Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У КУРЯЩИХ Изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и способу снижения повреждения ДНК, вызванного различными вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно данное изобретение относится к применению указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами в человеческих клетках снижением аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека. 015759 Область изобретения Изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и к способу снижения повреждения ДНК, которое вызвано различными вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно данное изобретение относится к применению указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами, в человеческих клетках снижением аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека. Предпосылки изобретения Аддукт бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека концентрируется в бронхиальных клетках. Сейчас этот аддукт признают критическим случаем в онкогенезе бензо(а)пиренами. Сигаретный дым содействует образованию BPDE-dG в значительной степени. Использование табака, несомненно, является наиболее широко распространенной взаимосвязью между воздействием известных канцерогенов и смертью от рака и поэтому является моделью для понимания механизмов индукции рака. Бензо(а)пирен (BP) является высококанцерогенным полициклическим ароматическим углеводородом (PAH), который находится в выбросах выхлопных газов, приготовленной на углях пище и в небольшом количестве в сигаретном дыме, типично, менее чем 10 нг на сигарету. BP является одним из более 60 канцерогенов в сигаретном дыме, который включен в этиологию рака легких. Он метаболически активируется в бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид (BPDE), который реагирует с ДНК преимущественно в положении N2-гуанина с получением первоначально повреждений N2-гуанина,например аддукта бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид-N2-деоксигуанозина (BPDE-dG). Окончательно установили присутствие аддуктов BPDE-ДНК в человеческих тканях, и аддукт BPDE-dG концентрировали непосредственно в бронхиальных клетках и, таким образом, его непосредственно связывали с инициированием рака легких человека. Трава и масло розмарина (Rosmarinus officinalis Labiatae), экстракты розмарина, карнозную кислоту и карнозол обычно применяют как специи и ароматизирующие вещества в пищевой промышленности изза их приятного аромата и высокой антиоксидантной активности. Тем не менее, до данного изобретения не признавали, что применение экстракта розмарина в сигаретном фильтре будет снижать повреждение ДНК, вызванное в человеческих клетках именно бензо(а)пиренами, аддуктом бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека, который сейчас признали критическим случаем в онкогенезе бензо(а)пиренами. Краткое описание изобретенияBP, как рассматривают, является существенным канцерогеном, вовлеченным в индукцию рака легких у курильщиков, и, как показано в данном исследовании, активные формы кислорода значительно способствуют образованию опасного онкогенного аддукта в легких. Несмотря на то что критически важно как предупредить пристрастие к табаку, так и увеличить эффективность прекращения курения и программ снижения, эти подходы оказали незначительное влияние. Предупреждение образования аддуктаBPDE-dG является единственным подходом, который может привести к снижению риска рака легких у склонных к курению. Данное изобретение относится к сигаретному фильтру, содержащему экстракт розмарина, и к способу снижения повреждения ДНК, которое вызвано вредными веществами в сигаретном дыме. Более конкретно, данное изобретение представляет применение указанного фильтра для снижения повреждения ДНК, вызванного бензо(а)пиренами, в человеческих клетках с помощью снижения аддукта бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека. Обнаружили, что количество (-)-анти-BPDE-dG аддукта линейно увеличивается с концентрацией сигаретного дыма в присутствии (+)-BP-7,8-диола. Каталаза и супероксиддисмутаза ингибируют его образование на более чем 80%. Когда клетки MCF-7 обрабатывают на протяжении 2 ч (+)-BP-7,8-диолом,сигаретный дым усиливает зависимое от дозы образование (-)-анти-BPDE-dG и снижает зависимое от ЦОГ (цитохром P450) образование (+)-syn-BPDE аддукта. Клетки обрабатывали в течение одного дня бензо(а)пиреном и затем воздействовали на них в течение 2 ч сигаретным дымом. В течение этих 2 ч обнаружили, что в два раза увеличилось образование аддукта в клетках, обработанных сигаретным дымом, по сравнению с уровнями в необработанных клетках вследствие активности ЦОГ. Таким образом, обнаружили, что сигаретный дым активирует активными формами кислорода, которые он содержит, второй этап метаболического пути бензо(а)пирена, ведущий к образованию аддукта BPDE-dG. Сигаретный дым, таким образом, может отвечать за образование опасного онкогенного аддукта в легких. В итоге, выяснили, что модифицированный сигаретный фильтр, содержащий экстракт розмарина,снижает на более чем 70% уровень аддуктов BPDE-dG сигаретного дыма в клетках MCF-7. Полагают,что это открытие является значительным успехом в снижении риска рака легких у постоянных курильщиков. Краткое описание фигур, схемы и таблицы Фиг. 1 - основной метаболический путь и связывание ДНК канцерогеном бензо(а)пиреном. Бензо(а)пирен является табачным канцерогеном, который может быть преобразован ферментами in vivo или-1 015759 активными формами кислорода до образования ДНК-активных дигидродиолэпоксидов. Стереоселективное образование мутагенного (+)-r-7,t-8-дигидрокси-t-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро-BP [(+)-анти-BPDE] из (-)-BP-7,8-дигидродиола катализировано зависимыми от цитохрома-P450 монооксигеназами (P450) или активными формами кислорода. Последующая реакция этого электрофильного промежуточного соединения с геномной ДНК дает устойчивый аддукт дигидродиолэпоксида с экзоциклической аминогруппой гуанозина. Этот вид повреждения ДНК может преобразоваться в мутации в следующем репликационном цикле, если не происходит восстановление этого аддукта. Фиг. 2 - результаты, полученные с помощью бесклеточной системы, сопровождающейся аддукцией ДНК: 6 мг ДНК тимуса теленка в 2 мл воды добавили к 5 мл CSS (раствор сигаретного дыма) с разными разбавлениями, и реакция протекала 2 ч при комнатной температуре с (+)-BP-7,8-диолом (конечная концентрация 3,6 мкМ). ДНК гидролизировали, а высвобожденный BP-тетрол измеряли, как изложено в разделе Материалы и способы. Фиг. 3(a) - стереохимия эпоксидации BP-7,8-диола пероксильными радикалами и цитохромом P450 до активных форм (анти-BPDE и syn-BPDE), которые могут связываться с ДНК, и (b) кислотный гидролиз ДНК до BP-тетролов, определенный в данном исследовании. Гидролиз (-)-анти-BPDE-dG и (-)-synBPDE ведет к образованию BP-тетрола I-2 и BP-тетрола II-1, которые, тем не менее, неустойчивы и преобразовываются в BP-тетрол I-1 и BP-тетрол II-2. Фиг. 4 - результаты получены с помощью клеток MFC-7. 10106 клеток/150 см 2 сосуде при общем объеме 20 мл обрабатывали в течение 2 ч только (+)-BP-7,8-диолом (0,2 мкМ) или в присутствии разных разбавлений CSS, ДНК выделяли, гидролизировали и измеряли освобожденные BP-тетролы, а уровни связывания определяли, как изложено в разделе Материалы и способы. На хроматограммах наблюдаются два отдельных пика, соответствующих BP-тетролу I и BP-тетролу II, полученных от (-)-анти-BPDEdG и (+)-syn-BPDE-dG соответственно (ссылки 32-34). Значения представляют собой средние значения плюс стандартное отклонение двух независимых экспериментов с 3-4 циклами ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). На фиг. 4a, верхняя часть, показано увеличение (-)-анти-BPDE-dG аддуктов с разбавлением CSS; на фиг. 4b, нижняя часть, показано увеличение 1/(+)-syn-BPDE-dG аддукта с разбавлением CSS. Фиг. 5 - связывание BPDE-dG в клетках MCF-7 после воздействия BP 2,5 мкМ или BP 2,5 мкМ + CS(сигаретный дым) раствора (разбавленного в 20 раз) за указанное время. Раствор сигаретного дыма добавляли в течение 2 ч при воздействии BP (схема 1). Анализ BPDE-dG выполнили, как описано в разделе Материалы и способы. Значения представляют собой средние значения двух независимых экспериментов с 4-6 циклами ВЭЖХ плюс стандарт. Значение BPDE-dG равно 11,70,5 (среднее значениесреднеквадратическое отклонение) мкг аддуктов на мг ДНК после 12 ч инкубации и 17,60,4, 26,10,9 после 18 ч и 24 ч соответственно. Самопроизвольный метаболизм ЦОГ увеличивал эти значения до 17,20,5,27,80,8 и 42,21,0 2 ч после начального момента времени в 12, 18 и 24 ч соответственно. Добавление раствора сигаретного дыма (CSS) вызывало намного более резкое изменение на протяжении того же двухчасового периода, что привело к окончательному значению BPDE-dG 36,91,2, 56,70,9 и 80,21,2(среднее значениесреднеквадратическое отклонение) мкг аддуктов на мг через 12, 18 и 24 ч соответственно. Фиг. 6 - связывание BPDE-dG в клетках MCF-7 после воздействия 2,5 мкМ BP или BP 2,5 мкМ + CS раствора, полученного из стандартного фильтра и фильтра, содержащего экстракт розмарина. Раствор сигаретного дыма добавляли последние 2 ч воздействия на BP в течение указанного времени (схема 1). Анализ BPDE-dG выполнили, как описано в разделе Материалы и способы. Циклы ВЭЖХ показывают,что на хроматограмме есть только один пик, который соответствует BP-тетролу I, происходящему из (+)анти-BPDE-dG. Значения представляют собой средние значения двух независимых экспериментов с 4-6 циклами ВЭЖХ плюс стандарт. Схема 1 - клетки MCF-7 обрабатывали BP на протяжении 12 и 18 ч, а потом сигаретным дымом еще 2 ч вместе с BP (эксперименты A и B соответственно). Целью данного эксперимента являлась активация при разном времени BP для получения BP-7,8-диола и после обработки клеток сигаретным дымом и продолжение этого эффекта последние 2 ч. Контрольный образец представляет собой клетки, обработанные только BP.-2 015759 Таблица 1 Влияние поглотителей на уровень BPDE-dG, вызванный сигаретным дымом в бесклеточной системе Система стандартного CSS включает 2 мл ДНК тимуса теленка (3 мг/мл), 600 мкл 30 мМ (+)антиBPDE и 5 мл разбавленного ФБС CSS (1:19) при pH 7,4, ее инкубировали при комнатной температуре 2 ч. Каждое значение получали из трех независимых экспериментов, выполненных в двух повторностях. Средняя погрешность составляла приблизительно 12% в каждой повторности эксперимента. ЗначениеBPDE-dG стандарта составило 566,3 (среднеесреднеквадратическое отклонение) аддуктов на мг ДНК. Подробное описание Курение сигарет причинно связано с большим количеством случаев рака у человека. Использование табака является, безусловно, самой широкораспространенной связью между воздействием известных канцерогенов и смертностью из-за рака и, таким образом, является моделью для понимания механизмов индукции рака. Бензо(а)пирен (BP) является высококанцерогенным полициклическим ароматическим углеводородом (PAH), присутствующим в выбросах выхлопных газов, приготовленной на угле пище и в небольшом количестве в сигаретном дыме, обычно менее чем 10 нг на сигарету. BP является одним из более 60 канцерогенов в сигаретном дыме, который включен в этиологию рака легких. Он метаболически активируется в бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксиде (BPDE), который реагирует с ДНК преимущественно в N2 положении гуанина с образованием первоначально повреждений N2-гуанина, например аддукта бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид-N2-деоксигуанозина (BPDE-dG). Присутствие аддуктов BPDE-ДНК в человеческих тканях было окончательно установлено, и BPDEdG аддукт концентрировался исключительно в бронхиальных клетках и, таким образом, был вовлечен в инициацию рака легких человека. Этот канцероген метаболизируется ферментами фазы I до большого количества метаболитов,включая фенолы, ареноксиды, хиноны, дигидродиолы и диолэпоксиды. Обзор метаболического пути ВР,ведущий к образованию (+)-анти-BPDE-dG аддукта, представлен на фиг. 1. Более подробно, окончательный канцероген (+)-анти-BPDE образован из BP двумя этапами опосредованного цитохромом P450 окисления. Первый этап этого окисления предпочтительно приводит к (-)7,8-дигидро-7,8-дигидробензо(а)пирен[(-)BP-7,8-диолу]. Диол далее окисляется в первую очередь до высоко мутагенного (+)-r-7,t-8-дигидрокси-t-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро-BP [(+)-анти-BPDE]. Многочисленные исследования четко определили [(+)-анти-BPDE] как первичный канцерогенный метаболит ВР,проявляющий повышенную мутагенную активность in vitro и in vivo. Большинство предыдущих исследований генетического изменения в метаболизме канцерогенов легких направлено на метаболическую активацию различными цитохромами P450, несмотря на то, что экспрессия этих ферментов в легких, как правило, низкая. Активация BP-7,8-диола эпителиальными клетками легких не вызывается исключительно классическими процессами биотрансформации зависимыми от ЦОГ/GST, а также включает несколько путей метаболизма кроме ЦОГ. Они включают липооксигеназу, продукты перокисления липидов и зависимые от пероксидазы пути метаболизма, COX-1 и COX-2. Увеличение свидетельств позволяет предположить причинное значение свободных радикалов табака в индукции рака легких у курильщиков. Каждая затяжка дыма образует более чем 10 триллионов свободных радикалов, присутствующих в дыме, которые могут содействовать как образованию опухоли, так и стимуляции различных форм рака человека, вызванных повторными воздействиями ROS (активные формы кислорода) на клеточные макромолекулы. Предполагают, что главные формы свободных радикалов являются равновесной смесью семихинонов, гидрохинонов и хинонов. Предложено, что этот свободнорадикальный комплекс вызывает окислительно-восстановительный цикл, который образует анион супероксида из молекулярного кислорода и приводит к образованию пероксида водорода и гидроксильного радикала. Эти активные формы вызывают одноцепочечный разрыв в ДНК и однонитевый разрыв ДНК в культивируемых клетках грызунов и человека. Связанный с хиноном окислительно-восстановительный цикл также может быть включен в данные эффекты; гидрохинон и катехол, как полагают, играют главную роль. Обнаружили, что сигаретный дым может активизировать образованными кислородом радикалами второй этап метаболического пути ВР, ведущий к образованию аддукта BPDE-dG, вероятно, метаболиз-3 015759 мом образованного в клетках (-)-BP-7,8-диола в (+)-r-7,t-8-дигидрокси-t-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидроBP [(+)-анти-BPDE] (фиг. 1). Также обнаружили, что эта активация по меньшей мере в два раза выше, чем полученная с механизмом ЦОГ. Кроме того, обнаружили, что ROS из сигаретного дыма может частично отвечать за увеличенное образование BPDE-dG аддукта. Также обнаружили, что фильтр, содержащий сформулированный порошок розмарина, может значительно снизить уровень BPDE-dG из-за радикала, образованного кислородом в CS, и что это открытие можно применять для сигаретных фильтров, которые снижают образование канцерогенного аддуктаBPDE-dG в бронхиальных эпителиальных клетках. Данное изобретение обеспечивает (i) средство для определения относительной доли ROS в сигаретном дыме в активацию BP-7,8-диола по сравнению с цитохромом P450; (ii) средство для установления вызывает ли ROS сигаретного дыма канцерогенный процесс путем содействия метаболизму BP-7,8 диола, приводя к увеличению образования опасного BPDE-dG в легких; (iii) фильтр, содержащий поглотитель свободных радикалов сигареты для существенного снижения образования BPDE-dG; и (iv) применение указанного фильтра для значительного снижения функции BPDE-dG аддуктов. Примеры Химикаты. Протеиназу K (EC 3.4.21.64, из Tritirachium album) закупили у Sigma (St. Louis, MO),РНКазу T1 (EC 3.1.21.3, из Aspergillus oryzae) и РНКазу (без ДНКазы, гетерогенная смесь рибонуклеаз из бычьей поджелудочной железы) получили у Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). Фосфатносолевой буфер (ФСБ) содержал 3,0 мМ KCl, 1,5 мМ KH2HPO4, 140 мМ NaCl, 8,0 мМ Na2HPO4, (pH 7,4),воду, отвечающую требованиям ВЭЖХ, MeOH, эфир и этанол для спектроскопии от E. Merck, Darmstadt,Germany. Если не заявлено иное, другие химикаты были закуплены у Sigma (L 'Isle d'Abeau Chesnes,France), Boehringer Ingelheim (Heidelberg, Germany) и Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). Все BP стандарты метаболитов получили из National Cancer institute, Chemical Carcinogen Reference Standard Repository Midwest Research Institute (Kansas City, MO). Аппаратура. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили при помощи изократичных и градиентных систем Hewlett-Packard высокого давления (Waldborn, Germany), оснащенных детектором флуоресценции Shimadzu RF-10AXL, связанным с интегратором Hewlett-Packard. Получение сигаретного дыма/раствора ФСБ (CSS). Курение выполняли согласно Pryor et al. без Кембридж фильтра. По существу, тот же способ сбора дыма ранее применяли Nakayama et al. Дым от одной горящей 8 см сигареты (Marlboro) в течение 3,8 мин при помощи постоянного вакуума, полученного водяным насосом, барботировали через 10 мл раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), который захватывает как газообразную фазу, так и химические вещества смолы сигаретного дыма. Поскольку никаких не растворимых в воде соединений смолы не присутствовало на стенках промывалок, основная часть растворимых в воде соединений дыма одной сигареты содержалась в 10 мл раствора ФСБ. Этот водный раствор, называемый раствором сигаретного дыма (CSS), непосредственно реагировал с экзогенной ДНК, или его добавляли в клетки MCF-7 в культуре в присутствии бензо(а)пирена или его непосредственного метаболита (+)-BaP-7,8-диола. Применяли различные разбавления CSS (см. ниже). Включение порошкообразного экстракта розмарина в сигаретный фильтр. Фильтр обычной сигареты извлекли и в свободное от фильтра место возле самой сигареты ввели 40 мг порошкообразного экстракта розмарина. После этого фильтр установили заново. Эффект этого фильтра оценивали масс-спектрометрией. Кратко, сигаретный дым барботировали в органический раствор, содержащий аддукт спиновой ловушки 3,3,5,5-тетраметил-1-пирролин-N-оксида (TNPO). Затем определяли количество аддукта гидроксильного радикала с помощью жидкостной хроматографии, массспектрометрии. При используемых условиях курения наблюдалось 30% уменьшение гидроксильного радикала. Реакция экзогенной ДНК с (+)-BP-7,8-диолом в присутствии разбавленного раствора сигаретного дыма (CSS). 2 мл ДНК тимуса теленка (3 мг/мл) добавили к 5 мл разбавленного в 20 раз CSS и подвергали реакции на протяжении 2 ч при комнатной температуре с (+)-BP-7,8-диолом (конечная концентрация 3,6 мкМ) согласно следующему уравнению реакции: ДНК + [(+)-BP-7,8-диол] + CSS(-)-анти-BPDE-N2-dG. Измеряли уровень образовавшегося (-)-анти BPDE-dG аддукта (см. ниже). В качестве контроля эксперимент провели без CSS. Условия клеточной культуры и обработка. Человеческую линию клеток карциномы груди MCF-7 выращивали в 150-см 2 матрасе клеточной культуры при общем объеме 20 мл минимальной поддерживающей среды E-MEM, дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка), 15 мМ буфера Hepes (N-2 гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) и антибиотиками (200 ед./мл пенициллина, 200 мкг/мг стрептомицина и 25 мкг/мл ампициллина). Клетки выдерживали и обрабатывали при 37C в атмосфере CO2 5%/95% воздуха. После того как клетки MCF-7 покрыли 90% площади поверхности матрасов (через 2-3 дня после-4 015759 разъединения слитой культуры), среду заменили 20 мл свежей среды, содержащей 10% сыворотки. Через 24 ч клетки около слитого слоя, например более 90% клеток в фазе G0/G1, обработали только DMSOa) Обработка клеток MCF-7 (+)-BP-7,8-диолом и сигаретным дымом. Клетки обрабатывали на протяжении 2 ч только (+)-BP-7,8-диолом (0,2 мкМ) или в присутствии CSS с разными разбавлениями. (+)BaP-7,8-диол активировали при помощи ROO, полученного из CS и ЦОГ клеток, для образования (-)анти-BPDE-dG и (+)-syn-BPDE-dG соответственно. Их уровни определяли при помощи образования BPтетрола I-1 и BP-тетрола II-2 (см. ниже и фиг. 3).b) Эксперименты воздействия времени/дозы на BP. Для характеристики воздействия времени/дозы на уровни BP и BPDE-dG клетки (10106 клеток/150 см 2 матрас, общий объем 20 мл) обрабатывали средой, содержащей конечную концентрацию 1,25, 2,5 и 5,0 мкМ, каждые 6, 12, 18 и 24 ч (два матраса/доза/момент времени). BPDE-dG аддукт, образованный в клетках, увеличивается линейно в зависимости от дозы и времени, что также было показано другими (30). На основании полученных результатов выбрали значение 2,5 мкМ в качестве рабочей концентрации для BP.c) Обработка MCF-7 клеток BP и сигаретным дымом. Чтобы увидеть эффект концентрации CS,опыт A по схеме 1 выполнили при различных разбавлениях CSS (1:79; 1:39; 1:19; 1:9 об./об.). На основании результатов, полученных в данном эксперименте I, разбавление 1:19 (об./об.) выбрали как рабочую концентрацию CS. Таким образом, клетки (см. выше "Клеточная культура и обработка") обработалиBP (2,5 мкМ) и CSS (разбавление 1:19 об./об.) по схеме 1 (см. фиг. 6 - схема 1). Все серии инкубации повторили 2-3 раза с двойными образцами. В конце обработки клетки исследовали микроскопически по морфологическим изменениям, затем собрали трипсинизацией с 0,05% трипсин-EDTA (0,05% трипсина, 0,14 М NaCl, 3 мМ KCl, 0,1 М Na2HPO4, 1,5 мМ K2HPO4, 0,5 мМ EDTA). После добавления равного объема среды, содержащей 10% FCS клетки центрифугировали при 1000 г,промывали трижды ФСБ и затем дебрис хранили замороженным при -20C. Жизнеспособность клеток,обработанных BP и сигаретным дымом или (+)-BP-7,8-диолом и сигаретным дымом, составляла приблизительно 90% собранных, как определено при помощи метода освобождения трипанового синего. Применяемые дозы не показывали никакой цитотоксичности при измерении с помощью анализа активности лактатдегидрогеназы (набор ELISA, Boehringer, Mannheim). Получение и гидролиз ДНК. Выделение ДНК из дебрисов MGF-7 проводили при помощи обработки РНКазой, протеиназой K, метода засаливания (31) и хлороформа. Кратко, дебрисы повторно суспендировали в буфере EDTA-додецилсульфата натрия (SDS) [10 мМ Tris буфера, 1 мМ Na2EDTA, 1% SDS(вес./об.), pH 8], инкубировали в течение 1 ч при 37C с РНКазой T1 (2000 ед./мл) и РНКазой A (без ДНКазы; 100 мкг/мл) на шейкере (100 rpm). Затем добавили протеиназу K (300 мкг/мл) и инкубацию продолжали в течение ночи при 37C. После расщепления добавили 6 М NaCl до конечной концентрации 1 М с последующим центрифугированием при 10000 g. ДНК в супернатанте осадили с 2 об. этанола, промыли 70%, 100% этанолом, эфиром, высушили и растворили в 10 мМ Tris буфере. Снова добавили РНКазу A (100 мкг/мл) и РНКазу T1 (2000 ед./мл) и раствор инкубировали при 37C 1 ч, а затем с протеиназой K (100 мкг/мл) еще 2 ч при 37C. Раствор экстрагировали один раз с хлороформом, центрифугировали и растворили 1 М NaCl. ДНК осадили 2 об. холодного этанола. Часть ДНК для гидролиза промыли 100% этанолом для удаления несвязанных BP-тетролов. ДНК,без несвязанных BP-тетролов, растворили в воде и концентрацию ДНК определяли при помощи спектрофотометрии с длиной волны A260 нм. Чистоту устанавили при помощи соотношений при A260/A280 иA260/A230. Количество ДНК для анализа гидролизировали, как описано ранее, инкубацией при 90C в течение 4 ч при конечной концентрации 0,1N HCl. Это высвобождает тетролы (фиг. 3) из аддуктов BPDEДНК с 90% восстановлением. Объем изготовленного гидролизата для инъекций был равен 700 мкл, содержащий 5-10 мкг ДНК. Определения уровня аддукта BPDE-N2-dG. Уровни аддукта определяли при помощи ВЭЖХ-FD, как описано ранее [32, 33], с применением r-7,c-9,t-8,t-10-тетрагидрокси-7,8,9,10-тетрагидробензо(а)пирен(BP-тетрол II-1) в качестве внутреннего стандарта [34]. Гидролизат загрузили в блок предколонки Latex(HD-Germany), содержащий 5 мкм обратно фазового материала C18 (Nucleosil 100), уравновесили 10%MeOH и промыли в течение 20 мин 12 мл 10% MeOH. Затем предколонку переключили посредством клапана переключателя измерительного прибора Valco для протекания через 4,6 мм 25 см 5 мкм C18 обратно фазовую аналитическую колонку (Nucleosil 100) (Alltech GmbH, Unterhaching, Germany). Продукты, полученные гидролизом, элюировали следующим градиентом MeOH/H2O: 50%, 0-17 мин; 50-60%,17-32 мин; 60%, 32-42 мин; 60-100%, 42-57 мин. Время удерживания BP тетролов составляло: BP тетролI-1 (trans-анти-BP-тетрол) (35,2 мин); BP-тетрол II-1 (trans-syn-BP-тетрол), внутренний стандарт (36,9 мин); BP тетрол II-2 (cis-syn-BP-тетрол) (42,3 мин). Флуоресценцию оценивали при длине волны возбуждения 344 нм и длине волны излучения 398 нм. Поскольку не определили образование BP тетрола II-1 при сепаратном анализе образцов MCF-7, его применяли как внутренний стандарт (2 пг добавили в каж-5 015759 дый цикл ВЭЖХ) для подтверждения относительного времени удерживания. Предел обнаружения составлял 0,5 пг BP тетрола I-1 и BP-тетрола II-1. Уровень каждого BP-тетрола определяли с помощью стандартной кривой, полученной по площади пика флуоресценции подлинного стандарта BP-тетрола,который анализировали как раз перед анализом образцов MCF-7. Определенный BP-тетрол-I-1 получен после гидролиза (+)-анти-BPDE-ДНК аддукта. Гидролиз (-)-анти-BPDE-dG приводит к образованию BPтетрола I-2, который, тем не менее, является неустойчивым и превращается в BP-тетрол I-1 (фиг. 3) (38). Таким образом, уровень образованного (-)-анти-BPDE-dG измеряли количеством BP-тетрола I-1, выявленного в циклах ВЭЖХ. В результате выяснили, что BPDE при реакции с ДНК дает в первую очередьBPDE-N2-dG (7), полагают, что уровень BP-тетрол-I-1 соответствует этому BPDE-N2-dG. Уровень BPDE,что связывается с ДНК MCF-7, определяли количественно в двух повторностях. Уровень аддукта рассчитывали по уравнению 1 пмоль/мг ДНК/3,125 = 1 аддукт на 106 нуклеотида. Циклы ВЭЖХ воспроизвели количественно и изменчивость между двумя испытаниями составили менее 5%. Механизм мутагенеза при помощи BP достаточно хорошо известен и назван "молекулярная сигнатура" для установления причинных отличий между определенными генетическими событиями в развитии опухолей и канцерогенным воздействием ("дымящееся оружие"). "Молекулярная сигнатура ВР" имеет главное значение для точного определения табачного дыма как причины рака легких человека и для разработки конкретных принципов для минимизации курения табака или для введения мер предосторожности. Специфические средства, применяемые в хемопрофилактике рака, очевидно, действуют путем ингибирования повреждения ДНК канцерогеном, мутагенеза, активации опухолей и/или распространения опухолей. Объяснили относительную роль CS на биотрансформацию BP-7,8-диола до BPDE, который способен образовывать устойчивый аддукт ДНК в клетках человека. Многочисленные исследования показали,что устойчивые аддукты РАН-ДНК могут привести к мутациям через ошибку включения нуклеотидов или делеции. CS представляет собой аэрозоль сложной химической композиции, содержащей как органические, так и неорганические соединения, из которых пока было идентифицировано только 4800. Известно, что и газообразная фаза, и фаза частичек дыма несет свободные радикалы. В то время как радикалы в газовой фазе в основном быстро распадаются, радикалы в фазе с частичками дыма относительно устойчивы и состоят из гидрохинона, семихинона, комплекса хинона, этот комплекс является активной окислительно-восстановительной системой, которая способна восстанавливать молекулярный кислород до супероксида, что в результате дает перекись водорода и гидроксильные радикалы. Кроме того, по меньшей мере 60 различных канцерогенов CS были вовлечены в инициацию и развитие опухоли; самым сильным канцерогенным агентом, содержащимся в CS, является BP и NNK (4-(метилнитрозамино)-1-(3 пиридил)-1-бутанон). Влияние сигаретного дыма на (+)-анти-BPDE-dG с применением бесклеточной системы, сопровождающееся аддукцией ДНК. Для объяснения механизма образования BPDE-dG, зависимого от активного кислорода, образованного из сигаретного дыма, искали этот аддукт в бесклеточной системе in vitro, которая сопровождается аддукцией ДНК. Раствор CSS, содержащий газообразную фазу и радикалы смолы сигаретного дыма, реагировал непосредственно с ДНК в присутствии (+)-BP-7,8-диола (см. протокол выше). Результаты этого эксперимента показали, что CS может окислять (+)-BP-7,8 диол до (-)-антиBPDE, который, в свою очередь, образует (-)-анти-BPDE-dG аддукт. Количество (-)-анти-BPDE-dG повысилось линейно и в зависимости от дозы (см. фиг. 2). Ранее обнаружили, что большие количества активного кислорода, такого как H2O2 и O-2, были образованы из сигаретного дыма после улавливания дыма в ФСБ. Этот активный кислород, образованный из сигаретного дыма, мог быть причиной наблюдаемого образования (-)-анти-BPDE-dG. Для подтверждения этого, проверили влияние каталазы и супероксиддисмутазы (SOD) на полученный (-)-анти-BPDE-dG,и обнаружили, что оба фермента ингибируют образование аддукта. Инактивированная каталаза не показала никакого влияния (табл. 1). В результате этого пришли к выводу, что сигаретный дым может окислять (+)-BP-7,8-диол, образуя, тем самым, (-)-анти-BPDE-dG, и что такую способность можно объяснить в основном действием кислорода, образованного из сигаретного дыма. Влияние сигаретного дыма на аддукт (-)-анти-BPDE-dG, образованный в клетках MCF-7, обработанных (+)-BP-7,8-диолом. Показали, что два независимых пути метаболизма принимают участие в метаболизме BP-7,8-диола до BPDE (фиг. 3). Зависимый от цитохрома P450 метаболизм (+)-энантиомера предпочтительно приводит к (+)-syn-BPDE, тогда как путь метаболизма, включающий гемм-содержащие белки в конъюгации с пероксидом (например, пероксид липида) предпочтительно дает в результате (-)анти-BPDE. С другой стороны, (-)-BP-7,8-диол может быть метаболизирован по обоим путям метаболизма и приводить к образованию (+)-анти-BPDE, конечной формы ВР, и (-)-syn-BPDE. Разные пути метаболизма можно отличить анализом ВЭЖХ, поскольку тетролы, полученные из анти- и syn-BPDE соответственно, четко разделяются при условиях данного эксперимента. Для исследования дополнительной роли зависимой от сигаретного дыма эпоксидации (+)-BP-7,8 диола, приводящей к образованию (-)-анти-BPDE, что образует с ДНК (-)-анти-BPDE-dG аддукт, использовали человеческую линию клеток груди MCF-7. Причиной, по которой применяли клетки MCF-7, чтобы увидеть влияние сигаретного дыма ROS на активацию (+)-BP-7,8 диола, являлось то, что эти клетки-6 015759 имели небольшую активность пероксидазы. Клетки обработали (+)-BP-7,8-диолом, стереохимическая проба которого может распознать аддукты, образованные зависимыми от ROS и ЦОГ путями метаболизма (фиг. 3). На хроматограммах наблюдали два отдельных пика, соответствующих BP-тетролу I и BPтетролу II, происходящим от (-)-анти-BPDE-dG и (+)-syn-BPDE-dG соответственно (см. 32-34). Сигаретный дым увеличил линейно и в зависимости от дозы зависимое от ROS образование (-)-анти-BPDE-dG(фиг. 4a) и снизил зависимое от ЦОГ образование аддукта (+)-syn-BPDE-dG, измеренного образованиемBP-тетрола II. Это увеличение также зависит от дозы, и обращение аддуктов ДНК повышалось линейно с концентрацией сигаретного дыма (4b). Ингибиторный эффект CS на зависимое от ЦОГ образование (+)syn-BPDE-dG и повышенное образование (-)-анти-BPDE-dG аддукта подтверждает роль кислорода, образованного из сигаретного дыма при образовании(-)-анти-BPDE-dG аддукта. Другие изучения показали, что повышенная активность ЦОГ ослаблялась окислительными проверками. Механизм, лежащий в основе такого феномена, может быть понижающим регуляцию гена цитохрома P4501A1. Наличие небольшой активности пероксидазы может привести клетки MCF к состояниям"нагрузки" для повышенного повреждения ДНК и пониженной емкости производительности. Следовательно, это может являться причиной увеличения аддуктов BPDE-DHA независимо от активации BP-7,8 диола. Влияние сигаретного дыма на аддукт BPDE-dG, образованный в клетках, обработанных BP. В предыдущих исследованиях с клеточными культурами MCF-7 выявили, что эти клетки обладают индуцируемой P4501B1 и P4501A1 активностью. Присутствие P450 катализированного метаболического обменаBP и отсутствие поддающейся обнаружению пероксидазной активности в клетках MCF-7 позволяют оценить роль радикалов кислорода сигаретного дыма на активацию BP в культурах клеток человека. Клетки MCF-7 имеют высокую активность ферментов ЦОГ 1A1 для метаболитической активации ВР, что ведет к образованию (-)-BP-7,8-диола и вследствие этого к (+)-анти-BPDE-dG (фиг. 1). Уровень образования аддукта за 6 ч был значительно ниже, чем наблюдаемый через 12 и 24 ч воздействия. После обработки 2,5 мкМ BP в течение 6 ч образовалось приблизительно 2000 пг аддуктов на мг ДНК, поскольку более чем 11000 пг и более чем 20000 пг аддуктов на мг ДНК присутствовали через 12 и 24 ч соответственно (критерий суммы рангов Вилкоксона дал p=0,0022). Клетки обрабатывали в течение 12 и 18 ч BP для индукции образования (-)-BP-7,8-диола, который является субстратом для ROS. Непрямым подтверждением предпочтительного образования (-)-BP-7,8 диола являлось отсутствие BP-тетрола II, происходящего из syn-BPDE, в циклах ВЭЖХ, предшественником которого является (+)-BP-7,8-диол (фиг. 3). Затем клетки подвергали 2-часовой обработке CSS сигаретного дыма вместе с BP. Циклы ВЭЖХ показали, что существует только один пик на хроматограммах,который отвечает BP-тетролу I, происходящему из (+)-анти-BPDE-dG. Отличие между клетками, обработанными CSS и необработанными (контроли), представлено на фиг. 5. Как упоминалось выше, линия клеток, применяемая в данном исследовании, поддерживала способность к более низкой экспрессии ЦОГ 1A1 после окислительной стимуляции CS. Подавление цитохрома P450 предположительно снижает активацию BP к (-)-BP-7,8-диолу и (+)-анти-BPDE. Таким образом, усиленный отличительный признак посредством CS происходит из-за усиленного метаболизма (-)-BaP-7,8-диола при помощи ROS, образованного от CS. Критерий суммы рангов Вилкоксона дал p=0,0022 для обработки CS против контролей на протяжении 14 ч и 20 ч соответственно. Последнее опасное повреждение BP ДНК происходит в бронхиальных эпителиальных клетках человека с образованием BPDE-dG аддукт, который можно рассматривать как "критический" для инициирования раковых бронхиальных эпителиальных клеток легких человека. Таким образом, активные формы кислорода, образованные в сигаретном дыме, могут играть важную роль в образовании этого "критического" аддукта в бронхиальных эпителиальных клетках (фиг. 1). Влияние фильтра, содержащего экстракт розмарина, на образование BPDK-dG аддукта. Траву и масло розмарина (Rosmarinus officinalis Labiatae) обычно применяют как специи и ароматизирующие средства в пищевой промышленности из-за их приятного аромата и высокой антиоксидантной активности. Местное нанесение экстракта розмарина, карназола или урсоловой кислоты на кожу мыши ингибирует ковалентное связывание бензо(а)пирена с эпидермальной ДНК, инициацию опухоли 7,12 диметилбенз(а)антраценом (DMBA), активацию TPA-индуцированной опухоли, активность орнитин декарбоксилазы и воспаление. Доказали, что экстракты розмарина являлись эффективными не только в фазе активации, а также в фазе инициации. Экстракты розмарина, карнозная кислота и карнозол сильно ингибируют фермент фазы I, активности ЦОГ 450 и индуцируют экспрессию фермента фазы II, активности глутатион S-трансферазы (GST) и хинон-редуктазы. Карнозол ингибирует продуцирование окиси азота (NO) в активированном макрофаге. Антиоксидантное свойство упоминалось как механистическая основа их защитных эффектов. С целью удаления свободных радикалов и активных форм кислорода в сигаретном дыме небольшое количество порошкообразного розмарина включили в стандартный фильтр (см. Материалы). Уменьшение свободных радикалов в конденсате, вызванное фильтрами, включающими экстракт розмарина,оценивали количественное содержание гидроксильного радикала CSS со спиновой ловушкой (TNPO) с помощью LC-ESI-MS/MS. При используемых условиях курения наблюдали 30% снижение гидроксильных радикалов. Благодаря эффективности этого фильтра для снижения уровня свободных радикалов в-7 015759 сигаретном дыме по сравнению с сопоставимым стандартным фильтром Marlboro без добавки, сравнивали влияние CS, проходящего через этот фильтр, со стандартным фильтром на образование BPDE-dG с помощью клеток MCF-7. Результаты, представленные на фиг. 6, получили, когда клетки MCF-7 обработали BP. Выполнили две группы экспериментов (A и B). Клетки обрабатывали BP в течение 12 и 18 ч соответственно, а затемCSS из двух фильтров еще 2 ч вместе с BP (схема 1). Для оценки зависимого от ЦОГ увеличения аддукта в течение этих последних 2 ч выполнили два контроля для каждой группы: 12 и 14 ч для группы A, 18 и 20 ч для группы B. CSS из стандартного фильтра удваивает связывающий уровень, полученный за 14 и 20 ч. Тем не менее, фильтр с розмарином сильно препятствует увеличению, полученному при стандартном фильтре, на более чем 70% в двух группах (фиг. 6). Модифицированный фильтр поглощает ROS и,следовательно, снижает активацию (-)-BP-7,8-диола (фиг. 3). Помимо уменьшения свободных радикалов,порошкообразный розмарин также может иметь другие механизмы для снижения образования BPDE-dG. Применение всего экстракта розмарина (6 мкгмл-1) также ингибирует активность ЦОГ 1A1 и образование аддукта ДНК до 80% через 6 ч совместной инкубации с 1,5 мкМ BP в бронхиальных эпителиальных клетках человека (BEAS-2B). Таким образом, применение фильтров, которые снижают количество свободных радикалов для снижения образования опасного онкогенного аддукта, является значительным преимуществом для постоянных курильщиков. Сигаретный фильтр с розмарином по данному изобретению, таким образом, является перспективным кандидатом для хемопредупреждающих программ с целью снижения BPDE-dG в бронхиальных эпителиальных клетках. Будет понятно, что вышеизложенное описание данного изобретения допускает различные модификации, изменения и адаптации, которые охватываются значениями и диапазоном эквивалентов приложенной формулы изобретения. Самой очевидной модификацией, например, является применение различных гелевых материалов в качестве электрочувствительной композиции веществ. Таким образом, будет видно, что вышеизложенные цели, среди тех, что очевидны из предыдущего описания, эффективно достигнуты, и, так как определенные изменения могут быть сделаны при проведении вышеописанного способа (процесса) без отклонения от сущности и объема изобретения, предполагается, что содержание описанного выше должно толковаться как иллюстрирование, а не ограничение. Также следует понимать, что следующая формула изобретения предназначена охватить все основные и специфические признаки данного изобретения, описанные тут, и все положения объема данного изобретения, которые, как можно сказать, попадают туда. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих, включающий снижение аддуктов бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека из сигаретного дыма, образованных при курении сигареты, имеющей фильтр, причем указанный способ включает этапы, на которых пропускают сигаретный дым через фильтр, где указанный фильтр пропитан экстрактом растения семейства Labiatae,где указанный экстракт включает полифенольные соединения или их производные. 2. Способ по п.1, где растением является розмарин. 3. Способ по п.1, где экстракт получают экстракцией из спиртового растворителя или водноспиртового растворителя. 4. Способ профилактики онкологических заболеваний у курящих, включающий снижение аддуктов бензо(а)пирендиолэпоксида-dG (BPDE-dG) в легких человека из сигаретного дыма, образованных при курении сигареты, имеющей фильтр, причем указанный способ включает этапы, на которых пропускают сигаретный дым через фильтр, где указанный фильтр пропитан смесью, включающей по меньшей мере одно полифенольное соединение или его производные. 5. Способ по п.4, где смесь включает по меньшей мере одно полифенольное соединение или его производное, выбранное из группы, включающей карнозол, розманол, розмариновую кислоту и карнозную кислоту. 6. Способ по п.5, где смесь включает карнозол, карнозную кислоту, розмариновую кислоту и розманол. 7. Способ по п.6, где смесь включает карнозную кислоту или карнозол. 8. Способ по п.7, где фильтр включает от 0,5 г до 0,1 мг по меньшей мере одного полифенольного соединения или его производного. 9. Способ по п.7, где фильтр включает 0,01 г по меньшей мере одного полифенольного соединения или его производного. 10. Способ по п.7, где по меньшей мере один полифенол или его производное соединен с полимерным носителем, или находится в матрице микрокапсулы, или добавлен к волокнам фильтра.