Применение марганца для селективной стимуляции роста lactobacillus casei в смешанных культурах

ПРИМЕНЕНИЕ МАРГАНЦА ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЙ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА В изобретении описан способ селективной стимуляции роста бактерий из группы Lactobacillus casei в смешанной культуре, включающий добавление марганца в среду для культивирования. Указанный способ можно применять, в частности, в случае смешанных культур, объединяющих Lactobacillus(71)(73) Заявитель и патентовладелец: КОМПАНИ ЖЕРВЭ ДАНОН (FR) В изобретении описан способ стимуляции роста бактерий из группы Lactobacillus casei в смешанных культурах. Группа Lactobacillus casei включает несколько видов молочнокислых бактерий, представляющих значительный интерес для пищевой промышленности. В частности, было показано, что штаммы группыLactobacillus casei, принадлежащие видам L. casei ssp. casei, L. casei ssp. paracasei, и L. casei ssp. rhamnosus, обладают характеристиками, укрепляющими здоровье, и их используют в качестве пробиотиков в различных пищевых продуктах, включая, в том числе, молочные продукты. Если не указано иначе, термин Lactobacillus casei (или L. casei) в настоящем документе используется для обозначения всех подвидов группы Lactobacillus casei, и, в частности, упомянутых выше подвидовcasei, paracasei и rhamnosus. Недостатком использования бактерий группы Lactobacillus casei в производстве кисломолочных продуктов является их медленный рост в молоке. Время ферментации L. casei при использовании в чистых культурах очень велико и является лимитирующим фактором в промышленном производстве. В производстве пробиотических молочных продуктов бактерии Lactobacillus casei часто объединяют с другими видами молочнокислых бактерий, пробиотическими и не только. Во многих случаях их объединяют с йогуртными бактериями (Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus или ssp. lactis), которые придают особые органолептические свойства (такие как консистенция и вкус) ферментированному продукту. Йогуртные бактерии в молоке растут быстрее, чем Lactobacilluscasei, позволяя таким образом ускорить общий процесс ферментации. Быстрое подкисление среды такими йогуртными бактериями ограничивает, однако, рост L. casei в смешанной культуре и, соответственно,величину их популяции в конечном продукте. Авторы изобретения выявили, что добавление марганца в смешанную культуру Lactobacillus casei с другими молочнокислыми бактериями, в частности, с йогуртными бактериями, стимулировало рост L.casei, при этом воздействия на другие молочнокислые бактерии не наблюдалось. Целью изобретения, таким образом, является использование марганца для селективной стимуляции роста бактерий из группы Lactobacillus casei в смешанной культуре, содержащей молочнокислые бактерии, не принадлежащие к группе Lactobacillus casei. Более конкретно, изобретение относится к способу селективной стимуляции роста бактерий из группы Lactobacillus casei в смешанной культуре, содержащей молочнокислые бактерии, не принадлежащие к группе Lactobacillus casei, где указанный способ включает:b) инокуляцию указанной ферментационной среды бактериями;c) ферментацию инокулированной среды вплоть до достижения желаемого целевого рН;d) прекращение ферментации и сбор продукта ферментации. Бактерии группы Lactobacillus casei предпочтительно выбирают среди видов L. casei ssp. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus. Молочнокислые бактерии, не принадлежащие к группе Lactobacillus casei предпочтительно выбирают среди Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis и Streptocccus thermophilus. Ферментационная среда предпочтительно является молочной ферментационной средой, т.е. жидкой средой, основу которой составляет молоко. Источниками могут служить как животные, так и растительные виды молока. Предпочтительным, однако, является коровье молоко. Это может быть цельное, частично или полностью обезжиренное молоко, например, восстановленное из порошкового молока. Среда также может содержать фракции молока, например, сыворотку, или смесь двух или более молочных фракций. Предпочтительно указанная среда будет использоваться без других добавок, кроме марганца. Она может, однако, в некоторых случаях содержать такие ингредиенты, как сахара, крахмал, загустители и т.д., если эти ингредиенты не мешают росту одного или нескольких штаммов смешанной культуры, и если они годятся для потребления людьми или животными. Перед инокуляцией штаммами Lactobacillus указанную среду обычно стерилизуют. Стерилизацию проводят известными способами, такими как термическая обработка. рН ферментационной среды перед инокуляцией бактериями предпочтительно составляет от 5,5 до 7, более предпочтительно приблизительно 6,4. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения ферментационная среда содержит по меньшей мере 0,1 мг/л, более предпочтительно от 0,5 до 100 мг/л марганца. В общем случае она будет содержать от приблизительно 5 и до приблизительно 60 мг/л марганца. Марганец добавляют в ферментационную среду в форме пищевой марганцевой соли в надлежащем количестве до получения указанных выше конечных концентраций аниона марганца. Примеры пищевых марганцевых солей, которые можно использовать в способе по изобретению, включают хлорид марганца, оксид марганца,сульфат марганца, цитрат марганца, глицерофосфат марганца, глюконат марганца и т.п. В случае молочной ферментационной среды, принимая во внимание количество марганца, естественным образом присутствующего в молоке (которое приблизительно составляет 0,050,02 мг/л) количество добавляемого марганца будет составлять по меньшей мере 0,05 мг, предпочтительно по меньшей мере 0,45 мг. Марганцевую соль можно добавлять в ферментационную среду до инокуляции бактериями или одновременно с вышеуказанной инокуляцией. Преимущественным образом, его также можно добавлять в инокулят L. casei во время его получения, например, его можно добавлять после концентрирования выращиваемых бактерий и перед тем, как замораживать концентрат. В этом случае количество марганца в инокуляте будет, как правило, составлять от 0,5 до 4,5 мг/мл. Как правило, количество инокулируемых в среду бактерий группы Lactobacillus casei составляет по меньшей мере 104 КОЕ/мл, предпочтительно от 5104 до 11010 КОЕ/мл, более предпочтительно от 106 до 108 КОЕ/мл и еще более предпочтительно приблизительно 2107 КОЕ/мл. Молочнокислые бактерии, не принадлежащие к группе Lactobacillus casei, инокулируют в среду в количестве от 103 КОЕ/мл до 109 КОЕ/мл, предпочтительно от 105 до 108 КОЕ/мл, более предпочтительно от 106 до 107 КОЕ/мл и еще более предпочтительно приблизительно 5106 КОЕ/мл. Более конкретно, при использовании смешанной культуры L. casei и йогуртных бактерий, Streptococcus thermophilus инокулируют в среду в количестве от 105 КОЕ/мл до 108 КОЕ/мл, предпочтительно от 106 до 107 КОЕ/мл, более предпочтительно приблизительно 5106 КОЕ /мл, a Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus и Lactobacillus delbrueckii ssp lactis инокулируют в среду в количестве от 104 КОЕ/мл до 108 КОЕ /мл, предпочтительно от 105 до 107 КОЕ/мл, более предпочтительно приблизительно 106 КОЕ/мл. После инокуляции в молочную среду проводят ферментацию при обычных условиях, подходящих для роста инокулированных бактерий. Температура ферментации, как правило, составляет от 15 до 45 С, предпочтительно от 25 до 43 С,наиболее предпочтительно приблизительно 36 С. Ферментацию прекращают, когда ферментационная среда достигает желаемого целевого рН и/или когда популяция Lactobacillus casei достигает желаемой целевой величины. Как правило, целевой рН составляет от 3,7 до 4,9, предпочтительно от 4 до 4,8, наиболее предпочтительно приблизительно 4,6. Целевая величина популяции Lactobacillus casei превышает, как правило, величину конечной популяции бактерий Lactobacillus casei, полученной в тех же условиях при отсутствии марганца, по меньшей мере в 1,1 раза, предпочтительно по меньшей мере в 1,3 раза и, как правило, не более чем в 1,5 раза. Как правило, ферментацию останавливают, когда популяция L. casei составляет по меньшей мере 107 КОЕ/мл, предпочтительно по меньшей мере от 107 до 1010 КОЕ/мл. Изобретение также относится к ферментированному молочному продукту, полученному за счет способа по изобретению. Этот продукт, как правило, содержит в дополнение к использованным для ферментации бактериям ферментированную молочную среду, включающую добавленную марганцевую соль. Этот ферментированный молочный продукт можно использовать, в частности, как пищевой продукт или питательную добавку. Его также можно добавлять в пищевые продукты, в частности, в молочные продукты, например, в йогурты, или в диетические, фармацевтические или косметические композиции. Пищевые композиции, а также диетические, фармацевтические или косметические композиции, включающие указанный ферментированный молочный продукт, также являются частью изобретения. Настоящее изобретение далее проиллюстрировано дополнительным описанием неограничивающих примеров применения способов по изобретению. Пример 1. Селективная стимуляция роста смешанной культуры L. casei ssp paracasei и йогуртных бактерий с помощью марганца Молочную ферментационную среду получили смешиванием обезжиренного порошкового молока(среда В) моногидрата сульфата марганца до конечной концентрации 61,44 мг/л, соответствующей 20 мг/л катионов марганца. После 1 ч регидратации смесь стерилизовали путем автоклавирования в течение 15 мин при 115 С. Среду А и среду В инокулировали Lactobacillus casei ssp. paracasei DN-114 121 (3,80107 КОЕ/мл), и йогуртной закваской (DN 542 142), состоящей из: Streptococcus thermophilus DN-001 640 (106 КОЕ/мл),Streptococcus thermophilus DN-001 336 (2106 КОЕ/мл), Streptococcus thermophilus DN-001 236 (7105 КОЕ/мл) и Lactobacillus bulgaricus DN- 100 290 (105 КОЕ/мл). Ферментацию проводили при 36 С и отслеживали, измеряя снижение рН в среде для культивирования. После достижения целевого рН 4,6 ферментацию остановили, поместив препарат в 4 С. Целевой рН был достигнут после 6,1 ч ферментации в случае среды А и 6,6 ч ферментации в случае среды В. Величину популяции Lactobacillus casei ssp. paracasei измерили на J+3 посредством подсчета клеток. Подсчет клеток проводили, делая серийные разведения ферментированной среды с раствором соли триптона и высевая ее на чашки Петри с надлежащей агаровой средой: MRS Agar, содержащей 1,5 г/л BactoOXGALL (DIFCO) для Lactobacillus casei. Чашки Петри инкубировали при 37 С в течение 96 ч в анаэробных условиях (5% CO2). Величина популяции Lactobacillus casei в полученном из среды А ферментированном продукте составила 1,2108 КОЕ/мл. Величина популяции Lactobacillus casei в полученном из среды В ферментированном продукте составила 8,8107 КОЕ/мл. Величины популяций Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus не измеряли путем подсчета клеток, а определяли за счет оценки скорости процесса подкисления. Хорошо известно, что Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus растут в молоке быстрее, чем L. casei и что количество их молочнокислых продуктов непосредственно зависит от их роста. Таким образом, в настоящем изобретении отслеживание процесса подкисления соответствует отслеживанию роста Streptococcus thermophilus иLactobacillus bulgaricus. Эксперименты также провели с Lactobacillus casei ssp. paracasei DN-114 121, в такой же молочной ферментационной среде, как описана выше, без или с моногидратом сульфата марганца с конечной концентрацией 61,44 мг/л, соответствующей 20 мг/л катионов марганца. Две йогуртных закваски исследовали в сочетании с Lactobacillus casei: указанную выше DN 542 142 и DN 543 043, содержащую штамм Streptococcus thermophilus (DN-001 171) и штамм Lactobacillus bulgaricus (DN-100 182).DN 543043 инокулировали до 2106 КОЕ/мл для Streptococcus thermophilus DN-001 171; и 7104 КОЕ/мл для Lactobacillus bulgaricus DN-100 182. Ферментацию проводили при 36 С и отслеживали, измеряя снижение рН в среде для культивирования. Ферментацию остановили после достижения целевого рН приблизительно 4,6 (в случае смешанной культуры с йогуртной закваской DN 542 142), или приблизительно 4,45 (в случае смешанной культуры с йогуртной закваской DN 543 043). Величину популяции Lactobacillus casei ssp. paracasei измерили после 1 суток (J+1) и 3 суток (J+3) инкубации при 10 С. Результаты показаны ниже на фиг. 1 и 2 и табл. I и II. Таблица I Эти результаты показывают, что добавление 20 мг/л марганца не оказывает воздействия на кинетику процессов подкисления в смешанных культурах. Время, нужное для достижения целевого рН одинаково с марганцем и без марганца. С другой стороны, добавление 20 мг/л марганца селективно увеличивает размеры популяции Lactobacillus casei. В некоторых случаях популяция L. casei была выше на J+3 чем на J+1. Это можно объяснить тем фактом, что охлаждение культуры до 4 С для остановки ферментации вызывает некоторый стресс, который приводит к снижению способности к росту при посеве на чашки Петри. Через несколько суток бактерии восстанавливаются от стресса и вновь обретают способность запускать процесс роста. Пример 2: Воздействие марганца на рост смешанной культуры L. casei ssp. paracasei или L. casei ssp.rhamnosus с разными йогуртными заквасками Такие же эксперименты, как в примере 1, проводили со смешанными культурами Lactobacillus caseissp. paracasei DN-114121 или Lactobacillus casei ssp. rhamnosus DN-116010 с указанной выше йогуртной закваской DN 543043 или йогуртной закваской DN 522044, содержащей штаммы Streptococcus thermophilus (DN-001143), Streptococcus thermophilus (DN-001257) и штамм Lactobacillus lactis (DN-111224). Эксперименты проводили с такой же молочной ферментационной средой, как в примере 1, без или с моногидратом сульфата марганца с конечными концентрациями 1,54, 61,44, 184,33 мг/л, соответствующими 0,5, 20 и 60 мг/л катионам марганца.DN 522044 инокулировали до 2106 КОЕ/мл для Streptococcus thermophilus DN-001143; до 106 КОЕ/мл для Streptococcus thermophilus DN-001257; до 4106 КОЕ/мл для Streptococcus thermophilus DN001623 и до 2,5105 КОЕ/мл для Lactobacillus lactis DN-111224. Ферментацию проводили при 36 С и отслеживали, измеряя снижение рН в среде для культивирования. Ферментацию остановили после достижения целевого рН приблизительно 4,6. Величину популяции Lactobacillus casei ssp. paracasei измерили через 1 сутки (J+1) инкубации при 10 С. Результаты показаны ниже на фиг. 3, 4 и 5 и табл. III и IV. Таблица III Эти результаты показывают, что добавление 20 мг/л марганца не оказывает воздействия на кинетику процессов подкисления смешанных культур. Время, нужное для достижения целевого рН одинаково с марганцем и без марганца. С другой стороны, оно селективно увеличивает размеры популяции бактерий группы L. casei (Lactobacillus casei ssp. paracasei или Lactobacillus casei ssp. rhamnosus). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение марганца для селективной стимуляции роста бактерий из группы Lactobacillus casei в смешанных культурах, содержащих молочнокислые бактерии, выбранные из Lactobacillus delbrueckiissp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis и Streptococcus thermophilus. 2. Применение по п.1, где бактерии группы Lactobacillus casei выбраны из видов L. casei ssp. casei,L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus. 3. Применение по любому из пп.1 или 2, где бактерии культивируют в молочной ферментационной среде. 4. Способ селективной стимуляции роста бактерий группы Lactobacillus casei в смешанной культуре, содержащей молочнокислые бактерии, выбранные из Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis и Streptococcus thermophilus, где указанный способ включает:a) получение молочной ферментационной среды, содержащей по меньшей мере 0,5 мг/л марганца;b) инокуляцию указанной ферментационной среды 106-108 КОЕ/мл бактерий группы Lactobacillusc) ферментацию инокулированной среды при температуре от 15 до 45 С и вплоть до достижения желаемого целевого рН от 3,7 до 4,9; таким образом селективно стимулируя рост бактерий. 5. Способ по п.4, где бактерии группы Lactobacillus casei выбраны из видов L. casei ssp. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus. 6. Способ по любому из пп.4, 5, где величина конечной популяции бактерий группы Lactobacilluscasei в ферментированном продукте больше величины конечной популяции таких же бактерий Lactobacillus casei, полученной в тех же условиях без Mn, по меньшей мере в 1,1 раза. 7. Способ по п.6, где величина конечной популяции бактерий группы Lactobacillus casei в ферментированном продукте больше по меньшей мере в 1,3 раза. 8. Ферментированный молочный продукт, содержащий популяцию Lactobacillus casei, рост которой селективно стимулирован способом по пп.4-7, где величина конечной популяции бактерий группы Lactobacillus casei в ферментированном продукте больше величины конечной популяции таких же бактерийLactobacillus casei, полученной в тех же условиях без Mn, по меньшей мере в 1,1 раза. 9. Ферментированный молочный продукт по п.8, где величина конечной популяции бактерий группы Lactobacillus casei в ферментированном продукте больше по меньшей мере в 1,3 раза.