Антиидиотипические антитела к &alpha-фетопротеину, используемые для лизиса клеток

1 Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии. Используемые в настоящее время методы воздействия на измененные, трансформированные клетки (химиотерапия, лучевая терапия) не избирательны и в одинаковой степени вредно действуют как на клетки, обуславливающие заболевание, так и на обычные, нормальные клетки организма. Известно, что антитела обладают способностью избирательно связываться с клеточными рецепторами - антигенами и, при участии компонентов комплемента, вызывать лизис таких клеток-мишеней (А. Роит, Дж. Брестофф, Д. Мейл, "Иммунология", М, "Мир", 2000 г, стр. 61-62). В настоящее время, интерес многих исследователей проявляется к особым рецепторам на поверхности клеток, служащих для взаимодействия с -фетопротеином - белком, обнаруживаемым в организме человека и животных, при росте и делении клеток при эмбриогенезе, репаративных процессах (Abelev G.I. Transplant Rev. 1974; v. 20, pp. 3-37), а также при образовании некоторых видов опухолей (Colombo M. Hepatology 1994, No.20, v.6, pp.1650). Предполагается, что антитела к рецепторам -фетопротеина могут вызвать цитотоксическое действие на измененные, трансформированные клетки, имеющие такие рецепторы. Известны исследования in vitro, указывающие на возможность оказания моноклональными антителами, избирательно связывающимися с рецептором к -фетопротеину на поверхности опухолевых клеток, прямого цитотоксического действия. Обнаружено, что антитела к рецептору фетопротеина могут повышать противоопухолевый иммунитет, усиливая антителозависимую клеточную цитотоксичность клеток-эффекторов в отношении опухолевых клеток. Введение в организм реципиента антител к рецепторам -фетопротеина (структурно близким к антиидиотипическим антителам к фетопротеину) может вызвать комплементзависимый лизис клеток, имеющих такие рецепторы (Северин С.Е., Родина А.В., Ницветов М.Б. и др. Моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина для регуляции противоопухолевого иммунитета. Тезисы Второй Международной Ассамблеи "Новые Медицинские Технологии" 2000. www.apteka-expo.ru). Вместе с тем, иных сведений об использовании антиидиотипических антител к фетопротеину для избирательного, комплементзависимого лизиса измененных клеток не обнаружено. Сущность предлагаемого изобретения по использованию антиидиотипических антител для избирательного, комплемент-зависимого 2 лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, заключается в введении в организм реципиента антиидиотипических антител к -фетопротеину человека или животных, причем в осуществлении комплементзависимого лизиса измененных клеток-мишеней участвуют компоненты комплемента, имеющиеся в крови и физиологических жидкостях организма реципиента, а при использовании антиидиотипических антител к-фетопротеину наружно, для импрегнации слизистых тканей и кожи реципиента, дополнительно к антиидиотипическим антителам к фетопротеину добавляют необходимые в этом случае компоненты комплемента. В ходе экспериментальной проверки особенностей использования антиидиотипических антител к -фетопротеину установлено, что указанные антитела проявляют сродство только к особым морфологическим структурам на поверхности измененных клеток и не проявляют специфичности к структурам клеточных поверхностей нормальных, не измененных клеток тканей человека и животных. Предлагаемое использование антиидиотипических антител к -фетопротеину человека и животных позволяет осуществлять in vivo и invitro избирательный, комплементзависимый лизис клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, в том числе опухолевых, без какого-либо влияния на другие, нормальные клетки организма. Получают антиидиотипические антитела к-фетопротеину известными методами, например, спиртовым фракционированием белков сыворотки крови по методу Кона (Conn Е. J. 1950), после предварительной иммунизации человека или животных клеточными рецепторами или антителами к генно-инженерному или природному -фетопротеину. Изобретение поясняется фотографиями,где на фиг. 1 показано сосудистое образование у пациента; на фиг. 2-5 представлена динамика процесса разрушения новообразования; на фиг. 6-9 - изменение новообразования при воздействии смеси из равных количеств антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента; на фиг. 10-15 - результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом. Используют антиидиотипические антитела к -фетопротеину для избирательного, комплементзависимого лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток организма следующим образом. Пример 1. Больной Г., возраст 56 лет, (амбулаторная карта 5117006), пациент поликлиники МВД г. Алматы, стоит на учете у врача онколога. 3 Больному Г. в 1993 г. была проведена близкофокусная рентгенотерапия по поводу базалиомы кожи лба, справа. В 1993 г. проведено оперативное лечение по поводу гиперкератоза левой ушной раковины, цитологическое заключение: плоскоклеточный рак. При осмотре онкологом больного Г. в 1994 г. отмечалось два места гиперкератоза кожи на шее справа, которые к концу 1998 г. слились между собой в единое новообразование, размером 1,5 х 0,9 х 0,8 см, выступающее над уровнем кожи шеи,хорошо различимое на фиг. 1. Кроме того, под кожей, на груди больного Г., в районе левого соска, имелось сосудистое образование размером 0,6 х 0,7 см, выступающее на 0,7 см (фиг. 1). В период времени с 1994 г. по декабрь 1998 г. больному Г. лечения по поводу новообразований не проводилось. Для воздействия на новообразования, локализованные на коже шеи и в районе левого соска больного Г., использовали смесь из равных количеств антиидиотипических антител к-фетопротеину и полного набора компонентов комплемента. Указанной смесью пропитывались небольшие марлевые тампоны, которые накладывались непосредственно на новообразования в районе шеи и соска, тампоны сверху покрывались полиэтиленовой пленкой для снижения скорости высыхания, закреплялись при помощи полосок лейкопластыря и оставались на теле на 2 ч. Указанная процедура проводилась два раза в день в течение одного месяца. В течение указанного периода времени происходило разрушение новообразования на шее больного Г. и отделение его верхней части от уровня кожи. Динамика процесса разрушения новообразования на коже шеи показана на фиг. 2-5. Микроскопическое исследование отделившейся части новообразования от кожи шеи показало наличие в изучаемом материале массы кератина с кальцинатами и подвергнутых лизису "клеток - теней". Опухолевых клеток в отделившейся части не найдено (биопсия 500 от 29.01.1999 г.). На основании результатов микроскопического исследования хирургически иссеченного основания новообразования на коже шеи поставлен диагноз: кератоакантома с дисплазией эпителия и начальной малигнизацией (биопсия 1496 от 08.02.1999 г.). На фиг. 6-9 показаны результаты месячного воздействия смеси из равных количеств антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование на коже груди в районе левого соска больного Г. 4 Как видно из данных фиг. 6-9, в ходе воздействия смеси из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование в районе соска, изменений,в форме или его геометрических размерах не отмечено, так как оно находилось под нормальными, не измененными клетками эпителия кожи, на которые смесь из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента не действует, т.е. имеет место избирательный лизис только измененных, опухолевых клеток и абсолютная нейтральность смеси из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента к нормальным клеткам эпидермиса. В ходе микроскопического исследования хирургически иссеченного новообразования под эпителиальными клетками кожи груди, в районе левого соска. установлено: изменение клеток ткани кровеносного сосуда - гемангиома (биопсия 1496 а от 08.02.99 г.). Пример 2. В экспериментах in vivo по введению в организм антиидиотипических антител к фетопротеину одной группе лабораторных крыс, из шести животных, с привитой асцитной опухолью яичников, подкожно, в течение трех дней вводили по 0,5 мл изотоничного раствора антиидиотипических антител козы против козьих антител к -фетопротеину человека с концентрацией белка в растворе 0,5 мг/мл. В качестве контрольных животных использовались крысы с привитой асцитной опухолью яичников, которым антиидиотипические антитела к -фетопротеину не вводили. На четвертый, пятый и шестой день от начала эксперимента забивали по две крысы из экспериментальной группы животных и по одному животному из контрольной. Из тел животных, при помощи пункции,извлекались клетки опухолей, из которых готовились окрашенные мазки и исследовались под микроскопом для обнаружения разрушенных лизисом клеток. Среди клеток асцитной опухоли яичников крыс из контрольной группы разрушенных клеток практически не наблюдалось, отмечалось присутствие в поле зрения одной-двух разрушенных клеток, и число таких разрушенных клеток не возрастало в последующие дни проведения эксперимента. Среди клеток асцитных опухолей яичников, выделенных из тел забитых животных экспериментальной группы, на четвертый, пятый и шестой день эксперимента, отмечалось наличие клеток-теней - следов лизиса опухолевых клеток, причем число разрушенных лизисом клеток, в поле зрения микроскопа, нарастало к концу эксперимента и достигало 8% от числа не поврежденных клеток опухоли. 5 Примерно одинаковая динамика нарастания числа клеток, подвергнутых лизису, отмечалась для клеток асцитных опухолей яичников в каждой паре забитых крыс из экспериментальной группы. Опыт проводили в двух повторностях, результаты которых совпадали между собой. Таким образом, подкожное введение животным экзогенных, "готовых" антиидиотипических антител к -фетопротеину, по принципу защиты организма "сывороткой", приводит к лизису измененных, опухолевых клеток. Работа по изучению возможности индукции в организме крыс с привитой асцитной опухолью яичников, собственных антиидиотипических антител к -фетопротеину, по принципу"вакцинации", проводилась с использованием очищенных козьих антител к -фетопротеину. Трем крысам с привитой асцитной опухолью яичников из экспериментальной группы внутрибрюшинно вводили стерильный раствор козьих антител к -фетопротеину человека. Другой группе, из трех крыс, с асцитной опухолью яичников, используемой в качестве контрольной, в тот же день внутрибрюшинно вводили равное количество стерильного раствора нормального человеческого -глобулина. На восьмой день от начала эксперимента крысы забивались, из их тел извлекались клетки опухолей, среди которых под микроскопом выявлялись клетки-тени, являющиеся признаками процесса лизиса клеток опухоли. Поиск поврежденных в результате лизиса клеток асцитной опухоли яичников среди крыс контрольной и экспериментальной групп показал, что в мазках клеток опухолей из контрольной группы имеются отдельные разрушенные клетки, тогда как в препаратах мазков клеток опухолей из экспериментальной группы крыс число разрушенных лизисом клеток асцитной опухоли яичников достигало 6%. Эксперимент проводился в двух повторностях, имевших одинаковые результаты. Этими экспериментами показана возможность индукции синтеза собственных антиидиотипических антител к -фетопротеину, на принципах "вакцинации", при введении в организм реципиента иммуногенных соединений, например антител или их Fab-фрагментов, для синтеза целевых (антиидиотипических к -фетопротеину) иммуноглобулинов. Пример 3. Исследования цитолитической активности смеси из антиидиотипических антител к фетопротеину и компонентов комплемента invitro проводились на одиннадцати видах коротко живущих культур клеток, в число которых входили клетки периферической крови пятерых больных лейкозом, клетки перевиваемой мышиной опухоли Эрлиха, клетки асцитной опу 004717 6 холи яичников, кровь больных псориазом и анемией. В качестве контроля, во всех случаях, использовались клетки периферической крови здоровых людей или гомологичных животных. Образцы клеток крови смешивали с пятикратным по объему количеством питательной среды 199, в которую однократно вводили смесь из равных количеств антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента. Инкубация препаратов клеток проводилась в СO2 инкубаторе, при 36 С. В течение инкубации из образцов клеток, через каждые 0,5 ч брались аликвоты, из которых приготовлялись мазки, для окрашивания клеток и последующей микроскопии их морфологического состояния. Установлено, что в культуре клеток периферической крови, взятой у больных псориазом,так же как и больных анемией, при инкубации их в смеси антиидиотипических антител к фетопротеину и необходимых в этом случае компонентов комплемента, у отдельных клеток имеют место нарастающие, в течение времени инкубации морфологические изменения структуры, такие как увеличение размера их ядер и образование в них глыбчатых структур хроматина. Однако гибели таких клеток в результате лизиса, в течение всего процесса инкубации не отмечалось. Обнаружение в периферической крови таких клеток, морфологическое строение которых меняется от воздействия на них антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента, может служить диагностическим признаком наличия в исследуемом организме серьезных системных нарушений. Результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом показаны на фиг. 10-15. В культуре клеток крови лейкозных больных, через три часа инкубации обнаружен избирательный лизис бластных (трансформированных) клеток, с появлением ядер-теней остается остров ядра в виде теневых очертаний - следы разрушенных лизисом клеток. Таким образом, в препаратах крови лейкозных больных на фоне достаточного количества нормальных, не измененных клеток, выявлен эффект избирательного лизиса - гибели патологически измененных бластных клеток, выражающийся в виде остаточных теней - контуров, не воспринимающих основной краситель Гимза-Романовского, окрашивающий ядерные структуры. Как видно из данных фиг. 10-15, антиидиотипические к -фетопротеину антитела и компоненты комплемента избирательно действуют только на отдельные клетки крови боль 7 ных лейкозом, тогда как другие, находящиеся рядом клетки, остаются неповрежденными. Неповрежденными, в течение всего времени инкубации, оставались и клетки крови доноров. В культурах клеток, состоящих только из измененных клеток, культивируемые раковые клетки человека или животных, наблюдалась тотальная гибель клеток в результате их лизиса. В большинстве случаев, лизис измененных клеток отмечался после трех часов инкубации их с антиидиотипическими антителами к фетопротеину и компонентами комплемента,однако гибель клеток асцитной опухоли яичников наблюдалась только после шести часов воздействия на них испытуемой смеси из антител и компонентов комплемента. 8 Таким образом, антиидиотипические антитела к -фетопротеину в сочетании с компонентами комплемента позволяют проводить in vitro и in vivo избирательный лизис измененных клеток тканей человека и животных, имеющих на поверхности клеточных стенок структуры, отличающие их от обычных клеток организма, что может быть использовано в целях диагностики,профилактики и лечения заболеваний, а также для применения в научных экспериментах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Применение антиидиотипических антител к -фетопротеину человека или животных для лизиса измененных клеток in vivo и in vitro.