемыми) в присутствии или отсутствии защитного от нуклеаз фрагмента(ов) и неочищенный лизат используют непосредственно (например, в лунке титрационного микропланшета) без дополнительной очистки, например, от других клеточных компонентов. Если клетки лизируют в отсутствии защитных от нуклеаз фрагментов, то затем такие защитные фрагменты можно необязательно добавить к лизату. В предпочтительном воплощении, например, когда детектируют защитные от нуклеаз фрагменты,пробы готовят контактированием интересующих клеток (например, клеток на поверхности лунки титрационного микропланшета; клеток в ткани или в пробе из организма, или тому подобное) с водной средой(раствор для лизиса), которая содержит поверхностно-активное вещество или детергент (например, SDS,в концентрации примерно от 0,01 до примерно 0,5% мас./об.) и агент (например, формамид (например, в концентрации примерно от 8 до примерно 60%, об./об.), гуанидин HCl (например, в концентрации примерно от 0,1 до примерно 6M), гуанидин изотиоцианат (например, в концентрации примерно от 0,05 до примерно 8M) или мочевину (например, в концентрации примерно от 40 до примерно 46%, мас./об. или примерно 7 М), которая одна или в сочетании с одним или более другими агентами, может функционировать в качестве хаотропического агента. Водную среду можно забуферить любым стандартным буфером. В предпочтительном воплощении буфером является примерно 0,5-6 Х SSC, более предпочтительно примерно 3 Х SSC. Необязательно водная среда также может содержать тРНК в соответствующей концентрации, примерно 0,1-2,0 мг/мл, предпочтительно примерно 0,5 мг/мл. В водную среду можно также добавить защитные от нуклеаз фрагменты перед его добавлением к клеткам. Оптимальную концентрацию каждого защитного фрагмента можно определить эмпирически с использованием общепринятых методов. В предпочтительном воплощении концентрации каждого защитного фрагмента составляет примерно от 3 до примерно 300 пкМ, более предпочтительно примерно 30 пкМ. Клетки инкубируют в водном растворе, пока клетки не становятся проницаемыми и/или лизируются, и ДНК и/или мРНК высвобождаются из клеток в водную среду. Клетки инкубируют в водной среде в течение эмпирически подобранного периода времени (например, примерно от 1 до примерно 60 мин),при эмпирически подобранной оптимальной температуре (например, примерно от 37 до примерно 115 С,предпочтительно примерно от 90 до примерно 115 С). Например, в одном воплощении, когда как ДНК, так и РНК высвобождаются из клеток в денатурированной форме, способной связываться с защитным фрагментом, то клетки инкубируют в течение примерно от 1 до примерно 60 мин, предпочтительно примерно от 5 до примерно 20 мин в водной среде при температуре примерно от 90 до примерно 115 С, предпочтительно примерно при 105 С. Если желательно, например, когда требуется проанализировать ДНК в отсутствии РНК, то в инкубационную смесь можно включить различные общеприменяемые рибонуклеазы. Специалист в данной области может легко выбрать соответствующую рибонуклеазу и оптимальные условия расщепления. В другом воплощении мРНК можно получить при инкубации клеток в течение примерно от 5 до примерно 20 мин, предпочтительно примерно 10 мин, в водной среде при температуре примерно от 90 до примерно 100 С, предпочтительно примерно 95 С, необязательно в присутствии одного или более защитных фрагментов. В данном случае мРНК в основном высвобождается из клеток в денатурированной форме, способной связываться с защитным фрагментом, и ДНК остается в основном внутри или прикрепленной к клеткам, или недоступной для зонда за счет ее двухцепочечной природы, или она высвобождается из клеток, но в форме, неспособной связываться с защитным фрагментом (например, неденатурирована). Не стремясь связываться с каким-либо определенным механизмом, оказалось, что поскольку нуклеиновая кислота высвобождается из лизированных/сделанных проницаемыми клеток, достаточно ее денатурировать для связывания с защитным фрагментом с образованием стабильного дуплекса, который устойчив к разрушительному действию эндогенных или экзогенных реагентов или ферментов, а белки внутри клеток (например, нуклеазы) денатурируются и/или инактивируются. После получения интересующей нуклеиновой кислоты вышеуказанным способом пробу можно разбавить до соответствующего объема так, чтобы водная среда не ингибировала функции экзогенных внесенных белков, таких как, например, нуклеазы (например, S1-нуклеаза), полимеразы (например, полимеразы, необходимые для постановки ПЦР) или связывающие белки (например, стрептавидин). Количества для разбавления, и идентичность и количества компонентов для использования в водном растворе, описанном выше, можно определить эмпирически с использованием обычных методов. Для любого из способов по настоящему изобретению в мишени можно ввести метку (пометить) с помощью любого из самых разнообразных методов, которые хорошо известны в данной области и/или которые здесь описаны (например, в отношении детектирования защитных от нуклеаз фрагментов). Например, к молекулам-мишеням можно непосредственно или опосредованно присоединить химические группы, которые обеспечивают сигнал для детектирования, такие как хемилюминесцентные молекулы или ферменты, которые катализируют продуцирование хемилюминесцентных молекул, или флуоресцентные молекулы, такие как флуоресцеин или су 5, молекула со время-разрешающей флуоресценцией,такая как один из металлов-хелатообразователей ряда лантанидов, или радиоактивное соединение. Альтернативно, мишени можно пометить после их взаимодействия с зондом с помощью одного или более меченых мишень-специфических репортеров (например, антител, олигонуклеотидов, как представлено на фиг. 1, или любым из общих типов молекул, уже обсужденных выше в отношении зондов и мишеней). Одним типом флуоресцирующей молекулы может быть непревращаемый фосфор, т.е. флуоресцентная метка, которая поглощает и возбуждается при дальних длинах волн (например, ИК), затем испускает при более коротких длинах волн (например, видимый свет). Поскольку непревращаемые фосфоры испускают при более коротких длинах волн, чем это делает большинство потенциально мешающих веществ, обычно находящихся в типичной пробе, которая подвергается анализу, применение непревращаемых фосфоров делает возможным уменьшить помехи, вызываемые веществом в пробе, по сравнению с фосфорами, которые поглощают при более коротких длинах волн. Узкий спектр эмиссии большинства- 27011415 непревращаемых фосфоров также позволяет проводить одновременное детектирование большого количества различных непревращаемых фосфоров. Непревращаемые фосфоры являются хорошо известными,и их использование является общепринятым в данной области, и включают, например, ионы редкоземельных металлов, таких как иттербий (Yb), эрбий (Er), тулий (Tm) и празеодим (Pr), особенно в виде оксисульфида. Описано 80 или более независимо детектируемых непревращающихся фосфоров. (Смотри, например, Biological Agent Detection and Identification, April 27-30, 1999, DARPA, Biological WarfareDefense, Defense Sciences Office.) Фосфоры можно необязательно присоединить к любой поверхности,например к микросфере или грануле из латекса. Как и другие флуоресцентные метки, непревращаемые фосфоры можно детектировать по переходу энергии (или модуляцией) к метке в достаточно близком линкере, мишени или репортере. Кроме того, как и другие сигнальные группы, раскрытые здесь, непревращаемые фосфоры можно использовать для количественного определения мишени, и можно использовать в любом из самых разнообразных способов, описанных здесь, например, для детектирования защитных от нуклеаз фрагментов. Конечно, непревращаемые фосфоры можно также использовать для детектирования мишеней, которые распределены любым другим образом на поверхности, например, мишеней (включая защитные от нуклеаз фрагменты), которые непосредственно присоединены к поверхности, связаны непосредственно с совокупностью различных олигонуклеотидов на поверхности, или связаны через бифункциональные линкеры с якорями (различными или в основном одинаковыми), которые распределены на поверхности в основном равномерно или в любой желательной организации или порядке. Можно использовать любую поверхность, например проточную систему или твердую поверхность, например, такую как гранулы. Гранулы, используемые в любом из тестов по изобретению, могут быть любого типа, например, из любого материала, магнитные и/или немагнитные; и гранулы, используемые в одном тесте, могут быть в основном одинаковыми или различными по размеру и/или форме. Можно использовать различные более сложные способы детектирования типа сэндвича. Например, мишень можно гибридизировать с бифункциональной молекулой, содержащей первую группу, специфическую к мишени, и вторую группу, которую может распознать обычный (т.е. одинаковый) репортер, например, меченый полинуклеотид, антитело или тому подобное. Бифункциональные молекулы можно сконструировать таким образом, чтобы в каждом анализе можно было использовать любое желаемое число обычных репортеров. Для любого из способов по изобретению можно использовать разнообразные сложные методы детектирования типа сэндвича для введения метки в мишени. Например, мишень может взаимодействовать, например, гибридизоваться с бифункциональной (или мультифункциональной) молекулой (детектирующим линкером), содержащей первую группу, специфичную к мишени, и вторую группу, которая специфична для репортера. Термин специфический имеет значения, уже определенные для взаимодействия, например зондов и мишеней. Термин репортер, в том смысле, в котором он здесь используется, относится к меченому полинуклеотиду, антителу или любому из обоих типов молекул, уже обсужденных здесь в связи с зондами и мишенями. Данные две группы детектирующих линкеров могут распознавать (взаимодействовать или связываться с) их соответствующие партнеры для связывания любым способом, обсужденным выше в связи, например, с зондами и мишенями. Детектирующий линкер также может включать другие последовательности, например последовательности, специфичные к мишени, но отличающиеся (не перекрывающиеся) от мишень-специфической группы соответствующего комплекса якорь-связанный линкер. Любая последовательность в детектирующем линкере может служить в качестве последовательности узнавания для детектирующего зонда или репортера. В предпочтительном воплощении детектирующий линкер является полинуклеотидом. Детектирующие линкеры можно сконструировать таким образом, чтобы в анализе можно было использовать любое желаемое число общих репортеров. Например, группу детектирующих линкеров можно сконструировать таким образом, что каждый детектирующий линкер будет специфичным к разным мишеням, но будет включать сайт связывания для одного и того же (общего), или одного из ограниченного числа репортеров. Возможность использовать ограниченное число (например, один) репортеров для мечения различных мишеней в одном анализе обеспечивает преимущество низкой стоимости и более низкого фона. Конечно, комбинации детектирующий линкер/репортер можно использовать для детектирования мишеней, которые распределены любым образом на поверхности, например, как описано выше для типов расположения мишеней, которые можно детектировать непревращающимися фосфорами. В наиболее предпочтительном воплощении детектирующие линкеры можно сконструировать для детектирования защитных от нуклеаз фрагментов таким образом, чтобы защитные фрагменты, отщепленные под действием нуклеазы от контрольных выступающих последовательностей во время проведения способа защиты от нуклеаз (как, например, описано в примере 15), преимущественно метились. Данный тип детектирования схематично представлен на фиг. 24. В данном воплощении детектирующий линкер включает первую группу, специфичную к мишени и вторую группу, специфичную к общей контрольной выступающей последовательности, которая в предпочтительном воплощении находится в основном во всех защитных от нуклеаз фрагментах в начале анализа. Если желательно, контрольную выступающую последовательность можно отщепить от защитного от нуклеаз фрагмента во время реакции- 28011415 защиты от нуклеаз, мишень-специфическая группа детектирующего линкера будет гибридизироваться с отщепленным защитным фрагментом, но контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера будет оставаться несвязанной и доступной для последующей гибридизации. С другой стороны, если контрольная выступающая последовательность-специфическую последовательность не отщепить от защитного фрагмента, например, в результате неполного расщепления нуклеазами во время реакции защиты от нуклеаз, то обе мишень-специфическая и контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера будет гибридизоваться с защитным фрагментом, и они будут недоступными для последующей гибридизации. В предпочтительном воплощении комплексы, включающие защитные от нуклеаз фрагменты и связанные детектирующие линкеры, затем на последующей стадии гибридизуются с репортером, который включает сигнальную группу (например, флуорохром, гаптен, фермент или любую другую молекулу, несущую детектируемый сигнал или генерирующую сигнал группу, как здесь уже было описано) и группу (например, олигонуклеотид), которая специфична к контрольная выступающая последовательность-специфической группе детектирующего линкера. Репортер предпочтительно будет связываться и метить такие комплексы, в которых контрольная выступающая последовательность защитного от нуклеаз фрагмента отщеплена (т.е. комплекс, в котором контрольная выступающая последовательность-специфическая группа детектирующего линкера доступна для последующей гибридизации с репортером). Специалистам в данной области, очевидно, понятны многочисленные другие вариации способов сэндвич-детектирования. Способы, с помощью которых мишени можно инкубировать с мишень-специфическим репортером(ами), или можно инкубировать комплексы мишень/детектирующий линкер с репортерами в условиях, эффективных для достижения связывания или другого стабильного взаимодействия, являются легко определяемыми (смотри выше). Например, флуоресцентные олигонуклеотидные репортеры (в концентрации примерно от 10 нМ до примерно 1 мкМ или выше, предпочтительно примерно 30 нМ, в буфере,таком как 6 Х SSPE-T или другие) можно инкубировать со связанными мишенями в течение примерно от 15 мин до 2 ч или дольше (предпочтительно примерно от 30 до 60 мин) при температуре в пределах примерно от 15 до примерно 45 С (предпочтительно около комнатной температуры). После инкубации пробы необязательно можно обработать (например, промыть) для удаления несвязавшихся мишеньспецифических репортеров с использованием условий, которые легко определяются эмпирически, оставляя интактными специфические взаимодействия, но при этом удаляя неспецифически связанные вещества. Например, пробы можно промыть от одного до десяти раз или более в тех же или несколько более жестких условиях, чем таковые, которые использовались для достижения связывания мишень/репортер. Мечение мишень-специфическим репортером(ами) может обеспечить дополнительную специфичность для начальной реакции гибридизации, например, в случае, когда мишень-специфический олигонуклеотидный репортер связывается с другим участком последовательности нуклеиновой кислотымишени, чем олигонуклеотидный зонд, или когда зонд и репортерные антитела распознают различные эпитопы антигена-мишени. Кроме того, мечение мишень-специфическими репортерами позволит настраивать чувствительность реакции. Например, если мРНК-мишень, которая является частью коррелятивного типа экспрессии, экспрессируется в очень низкой концентрации, то уровень сигнала можно увеличить (амплификация сигнала) гибридизацией связанной мишени с несколькими (например, примерно двумя или примерно пятью или более) мишень-специфическими олигонуклеотидными репортерами, каждый из которых специфически гибридизуется с различным участком мРНК-мишени. Возможность независимо детектировать два типа меток позволяет иметь дополнительный контроль в MAPS-тестах. Некоторые (например, примерно от 10 до примерно 100%) линкеры, сконструированные для конкретного локуса якорей (на фиг. 7 показано 3 типичных локуса якорей, каждый включающий множество в основном одинаковые якорей (А, В и С, могут иметь метку (например, флуоресцирующую метку), связанную с одним концом. Например, родамин или Су 5-флуор можно связать с 5'-концом линкера. Подобные модифицированные линкеры называются контрольными линкерами. После связывания смеси линкеров и контрольных линкеров с якорями и инкубации пробы, содержащей мишень, с полученной совокупностью зондов, мишень-специфический репортер, несущий другую флуоресцентную метку (например, флуоресцеин или другую детектирующую метку такую, как хемилюминесцентная) можно использовать (или мишень можно непосредственно пометить флуоресцентной меткой или другой детектирующей меткой), и определить соотношение двух сигналов. Присутствие контрольных линкеров позволяет провести калибровку числа функциональных якорей (например, способных к взаимодействию с линкерами) внутри и между тест-областями (т.е. тестируется способность каждого локуса совокупности связываться с мишенью для нормализации сигналов), служит в качестве основы для количественного определения связанной мишени, помогает при расположении локусов якорей и/или обеспечивает положительный контроль, например, в случаях, когда сигнал отсутствует в результате отсутствия мишени в пробе. В одном воплощении изобретения можно также использовать две различные метки (например,флуорофоры) для детектирования двух различных популяций молекул-мишеней; однако возможность распознавания присутствия мишеней пространственным разрешением сигналов позволяет использовать сигнальный тип метки для различных мишеневых молекул.- 29011415 Возможность независимо детектировать метки (например, с помощью флуоресцентных меток, излучение от которых происходит при различных длинах волн, таких как, например, флуоресцеин и родамин, или различные непревращаемые фосфоры), придает способам по изобретению дополнительную гибкость. Например, каждую из двух или более мишеней можно пометить, непосредственно или опосредованно, с помощью его собственной, уникально детектируемой метки. Это позволяет детектировать метки на основе свойств, специфических для меток (например, цвет эмиссии) в дополнении (или вместо),например, к идентификации положения локализованной на поверхности мишени или идентификации мишени посредством размера гранулы, на которой она находится. В другом воплощении изобретения множество мишеней можно детектировать независимо в одном локусе внутри области. Например, две или более мишеней (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) можно детектировать в локусе, который определяется одной группой (в основном одинаковых) якорей. То есть, можно использовать группу линкеров,каждый из которых имеет якорь-специфический участок, специфичный к одному и тому же якорю плюс мишень-специфический участок, специфичный к другой мишени. Если используется, например, группа из четырех подобных линкеров, то все четыре могут связываться с членами группы якорей в одном локусе, что позволяет четырем различным мишеням связываться в данном локусе. Если каждая из данных мишеней помечена (непосредственно или опосредованно) с помощью разных, различимых меток, то исследователь может независимо установить присутствие каждой из четырех мишеней в локусе. Следовательно, совокупность, например, пяти якорей (групп якорей) в области можно использовать в сценарии,описанном выше, для детектирования, например, двадцати различных мишеней. Подобный анализ представлен в примере 24 и на фиг. 25. Аналогичным образом множество мишеней, например, 80 или более,можно независимо детектировать, когда распределяется один тип якорей, но не в одном локусе, а равномерно, или в любом желаемом порядке, на твердой поверхности, например, такой как гранула или проточное устройство, и можно использовать другие аспекты такие, как размер или распределение гранул для обеспечения информации об идентичности мишеней или групп мишеней. Связывание многих линкеров (например, в пределах от 2 до примерно 50 или более), обладающих различной специфичностью по отношению к мишени, с якорями в данном локусе (либо группа в основном одинаковых якорей, смешанный локус), в некоторых случаях, относящаяся к смешанным линкерам, составляет основу для других воплощений изобретения, которые будут, очевидно, понятны специалистам в данной области. Например, в данном локусе якоря можно связать со смесью линкеров, которые специфичны ко множеству различных защитных фрагментов, каждый из которых соответствует (или специфичен к) различному участку нуклеиновой кислоты (например, мРНК), представляющей интерес. Присутствие подобного множества различных линкеров в локусе позволяет значительно повысить чувствительность детектирования интересующей мишени (например, мРНК), например, находящейся в пробе в небольшом количестве. Каждый локус можно сконструировать так, что число линкеров, соответствующих различным участкам мРНК, соответствующей данному локусу, обратно пропорционально (эмпирически определенным образом) содержанию данной мРНК в пробе. Например, если в предварительном опыте обнаружено, что одна представляющая интерес мРНК находится в пробе в большом избытке по сравнению со второй представляющей интерес мРНК, то относительное число линкеров, соответствующих различным участкам двух мРНК, можно подвести таким образом, что относительная интенсивность сигналов, соответствующих каждой мРНК, в основном будет одинаковой. То есть, интенсивность сигналов можно подвести таким образом, что сигнал, соответствующий первой мРНК не будет перекрывать сигнал, соответствующий второй мРНК. Таким образом, анализ подводится так, что можно проводить одновременное детектирование множества мРНК, которые находятся в пробе в резко отличающихся количествах, уравновешивая интенсивность сигналов, соответствующих каждой мРНК. Как уже отмечалось выше, в другом воплощении изобретения данный локус может включать линкеры, которые специфичны ко множеству неродственных или различных мишеней, или защитных фрагментов, что позволяет детектировать значительно большее число мишеней или защитных фрагментов с использованием одной совокупности якорей. Например, если каждый локус совокупности из 350 якорей включает линкеры, специфические к 10 различным мишеням, то тогда совокупность можно использовать для детектирования 3500 мишеней. На практике подобное расположение позволит превратить совокупность, с помощью которой можно определять низкую плотность мишеней в таковую, которая позволяет определять высокую плотность мишеней. Множество молекул (например, защитных фрагментов), связанных в одном локусе, можно детектировать последовательно или одновременно, например, с использованием способов детектирования, описанных в настоящей заявке. (См., например, обсуждение, касающееся детектирующих линкеров и репортеров, в разделе выше по сложным способам детектирования сэндвич-типа.) В одном воплощении первую мишень (например, защитный фрагмент) в данном локусе детектируют, например, с помощью первой системы детектирования (например, детектирующим линкером/репортером или детектирующим зондом, специфическим к ней); затем первый детектирующий линкер/репортер или зонд удаляют или инактивируют с использованием обычных способов (например, изменением рН для инактивации репортера, включающего фермент, генерирующий хемилюминесцентный сигнал), и используют второй детектирующий линкер/репортер или детектирующий зонд, специфический ко второй мишени в том же локу- 30