Штамм трансгенных растительных клеток и трансгенное растение, содержащие кассету экспрессии полипептида-мишени usp рецептора, способы получения их потомства, способы регулирования экспрессии полипептида-мишени в указанном растении с помощью ювенильного гормона или его агонистов, способы выявления и получения лиганда для полипептида usp рецептора и соответствующий лиганд

1 Настоящее изобретение относится к химическому регулированию экспрессии гена в растениях. В частности оно относится к способу, в котором ювенильный гормон или один из его агонистов применяют в качестве химического лиганда для регулирования опосредуемой рецептором экспрессии полипептида-мишени в растительной клетке, а также к трансгенным растительным клеткам, растительному материалу или растениям и их потомству, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии. В некоторых случаях необходимо регулировать время или уровень проявления фенотипического признака в растениях, растительных клетках или ткани растения. В идеальном случае было бы желательно регулировать проявление такого признака, вызывая его химическим соединением, которое можно легко наносить на сельскохозяйственные культуры, декоративные кустарники и т.д. Одной из таких систем регулирования экспрессии гена, которая может применяться для осуществления этого идеального варианта и в отношении которой до сих пор неизвестно, присутствует ли она в естественных условиях в растениях, является суперсемейство ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов. Суперсемейство ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов обнаружено у млекопитающих и насекомых, и оно состоит из более чем 100 известных протеинов. Некоторые из рецепторов этого суперсемейства, которые обнаружены у млекопитающих, представляют собой рецептор ретиноевой кислоты(RAR), рецептор витамина D (VDR), рецептор тироидного гормона (Т 3R) и ретиноевый Хрецептор (RXR). Эти и другие рецепторы суперсемейства связываются с 5'-регуляторной областью гена-мишени и в результате связывания химического лиганда с рецептором трансактивируют экспрессию гена-мишени. Кроме описанных выше рецепторов, обнаруженных у млекопитающих, рецепторы аналогичной структуры и активности были выявлены у насекомых рода Drosophila (Koelle и др Cell 67: 59 (1991); Christianson и Kafatos, Biochem.Biophys. Res. Comm. 193: 1318 (1993); Henrich и др., Nucleic Acids Res. 18: 4143 (1990. Рецептор экдизона (EcR) связывает стероидный гормон насекомых 20-гидроксиэкдизон и при гетеродимеризации с продуктом гена Ultraspiracle(USP) трансактивирует экспрессию гена. Помимо 20-гидроксиэкдизона другие химические лиганды, такие как агонисты гормонов, также связываются с EcR в аналогичных условиях и вызывают трансактивацию гена-мишени. Было также установлено, что USP является представителем суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов, хотя он рассматривается как "сиротский" рецептор,поскольку к настоящему времени не выявлен его лиганд (Seagraves, Cell 67: 225-228 (1991.RXR обладает способностью образовывать гетеродимеры с EcR (Thomas и др., Nature, 362: 471-475 (1993. Было установлено, что метопрен и его производное - метопреновая кислота,которые являются агонистами ювенильного гормона, в результате транскрипции приобретают способность активировать рекомбинантный репортерный ген как в клетках насекомых,так и млекопитающих, действуя через RXR(Наrmоn и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 61576160 (1995. Однако ювенильный гормон не индуцирует трансактивацию, опосредуемуюRXR (Наrm и др.). В настоящее время отсутствует четкое доказательство существования ядерного рецептора ювенильного гормонаMolec. Biol. 25: 881-897 (1995, хотя и высказано предположение, что сиротский рецептор USP может являться таковым (Наrmоn и др.; см. также у Seagraves; Oro и др Current Opinion in Genetics and Development 2: 269-274 (1992. Ювенильный гормон и его агонисты открывают ранее неизвестные возможности химического регулирования экспрессии генов в растениях, поскольку для этих химических соединений уже известно применение в сельском хозяйстве. Однако в настоящее время отсутствуют способы, посредством которых эти химические соединения могут применяться для индукции трансактивации гена-мишени в трансгенном растении. Согласно настоящему изобретению было установлено, что ювенильный гормон и его агонисты являются лигандами для "сиротского" рецептора USP. Открытие этого факта позволяет использовать стратегии регулирования генов для растений, основанные на применении ядерного рецептора, который не встречается в растениях в естественных условиях. Это означает, что единственным эффектом применения ювенильного гормона или одного из его агонистов будет индукция экспрессии сконструированного генетическим путем генамишени. Согласно настоящему изобретению были разработаны полипептиды рецептора USP и кодирующие их экспрессируемые в растении гены, функция которых в растительных клетках состоит в регулировании экспрессии полипептида-мишени, причем полипептид рецептораUSP активирует 5'-регуляторную область кассеты экспрессии мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Такой способ регулирования экспрессии генов в растениях может использоваться для регулирования различных агрономически важных признаков, таких как фертильность растения. Настоящее изобретение относится к способу регулирования экспрессии генов в растениях. В частности этот способ включает трансформацию растения с помощью кассеты экспрессии рецептора USP, которая кодирует по 3 липептид рецептора USP, по крайней мере, с помощью одной кассеты экспрессии мишени,которая кодирует полипептид-мишень, и необязательно с помощью вспомогательной кассеты экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептида рецептора USP. При контакте трансформированного растения с ювенильным гормоном или с одним из его агонистов происходит активация или ингибирование экспрессии полипептида-мишени в присутствии полипептида рецептора USP. Необязательно могут применяться дополнительные "вспомогательные" кассеты экспрессии рецептора, причем такая вспомогательная кассета экспрессии рецептора кодирует полипептид рецептора, отличный отUSP. Способ пригоден для регулирования различных агрономически важных признаков, таких как фертильность растения. Кроме того, изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим кассету экспрессии рецептора USP и кассету экспрессии мишени, способную к активации ювенильным гормоном или одним из его агонистов. Изобретение также включает способ выявления ранее неизвестных лигандов для USP, которые обладают эффективностью в окружающей среде,представляющей собой растительные клетки. Тестируемые химические соединения оценивают путем их контактирования с растительными клетками, трансформированными с помощью кассеты экспрессии рецептора USP и кассеты экспрессии мишени. Кассета экспрессии мишени кодирует репортерный полипептид, экспрессия которого может быть оценена количественно или качественно, в результате чего определяют, является ли тестируемое соединение лигандом для USP. На фиг. 1 представлено схематическое изображение растительной клетки, содержащей кассету экспрессии рецептора VP16-USP и кассету экспрессии мишени, имеющую в 5'регуляторной области прямой повтор реагирующего элемента (response element). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов рецептор VP16-USP активирует экспрессию полипептида-мишени. На фиг. 2 представлено схематическое изображение растительной клетки, содержащей кассету экспрессии как рецептора USP-VP16,так и GAL4-EcR. При воздействии ювенильного гормона или одного из его агонистов происходит реверсия активации экспрессии полипептида-мишени, вызванная комбинацией рецепторных полипептидов GAL4-EcR и USP-VP16. Фиг. 3 соответствует фиг. 2 за исключением того, что присутствует химический лиганд тебуфенозид (также известный как RH 5992). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов в этих условиях также происходит реверсия активации экспрессии. 4 Понятие "ювенильный гормон" относится к классу химических соединений, которые продуцируются насекомыми. Ювенильный гормон контролирует метаморфоз личинок, приводя к сохранению у насекомого ювенильных характеристик и в результате этого к предотвращению созревания. Биологическое действие ювенильного гормона проявляется в поведенческих,биохимических или молекулярных реакциях. Было выделено и охарактеризовано несколько встречающихся в естественных условиях ювенильных гормонов. Понятие "агонисты ювенильного гормона" относится к классу соединений, которые обладают одной или несколькими биологическими активностями ювенильного гормона. Агонисты ювенильного гормона могут быть структурными аналогами ювенильного гормона, но могут и не являться таковыми. Под это понятие также подпадают такие соединения,которые могут быть метаболическими предшественниками соединения, которое непосредственно вызывает вышеуказанные биологические эффекты, подобные таковым, характерным для ювенильного гормона. Например, метопрен является метаболическим предшественником метопреновой кислоты, которая в свою очередь непосредственно вызывает биологические эффекты, подобные таковым, характерным для ювенильного гормона, которые наблюдаются при применении метопрена. Понятие "полипептид рецептора" в контексте настоящего описания относится к полипептидам, которые могут либо активировать,либо ингибировать экспрессию полипептидамишени в ответ на применяемый химический лиганд. Полипептид рецептора включает лигандсвязывающий домен, ДНК-связывающий домен и трансактивирующий домен. Лигандсвязывающий домен включает последовательность аминокислот, которая нековалентно связывает комплементарный химический лиганд. Таким образом, лигандсвязывающий домен и его химический лиганд образуют комплементарно связанную пару. ДНК-связывающий домен включает последовательность аминокислот,которая нековалентно связывает специфическую нуклеотидную последовательность, известную как реагирующий элемент (RE). Один или несколько реагирующих элементов локализованы в 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени. Каждый RE включает пару полусайтов, каждый из которых имеет состоящее из 5-6 пар оснований ядро, в котором отдельный ДНК-связывающий домен распознает отдельный полусайт. Полусайты могут быть расположены в близкой к линейной ориентации по отношению друг к другу в виде прямых повторов, палиндромных повторов или инвертированных повторов. Нуклеотидная последовательность, пространственное размещение и линейная ориентация полусайтов определяют, какой ДНК-связывающий домен или домены бу 5 дут образовывать комплементарно связанную пару с реагирующим элементом. Трансактивирующий домен включает одну или несколько последовательностей аминокислот, действующих в качестве субдоменов, которые влияют на функцию факторов транскрипции во время периода, предшествующего инициации, и объединены в ТАТА-боксе (боксе Хогнесса). Роль трансактивирующего домена заключается в том,что он позволяет осуществлять повторные случаи инициации транскрипции, приводя к увеличению уровней экспрессии гена."Кассета экспрессии рецептора" включает нуклеотидную последовательность для 5'регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептора, и нетранслируемую 3'-терминирующую область(стоп-кодон и полиаденилирующую последовательность). 5'-Регуляторная область способна обеспечивать экспрессию в растениях. Понятие "USP" относится к рецептору Ultraspiracle, обнаруженному в Drosophila. Он также известен как "XR2C", и этот рецептор был выделен и клонирован, а его лигандсвязывающий домен был идентифицирован на основе гомологии последовательности с известными лигандсвязывающими доменами (Henrich и др.,Nucleic Acids Research 18: 4143-4148 (1990,хотя в настоящее время пока неизвестны химический лиганд или лиганды, которые связываются с ним. Обозначение "USP" в контексте настоящего описания относится к нативным формам рецептора, а также к его мутантным или химерным формам. Они включают, но не ограничены ими, мутантные или химерные формы,представленные в данном описании, а также химерные формы USP, которые, по крайней мере, включают лигандсвязывающий домен нативного USP и его мутанты. В соответствии с настоящим изобретением одновременно может применяться более одной формы USP."Вспомогательная кассета экспрессии рецептора" включает нуклеотидную последовательность для 5'-регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептора, отличный от USP, функционально связанный с 3'-терминирующей областью. Вспомогательная кассета экспрессии рецептора включает EcR, RXR, DHR38 (Kafatos и др., Proc.Natl. Acad. Sci. 92: 7966-7970 (1995, а также их мутантные и химерные формы, но не ограничена ими. Понятие "фрагмент" относится к части полипептида рецептора, полученной из указанного источника. Например, "USP-фрагмент" относится к такой части полипептида рецептора, которая получена из нативного рецептора Ultraspiracle. В контексте настоящего описания фрагмент может включать один или несколько доменов и,по крайней мере, включать лигандсвязывающий 6 домен рецептора, от которого фрагмент получает свое название. Понятие "химерный" используют для обозначения того, что полипептид рецептора включает домены, по крайней мере, один из которых имеет происхождение, гетерологичное по отношению к другим присутствующим доменам."Гетерологичный" означает, что один или несколько доменов, присутствующих в полипептиде рецептора, отличаются по их естественному происхождению от других присутствующих доменов. Например, если трансактивирующий домен протеина VP16 герпеса простого функционально связывают с USP-рецептором Drosophila, то трансактивирующий домен VP16 является гетерологичным по отношению к USPфрагменту. Кроме того, если домен из USP функционально связывают с доменом из RXR для создания функционального рецептора, то химерный гибрид будет иметь домены, гетерологичные по отношению друг к другу. Эти химерные рецепторные полипептиды кодируются нуклеотидными последовательностями, которые были функционально связаны, что приводит к получению кодирующей последовательности,которая не встречается в естественных условиях. Химерные рецепторные полипептиды по настоящему изобретению обозначают в соответствии с линейной номенклатурой в направлении от N-концевой к С-концевой части полипептида. В соответствии с этой номенклатурой химерный рецепторный полипептид, имеющий трансактивирующий домен из VP16, добавленный к N-концевой области USP-рецептора, обозначают как VP16-USP. И наоборот, если VP16 добавлен к С-концевой области USP-рецептора,то химерный рецепторный полипептид обозначают как USP-VP16. Генные конструкции обозначают на основе 5'-регуляторной области и функционально связанной с ней кодирующей последовательности,причем обозначение 5'-регуляторной области помещают перед значком дроби (/), а обозначение кодирующей последовательности помещают после этого знака. Например, генная конструкция 35S/USP-VP16 обозначает промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей химерный рецептор USP-VP16, в котором трансактивирующий домен VP16 был добавлен к С-концевой области USP. Когда ссылка делается на полипептид рецептора, то промотор не обозначают. Например, вышеуказанная генная конструкция кодирует полипептид USP-VP16."Кассета экспрессии мишени" включает нуклеотидную последовательность для 5'регуляторной области, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид-мишень, экспрессия которого либо активируется, либо ингибируется рецепторными полипептидами в присутствии 7 химического лиганда. 5'-Регуляторная область гена-мишени включает коровую промоторную последовательность, последовательность инициации транскрипции и реагирующий элемент или реагирующие элементы, необходимые для комплементарного связывания рецепторных полипептидов. 5'-Регуляторная область способна обеспечивать экспрессию в растениях. Кассета экспрессии мишени также несет 3'терминирующую область (стоп-кодон и полиаденилирующую последовательность). Известны ювенильные гормоны I, II, III и О в качестве замещенного варианта I (см., например, Fundamentals of Insect Physiology, M.S.Blum (ред.), John WileySons, New York,1985). Ювенильный гормон I имеет формулу метил-10,11-эпокси-7-этил-3,11-диметил-транс 2,6-тридекадиеноат. Строение ювенильного гормона I приведено ниже. Агонисты ювенильного гормона представляют собой соединения, которые обладают одной или несколькими биологическими активностями ювенильного гормона. Обладающие этим свойством соединения, которые имеют структурное сходство с ювенильным гормоном,включают кинопрен, метопрен, гидропрен и метопреновую кислоту, но не ограничены ими. Строение кинопрена в качестве примера одного из этих агонистов ювенильного гормона приведено ниже. Также известны агонисты ювенильного гормона, структура которых не является сходной с таковой ювенильного гормона. Такие соединения включают полициклическое неизопреноидное соединение феноксикарб, который является хорошо известным агонистом ювенильного гормона, но не ограничены этим соединением. Феноксикарб имеет формулу этил[2-(4-феноксифенокси)этил]карбамат. Строение феноксикарба приведено ниже. Другим агонистом ювенильного гормона,пригодным в соответствии с изобретением, является диофенолан, соединение, представляющее собой дифениловый эфир. Диофенолан имеет формулу фениловый эфир 4-(2-этил-1,3 диоксолан-4-илметокси)фенила. Известно, что это соединение обладает активностью ювенильного гормона и вероятно функционирует аналогично таким соединениям, как феноксикарб или метопрен. 8 Применение агонистов ювенильного гормона по настоящему изобретению обладает рядом преимуществ. Во-первых, соединения являются синтетическими и легко доступными. Во-вторых, преимуществом многих из этих соединений является то, что они уже были оценены в сельскохозяйственном производстве, что делает эти соединения "готовыми к применению" на сельскохозяйственных культурах в полевых условиях. Настоящее изобретение основано на том неожиданно обнаруженном факте, что ювенильный гормон или один из его агонистов действует в качестве химического лиганда для рецептора USP. Ранее неизвестный химический лиганд для рецептора USP был использован согласно изобретению в сочетании с экспрессируемыми в растении кассетами экспрессии рецептора USP и соответствующими кассетами экспрессии мишени для создания нового способа регулирования экспрессии генов в растениях. Было обнаружено, что многие регуляторы роста насекомых ингибируют линьку насекомых и вероятно воздействуют непосредственно на рецепторы, участвующие в инициации линьки. Такие регуляторы роста насекомых включают трифлумурон (1-(2-хлорбензоил)-3-(4-трифторметоксифенил)мочевина), гексамфлумурон (1[3,5-дихлор-4-(1,1,2,2,-тетрафторэтокси)фенил]3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), тефлубензурон(1-(3,5-дихлор-2,4-дифторфенил)-3-(2,6 дифторбензоил)мочевина), флуфеноксурон (1[4-(2-хлор--трифтор-паратолилокси)-2-фторфенил]-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), флуциклоксурон (1-[-(4-хлорциклопропилбензилиденаминоокси)-паратолил]-3-(2,6-дифторбензоил) мочевина) и луфенурон (1-[2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-гексафторпропокси)фе-нил]-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина), но не ограничены ими. В соответствии с настоящим изобретением также могут использоваться дополнительные инсектициды из класса бензоилфенилмочевин, которые включают, но не ограничены ими, дифлубензурон и хлорфлузурон. Ретиноевая кислота или ее производные также могут использоваться в качестве лиганда для регулирования экспрессии гена в трансгенных растениях. Было установлено, что ретиноевая кислота обладает способностью активировать гетерологично экспрессируемый продукт гена USP в культивируемых линиях клеток млекопитающих(Harmon и др.). Следовательно, рецепторы насекомых могут регулироваться при воздействии производных ретиноевой кислоты на трансгенные растения, несущие соответствующую комбинацию рецептора(ов) и конструкций генамишени, как описано ниже. Естественные источники также могут действовать в качестве лигандов для рецепторов насекомых, экспрессируемых в трансгенных 9 растениях, таких как трансгенная кукуруза или пшеница. Известен целый ряд растений, обладающих способностью синтезировать соединения, которые либо усиливают, либо ингибируют линьку насекомых. Например, один из наиболее активных экдистероидов - муристерон выделен из источников растительного происхождения. Известно много семейств растений, обладающих либо экдистероидной активностью, либо активностью ювенильного гормона. Антагонисты ювенильного гормона также могут служить в качестве лигандов для регулирования экспрессии генов в трансгенных растениях. Примерами таких лигандов являются этил-4-[2-трет-бутилкарбоксилокси]бензоат; бистиокарбамат, 5-метокси-6-[1-(4-метоксифенил)этил]-1,3-бензодиоксол или этил-Е-3-метил 2-додеценоат. Такие лиганды-антагонисты могут служить для активации низкого основного уровня экспрессии трансгенов или для ингибрования высокого основного уровня экспрессии в гетерологичной растительной системе, экспрессирующей модифицированный(ые) рецептор(ы) насекомых. Способ по настоящему изобретению включает трансформацию растительной клетки или растения с помощью кассеты экспрессии рецептора USP и кассеты экспрессии мишени. При экспрессии в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов полипептид рецептора USP в полученных растительных клетках, растениях или их потомстве активирует 5'-регуляторную область кассеты экспрессии мишени в трансгенных клетках или растениях(фиг. 1). Ювенильный гормон или один из его агонистов, для которых характерно связывание с лигандсвязывающим доменом USP, являются частью настоящего изобретения. Регулирование экспрессии кассеты экспрессии мишени также может быть достигнуто необязательно путем экспрессии в растении дополнительного вспомогательного полипептида или полипептидов рецептора, отличного от USP(фиг. 2 и 3). Примеры дополнительных вспомогательных полипептидов рецепторов согласно изобретению включают EcR, RXR, DHR38 (Kafatos и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7966-7970(1995, а также их мутантные и химерные формы, но не ограничены ими. Применение этих рецепторов для опосредования индуцированной лигандом трансактивации описано в международной заявке РСТ/ЕР 96/00686, поданной 19 февраля 1996, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Лигандсвязывающий домен полипептида рецептора USP позволяет осуществлять химическое регулирование активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени посредством ювенильного гормона или одного из его агонистов. USP аналогичен стероидному рецептору RXR, химическим лигандом для которого является 9-цисретиноевая кислота. Также уста 003423 10 новлено, что USP образует гетеродимеры с полипептидом рецептора EcR и регулирует экспрессию полипептида-мишени в трансформированных клетках почки мыши в ответ на применение гормона насекомых экдизона, который связывается с EcR и не является родственным ювенильному гормону и его агонистам (WO 94/01558). Согласно изобретению было установлено, что рецептор USP и его лигандсвязывающий домен являются наиболее пригодными для регулирования экспрессии полипептидамишени в ответ на воздействие ювенильного гормона или одного из его агонистов в растениях, что описано ниже в примерах. Химерные формы полипептидов рецептораUSP также могут применяться в соответствии с настоящим изобретением для активации экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. В качестве гетерологичного источника могут быть выбраны либо ДНК-связывающий домен, либо трансактивирующий домен химерного полипептида рецептора USP на основе данных об их эффективности в отношении трансактивации или связывания ДНК. Эти домены химерного полипептида рецептора могут быть получены из любого организма, такого как растения, насекомые и млекопитающие, который имеет сходные функции регуляции транскрипции. В одном из вариантов осуществления изобретения эти домены выбирают из других представителей суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов. Преимуществом применения химерных полипептидов рецептора является объединение доменов из различных источников. Преимуществом химерных полипептидов рецептора USP согласно настоящему описанию является объединение оптимальной трансактивирующей активности или измененного связывания RE или распознавания специфического реагирующего элемента с ювенильным гормоном или одного из его агонистов в качестве лиганда. Таким образом, химерный полипептид может быть сконструирован таким образом, чтобы специально адаптировать его для конкретной цели. Такие химерные полипептиды рецептора также обладают улучшенной функциональной активностью в гетерологичной окружающей среде,представляющей собой растительную клетку. Согласно настоящему изобретению трансактивирующий, лигандсвязывающий и ДНКсвязывающий домены могут быть объединены в виде химерного полипептида рецептора в любом функциональном расположении. Например,если один субдомен трансактивирующего домена расположен на N-концевой части встречающегося в естественных условиях рецептора, то химерный рецепторный полипептид по настоящему изобретению может включать трансактивирующий субдомен на С-конце вместо или в дополнение к субдомену на N-конце. Химерные 11 рецепторные полипептиды, как описано ниже,также могут иметь множественные домены такого же типа, например, более одного трансактивирующего домена (или два субдомена) на один полипептид рецептора. Так, один из вариантов осуществления изобретения относится к полипептиду рецептора USP, который активирует экспрессию полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов и который также обладает улучшенными характеристиками в отношении трансактивации. Трансактивирующие домены могут быть определены как аминокислотные последовательности, которые усиливают инициацию продуктивной транскрипции с помощью РНК-полимераз (см. обзорPtashne, Nature, 335: 683-689 (1988. Известно,что различные трансактивирующие домены обладают различной эффективностью в отношении их способности усиливать инициацию транскрипции. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно применять трансактивирующие домены, обладающие повышенной трансактивирующей эффективностью в растительных клетках, чтобы создать высокий уровень экспрессии полипептидамишени в ответ на присутствие ювенильного гормона или одного из его агонистов. Трансактивирующие домены, которые, как было установлено, являются наиболее эффективными в соответствии со способом по настоящему изобретению, включают, но не ограничены им,VP16 (выделенный из вируса герпеса простого). В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения трансактивирующий домен из VP16 функционально связывают с USP-фрагментом для создания химерного полипептида рецептора USP для регулирования экспрессии в растениях полипептидамишени. Также могут быть эффективными и другие трансактивирующие домены. ДНК-связывающий домен представляет собой последовательность аминокислот, которая имеет определенные функциональные особенности, ответственные за связывание полипептида рецептора USP со специфической последовательностью нуклеотидов, называемой реагирующим элементом, которая присутствует в 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени. Строение ДНК-связывающих доменов для суперсемейства ядерных рецепторов стероидного и тироидного гормонов является высоко консервативным у различных видов, и, следовательно, имеются лишь небольшие вариации в реагирующих элементах, которые применяются для образования комплементарно связывающейся пары (Evans, Science 240: 889-895 (1989. Однако способ регулирования экспрессии гена может быть сделан более гибким за счет использования реагирующих элементов другими путями. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в 5'-регуляторную область 12 интродуцируют множественные копии, предпочтительно от 1 до 11 копий соответствующего реагирующего элемента, что позволяет создать множественные сайты связывания USP или необязательно вспомогательных рецепторных полипептидов, что приводит к большей степени активации. Дополнительная гибкость способа регулирования гена может быть достигнута путем изменения линейной ориентации или положения реагирующих элементов в 5'-регуляторной области. Реагирующие элементы, которые распознаются рецепторными протеинами класса II,имеют "диадную" симметричную структуру,состоящую из двух "полусайтов" (Evans, Science 240:889-895 (1988. Каждый рецепторный полипептид связывается с "полусайтом". Эти "полусайты" могут быть ориентированы в виде либо прямого повтора, инвертированного повтора,либо палиндромного повтора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения более одной молекулы полипептида USPрецептора распознает прямой повтор (DR) реагирующего элемента, благодаря чему достигается активация кассеты экспрессии мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Дополнительная гибкость способа регулирования экспрессии гена по настоящему изобретению может быть достигнута благодаря использованию ДНК-связывающих доменов и реагирующих элементов из других активаторов транскрипции, которые включают, но не ограничены ими, протеины LexA или GAL4. Могут быть использованы ДНК-связывающий домен из протеина LexA, кодируемого геном lexAE.coli, и комплементарный ему сайт связывания(см. Brent и Ptashne, Cell 43: 729-736, (1985), где описан активатор транскрипции LexA/GAL4). Другим пригодным источником является форма протеина GAL4 дрожжей (см. Sadowski и др.,Nature 335: 563-564 (1988), где описан активатор транскрипции GAL4-VP16). В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения химерный вариант необязательного вспомогательного рецепторного полипептида конструируют путем слияния ДНКсвязывающего домена GAL4 и фрагмента, содержащего лигандсвязывающий домен из EcR. Кроме того, 5'-регуляторная область USP и необязательные вспомогательные кассеты экспрессии рецептора содержат промотор, который обеспечивает экспрессию в растительных тканях и клетках. Соответствующие промоторы для кассет экспрессии рецептора выбирают таким образом, чтобы экспрессия рецепторных полипептидов могла быть конститутивной, регулируемой в процессе развития, тканеспецифичной,специфичной по отношению к клетке или специфичной по отношению к компартменту клетки. Промоторы также могут быть выбраны таким образом, чтобы сама экспрессия рецептор 13 ных полипептидов могла индуцироваться в растении химическим путем, что приводит к увеличению уровня индукции промотора лигандом. При объединении элементов промотора, обеспечивающих специфическую экспрессию с таковыми, обеспечивающими индуцируемую химическим путем экспрессию, рецепторные полипептиды могут экспрессироваться или активироваться в специфических клетках или тканях растения в ответ на обработку химическим соединением. Нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид рецептора, может быть модифицирована с целью улучшения экспрессии в растениях, улучшения функциональной активности или обоих этих параметров. Такие модификации включают изменение наиболее часто встречающегося кодона, встраивание интронов или создание мутаций, но не ограничены ими. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения кассеты экспрессии, включающие специфический по отношению к пыльнику или специфический по отношению к пестику промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид рецептораUSP, применяют для активации экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Настоящее изобретение также относится к полипептидам-мишеням, экспрессия которых активируется рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. В соответствии с настоящим изобретением может регулироваться экспрессия любой кодирующей последовательности при условии, что был сконструирован промотор,функционально связанный с этой кодирующей последовательностью, содержащий реагирующий элемент или реагирующие элементы, комплементарные ДНК-связывающему домену рецептора USP, и необязательно реагирующий элемент или реагирующие элементы, необходимые для вспомогательного рецептора. Например, полипептиды-мишени, пригодные для регулирования фертильности растения, активируют полипептидом рецептора USP в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Мутанты полипептида рецептора USP также включены в настоящее изобретение. Могут быть получены мутанты, которые обладают способностью уменьшать уровень фоновой активации кассеты экспрессии мишени таким образом, чтобы индукция оказалась высокой относительно неиндуцируемой фоновой экспрессии. Кроме того, могут быть созданы мутанты, у которых изменена способность связываться с ювенильным гормоном или одним из его агонистов. Мутанты, обладающие измененными характеристиками связывания, будут реагировать на различные агонисты способами, специфиче 003423 14 скими для этих агонистов. Например, могут быть созданы мутантные рецепторы USP, которые реагируют только на агонист феноксикарб и не реагируют на гидропрен, различая, таким образом, агонисты ювенильного гормона изопреноидного и неизопреноидного строения. Пригодные методы мутагенеза, такие как химический мутагенез или сайтнаправленный мутагенез, хорошо известны в данной области. В другом способе мутантные полипептиды рецептора получают путем ПЦР-мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей лигандсвязывающий домен USP. Эти мутантные рецепторные полипептиды экспрессируют в организме-хозяине, который сам по себе пригоден для общепринятых методов скрининга и выделения, в таком, как дрожжи. Скрининг мутантных рецепторных полипептидов, которые обладают пониженной основной активностью и многократно увеличенной индукцией, в таком организме-хозяине позволяет, однако, отобрать только кандидатов для дальнейшего изучения в растительных клетках, поскольку из работы с глюкокортикоидным рецептором (GR) ясно, что хотя рецепторы из суперсемейства рецепторов стероидного и тироидного гормонов могут функционировать в дрожжах, нельзя заранее предсказать, что они будут функционировать в трансгенных растениях (Lloyd и др., Science 226:436 (1994. Кроме того, ограничение применимости результатов, полученных с использованием дрожжей, обусловлено имеющимися данными, что дрожжевые клетки, которые экспрессируют GR, не реагируют на обычно применяемый химический лиганд дексаметазон,тогда как этот лиганд обладает функциональной активностью в других гетерологичных системах(Schena и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 (1991. Дополнительное исследование на растительных клетках проводят, создавая кассеты экспрессии рецептора, которые кодируют мутантные рецепторные полипептиды, и трансформируя ими растительные клетки в сочетании с кассетой экспрессии мишени. Трансформированные растительные клетки тестируют в отношении активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени мутантными рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Мутантные рецепторные полипептиды, которые вызывают низкий основной уровень экспрессии полипептида - мишени при отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов и высокий уровень экспрессии полипептидамишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, пригодны для регулирования экспрессии гена в растениях. Как описано выше, способ по настоящему изобретению может применяться для статистически достоверного увеличения экспрессии гена по сравнению с минимальным основным уров 15 нем. Однако настоящее изобретение также может применяться для статистически достоверного понижения или ингибирования активации экспрессии гена, что может опосредоваться комплексом, состоящим из таких рецепторов,как USP и EcR. Регулирование генной экспрессии в растениях, опосредуемое такими комплексами рецепторов, является объектом заявки РСТ/ЕР 96/00686, поданной 3 марта 1995, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Реверсия активации, опосредуемой этими комплексами рецепторов, вызывается присутствием ювенильного гормона или одного из его агонистов, которые являются химическими лигандами для полипептида рецептора USP (см. фиг. 2 и 3). В присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов комплексUSP:EcR разрушается, приводя тем самым к реверсии активации. Например, в трансгенном растении, экспрессирующем рецепторные полипептиды USP и GAL4-EcR-Cl и включающем кассету экспрессии мишени, несущую элемент сайта связывания GAL4, активация экспрессии гена полипептида-мишени, вызванная этим комплексом, окажется ревертированной. Эта реверсия будет происходить либо в присутствии тебуфенозида (также известного как RH 5992) или другого химического лиганда, который связывается с лигандсвязывающим доменом EcR,либо в отсутствии такого химического лиганда. Для экспрессии в растениях могут быть выбраны промоторы, приемлемые как для кассет экспрессии рецептора, так и для кассеты экспрессии мишени. Если не указано иное, описанные ниже промоторы могут применяться для обеспечения экспрессии в растениях как рецепторных полипептидов, так и полипептидамишени. Эти промоторы включают конститутивные, индуцируемые, регулируемые временными параметрами, регулируемые параметрами,связанными со стадией развития, регулируемые химическими стимулами, предпочтительные для определенной ткани и тканеспецифичные промоторы, но не ограничены ими. Предпочтительные конститутивные промоторы включают, но не ограничены ими, промоторы 35S и 19SCaMV (патент США 5352605). Дополнительные предпочтительные промоторы включают один из нескольких генов актина, которые, как известно, обеспечивают экспрессию в большинстве типов клеток, но не ограничены ими. Промотор, описанный у McElroy и др., Mol. Gen.Genet. 231: 150-160 (1991), может быть легко включен в кассеты экспрессии рецептора по настоящему изобретению и особенно предпочтителен для применения в однодольных растениях-хозяевах. Еще один предпочтительный конститутивный промотор получают из убикитина, который представляет собой еще один генный продукт, для которого известна способность накапливаться во многих типах клеток. Промотор убикитина клонировали из несколь 003423 16 ких видов для применения в трансгенных растениях (например, в подсолнечнике - Binet и др.,Plant Science 79: 87-94 (1991); в кукурузе Christensen и др., Plant Molec. Biol. 12: 619-632(1989. Промотор убикитина кукурузы исследовали в трансгенных системах однодольных растений, а его последовательность и векторы,сконструированные для трансформации однодольных растений, описаны в заявке ЕР-А 342926. Промотор убикитина пригоден для применения по настоящему изобретению в трансгенных растениях, особенно в однодольных растениях. Также приемлемыми промоторами являются U2 и U5 малой ядерной РНК(мяРНК) из кукурузы (Brown и др., Nucleic Acids Res. 17: 8991 (1989 и промотор спиртовой дегидрогеназы (Dennis и др., Nucleic Acids Res. 12: 3983 (1984. Тканеспецифичные или тканепредпочтительные промоторы, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением в растениях, в частности в кукурузе, являются таковыми, которые обеспечивают экспрессию в корне, сердцевине растения, листе или в пыльце. Такие промоторы описаны в заявке WO 93/07278, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Также приемлемы промоторы, которые обеспечивают специфическую для семени экспрессию, например описанные у Schernthaner и др., ЕМВО J. 7: 1249 (1988); специфические для пыльника промоторы ant32 и ant43D, описанные в заявке ЕРА-578611, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки; специфический для пыльника (тапетальный) промотор В 6 (Huffman и др., J. Cell. Biochem. 17B: Abstract D209 (1993; специфические для пестика промоторы, такие как модифицированный промотор S13 (Dzelkalns и др., Plant Cell 5: 855(1993. Также пригодными для использования в соответствии с настоящим изобретением являются промоторы, индуцируемые химическим путем. Конкретные промоторы этой категории,пригодные для обеспечения экспрессии рецепторных полипептидов или полипептида-мишени в растениях, описаны, например, в заявке ЕР-А 332104, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. 5'-Регуляторная область либо кассеты экспрессии рецептора, либо кассеты экспрессии мишени также может включать другие усиливающие последовательности. Обнаружены многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию гена в трансгенных растениях. Например, известно, что многочисленные нетранслируемые лидерные последовательности, происходящие из вирусов, усиливают экспрессию. В частности было подтверждено, что лидерные последовательности из вируса мозаики табака(TMV, "-последовательность"), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (MCMV) и вируса 17 мозаики люцерны (AMV) эффективны в отношении усиления экспрессии (см., например,Gallie и др. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711(1987); Skuzeski и др., Plant Molec. Biol. 15: 6579 (1990. Другие лидерные последовательности, известные в данной области, включают, но не ограничены ими:(вирус мозаичной карликовости кукурузы) (Virology, 154: 9-20),- лидерную последовательность тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, связывающую протеин (BiP) (Macejak, D.G. и Sarnow,P., Nature, 353: 90-94, (1991.- нетранслируемую лидерную последовательность мРНК покровного протеина вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling, S.A. иGehrke L., Nature, 325: 622-625, (1987,- лидерную последовательность вируса мозаики табака (TMV) (Gallie D.R. и др., Molecular- лидерную последовательность вируса хлорозной мозаики кукурузы (MCMV) (Lommel,S.A. и др., Virology, 81: 382-385, (1991), см. также у Della-Cioppa и др., Plant Physiology, 84: 965-968, (1987. Было установлено, что различные интронные последовательности усиливают экспрессию при добавлении к 5'-регуляторной области,прежде всего в клетках однодольных растений. Например, было установлено, что интроны гена кукурузы Adhl значительно усиливают экспрессию гена дикого типа под контролем родственного ему промотора при интродукции в клетки кукурузы (Callis и др., Genes Develop. 1: 11831200 (1987. Кроме включения одного или нескольких вышеуказанных элементов в 5'-регуляторную область в кассеты экспрессии мишени также могут быть включены другие элементы, характерные для кассеты экспрессии мишени. Такие элементы включают минимальный промотор, но не ограничены им. Под минимальным промотором понимают, что основные элементы промотора являются неактивными или практически неактивными без сайтов связывания для расположенных против хода транскрипции активаторов. Такой промотор обладает низкой фоновой активностью в растениях, когда в них не присутствует трансактиватор или когда в них отсутствуют энхансер или сайты связывания реагирующих элементов. Одним из минимальных промоторов, который особенно пригоден для генов-мишеней в растениях, является минимальный промотор Bzl, который получают из 18 гена кукурузы bronzel. Коровый промотор Bzl получали из конструкции pBzlLucR98, содержащей "mус"-мутант Bzl-люциферазу, путем расщепления сайта NheI, локализованного на нуклеотидах от -53 до -58 (Roth и др., Plant Cell 3: 317 (1991. Таким образом, фрагмент, происходящий из корового промотора Bzl, располагается между нуклеотидами -53 и +227 и, когда применяется для трансгенного растения кукурузы, содержит интрон-1 Bzl в 5'-нетранслируемой области. Помимо промоторов для использования в соответствии с настоящим изобретением также пригодны различные 3'-терминаторы транскрипции. Терминаторы транскрипции ответственны за прекращение транскрипции и за правильное полиаденилирование мРНК. Пригодными терминаторами транскрипции являются таковые, для которых известно, что они функционируют в растениях и они включают терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор нопалинсинтазы, терминатор Е 9 гена rbcS гороха и другие известные в данной области. Они могут применяться как в однодольных, так и в двудольных растениях. Кассеты экспрессии по настоящему изобретению могут быть интродуцированы в растительную клетку многочисленными известными в данной области способами. Для специалиста в данной области очевидно, что выбор способа может определяться типом растения, подлежащим трансформации, а именно однодольным или двудольным растением. Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Crossway и др.,BioTechniques 4: 320-334 (1986, электропорацию (Riggs и др., Рrос. Natl. Acad. Sci, USA 83:5602-5606 (1986, опосредуемую Agrobacterium трансформацию (Hinchee и др., Biotechnology 6: 915-921 (1988, непосредственный перенос гена (Paszkowski и др., EMBO J. 3: 27172722 (1984 и способ баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin и BioRad, Hercules, California (см., например, Sanford и др., патент США 4945050; и McCabe и др., Biotechnology 6: 923-926 (1988. К таким известным публикациям относятся также, но не ограничены ими,Weissinger и др., Annual Rev. Genet. 22: 421-477(пшеница). Ряд наиболее предпочтительных вариантов осуществления интродукции кассет экспрессии по настоящему изобретению в растение кукурузы путем бомбардировки микроснарядами описан у Koziel и др., Bio/Technology 11: 194-200(1993), причем эта публикация в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является способ трансформации протопласта кукурузы, как описано в заявке ЕР-А-292435, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Ряд наиболее предпочтительных вариантов осуществления интродукции кассет экспрессии по настоящему изобретению в растение пшеницы путем бомбардировки микроснарядами можно найти в заявке WO 94/13822, в полном объеме включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Трансформация растений может быть осуществлена с помощью одной молекулы ДНК или с помощью многих молекул (т.е. котрансформация), и обе эти методики пригодны для применения с кассетами экспрессии по настоящему изобретению. Для трансформации растений пригодны многочисленные трансформирующие векторы, а кассеты экспрессии по изобретению могут применяться вместе с любыми такими векторами. Выбор вектора будет зависеть от предпочтительного способа трансформации и видов-мишеней, предназначенных для трансформации. Для трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens пригодны многочисленные векторы. Они обычно несут, по крайней мере, одну пограничную последовательность ТДНК и включают такие векторы, как pBIN19(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984. В одном из предпочтительных вариантов осуществления кассеты экспрессии по настоящему изобретению могут быть встроены в любые бинарные векторы рСIВ 200 и рСIВ 2001 для применения вAgrobacterium. Эти векторные кассеты для опосредуемой Agrobacterium трансформации конструировали следующим образом. ПлазмидуpTJS75kan создавали обработкой pTJS75 с помощью NarI (Schmidhauser и Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985, что позволило вырезать ген устойчивости к тетрациклину, с последующим встраиванием AccI-фрагмента из плазмиды pUC4K, несущей NPTII (Messing и Vierra,Gene 19: 259-268 (1982); Bevan и др., Nature 304: 184-187 (1983); McBride и др., Plant MolecularBiology 14: 266-276 (1990. Линкеры XhoI лигировали с EcoRV-фрагментом рСIВ 7, содержащим левую и правую пограничные последовательности Т-ДНК, селектируемый в растении химерный ген nos/nptII и полилинкер pUC(Rothstein и др., Gene 53: 153-161 (1987 и обработанный с помощью XhoI фрагмент клонировали в обработанной с помощью SalI плазмиде pTJS75kan, создавая рСIВ 200 (см. также ЕРА-332104, пример 19). рСIВ 200 содержит в полилинкере следующие уникальные сайты рестрикции: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI и SalI. Плазмиду рСIВ 2001 получали из рСIВ 200, создавая ее путем встраивания в полилинкер дополнительных сайтов рестрикции. Уникальными сайтами рестрикции полилинкера рСIВ 2001 являются EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI,MluI, BclI, AvrII, ApaI, XpaI и StuI. В конструкцию рСIВ 2001 помимо указанных уникальных сайтов рестрикции также входят ген канамицина для отбора трансформированных растений и бактерий, левая и правая пограничные последовательности Т-ДНК для опосредуемой Agrobacterium трансформации, происходящий из RK2 функциональный ген trfA, предназначенный для мобилизации от E.coli к другим хозяевам, и другие функциональные гены OriT и OriV, также происходящие из RK2. Полилинкер рСIВ 2001 пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы. Для опосредуемой Agrobacterium трансформации дополнительным пригодным вектором является бинарный вектор pCIB10, который содержит ген, кодирующий устойчивость к канамицину для отбора трансформированных растений, правую и левую пограничные последовательности Т-ДНК и включает последовательности из плазмиды pRK252 с широким спектром хозяев, что позволяет осуществлять репликацию как в E.coli, так и в Agrobacterium. Эта конструкция описана у Rothstein и др., Gene 53: 153161 (1987). Были сконструированы различные производные pCIB10, которые включают ген фосфотрансферазы-гигромицин В, описанные уGritz и др., Gene 25: 179-188 (1983). Эти производные позволяют осуществлять селекцию растительных клеток только по признаку устойчивости к гигромицину (рСIВ 743) или по признаку устойчивости к гигромицину и канамицину(рСIВ 715, рСIВ 717). Способы, в которых используется либо форма непосредственного переноса гена, либо опосредуемого Agrobacterium переноса, обычно,но необязательно, осуществляют с использованием селектируемого маркера, который может обеспечивать устойчивость к антибиотику (например, канамицину, гигромицину или метотрексату) или к гербициду (например, фосфинотрицину). Выбор селектируемого маркера для трансформации растения, однако, не имеет решающего значения для изобретения. 21 Для определенных видов растений могут быть предпочтительны различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Маркеры для селекции,применяемые обычно при трансформации,включают ген nptII, который обусловливает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Messing и Vierra, Gene 19: 259-268(1982); Bevan и др., Nature 304: 184-187 (1983,ген bar, который обусловливает устойчивость к гербициду фосфинотрицину (White и др., Nucl.Appl. Genet. 79: 625-631 (1990, ген hph, который обусловливает устойчивость к антибиотику гигромицину (Blochinger и Diggelmann, Mol.Cell Biol. 4: 2929-2931), и ген dhfr, который обусловливает устойчивость к метотрексату(Bourouis и др., EMBO J. 2: 1099-1104 (1983. Одним из таких векторов, пригодных для использования в методе непосредственного переноса гена в сочетании с селекцией по признаку устойчивости к гербициду Баста (или фосфинотрицину), является рСIВ 3064. Основой этого вектора является плазмида рСIВ 246, которая включает промотор 35S CaMV, функционально слитый с геном GUS Е.соli, и терминатор транскрипции 35S CaMV, которая описана в международной заявке WO 93/07278, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Одним из генов, пригодных для придания устойчивости к фосфинотрицину, является ген bar из Streptomyces viridochromogenes (Thompson и др., ЕМВО J. 6: 2519-2523 (1987. Этот вектор пригоден для клонирования растительных кассет экспрессии, содержащих их собственные регуляторные сигналы. Дополнительным трансформирующим вектором является pSOG35, в котором в качестве селектируемого маркера, обусловливающего устойчивость к метотрексату, используется ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) E.coli. Для амплификации промотора 35S (длиной 800 пар оснований), интрона 6 из гена Adhl кукурузы(длиной 550 пар оснований) и нетранслируемой лидерной последовательности GUS изpSOG10 применяли ПЦР. Фрагмент длиной 250 пар оснований из гена дигидрофолатредуктазы типа II E.coli также амплифицировали с помощью ПЦР и два ПЦР-фрагмента объединяли сSacI-PstI фрагментом рВ 1221 (фирма Clontech),который включает каркас вектора pUC19 и терминатор нопалинсинтазы. Объединение этих фрагментов приводило к созданию pSOG19,которая содержит промотор 35S, слитый с последовательностью интрона 6, лидерной последовательностью GUS, геном DHFR и терминатором нопалинсинтазы. Замещение лидера GUSpSOG35. pSOG19 и pSOG35 несут происходящий из pUC ген устойчивости к ампициллину и 22 имеют сайты HindIII, SphI, PstI и EcoRI, пригодные для клонирования чужеродных последовательностей. Одним из преимуществ настоящего изобретения является его применимость для регулирования фертильности растений в полевых условиях. Эффективное оплодотворение определяется образованием жизнеспособных зигот и может быть измерено в виде процента семян,образовавших жизнеспособные зиготы. В соответствии с настоящим изобретением фертильность может регулироваться путем включения нуклеотидной последовательности, кодирующей соответствующую мишень в кассете экспрессии мишени, причем экспрессия этого полипептида-мишени оказывает влияние на фертильность растения, означая, что она обладает способностью статистически достоверно понижать или повышать фертильность растения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения этот полипептид-мишень делает неэффективным процесс оплодотворения, означая, что образование жизнеспособных зигот будет затруднено или прекращено. Такое неэффективное оплодотворение может быть измерено в виде процента семян, не образовавших жизнеспособные зиготы, и может быть вызвано различными способами. Они включают 1) нарушение или изменение тех процессов, которые важны для образования жизнеспособных гамет,2) нарушение функциональной способности пыльцы или семяпочки, если они образуются,или 3) неспособность к нормальному развитию зародышевого мешка, пестика, рыльца или передающего пути, но не ограничены ими. В соответствии с настоящим изобретением ювенильный гормон или один из его агонистов наносят или приводят в контакт с трансгенными растениями в полевых условиях, при этом активируется экспрессия полипептида-мишени, вследствие чего оплодотворение становится неэффективным. В другом варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия этого полипептида-мишени увеличивает или восстанавливает фертильность растения. Было установлено, что в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены различные степени эффективного или неэффективного оплодотворения. В предпочтительном варианте осуществления может быть достигнута степень неэффективного оплодотворения свыше 80% и более предпочтительно свыше 95%. Способность обеспечивать вариабельность уровня фертильности позволяет использовать изобретение в различных сельскохозяйственных целях. Кодирующие последовательности, пригодные в качестве полипептида-мишени, включают, но не ограничены ими, любую последовательность, которая кодирует продукт, способный сделать оплодотворение неэффективным. Эти кодирующие последовательности могут быть либо гомологичного, либо гетерологично 23 го происхождения. Генные продукты этих кодирующих последовательностей включают, но не ограничены ими, следующие:- А-цепь токсина дифтерии (DTA), которая ингибирует синтез протеинов (Greenfield и др.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6853 (1983); Palmiter и др., Cell, 50: 435 (1987,- пектатлиазу peIE Erwinia chrysanthemiEC16, которая разлагает пектин, вызывая лизис клеток (Keen и др., J. Bacteriology, 168: 595(1986,- T-urf13 (TURF-13) митохондриальных геномов cms-T кукурузы; этот ген кодирует полипептид, обозначенный как URF13, который разрушает мембраны митохондрий или плазмыDewey и др., Cell, 44: 439 (1986,- бета-1,3-глюканазу, которая вызывает растворение каллозной стенки микроспоры до ее созревания (Worral и др., Plant Cell, 4: 759771 (1992,- ген Gin-рекомбиназы фага Мu, который кодирует сайтспецифическую ДНКрекомбиназу, которая вызывает перестройку генома и приводит к потере жизнеспособности клетки при экспрессии в клетках растений (Maeser и др., Моl. Gen. Genet., 230: 170-176 (1991,- лизинсинтазу индолуксусной кислоты(iaal) Pseudomonas syringae, которая кодирует фермент, связывающий лизин с индолуксусной кислотой (IAA); при экспрессии в клетках растений она вызывает изменение развития в результате удаления IAA из клетки путем конъюгации (Romano и др., Genes and Development, 5: 438-446 (1991); Spena и др., MoL Gen. Genet.,227: 205-212 (1991); Roberto и др., Proc. Natl.- ген токсина CytA Bacillus thuringiensis israeliensis, который кодирует протеин, являющийся токсичным для комаров и обладающий гемолитической активностью; при экспрессии в растительных клетках он вызывает гибель клетки вследствие разрушения клеточной мембраны(1987); Ellar и др., патент США 4918006 (1990. Такие полипептиды также включают аденинфосфорибозилтрансферазу (APRT) (Moffatt и Somervill, Plant Physiol., 86: 1150-1154 (1988,ДНКазу, РНКазу, протеазу, салицилатгидроксилазу и т.д. Кроме того, было установлено, что кассета экспрессии мишени может содержать 5'регуляторную область, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая при транскрипции образует антисмысло 003423 24 вую версию кодирующей последовательности,имеющую решающее значение для образования жизнеспособных гамет, такую как APRT. В альтернативном варианте могут использоваться рибозимы, действие которых направлено на мРНК гена, который имеет решающее значение для образования или функции гамет. Такие рибозимы должны включать область гибридизации длиной приблизительно 9 нуклеотидов, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, по крайней мере, части РНКмишени, и каталитическую область, адаптированную для расщепления РНК-мишени. Рибозимы описаны в заявках ЕР-А-321201 и в WO 88/04300, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Можно назвать также следующие публикации: Haseloff и Gerlach, Nature, 334: 585-591 (1988); Fedor и Uhlenbeck,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1668-1672 (1990);T.R. Gene, 73: 259-271 (1988); и Zang и Cech,Science, 231: 470-475 (1986). Было установлено, что вышеуказанные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипетид-мишень, также могут быть функционально связаны с 5'-регуляторной последовательностью, которая ориентирует их экспрессию специфическим для ткани или клетки образом. Способы получения такой специфической для ткани или клетки экспрессии описаны выше. Эта специфичность экспрессии гарантирует, что воздействие полипептидамишени будет направлено только на те ткани или клетки, которые необходимы для образования жизнеспособных зигот, и не будут оказывать вредного воздействия на растение, помимо воздействия на его фертильность. В соответствии с настоящим изобретением может регулироваться либо мужская фертильность трансгенных растений, женская фертильность трансгенных растений, либо и то и другое. Мужская стерильность заключается в недостаточной способности производить функциональную или жизнеспособную пыльцу или в отсутствии этой способности. Мужская стерильность может быть результатом дефектов, приводящих к отсутствию образования пыльцы или к отсутствию функционально активной пыльцы, если она образуется. Следовательно, либо пыльца не образуется, либо, если она образуется, она является либо нежизнеспособной, либо неспособной по каким-либо другим причинам осуществлять эффективное оплодотворение в нормальных условиях. Женская стерильность заключается в недостаточной способности производить функциональные или жизнеспособные мегаспоры или зародышевые мешки или другие ткани, необходимые для прорастания пыльцы, роста или оплодотворения, или в отсутствии этой способности. Женская стерильность может быть ре 25 зультатом дефектов, приводящих к отсутствию образования мегаспор или зародышевого мешка или к неспособности развиваться соответствующим образом завязи, семяпочки, пестика,рыльца или передающих путей. Следовательно,либо жизнеспособный зародышевый мешок не образуется, либо, если он образуется, он неспособен эффективно оплодотворяться в нормальных условиях. Например, может быть получено трансгенное растение, которое экспрессирует полипептид или полипептиды рецептора USP в пыльниках, с использованием специфического для пыльника промотора, функционально связанного с соответствующими нуклеотидными последовательностями. Кроме того, трансгенное растение дополнительно может содержать кассету экспрессии мишени, имеющую 5'регуляторную последовательность, которая содержит соответствующую последовательность реагирующего элемента с элементами корового промотора из Bzl, функционально связанную с кодирующей последовательностью рибонуклеазы барназы. При обработке ювенильным гормоном или одним из его агонистов трансгенного растения, экспрессирующего полипептиды рецептора USP, происходит активация 5'регуляторной последовательности кассеты экспрессии мишени с последующим производством полипептида-мишени барназы. Происходящая в результате этого специфическая для пыльников экспрессия барназы приводит к гибели клетки и вследствие этого к мужской стерильности. Аналогичная комбинация рецепторных полипептидов и кассеты экспрессии мишени при использовании специфического для пестика промотора, функционально связанного с нуклеотидными последовательностями, кодирующими рецепторные полипептиды, может привести к женской стерильности. В альтернативном варианте может быть создано растение, в котором экспрессия полипептида-мишени восстанавливает фертильность стерильного мужского или стерильного женского растения. Например, может быть получено растение, которое экспрессирует ген барназы под контролем промотора Ant43D, Ant32 или В 6, либо, как описано у Mariani и др., Nature 347: 737-741 (1990) и Mariani и др., Nature 357: 384-387 (1992), под контролем промотора ТА 29. Эти растения дополнительно включают кассеты экспрессии рецептора для полипептида рецептора USP и необязательно полипептид вспомогательного рецептора либо из того же самого специфического для пыльника промотора, либо из конститутивного промотора, такого как промотор убикитина кукурузы, 35S или актина риса. Эти растения, кроме того, включают кассету экспрессии мишени, несущую 5'-регуляторную последовательность, включающую соответствующую последовательность реагирующего элемента с коровыми элементами промотора изBzl, функционально связанную с кодирующей последовательностью ингибитора барназы барстара (barstar). Растения обладают мужской стерильностью, но после обработки ювенильным гормоном или одним из его агонистов происходит активация 5'-регуляторной последовательности кассеты экспрессии мишени с последующим продуцированием полипептида-мишени барстара. Барстар ингибирует рибонуклеазную активность полипептида барназы и происходит нормальное развитие пыльника и пыльцы. Тем самым восстанавливается фертильность. Аналогичный подход может быть использован для регулирования женской стерильности. Растения, обладающие женской стерильностью,могут быть получены при использовании для управления экспрессией барназы промоторов,специфических для экспрессии в репродуктивных тканях женского растения, вместо специфических для пыльника промоторов. Индукция кассеты экспрессии мишени, включающей кодирующую последовательность гена барстара, с помощью ювенильного гормона или одного из его агонистов приводит к восстановлению женской фертильности. Вышеуказанные подходы могут быть основаны на использовании любого гена женской или мужской стерильности, для которого создан ген-восстановитель. Возможные гены-восстановители, отличные от гена барстара, описаны в ЕР-А-412911. Генетические особенности, сконструированные в описанных выше трансгенных растениях и их семенах, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и,таким образом, могут сохраняться и передаваться потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для этих конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также могут применяться специализированные способы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Поскольку выращиваемые культурные растения подвержены нападению со стороны насекомых и повреждениям в результате такого нападения или инфекций, а также подвержены конкуренции со стороны сорных растений, для улучшения урожая проводят мероприятия по борьбе с сорняками, болезнями растений, насекомыми,нематодами и другими вредными факторами. Они включают механические способы, такие как обработка почвы или удаление сорняков и зараженных растений, а также применение средств защиты растений, таких как гербициды,фунгициды, гаметоциды, нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды. Кроме того, дающие преимущества генетические особенности трансгенных растений и семян по изобретению могут быть использова 27 ны при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к пестицидам, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные способы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают гибридизацию, инбридинг,обратное возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д.,но не ограничены ими. Таким образом, трансгенные растения по настоящему изобретению и их семена могут применяться для селекции улучшенных линий растений, что, например,позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или позволяет отказаться от этих методов благодаря модифицированным генетическим особенностям этих растений. Кроме того, могут быть получены новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического "аппарата", что позволяет получить урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами,полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития. При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как качество прорастания и однородность семян, собираемых и продаваемых фермером, не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы с передающимися с семенами болезнями и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны довольно обширные и целенаправленные способы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала,удовлетворяющего определенным стандартам качества, а не использует семенной материал,полученный от его собственной культуры. Материал для размножения, который используют в качестве семенного материала, обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия включают такие соединения, как каптан, кар 003423 28 боксин, тирам (TMTD), металаксил (Apron) и пиримифосметил (Actellic). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративной формы вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адьювантами, обычно применяемыми в технике приготовления препаративных форм, предназначенных для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или вредителями. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем нанесения покрытия из объединенной влажной или сухой композицией. Также возможны другие способы нанесения, такие как обработка почек или плодов. Еще одним объектом изобретения являются новые сельскохозяйственные методы, такие как приведенные выше, для которых характерно применение трансгенных растений, трансгенного растительного материала или трансгенных семян по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением может использоваться любое растение, которое может быть трансформировано и из которого может быть получено трансгенное растение. Мужская стерильность, женская стерильность или оба вида стерильности могут регулироваться путем применения соответствующего химического лиганда. Регулирование фертильности растения является наиболее пригодным для производства гибридных семян. Для получения гибридных семян, не загрязненных семенами,полученными в результате самоопыления,должны применяться методы регулирования опыления, обеспечивающие перекрестное опыление, а не самоопыление. Это обычно осуществляют механическим, генетическим путем или с помощью химических гибридизующих агентов(ХГА). Например, для кукурузы общепринятой практикой является механическое удаление женских (или семенных) родительских растений, что является трудоемким процессом, требующим много времени. У пшеницы регулирование фертильности механическими способами принято в промышленном семеноводстве и пока не разработаны генетические источники регулирования фертильности. Преимущество применения настоящего изобретения для производства гибридных семян состоит в надежности,простоте применения и регулирования как мужской, так и женской фертильности. Могут быть созданы гомозиготные трансгенные растения, содержащие соответствующие кассеты экспрессии рецептора и кассету экспрессии мишени, которые будут сохраняться в них неограниченно долго. Для получения гибридных семян скрещивают гомозиготные линии родительского растения 1 и родительского растения 2. В одном из примеров практического осуществления настоящего изобретения для 29 получения гибридных семян создают родительское растение 1, обладающее мужской стерильностью в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, тогда как родительское растение 2 конструируют таким образом, чтобы оно обладало женской стерильностью в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. При контакте родительского растения 1 и родительского растения 2 с ювенильным гормоном или одним из его агонистов успешное производство семян может быть достигнуто только в том случае, когда пыльцой родительского растения 2 опыляются семяпочки родительского растения 1. В другом примере практического осуществления настоящего изобретения создают родительское растение 1, обладающее мужской стерильностью в отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, а родительское растение 2 конструируют таким образом, чтобы оно обладало женской стерильностью в отсутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Контакт родительского растения 1 и родительского растения 2 с ювенильным гормоном или одним из его агонистов позволяет поддерживать каждую линию путем самоопыления. Для получения гибридных семян проводят уплотненную посадку двух родительских линий и получают только гибридные семена. Фертильность в гибридных растениях потомства восстанавливают путем интродуцирования гена-восстановителя. Этими способами могут быть получены любые требуемые гибридные семена. Регулирование экспрессии трансгенного растения химическим путем может применяться для регулирования либо значительных изменений в процессе развития культуры-мишени, либо для изменения культурного растения с целью его большей приспособленности к вредным условиям окружающей среды, либо для изменения направления специфических путей метаболизма, либо для простой индукции высокого уровня экспрессии отдельного требуемого продуктапротеина. Регулирование программ развития растений химическим путем может позволить фермеру задавать время, когда должны наступать конкретные стадии, такие как развитие цветков,опадание листьев или плодов или другие важные стадии развития. Такое регулирование химическим путем позволит фермеру более гибко реагировать на условия окружающей среды,такие как раннее наступление зимы или дождливой весны. Такие изменения могут быть сделаны с помощью регулирования генов, имеющих решающее значение для развития или реакции на условия окружающей среды, по аналогии с гомеотическими генами Drosophila. Также может быть обеспечено достижение ряда преимуществ для регулирования экспрессии гена, участвующего в метаболическом обмене. Предполагается, что растением может 30 быть израсходовано только фиксированное количество энергии и что любое усиление определенного пути метаболизма, такого как биосинтез запасаемых протеинов, должно приводить к одновременному снижению процесса биосинтеза в конкурентных энергетических путях, таких как синтез крахмала или липидов. В случае, когда такие изменения путей биосинтеза оказываются приемлемыми только по достижении растением определенной стадии развития (т.е. созревание по отношению к росту), химическое регулирование экспрессии гена может оказаться целесообразным или даже необходимым для достижения определенных изменений биосинтеза. Регулирование экспрессии гена химическим путем может оказаться целесообразным для обеспечения высоких уровней сверхэкспрессии определенного протеина. Известно, что определенные протеины являются токсичными для клетки при экспрессии в гетерологичном хозяине, чужеродном субклеточном компартменте или даже при экспрессии с необычно высоким уровнем. Регулирование химическим путем экспрессии таких протеинов может быть либо благоприятным для нормального роста растения, либо даже необходимым для получения достаточной растительной массы при использовании растения в качестве "фабрики" биосинтеза протеина. Протеины, которые могут быть пригодны для крупномасшабного биосинтеза в растениях, включают промышленные ферменты, фармацевтические протеины, антигены, а также другие протеины. Способы биологического анализа для выявления лигандов для рецепторов стероидных гормонов являются известными (Evans и др.,патент США 5298429). Описанные рецепторы ограничены рецепторами глюкокортикоида,минералкортикоида, гормонов, родственных эстрогену, и тироидного гормона. Этими рецепторами трансформировали культуру клеток почки мыши (линии клетокCV-1 или COS) и тестировали на их способность трансактивировать экспрессию химерного гена CAT в присутствии соответствующего гормона млекопитающего. В известной литературе не описаны ни трансформация растительных клеток с помощью этих рецепторов, ни конструирование экспрессируемых в растении генов, ни использование рецепторов, отличных от таковых, для которых лигандом является гормон млекопитающего. Было сделано предположение (Оrо и Evans, WO 91/14695), что USP является "ретиноидным рецептором насекомого". В этом примере XR2C, кодирующим USP, трансформируют культуру клеток насекомого (линия клеток S2) для трансактивации химерного гена CAT в ответ на добавление ретиноевой кислоты. В описании к указанной выше заявке предполагается,что клетки насекомого или животного, транс 31 формированные такими "ретиноидными рецепторами насекомого", могут использоваться для скрининга соединений в отношении их способности приводить к активации рецепторов. Однако Оrо и др. позднее показали в опытах на культуре клеток Drosophila, что USP не активируется ретиноевой кислотой, и в условиях, при которых RXR является реактивным, USP не реагирует ни на один из изученных ретиноидов или ювеноидов, включая метопреновую кислоты(Наrmоn и др. и приведенные в этой работе ссылки). На основании приведенного в данном описании того неожиданного факта, что ювенильный гормон и его агонисты являются лигандами для USP и что USP может использоваться для активации в растительных клетках экспрессии гена-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов, в настоящее время представляется возможным обнаружение новых лигандов для рецептора USP, которые эффективны в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку. Скрининг базируется на экспрессии кассеты экспрессии мишени, кодирующей регулируемый рецептором репортерный ген в трансгенных растениях или растительных клетках, которая также экспрессирует трансгенный полипептид рецептораUSP, а также необязательно вспомогательный рецепторный полипептид, отличный от полипептида рецептора USP. Химические соединения в различной концентрации, исследуемые на их способность индуцировать опосредуемую рецептором USP активацию экспрессии полипептида-мишени, приводят в контакт с трансгенным растением или растительными клетками, после чего проводят анализ экспрессии репортерного гена для определения экспрессии полипептида-мишени. Тестируемые соединения,которые проявляют активацию или статистически достоверное увеличение экспрессии полипептида-мишени, а также тестируемые соединения, которые проявляют ингибирование или статистически достоверное уменьшение экспрессии полипептида-мишени, признаются лигандами полипептида рецептора USP. Способ позволяет определить, являются ли лигандами тестируемые соединения, для которых ранее не было известно, что они являются лигандамиUSP в среде, представляющей собой растительную клетку, или подтвердить, что лигандами являются тестируемые соединения, для которых предполагалось, что они являются лигандамиUSP в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку. Таким образом, согласно настоящему изобретению стало возможным получать лиганды полипептида рецептора- синтез новых тестируемых соединений в соответствии с общепринятыми методами, известными в химии, 003423- трансформацию растительной клетки с помощью кассеты экспрессии рецептора USP,кодирующей полипептид рецептора USP, и кассеты экспрессии мишени, кодирующей полипептид-мишень,- культивирование клеток потомства этих трансформированных растительных клеток,- экспрессию полипептида рецептора USP в клетках потомства,- контактирование клетки потомства с новым тестируемым соединением, синтезируемым по описанной выше методике, и- определение экспрессии полипептидамишени,- повторение двух предыдущих стадий процесса с использованием других новых тестируемых соединений,- отбор тестируемого соединения, которое в значительной степени активирует или ингибирует экспрессию полипептида-мишени, и- дополнительный химический синтез отобранного соединения. Лиганды полипептида рецептора USP, полученные в соответствии с описанными выше стадиями процесса, представляют собой еще один объект настоящего изобретения. Кроме того, данный способ может быть использован для выявления антагонистов или ингибиторов опосредуемой рецептором USP активации экспрессии полипептида-мишени. Такие антагонисты могут быть выявлены по их способности снижать индуцируемую лигандом активность экспрессии полипептида-мишени. В этом способе скрининга в качестве кассеты экспрессии мишени могут быть использованы различные репортерные гены. Одним из пригодных репортерных генов является ген люциферазы светляка. Его использование в кассете экспрессии мишени описано ниже в примерах 7 и 9. Другим пригодным репортерным геном является ген GUS или глюкуронидазы, которая катализирует расщепление хромогенного субстрата, такого как 5-бром-4-хлор-3-индолил-D-глюкуронид или орто-нитрофенилDглюкуронид. Репортерный ген GUS предпочтителен при получении продукта хромогенной реакции, который может быть определен количественным способом, например, с помощью спектрометрии или качественным способом путем визуальной оценки. Кассетами экспрессии рецептора, пригодными для скрининга, являются USP или химерные варианты USP, такие какUSP-VP16 или VP16-USP. Поскольку последовательность USP сходна с последовательностью рецептора RXR млекопитающего и RXR обладает способностью образовывать гетеродимеры с EcR (Thomas и др., Nature 362: 471-475 (1993, кассеты экспрессии рецептора, кодирующие RXR, также могут быть использованы в скрининге. Таким образом может быть установлено, в какой сте 33 пени лиганды USP могут быть пригодны в качестве лигандов RXR в растительных клетках, или могут быть выявлены химические вещества,отличные от ювенильного гормона или одного из его агонистов и являющиеся пригодными химическими лигандами RXR в растительных клетках. Примеры В следующих примерах дополнительно описаны материалы и методы, использованные при осуществлении изобретения, и полученные при этом результаты. Эти примеры представлены только с целью иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Пример 1. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора, кодирующей рецептор экдизона. Кодирующую область ДНК для рецептора экдизона (EcR) Drosophila выделяли из библиотеки кДНК, происходящей из куколки линииCanton S (день 6), полученной в gt11 (Clontech,каталожный номер IL 1005b), и из полученных с помощью геномной ПЦР фрагментов олигонуклеотидов, сконструированных на основе опубликованной последовательности изоформы В 1EcR (Koelle и др., Cell 67: 59 (1991. Последовательность изоформы В 1 EcR подтверждали с помощью автоматического секвенирования с использованием стандартных методов сравнительного анализа последовательности с опубликованной последовательностью (Talbot и др.,Cell 73: 1323 (1993. Экспрессируемую полноразмерную кодирующую область EcR модифицировали таким образом, чтобы она содержала сайт BamHI непосредственно за старт-кодоном против хода транскрипции, используя в ПЦР олигонуклеотид SF43 (5'-CGC GGA ТСС ТАА АСА ATG AAG GGG CGC TGG TCG AAC AACGGC-3', SEQ ID NO: I). Растительные векторы экспрессии pMF6 и pMF7 содержат промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (35SCaMV), интрон 1 Adhl кукурузы и участок полиаденилирования гена нопалинсинтазы и сигнал терминации транскрипции (см. Goff и др.,Genes and Development 5: 298 (1991. Векторы рМF6 и pMF7 отличаются только по ориентации полилинкера, использованного для встраивания требуемой кодирующей последовательности. Полноразмерную кодирующую последовательность EcR лигировали в растительном векторе экспрессии pMF6, содержащем 35S CaMV, используя фланкирующие сайты рестрикцииBamHI. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/EcR. Пример 2: Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора, кодирующей рецептор Ultraspiracle. кДНК, кодирующая нативный рецептор 34 рующую USP, с фланкирующими 5'- и 3'нетранслируемыми областями лигировали с растительным вектором экспрессии pMF7 (описанном в примере 1), используя фланкирующие сайты рестрикции EcoRI. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/USP. Пример 3. Конструирование кассеты экспрессии рецептора,имеющей ДНКсвязывающий домен GAL4 и лигандсвязывающий домен EcR. Конструировали кассету экспрессии рецептора, в которой ДНК-связывающий доменGAL4, слитый в N-концевом положении. Кодирующую область ДНК для EcR Drosophila получали аналогично примеру 1. Кодирующую последовательность для ДНК-связывающего домена GAL4 субклонировали из плазмиды рМА 210 (Ма и Ptashne, Cell 48: 847 (1987. Кассету экспрессии рецептора, кодирующую химерный рецепторный полипептидGAL4-EcR, конструировали путем слияния ДНК-связывающего домена GAL4 с лигандсвязывающим доменом и карбоксильным концомEcR. При осуществлении слияния для интродукции с помощью ПЦР сайга BamHI в последовательность кДНК для EcR в положении нуклеотида, эквивалентного остатку аминокислоты 330 (непосредственно за ДНК-связывающим доменом EcR), применяли олигонуклеотид SF23CGT CGT CCC G-3', SEQ ID NO: 2). Образовавшуюся усеченную кодирующую последовательность EcR (EcR330-878) субклонировали в плазмиде pKS+ (фирма Stratagene). Субклон GAL4 получали из плазмиды рМА 210, которая содержала кодирующую последовательность для ДНК-связывающего домена (аминокислоты 1-147), субклонируя Nконец кодирующей последовательности ДНКStratagene), как описано выше (Goff и др., Genesand Development 5: 298 (1991. Эта плазмида была названа pSKGAL2 и ее разлагали с помощью ClaI и KnpI и встраивали следующий двухцепочечный олигонуклеотид: Образовавшаяся плазмида была названа как pSKGAL2.3. Полный гибрид 35S/GAL4EcR330-878 получали с использованием сайтовBamHI в полилинкерах, фланкирующих ДНКсвязывающий домен GAL4 в плазмиде pKS+ и фрагмент EcR330-878 в pKS+. Эти кодирующие последовательности лигировали в векторе экспрессии однодольных растений рМF6 (описанном в примере 1) с использованием фланкирующих сайтов рестрикции EcoRI. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/GAL4EcR330-878. Пример 4. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецепто 35 ра, имеющей лигандсвязывающий домен Ultraspiracle и трансактивирующий домен VP16. Конструировали кассету экспрессии рецептора, которая содержит лигандсвязывающий домен USP вместе с трансактивирующим доменом VP16, слитые либо с N-концом, либо с Сконцом полипептида USP. Для конструирования кассеты экспрессии рецептора, кодирующей химерный полипептид,имеющий трансактивирующий домен VP16 в Сконцевом положении, карбоксильный конец и стоп-кодон кДНК рецептора USP (описанной в примере 2) удаляли путем субклонирования в плазмиде pKS+ (фирма Stratagene), используя сайт XhoI на нуклеотиде номер 1471 кодирующей последовательности USP. Образовавшийся субклон USP, кодирующий аминокислоты с 1 по 490, сливали с трансактивирующим доменомVP16, используя фланкирующий сайт рестрикции KpnI субклона USP и сайт KpnI плазмидыpSJT1193CRF3, который кодирует 80 Сконцевых аминокислот VP16 (Triezenberg и др.,Genes and Development 2: 718-729 (1988. Образовавшийся гибрид USP-VP16 клонировали в растительном векторе экспрессии рМF6, содержащем 35S CaMV (описанном в примере 1),используя сайты рестрикции EcoRI и BamHI,фланкирующие кодирующую последовательность USP-VP16. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/USP-VP16.USP-производное с доменом активации транскрипции, слитым с N-концом, конструировали сначала путем создания сайта BamHI, соседнего со стартовым кодоном USP, используя в ПЦР олигонуклеотид SF42 (5'-CGC GGA TCCNO: 5). Стоп-кодон в VP16 удаляли и интродуцировали фланкирующий сайт BamHI, используя олигонуклеотид SF37 (5'-GCG GGA TCCNO: 6) и стартовый кодон с растительной консенсусной последовательностью, расположенной непосредственно за стартовым кодоном против хода транскрипции, а также интродуцировали сайт BamHI на N-конец, используя олигонуклеотид SA115 (5'-GTC GAG CTC TCG(кодирующую аминокислоты с 1 по 507) объединяли в рамке считывания с помощью соседних сайтов BamHI и кодирующую последовательность VP16-USP встраивали в растительный вектор экспрессии pMF7, содержащий 35SEcoRI. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/VP16-USP. Пример 5. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии рецептора,имеющей ДНК-связывающий домен и лигандсвя 003423 36 зывающий домен EcR и трансактивирующий домен регуляторного гена С 1 кукурузы. Гибрид EcR227-825-Cl получали, помещая стартовый кодон непосредственно перед ДНКсвязывающим доменом EcR, с использованием в ПЦР на полноразмерной кодирующей последовательности EcR олигонуклеотида SF30 (5'-CGCTC-3'; SEQ ID NO: 8). Кодирующую последовательность домена активации транскрипции(1991 сливали в рамке считывания с кодирующей последовательностью для аминокислот с 51 по 825 EcR (в сайте рестрикционного фермента KpnI EcR). Трансактивирующий доменNO: 9). Растительный экспрессирующий векторный гибрид 35S/EcR227-825-Cl конструировали путем встраивания фрагмента BamHI, несущего кодирующую последовательность, в векторpMF7. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/EcR227-825-Cl. Пример 6. Конструирование кассеты экспрессии рецептора, имеющей ДНК-связывающий домен GAL4, лигандсвязывающий домен из EcR и трансактивирующий домен регуляторного гена С 1 кукурузы. Гибрид GAL4-EcR330-825-Cl конструировали с использованием описанной в примере 3 конструкции GAL4-EcR330-878 и конструкции EcR227-825-Cl,описанной в примере 5. Последовательность кодирующей области EcR (начиная с аминокислоты 456) заменяли в сайте AatII. Эта кассета экспрессии рецептора названа как 35S/GAL4EcR330-825-Cl. Пример 7. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии мишени,кодирующей ген люциферазы светляка, имеющий реагирующий элемент для ДНКсвязывающего домена GAL4. Экспрессируемую в растении кассету экспрессии мишени, кодирующую ген люциферазы светляка, имеющий реагирующий элемент для ДНК-связывающего домена GAL4, конструировали следующим образом. Коровый промоторBronze-1 (Bzl) кукурузы, обеспечивающий синтез люциферазы светляка, удаляли из Bzlрепортера pBzlLucR98 (Roth и др., Plant Cell 3: 317 (1991 с помощью сайтов Nhel и SphI и помещали в плазмиду, полученную из плазмидыpUC6S, несущую ген люциферазы. Модифицированный коровый промотор Bzl содержит последовательности сайта NheI (GCTAGC) и промотора Bzl до нуклеотида в положении -53(Roth и др., Plant Cell 3: 317 (1991. Из регуляторного репортера GAL4 плазмиды pGALLuc2 удаляли десять сайтов связывания GAL4 (Goff и др., Genes and Development 5: 298 (1991, обрабатывая с помощью EcoRI и PstI и встраивая в вектор pBlueScript (фирма Stratagene) с исполь 37 зованием этих же сайтов рестрикции. Сайт HindIII на 5'-конце сайтов связывания GAL4 заменяли на сайт BamHI с помощью встраивания адаптора HindIII/BamHI/HindIII и образовавшийся фрагмент BamHI, содержащий сайты связывания GAL4, удаляли и помещали в сайтBglII против хода транскрипции корового промотора Bzl, обеспечивающего синтез люциферазы. Эта кассета экспрессии мишени названа как(GAL4b.s.)10-BzlTATA/Luc. Пример 8. Конструирование экспрессируемой в растении кассеты экспрессии мишени,кодирующей ген люциферазы светляка, имеющий прямой повтор реагирующего элемента. Экспрессируемую в растении кассету экспрессии мишени, кодирующую ген люциферазы светляка, имеющий прямой повторEcRE и RXR-предпочтительным полусайтом,конструировали следующим образом. Конструкцию коровый промотор Bzl кукурузы люцифераза в плазмиде, полученной из плазмиды pUC6S, как описано в примере 7, применяли в качестве исходного материала. Синтезировали двухцепочечные синтетические олигонуклеотиды, содержащие DR RE и спейсинг длиной 3 пары оснований между полусайтами, с помощью липких концов BamHI иCCT ACG-3'; SEQ ID NO: 11) в результате фосфорилирования, отжига и лигирования против хода транскрипции корового промотора Bzl путем встраивания в уникальный сайтBglII. Три копии RE получали путем последовательной обработки BglII и встраивания дополнительных двухцепочечных олигонуклеотидов. Эта кассета экспрессии мишени названа как (DR3)3-BzlTATA/Luc. Пример 9. Трансформация растительных клеток и регулирование экспрессии полипептида-мишени с помощью рецепторных полипептидов в присутствии химического лиганда. Регулирование экспрессии полипептидамишени с помощью различных рецепторных полипептидов, включая химерные рецепторные полипептиды по изобретению, может быть продемонстрировано путем одновременной трансформации растительных клеток необходимыми генными конструкциями с использованием высокоскоростной бомбардировки микроснарядами с последующим биохимическим анализом на присутствие полипептида-мишени. Необходимые генные конструкции включают кассету экспрессии рецептора USP, которая кодирует полипептид рецептора USP (фиг. 1). Необязательно кассета экспрессии рецептора USP может быть трансформирована вместе с вспомогательной кассетой экспрессии рецептора, которая кодирует полипептид рецептора, отличного от USP(фиг. 2 и 3). Кроме того, также необходима кассета экспрессии мишени, которая кодирует полипептид-мишень. Кассеты экспрессии одновременно доставляли в суспензионные клетки кукурузы, которые культивировали в жидкой среде N6 (Chu и др., Science Sinica XVIII: 659-668 (1975 с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами, используя стандартные методы осаждения ДНК на микроснаряды и осуществление высокоскоростной бомбардировки с помощью сжатого гелия (устройство PDS-1000/He,фирма BioRad, Hercules, CA). Подвергнутые трансфекции клетки инкубировали в жидкой суспензии в среде N6 в присутствии соответствующего химического лиганда в течение приблизительно 48 ч. После инкубации трансформированные клетки собирали и затем гомогенизировали при 0 С. Дебрис удаляли из экстракта центрифугированием при 10000xg при 4 С в течение 5 мин. Экспрессию полипептида-мишени обнаруживали путем анализа экстракта на присутствие продукта, кодируемого кассетой экспрессии мишени. Обычно используемой кодирующей последовательностью полипеп-тидамишени при тестировании регулирования экспрессии с помощью рецепторных полипептидов в присутствии химического лиганда является люцифераза светляка. Активность люциферазы светляка определяют с помощью количественной оценки хемолюминесценции, которая обусловлена катализируемым люциферазой фосфорилированием люциферина, с использованием АТФ в качестве субстрата (набор Promega Luciferasa Kit, каталожный номер Е 1500) с помощью люминометра типа Analytical Luminescence Model 2001. Пример 10. Рецепторные полипептидыGAL4-EcR330-825-Cl и USP-VP16, активирующие экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках, и активация, блокируемая агонистами ювенильного гормона. Используя метод трансформации, изложенный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора 35S/GAL4-EcR330-825-Cl (пример 6), кассетой экспрессии рецептора 35S/USP-VP16(GAL4b.s.)10-BzlTATA/Luc (пример 7) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в присутствии 10 мкМ феноксикарба или метопрена в качестве химических лигандов в течение приблизительно 48 ч. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9. Результаты представлены в табл. 1. 003423 Таблица 1 Химиче- Активность ский люцифералиганд зы (единицы света) Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая реагирующие элементы GAL4, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторных полипептидов GAL4-EcR-Cl и USP-VP16 и что эта активация является обратимой в присутствии агониста ювенильного гормона. Уровень экспрессии полипептида-мишени люциферазы оказался в 3,5-31 раз ниже в присутствии агониста ювенильного гормона по сравнению с вариантом, когда он отсутствовал. Пример 11. Рецепторные полипептидыGAL4-EcR330-825-Cl и USP-VP16, активирующие экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках, и активация, блокируемая агонистами ювенильного гормона. Используя метод трансформации, описанный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора 35S/GAL4-EcR330-825-Cl (пример 6), кассетой экспрессии рецептора 35S/USP-VP16 (пример 4) и кассетой экспрессии мишени (GAL4b.s.)10BzlTATA/Luc (пример 7) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в течение приблизительно 48 ч в присутствии 10 мкМ тебуфенозида с использованием 10 мкМ феноксикарба или метопрена в качестве химических лигандов или без них. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9. Результаты представлены в табл. 2. Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая реагирующие элементы GAL4, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторных полипептидов GAL4-EcR-Cl и USP-VP16 в ответ на присутствие химического лиганда тебуфенозида и что эта активация блокируется в присутствии агониста ювенильного гормона метопрена. Уровень индуцированной тебуфенозидом активации экспрессии гена люциферазы при использовании только тебуфенозида оказался увеличенным приблизительно в 6 раз, и он полностью блокировался в присутствии агониста ювенильного гормона метопрена. Пример 12. Рецепторный полипептидVP16-USP, активирующий экспрессию полипептида-мишени в растительных клетках. Используя метод трансформации, описанный в примере 9, кассетой экспрессии рецептора 35S/VP16-USP (пример 4) и кассетой экспрессии мишени (DR3)3-BzlTATA/Luc (пример 8) совместно трансформировали клетки кукурузы. Трансформированные клетки инкубировали в присутствии 10 мкМ метопрена в качестве химического лиганда в течение 48 ч. Анализ люциферазы осуществляли аналогично примеру 9. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Активность люХимический циферазы (едиРецептор лиганд ницы света) нет нет 5,690 35S/VP16 нет 29,967USP Вышеприведенные результаты показывают, что 5'-регуляторная область кассеты экспрессии мишени, содержащая прямой повтор реагирующих элементов, может быть активирована в растительных клетках с помощью рецепторного полипептида VP16-USP в присутствии агониста ювенильного гормона. Уровень экспрессии полипептида-мишени люциферазы оказался примерно в 16 раз выше по сравнению с 41 таковым, который наблюдался в отсутствии агониста ювенильного гормона. Пример 13: Конструирование векторов для трансформации растений Arabidopsis, которые экспрессируютRXRпроизводные и несут регулируемый рецептором репортерный ген. Векторные плазмиды, содержащие Т-ДНКAgrobacterium, конструировали из ранее описанных плазмид pGPTV-Kan и pGPTV-HygGAL4-регулируемый репортерный ген люциферазы в виде кассеты экспрессии мишени конструировали как плазмиду Т-ДНК Agrobacterium,сначала субклонируя фрагмент KpnI/HmdIII длиной 328 пар оснований с 10 сайтами связывания GAL4 и ТАТА гена Bronze-1 аналогично примеру 7 в сайтах KpnI/HindIII модифицированной плазмиды pSPLuc+ (фирма Promega),несущей репортерный ген люциферазы, создавая плазмиду pSGCFOl. KpnI/XbaI-фрагмент длиной 1,991 т.п.н. из pSGCFO1, содержащий сайты связывания GAL4-TATA Bzl-репортер люциферазы, субклонировали в векторе Т-ДНК с помощью лигирования сNdeI/KpnI-фрагментом длиной 4,111 т.п.н. описанной выше плазмиды pSGCFZl. Образовавшуюся плазмиду обозначили как pSGCGLl, и она несет селектируемый маркер NPTII под контролем промотора nos, обусловливающий устойчивость к канамицину трансгенного растения, и GAL4-регулируемый репортерный ген люциферазы. GAL4-регулируемый репортерный ген GUS, включающий 10 сайтов связыванияGAL4, ТАТА-область 35S и кодирующую область GUS, конструировали аналогичным образом и полученную из этих фрагментов плазмиду обозначили как рТА 86. Прямой повтор (DR) реагирующего элемента репортерного гена с 3 копиями DR RE, ТАТА Bzl, кодирующую область люциферазы и терминатор nos, аналогичный таковому, описанному в примере 8, также конструировали способом, аналогичным описанному для pSGCGL1, и полученную плазмиду назвали как pSGCHU1. Кассеты экспрессии рецептора, описанные выше в примерах 3-6, применяли для создания аналогичных Т-ДНК Agrobacterium конструкций, несущих промотор 35SCaMV и сигнал полиаденилирования nos. Одиночные и двойные конструкции рецепторов получали путем субклонирования соответствующей кассеты экспрессии в плазмиде pSGCGL1,несущей GAL4-репортер люциферазы. 42 Пример 14. Получение трансгенных растений Arabidopsis, экспрессирующих VP16-USP и несущих репортерный ген DR-люциферазы.Arabidopsis thaliana (Колумбия) трансформировали вектором Agrobacterium, несущим промотор 35S CaMV и DR-репортер люциферазы (аналогично примеру 13, см. выше) с помощью следующего метода, основанного на вакуумной пропитке. Электрокомпетентные клетки Agrobacterium GV3101 получали путем инкубирования клеток Agrobacterium GV3101 в двукратной YT-среде при 28 С с аэрацией в течение 24-30 ч до ОП 600(оптическая плотность), равной приблизительно 0,5-0,7 единиц. Клетки охлаждали на льду в течение 10-30 мин и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в однократном объеме охлажденного на льду 10%ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,05-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,02-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,02-кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. Клетки снова центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Супернатант удаляли и клеточный дебрис ресуспендировали в 0,01 кратном объеме охлажденного на льду 10%-ного глицерина. 200 мл клеток распределяли в аликвотных количествах в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, быстро замораживали в жидком N2 и хранили при -80 С. Электрокомпетентные клетки использовали в течение не более чем 6 недель при хранении при -80 С. Замороженные электрокомпетентные клетки подвергали оттаиванию на льду и 40 мл этих клеток вносили в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. К подвергнутым оттаиванию клеткам добавляли по 1 мл соответствующей плазмидной ДНК Agrobacterium (2-10 нг) и смешивали при охлаждении на льду. Смесь клетка/плазмида переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации фирмыBio-Rad размером 0,2 см и подвергали электропорации при 2,0 кВ, 600 Ом, 25 мкФ с постоянной времени, составляющей 6 мс. В кювету для электропорации добавляли 1 мл двукратной YT-среды,раствор клетка/плазмида перемешивали кончиком пипетки и содержимое переносили в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем клетки инкубировали при 37 С в течение 1 ч на шейкере при 200 об/мин. Клетки отделяли центрифугированием в течение 2 мин при значении регулировочного параметра 6 в микроцентрифуге Эппендорфа с регулируемой скоростью, суперна 43 тант снимали и клеточный дебрис ресуспендировали в оставшейся жидкости. Ресуспендированные клетки наносили на пластину с LB-средой, содержащей соответствующий антибиотик. Пластины инкубировали при 28-30 С в течение 2-3 дней. 50 мл LB-культуры инокулировали одной трансформированной колонией в колбах объемом 250 мл,содержащих рифамицин в концентрации 100 мкг/мл, гентомицин в концентрации 25 мкг/мл и канамицин в концентрации 100 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение 24-36 ч при 28 С при 250 об/мин и 10 мл культуры использовали для инокуляции 500 мл среды LB + антибиотик в двухлитровых колбах. Эту культуру инкубировали в течение ночи при 28 С при встряхивании при 250 об/мин. ДНК плазмиды выделяли из этой культуры Agrobacterium и оценивали с помощью рестрикционного анализа. Растения Arabidopsis выращивали в покрытой сеткой почве в пластиковых горшках площадью 3 квадратных дюйма в фитотроне,отрегулированном на 16-часовой световой период и на 8-часовой темновой период, при 20 С в течение 4-5 недель. Растения выращивали до тех пор, пока цветочная меристема не достигала высоты приблизительно 2 дюйма. Цветочную меристему растений Arabidopsis, предназначенную для трансформации, удаляли за два дня до обработки Agrobacterium. Культуру Agrobacterium центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин и образовавшийся дебрис ресуспендировали в 500 мл пропитывающей среды (4,3 гMS-солей/л, 5% сахарозы, 0,01 мг/мл бензиламинопурина, 100 мл/л Silwet L77, рН 5,8). Растения Arabidopsis пропитывали водой, насыщая почву. 500 мл суспензии клеток бактерий переносили на дно стерильного вакуумного дессикатора и растения Arabidopsis в горшках верхушкой погружали в раствор, содержащий Agrobacterium. В дессикаторе на период времени 5 мин создавали вакуум и затем медленно восстанавливали давление. Вакуумную обработку повторяли три раза, затем растения промывали для удаления избытка Agrobacterium и возвращали в климатическую камеру. Пропитанным с помощью вакуума растениям давали созреть, зацвести и дать семена. Затем полученные семена высушивали в камере для сушки с низкой влажностью при 95 С в течение приблизительно 5-10 дней. Семена отделяли от высушенных цветков путем дробления, затем просеивали через сито с размером ячеек 425 мкм. Для получения семян требовалось приблизительно 5 недель после вакуумной пропитки. После полного высушивания приблизительно 240 мг семян стерилизовали путем добавления 1 мл 70%-ного EtOH, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при высокой скорости в микроцентрифуге Эппендорфа и удаляли супернатант. Пеллетированные семена ресуспендировали в 1 мл 44 буфера для стерилизации (1 часть 10%-ного тритона Х-100, 10 частей хлорной извести, 20 частей двукратно дистиллированной (д.д.) Н 2 О),перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при высокой скорости в микроцентрифуге Эппендорфа и удаляли супернатант. Семена ресуспендировали в 1 мл стерильной д.д. Н 2 О, перемешивали, центрифугировали при высокой скорости в микроцентрифуге и удаляли супернатант. Эту стадию промывки повторяли три раза, после чего семена переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл для окончательной промывки в 5 мл д.д. Н 2 О. Семена центрифугировали в течение короткого промежутка времени при максимальной скорости в центрифуге типа Beckman с верхним расположением пробирок. Супернатант сливали и семена ресуспендировали при 50 С в 24 мл стерильной 0,8% (масса/объем) агарозы с низкой температурой плавления, смешивали и добавляли аликвотные количества по 8 мл в каждый из трех планшетов размером по 150 мм со средой для прорастания (GM) (Murashige и Skoog,Physiol. Plant 15: 473-497, 1962), содержащей антибиотик для селекции (либо 50 мкг/мл канамицина, либо 50 мкл/мл гигромицина) и 500 мкг/мл карбенициллина. Высеянные семена инкубировали при 4 С в темноте в течение 24 ч,затем их переносили в климатическую камеру,настроенную на суточный режим, включавший 16-часовой световой период и 8-часовой темновой период, при 20 С. Осуществляли отбор проросших сеянцев на планшетах в течение 5-10 дней, проростки переносили на планшеты со свежей средой для селекции и высаживали в почву через 5-10 дней после дополнительной селекции. Непосредственно после высаживания проростки покрывали пластиковой оболочкой на 2-3 дня, после чего выращивали до начала образования цветочных меристем. Пример 15. Химическая индукция выделенных тканей трансгенных растений. Трансгенные растения тестировали в отношении индуцируемой экспрессии гена с помощью следующей методики. Два листа приблизительно одинакового размера срывали с трансгенного растения и инкубировали в воде,содержащей 50 мкг/мл канамицина (или 25 мкг/мл гигромицина в случае, когда трансгенное растение несло этот маркер) с добавлением либо 0,1% этанола, либо 0,1% этанола и 10 мкМ метопрена или феноксикарба. Листья инкубировали в течение приблизительно 24 ч в стандартных условиях для роста, описанных в примере 14. После инкубации с индуцирующим соединением получали экстракт листа путем гомогенизации листа в 500 мкл 100 мМ K2PO4, 1 мМ ДТТ с рН буфера 7,8 при 0 С. Экстракты центрифугировали в течение 5 мин в микроцентрифужной пробирке Эппендорфа при 4 С и хра 45 нили при 0 С до анализа. Люциферазную активность в каждом экстракте определяли, используя люминометр типа Analytical Luminescence Model 2001 и систему для определения люциферазной активности фирмы Promega в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию протеина в экстракте определяли по методу Pierce BCA Protein Assay (Smith и др.,Anal. Biochem. 150: 76-85). Значения люциферазной активности выражают в виде световых единиц, измеренных в течение 10 с при комнатной температуре с использованием 100 мкг протеина экстракта. Обработка феноксикарбом привела к увеличению люциферазной активности в 6,2 раза, а обработка метопреном привела к увеличению люциферазной активности в 25 раз, как показано ниже в табл. 4. Таблица 4 Рецептор Химический Активность люлиганд циферазы (единицы света) нет нет 638 35S/VP16 феноксикарб 3,991USP Пример 16. Скрининг новых лигандов, которые связываются с USP, с использованием трансгенного растения или растительных клеток, экспрессирующих производные USP илиRXR и несущих регулируемый рецептором репортерный ген. Новые лиганды для USP или RXR, эффективные в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, могут быть выявлены с использованием метода скрининга, основанного на экспрессии регулируемого рецептором репортера в качестве кассеты экспрессии мишени в трансгенных растениях или растительных клетках,которые также экспрессируют соответствующий рецепторный полипептид. При этом химические соединения в различных концентрациях, исследуемые на их способность опосредовать с помощью USP или RXR активацию экспрессии полипептида-мишени, приводят в контакт с трансгенным растением или растительными клетками, после чего осуществляют анализ экспрессии репортерного гена. Например, 1) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемый репортерный ген люциферазы в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии рецепторов GAL4-EcR и USP-VP16, можно воздействовать предназначенными для тестирования соединениями и сравнивать их с растениями, не обработанными с помощью усилительного светового устройства, такого как Hamamatsu Light Detection Device, 2) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемыйGAL4 репортерный ген GUS в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии рецепторов GAL4-EcR-Cl и VP16-RXR, можно воздей 003423 46 ствовать предназначенными для тестирования соединениями и сравнивать их с необработанными растениями в отношении их способности катализировать расщепление хромогенного субстрата,такого как 5-бром-4-хлор-3-индолилDглюкуронид или орто-нитро-фенилDглюкуронид, 3) на трансгенные растения или растительные клетки, несущие регулируемый DR RE репортерный ген люциферазы в качестве кассеты экспрессии мишени и кассеты экспрессии VP16USP, можно воздействовать предназначенными для тестирования соединениями и сопоставлять с растениями, не обработанными усилительным световым устройством, таким как HamamatsuLight Detection Device. Положительные контроли,которые целесообразно применять в вышеописанных способах скрининга, включают тебуфенозид и метопрен, но не ограничены ими. В каждом из указанных выше способов более высокий уровень обнаруживаемой экспрессии полипептидамишени в присутствии тестируемого соединения по отношению к уровню экспрессии в отсутствии тестируемого соединения означает, что тестируемое соединение является лигандом либо для USP,либо для RXR в зависимости от кассеты экспрессии рецептора, используемой в данном способе. Таким образом может быть установлено, являются ли лигандами для USP в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, тестируемые соединения, в отношении которых это было ранее неизвестно, или может быть подтверждено, что тестируемое соединение, которое, как предполагалось, должно быть лигандом для USP в окружающей среде, представляющей собой растительную клетку, в действительности является таковым. Пример 17. Выделение мутантов рецепторного полипептида, обладающих пониженной основной активностью. Мутации в лигандсвязывающем домене рецептора Ultraspiracle (USP) получали in vitro путем ПЦР-мутагенеза, как описано у Leung и др., Technique 1: 11-15 (1989). ПЦР-фрагменты подвергнутого мутации лигандсвязывающего домена USP клонировали в векторе экспрессии дрожжей,функционально связывая с активирующим транскрипцию доменом VP16. Конструкции мутантов трансформировали в репортерный штамм дрожжей GGY1171, несущий GAL4-репортер. Трансформанты дрожжей высевали на среду, содержащую индикатор X-Gal. Мутанты, обладавшие пониженным основным уровнем активности полипептида рецептора USP в отношении гетеродимера, образовывали на планшете с индикатором XGal колонии, имеющие цвет от белого до светлоголубого, тогда как трансформанты, экспрессировавшие мутантный полипептид рецептора USP,образовывали колонии темно-синего цвета. Колонии, имеющие цвет от белого до светло-голубого,тестировали для определения основного и индуцированного химическим лигандом уровня актив 47 ности рецепторного полипептида путем выращивания клеток дрожжей из этих отобранных колоний в S-среде, содержащей глицерин, этанол и галактозу в качестве источника углерода. Образовавшуюся культуру разделяли на две части, одну из которых обрабатывали ювенильным гормоном или одним из его агонистов, а другую использовали в качестве контроля при отсутствии химического лиганда. После обработки ювенильным гормоном или одним из его агонистов обе, т.е. обработанную и служащую в качестве контроля, части культуры анализировали в отношении активностиMolecular Genetics, стр. 352-355, J.H. Miller, ред.,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y., 1972). Нуклеотидные последовательности,кодирующие мутантные рецепторные полипептиды, выделенные и идентифицированные этим методом, приемлемы для дальнейших исследований,поскольку рецепторные полипептиды, которые они кодируют, могут обладать в растительных клетках пониженной основной активностью, многократно увеличенной индукцией экспрессии гена-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов или различной реакцией на различные агонисты ювенильного гормона. Пример 18. Идентификация мутантных рецепторных полипептидов, обладающих улучшенной функцией в растительных клетках. Кассеты экспрессии рецепторов, кодирующие мутантные полипептиды рецептора USP из примера 15, получали в соответствии с вышеописанными примерами 2 и 4. Этими кассетами экспрессии рецепторов в комбинации с кассетами экспрессии мишени из примера 8 трансформировали растительные клетки в соответствии с методом, описанным в примере 9. Трансформированные растительные клетки тестировали в отношении активации 5'-регуляторной области кассеты экспрессии мишени мутантными рецепторными полипептидами в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов. Мутантные полипептиды рецептора USP, которые обладают в растительных клетках низким основным уровнем экспрессии полипептида-мишени в отсутствии химического лиганда и высоким уровнем экспрессии полипептида-мишени в присутствии ювенильного гормона или одного из его агонистов,пригодны для регулирования экспрессии гена в растениях. Пример 19. Выращивание потомства трансгенных растений. Трансформированные растения Arabidopsisthaliana (Колумбия), полученные аналогично примеру 14, выращивали в покрытой сеткой почве в пластиковых горшках площадью 3 квадратных дюйма в фитотроне, отрегулированном на 16-часовой световой период и на 8 часовой темновой период, при 20 С в течение 45 недель. Растения содержали интегрированную в их геном чужеродную ДНК в форме рецептора 48 и кассеты экспрессии мишени в соответствии с изобретением. Эту интегрированную ДНК передавали от одного поколения растений к следующему путем оплодотворения в соответствии с жизненным циклом трансформированного растения. Оплодотворение представляет собой процесс, при котором мужской гаметофит и спорофитные или гаметофитные женские ткани успешно взаимодействуют с получением зиготы. Зрелые пыльцевые зерна производятся в пыльниках цветка и попадают на поверхность стигмы (опыление), где они увлажняются и прорастают с образованием пыльцевой трубки. Клетки спермы в пыльцевой трубке доставляются в зародышевый мешок, находящийся в завязи (гинецее), где происходит сам процесс оплодотворения (слияние гамет) с образованием зиготы. Зигота в виде семени является реализацией следующего поколения линии растений. Это следующее поколение называют "потомством" трансформированного растения. Потомство может быть получено путем самоопыления, когда мужской гаметофит и женская гаметофитная ткань происходят из одного и того же отдельного растения. Это означает, что одно отдельное растение является источником геномной ДНК для следующего поколения. В другом варианте потомство может быть получено путем перекрестного опыления двух отдельных растений в результате контактирования мужского гаметофита из одного растения с женскими спорофитными тканями другого растения для получения следующего поколения растений. В этом случае геномная ДНК потомства происходит из двух различных растений. Кроме того, если трансформированное растение подвергается перекрестному опылению нетрансформированным растением, геномная ДНК потомства состоит из трансгенной геномной ДНК одного растения и нетрансгенной геномной ДНК другого растения. Вне зависимости от того, получено ли потомство трансформированного растения путем самоопыления или путем перекрестного опыления, некоторая часть потомства может получить неодинаковый генетический вклад, обусловленный наличием чужеродной ДНК, интегрированной в геном. Этот неодинаковый генетический вклад может быть оценен с помощью методов классической генетики и молекулярной биологии. Для получения следующего поколения растений, содержащих кассеты экспрессии рецептора и мишени по изобретению, исходным трансформированным растениям давали созреть, зацвести и произвести семена в контролируемых условиях окружающей среды. Затем полученные семена сушили в камере для сушки с низким уровнем влажности при 95F в течение приблизительно 510 дней. Семена отделяли от высушенных цветков путем дробления стручков и последующего просеивания через сито с размером ячеек 425 мкм для 49 отделения семян от другого растительного материала. После этого семена могут быть использованы для выращивания следующих поколений растений. Хотя этот способ получения следующего поколения трансформированных растений описан применительно к Arabidopsis, он в целом применим для всех покрытосеменных растений,имеющих интегрированные в их геном кассеты экспрессии рецептора и мишени по изобретению. Все публикации и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании, относятся к уровню техники в той же области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патент включены в настоящее описание в качестве ссылок в той степени, как если бы было особо указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент включена в качестве ссылки. Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные примеры его осуществления, очевидно, что в объеме прилагаемой формулы изобретения в изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Ювенильный гормон или один из его агонистов в качестве химического лиганда для регулирования экспрессии гена в растениях путем опосредуемый рецептором трансактивации(iv) ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА:(А) ОПИСАНИЕ: /desc = "положительная цепь олигонуклеотида, используемая для создания pSKGAL2.3"(А) ОПИСАНИЕ: /desc = "комплементарная цепь олигонуклеотида, используемая для создания pSKGAL2.3"(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 11: ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм трансгенных растительных клеток, содержащих: а) кассету экспрессии USP рецептора, кодирующую полипептид USP рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и 53 б) кассету экспрессии полипептидамишени, включающую ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется USP рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно в) вспомогательную кассету экспрессии рецептора, кодирующую вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептидаUSP рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени. 2. Штамм растительных клеток по п.1, отличающийся тем, что экспрессия полипептидамишени оказывает влияние на фертильность растения. 3. Трансгенное растение, содержащее: а) кассету экспрессии USP рецептора, кодирующую полипептид USP рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и б) кассету экспрессии полипептид-мишени,включающую ген полипептида-мишени, экспрессия которого опосредуется USP рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист,и необязательно в) вспомогатальную кассету экспрессии рецептора, кодирующую вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептидаUSP рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени. 4. Растение по п.3, отличающееся тем, что экспрессия полипептида-мишени оказывает влияние на фертильность растения. 5. Растение по п.3, представляющее собой кукурузу. 6. Растение по п.3, представляющее собой пшеницу. 7. Способ получения дочернего штамма трансгенных растительных клеток по п.1, включающий трансформацию растительной клетки с помощью а) кассеты экспрессии USP рецептора, кодирующей полипептид USP рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и б) кассеты экспрессии полипептидамишени, включающей ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется USP рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно в) вспомогательной кассетой экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептидаUSP рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени, и г) отбор трансформированных клеток и выращивание этих клеток с получением дочернего штамма. 8. Способ получения потомства трансгенного растения по п.3, включающий трансформацию растительных клеток с помощью а) кассеты экспрессии USP рецептора, кодирующей полипептид USP рецептора для контроля экспрессии полипептида-мишени, и 54 б) кассеты экспрессии полипептидамишени, включающей ген полипептидамишени, экспрессия которого опосредуется USP рецептором в ответ на ювенильный гормон или его агонист, и необязательно в) вспомогательной кассеты экспрессии рецептора, кодирующей вспомогательный полипептид рецептора, отличный от полипептидаUSP рецептора, для контроля экспрессии полипептида-мишени,г) регенерацию указанных клеток в трансгенное растение и д) отбор трансформированных растений,их оплодотворение путем самоопыления, получение семян и их выращивание. 9. Способ регулирования экспрессии полипептида-мишени в растении по п.3, включающий: а) обеспечение экспрессии полипептидаUSP рецептора и полипептида-мишени в растении и необязательно вспомогательного полипептида рецептора за счет трансформации растительной клетки соответствующими кассетами экспрессии и б) контактирование клеток растения с ювенильным гормоном или одним из его агонистов. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени увеличивают или активируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени уменьшают или ингибируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов. 12. Способ по п.9, отличающийся тем, что полипептид рецептора USP включает гетерологичный трансактивирующий домен. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что гетерологичный трансактивирующий домен представляет собой трансактивирующий домен протеина VP16 вируса простого герпеса. 14. Способ по п.9, отличающийся тем, что вспомогательный полипептид рецептора выбирают из группы, включающей EcR, DHR38 иRXR. 15. Способ по п.9, отличающийся тем, что агонист выбирают из группы, включающей феноксикарб, диофенолан, кинопрен, метопрен,гидропрен, диофенолан, метопреновую кислоту,трифлумурон, гексамфлумурон, тефлубензурон,флуфеноксурон, флуциклоксурон и луфенурон,дифлубензурон и хлорфлузурон. 16. Способ по п.9, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида-мишени включает 5'-регуляторную область, содержащую от 1 до 11 копий реагирующего элемента. 17. Способ регулирования фертильности растения по п.4, включающий: а) обеспечение экспрессии полипептидаUSP рецептора и полипептида-мишени в растении и необязательно вспомогательного полипептида рецептора за счет трансформации рас 55 тительной клетки соответствующими кассетами экспрессии и б) контактирование растения с ювенильным гормоном или одним из его агонистов. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени увеличивают или активируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов. 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени уменьшают или ингибируют под действием ювенильного гормона или одного из его агонистов. 20. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида USP рецептора или вспомогательного полипептида рецептора включает специфичный для пыльника промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью полипептида рецептора. 21. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида USP рецептора или вспомогательного полипептида рецептора включает специфичный для пестика промотор,функционально связанный с кодирующей последовательностью полипептида рецептора. 22. Способ по п.17, отличающийся тем, что полипептид-мишень представляет собой рибонуклеазу барназу. 23. Способ по п.17, отличающийся тем, что кассета экспрессии полипептида-мишени кодирует антисмысловую последовательность, что приводит к неэффективности оплодотворения. 24. Способ по п.17, отличающийся тем, что полипептид-мишень восстанавливает эффективность оплодотворения. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что полипептид-мишень представляет собой ингибитор рибонуклеазы барстар. 26. Способ выявления лиганда для полипептида USP рецептора, который в клетках штамма по п.1 активирует или ингибирует экспрессию полипептида-мишени, включающий: а) обеспечение экспрессии полипептидаUSP рецептора и необязательно вспомогательного полипептида рецептора в данном штамме, б) контактирования ее с тестируемым соединением,в) определение экспрессии полипептидамишени и г) выявление тестируемых соединений, которые в значительной степени активируют или ингибируют экспрессию полипептида-мишени. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени определяют качественно. 28. Способ по п.26, отличающийся тем, что экспрессию полипептида-мишени определяют количественно. 29. Способ получения лиганда для полипептида USP рецептора, включающий: а) синтез новых тестируемых соединений в соответствии с известными методами,б) культивирование штамма клеток по п.1 с получением штамма дочерних трансформированных растительных клеток,в) обеспечение экспрессии полипептидаUSP рецептора и необязательно вспомогательного полипептида рецептора в штамме дочерних клеток,г) обеспечение контактирования штамма дочерних клеток с тестируемыми соединениями,синтезированными на стадии а), и д) определение экспрессии полипептидамишени,е) отбор тестируемых соединений, которые в значительной степени активируют или ингибируют экспрессию полипептида-мишени, и ж) повторение стадии а) для соединений,отобранных на стадии е). 30. Лиганд для USP рецептора, полученный способом по п.29. 31. Применение ювенильного гормона или агониста ювенильного гормона для регулирования экспрессии полипептида-мишени в штамме клеток по п.1 или растении по п.3.