Ret-лиганды (retl) для стимуляции роста невральной и ренальной ткани и их применение

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют Ret-лиганд (RetL), а также к способам стимуляции роста нервной и почечной тканей путем лечения клеток и особей млекопитающих с помощью RetL-ДНК или RET-белка. Предпосылки к созданию изобретения Одна из целей настоящего исследования клеточных сигналов и рецепторной активации заключается в том, чтобы создать возможность для терапевтической модуляции процессов, участвующих в клеточном росте и жизнеспособности. Такие процессы определяют последствия различных медицинских состояний, в том числе,органную недостаточность, внутриутробное развитие и, среди других, опухолевый рост. Каждое их этих состояний считается во всем мире клинически важным и обладает ограниченным выбором эффективного лечения. Цель настоящего изобретения заключается в создании композиций и способов по усилению регенерации или жизнеспособности поврежденной ткани, а также для лечения нарушений, влекущих за собой аберрантный рост и развитие тканей. Гибель ткани или повреждаемость органа на терминальной стадии поражает миллионы людей во всем мире каждый год и существенно прибавляет расходы по уходу за здоровьем. Утрату органа или ткани обычно лечат путем трансплантации органов от доноров, путем хирургической реконструкции или с помощью технических приспособлений. Каждое из этих средств обладает недостатками. Трансплантация ограничена нехваткой доноров, хирургическая реконструкция может создавать другие долговременные проблемы, а технические устройства не могут осуществлять все функции отдельного органа, и поэтому не могут предупреждать прогрессирующую деградацию. Поэтому практическая медицина нуждается в получении новых решений этих проблем. Белковые факторы, которые влияют на рост, дифференциацию и/или жизнеспособность клеток могут быть полезны для лечения болезней органов, которые содержат клетки-мишени. Факторы или лиганды, которые взаимодействуют с рецепторами из семейства тирозинкиназного белкового рецептора (RPTK), представляют в этом отношении особый интерес. Эти рецепторы участвуют во многих клеточных программах, включающих клеточный рост и дифференцировку, а также генезис многих неоплазий. Поэтому данные факторы или лиганды, которые взаимодействуют с этими рецепторами, могут оказываться пригодными для лечения болезней некоторых органов, ткани которых были повреждены. Альтернативно, может быть полезно блокировать взаимодействие этих факторов с их рецепторами с целью блокировать опухолевый рост.Ret-протоонкоген кодирует рецепторную тирозинкиназу, которая экспрессируется во время развития разных тканей, в том числе, периферической и центральной нервной систем и почек. Аномалии, представленные в ret-нулевых мышах, предполагают, что Ret крайне необходим для иннервации энтеронейронами задней кишки, а также для пролиферации и ветвления эпителиальной ткани эмбрионального мочеточника во время развития почки (Nature 367, 380383, 1994). Поиск ключевого компонента сигнального пути Ret, Ret-лиганда, явилось частью интенсивного исследования. Краткое изложение существа изобретения В настоящем изобретении создали очищенную и выделенную молекулу ДНК, кодирующую RetL, содержащую нуклеотидную последовательность любого RetL, но специфически включающую кДНК retL1 крысы (SEQ IDNO:21). В другом варианте осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение включает последовательность ДНК, которая охватывает последовательность (кДНК неполного RetL1 человека (SEQ ID NO:8 ДНКвставки из клона HRL20, которая представляет собой АТСС No. 97604, или последовательность ДНК-вставки из клона 230-5 А-8617 (кДНКretL1 крысы (SEQ ID NO:1, которая включена в АТСС No. 98047. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, очищали и выделяли молекулу ДНК для применения в гарантированной экспрессии в прокариотической или эукариотической хозяйской клетке полипептидного продукта, который обладает, как минимум, частью первичной структурной конформации и биологической активности RetL; эта ДНК может быть а) молекулой ДНК, которая включает кДНКretL3 человека, или комплементарной цепью кДНК retL1 крысы, кДНК неполного retL1 человека, кДНК полноразмерного retL1 человека,кДНК retL2 человека, кДНК retL3 мыши или кДНК retL3 человека; b) молекулами ДНК, которые гибридизуют в строгих условиях с моле 3 кулами ДНК, указанными в а) или его фрагментах; или с) молекулами ДНК, но для вырожденного генетического кода, которые должны были бы гибридизовать с молекулами ДНК, указанными в а) и b). В рамках настоящего изобретения также очищали и выделяли молекулу ДНК,кодирующую полипептидный фрагмент или вариант RetL человека, обладающий биологической активностью RetL. Любую из рекомбинантных молекул ДНК настоящего изобретения можно присоединить путем сшивки к последовательности, контролирующей экспрессию. В рамки настоящего изобретения включены также векторы и системы доставки, которые включают молекулы ДНК или конструкции,указанные в других местах данного описания. Такой вектор может включать молекулу ДНК,кодирующую RetL или вариант RetL. Настоящее изобретение включает прокариотические или эукариотические клетки, устойчиво трансформированные или трансфецированные вектором, включающим молекулу ДНК, кодирующую нативный или вариантныйRetL. Очищенный и выделенный RetL человека,практически свободный от других белков человека, является специфическим в рамках настоящего изобретения, поскольку представляет собой способ по получению полипептидного продукта, обладающего частью или всею первичной структурной конформацией и биологической активностью RetL. Такой способ может включать стадии выращивания, в подходящих культуральных условиях, прокариотических или эукариотических хозяйских клеток, трансформированных или трансфецированных любой молекулой ДНК настоящего изобретения способом, обеспечивающим экспрессию такого полипептидного продукта и получение RetL. Включен также полипептид как продукт экспрессии ДНК в прокариотических или эукариотических клетках хозяина. Настоящее изобретение включает также белки и белковые фрагменты, варианты или производные, растворимые и мембранносвязанные. В избранных вариантах осуществления настоящего изобретения, данный белок обладает аминокислотной последовательностью,которая включает крысиный RetL1, неполныйRetL1 человека, полноразмерный RetL1 человека, RetL2 человека, мышиный RetL3 или RetL3 человека, или представляет собой вариант одной из этих последовательностей. В других вариантах осуществления настоящего изобретения данный белок представляет собой фьюжн белок,включающий Ret или RetL, слитый с другой молекулой или молекулярным фрагментом, таким как иммуноглобулин, токсин, воспроизводимое соединение или радионуклид. Включены также химерные молекулы RetL. 4 Другие варианты настоящего изобретения включают специфические моноклональные антитела к RetL настоящего изобретения. Такие антитела могут быть ассоциированы с токсином, воспроизводимым соединением или радионуклидом. Настоящее изобретение включает также гибридомные клеточные линии, которые продуцируют специфические антитела к Ret, в том числе, AA.FF9, АА.НЕ 3, AF.E9, ВА.В 1,ВВ.В 6, AA.GE7, CD.F11, АН.Е 3, CD.G4, AG.E7,BD.G6 и BH.G8, а также субклоны этих гибридом и антитела, образуемые этими гибридомами или субклонами этих гибридом. Кроме того, настоящее изобретение включает способ стимуляции роста новой ткани или стимуляции выживания поврежденной ткани у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества, которое взаимодействует с клеточным Ret и, в связи с этим, индуцирует аутофосфорилирование Ret. Данное соединение может представлять собойRet. Данное соединение может быть введено совместно с терапевтически эффективным количеством второго соединения, таким какGDNF, неуртурин или родственной GDNF молекулой. Несмотря на то, что ткани, представляющие интерес для этих способов, могут включать любую ткань, предпочтительные ткани включают ренальную ткань, невральную ткань, сердце, желудок, тонкий кишечник,спинной мозг или легкие. Субъектом для данных способов может быть человек. В другом способе настоящего изобретения,Ret-сигнальная трансдукция между первой клеткой, экспрессирующей RetL, и второй клеткой ингибируется при контактировании первой клетки с растворимым Ret-белком или с антителом к RetL. Растворимый Ret-белок может быть слитым ("фьюжн") белком. Настоящее изобретение включает также способ для мишенирования токсина, воспроизводимого соединения или радионуклида в клетке, экспрессирующей Ret, включающий контактирование данной клетки с RetL-слитым белком или антителом анти-Ret, конъюгированного с токсином, воспроизводимым соединением или радионуклидом. Данный RetL может представлять собой RetL1, RetL2 или RetL3. В другом способе супрессируется рост опухолевой клетки, которая экспрессирует Ret, на стадии данного способа, включающего контактирование данной клетки со слитым белком RetL и токсином или радионуклидом, или антителом к анти-Ret,конъюгированным с токсином или радионуклидом. Данная клетка может находиться в рамках субъекта, а белок или конъюгированное антитело быть введенным данному субъекту. В настоящее изобретение включен также способ мишенирования токсина, воспроизводимого соединения или радионуклида в клетке, 5 экспрессирующей RetL, включающий контактирование данной клетки со слитым белком,включающим Ret и токсин, воспроизводимое соединение или радионуклид, или антитело к анти-Ret, конъюгированное с токсином, воспроизводимым соединением или радионуклидом. Очередной вариант осуществления настоящего изобретения включает способ супрессии роста опухолевой клетки, которая экспрессирует RetL,включающий контактирование данной клетки со слитым белком Ret и токсином или радионуклидом или с антителом к анти-RetL, конъюгированным с токсином или радионуклидом; данная клетка может находиться в рамках субъекта, а данный белок введен данному субъекту. Для любого способа настоящего изобретения RetL может представлять собой RetLl, RetL2 или RetL3, или вариант или фрагмент RetLl,RetL2 или RetL3. В рамках настоящего изобретения рассматриваются также способы генной терапии. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения субъекта с нарушением Ret-метаболизма, включающий введение субъекту вектора, включающего молекулу ДНК, кодирующую RetL, a также способ усиления роста новой ткани у любого субъекта, включающий введение такого вектора данному субъекту. Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает способ,усиливающий выживаемость поврежденной ткани у любого субъекта, первая стадия данного способа заключается во введении терапевтически эффективного количества вектора, кодирующего RetL для данного субъекта. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 представляет собой последовательность кДНК (SEQ ID NO:1) и выведенную из нее аминокислотную последовательность (SEQID NO:2) крысиного RetL1. Данная нуклеотидная последовательность простирается от 201-й пары оснований до 1700-й пары оснований SEQID NO:1 и содержит полную открытую рамку считывания. Фиг. 2 А представляет собой неполную последовательность кДНК (SEQ ID NO:8) и установленную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:9) RetL1 человека. Данная последовательность представляет собой последовательность-вставку из клона HRL20, депонированного в АТСС 97604. Фиг. 2 В представляет собой композитную полноразмерную последовательность ДНК (SEQID NO:10) и установленную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:11) RetL1 человека. Фиг. 3 А представляет собой сравнение нуклеотидной последовательности RetL1 человека (верхний ряд последовательности) с нуклеотидной последовательностью RetL1 крысы(нижний ряд последовательности). Вертикальные линии между нуклеотидами показывают 6 тождество в позиции, а точка указывает на делецию в этой позиции. Фиг. 3 В представляет собой аминокислотную последовательность RetL1 человека (верхний ряд последовательности) с нуклеотидной последовательностью RetL1 крысы (нижний ряд последовательности). Вертикальные линии между соответствующими аминокислотами показывают тождество в позиции, а точка указывает на консервативную замену по этому остатку. Фиг. 4 А представляет собой схематическую диаграмму возможной роли Ret и RetL во взаимодействии между клеткой метанефрогенной мезенхимы и эмбриональной клеткой мочеточника. Фиг. 4 В представляет собой схематическую диаграмму способа скрининга трансфектантов кДНК-библиотеки клонов, которые экспрессирует RetL. Наличие в трансфектантах экспрессируемого RetL детектировали путем анализа связывания с этими трансфектантами слитого белка Ret/IgG или слитого белкаRet/щелочная фосфатаза. Фиг. 5 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую конструкцию плазмид, используемых для экспрессии слитого белка Ret/IgG крысы. Фиг. 6 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую конструкцию плазмид, используемых для экспрессии слитого белка Ret/IgG человека. Фиг. 7 представляет собой последовательность кДНК (SEQ ID NO:12) и установленную аминокислотную последовательность (SEQ IDNO:13) retL2 человека, которую обнаружили в клоне DSW240. Открытая рамка считывания белка находится в пределах нуклеотидов 251416. Фиг. 8 представляет собой сравнение аминокислотной последовательности RetL2 человека (верхняя линия последовательности) с последовательностью RetL1 человека (нижняя линия последовательности). Вертикальные линии между аминокислотами показывают идентичность позиции, тогда как точки указывают пробел в этой позиции. Фиг. 9 представляет собой последовательность кДНК (SEQ ID NO:16) и установленную аминокислотную последовательность (SEQ IDNO:17) RetL3 мыши. Фиг. 10 представляет собой последовательность кДНК (SEQ ID NO:20) и установленную аминокислотную последовательность (SEQID NO:21) RetL3 человека. Подробное описание настоящего изобретения Идентификационные номера последовательностей Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, указанные в настоящем описании, приведены под нижеследующими идентификационными номерами:SEQ ID NO: 21 - retL3-aa человека Определения Термин "RetL", как он используется здесь,означает любой белок, который специфически взаимодействует с рецепторным белком Ret и который при взаимодействии с Ret запускаетRet-димеризацию и/или аутофосфорилирование тирозинкиназного домена Ret. Последовательности ДНК, которые кодируют RetL и Ret назвали, соответственно, "retL" и "ret". Лиганд может быть растворимым или быть представленным в виде мембранно-связанной молекулы в одной и той же или в отличающейся клетке в виде Ret-молекулы, по которой запускается аутофосфорилирование. Для некоторых применений или взаимодействий с Ret данный лиганд может нуждаться в дополнительных молекулах для запуска аутофосфорилирования. Лиганды настоящего изобретения включают корецепторы или дополнительные лигандные кофакторы. Лиганды настоящего изобретения включают,кроме того, анти-Ret mAb, которые действуют в качестве Ret-антагонистов, запуская Ret димеризацию и аутофосфорилирование. Данный лиганд можно также модифицировать разными способами, таким, когда инкорпорируется часть слитого белка, такого как токсин или радионуклид. Под "выравниванием последовательностей" подразумевается позиционирование одной последовательности, нуклеотидной или аминокислотной, которая позиционируется с другой,что дает возможность сравнивать актуальные части данной первой последовательности с актуальными частями другой последовательности. Пример одного из способов этой методики дан у 8 1970). Этот способ может быть удобно осуществлен с помощью компьютерной программы,такой как Align-программа (DNAstar, Inc.). Специалистам в данной области понятно, что гомологичные или функциональные эквивалентные последовательности включают функционально эквивалентные расстановки цистеиновых остатков в границах консервативного цистеинового остова, включающего аминокислотные инсерции или делеции, которые изменяют линейный строй этих цистеинов, но практически не нарушают их взаимоотношения в упорядоченной структуре данного белка. Поэтому внутренние выпадения и аминокислотные вставки выбранной последовательности игнорируются в целях вычисления уровня аминокислотной гомологии или идентичности между выбранной и тестпоследовательностью. Первая характеристика,часто используемая для установления гомологии белков, представляет собой сходство численности и местоположения цистеиновых остатков между одним и другим белком. Под "клонированием" подразумевают применение in vitro рекомбинантных методик для вставки отдельного гена или иной последовательности ДНК в молекулу вектора. Чтобы успешно клонировать требуемый ген, необходимо использовать методы для получения фрагментов ДНК, присоединения фрагментов к векторным молекулам, интродуцирования составной молекулы ДНК в клетку хозяина, в которой он может реплицироваться, и селекции клона, обладающего геном-мишенью, из реципиентных клеток хозяина. Под "кДНК" подразумевают комплементарную или копийную ДНК, полученную из РНК-матрицы с помощью действия РНКзависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза). Таким образом, "кДНК-клон" представляет собой дуплексную ДНК-последовательность, комплементарную рассматриваемой молекуле РНК, переносимой в клонирующий вектор. Под "кДНК-библиотекой" подразумевают коллекцию рекомбинантных молекул ДНК, содержащих кДНК-вставки, которые вместе включают представительные молекулы мРНК,присутствующие в целом организме или ткани,в зависимости от источника РНК-матриц. Такая кДНК-библиотека может быть приготовлена методами, известными специалистам в данной области и описана выше, например, у Maniatis с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Обычно, РНК первой выделяют из клеток организма, из генома которого желательно проклонировать отдельный ген. Для целей настоящего изобретения предпочтительными являются клеточные линии млекопитающих, и особенно человека. Альтернативно, РНК может быть выделена из опухолевой клетки, полученной из опухоли животного и, предпочтительно, из опухоли человека. Следовательно, библиотека может 9 быть получена, например, из опухоли надпочечника, но может быть использована любая опухоль. Термин "полиморфизм ДНК", как он используется здесь, относится к состоянию, в котором две или несколько отличающихся нуклеотидных последовательностей могут существовать по отдельному участку в ДНК."Экспрессирующий вектор" включает векторы, которые обеспечивают экспрессию содержащихся в них последовательностей ДНК,т.е. кодирующие последовательности, присоединенные путем сшивки к другим последовательностям, улучшающим их экспрессию. Подразумевается, хотя не всегда точно оговаривается, что эти экспрессирующие векторы должны быть реплицируемыми в хозяйских организмах либо в качестве эписом, либо в качестве неотъемлемой части хромосомной ДНК. Полезно, но не необходимо, чтобы элемент эффективного экспрессирующего вектора был маркером, кодирующим последовательность, которая представляет собой последовательность, кодирующую белок, который имеет своим результатом фенотипические свойства (например, устойчивость к тетрациклину) клеток, содержащих данный белок, который позволяет таким клеткам быть легко идентифицированными. В общем,"экспрессирующий вектор" представляет собой данное функциональное определение, и любая последовательность ДНК, которая обладает способностью эффективно экспрессировать точно определенный содержащийся код ДНК,включена в данный термин, что применимо к данной указанной последовательности. Такие векторы часто бывают в форме плазмид, поэтому "плазмида" и "экспрессирующий вектор" часто взаимозаменяемы. Однако настоящее изобретение подразумевает включение также других форм экспрессирующих векторов, в том числе фагов, которые выполняют эквивалентные функции и которые, время от времени, становятся известны в данной области. Аналогично, "функциональное производное" гена любого белка настоящего изобретения подразумевает включение "фрагментов", "вариантов" и "аналогов" данного гена, который может быть "фактически сходным" по нуклеотидной последовательности и который кодирует молекулу, обладающую аналогичной активностью."GDNF-родственная молекула" подразумевает любую молекулу, которая, как минимум, на 40% гомологична GDNF или неуртурину и обладает способностью специфического связывания RetL. Термин "ген" означает полинуклеотидную последовательность, кодирующую пептид. Под "гомогенностью" подразумевается,при ссылке на пептидную или ДНКпоследовательность, что первичная молекулярная структура (т.е. последовательность амино 002544 10 кислот или нуклеотидов) практически всех молекул рассматриваемой композиции идентична. Термин "олигонуклеотид", как он используется здесь, относится к пробам, олигомерным фрагментам для детектирования, олигомерным контролям, немеченным блокирующим олигомерам и праймерам для амплификации последовательностей, определяемых в качестве молекулы, включающей более чем три дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида. Ее точный размер зависит от многих факторов, которые, в свою очередь, зависят от основной функции или использования данного олигонуклеотида. Термин "проба" относится к лиганду с известными характеристиками, способного селективно связываться с антилигандом-мишенью. Применительно к нуклеиновым кислотам, термин "проба" относится к цепи нуклеиновой кислоты, обладающей последовательностью оснований, комплементарных цепи-мишени."Рекомбинантные хозяйские клетки" относятся к клеткам, которые были трансформированы с помощью векторов, построенных с использованием методик рекомбинантной ДНК. Как здесь указано, антитело или его модификацию получали в рекомбинантной хозяйской клетке посредством этой трансформации в таких небольших количествах, или точнее, в таком малом, чем детектируемые количества, как будто бы его получали в нетрансформированном хозяине. Как он используется здесь, термин "эндонуклеазы рестрикции" и "ферменты рестрикции" относится к бактериальным ферментам,каждый из которых разрезает двухцепочечную ДНК по, или вблизи, специфической нуклеотидной последовательности. Как он используется здесь, термин "полиморфизм длины фрагмента рестрикции"("RFLP") относится к различиям между индивидуумами по длинам отдельного фрагмента рестрикции. Указанная молекула "фактически подобна" другой молекуле, если последовательность аминокислот в обеих молекулах фактически одна и та же, и если обе молекулы обладают сходной биологической активностью. Таким образом,если созданные две молекулы обладают сходной активностью, они считаются вариантами в качестве термина, который используется здесь,даже если одна из молекул содержит дополнительные аминокислотные остатки, не обнаруженные в другой молекуле, или если последовательность аминокислотных остатков не идентична. Как она используется здесь, указанная молекула является "химическим производным" другой молекулы, когда она содержит дополнительные химические составляющие, обычно не являющиеся частью данной молекулы. Такие составляющие могут улучшать молекулярные растворимость, абсорбцию, время биологической полужизни и т.д. Составляющие могут 11 альтернативно уменьшать токсичность данной молекулы, элиминировать или аттенуировать любой нежелательный побочный эффект данной молекулы и т.д. Составляющие, способные опосредовать такие эффекты, раскрыты, например,в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed.,Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980). Под "вектором" подразумевается молекула ДНК, полученная из плазмиды или бактериофага, в которой могут быть вставлены или клонированы фрагменты ДНК. Вектор будет содержать один или несколько уникальных сайтов рестрикции и может обладать способностью автономно реплицироваться в указанном хозяине или в таком репродуцируемом организмепосреднике, который клонирует последовательность. Под "фактически чистым" подразумевается любой белок настоящего изобретения или любой ген, кодирующий такой белок, который по существу свободен, соответственно, от других белков или генов, или от других контаминантов, с которыми он может быть обычно обнаружен в природе и, как таковой, существует в форме, не обнаруживаемой в природе. Соединения настоящего изобретения Настоящее изобретение включает кДНК,кодирующую RetL, такую как нуклеотидную последовательность retL1-кДНК крысы, неполную retL1-кДНК человека, полноразмернуюretL1-кДНК человека, retL2-кДНК человека,мышиную rеtL3-кДНК или retL3-кДНК человека. Кроме того, соединения настоящего изобретения включают последовательности, которые включают вышеуказанные последовательности или производные этих последовательностей. Настоящее изобретение включает также векторы, липосомы и другие транспортные средства,которые включают одну из этих последовательностей или производное одной из этих последовательностей. Настоящее изобретение включает также белки, транскрибируемые и транслируемые из retL1-кДНК крысы, неполной retL1 кДНК человека, полноразмерной retL1-кДНК человека, retL2-кДНК человека, мышиной rеtL3 кДНК или rеtL3-кДНК человека, включающие,но не ограничивающие его, RetL1 крысы, неполный RetL1 человека, полноразмерный RetL1 человека, RetL2 человека, мышиный RetL3 илиRetL3 человека и их производные и варианты. Первый вариант настоящего изобретения включает растворимые варианты RetL. В растворимом варианте отсутствует, как минимум,часть внутримембранного участка нативногоRetL. В некоторых примерах в растворимом варианте отсутствует фосфатидилинозитолгликан, входящий в состав нативного RetL. Растворимые варианты включают "фьюжн" (слитые) белки, которые охватывают производныеRetL, которым недостает фосфатидилинозитоловой части. 12 Варианты могут отличаться от природногоRetL по аминокислотной последовательности или без участия последовательности, или отличаться двояко. Варианты аминокислотной последовательности получают, когда один или несколько аминокислотных остатков в природном RetL замещены отличающейся природной аминокислотой, аминокислотным производным или неприродной аминокислотой. Наиболее предпочтительные варианты включают природный RetL или биологически активные фрагменты природного RetL, последовательности которых отличаются от последовательности дикого типа по одной или нескольким консервативным аминокислотным заменам, которые обычно обладают минимальным влиянием на вторичную структуру и гидрофобную природу данного белка или пептида. Варианты могут также обладать последовательностями, которые отличаются по одной или нескольким не консервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям, которые не нарушают биологическую активность RetL. Консервативные замены обычно включают замены одной аминокислоты на другую с аналогичными характеристиками,такими как замены в рамках нижеследующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин,изолейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин,пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин,аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Негативно заряженные(кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замены могут быть взяты из нижеприведенной таблицы, а еще одни описаны у Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure (1988). Таблица 1. Консервативные аминокислотные замены Аминокислота Код Замена на любую из Аланин А Другие варианты в настоящем изобретении представляют собой варианты с модификациями, которые повышают стабильность пептида. Такие варианты могут, например, содержать один или несколько непептидных связей (которые замещают пептидные связи) в данной пептидной последовательности. Включенными также являются: варианты, которые включают остатки иные, чем природные L-аминокислоты,такие как D-аминокислоты, или не встречающиеся в природе или синтетические аминокислоты, такие как бета- или гамма-аминокислоты и циклические варианты. Включение D- вместоL-аминокислот в данный полипептид может повышать его устойчивость к протеазам. См.,например, патент США 5 219 990. Пептиды данного изобретения могут быть также модифицированы различными изменениями, такими как инсерции, делеции и замещения, консервативными или неконсервативными, где такие изменения могут создавать определенные преимущества в их использовании. В настоящее изобретение отдельно включены варианты сплайсинга. В дополнение к фактически полноразмерным полипептидам в настоящем изобретении создали биологически активные фрагменты этих полипептидов. RetL-полипептид или фрагмент биологически активен, если он проявляет биологическую активность природного RetL. Такая биологическая активность включает способность к специфическому связыванию внеклеточного участка RetL, которая составляет, как минимум, 50% или, по крайней мере, равна по сродству природному RetL с внеклеточным участком Ret. Другая биологическая активность заключается в способности связываться с антителом к эпитопу, который присутствует в природном RetL. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, вариантах с аминокислотными заменами, которые менее консервативны, можно также получать желаемые производные, например, вызывая изменения в заряде, 002544 14 конформации и других биологических свойствах. Такие замены должны были бы включать, к примеру, замещение гидрофильного остатка на гидрофобный остаток, замещение цистеина или пролина другим остатком, замещение остатка,обладающего малой боковой цепью, на остаток,обладающий объемной боковой цепью, замещение остатка, обладающего суммарным положительным зарядом, на остаток, обладающий суммарным отрицательным зарядом. Когда результат данного замещения невозможно предсказать с уверенностью, полученные производные можно легко проанализировать в соответствии с методами, описанными здесь, для определения наличия или отсутствия желаемых характеристик. Вообще, замены, которые могут, предположительно, вызывать изменения в функциональных свойствах Ret-полипептидов, представляют собой замены, в которых: (i) гидрофильный остаток, например, серин или треонин,замещен гидрофобным остатком, например,лейцином, изолейцином, фенилаланином или аланином; (ii) цистеиновый остаток замещен на любой другой остаток; (iii) остаток, обладающий электроположительной боковой цепью,например, лизин, аргинин или гистидин, замещен на остаток, обладающий электроотрицательным зарядом, например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота; или (iv) остаток, обладающий объемной боковой цепью, например, фенилаланин замещен на остаток, не обладающий такой боковой цепью, например,глицин. Варианты в рамках объема настоящего изобретения включают белки или пептиды с аминокислотными последовательностями, обладающие, по крайней мере, шестьюдесятью процентами гомологии с RetL1 крысы (SEQ ID(SEQ ID NO:21). Более предпочтительна последовательность с гомологией, по крайней мере,восемьдесят, по крайней мере, девяносто процентов, или, по крайней мере, девяносто пять процентов. Для целей определения гомологии,длина сравниваемых последовательностей должна обычно составлять, по крайней мере, 8 аминокислотных остатков, обычно, по крайней мере, 20 аминокислотных остатков. Варианты соединений настоящего изобретения включают также любой белок, который 1) обладает аминокислотной последовательностью, которая, по крайней мере, на 40 процентов гомологична белку RetL настоящего изобретения, и у которого также 2) после оптимального выстраивания сRetL1 и RetL2 на фиг. 8) местоположение, по крайней мере, 80% цистеиновых остатков соот 15 ветствует цистеинам белка RetL настоящего изобретения. Поскольку представляется возможным заменить заместители данного остова, то можно заменить функциональные группы, которые связаны с остовом, на группы с аналогичными свойствами. Такие модификации не изменяют первичную последовательность. Изначально они должны быть консервативными, т.е. замещающая группа должна обладать, приблизительно, тем же размером, формой, гидрофобностью и зарядом, что и исходная группа. Модификации не последовательности могут включать, например, in vivo или in vitro химически произведенные части природного RetL, а также изменения в ацетилировании, метилировании,фосфорилировании, карбоксилировании или гликозилировании. В рамки настоящего изобретения включены также агенты, которые специфически связываются с белком настоящего изобретения или с фрагментом такого белка. Эти агенты включаютIg слитые белки и антитела (в том числе, одноцепочечные, двухцепочечные, Fab-фрагменты и другие, или природные, или человеческие, или от приматов, или химерные). Дополнительные описания агентов этих категорий находятся в РСТ-заявке 95/16709, описание которой включено здесь путем ссылки. Методика эксперимента Общее представление о способе Общий прием, используемый для клонирования RetL1, показан на фиг. 4 А и 4 В. Наш подход основан на той предпосылке, что, по крайней мере, RetL экспрессируется в метанефрогенной мезенхиме развивающейся почки в виде мембранного белка (хотя представляется возможным, что данный лиганд экспрессируется также в растворимой форме; фиг. 4 А). RetL взаимодействует в эмбриональной клетке мочеточника с Ret-рецептором, активирующим ее тирозинкиназный цитоплазматический домен и посылающим сигнал в ядро, которое, в свою очередь, активирует гены, вовлеченные в рост и ветвление мочеточниковой почки. Поэтому белки, содержащие внеклеточный домен Ret, слитые либо с Fc-частью человеческого иммуноглобулинa Gl (IgG1), либо со щелочной фосфатазой (АР), могут использоваться как часть подхода к клонированию RetL, как показано на фиг. 4 В. Слитые белки, экспрессируемые библиотеки и другие реагенты, используемые для клонирования RetL1, описаны ниже. Сначала выделили кДНК для крысиногоRetL1 и затем использовали ее в качестве пробы для выделения кДНК человеческого RetLl. кДНК последовательно выделяли для RetL2 иRetL3. Получение реагентов, необходимых для прямой экспрессии клонированных 16 1. Выделение кДНК, кодирующей крысиный внеклеточный домен Ret. Чтобы идентифицировать RetL1, получали слитые белки, состоящие из внеклеточных доменов либо крысиного, либо человеческого Ret,сливаемого с белком, в одном примере - с Fcчастью IgG1 человека, а в другом примере - со щелочной фосфатазой. Оба слитых белка можно легко проанализировать при анализе клеток,которые экспрессируют данный лиганд, как проиллюстрировано на фиг. 4 В. Так как кДНК, кодирующая крысиный Ret,никогда не была описана, была выделена кДНК,кодирующая внеклеточный домен крысиногоRet-рецептора с использованием метода Полимеразной Цепной Реакции с Обратной Транскриптазой (RT-PCR). Две нуклеотидные последовательности для ret человека (Genbank, каталожные номера М 57464 и Х 15262) и мыши(Genbank, каталожный номер Х 67812) сравнили и создали олигонуклеотидные праймеры из высокоидентичных областей между двумя последовательностями. Смысловой олигомер, названный kid-013 (SEQ ID NO:3; содержит нуклеотиды 150-169 последовательности Х 15262 из Genbank), выбрали с 5'-конца ret-кДНК-последовательности человека, перекрывающей инициаторный кодон ATG. Он включает нуклеотиды на ее 5'-конце, кодирующие сайт рестрикции Not1 для целей клонирования. Антисмысловые олигомеры, названные kid-014 (SEQ ID NO:4; содержит комплементарные последовательности М 57464 из Genbank нуклеотиды 1819-1839,) иkid-015 (SEQ ID NO:5, содержат комплементарные последовательности Х 67812 из Genbank нуклеотиды 1894-1914), выбраны, соответственно, из человеческой и мышиной кДНКпоследовательностей, непосредственно примыкающих к 5' -концу последовательности, которая кодирует трансмембранные домены. Олигомеры kid-014 и kid-015 содержат дополнительные нуклеотиды на своих 5'-концах, которые кодируют сайт рестрикции Sall для целей клонирования. Общую РНК выделяли из 14-дневной эмбриональной крысиной почки, мРНК выделяли очисткой, используя олиго-dТ-хроматографию. мРНК превращали в кДНК, используя AMV обратную транскриптазу, и данную кДНК преобразовывали в двухцепочечную кДНК и амплифицировали с использованиемTaqполимеразы в стандартной полимеразной цепной реакции с олигомерами kid-013 и kid-015. Синтез 1942 п.н. фрагмента PCR подтверждали электрофорезом аликвот PCR в 1%-ном агарозном геле. Остальной PCR-фрагмент подвергали гидролизу с помощью Not1 и Sal1 и клонировали в pSAB132, предварительно гидролизованную также Not1 и Sal1. Полученную плазмиду назвали pJC011. Полную вставку плазмидыpJC011, содержащуюся между сайтами Not1 иSal1, секвенировали и показали в качестве вне 17 клеточной крысиной ret-кДНК, SEQ ID NO: 6. Трансляция этой последовательности обнаруживает пептидную последовательность (SEQ IDNO:7) внеклеточного крысиного Ret. Вследствие того, что олигомеры для PCR были выбраны из человеческой и мышиной последовательностей ret, представляется возможным, что данная нуклеотидная последовательность, показанная в качестве внеклеточной крысиной ret-кДНК, и пептидная последовательность, показанная в качестве внеклеточной крысиной Ret, могут отличаться от природной крысиной retнуклеотидной и Ret-пептидной последовательностей в областях последовательностей kid-013 и kid-015. Впоследствии ret-кДНК клонировали и выделяли из кДНК-библиотеки почки 18 дневного крысиного эмбриона и наблюдали несколько нуклеотидных замен в праймерных областях, приводящих к двум аминокислотным заменам. Одна замена находится в сигнальной последовательности (аргинин в позиции 5 на треонин) и одна замена находится вблизи конца внеклеточного домена (глутаминовая кислота в позиции 633 на аланин). Обе эти замены не должны влиять на лигандное связывание. 2. Слитые белки Ret/IgG. Получали фьюжн белки, состоящие из внеклеточных доменов крысиного (аминокислотные остатки 1-637) и человеческого (аминокислотные остатки 1-636) Ret-рецепторов,сливали с Fc-фрагментом человеческого IgG1. Конструкцию данных плазмид использовали для экспрессии крысиного слитого белкаRet/IgG, схематически показанного на фиг. 5. Для того, чтобы сконструировать ген, кодирующий крысиный слитый белок Ret/IgG, обработали pJC011 (описанную выше), содержащую крысиный внутриклеточный домен Ret, с помощью Sal1 и лигировали его с 700 п.н. Sal1 фрагментом из плазмиды 2-4, чтобы создать плазмиду pJC012. Данный Sal1-фрагмент содержит часть Fc-домена человеческого IgG, первоначально полученного из плазмиды pSAB144. Плазмиду 2-4 создали ранее путем трехлинейного лигирования: Not1-Sal1-фрагмента, полученного с помощью PCR, содержащего внеклеточный домен кроличьего рецептора TGF-beta тип II; 693 п.н. Sal1-Not1-фрагмента изpSAB144, содержащую часть Fc-домена человеческого IgG1; и pSAB132, обработанную Not1. Как показано на фиг. 5, фрагмент, содержащийFc-домен, может быть высвобожден из плазмиды 2-4 в виде 700 п.н. Sal1-фрагмента. pJC012 трансфецировали в COS-клетки и крысиный слитый белок Ret/IgG выделяли через 48 ч хроматографией на белок-А-Сефарозе. Для того,чтобы создать устойчивую клеточную линию,продуцирующую крысиный Ret/IgG-белок, 2612 п.н. Not1-фрагмент из pJC012, содержащий полный крысиный слитый белок Ret/IgG, выделяли и клонировали в Not1-сайт экспрессирующего вектора pMDR901. Результирующую плазмиду 18 назвали pJC022. Плазмиду pJC022 трансфецировали в СНО-клетки с получением стабильных клеточных линий. Наиболее продуктивную клеточную линию адаптировали для суспензии. Типичные выходы крысиного Ret/IgG составили в СНО-линии 75 мг/л. Конструкции плазмид, используемых для экспрессии человеческого слитого белкаRet/IgG, показаны схематически на фиг. 6. Для того, чтобы сконструировать ген, кодирующий человеческий слитый белок Ret/IgG, получали плазмиду, содержащую кДНК, кодирующую человеческий Ret-рецептор, от Dr. М. Takahashi(Department of Pathology, Nagoya University,School of Medicine, Nagoya, Япония). PCRфрагмент получали из этой плазмиды с использованием олигомеров kid-013 и kid-014. Полученный PCR-фрагмент обрабатывали фрагментом Клнова с последующей обработкой Not1,чтобы получить PCR-фрагмент с одним липкимNot1-концом и одним тупым концом. Этот фрагмент клонировали в вектор pGEM11zf(+),предварительно гидролизованный EcoR1, обработанный с фрагментом Клнова и гидролизованный Not1, чтобы получить один липкийNot1-конец и один тупой конец. Результирующую плазмиду назвали pJC013. 1916 п.н. Not1Sal1-фрагмент выделяли из pJC013 после полного гидролиза Not1 и частичного гидролиза Sal1 и лигировали с 693 п.н. Sal1-Not1-фрагментом из pSAB144, содержащем Fc-домен человеческого IgG1, с экспрессирующим векторомpJC015. Вставку в плазмиде pJC013 секвенировали и обнаружили единственную нуклеотидную замену, которая изменяет одну аминокислоту во внеклеточном домене человеческого Ret(Genbank, последовательность М 57464 обладает С в позиции 812, тогда как pJC013 обладает Т в соответствующей позиции; это приводит к изменению аминокислот с аланина на валин в положении 294 Ret-белковой последовательности человека). Этот нуклеотид исправляли обратно на С-остаток, описанный в Genbank-последовательности М 57464, с помощью сайт-специфического мутагенеза плазмиды pJC013, получая плазмиду pJC023. 585 п.н. фрагмент BstE2 выделяли из pJC023, содержащей восстановленную нуклеотидную последовательность, и клонировали в плазмиду pJC015, из которой был удален 585 п.н. фрагмент BstE2, содержащий вариантный нуклеотид. Новую плазмиду назвали pJC024. Из pJC024, содержащей полный слитый белок Ret/IgG человека, выделяли 2609 п.н. фрагмент Not1 и клонировали в Not1-сайт экспрессирующего вектора pMDR901. Результирующую плазмиду назвали pJC025. ПлазмидуpJC025 трансфецировали в СНО-клетки для получения стабильных клеточных линий. Клеточную линию с наивысшей продуктивностью адаптировали к росту в суспензии. Обычные 19 выходы СНО-линии с человеческим Ret/IgG составляют 6 мг/л. Дополнительные детали получения векторов, используемых в методах настоящего изобретения даны в РСТ-заявках 94/01456 и 92/02050, описание которых приведено здесь путем ссылки. 3. Биоактивность слитых белков Ret/IgG. Для того, чтобы определить, обладают ли полученные слитые белки Ret/IgG биоактивностью и, следовательно, могут ли быть хорошими скринирующими реагентами для клонированияRetL, провели несколько анализов органной культуры на биоактивность. Анализ данной органной культуры состоит из 13-14-дневного выращивания эмбриональных крысиных почек в органной культуре в течение 3-5 дней в присутствии слитого белка Ret/Ig в концентрации 50LFA-3TIP/IgG или в буфере для клонирования. После культивирования некоторые из почек окрашивали флуоресцентным лектином Dolichos Biflorus Agglutinin (DB-лектин), который окрашивает ткани собирательного канала, эпителиальные клетки которого произведены из эмбрионального мочеточника. Эти "DB"позитивные клетки метят Ret-позитивные клетки, поскольку Ret экспрессируется в эмбриональном мочеточнике и его эпителиальных производных. Это высоко оценивает слитый белокRet/IgG в росте и развитии эмбриональной почки. Существует четкое отличие в морфологии и росте собирающего канала между почками, которые культивировали с LFA-3TIP и почками,которые культивировали со слитым белкомRet/IgG крысы. Почки, обработанные Ret/IgG,обладают собирающими каналами, которые показывают существенно меньшее ветвление и обычно меньше в целом. Из других почек получали парафиновые срезы для гистологического исследования. Эмбриональные почки обрабатывали контрольным буфером или буфером с Ret/IgG, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Эмбриональная почка, обработанная Ret/IgG, проявляет меньшее ветвление собирающих каналов, чем эмбриональные почки, обработанные контрольным буфером. Кроме того, почки, обработанныеRet/IgG, обладают немногочисленными трубочками. Этот эффект наблюдали также с человеческим слитым белком Ret/IgG. Эти наблюдения согласуются с наблюдением в отношении слитых белков, блокирующих индуктивный сигнал между мезенхимой и мочеточниковой почкой. По этой причине можно утверждать, что данный слитый белок представляет собой хороший реагент для клонирования RetL. 4. Слитый белок Ret/щелочная фосфатаза. Слитые белки рецептор/щелочная фосфатаза (АР) с успехом использовали, чтобы идентифицировать и клонировать лиганды для c-kit(Cell 63:185, 1990), лиганды для членов eph 002544 20 семейства orphan-рецепторов (Cell 79:157, 1994) и, в последнее время, для клонирования рецептора для лептина, продукта ob-гена (Cell 83:1263, 1995). Конструировали плазмиды, кодирующие слитый белок, и производили крысиный Ret/AP-белок в COS-7 клетках на клеточных фабриках. Впоследствии получали стабильную клеточную линию NIH3T3, экспрессирующую, в среднем, 10 мг/л слитого белка.SDS-PAGE-анализ крысиного белка Ret/AP свидетельствует, что его размер согласуется с предсказанным молекулярным весом, а анализ гельфильтрации свидетельствует, что он производится в виде димера. Неполную очистку осуществляли с помощью аффинной хроматографии на колонке с anti-AP. 5. Антитела anti-Ret. Получали кроличьи поликлональные антитела к крысиному слитому белку Ret/IgG. Полученное антитело работает в Вестерн-блотах,FACS-анализе Ret-положительных клеточных линий и в иммуногистохимических срезах эмбриональной почки. Получали панель антител хомячка к крысиным Ret-моноклональным антителам. Крысиный Ret/IgG-слитый белок, присоединенный к белку А Сефарозы, использовали для иммунизации Армянских хомячков. Получили 316 клонов после слияния и скринирования их способности связывать крысиные Ret-слитые белки и человеческий IgG в ELISA-анализе. 11 клонов продуцировали антитела, которые связывались только с крысиными Ret/IgG (и крысинымиRet/AP), но не с человеческим IgG. Перекрестную реакцию с человеческим Ret анализировали с помощью FACS; получили четыре клона антител, которые могут связываться с Retположительной человеческой клеточной линией ТНР-1. Нижеследующая таблица суммируетRet-связывающие свойства двенадцати моноклональных антител. Клон 6. Экспрессионные библиотеки кДНК. Получали кДНК-библиотеки из эмбриональной почки крысы, одну - в CDM8-вектор,который использует SV40-origin для амплифи 21 кации, и одну - в модифицированный Vitrogenвектор, рСЕР 4, который использует EBV-origin для амплификации. Этот модифицированный вектор, СН 269, обладал удаленной генной последовательностью EBNA-1. Белок EBNA-1 взаимодействует с EBV-origin, но данный ген не нуждается в векторе, когда используются клетки, которые стабильно экспрессируют EBNAбелок. Библиотека в CDM8-векторе содержит 1,5 х 106 клонов со средним размером вставки 1,18 т.п.н., а библиотека в СН 269-векторе содержит, приблизительно, 1 х 106 клонов со средним размером вставки 1,5 т.п.н. Экспрессия клонируемого Ret лиганда RetL1 А. Клонирование лиганда RetL1 крысойRet. 1. Начальные попытки экспрессии клонирующего Ret лиганда RetL1. Для клонирования RetL1 был испробован ряд методов прямой экспрессии. Все эти методы основаны на концепции, проиллюстрированной на фиг. 4 В. кДНК из кДНК-библиотеки интродуцировали в клетки млекопитающих, клетки,которые приобретали RetL1, могли быть идентифицированы с использованием Ret-слитых белков. Несмотря на то, что три методики, описанные ниже, оказались безуспешными, были получены важные знание и заключение специалистов, которые были учтены в последующем подходе, которого ждал успех. а. Метод иммобилизации Ret/IgG на пластинках - Использовали крысиный слитый белок Ret/IgG в попытке выделить RetL1 путем прямого экспрессионного клонирования, применяя метод иммобилизации на пластинках(Aruffo and Seed. Proc. Natl. Acad. Sci. 84:87538757 (1987. На 18-й день эмбрионального развития крысиной почки кДНК-библиотеку использовали в CDM8 для осуществления попытки метода панорамирования. кДНК, сведенные воедино из данной библиотеки (5000 - 10000 кДНК на пул), интродуцировали в СОS-клетки с применением DEAE-декстранового метода. Через 48 ч эти клетки удаляли из чашек с помощью ЭДТА, инкубировали со слитым белком и затем помещали на чашки, покрытые антителом к человеческому IgG1. ДНК извлекали из клеток,которые прилипали, трансформировали обратно в Е. coli и затем выделяли для второго цикла иммобилизации на пластинках. Невозможно было увидеть какие-либо связанные клетки после третьего цикла иммобилизации на пластинках и были получены очень немногие клоны после обратной трансформации Hirt-ДНК в Е.coli. VCAM-кДНК, используемая в сочетании с анти-VCAM моноклональным антителом в качестве положительного контроля, можно разводить в соотношении 1:100 и все еще детектировать, что свидетельствует о том, что размеры предлагаемого пула, вероятно, слишком велики. Анализ некоторых клонов, которые получали после второго цикла иммобилизации на пласти 002544 22 нах, свидетельствует о том, что данные клоны подвергались перестройке и делеции.- 80000 клонов кДНК из библиотеки 18-дневной крысиной почки (CDM8-вектор) интродуцировали в COS 7-клетки и подвергали препаративному FACS с использованием крысиного белкаRet/IgG с последующим флуоресцентным меченьем вторичного антитела. Собирали 0,5% и 0,9% верхних флуоресцирующих клеток и извлекали плазмидную ДНК с помощью Hirtлизиса. Полученную ДНК электропорировали обратно в Е. coli; получали 228 клонов для 0,5%-го пула и 752 клона для 0,9%-го пула. Из полученных бактериальных клонов извлекали ДНК и осуществляли второй цикл препаративного FACS. В конце второго цикла из бактериальных клонов извлекали и анализировали плазмиды и обнаруживали, что они содержат много делеций и перестроек. с. Способ колориметрической детекции с помощью Ret/AP -Клетки COS трансфецировали 400 пулами кДНК-клонов (1000 клонов на пул) от 18-дневной кДНК-библиотеки эмбриональной почки (CDM8-вектор) и окрашивали с помощью белка Ret/AP и колориметрического субстрата щелочной фосфатазы. Полученные трансфецированные клетки обследовали под микроскопом на позитивные сигналы. В одном из экспериментов повторно проанализировали пять потенциальных позитивов, но все они оказались отрицательными. В качестве контроля для белка Ret/AP получали белок VCAM/AP путем слияния первых двух доменов VCAM человека с N-концом АР из плаценты. (VCAM связан с интегриномVLA4, который составлен из двух цепей, альфа 4 и бета-1). Временные трансфекции СОSклеток образуют достаточно белка VCAM/AP для контрольных экспериментов. БелокVCAM/AP сравнивали с VCAM/IgG, непосредственно присоединенным к АР, а к VCAM/IgG плюс АР присоединяли вторичное антитело,чтобы проанализировать их способность детектировать VLA4 в COS-клетках, трансфецированных цепью альфа-4 кДНК (COS-клетки уже экспрессируют цепь бета-1). Полученные результаты демонстрируют, что несмотря на то,что белок VCAM/AP мог бы детектироватьVLA4 в трансфецированных клетках, лучшую детекцию обнаруживает белок VCAM/IgG в сочетании с АР-присоединенным вторичным антителом.d. Методологические выводы. На основании этих первоначальных попыток клонирования выявляются три основных вывода. 1) Методы, которые необходимы для получения в последовательных циклах плазмидной ДНК (т.е. иммобилизирующий и препаративный FACS) непригодны, когда распространенность кДНК-мишени является низкой, 23 вследствие перестроек и делений, которые происходят во время этих последовательных циклов. Из-за низкой экспрессии Ret имеется веское основание подозревать, что экспрессия RetL1 также является низкой. Предпочтительный подход заключается в трансфекции пулов и использовании метода детекции, который позволяет идентифицировать позитивный пул. Исходный пул может быть затем разбит без необходимости получения временной экспрессии ДНК из трансфецированных клеток. 2) Белок Ret/IgG при присоединении ко вторичному реагенту обладает лучшей детектирующей способностью, нежели белок Ret/AP. 3) Контрольные эксперименты с контрольным белком VCAM/IgG (и АР-присоединенным вторичным антителом) и альфа-4 интегриновой кДНК (разбавленной в CDM8-векторе и трансфецированной в COS-клетках) свидетельствуют,что предлагаемая детекционная способность составляет один на тысячу (т.е. размер пула не может превышать 1000 клонов). Для достижения повышенного уровня чувствительности был заменен вектор, основанный на SV-origin (экспрессируемый в СОS-клетках), на вектор, основанный на EBV-origin (экспрессируемый вEBNA-положительных клеточных линиях). Векторы на основе EBV-origin сохраняются в качестве эписом и не так токсичны для клеток после амплификации, как векторы на основе SV40origin. Имеются существенные доказательства того, что гены могут экспрессироваться в наибольшей мере в этих векторах и что кДНК могут быть разбавлены много больше (т.е. до 1 к 80000) и все еще детектироваться. 2. Скринирование пулов из кДНКбиблиотек, основанных на ЕВV-ориджине. Были скринированы пулы клонов из кДНК-библиотек (вектор СН 269 с EBV-origin) 18-дневной эмбриональной почки крысы со слитым крысиным белком Ret/IgG. В первом эксперименте получили 256 пулов, содержащих,каждый, 5000 клонов из данной библиотеки. Коротко, аликвоты кДНК-библиотеки титровали, размещали 5000 клеток (на 256 чашках) и выращивали в течение ночи. Полученные колонии соскабливали в среду: часть культуры использовали для образования глицеринового стока для пула (сохраняемого при -70), а часть использовали для выделения плазмид. ДНК из 256 пулов индивидуально трансфецировали в 293/ЕВNА-клетки (8 Х 105 на 60 мм чашку),применяя метод липофекции. Через 48 ч эти клетки промывали два раза НВНА-буфером (0,5 мг/мл BSA, 0,1% NaN3, 20 мл HEPES (pH 7,0 и инкубировали с 20 ug/мл крысиного Ret/IgG в Трис-солевом буфере плюс 1 мМ MgCl2 и CaCl2) в течение 60-90 мин при комнатной температуре. После этой инкубации клетки промывали четыре раза НВНА-буфером и затем фиксировали с помощью 60% ацетона/3% формальдегида/20 мМ HEPES (pH 7,0) в течение 30 24 с. После двух промывок HBS-буфером (150 мМNaCl, 20 мМ HEPES (pH 7,0 эти клетки инкубировали с АР-конъюгированным вторичным антителом (козьи антитела к Fc-гаммаспецифичному (Fab')2 анти-IgG человека (Jackson Immuno Research Laboratories; catalog109056-098; разведение 1:5000 в Трис-солевом буфере плюс 1 мМ MgCl2 и CaCl2 в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем эти клетки дважды промывали HBS-буфером и дважды с АР-субстратным буфером (100 мМ Трис-НСl(pH 9,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2), содержащем 2 Х Pierce Immuno PureR Phosphatase suppressor ( по каталогу 35002). Последнюю промывку оставляли на 15 мин. Затем в АРсубстратный буфер, содержащий указанный АРингибитор Pierce, вносили АР-субстраты NBT(0,33 мг/мл) и BCIP (0,17 мг/мл) и инкубировали с клетками в течение 5-20 мин. Затем чашки дважды промывали водой. После этого эти чашки просматривали под препаровальным микроскопом на наличие пурпурно окрашенных клеток. При первичном просмотре из 256 пулов идентифицировали 17 позитивных пулов. ДНК из каждого позитивного пула ретрансфецировали в 293/ЕВNА-клетки и повторяли вышеуказанную процедуру вместе с некоторыми дополнительными контрольными экспериментами для подтверждения того, что наблюдаемое окрашивание является Ret/IgG-специфичным. 10 из 17 позитивных клонов демонстрируют окрашивание только со слитым белком Ret/IgG, но не с другим IgG-слитым белком. 3. Разбиение пула 230. В качестве примера один из вышеописанных позитивных пулов, обозначенный 230,разбивали на небольшие субпулы для того, чтобы идентифицировать кДНК в рамках данного пула, который обеспечивает связывание со слитым белком Ret/IgG. 600 клеток из глицеринового стока пула 230 помещали на чашки (10 раз) и выращивали (10 раз) в течение ночи. Колонии этих чашек соскребали в среду: одну десятую полученной культуры использовали для получения глицеринового стока, а остальную порцию использовали для получения ДНК. Десять субпулов из 600 клонов обозначили от 2301 А до 230-5 А и от 230-1 В до 230-5 В. ДНК из этих пулов трансфецировали в клетки 293/EBNA и повторяли вышеописанную процедуру по окрашиванию со слитым белкомRet/IgG. При окрашивании с Ret/IgG-белком один субпул 230 оказался позитивным. Пул 230-5 А дополнительно разбивали,чтобы идентифицировать кДНК этого субпула,обеспечивающего связывание с Ret/IgG-слитым белком. Клетки данного глицеринового стока помещали на чашки и выращивали в течение ночи. Колонии отбирали в лунки семи 96 луночных Bioblocks и растили в течение ночи. Из каждого 96-луночного Биоблока получали 4 25 пула из 20 клонов и 1 пул из 16 клонов. Таким образом получали 35 пулов из семи Bioblocks,обозначенных от 230-5 А-71 до 230-5 А-105. ДНК получали от каждого из этих пулов и трансфецировали в клетки 293/EBNA и повторно анализировали со слитым белком Ret/IgG, как описано выше. Пул 230-5 А-86 оказался позитивным. Пул 230-5 А-86 разбивали путем возвращения в указанный Биоблок и идентифицировали 20 клонов, которые смешивали для создания этого пула. Получали ДНК из всех двадцати клонов и индивидуально трансфецировали в клетки 293/EBNA и повторно анализировали наRet/IgG, как описано выше. Обнаружили, что пул 230-5 А-86-17 оказался позитивным. 4. Характеристика клона 230-5 А-86-17. Клон 230-5 А-86-17 (называемый retL-17 или клон 17 и депонированный в АТСС 98047) дополнительно анализировали путем ДНК-секвенирования. Полная нуклеотидная последовательность вставки этого клона представляет собой SEQ ID NO:1 (кДНК retL1 крысы), и часть данной нуклеотидной последовательности показана на фиг. 1. В рамках этой нуклеотидной последовательности обнаружили открытую рамку считывания, кодирующую белок из 468 аминокислот (крысиный RetL1). Предсказываемый белок обладает сигнальной последовательностью с предсказываемым расщеплением после аминокислоты 24 (Von Heijne с соавт., Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986. Гидрофобный С-конец указывает, что данный белок может быть присоединен к клетке через фосфатидилинозитол-гликановую связь. Имеется три предсказываемых N-сцепленных сайта гликозилирования. Эти свойства согласуются со свойствами, прогнозируемыми для лиганда Ret. Можно экспрессировать растворимые формы крысиного RetL1-белка с помощью усечения гена до гидрофобного С-конца. Например, это можно было бы осуществить путем усечения после Лизина 435 (крысиный RetL1). Усечение выше этой аминокислоты должно было бы привести к экспрессии растворимой формы крысиного RetL1-белка. Данный растворимый крысиный RetL1-белок может быть экспрессирован один или в виде неполно слитого с человеческим иммуноглобулином, гистидиновой метки или небольшого эпитопа, который распознается антителом. В. Клонирование человеческого Retлиганда RetL1. кДНК-библиотеку эмбриональной почки человека в векторе лямбда-gt10 приобретали уClontech ( по каталогу HL5004A). Один миллион бляшкообразующих единиц из фагового штамма помещали в 10 чашек Nunc. Реплики фаговых бляшек осуществляли на фильтрахSchleicher and Schuell Optitran. Пробу получали путем гидролиза плазмиды крысиного RetL1 ферментом рестрикции 26 геле 1,34 т.п.н. фрагмента, который соответствует 242-1582 нуклеотидной последовательности RetL крысы (retL1-кДНК крысы). Эту кодирующую область пробы метили Р 32 путем случайного праймирования (Feinbergand Vogelstein. Anal. Biochem. 137:266267.1984). Эти фильтры гибридизовали в течение ночи в 300 мл буфера PSB (50 мМ Трис рН 7,5, 1 М NaCl, 0,1% натрийпирофосфат, 0,2%PVP и 0,2% Фиккола), содержащего 10% декстрансульфата, 100 ug/мл tRNA и 6,7 X 107 СРМ крысиной пробы, при 55 С. Их дважды промывали буфером для скрининга бляшек и дважды с 2XSSC/1% SDS при 55 С и экспонировали на пленке при -70 С с усиливающим экраном. Позитивные реплики переносили из исходных чашек в SM (100 мМ NaCl, 10 мМ SO4,50 мМ Трис рН 7,5) плюс желатин. 24 из этих позитивов представляли собой чистые бляшки. Очищенную ДНК из кандидата-бляшки гидролизовали с Not1, фрагменты разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и получали блоты по Саузерну. Полученный Саузерн-блот гибридизовали с кодирующей областью пробы крысиного RetL1. Клон HRL20 обладает наиболее длинной вставкой (4,4 т.п.н.), которая интенсивно гибридизует с данной крысиной пробой. Последовательность ДНК (неполная retL1 кДНК человека; SEQ ID NO:8; фиг. 2 А) и установленная пептидная последовательность (неполный RetL1 человека; SEQ ID NO:9; фиг. 2 А) были получены из этого клона, подтверждая,что она представляет гомолог человека. Данный клон кодирует большую часть кодирующей области, в том числе, 3'-конец кодирующей области. Для получения 5'-конца кДНК человека, отClontech приобретали набор кДНК эмбриональной почки человека Marathon-Ready (каталожный 7423-1). Синтезировали антисмысловой олигонуклеотид Kid-155, соответствующий последовательности 62-81 SEQ ID NO: 8 (кДНК неполного retL1 человека), и Kid-154, соответствующий последовательности 17-43 SEQ IDClontech 8417-1) в сочетании с реагентами кДНК Marathon и данными олигонуклеотидами Kid-155 или Kid-154. Первую PCR-реакцию осуществляли следующим образом: 35,5 ul Н 2 О; 5,0 ul 10X KlenTaq Buffer; 1,0 ul 10 мМ dNTP смеси; 1,0 ul 50X Advantage KlenTaq Polymerase смеси. Эти реагенты объединяли и смешивали. Затем добавляли 5,0 ul Marathon-ReadyThermal Cycler 480 с нижеследующими условиями амплификации: 1 цикл при 94 С в течение 1 мин; 30 циклов при 94 С в течение 30 с,55 С в течение 30 с, 68 С в течение 4 мин. Гнез 27 довую PCR осуществляли с использованием продукта из первой PCR. Вначале разбавляли 5ul PCR-продукта 1 в 50 раз с помощью ТЕ (конечный объем 250 ul) . Данная гнездовая PCRреакция содержит 35,5 ul Н 2 О; 5,0 ul 10X KlenTaq Buffer; 1,0 ul 10 мМ смеси dNTP; 1,0 ul 50X смеси Advantage KlenTaq Polymerase. Эти реагенты смешивали как указано выше. Затем добавляли 5,0 ul разбавленного PCR-продукта 1; 1,0 ul 10 uM АР 2-праймера и 1,5 ul 6,9 uMKid-154. Условия амплификации были теми же,что и вышеуказанные. Полученный продукт,приблизительно 700 п.н. выделяли очисткой в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы и экстрагировали фенолом. Выделенную ДНК клонировали по EcoR5-сайту pZErO (каталожныйпоInvitrogen K2510-01). Сведения о последовательности получали от множества изолятов, в том числе от клонов, названных HRL7G6 иHRL20 (кДНК неполного retL1 человека), использовали для получения полноразмерногоRetL1 человека (кДНК полноразмерного retL1 человека) (фиг. 2 В). Нуклеотидная последовательность клона HRL7G8 представляет нуклеотиды 1-502 кДНК полноразмерного retL1 человека; нуклеотидная последовательность клонаHRL20 представлена нуклеотидами 460-1682 кДНК полноразмерного retL1 человека. Последовательность клона HRL7G8 подтверждена путем секвенирования другого кДНК-клона(GJ102), выделенного из кДНК-библиотеки лямбда gt10 эмбриональной почки человека,описанной выше, с использованием пробы, полученной из клона HRL7G6. Нуклеотиды 1181497 включают белковую рамку считывания полноразмерной кДНК retL1 человека. Полная аминокислотная последовательность retL1 человека также показана на фиг. 2 В. Как показано с помощью анализа BESTFIT,изображенного на фиг. 3 А, кДНК retL1 человека идентична на 88,2% кДНК крысиного retL1. Сравнение пептидов (фиг. 3 В) показывает, что предполагаемая пептидная последовательность человека на 93% идентична и на 97,2% аналогична такой же последовательности, но из крысы. Клонирование Ret-лиганда RetL2 А. Клонирование RetL2 человека. Пептидную последовательность RetL1rhscs (RetL1 крысы) использовали для поиска в базе данных GenBank с помощью программыBLAST, чтобы идентифицировать близкие белки (т.е. изологи). BLAST или Basic Local Alignment Search Tool использует метод Altschul с соавт. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) для поиска сходства между запрашиваемой последовательностью и всеми последовательностями в базе данных последовательностей. Запрашиваемая последовательность и найденная в базе дан 002544 28 ных могут представлять собой либо пептидную,либо нуклеотидную в любом сочетании. Когда пептидную последовательность RetL1 крысы запрашивают по отношению к Последовательности, Снабженной Меткой (EST) в нуклеотидной базе данных, получают две существенно совпадающие последовательности. Первая представлена каталожным R02249 GenBank,229 п.н. EST из объединенной кДНКбиблиотеки печени и селезенки плода человека,а вторая представлена каталожным Н 12981,521 п.н. EST из кДНК-библиотеки мозга человеческого младенца. Эти две EST обладают 99% идентичности в области перекрывания, указывающей на то, что они происходят из одной и той же кДНК. Олигонуклеотиды получали изNO:12). 1x106 бляшкообразующих единиц из кДНК-библиотеки 5'-участка печени плода плюс лямбда-GT10, полученной от Clontech ( по каталогу HL5003a) , скринировали на реплики в ОРТIТRАN-фильтрах. Эти фильтры гибридизовали при 65 С в течение ночи с меченными по Р 32 олигонуклеотидами KID-228 и KID-229 в 400 мл буфера для скрининга бляшек (50 мМ Трис рН 7,5, 1 МNaCl, 0,1% натрийпирофосфата, 0,2% поливинилпирролидона и 0,2% Фиккола), содержащего 10% декстрансульфата и 100 ug/мл tRNA и 80 пмоль каждого олигонуклеотида, меченного 32P. Их дважды отмывали с 2 Х SSC/1% SDS и дважды с 1X SSC/1% SDS и экспонировали с пленкой. Выделяли очисткой 11 дуплицированных позитива. ДНК от каждого из этих клонов анализировали путем обработки ферментом рестрикции с последующим электрофорезом в агарозном геле и Саузерн-блоттингом. Полученные фильтры гибридизовали с KID-228 и KID-229 для подтверждения того, что данная вставка гибридизируется с данной пробой. Вставку клона DSW240 полностью секвенировали (кДНКretL2 человека, SEQ ID NO:12) (фиг. 7). Нуклеотиды 25-1416 включают белковую открытую рамку считывания кДНК retL2 человека, которая кодирует белок из 464 аминокислот (RetL2 человека; SEQ ID NO:13) (фиг. 7). Как показано с помощью BESTFIT-анализа,изображенного на фиг. 8, белок RetL2 человека на 49,1% идентичен и на 63,75 сходен с белкомRetL1 человека N-гидрофобным концом, указывающим на сигнальную последовательность, и С-концом, свидетельствующим о фосфатидилинозитолгликановом мотиве сцепления. Кроме 29 того, 30 цистеинов из 31, которые представлены в каждом белке, являются консервативными. В. Демонстрация того, что RetL2 представляет собой лиганд для Ret. Мы продемонстрировали, что RetL2 представляет собой лиганд для Ret, путем трансфекции 293/EBNA-клеток экспрессирующей плазмидой, которая содержит вставку клонаDSW240 и путем показа того, что данные клетки могут связывать растворимый слитый белокRetL/IgG. Вставку из DSW240 выделяли с использованием Not1 и клонировали в экспрессирующий вектор СН 269, который содержит EBV-origin,что обеспечивает возможность для высокой экспрессии в EBNA-позитивных клеточных линиях. Рестрикционные обработки осуществляли,чтобы идентифицировать клоны, которые обладают правильной ориентацией. Плазмидную ДНК получали из клона, обладающего правильной ориентацией. Плазмидные ДНКretL1 для позитивного контроля и экспрессирующая плазмида, содержащая неродственный белок для негативного контроля) трансфецировали в 293/EBNA-клетки (8 х 105 на 60 мл чашку) с использованием метода липофекции. Через 48 ч полученные клетки промывали два раза НВНА-буфером (0,5 мг/мл BSA, 0,1% NaN3, 20 мМ HEPES (pH 7,0) и инкубировали с 20 ug/млRetL/IgG крысы в Трис-солевом буфере плюс 1 мМ MgCl2 и СаСl2 в течение 60-90 мин при комнатной температуре. После этой инкубации клетки промывали четыре раза НВНА-буфером,а затем фиксировали с помощью 60% ацетона/3% формальдегида/20 мМ HEPES (pH 7,0) в течение 30 с. После двух промывок HBSбуфером (150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES (pH 7,0) полученные клетки инкубировали с АРприсоединенным вторичным антителом (козьиFc-гамма-специфичные F(ab')2 анти-IgG человека (Jackson Immuno Research Laboratories; catalog109-056-098; разведение 1:5000 в Триссолевом буфере плюс 1 мМ MgCl2 и СаСl2) в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем эти клетки дважды промывали НВSбуфером и дважды с АР-субстратным буферомPhosphatase suppressor ( по каталогу 35002). Последнюю промывку оставляли на 15 мин. Затем в АР-субстратный буфер, содержащий указанный АР-ингибитор Pierce, вносили АРсубстраты NBT (0,33 мг/мл) и BCIP (0,17 мг/мл) и инкубировали с клетками в течение 5-20 мин. Затем чашки дважды промывали водой. После этого эти чашки просматривали под препаровальным микроскопом на наличие пурпурно окрашенных клеток. Наличие пурпурных окрашенных клеток свидетельствует о том, чтоRetL2-белок является лигандом для Ret. Пурпурно окрашенные клетки наблюдали также после трансфекции с экспрессирующим вектором retL1, но не с негативным контрольным вектором. Клонирование Ret-лиганда RetL3 А. Мышиный RetL3. Поиск EST в базе данных с аминокислотными последовательностями RetL1 крысы обнаружил гомологию с Ret-лигандами двух мышиных EST. Эти EST представляют собой АА 049894 и АА 050083 (которая представляет собой неполную кДНК мышиного retL3, SEQ IDNO:14). Плазмиды, кодирующие эти EST, получали из Genome Systems Inc. ( по каталогу 475791 и 475497) в виде столбиков питательного агара с бактериями. Плазмидную ДНК получали из одиночных колоний, полученных путем штрихования косячков в LB-Amp-чашках. Вставки из этих плазмид секвенировали на их полноту. Сравнение двух последовательностей демонстрирует, что АA049894, которая обладает 1,4 т.п.н. вставкой, содержится в АА 050083,которая обладает 1,9 т.п.н вставкой. Трансляция последовательности ДНК из АА 050083 указывает на существование непрерывной открытой рамки считывания от NT205 до NT1242 (неполный мышиный RetL3; SEQ ID NO:15). Эта открытая рамка считывания обладает 37,5% идентичности с открытой рамкой считывания retL1 крысы и 40,2% идентичности с retL2 крысы. Однако данная открытая рамка считывания не кодирует Met или сигнальную последовательность на 5'-конце. Исследовали 5'-открытые рамки считывания, лежащие выше этой области,и обнаружили Met в контексте консенсусной последовательности Kozak для инициации трансляции и потенциальную сигнальную последовательность для поверхностной экспрессии/секреции. Эта открытая рамка считывания отсутствует в рамке с нижележащей открытой рамкой считывания, указывая, что EST АА 50083 содержит потенциальную мутацию,такую как инсерция, делеция, интрон или артефакт клонирования на своем 5'-конце. Для того, чтобы получить правильный 5'конец, использовали Marathon RACE. кДНК эмбриона мыши Marathon-Ready (кат. 74581) и набор Advantage (кат. 8417-1) приобретали от Clontech. Синтезировали антисмысловые олигонуклеотиды, Kid-366, соответствующие нуклеотидам 847-866 SEQ ID NO:14 и Kid365, соответствующие нуклеотидам 589-615KlenTaq Buffer; 1,0 ul 10 мМ смеси dNTP; 1,0 ul 50X Advantage KlenTaq Polymerase смеси. Эти реагенты объединяли и смешивали. Затем до 31 бавляли 5,0 ul кДНК 11-дневного эмбриона мыши Marathon-Ready; 1,0 uM AP1-праймера и 1,7 ul 5,88 uM Kid-366 (конечный объем = 50DNA Thermal Cycler 480 в нижеследующих условиях амплификации: 1 цикл при 94 С в течение 1 мин; 5 циклов при 94 С в течение 30 с,72 С в течение 4 мин; 5 циклов при 94 С в течение 30 с, 70 С в течение 4 мин; 25 циклов при 94 С в течение 30 с, 68 С в течение 4 мин. Гнездовую PCR осуществляли с использованием продукта из первой PCR-реакции. Вначале, 5 ulKlenTaq Buffer; 1,0 ul 10 мМ смеси dNTP; 1,0 ul смеси Advantage KlenTaq Polymerase. Эти реагенты смешивали как указано выше. Затем добавляли 5,0 ul разбавленного PCR-продукта 1; 1,0 ul 10 uM АР 2-праймера и 3,6 ul 2,8 uMKid-365. Условия амплификации были теми же,которые указаны выше. Полученный продукт,приблизительно 665 п.н. выделяли очисткой в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы и экстрагировали Qiaex (Qiaex кат. 20021). Выделенную очисткой ДНК клонировали в pNoTA/T7 с использованием клонирующей системы PRIMEPCR CLONER (5 Prime - 3 Prime кат. 1725029). Информация о последовательности получена от множества изолятов, в том числе,от клонов, названных DSW252 и DSW253. Обнаружили, что последовательностьDSW252 перекрывается с SEQ ID NO: 14 за тем исключением, что дополнительный Т представлен между нуклеотидами 252 и 253 из последовательности SEQ ID NO:14. Этот Т представлен также в других изолятах, DSW251 и DSW253. Инсерция этого дополнительного основания исправляет открытую рамку считывания так,что получали единственную 1191 п.н. открытую рамку считывания (счет от первого Met), кодирующую 397 аминокислот. Эта открытая рамка считывания кодирует Met в контексте канонической консенсусной последовательности (Kozak) инициации трансляции и включает сигнальную последовательность для поверхностной экспрессии/секреции. Для получения полноразмерного мышиного клона, который способен экспрессироваться,выделяли очисткой 630 п.н. Not1-BamH1 фрагмент из DSW252 и 1308 п.н. BamH1-Not1 фрагмент из АА 050083 лигировали в экспрессирующий вектор СН 269, гидролизованный Not1,и трансформировали Е. coli XL1-Blue (Strategenecat. 200236). Qiawell Ultra minipreps осуществляли на полученных трансформантах. Их анализировали электрофорезом рестрикционных фрагментов гидролиза по правильной длине и по ориентации. Эту конструкцию назвалиDSW254. Полученную вставку DSW254 секвенировали на ее полноту (мышиный retL3; SEQID NO:16), а открытую рамку считывания коди 002544 32 рует белок из 397 аминокислот (мышиныйRetL3; SEQ ID NO:17). Эти последовательности показаны также на фиг. 9. Полученный С-конецRetL3 является гидрофобным и свидетельствует о фосфатидилинозитолгликановом сцепленном мотиве. В. RetL3 человека. Чтобы найти источник ткани-кандидата для клонирования RetL3 человека, использовали нозерн-блоты мышиных тканей для определения экспрессии мышиного RetL3. Из данных обследованных тканей наибольшая экспрессияRetL3 найдена в ткани сердца. кДНКбиблиотеку сердца взрослого человека в векторе лямбда-gt10 приобрели у Clontech (catalogHL3026a). Один миллион бляшкообразующих единиц из данного фагового стока поместили на 10 Nunc-чашек. Реплики фаговых бляшек осуществляли на фильтрах Schleicher and SchuellOptitran. Пробу получали при помощи PCR с праймерами Kid-366 и Kid-367, соответствующими нуклеотидам 397-420 последовательности АА 050083. Параметры PCR-реакции были следующими: смешивали 10 ul 10 Х PFU-буфер, 2,0(Strategene catalog 600154). PCR осуществляли на Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 с нижеследующими условиями: 25 циклов при 94 С в течение 1 мин, 53 С в течение 1 мин.,72 С в течение 4 мин. Полученный продукт выделяли очисткой путем экстракции с фенолом,хлороформом, изоамиловым спиртом в соотношении 50:49:1 с последующим электрофорезом в легкоплавком агарозном геле и QiaexIIвыделением очисткой вырезанных фрагментов. Эту кодирующую область пробы, содержащую Р 32, метили случайным праймированием (Feinberg and Vogelstein). Полученные фильтры гибридизовали в течение ночи в 200 мл буфера для скринирования бляшек, содержащего 10% декстрансульфата, 100 ug/мл tRNA и 1,8 X 108 СРМ из мышиной пробы, при 65 С. Их дважды промывали с помощью буфера для скринирования бляшек, дважды - с помощью 2XSSC/1% SDS,дважды - с 1XSSC/1% SDS при 65 С и экспонировали на пленке при -70 С с усиливающим экраном. Реплики позитивных бляшек выделяли очисткой. ДНК из выделенных бляшеккандидатов гидролизовали с помощью EcoR1,фрагменты разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и готовили блоты по Саузерну. Полученный Саузерн-блот гибридизовали с мышиной пробой. Клон GJ128, который обладает 1,3 т.п.н. вставкой, интенсивно гибридизовался с мышиной пробой кодирующей области. От этого клона получали последовательность ДНК (кДНК неполного retL3 человека; SEQ IDNO:18), установленная пептидная последовательность (неполный RetL3 человека; SEQ IDNO:19) подтверждала, что данная последовательность гомологична последовательности человека. Этот клон содержит наибольшую часть кодирующей области, в том числе, 3'-конец. Из GJ128 выделяли очисткой 1,3 т.п.н. вставку, метили с помощью Р 32 и использовали для скринирования Clontech-библиотеки сердца взрослого человека для того, чтобы получить клон с 5'-концом. При скринировании 2 Х 106 бляшек из этой библиотеки не получали клонов,содержащих 5'-конец. Нозерн-анализированные мРНК-блоты ткани взрослого человека (Clontech, каталожный 7760-1,7759-1 и 7767-1), гибридизованные с той же пробой с использованием протоколов, представленных производителем, свидетельствуют, что RetL3 человека экспрессируется в спинном мозге взрослого человека, желудке, сердце, поджелудочной железе,тонкой кишке, толстой кишке, предстательной железе и яичках. Clontech-кДНК-библиотеку спинного мозга взрослого человека (каталожный 5001 а) скринировали с помощью СJ128 вставки. Выделили очисткой 3 независимых клона и самый длинный, GJ135, секвенировали. Последовательность вставки GJ135 перекрывает вставку GJ128, что позволяет получить составную последовательность кДНК полноразмерного retL3 человека (SEQ ID NO:20) и определить полноразмерный RetL3 человека (SEQ IDNO:21). Эти последовательности показаны также на фиг. 10. RetL3 человека на 34,3% и 34,9% идентичны, соответственно, RetL1 человека иRetL2 человека. Он обладает 76,8%-ной идентичностью с RetL3 мыши. Терапевтическое использование соединения настоящего изобретения Природный и вариантный RetL, антитела к анти-RetL, антитела к анти-Ret и слитые белкиRet и RetL могут иметь терапевтическое применение в ситуациях, когда желательно блокировать или активировать сигнальный путь Ret,чтобы стимулировать рост или выживание ренальной и/или невральной клетки при заболеваниях, в которых эти клетки утрачены или повреждены, или для супрессии роста или для уничтожения нежелательных клеток, таких как опухолевые клетки, которые экспрессируют Ret или RetL. Вообще, соединения настоящего изобретения, которые связываются с Ret, индуцируя димеризацию и/или аутофосфорилирование Ret,пригодны для стимуляции роста или ограничения повреждения тканей, экспрессирующих Ret. Соединения настоящего изобретения пригодны для стимуляции роста и/или выживания ренальной ткани, сохраняя ренальную функцию и минимизируя повреждение ренальной ткани после различных инсультов. Конкретные состояния,которые поддаются успешному лечению соединениями настоящего изобретения, включают острую ренальную недостаточность, острый нефрит, хроническую ренальную недостаточ 002544 34 ность, нефротический синдром, дефекты почечных канальцев, почечные трансплантанты, токсическое повреждение, гипоксическое повреждение и травму. Дефекты почечных канальцев включают дефекты любой природы, наследственной или приобретенной, ювенильный нефронофтиз и медуллярная губчатая почка. Данный список не ограничен и может включать многие другие болезни почек (см., например,Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th ed.,1994, включенное здесь путем ссылки). В других заявках гены и белки настоящего изобретения могут использоваться для лечения состояний, где требуется невральный рост и должна быть регенерация. В настоящую заявку включены состояния, вызывающие заболевания,связанные с расстройством нервной системы,такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона,боковой амиотрофический склероз, а также заболевание двигательного нейрона, демиелинизирующие заболевания, такие как множественный склероз, заболевания, вызванные бактериями, такие как менингиты, абсцессы или эмпиема, вирусные заболевания, такие как HIVассоциированная миелопатия, прионовые заболевания, в том числе, заболевание Гревтцфельдт-Джекоба. Включены также болезни, повреждающие нервные ткани, независимо от того, вызваны ли они неопластическим посягательством, травмой или цереброваскулярными событиями, такими как кровоизлияние или эмболия. Заболевания краниальных нервов и спинного мозга, в том числе, болезни, сопряженные с травматической, воспалительной,врожденной или сосудистой этиологиями,включены специфически, поскольку являются болезнями, влияющими на вегетативную нервную систему. Включены также болезни, связанные с развитием нервной системы, такие как задержка умственного развития, аутизм, плодный алкогольный синдром, синдром Дауна, церебральный паралич. Соединения настоящего изобретения могут также использоваться для лечения синдромов, сопряженных с периферической нервной системой. Эти болезни включают болезни, вызванные любым из факторов ранее приведенного списка, и специфически включают болезнь Лима, HIV-ассоциированные невропатии, полиомиозиты, мышечную дистрофию и миастению. Антитела анти-RetL и слитые белки Ret настоящего изобретения, которые специфически связываются с крысиным белком RetL, неполным RetL1 человека, полноразмерным RetL1 человека, RetL2 человека, мышиным RetL3 илиRetL3 человека или с фрагментами этих белков,пригодны для нескольких способов. Настоящие соединения могут использоваться терапевтически для ингибирования или блокирования сигнального рецептора Ret, такого, который блокирует рост опухолей, зависящих от ростовой активации Ret-сигнала. Эти агенты могут также 35 сливаться с детектируемыми маркерами, такими как флуоресцентно или радиографически непроницаемые вещества, и вводиться субъекту для того, чтобы получить изображение ткани,которая экспрессирует RetL. Эти агенты могут также связываться с веществами, такими как пероксидаза хрена, которая может использоваться для иммуноцитохимической окраски для визуализации областей клеток, позитивных поRetL, на гистологических срезах. В данном способе специфическое антитело могло бы использоваться в одиночку, а участки, где оно связывается, можно визуализировать в сэндвич-анализе с использованием антитела к иммуноглобулину,которое связывается с детектируемым маркером. Специфические антитела к любому RetL также пригодны в иммуноанализах по количественному анализу вещества, к которому данное антитело обладает специфичностью. Специфические антитела к RetL могут также связываться с твердыми подложками, такими как бусинки и чашки, и использоваться для удаления данного лиганда из раствора, либо при выделении очисткой белка или для извлечения его из раствора. Каждая из этих методик является стандартной для специалистов в области иммунологии. Другие методы настоящего изобретения включают модуляцию сигнализирования RetRetL путем контактирования Ret с моноклональным антителом к анти-Ret. Эффект такогоmAB-Ret-контакта может приводить либо к блокированию, либо к стимуляции активностиRet-сигнального пути, в зависимости от особенностей взаимодействия каждого отдельногоRet в качестве агонистов, с помощью связывания агониста mAB-Ret запускается димеризация и аутофосфорилирование Ret. Другие mАВ действуют в качестве антагонистов Ret. Взаимодействие Ret с mАВ-антагонистом предотвращаетRetL, которые должны иначе активировать Retсигнальный путь.RetL и/или антитела к Ret, или к Retслитым белкам могут применяться для получения (оптических) изображений тканей, которые экспрессируют Ret, или в иммуногистологических или препаративных методах, описанных выше для антител к RetL. Слитые белки, охватывающие RetL и/или антитела к анти-Ret, могут использоваться для специфически мишенированного терапевтического лечения рака и опухолей, которые экспрессируют Ret. Такие опухоли могут включать несколько различных опухолевых фенотипов,которые ассоциированы с мутациями по Ret (N.Engl. J. Med. 335:943-951, 1996; Nature 367:319320, 1996; Trends Gen. 12:138-144, 1996). Терапевтическое вмешательство против неоплазий,которые экспрессируют RetL, использует слитые белки, которые инкорпорируют Ret и/или 36 антитело к анти-RetL. Антитело к анти-Ret или антитело к анти-RetL может быть эффективным само по себе, вследствие антитело-зависимого и комплемент-зависимого цитолиза, опосредованного Fc-доменом. Такие гибридные лиганды и антитела могут сделать лечение рака более эффективным при использовании их в качестве транспортных поставщиков антинеопластических лекарственных средств, токсинов и разрушающих клетки радионуклидов, таких как иттрий 90. Цитотоксические эффекторные клетки могут мишенироваться на опухолевые клетки с использованием гетероконъюгатных антител,когда антитело, специфичное либо по Ret, либо по RetL, экспрессируемого опухолью, ковалентно соединяется с антителом, нацеленным против поверхностного белка, на цитотоксических эффекторных клетках, таких как NK-клетки илиCTL. Один из примеров терапии антителом к анти-Ret или к RetL заключается в конъюгировании токсичной А-цепи рицина или модифицированной полноразмерной формы рицина(который может непродолжительно связывать клетки) с RetL или с антителом, нацеленным против Ret-полипептида, экспрессируемого на поверхности малигнизированной клетки. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, токсин конъюгировали с Ret или с анти-Ret антителом, чтобы избирательно мишенировать и убить RetL-позитивную клетку, такую как опухолевую, экспрессирующую RetL. Такой подход оказывается успешным для блокирования рицина, конъюгированного с моноклональным антителом к антигену CD19, экспрессируемому большинством неопластических клеток (Grossbard с соавт., Blood 79:576, 1992). Другие токсины, пригодные в равной степени,известны специалистам в данной области. Такие токсины включают, но не ограничиваются, экзотоксин псевдомонад, дифтерийный токсин и сапорин. Этот подход должен оказаться даже более успешным с использованием RetL или анти-Ret антителом, в противоположность известному подходу с антигеном анти-СD19, потому что Ret экспрессируется очень ограниченным числом тканей. Вышеприведенные подходы с использованием слияний рицина или других токсинов в равной мере применимы к конъюгатам токсинов с RetL или с антителом анти-Ret; они пригодны для избирательного мишенирования и уничтожения Ret-позитивных клеток, таких как опухолевые клетки, экспрессирующие Ret. Другой подход к такому терапевтическому лечению заключается в использовании меченных радиоизотопом RetL или антител анти-Ret. Такие соединения, меченные радиоизотопами,будут предпочтительными для радиоактивного мишенирования участков опухоли в клетках,экспрессирующих Ret, располагающихся бок-обок с нормальными тканями. В зависимости от 37 используемого радиоизотопа, испускаемая радиоактивность радиоактивно меченного антитела, связывающегося с опухолевой клеткой, может также уничтожать расположенные рядом клетки малигнизированной опухоли, которые не экспрессируют Ret. Могут использоваться разнообразные радионуклиды. Изотопы, которые испускают -частицы (например, 131I), имели успех при использовании моноклональных антител к CD20, присутствующих в B-клеточных лимфомах (Kaminski с соавт., N. Engl. J. Med. 329:459 (1993); Press с соавт., N. Engl. J. Med. 329:1219 (1993. Радионуклиды, испускающие-частицы, создают радиоактивную эмиссию,которая может повреждать опухолевые клетки на расстоянии, превышающем несколько клеточных диаметров, позволяя искоренять антиген-негативные клетки и уменьшать последствия негомогенного расположения антитела или лиганда в опухолях. Могут также использоваться радионуклиды, испускающие -частицы. Низкодозовая облучаемость, создаваемая с помощью радионуклида, метящего антитела RetL или анти-Ret, терапевтически может быть более эффективной,чем мгновенное облучение, производимое при традиционной радиационной терапии. Облучение малыми дозами может индуцировать апоптоз (программируемая клеточная гибель) в некоторых клеточных линиях (Macklis с соавт.,Radiat. Res. 130:220 (1992); Maklis с соавт., Radiopharm. 5:339 (1992. Соединения настоящего изобретения вводили в терапевтически эффективных количествах, что означает количество соединения, которое производит терапевтически желаемый результат или воздействует на отдельное состояние, которое лечат. Термин "субъект", используемый здесь,подразумевает любое млекопитающее, которому может быть введен Ret-лиганд или ген. Специально подобранные субъекты для лечения способом настоящего изобретения включают людей, а также не человекообразных приматов,овец, лошадей, крупный рогатый скот, коз, свиней, собак, кошек, кроликов, морских свинок,хомячков, песчанок, крыс и мышей, а также органы, опухоли и клетки, производные или исходные от этих хозяев. Использование соединений настоящего изобретения для генной терапииRetL-гены настоящего изобретения вводили в поврежденную ткань, чтобы стимулировать образование RetL трансфецированными клетками, для усиления клеточного роста и/или выживаемости клеток, которые экспрессируют Ret. В конкретном варианте осуществления способа генной терапии RetL-ген может быть введен в ренальную или невральную тканьмишень, по выбору. Позже RetL должен устойчиво экспрессироваться и стимулировать рост, 002544 38 деление, дифференциацию и/или потенциальную клеточную выживаемость позитивных поRet рецепторных клеток. Помимо этого, RetLгены могут быть введены в клетку-мишень с использованием различных хорошо известных способов, основанных на использовании вирусных или невирусных подходов. Невирусные способы включают электропорацию, мембранное слияние с липосомами,высокоскоростную бомбардировку микропулями, покрытыми ДНК, инкубацию с кальцийфосфат-ДНК преципитатом, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, и прямую микроинъекцию в отдельную клетку. Например,RetL-ген может быть интродуцирован в клетку с помощью кальцийфосфатной копреципитации(Pillicer с соавт., Science, 209:1414-1422 (1980); механической микроинъекцией или ускоренной частицей (particle acceleration) (Anderson с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403(1980); ДНК-переносом, основанным на липосоме (например, LIPOFECTIN-опосредованная трансфекция Fefgner с соавт., Proc. Nat. Acad.DEAEдекстраном; электропорацией (Патент США 4956288); или способами, основанными на полилизине, в которых ДНК конъюгировали с доставщиком ДНК, предпочтительно с гепатоцитами печени (Wolff с соавт., Science, 247:465-468,1990; Curiel с соавт., Human Gene Therapy 3:147154, 1992). Клетки-мишени могут быть трансфецированы генами настоящего изобретения путем прямого переноса гена. См., например, Wolff с соавт., "Direct Gene Transfer Into Moose In Vivo",Science 247:1465-68, 1990. Во многих случаях желательна вектор-опосредованная трансфекция. Можно использовать любой из способов,известный в данной области, по инсерции полинуклеотидной последовательности в вектор. См., например, Sambrook с соавт., MolecularBiology, J.WileySons, NY (1992), которые,оба, включены здесь путем ссылки. Промоторная активация может быть тканеспецифической или индуцибельной с помощью метаболического продукта или вводимого вещества. Такие промоторы/энхансеры включают, но не ограничивают, нативный RetL-промотор, цитомегаловирусный предранний промотор/энхансер (Karasuyama с соавт., J. Exp. Med., 169:13 (1989); бета-актиновый промотор человека (Gunning с соавт., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:4831 (1987); глюкокортикоид-индуцибельный промотор,присутствующий в длинном концевом повторе мышиной вирусной опухоли молочной железы(MMTV LTR) (Klessig с соавт., Mol. Cell. Biol.,4:1354 (1984); в длинно-концевых повторяю 39 щихся последовательностях вируса лейкоза мышей Молони (MuLV LTR) (Weiss с соавт.,RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985; промотор ранней области SV40 (Bernoist and Chambon,Nature, 290:304 (1981; промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (Yamamoto с соавт., Cell, 22:787(1980; тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса (HSV) (Wagner с соавт., Ргос.RetL-гены могут быть также интродуцированы с помощью специфических вирусных векторов, используемых для систем генного переноса, которые в настоящее время хорошо определены. См., например: Madzak с соавт., J. Gen.Publishing Associates, 1989, которые все включены здесь путем ссылки. Предпочтительными векторами являются ДНК-вирусы, которые включают аденовирус(предпочтительно векторы, основанные на Ad-2 или Ad-5), бакуловирус, вирусы герпеса (предпочтительно векторы, основанные на вирусе простого герпеса) и парвовирусы (предпочтительно векторы, основанные на "дефективном" или на не автономном парвовирусе, более предпочтительно векторы, основанные на аденоассоциированном вирусе, наиболее предпочтительно - векторы, основанные на AAV-2). См.,например, Ali с соавт., Gene Therapy 1:367-384,1994; патент США 4797368 и 5399346 и обсуждение ниже. Выбор конкретной векторной системы для трансфецирования, например, RetL-последовательности зависит от разных факторов. Одним из важных факторов является природа мишени клеточной популяции. Хотя ретровирусы изучались широко и применялись для генной терапии, в целом, они непригодны для инфицирования клеток, которые не делятся, но могут быть полезны для терапии рака, поскольку они интегрируют и экспрессируют свои гены в реплицирующихся клетках. Они пригодны для ис 002544 40 пользования ex vivo и являются привлекательными в этом отношении, вследствие их устойчивой интеграции в геном клетки-мишени. Аденовирусы представляют собой эукариотические ДНК-вирусы, которые можно модифицировать для эффективной доставки терапевтического или репортерного трансгена к разным типам клеток. Основные аденовирусные типы 2 и 5 (соответственно, Ad2 и Ad5), которые вызывают респираторное заболевание у людей, в настоящее время применяются для генной терапии мышечной дистрофии Дюшена(DMD) и муковисцидоза (CF). И Ad2 и Ad5 относятся к подклассу аденовирусов, которые не ассоциированы с малигнизациями человека. Аденовирусные векторы обладают способностью создавать очень высокие уровни доставки трансгена практически во все типы клеток, независимо от митотического состояния. Высокие титры (1013 бляшкообразующих единиц/мл) рекомбинантного вируса можно легко получить у клеток 293 (трансформированная аденовирусом комплементационная клеточная линия эмбриональной почки человека: АТСС CRL1573) и криосохраняемая в течение продолжительных периодов без ощутимых потерь. Эффективность этой системы для доставки терапевтического трансгена in vivo, который комплементирует генетический дисбаланс, была продемонстрирована на животных моделях различных болезней. См., Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268Engl. J. Med., 309 (11983):288-296 (1983); S. Ishibashi с соавт., J. Clin. Invest., 92:883-893 (1993); и S. Ishibashi с соавт., J. Clin. Invest., 93:18891893 (1994), которые все включены здесь путем ссылки. Действительно, рекомбинантный аденовирус, дефективный по репликации, кодирующий кДНК трансмембранного регулятора(CFTR) муковисцидоза, был одобрен для использования на человеке, по крайней мере, в двух клинических CF-испытаниях. См., например, J. Wilson, Nature, 365;691-692 (Oct., 21,1993). Дополнительное подтверждение безопасности рекомбинатных аденовирусов для генной терапии заключается в широком опыте применения живых аденовирусных вакцин на человеческие популяции. Аденовирусы человека включают линейную, приблизительно 36 т.п.н. двухцепочечную геномную ДНК, которую разделили на 100 единиц генетической карты (m.u.), каждая из которых имеет в длину 360 п.н. Эта ДНК содержит короткие инвертированные концевые повторы(ITR) на конце генома, который требуется для репликации вирусной ДНК. Эти генные продукты организованы в ранние (Е 1-Е 4) и поздние(L1-L5) области, основанные на экспрессии до или после инициации синтеза вирусной ДНК. См., например, Horwitz, Virology, 2d edit., ed. 41 Впервые образованный рекомбинант, аденовирусы, дефицитные по репликации, которые были созданы для генной терапии DMD и других наследственных болезней, содержат делеции полной Е 1 а- и неполной Elb-областей. Данный вирус, дефективный по репликации, выращивали в 293-клетках, содержащих функциональный Ela-ген аденовируса, который создает трансдействующий белок Ela. Е 1-делетированные вирусы способны реплицироваться и продуцировать в 293-клетках инфекционные вирусы, которые создают генные продукты областиEla и Elb в транс. Этот результирующий вирус способен инфицировать многие типы клеток и может экспрессировать интродуцированный ген(созданный под своим собственным промотором), но не может реплицировать его в клетке,которая не несет El-область ДНК, если клетка не инфицирована при очень высокой множественности инфицирования. Аденовирусы обладают тем преимуществом, что они обладают широким кругом хозяев, могут инфицировать неподвижные, полностью дифференцированные клетки, такие как нейроны, и, по существу, не являются онкогенными. Аденовирусы не интегрируются в геном хозяина. Вследствие того, что они существуют не в хромосомах, риск мутагенных вставок сильно снижен. Ali с соавт., см. выше, на 373. Рекомбинантные аденовирусы(rAdV) производят очень высокие титры, умеренно стабильные вирусные частицы, высокие уровни экспрессии и могут инфицировать широкий круг хозяев. Их естественными хозяйскими клетками являются клетки эпителия дыхательных путей, поэтому они пригодны для терапии легочных раков. Перенос, опосредованный бакуловирусом,обладает несколькими преимуществами. Перенос бакуловирусного гена может происходить в реплицирующихся и не реплицирующихся клетках и может происходить в клетках почек, а также в гепатоцитах, нервных клетках, селезенки, кожи и мышечных. Бакуловирус не реплицируется и не патогенен в клетках млекопитающих. Людям недостает предсуществующих антител к рекомбинантному бакуловирусу, которые могли бы блокировать инфекцию. Кроме того, бакуловирус обладает способностью инкорпорироваться и трансдуцировать очень большие вставки ДНК. Адено-ассоциированные вирусы (AAV) также использовали в качестве векторов для терапии соматических генов. AAV представляет собой небольшой вирус с одноцепочечной ДНК с простой геномной организацией (4,7 т.п.н),что делает его идеальным субстратом для генной инженерии. Две открытые рамки считывания кодируют серии полипептидов - rep и cap. 42 Фланкирующие открытые рамки считывания rep и cap на 5'- и 3'-концах представляют собой 145 п.н. инвертированные концевые повторы (ITR),первый из которых, 125 п.н., обладает способностью формировать Y- или Т-образные дуплексные структуры. Важные для создания AAVвекторов полные rep- и сар-домены могут быть вырезаны и заменены на терапевтический или репортерный трансген. См. B.J. Carter, в Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press,pp. 155-168 (1990). Было показано, что ITR представляют минимальную последовательность, необходимую для репликации, сохранения, упаковки и интеграции AAV-генома. Жизненный цикл AAV двухфазный, составленный из латентного и литического эпизодов. Во время латентной инфекции AAVвирионы входят в клетку в виде инкапсулированной одноцепочечной ДНК, и некоторое время спустя достигают ядра, где ДНК AAV устойчиво интегрируется в хромосому хозяина без необходимости в делении клетки хозяина. В отсутствие хелперного вируса, интегрированный AAV-геном остается латентным, но способен активироваться и сохраняться. Литическая фаза жизненного цикла начинается тогда, когда клетка, несущая AAV-провирус, подвергается вторичному заражению с помощью герпесвируса или аденовируса, который кодирует хелперные функции, которые привлекаются с помощью AAV, чтобы облегчить его вырезание их хроматина хозяина (B.J. Carter, выше). Инфицирующая родительская одноцепочечная ДНК увеличивается в объеме до дуплексной реплицирующейся формы (RF) ДНК rep-зависимым образом. Сохраняемые геномы AAV упаковываются в ранее сформированные белковые капсиды (икосаэдрическая симметрия, приблизительно, 20 нм в диаметре) и высвобождаются в виде инфекционных вирионов, которые упаковали либо +, либо -одноцепочечные ДНКгеномы с последующим клеточным лизисом. Адено-ассоциированные вирусы (AAV) обладают существенным потенциалом для генной терапии. Вирусные частицы очень стабильны, а рекомбинантные AAV (rAAV) обладают"лекарственно-подобными" характеристиками,которые могут быть выделены центрифугированием в градиенте плотности CsCl. Они теплоустойчивы и могут быть лиофилизированы до порошка и регидратированы до полной активности. Их ДНК устойчиво интегрирована в хозяйские хромосомы, чтобы длительно экспрессироваться. Их хозяйский ряд широк и AAV не вызывает известное заболевание, потому что данные рекомбинатные векторы не токсичны. Однажды интродуцировавшись в клеткумишень, обсуждаемые последовательности могут быть идентифицированы традиционными методами, такими как ДНК-гибридизация с использованием проб, включающих последовательности, которые гомологичны/комплемен 43 тарны клонированным в данном векторе генным последовательностям. В другой методике данная последовательность(и) может быть идентифицирована в присутствии или в отсутствие"маркерной" генной функции (например, тимидинкиназной активности, устойчивости к антибиотику и т.д.) путем интродукции экспрессирующего вектора в клетку-мишень. Препараты и введение Соединения настоящего изобретения могут быть введены любым способом, который является терапевтически приемлемым. Способ введения может включать инъекции с помощью парентеральных путей, таких как внутривенный,внутрисосудистый, внутриартериальный, подкожный, внутримышечный, внутриопухолевый,внутрибрюшинный, внутрижелудочный, внутриэпидуральный или других, а также пероральный, назальный, глазной, ректальный или местный. Также в настоящее изобретение отдельно включено поддерживающее введение,с помощью таких средств, как депонирующие инъекции или эродийные имплантанты. Особенно рассматривается локализованная доставка с помощью таких средств, как доставка через катетер по одной или нескольким артериям, таких как почечная артерия или сосуд, снабжающие локализованную опухоль. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько органических или неорганических ингредиентов, естественных или синтетических, с которыми сочетают мутантный протоонкоген или мутантный онкопротеин, чтобы облегчить их применение. Подходящий носитель включает стерильный физиологический раствор, хотя другие фармацевтически приемлемые водные и не водные изотонические стерильные растворы и стерильные суспензии известны специалистам в данной области. В этом отношении термин носитель" включает липосомы и HIV-1-tat-белок (см. Chen с соавт., Anal. Biochem. 227:168-175, 1995), а также любые плазмиды и вирусные экспрессирующие векторы. "Эффективное количество" относится к такому количеству, которое способно улучшать или замедлять развитие заболеваемости, дегенеративного или повреждающего состояния. Эффективное количество можно определить на индивидуальной основе или на основе частичного рассмотрения симптомов, чтобы лечить и получить желаемые результаты. Эффективное количество может быть определено одним из рядовых специалистов в данной области, применяющим такие факторы или применяющим лишь в рутинном экспериментировании. Липосомная система может представлять собой разнообразные одноламеллярные везикулы, мультиламеллярные везикулы или стабильные плюриламеллярные везикулы, и могут быть приготовлены и введены в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в дан 002544 44 ной области, например, в соответствии с указаниями на патенты Соединенных штатов 5169637, 4762915, 5000958 или 5185154. Кроме того, желательно экспрессировать новые полипептиды настоящего изобретения, а также другие выбранные полипептиды, такие как липопротеины, чтобы усилить их связывание с липосомами. В качестве примера, лечение острой почечной недостаточности человека с помощью липосом-инкапсулированного RetL можно осуществить in vivo путем интродуцирования RetL в клетки, нуждающиеся в таком лечении с использованием липосом. Эти липосомы можно доставить через катетер в ренальную артерию. Рекомбинантный RetL-белок выделяли очисткой, например, из СНО-клеток с помощью аффинной хроматографии или любым другим традиционным методом, затем смешивали с липосомами и инкорпорировали в них с высокой эффективностью. Инкапсулированный белок можно проверить in vitro по любому эффекту на стимуляцию клеточного роста. Настоящее изобретение предполагает также, что новый полипептид данного изобретения может быть введен животному с помощью липосомной системы доставки для того, чтобы усилить их устойчивость и/или иммуногенность. Доставка новых полипептидов с помощью липосом может быть особенно преимущественной, потому что липосомы могут быть поглощены фагоцитными клетками при лечении животного. Такие клетки при заглатывании липосомной мембраной и последующего присутствия полипептидов в иммунной системе в соединении с другими молекулами необходимы для выявления сильного иммунного ответа. Любой из новых RetL-полипептидов настоящего изобретения может использоваться в форме фармацевтически приемлемой соли. Соответствующие кислоты и основания, которые способны образовывать соли с полипептидами настоящего изобретения, хорошо известны специалистам в данной области и включают неорганические и органические кислоты и основания. Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно в виде иллюстрации и примера для целей лучшего восприятия,специалистам в данной области необходимо иметь в виду, что в рамках объема настоящего изобретения могут быть осуществлены определенные изменения и модификации, которые не ограничиваются объемом нижеследующей формулы изобретения.