Способ приготовления сусла, способ изготовления пива, способ изготовления питьевого спирта, применение &alpha-l-арабинофуранозидаз а и в и смесь ферментных препаратов

1 Настоящее изобретение касается способа приготовления сусла, способов изготовления пива и питьевого спирта, а также применений 1-арабинофуранозидаз А и В. Изобретение также касается смеси ферментных препаратов, содержащих ферменты, обладающие арабинофуранозной высвобождающей активностью. Предпосылки создания изобретения Применение ферментов при изготовлении сбраживаемого сусла уже давно известно. Для варки пива, например, зерна и/или осоложенные зерна ожижают и осахаривают, для того чтобы они произвели сбраживаемые сахара. Стадии сжижения (затирания) могут быть усовершенствованы при помощи термостабильных амилаз, как описано, например, в патентах США 4 285 975 или 5 180 669. Также, для того чтобы улучшить брожение, используются протеазы для повышения количества несвязанного азота в сусле. После фильтрации сжиженного и осахаренного затора, полученное сусло обрабатывают специальным штаммом дрожжей (Saccharomyces sp.), которые превращают сахара в этиловый спирт и характерные ароматические соединения. Однако в зернах злаков присутствуют,кроме крахмала, другие полисахариды. Например, присутствуют -глюканы (R.J. HENRY J.Sci. Food Agric. (1985) 36,1243-1253), как показано ниже для различных злаков: ЗлакGREGOR J. Inst Brew. (1991) 97, 39-44). глюканы обладают высокой вязкостью (N.WAGNER et al., Monatschrift fr Brauwissenschaft (1998) Heft 10, 384-395) и создают проблемы при фильтрации пива и сусла (S. AASTRUP Carlsberg Res. Commun. (1979) 44, 89304), если они не гидролизованы на стадии ожижения. По этой причине -глюканазы изBROWN Jr Biochim. Biophys. Acta (1978) 523,133-146) широко используются в промышленном масштабе, в дополнение к -глюканазе,присутствующей в солоде; последняя недостаточно термостабильна, чтобы сохранять активность во время процесса пивоварения (М. 2 К некрахмальным полисахаридам также относят пентозаны, структура которых была недавно широко изучена (Н. GRUPPEN et al.,Carbohydr. Res. (1992) 233, 45-64; G. ANNISONITO et al., Carbohydr. Chem. (1994) 13(3), 491498), в частности, структура полисахаридов ячменя и солода (R.J. VIETOR et al., Carbohydr.Res. (1994) 254, 245-255; R.J. VIETOR et al., Carbohydr. Polym. (1994) 24, 113-118). Патент Великобритании 2 150 933 касается применения пентозаназы из Penicillium emersonii для улучшения производства и экстракции сбраживаемых сахаров при пивоварении. Патент США 4 746 517 демонстрирует высокую эффективность ксиланолитической системы из Disporotrichum dimorphosporum,улучшающей фильтруемость сусла и пива. Использование ксиланазы В для улучшения фильтруемости сусла было также упомянуто в WO 94/14965. Там это применение включено в качестве ссылки. Применения, которые могут быть отмечены в связи с использованием ферментов в изготовлении сусла для брожения: WO 94/21785. Несмотря на успехи, которые были достигнуты в этой области, все еще имеется потребность в способах получения сусла с дальнейшим улучшением фильтруемости и/или более высоким выходом и в ферментных препаратах для использования в этих способах. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение представляет способ приготовления сусла, предусматривающий стадии:(a) приготовления затора осоложенных или неосоложенных злаков или смеси осоложенных или неосоложенных злаков в присутствии смеси ферментных препаратов,(b) фильтрацию полученного таким образом затора с получением сусла, причем указанная смесь ферментных препаратов представляет собой смесь, содержащую, по меньшей мере,препарат с -глюканазной активностью и препарат с -арабинофуранозной высвобождающей активностью, или смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с -глюканазной активностью, препарат с эндоксиланазной активностью и препарат с -арабинофуранозной высвобождающей активностью. Предпочтительно препарат с арабинофуранозной высвобождающей активностью представляет собой препарат, содержащий -Lарабинофуранозидазу (ЕС 3.2.1.55), или (1-4)-арабино-ксиланарабинофураногидролазу(АХН), или их смесь. Предпочтительно используют -L-арабинофуранозидазу или (1-4)арабиноксиланарабинофураногидролазу (АХН), полученную из штамма грибов Aspergillus. Предпочтительно,-L-арабинофуранозидаза представляет собой -L-арабинофуранозидазу А или В, полученную из штамма Aspergillus niger. Другой объект изобретения касается способа изготовления пива, предусматривающего приготовление сусла, сбраживание сусла и получение из него пива, причем приготовление сбраживаемого сусла осуществляют согласно вышеописанному способу по изобретению. И еще один объект изобретения касается способа изготовления питьевого спирта, предусматривающий приготовление сусла, сбраживание сусла и получение из него питьевого спирта, причем приготовление сусла также осуществляют согласно вышеописанному способу по изобретению. Еще один объект изобретения касается применения -L-арабинофуранозидазы В из штамма грибов Aspergillus niger для улучшения фильтруемости сусла, и еще один объект касается применения -L-арабинофуранозидазы А из штамма грибов Aspergillus niger для повышения выхода сусла. Изобретение также предоставляет смесь ферментных препаратов для использования в способе приготовления сусла, представляющую собой смесь, содержащую, по меньшей мере,препарат с -глюканазной активностью и препарат с -L-арабинофуранозной высвобождающей активностью, или смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с -глюканазной активностью, препарат с эндоксиланазной активностью и препарат с -L-арабинофуранозной высвобождающей активностью. В этой смеси ферментных препаратов,предпочтительно, препарат с арабинофуранозной высвобождающей активностью представляет собой препарат, содержащий -L-арабинофуранозидазу (ЕС 3.2.1.55), или (1-4)-арабиноксиланарабинофураногидролазу (АХН),или их смесь. Предпочтительно,-L-арабинофуранозидаза и (1-4)арабиноксиланарабинофураногидролаза (АХН), содержащиеся в этой смеси,получены из штамма грибов Aspergillus. Для целей данного описания препарат, содержащий или обеспечивающий требуемый фермент, имеющий желательную активность,далее будет сокращенно упоминаться как соответствующая ферментная "активность". Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что, когда сусло приготавливают в присутствии смеси ферментных активностей, включающей -глюканазную активность, -арабинофуранозидазную активность и предпочтительно эндо 1,4-ксиланазу, получается ожиженный и осахаренный затор, который отфильтровать гораздо легче, чем затор, полученный при использовании только -глюканаз или смесей глюканаз и эндоксиланазы. Более того, полу 001078 4 ченное после фильтрации такого затора сусло демонстрирует более высокий выход. Выход здесь относится к количеству сбраживаемыхcахаров в сусле, выражаемому в виде процентного содержания сахаров в сырье. Повышение выхода сусла зависит от выбранного солода. Солоды, приведенные здесь в качестве примера, показывают хорошие выходы и без добавления ферментных активностей в соответствии с изобретением. Более значительное повышение выхода достигается при использовании солода худшего качества, с несоложенными злаками или при смешанной варке. Производство сусла может быть осуществлено обычным образом, включая ожижение и осахаривание злакового сырья, обычно при помощи -амилаз и протеаз, чтобы получить ожиженный и осахаренный затор. Подходящим сырьем для начала производства являются злаки, или так называемые сырые или неосоложенные, или осоложенные, или смесь тех и других (смешанная варка). Например, могут быть использованы такие злаки как ячмень, пшеница, кукуруза, сорго, овес и рис,или осоложенные, или сырые, или в смеси. Предпочтительно использование способа по изобретению при 100% солодовой варке. В случае сырых злаков, стадия растворения обычно включает размалывание злакового сырья для получения муки с подходящим размером частиц, гидратирование с от приблизительно 1 до приблизительно 4, предпочтительно приблизительно с 3 частями воды, и необязательно, в зависимости от используемой эндопротеазы, с от приблизительно 50 до приблизительно 300 частей на миллион кальция, предпочтительно 200 частей на миллион Са 2+. Ферменты из Bacillus stearothermophilus являются менее зависимыми от кальция. Поэтому добавления Са 2+ в этом случае не требуется. Размер частиц размолотых злаков не должен превышать приблизительно 3 мм, не более 3,5% должны превышать 1,3 мм, не более 1,5% должны быть менее 0,25 мм. Ферменты, которые могут быть использованы в дополнение - это целлюлазы, -глюканазы или другие ферменты,разрушающие клеточную стенку растений. Среду для ожижения обычно доводят до уровня рН между 5 и 8, предпочтительно между приблизительно 6 и 1, используя, например,гидроксид кальция. Важно добавить -амилазу,предпочтительно термостабильную -амилазу, в среду для ожижения, так же, как и эндопротеазу в дозировке, достаточной для, по меньшей мере,частичного растворения злакового крахмала и,по меньшей мере, частичного разрушения белка. Подходящая дозировка -амилазы - приблизительно от 0,5 до 2,0, предпочтительно около 11,5 кг на тонну, если использовать B.A.T.S. Подходящая дозировка протеаз, в случае Brew 5ers протеазы 2000, - более 0,5 кг на тонну зернаPanstimase 400 следует использовать более 2 кг/т, предпочтительно более 5, более предпочтительно - более 10 кг/т. При ожижении ряд стадий обычно проводят при повышенной температуре: после добавления -амилазы и протеазы смесь выдерживают при температуре между приблизительно 40 и 65 С, предпочтительно между приблизительно 45 и 55 С, наиболее предпочтительно при 50 С,до тех пор пока не будет получено удовлетворительное oжижение. Необходимое время зависит от используемого злака или смеси злаков, но обычно достаточно от приблизительно 30 мин до приблизительно 2 ч. Впоследствии температуру постепенно повышают, причем скорость повышения температуры не имеет большого значения, до приблизительно 90-95 С и температуру поддерживают на этом уровне от приблизительно 30 мин до приблизительно 1 ч. Затем смесь охлаждают до температуры, при которой происходит осахаривание: обычно от приблизительно 50 С до приблизительно 70 С,предпочтительно между 55 и 65 С, лучше всего около 60 С. Температура может быть немного выше 70 С, в зависимости от термостабильности ферментов, используемых на стадии осахаривания. Когда достигнута предпочтительная температура, добавляют осахаривающие ферменты, такие как Brewers fermex (-амилаза) или Novamyl (рекомбинантная -амилаза),обычно в количестве от приблизительно 400 г/т до приблизительно 1 кг/т для Brewers fermex. Также часто используют глюкоамилазы. Осахаривание занимает от приблизительно 30 мин до приблизительно 2 ч, после чего температуру повышают до приблизительно 75 С - приблизительно 85 С, inter alia для инактивации ферментов и нежелательных микроорганизмов, и выдерживают при предпочтительной повышенной температуре около 10 мин, длительность этого периода не очень существенна. Полученный таким образом затор впоследствии фильтруют при помощи хорошо известного оборудования; достаточно воронки с фильтровальной бумагой Schleicher and Schuell. После фильтрации в сусле вызывают брожение подходящими дрожжами при условиях, зависящих от используемого штамма и конечной цели; в дополнение к варке пива данным изобретением предусматривается производство алкоголя в качестве биологического топлива или алкогольного напитка. Подходящие штаммы и подходящие условия хорошо известны специалистам в данной области. Другими ферментами, которые обычно используются при получении сусла, являются глюканазы. Предпочтительнее достаточно термостабильная -глюканаза, чтобы она сохраняла активность во время первой стадии стандартно 001078 6 го процесса варки (обычно несколько минут при 50 С и рН 5,6). Этим требованиям удовлетворяют некоторые микробные ферменты, например,-глюканаза из Penicillium emersonii,Trichoderma longibrachiatum, Bacillus amyloliquefaciens. Могут быть получены отличные результаты с -глюканазой из Bacillus amyloliquefaciens, которая коммерчески доступна от GistBrocades под торговым знаком Filtrase L(+), обладающей активностью около 600 BGR/г, лучше, чтобы -глюканазу получали из рекомбинантного штамма Bacillus amyloliquefaciens. Обычно могут быть использованы также протеазы, такие как Brewer's Protease и тому подобное. Эндоксиланазы, которые могут быть использованы, описаны в разделе предпосылок создания изобретения. Упомянутые там описания патентов включены в качестве ссылки. Эндо 1,4-ксиланаза(предпочтительно изофермент эндо I (R.A. FOURNIER Biotechnology and Bioeng. (1985) XXVII, 539-546) ) и -Lарабинофуранозидаза (предпочтительно изофермент А (F.J.M. KORMELINK et аl., Carbohydr. Res. (1993) 24, 345-353 могут быть получены от дикого, мутантного или рекомбинантного штаммов Aspergillus niger. В отношении -L-арабинозных высвобождающих активностей можно рассматривать несколько ферментов. Авторы изобретения показали, что использование АХН приводит к лучшей фильтруемости. Две -L-арабинозидазы изAspergillus niger приводят, как оказалось, к значительно более высоким скоростям фильтрации. Так как по образу действия АХН, -Lарабинозидазы А и В полностью различны,можно ожидать, что смесь из этих трех арабинозных высвобождающих активностей будет обеспечивать еще большее повышение скорости фильтрации. При использовании способа по изобретению можно в значительной степени повысить скорости фильтрации растворенной и осахаренной кашицы. Это дает такие преимущества, как ускорение процесса, меньшая засоряемость фильтров и большие объемы сусла. К тому же повышенный выход приводит к более экономичному способу варки. Сусло, полученное способом по изобретению, может использоваться при варке пива, изготовлении алкогольных напитков или биологического топлива (спирта). Применение изобретения и связанных с ним преимуществ проиллюстрировано подробнее в приведенных ниже не ограничивающих примерах. Экспериментальная часть 1/-глюканаза. В примерах используется -глюканаза изBacillus amyloliquefaciens, которая коммерчески доступна от Gist-Brocades под торговым знакомBGR/г. 2/Эндо 1,4-ксиланаза. Эндоксиланазу получают из чистой культуры Aspergillus niger в стерильных резервуаре и среде. Культуральная среда содержит соответствующие источники углерода и азота, а именно минеральные соли. Брожение проводят при постоянной температуре между 30 и 40 С, рН поддерживают в диапазоне 3-5. Активность фермента измеряют по гидролизу ксилана из суспендированных частиц овса(35 г/л) в 1 М глициновом буфере рН 2,75. Вязкость раствора определяют при помощи капиллярного вискозиметра (типа Ubbelhode) при 47 С. Время dt, требуемое верхнему мениску жидкости для того, чтобы опуститься между двумя контрольными точками, измеряют в течение периода Т. Наклон графика зависимости Т от 1/dt дает фактическую кинетическую константу. 1 единица Lyx - это количество фермента, требуемое,чтобы достигнуть значения 1 мин-1 для этой кинетической константы. 3/-L-арабинофуранозидаза. Изофермент А или изофермент В (F.J.M.(1991) 35, 753-758) получают из культуры рекомбинантных штаммов Aspergillus niger илиAspergillus nudulans. Аминокислотная последовательность, кодирующая ДНК, так же, как и рекомбинантное получение арабинофуранозидаз А и В, подробно описаны в заявке ЕР 0 506 190A1, опубликованной 30 сентября 1992, в частности, в примерах и схемах и в списке последовательности, соответствующие части которой включены здесь в качестве ссылки. Активность изоферментов А и В измеряют по гидролизу п-нитрофенилL-арабинофуранозида. 1 единица ARF - это количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкмоля п-нитрофенола в минуту при условиях опыта,описанных в (Z. GUNATA et al., J. Agric. FoodChem. (1989) 38, 772). Пример 1. Сусло готовят из размолотого солода в соответствии со стандартными технологическими инструкциями по приготовлению светлого пива. Солод размалывают на мельнице ЕВС MIAG в соответствии со стандартными методиками, т.е. обеспечивая разницу от тонкого (1 мм) до грубого (2,5 мм) экстракта в диапазоне 1,5-2%. Одну часть солода гидратируют с 3 частями воды или водного раствора фермента при 50 С. Эту температуру поддерживают 20 мин, затем ее повышают до 63 С (1 С/мин) и поддерживают 30 мин. Потом среду нагревают до 72 С(1 С/мин) и выдерживают при этой температуре 20 мин. Наконец среду нагревают до 76 С и вы 001078 8 держивают при этой температуре 5 мин. Добавляют воду для компенсации испарения. Полученный затор заливают в воронку с фильтром из фильтровальной бумаги Schleicher and Schuell. Объем отфильтрованного сусла измеряют через 15 мин. Плотность определяют в конце фильтрации. Эта величина позволяет вычислить степень экстракции и выход. 1-я серия (Британский солод). Проводят 5 варок с различными ферментами, как показано в таблице 1: Номер варки 1 2 3 4 5Biotechnol. (1991) 35, 753-758) использовали для гидролиза арабинозных участков арабиноксиланов. Дозировка была 0,15 мг чистой АХН на кг солода (АХН не активна на п-нитрофенилLарабинофуранозиде, поэтому у нее нет ARF активности). Результаты представлены в таблице 2: Номер варки 1 2 3 4 5 2-я серия (Французский солод). Те же варки, которые были описаны в первой серии, проводят из французского солода. Результаты представлены в таблице 3: Номер варки 1 2 3 4 5 В этих двух сериях комбинация глюканаза + эндоксиланаза + -L-арабинофуранозидаза изофермент В показывает себя лучшим образом в улучшении фильтрации сусла, тогда как та же комбинация, в которой -Lарабинофуранозидаза изофермент В заменена на -L-арабинофуранозидазу изофермент А,показывает себя лучшим образом в повышении выхода, причем фильтрация также значительно улучшается по сравнению с варкой без ферментных препаратов (варка 1). Пример 2. Сусло получают по примеру 1, всегда с той же партией солода, но варьируют композицию смеси ферментов. В соответствии с постановкой эксперимента проводят 12 варок, для того чтобы определить роль каждого компонента смеси по отношению к улучшению выхода и фильтрации. Во всех опытах -L-арабинофуранозидаза представлена изоферментом А из A. niger. Все произведенные действия представлены в таблице 4: Номер варки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Из варок 9-10-11 можно определить стандартные отклонения: 2,1 мл для объема, отфильтрованного через 15 мин; 0,03% для выхода. Из варок с 1 по 8 можно определить эффект каждого компонента и эффект взаимодействия между компонентами: Ферментная активность Только выделенные жирным шрифтом цифры можно считать значительными ( 95%).-L-арабинофуранозидаза А одна и в сочетании с -глюканазой дает самый сильный эффект в улучшении фильтрации, тогда как -глюканаза и эндоксиланаза по одиночке и в комбинациях привносят значительный вклад в улучшение выхода. Пример 3. В этой серии используют те же комбинации ферментов: 60 BGR/кг солода 10 но варят разные солоды как с этой ферментной комбинацией, так и без нее. Сусло получают в соответствии с той же методикой, что и в примере 1. Результаты представлены в таблице 6: Объем, отфильтрованный через 15 мин (мл) Источник солода без ферс фермента ментом США (1) 131 171 США (2) 114 164 Великобритания 117 167 Канада (1) 106 153 Канада (2) 99 137 Франция 89 118 Таким образом, смесь ферментных активностей эффективна для улучшения фильтрации,какой бы солод не варили. Эффект по выходу низок, но это обусловлено главным образом тем, что используемые солоды и без того очень высокого качества. Пример 4. Пшеница используется на некоторых пивоварнях как сырьевая добавка. Этот злак содержит большое количество пентозанов. Это одна из причин, по которым упомянутая выше комбинация ферментов тестировалась в смешанной варке. Сусло получают в соответствии с той же методикой, что и в примере 1, но 20% солода заменяют на 20% пшеницы. В таблице 7 описаны все произведенные действия: Номер варки 1 2 3 4 5 6 Эти результаты подтверждают пользу от описанной в изобретении комбинации в случае варок, включающих пшеничные добавки. Пример 5. В этом примере сусло готовится из сырых зерен ячменя разновидности PLAISANT. Зерна ячменя размалывают на мельнице ЕВС MIAG, для того чтобы получить пригодную для фильтр-пресса ячменную муку. 57 г ячменной муки добавляют в 300 мл воды или водного раствора фермента при 50 С. Эту температуру поддерживают 1 ч, затем среду нагревают до 63 С (1 С/мин) и выдерживают при этой температуре 30 мин. Потом среду нагревают до 90 С (1 С/мин) и выдерживают при этой температуре 20 мин. Добавляют воду для компенсации испарения. Затем полученный затор наливают в воронку с фильтром из бумагиARF получен из Аrа А) Номер Ферменты варки Микробный источник Единицы/кг ячменя 1 0 2 Bacillus amyloliquefaciens + 90 BGR + 1200 LYX + производится Gist-Brocades под торговым знаком Natugrain Эти результаты показывают, что описанная в изобретении комбинация, по меньшей мере, также хорошо или даже лучше показывает себя, чем существующие препараты, в случае варок со 100% неосоложенным ячменем. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ приготовления сусла, предусматривающий стадии:(a) приготовления затора осоложенных или неосоложенных злаков или смеси осоложенных или неосоложенных злаков, в присутствии смеси ферментных препаратов,(b) фильтрацию полученного таким образом затора с получением сусла, отличающийся тем, что указанная смесь ферментных препаратов представляет собой смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с -глюканазной активностью и препарат с -арабинофуранозной высвобождающей активностью, или смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с глюканазной активностью, препарат с эндоксиланазной и препарат с -арабинофуранозной высвобождающей активностью. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат с арабинофуранозной высвобождающей активностью представляет собой препарат,содержащий -L-арабинофуранозидазу (ЕС-L-арабинофуранозидаза или (1-4)арабиноксиланарабинофураногидролаза (АХН) получена из штамма грибов Aspergillus. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что-L-арабинофуранозидазу В из штамма Aspergillus niger. 6. Способ изготовления пива, предусматривающий приготовление сусла, сбраживание сусла и получение из него пива, отличающийся тем, что приготовление сбраживаемого сусла осуществляют согласно способу по любому из пп.1-5. 7. Способ изготовления питьевого спирта,предусматривающий приготовление сусла,сбраживание сусла и получение из него питьевого спирта, отличающийся тем, что приготовление сусла осуществляют согласно способу по любому из пп. 1-5. 8. Применение -L-арабинофуранозидазы В из штамма грибов Aspergillus niger для улучшения фильтруемости сусла. 9. Применение -L-арабинофуранозидазы А из штамма грибов Aspergillus niger для повышения выхода сусла. 10. Смесь ферментных препаратов для использования в способе приготовления сусла,представляющая собой смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с -глюканазной активностью и препарат с -L-арабинофуранозной высвобождающей активностью, или смесь, содержащую, по меньшей мере, препарат с глюканазной активностью, препарат с эндоксиланазной активностью и препарат с -Lарабинофуранозной высвобождающей активностью. 11. Смесь ферментных препаратов по п.10,отличающаяся тем, что препарат с арабинофуранозной высвобождающей активностью представляет собой препарат, содержащий -Lарабинофуранозидазу (ЕС 3.2.1.55), или (1-4)-арабиноксиланарабинофураногидролазу(АХН), или их смесь. 12. Смесь ферментных препаратов по п.11,отличающаяся тем, что -L-арабинофуранозидаза и (1-4)арабиноксиланарабинофураногидролаза (АХН) получены из штамма грибов