Специфичные ингибиторы pdgfrβ

Изобретение относится к новым специфичным антагонистам PDGFR. Антагонисты включают антитела, которые могут иметь двойную специфичность. Антитела используют для замедления или прекращения роста опухоли и/или для лечения связанных с ростом сосудов заболеваний. Изобретение также включает комбинации специфичных антагонистов PDGFR с антагонистами VEGFR для такого лечения. Антагонисты также можно вводить в сочетании с другими антиангиогенными или противоопухолевыми лекарственными средствами. Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США 60/923979,поданной 17 апреля 2007 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Область техники Настоящее изобретение относится к способам и композициям для ингибирования ангиогенеза и роста опухоли. Изобретение демонстрирует влияние специфичного ингибирования бета-рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) на ангиогенез и обеспечивает лечение ангиогенеза с использованием специфичных антагонистов PDGFR, отдельно или в сочетании с ингибиторами рецептора VEGF. Специфичными ингибиторами могут быть антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител. Далее,ингибиторы могут иметь двойную специфичность. Уровень техники Тромбоцитарные факторы роста (PDGF) представляют собой семейство эффективных митогенов для почти всех клеток, полученных из мезенхимы. Существует четыре изоформы PDGF: А, В, С и D, которые образуют пять различных димерных соединенных дисульфидными связями белков PDGF: AA, ВВ,АВ, СС и DD. Эти факторы роста реализуют свои клеточные эффекты через два структурно близких друг другу рецептора тирозинкиназы: рецептор PDGF(PDGFR) и рецептор PDGF(PDGFR) (Sandy, J.R.,1998, Br. J. Orthod. 25:269-74; Betsholtz C. et al., 2001, Bioessays 23:494-507). Рецепторы PDGFRa и PDGFR структурно сходны и могут образовывать гетеродимеры, а также гомодимеры. Рецепторы PDGF-ВВ и PDGF-DD являются первичными активаторами длягомодимерных рецепторов. PDGF-AA активирует только димеры рецепторов , в то время как PDGF-AB, PDGFBB и PDGF-CC активируют и димеры рецепторов . Молекулы димерных лигандов связываются с двумя белками-рецепторами одновременно и вызывают димеризацию рецептора, автофосфорилирование специфичных остатков в пределах цитоплазматического домена рецептора и внутриклеточную передачу сигнала. В итоге, активация сигнального пути PDGFR индуцирует различные клеточные ответы, включая пролиферацию и миграцию клеток. Полагают, что ангиогенез необходим как для роста опухоли, так и для метастазирования. Развитие системы сосудов или васкулогенез включает сборку двух главных типов клеток: клеток эндотелия (КЭ) и перицитов/гладкомышечных клеток сосуда (ГМК) в зрелые кровеносные сосуды. Участие сигнального пути PDGF-B/PDGFR в васкулогенезе подтверждено на мышах с нокаутом PDGF-В и PDGFR. Фенотипы нокаута PDGF-B и PDGFR фактически идентичны в том отношении, что у мышей наблюдают кровотечения из-за уменьшения покрытия перицитами и гладкомышечными клетками в сосудах. Исследования показали, что PDGFR участвует в привлечении перицитов в капилляры и развитие в сосудах гладкомышечных клеток. Привлечение перицитов для покрытия молодого сосуда важно для его стабилизации и дальнейшего создания сосудистой сети. Сосуды без достаточного покрытия перицитами более уязвимы к ингибированию VEGF, чем хорошо развитые зрелые сосуды. Оказалось, что множество ингибиторов тирозинкиназ, разработанных в качестве противоопухолевых препаратов, ингибируют PDGFR. Тем не менее, по меньшей мере, эти соединения имеют множественные тирозинкиназы-мишени. Например, иматиниб мезилат (Gleevec/ST571) был разработан в качестве ингибитора тирозинкиназы Abelson (Abl), но также ингибирует c-kit, PDGFR и PDGFR. Сунитиниб малат (Sutent/SU11248) является перорально применимым ингибитором тирозинкиназ широкого спектра с активностью против VEGFR, PDGFR, c-kit и FLT-3. СР 673,451 является ингибитором какPDGFR, так и PDGFR. Поскольку эти небольшие молекулы-антагонисты не являются специфичными в отношении этих рецепторов, представляется невозможным различить вклад сигнала от PDGFR в ангиогенез, включая связанный с опухолями ангиогенез, стимуляцию и рост опухоли, или токсичность,связанную с введением таких соединений, которая может являться следствием нежелательного действия многочисленных рецепторов. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает специфичные антагонисты PDGFR, демонстрирующие роль PDGFR в ангиогенезе, включая ангиогенез, который поддерживает рост и выживание опухоли, и обеспечивает способы лечения опухолей и ангиогенных заболеваний. Изобретение также демонстрирует преимущество одновременного ингибирования передачи сигнала через PDGFR и VEGFR. Краткое описание изобретения Изобретение обеспечивает специфичный к PDGFR антагонист передачи сигнала с участиемPDGFR. В одном варианте реализации изобретения, специфичный антагонист PDGFR является антителом, которое специфично связываетрецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). Каждое такое антитело имеет гипервариабельные участки, которые по меньшей мере примерно на 90% гомологичны или примерно на 90% идентичны SEQ ID NO:20 в участке CDRH1; SEQ ID NO:22 в участкеCDRL2; и SEQ ID NO:32 в участке CDRL3. Другое подобное антитело включает последовательность аминокислот вариабельного домена (вариабельной области) тяжелой цепи SEQ ID NO:18 и последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:26. В другом варианте реализации такое антитело имеет гипервариабельные участки, которые по меньшей мере примерно на 90% гомологичны SEQ ID NO:4 в участке CDRHl; SEQ ID NO:6 в участке CDRH2; SEQ ID NO:8 в участке CDRH3;SEQ ID NO:12 в участке CDRL1; SEQ ID NO:14 в участке CDRL2; и SEQ ID NO:16 в участке CDRL3. Другое такое антитело включает последовательность аминокислот вариабельного домена тяжелой цепиSEQ ID NO:2 и последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:10. Изобретение также включает специфическое к PDGFR антитело, которое связывает тот же или перекрывающийся эпитоп, что и одно из вышеупомянутых антител. Антитела настоящего изобретения могут быть химерными, гуманизированными или антителами человека. Антитела настоящего изобретения могут также быть антиген-связывающими фрагментами,такими как одноцепочечные антитела, Fab и F(ab')2 фрагменты, одноцепочечные Fvs и однодоменные антитела. Антитела также включают двойные (diabodies) и тройные антитела (triabodies). Кроме того,антитела могут иметь двойную специфичность. Изобретение далее обеспечивает изолированные полинуклеотиды, которые кодируют такие антитела, векторы экспрессии и клетки-хозяева, продуцирующие антитела. Изобретение обеспечивает способ модуляции активности -рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества специфичного антагониста PDGFR. В одном варианте реализации изобретения эффективное количество специфичного антагониста PDGFR используют для ингибирования ангиогенеза у млекопитающего. В другом варианте реализации эффективное количество специфичного антагониста PDGFR используют для уменьшения роста опухоли у млекопитающего. Специфичный антагонист PDGFR может являться антителом, которое связывает PDGFR или любое другое вещество, которое связывает PDGFR или лиганд PDGFR и уменьшает или блокирует обеспечиваемую PDGFR передачу сигнала. Способы лечения далее могут включать совместное введение с антагонистом VEGFR. Кроме того, способы лечения могут включать вещество, которое одновременно является PDGFR специфичным антагонистом и антагонистом VEGFR, такое как антитело с двойной специфичностью. В соответствии с настоящим изобретением лечение опухолей и состояний, связанных с ангиогенезом, может далее включать введение антинеопластического средства, например химиопрепарата или облучения. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано количественное связывание рецептора и тест на блокирование для антитела кPDGFR 1 В 3. (А) Очищенные Fab-фрагменты или полноразмерный 1 В 3 IgG добавляли в планшеты, покрытые mPDGFR/Fc (1 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связавшиеся с планшетом антитела детектировали с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител козы к антителам человека. (В) Антитело 1 В 3 или Fab сначала смешивали с фиксированным количествомmPDGFR/Fc (50 нг) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь затем переносили в планшет, покрытый PDGF-BB (0,5 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связавшиеся с планшетом mPDGFR/Fc детектировали с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена антител козы к Fc-фрагментам человека. Антитело IMC-1121 является антителом к VEGFR2 человека. Данные представляют средние значения со стандартным отклонением для трех повторностей. На фиг. 2 показано ингибирование индуцированного PDGF-BB фосфорилирования рецептора и следующих за ним сигнальных молекул МАРК и Akt, возникающее вследствие связывания антитела 1 В 3 с PDGFR поверхности клетки. (А) Анализ с помощью проточной цитометрии клеток NIH/3T3 (фибробласты), D122 (легочная карцинома Льюиса), 4 Т 1 (рак груди), В 16 (меланома) и H5V (PmTтрансформированные клетки эндотелия), инкубированных с антителами 1 В 3 к PDGFR и конъюгированными с FITC антителами к Fc человека. (В) Ингибирование индуцируемого PDGF-BB фосфорилирования рецептора в клетках NIH-3T3. (С) Ингибирование индуцируемого PDGF-BB фосфорилирования рецептора в клетках D122. (D) Ингибирование индуцируемого PDGF-BB фосфорилирования АКТ и р 44/42 MAP киназы в клетках D122. Фиг. 3 демонстрирует влияние обработки антителом 1 В 3 к mPDGFR на рост ксенографтных опухолей человека in vivo. Шесть ксенографтных моделей, SK-OV-3, OV-CAR-8, ВхРС-3, OV-CAR-5, Caki-1 и NCI-H460 (от А до F, соответственно) использовали для изучения влияния действия 1 В 3 на ксенографтные опухоли у безтимусных ("голых") мышей. Мышей с развитыми опухолями (250-300 мм 3) произвольно делили на группы и обрабатывали 1 В 3, нормальным IgG человека или солевым раствором путем внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю (за исключением модели ВхРС-3, в которой мышей обрабатывали три раза в неделю) в указанной дозировке. Объемы опухолей измеряли дважды в неделю и представляли в виде среднегостандартное отклонение. 1 показывает потерю одной мыши из-за острого течения заболевания. Антитело 1 В 3 связывает PDGFR мыши, но не человека. Соответственно, наблюдаемые ответы на обработку являются результатом ингибирования стимулирования клеток-хозяев. Фиг. 4 демонстрирует влияние комбинированной обработки антителом 1 В 3 (к mPDGFR) и антителом DC101 (к mVEGFR2) на рост ксенографтных опухолей человека in vivo. Подкожные ксенографты-2 019595 ВхРС-3 (А) или 5106 NCI-H460 (В) пересадили самкам безтимусных мышей (nu/nu). Когда опухоли достигали 300-350 мм 3, мышей перемешивали, произвольно делили на четыре группы (n=12) и вводили солевой раствор (фармакопея США), 40 мг/кг 1 В 3, 40 мг/кг DC101 или 40 мг/кг 1 В 3 плюс 40 мг/кгDC101, три раза в неделю. Объемы опухолей измеряли дважды в неделю и представляли в виде среднегостандартное отклонение. 1 показывает гибель одной мыши вследствие острого течения заболевания. Антитело 1 В 3 связывает PDGFR мыши, но не человека. Соответственно, наблюдаемые ответы на обработку являются результатом ингибирования стимулирования клеток-хозяев. Фиг. 5 представляет результаты иммуногистохимического анализа ксенографтов человека после обработки 1 В 3, DC101 или DC101 плюс 1 В 3. На 34-й день после обработки (модель ВхРС 3, панель от А до С) или 50-й (модель NCI-H460, панель от D до F) умерщвляли шесть мышей из каждой группы и обрабатывали опухоли с помощью ИГХ-анализа. Опухоли препарировали и дважды окрашивали на кровеносные сосуды (антитела к CD31), и на перициты/покрытие ГМК (-SMA, панели В и Е). Для каждого среза делали пять цифровых иммунофлюоресцентных снимков периферии и сердцевины опухоли и подсчитывали общую долю CD31+-сосудов (панели А и D), -SMA+-сосудов (панели В и Е) и процент двойных CD31+/-SMA+ среди общего числа CD31+ сосудов (панели С и F). Для измерения степени васкуляризации отдельных срезов опухоли использовали два разных количественных способа: плотность сосудов (число сосудов/мм 3) и процент площади сосудов (% площади сосудов в общей площади опухоли). Для статистического анализа использовали двухпараметрический дисперсный анализ и критерий наименьшей значимой разности Фишера для множественных сравнений (программное обеспечение SigmaStat 3,1 Systat Software, Inc., Point Richmond, CA). P0,05 по сравнению с группой солевого раствора. Белые столбики - периферия опухоли; закрашенные столбики - сердцевина опухоли. На фиг. 6 показано связывание с рецептором блокирования и лиганда (PDGF-BB) специфичным 2 С 5 антителом человека относительно PDGFR человека и PDGFR мыши. Связывание и блокирование лиганда сопоставляли со специфичным к PDGFR антителом 1 ВЗ, которое связывает только PDGFR мыши. На фиг. 7 представлен Вестерн-блот, демонстрирующий ингибирование индуцированного лигандом(PDGF-BB) фосфорилирования PDGFR в клетках опухоли человека Caki-1 антителом к PDGFR 2C5. Антитело также подавляет фосфорилирование Akt и Р 44/42. На фиг. 8 представлен Вестерн-блот, демонстрирующий ингибирование индуцированного лигандом(PDGF-BB) фосфорилирования PDGFR в клетках мыши линий NIH-3T3 и D122 антителом к PDGFR 2C5. На фиг. 9 представлен рост шести подкожных ксенографных опухолей человека у "голых" мышей,получавших антитело к PDGFR 1 В 3 (специфическое для PDGFR мыши) и/или 2 С 5 (которое связываетPDGFR как мыши, так и человека). На фиг. 10 представлен рост шести подкожных ксенографных опухолей человека у "голых" мышей,получавших антитело к PDGFR 2C5 (которое связывает PDGFR как мыши, так и человека) и специфическое антитело к VEGFR-2 мыши (DC101). На фиг. 11 показаны результаты теста на миграцию клеток, демонстрирующие, что 2C5 подавляет стимулируемую PDGF-BB миграцию клеток. На фиг. 12 представлена противоопухолевая активность сочетаний 2 С 5/химиотерапия и 2 С 5/химиотерапия/терапия DC101 на модели ксенографной опухоли. На фиг. 13 показана противоопухолевая активность терапии сочетаниями 2 С 5/3G3 и 2 С 5/1E10 на модели ксенографной опухоли. Фиг. 14 демонстрирует влияние 2 С 5 на экспрессию PDGFR, PDGF-BB, VEGF и FGF. Фиг. 15 демонстрирует связывание 2C5 с доменом PDGFR. На фиг. 16 показаны последовательности ДНК и аминокислот вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепей 1 В 3, где подчеркнуты участки CDR. На фиг. 17 показаны последовательности ДНК и аминокислот вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепей 2C5, где подчеркнуты участки CDR. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает антитела или их фрагменты, которые являются специфичными в отношении PDGFR. Антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, которые специфично связывают домены 1 и 2 PDGFR. Антитела согласно настоящему изобретению включают 2C5 и 1 В 3. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции и способы лечения опухолей и ангиогенных заболеваний указанными описанными антителами и антагонистами PDGFR в сочетании с антагонистами VEGFR. В частности, изобретение обеспечивает специфическое использование сигнального пути PDGF-B/PDGFR для терапии рака с помощью противоопухолевых и антиангиогенных механизмов. Также изобретение обеспечивает терапию ангиогенных заболеваний. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает антагонисты рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), которые обладают специфичностью к PDGFR. Специфичные антагонистыPDGFR являются биологическими молекулами, которые ингибируют преимущественно опосредуемуюPDGFR передачу сигнала. В соответствии с настоящим изобретением специфичные антагонистыPDGFR подавляют опосредуемую PDGFR передачу сигнала по меньшей мере в 3, или по меньшей мере в 5, или по меньшей мере в 10 раз сильнее, чем опосредуемую PDGFR. Один способ определения специфичного ингибирования PDGFR состоит в сравнении ингибирования индуцированной PDGF активации созданных для экспрессии PDGFR, но не PDGFR клеток, с ингибированием индуцированнойPDGF активации клеток, созданных для экспрессии PDGFR, но не PDGFR. Другой способ состоит в том, чтобы сравнивать ингибирование индуцированной активации PDGF путем использования PDGF,который преимущественно активирует PDGFR (например, PDGF-DD) и PDGF, который преимущественно активирует PDGFR (например, PDGF-AA). В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист PDGFR является антителом, которое связывает PDGFR. В другом варианте реализации изобретения специфичный антагонист PDGFR является небольшой молекулой. Подход к подавлению ангиогенеза, направленный на рецепторы VEGF, постепенно принимается в качестве эффективного при противоопухолевой терапии. Например, антитела к VEGF показаны для лечения определенных опухолей. Далее, антитела мыши к VEGFR2 блокируют взаимодействиеVEGF/VEGFR2 и ингибируют стимулируемую VEGF пролиферацию и выживание клеток сосудов эндотелия у мышей в ксенографной модели. Тем не менее, по меньшей мере, хотя обработка антителом кVEGFR2 приводила к значимой задержке роста ряда трансплантатов опухолей мышей, регрессия опухоли была редкой. Кроме того, существуют накапливаемые свидетельства, подтверждающие, что некоторые опухоли могут становиться менее чувствительными (или даже приобретать устойчивость) к блокированию VEGFR2 в течение длительных периодов обработки. В соответствии с изобретением специфическое ингибирование PDGFR значительно повышает как антиангиогенную, так и противоопухолевую активность антагониста VEGFR. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает улучшенные способы ингибирования ангиогенеза и снижения или ингибирования роста опухоли путем введения специфичного антагониста PDGFR и, возможно, антагонистаVEGFR. Антагонисты являются молекулами, которые блокируют, модулируют или препятствуют передаче сигнала, опосредуемого рецептором тирозинкиназы (то есть, PDGFR или VEGFR) и включают, но не ограничиваются, антитела, небольшие молекулы, белки, полипептиды, миметики лигандов, антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, антисмысловые РНК, небольшие ингибирующие РНК, образующие тройную спираль нуклеиновые кислоты, доминантные негативные мутации и экспрессию растворимых рецепторов. Кроме того, специфичные антагонисты PDGFR и антагонисты VEGFR можно объединить в единственное соединение, такое как, но без ограничения, антитело с двойной специфичностью. Рецепторы VEGF и PDGFR относятся к одному и тому же семейству содержащих внутренние киназные домены рецепторов. Однако рецепторы VEGF имеют семь иммуноглобулин-подобных петель в их экстраклеточных доменах, по сравнению с пятью в PDGFR и PDGFR. Также, рецепторы VEGF имеют более крупный киназный участок. Последовательности аминокислот PDGFR и VEGFR человека и других млекопитающих, и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, хорошо известны в данной области техники. Последовательности не ограничивающего примера PDGFR человека даны под номером доступа GenBank NM002609. Последовательность нуклеотидов кодирует белок,имеющий отрезаемую сигнальную последовательность. Готовый белок содержит экстраклеточную часть,содержащую примерно 499 аминокислот, 23 аминокислоты в трансмембранном участке и внутриклеточную часть примерно 552 аминокислот. Не ограничивающие примеры последовательностей VEGFR включают NM002019 (VEGFR1/Flt1 человека), NM002253 (VEGFR2/KDR/Flk1 человека) иNM182925 (VEGFR3/Flt4 человека). Структуры Ig подобного домена экстраклеточных доменов, положение трансмембранных доменов и внутриклеточные домены, включая тирозинкиназные домены для каждого из этих рецепторов, хорошо известны в данной области техники. Антитела согласно настоящему изобретению связывают PDGFR. В настоящей заявке термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов (Ig) и иммунологически активным частям или вариантам молекул иммуноглобулинов. Антитела содержат один или более антиген-связывающих сайтов,которые специфично связываются с антигеном. Антитела включают, но не ограничиваются, поликлональные, моноклональные, химерные и гуманизированные антитела. Иммунологически активные части включают моновалентные и бивалентные фрагменты, такие как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), одиночный вариабельный домен (sVD), Fab, Fab' и F(ab')2 фрагменты. Иммунологически активные части могут входить в состав мультивалентных антител, например, двойных, тройных и так далее. Антитела далее включают антиген-связывающие фрагменты после фагового дисплея и конъюгаты антител."Изолированное (выделенное) антитело" представляет собой антитело, которое (1) частично, в значительной степени или полностью было очищено от смеси компонентов; (2) было идентифицировано и отделено и/или восстановлено от компонента своей естественной среды; (3) является моноклональным;(4) свободно от других белков того же вида; (5) экспрессируется в клетке другого вида; или (6) не суще-4 019595 ствует в природе. Загрязняющие компоненты естественной среды являются материалами, которые могут создавать помехи диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или не белковые растворимые вещества. Примеры изолированных антител включают антитело к PDGFR, получаемое в ходе аффинной очистки с использованиемPDGFR, антитело к PDGFR, которое получено с помощью гибридомы или другой клеточной линии invitro, антитело к PDGFR человека, выделенное из библиотеки, такой как фаговая библиотека, и антитело к PDGFR человека, наработанное в трансгенной мыши. В общих чертах, молекулы антител природного происхождения образованы двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. Каждая легкая цепь обычно ковалентно связана с тяжелой цепью межцепочечной дисульфидной связью, две тяжелые цепи затем связаны друг с другом многочисленными дисульфидными связями в области петли. Отдельные цепи сложены в домены, имеющие сходные размеры (около 110-125 аминокислот) и структуры, но различные функции. Легкая цепь содержит один вариабельный домен (VL) и один константный домен (CL). Тяжелая цепь содержит один вариабельный домен (VH) и, В зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена(CH1, CH2, CH3 и CH4). У человека и мышей изотипы представляют собой IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем IgA и IgG далее разделяются на подклассы или подтипы. Часть антитела, состоящая из VL и областейVH, обозначается "Fv" и составляет антиген-связывающий сайт. Одноцепочечный Fv (scFv) представляет собой искусственный белок, содержащий домен VL и домен VH в одной полипептидной цепи, в которойN-конец одного домена и С-конец другого домен соединены гибким линкером. "Fab" относится к части антитела, состоящей из VL-CL (то есть, легкой цепи) и VH-CH1 (также называемой "Fd"). Антитела изобретения включают одиночные вариабельные домены (sVD) и связывающие антиген белки, которые включают sVD. Связывающие сайты sVD можно получить из антигенспецифичных участков Fv (которые включают как VH, так и VL домены). Часто может быть показано, что аффинность связывания и специфичность участка Fv первоначально содействует одному из вариабельных доменов. Кроме того, scFv можно получать напрямую. Прямые источники sVD включают млекопитающих (например, мозоленогих), которые в природе экспрессируют антитела, содержащие только VH домен. Далее,для экспрессии только одиночных вариабельных доменов можно создать библиотеки фагового дисплея. Например, библиотеку фагового дисплея доменов антител человека, коммерчески доступную от Domantis (Cambridge, UK). Вариабельные домены антитела показывают значительную вариабельность последовательности аминокислот между антителами, особенно в пределах антиген-связывающего сайта. Три области, называемые "определяющими комплементарность участками" (CDR), обнаружены в каждом домене VL и VH. Участки CDR антитела также часто называют "гипервариабельными участками"."Fc" обозначает часть антитела, которая включает спаренные константные домены тяжелых цепей. В антителе IgG1, например, Fc включает домены CH2 и CH3. Фрагмент Fc антитела IgA или IgM, кроме того, включает домен CH4. Фрагмент Fc связан со связыванием рецептора Fc, активацией цитотоксического действия комплемента и клеточной цитотоксичностью, вызываемой антителами. Для природных антител, таких как IgA и IgM, которые представляют собой комплексы нескольких IgG-подобных белков,образование комплекса требует константных доменов Fc. Наконец, участок "петли" разделяет части антитела Fab и Fc, обеспечивая мобильность Fab друг относительно друга и относительно Fc, а также множественные дисульфидные связи для ковалентного связывания двух тяжелых цепей. Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются, антитела природного происхождения, двухвалентные фрагменты, например (Fab')2,моновалентные фрагменты, такие как Fab, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), однодоменные антитела, мультивалентные одноцепочечные антитела, двойные, тройные и так далее антитела,которые специфично связывают антигены. Фрагменты антитела также включают полипептиды с последовательностями аминокислот, в значительной степени сходными с последовательностями аминокислот вариабельного или гипервариабельного участков антител согласно настоящему изобретению. В значительной степени сходная последовательность аминокислот определена в настоящей заявке как последовательность с по меньшей мере 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%,по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 99% гомологии или идентичности со сравниваемой последовательностью аминокислот, как определяют с помощью метода поиска FASTA в соответствии с Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988). Изобретение включает "химерные" антитела. Такие антитела обычно включают вариабельные домены одного антитела и константные домены другого антитела. Обычно для минимизации иммунного ответа хозяина против антитела и усиления ответа хозяина против мишени антитела с сохранением эффекторной функции антитела, константные домены химерного антитела берут из того же вида, которому будут вводить химерные антитела. Изобретение также охватывает "гуманизированные" антитела. Гуманизированные вариабельные домены созданы таким образом, что последовательности аминокислот, которые включают один или более гипервариабельных участков (CDR), взятых не у человека, перенесены на каркасные участки челове-5 019595 ка (FR). Пример можно найти в: Jones, Р. Т. et al., 1996, Nature 321, 522-25; Riechman, L. et al., 1988, Nature 332, 323-27; и патенте США 5530101 автор Queen et al. Гуманизированные конструкции особенно ценны для устранения неблагоприятных иммуногенных свойств, например, в случае, если для использования в лечении человека желателен антиген-связывающий домен, взятый не от человека. Вариабельные домены имеют высокую степень структурной гомологии, что позволяет легко идентифицировать аминокислотные остатки в пределах вариабельных доменов, которые соответствуют CDR (гипервариабельным участкам) и FR (каркасным участкам). См., например, Kabat Е.А., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th ed. National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Таким образом, легко выявить аминокислоты, которые, вероятно, непосредственно участвуют в связывании антигена. Кроме того, были разработаны способы сохранения или повышения аффинности к антигену гуманизированных связывающих доменов, содержащих перенесенные CDR. Один путь состоит в том, чтобы включить в вариабельный домен реципиента чужеродные каркасные аминокислоты, которые влияют на конформацию гипервариабельного участка. Второй путь состоит в том, чтобы переносить чужеродные CDR на вариабельные домены человека с наибольшей гомологией чужеродному вариабельному участку. Queen, С. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-33. Гипервариабельные участки наиболее легко переносить на другой FR путем, во-первых, амплификации отдельных последовательностей FR с использованием перекрывающихся праймеров, которые включают желаемые последовательности гипервариабельных участков, и соединения полученных сегментов гена в последующей реакции амплификации. Перенос гипервариабельного участка в другой вариабельный домен может далее включать замещение аминокислотных остатков, которые примыкают к гипервариабельному участку в последовательности аминокислот или расположены напротив гипервариабельного участка в структуре сложенного вариабельного домена, на которую влияет конформация гипервариабельного участка. Гуманизированные вариабельные домены изобретения, следовательно, включают домены человека, которые включают один или более гипервариабельных участков не человека, а также такие домены, в которых сделаны дополнительные замещения или замены для сохранения или повышения характеристик связывания. Антитело согласно настоящему изобретению также может содержать вариабельные домены, которые сделаны менее иммуногенными путем замещения экспонированных на поверхности остатков таким образом, чтобы антитело казалось иммунной системе своим (Padlan E.A., 1991, Mol. Immunol. 28, 48998). Этот процесс модифицирует антитела без потери аффинности (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91, 969-973). Поскольку внутренняя упаковка аминокислотных остатков вблизи от антигенсвязывающего сайта остается неизменной, аффинность сохраняется. Замещение экспонированных на поверхности остатков с целью снижения иммуногенности в соответствии с изобретением не означает замещение остатков CDR или смежных остатков, которые повлияют на характеристики связывания. Часто предпочтительным является применение вариабельных доменов, которые, по существу, принадлежат человеку. Антитела человека включают области каркаса человека VH и VL (FW), а также гипервариабельные участки человека (CDR). Предпочтительно вариабельные домены VH и VL полностью принадлежат человеку или являются производными последовательностей человека. Антитела можно получать непосредственно из клеток человека, например, путем создания гибридом человека. Кроме того, антитела человека можно получать из трансгенных животных, в которых введены сегменты гена Ig человека без перестроек и в котором инактивированы гены Ig мыши (см. Brggemann andTaussig, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8, 455-58). Предпочтительные трансгенные животные содержат очень большие непрерывные фрагменты гена Ig, которые по величине превышают 1 млн п.н. (Mendez etal., 1997, Nature Genet. 15, 146-56), но моноклональные антитела человека с умеренной аффинностью можно получить из трансгенных животных, содержащих меньшие локусы этого гена (см., например,Wagner et al., 1994, Eur. J. Immunol. 42, 2672-81; Green et al., 1994, Nature Genet. 7, 13-21). Антитела человека также можно получить из библиотек доменов VH и/или VL антител. Например,библиотеку вариабельных доменов можно получить на основе геномных последовательностей человека или из лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих продуктивно процессированные гены вариабельных доменов. Кроме того, библиотека генов человека может быть синтетической. В одном варианте реализации можно сконструировать библиотеку вариабельных доменов, которая включает области каркаса от человека с одним или более CDR, которые синтезируют включающими произвольные или частично произвольные последовательности. Например, можно создать библиотеку вариабельных доменов VH человека, в котором участники кодируются VH сегментом гена человека и синтетической последовательностью для участка CDR3H (то есть, синтетическим сегментом гена DH-JH). Подобным образом,вариабельный домен человека VL может кодироваться сегментом гена VL человека и синтетической последовательностью для участка CDR3L (то есть, синтетическим сегментом гена JL). В другом варианте реализации каркас человека может быть синтетическим, в котором присутствует консенсусная последовательность, производная известных последовательностей антител человека или подгрупп последовательностей человека. В другом случае один или более CDR получают с помощью амплификации из лимфоцитов человека, экспрессирующих перестроенные вариабельные домены и затем проводят рекомбинацию с конкретным каркасом антитела человека. Для скрининга библиотеки вариабельных доменов обычно применяют библиотеки фагового дисплея, в которых сочетания вариабельных доменов тяжелых и легких цепей человека экспонированы на поверхности филаментозного бактериофага (смотри, например, McCafferty et al., 1990, Nature 348, 55254; Aujame et al., 1997, Human Antibodies 8, 155-68). Сочетания вариабельных доменов обычно экспонированы филаментозным фагом в форме Fab или scFv-фрагментов. Библиотеку анализируют в поисках бактериофага, несущего сочетания вариабельных доменов, имеющих желаемые характеристики связывания антигена. Предпочтительными являются одиночные домены и сочетания вариабельных доменов,показавшие высокое сродство к выбранному антигену и небольшую кроссреактивность к другим родственным антигенам. С помощью скрининга очень больших наборов фрагментов антител (смотри например, Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13, 3245-60) отбирают достаточное разнообразие высокоаффинных связывающих доменов, с ожидаемым множеством имеющих сродство к желаемому антигену в концентрациях менее наномоля. В физиологическом иммунном ответе, мутации и селекция экспрессируемых генов антитела приводят к продукции антител, имеющих высокую аффинность для их антигена-мишени. Входящие в антитела согласно настоящему изобретению домены антител VH и VL могут аналогично подвергнуться мутагенезуin vitro или in vivo и процедуре скрининга для модификации аффинности и/или специфичности. Таким образом, связывающие домены согласно настоящему изобретению включают такие, для которых показатели связывания были улучшены мутациями CDR и/или участков FW с помощью направленного мутагенеза, способов созревания аффинности или перемещения цепей. Понято, что аминокислотные остатки,которые являются первичными детерминантами связывания однодоменных антител, могут находиться в пределах, определенных по Kabat CDR, но также могут включать другие остатки. Для sVD важные для связи антигена остатки также могут потенциально включать аминокислоты, которые напротив располагаются на поверхности гетеродимера VH-VL. Обычно для скрининга таких мутаций и определения тех из них, которые имеют желаемые показатели связывания, используют фаговый дисплей (см., например,Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995. Мутации можно создавать с помощью ряда способов. Один способ состоит в том, чтобы перемешать отдельные остатки или сочетания остатков так, чтобы в популяции во всем остальном идентичных последовательностей в конкретных положениях находились все двадцать аминокислот или часть из них. Кроме того, мутации можно создавать среди остатков CDR с помощью методов склонной к ошибкам ПЦР (см., например, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896(1992. Например, векторы для фагового дисплея, содержащие вариабельные участки генов тяжелой и легкой цепей, можно размножать в мутаторных штаммах Е. coli (см., например, Low et al., J. Mol. Biol.,250: 359-368 (1996. Эти способы мутагенеза иллюстрируются множеством способов, известных специалисту в данной области. Изобретение также включает антиген-связывающие белки, сконструированные на основе не иммуноглобулинов. Например, антитела, производные иммуноглобулин-связывающего домена белка А стафиллококка S. Aureus, не имеют никаких дисульфидных связей и демонстрируют обратимый фолдинг. Другим примером является фибронектин, который имеет подобную антителу структуру и несет CDRподобные петли. В отличие от антитела, доменная структура фибронектина не основана на дисульфидных связях и в то же время показывает высокую термодинамическую устойчивость. В таких белкахосновах сайты связывания можно создавать, например, путем создания разнообразия кодонов в определенных положениях и скрининга на связывание с желаемым антигеном. Случайные кодоны можно использовать в петлях, поверхности белка, полости белка или сочетаниях таких положений. Далее, можно осуществлять встраивание внутрь последовательности пептидов, обычно внутрь петель. Связывающие мишень варианты можно выделять из полученных библиотек с использованием способов скрининга и селекции, которые хорошо известны в данной области техники, включающих, но не ограничивающихся,фаговый дисплей, рибосомальный дисплей, бактериальный или дрожжевой дисплей поверхности, и тому подобное. Для антиген-связывающих белков, предназначенных для терапии, доступны различные стратегии для снижения потенциальной иммуногенности. Можно применять белки-основы человека и минимизировать иммуногенность, например, с помощью ПЭГилирования или изменения Т-клеточных эпитопов(то есть, минимизация числа последовательностей, вызывающих реакцию Т-клеток). Антиген-связывающие белки на основе неиммуноглобулинов часто можно получать с меньшими затратами, чем белки иммуноглобулинового типа. Например, отсутствие дисульфидных связей или свободного цистеина позволяет осуществлять экспрессию функциональных молекул в восстанавливающей среде цитоплазмы бактерий, которая обычно дает больший выход продукта, чем экспрессия в периплазме, и более удобна, чем повторный фолдинг in vitro. Binz, H.K. et al. (Nat. Biotech. 23:1257-68, 2005) описывает ряд таких антиген-специфичных связывающих белков и способов их разработки. Как было упомянуто ранее, для совместного введения в качестве альтернативы можно использовать антитело с двойной специфичностью. Существует ряд антител с двойной специфичностью, которые созданы для совмещения различных желаемых характеристик. Например, двойное антитело с двойной специфичностью имеет минимальный размер. Антитела с двойной специфичностью с четырьмя антигенсвязывающими сайтами (два для каждой специфичности связывания) имеют для каждой мишени такую же авидность связывания, как и соответствующие природные антитела. Некоторые антитела с двойной специфичностью содержат Fc-фрагменты, таким образом сохраняя эффекторные функции (например,комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность(АЗКЦ естественных антител. WO 01/90192 описывает IgG-подобные тетравалентные антитела. WO 2006/020258 описывает тетравалентные антитела, которые включают два двойных антитела и сохраняют эффекторные функции. Для антиген-связывающего сайта антител с двойной специфичностью можно применять ряд антиген-связывающих фрагментов антител. Они включают, но не ограничиваются, Fv,scFv и sVD. Другими средствами блокирования передачи связанного с PDGFR сигнала являются специфичные небольшие молекулы ингибиторы PDGFR. Термин "небольшая молекула" относится к небольшим органическим соединениям, таким как гетероциклы, пептиды, сахариды, стероиды и тому подобное. Небольшие молекулы-модуляторы предпочтительно имеют молекулярную массу менее примерно 2000 Да,предпочтительно менее примерно 1000 Да и более предпочтительно менее примерно 500 Да. Соединения могут быть модифицированы для повышения эффективности, устойчивости, фармацевтической совместимости и тому подобного. Небольшие молекулы-ингибиторы включают, но не ограничиваются, небольшие молекулы, которые блокируют АТФ-связывающий домен, субстрат-связывающий домен, или киназный домен рецептора тирозинкиназы. В другом варианте реализации небольшая молекулаингибитор связывается с лиганд-связывающим доменом PDGFR и блокирует активацию рецептораPDGFR лигандом. Библиотеки небольших молекул можно проверять на ингибиторную активность с использованием высокопроизводительных биохимических, ферментативных или клеточных тестов. Тесты можно применять для определения способности тестируемого соединения ингибировать PDGFR, но не PDGFR. Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, антисмысловые РНК и небольшие ингибиторные РНК(siRNA, интРНК) обеспечивают направленное разложение мРНК, таким образом, препятствуя трансляции белков. Соответственно, можно подавлять экспрессию PDGFR. Способность антисмысловых олигонуклеотидов подавлять экспрессию гена была обнаружена более 30 лет назад (Zamecnik andStephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:280-284 (1978. Антисмысловые олигонуклеотиды образуют пару с мРНК и пре-мРНК, и могут потенциально препятствовать на нескольких этапах процессинга РНК и матричных процессов, включая сплайсинг, полиаденилирование, экспорт, стабильность и трансляцию(Sazani and Kole, J. Clin. Invest. 112:481-486 (2003. Однако две наиболее эффективные и широко используемые стратегии применения антисмысловых нуклеотидов представляют собой деградацию мРНК или пре-мРНК посредством РНКазыН и изменение сплайсинга с помощью нарушения образования контактов при сплайсинге. РНКазаН узнает гетеродуплексы ДНК/РНК и расщепляет РНК примерно посередине между 5' и 3' концами ДНК олигонуклеотида. Врожденные механизмы с участием РНК могут регулировать устойчивость мРНК, трансляцию и организацию хроматина (Mello and Conte Nature. 431:338-342, 2004). Кроме того, введенная извне длинная двунитевая РНК (днРНК) является эффективным средством для выключения гена в ряде более низкоорганизованных организмов. Однако у млекопитающих длинная днРНК вызывает высоко токсичные ответы, которые связаны с эффектами вирусной инфекции и продукции интерферона (Williams, Biochem.Soc. Trans. 25:509-513, 1997). С целью избежания этого Elbashir и коллеги (Elbashir et al., Nature 411:494498, 2001) начали использовать интРНК, образованные дуплексом 19-нуклеотидных рибоолигонуклеотидов с 5' фосфатом и 2 основаниями на 3' липкого конца на каждой нити, которая избирательно разрушает мРНК-мишени после введения в клетку. Действие интерферирующей днРНК у млекопитающих обычно включает два ферментативных этапа. Сначала фермент РНКаза III Dicer расщепляет днРНК на сегменты интРНК 21-23 п.н. Затем комплекс РНК-зависимого сайленсинга RISC (RNA-induced silencing complex) разворачивает дуплекс РНК, спаривает одну нить с комплементарным участком в сходной мРНК и вносит разрыв на 10 нуклеотидов дальше от 5' конца нити интРНК (Hannon, Nature. 418:244-251, 2002). Короткие химически синтезированные интРНК размером 19-22 п.н. не требуют участия Dicer и могут напрямую активировать комплекс RISC. Следует отметить, что любая из нитей дуплекса РНК потенциально может быть загружена на комплексRISC, но композиция олигонуклеотидов может повлиять на выбор нити. Таким образом, для достижения избирательной деградации конкретной мРНК мишени следует загружать дуплекс, где компонент антисмысловой нити имеет сравнительно слабое спаривание оснований на своем 5' конце (Khvorova, Cell. 115:209-216, 2003). Экзогенные интРНК можно получить в виде синтезированных олигонуклеотидов или экспрессировать с плазмидных или вирусных векторов (Paddison and Hannon, Curr. Opin. Mol. Ther. 5:217-224, 2003). В последнем случае, молекулы предшественника обычно синтезируются в виде коротких РНК-шпилек (shRNA), которые содержат петлю из 4-8 нуклеотидов и стебель из 19-30 нуклеотидов; затем их расщепляет Dicer, и образуются функциональные интРНК. Другие способы ингибирования пути передачи сигнала с участием PDGFR включают, но не ограничиваются, миметики PDGF, которые связываются, но не активируют рецептор, и экспрессию генов или полинуклеотидов, которые снижают уровни PDGFR или активность, такие как ингибирующие тройные спирали и доминантные негативные мутации PDGFR. Антагонисты RTK (то есть, специфичные антагонисты PDGFR, антагонисты VEGFR) для использования в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют одно или более из следующих свойств: 1) Антагонист связывается с внешним доменом RTK (то есть, PDGFR, VEGFR) и подавляет связывание лиганда. Ингибирование можно определить, например, в тесте на прямое связывание, с использованием очищенного или связанного с мембраной рецептора. 2) Антагонист нейтрализует рецептор. Связывание лиганда с внешним, внеклеточным доменом рецептора (например, PDGF-BB или PDGF-DD с PDGFR; VEGF или P1GF с VEGFR) стимулирует аутофосфорилирование рецептора и нижележащих сигнальных молекул, включая МАРК, Akt и IRS-1. Нейтрализация рецептора включает ингибирование, уменьшение, инактивацию и/или нарушение одного или более видов активности, в норме связанных с передачей сигнала. Нейтрализацию можно определять invivo, ex vivo или in vitro с использованием, например, тканей, культуры клеток или очищенных компонентов клетки. Таким образом, нейтрализация PDGFR и/или VEGFR имеет различные эффекты, включая ингибирование, уменьшение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенез (привлечение кровеносных сосудов, инвазию и метастазирование), и подвижность и метастазирование клеток (адгезию и инвазивность клеток). Одним способом измерения нейтрализации рецептора является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы можно определять с использованием известных способов; например, путем измерения уровня аутофосфорилирования рекомбинантной киназы рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, при определении нейтрализации антитела в контексте согласно настоящему изобретению пригодны тесты на фосфорилирование. Фосфорилирование можно обнаружить, например, путем использования антитела, специфичного к фосфотирозину в тесте методом твердофазного ELISA или Вестерн-блоттинга. Некоторые тесты на активность тирозинкиназы описаны в Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998). Антитела согласно настоящему изобретению вызывают уменьшение фосфорилирования тирозина PDGFR по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 85%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% в клетках, которые реагируют на лиганд. Другим показателем нейтрализации рецептора является ингибирование фосфорилирования нижележащих (downstream) субстратов рецептора или других компонентов сигнальных путей. Соответственно можно измерять уровень фосфорилирования МАРК, Akt, IRS-1 и других клеточных компонентов. Снижение фосфорилирования достигает по меньшей мере примерно 40% и может достигать по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 80%. Кроме того, для определения нейтрализации рецептора можно использовать способы обнаружения экспрессии белка, если измеряемый белок регулируется активностью рецепторной тирозинкиназы. Эти способы обнаружения экспрессии белка включают иммуногистохимию (ИГХ), флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH) для обнаружения амплификации гена, тест на конкурентное связывание радиоактивного лиганда, способы блоттинга, такие как Нозерн- и Саузерн-блоттинг, обратная транскрипция полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) и твердофазный ELISA. См., например, Grandis et al., Cancer,78:1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85:567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148:104753 (1996); Collins, Glia 15:289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res. 1:19-31 (1995); Petrides et al.,Cancer Res. 50:3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., CancerRes. 55:3140-48 (1995). Также для определения нейтрализации рецептора можно использовать тесты exvivo. Например, ингибирование рецепторной тирозинкиназы можно понаблюдать в тесте на митогенность с использованием линии клеток, стимулированных лигандом рецептора в присутствии и в отсутствие ингибитора. Другой способ включает тест на ингибирование роста экспрессирующих RTK клеток опухоли или линии клеток, трансфецированных с целью экспрессии PDGFR. Ингибирование также можно наблюдать с использованием модели опухоли, например, клеток опухоли человека, инъецированных в мышей. Антагонисты согласно настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным механизмом нейтрализации рецептора. Антагонисты согласно настоящему изобретению могут связываться снаружи с поверхностным рецептором клетки, блокируя связывание лиганда и последующую передачу сигнала, опосредованную связанной с рецептором тирозинкиназы, и предотвращать фосфорилированиеPDGFR и белков, расположенных в каскаде передачи сигнала ниже. 3) Антагонист снижает число рецепторов. Количество присутствующего на поверхности клеткиRTK-рецептора зависит от продукции, интернализации и разложения белка-рецептора. Количество рецептора на поверхности клетки можно измерять косвенно путем обнаружения интернализации рецептора или связанных с рецептором молекул. Например, интернализацию рецептора можно измерить с помощью контакта клеток с рецептор-специфичным меченым антителом. Связанное с мембраной антитело затем удаляют, собирают и считают. Интернализованное антитело определяют путем лизиса клеток и детекции метки в лизате. Другой способ заключается в прямом измерении количества присутствующего в клетке рецептора после обработки антителом к RTK или другим веществом с помощью, например, проточной флюоресцентной цитометрии клеток, окрашенных на экспрессируемые на поверхности RTK. Окрашенные клетки инкубировали при 37 С и измеряли интенсивность флюоресценции во времени. В качестве контроля часть окрашенной популяции можно инкубировать при 4 С (условия, при которых подавлена интернализация рецептора).RTK на поверхности клеток можно обнаружить и измерить с помощью другого антитела, которое специфично для PDGFR и не блокирует или не конкурирует за связывание с тестируемым антителом. В определенных вариантах реализации уменьшение RTK на поверхности клетки в ответ на обработку антагонистом RTK составляет по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 90%. Значимое уменьшение обычно можно наблюдать спустя всего 4 ч. Другим показателем снижения является суммарное уменьшение белков рецепторов, присутствующих в клетке, которое отражает разложение внутренних рецепторов. Соответственно, лечение клеток(особенно раковых клеток) антителами согласно настоящему изобретению приводит к уменьшению суммарного количества RTK клетки. В определенных вариантах реализации уменьшение RTK на поверхности клетки в ответ на лечение антагонистом RTK составляет по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 90%. Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифичными. Антитела с двойной специфичностью (BsAb) являются антителами, которые имеют две различающихся специфичности связывания антигена или сайта связывания. Если антиген-связывающий белок имеет более одной специфичности,известные эпитопы могут быть связаны с единственным антигеном или более чем с одним антигеном. Предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению связывают рецептор с не меньшей эффективностью, чем природный лиганд этого рецептора. Аффинность, представленная константой равновесия диссоциации антигена и антитела (Kd), отражает меру силы связывания между антигенным детерминантом и связывающим сайтом антитела. Авидность является мерой силы связывания антитела со своим антигеном. Авидность обусловлена как аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающим сайтом антитела, так и валентностью антитела. Валентность относится к числу антигенсвязывающих сайтов, которые иммуноглобулин имеет для конкретного эпитопа. Например, моновалентное антитело имеет один сайт связывания для конкретного эпитопа. Антигенный детерминант или эпитоп - это участок антигена, который связывает данное антитело. Типичные величины K составляют от 105 до 1011 л/моль. Любую К меньше 104 л/моль считают показывающей неспецифическое связывание. Обратную K величину определяют как Kd. (Kd также называют константой диссоциации.) Чем меньше значение Kd, тем сильнее связывание между антигенным детерминантом и связывающим сайтом антитела. Антитела согласно настоящему изобретению включают любое антитело, которое специфично связываетPDGFR и уменьшает или подавляет передачу связанного с рецептором сигнала. В определенных вариантах реализации антитела связывают их соответствующие рецепторы с Kd примерно меньше 10-8 М-1 или примерно меньше 10-9 М-1 или меньше 310-10 М-1. Не ограничивающие примеры конкретных специфичных антител кPDGFR раскрываются и/или поясняются далее. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот двух конкретных антител согласно настоящему изобретению, 1 В 3 и 2C5, описаны в табл. 1. В предпочтительном варианте реализации, один, два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков (CDR) антитела выбирают из последовательностей любого из CDR 1B3. В другом предпочтительном варианте реализации один, два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков антитела выбирают из последовательностей группы, состоящей из любого из CDR 2C5. Антитела согласно настоящему изобретению в другом предпочтительном варианте реализации имеют последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, по существу, идентичную вариабельному домену тяжелой цепи 1 В 3 или 2C5, и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи в значительной степени идентичную вариабельному домену легкой цепи 1 В 3 или 2c5. "По существу, идентичный" означает, что последовательности аминокислот по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны контрольным последовательностям. В одном варианте реализации или изобретения специфическое антитело к PDGFR включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO:18, и легкую цепь, включающую последовательность аминокислот SEQ ID NO:26. В другом варианте реализации изобретения, специфическое антитело к PDGFR включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO:2, и легкую цепь, включающую последовательность аминокислот SEQ ID NO:10. Специфичные антитела к PDGFR согласно настоящему изобретению далее включают такие антитела, которые конкурируют с вышеупомянутыми антителами (то есть, связывают те же или перекрывающиеся эпитопы). Настоящее изобретение также включает антитела с последовательностями аминокислот в значительной степени такими же, как последовательность аминокислот вариабельного или гипервариабельного участков вышеупомянутых антител. В значительной степени такая же последовательность аминокислот определена в настоящей заявке как последовательность с по меньшей мере 80% или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95% гомологии или тождества с другой последовательностью аминокислот, что определяют с помощью способа поиска FASTA в соответствии с Pearson andLipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-8 (1998. Следует ожидать, что в участках каркаса можно сделать ряд замен, особенно ввиду частых мутаций в участках каркаса, которые наблюдают в результате мутаций in vivo и селекции. Тем не менее, по меньшей мере, надо ожидать, что также будут допустимы мутации в определенных позициях CDR. Например, не все аминокислоты CDR находятся в прямом контакте с антигеном. Ожидается, что замены аминокислот, особенно консервативные замены в не контактирующих положениях CDR, повлияют на аффинность связывания, потенциально улучшая, а не нарушая его. Текущая технология позволяет специалисту в данной области легко вносить в последовательности изменения, намеренно или произвольно, и проверять их результаты. Замена консервативной аминокислоты определена как изменение в композиции аминокислот посредством изменения одной или нескольких аминокислот пептида, полипептида или белка, или фрагмента антитела. Замены аминокислот с в общем аналогичными свойствами (например, кислотность, основность, ароматичность, размер, положительный или отрицательный заряд, полярность, неполярность) таковы, что замена в значительной степени не изменяет свойства пептида, полипептида или белка (например, заряд, изоэлектрическую точку,аффинность, авидность, конформацию, растворимость) или активность. Типичная замена, которую можно провести с целью замены консервативной аминокислоты, возможна внутри следующих групп аминокислот: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L) и изолейцин (I); аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е); аланин (А), серин (S) и треонин (Т); гистидин (Н), лизин (K) и аргинин (R): аспарагин (N) и глутамин (Q); фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W). В соответствии с изобретением специфичные антитела к PDGFR можно вводить сами по себе,вместе с антителами к VEGFR или в форме антител с двойной специфичностью, которые связывают иPDGFR, и VEGFR. Также предусмотрены примеры специфичных антител к VEGFR. Как обсуждалось в отношении специфичных антител к PDGFR, раскрытые антитела к VEGFR также не ограничиваются примерами. Изобретение также обеспечивает антитела, которые связывают определенные домены PDGFR. Антитела, связывающие домены 1 и 2, антитела, связывающие домен 1, и антитела, связывающие домен 2 PDGFR, входят в объем настоящего изобретения. 2C5 представляет собой пример антитела, которое связывает домен 2, и домены 1 и 2 PDGFR. Каждый вариабельный домен антител согласно настоящему изобретению может составлять полный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, либо он может быть функциональным эквивалентом или мутантной формой или производной природного домена или синтетического домена,созданного, например, с использованием методов in vitro, таких как описаны в WO 93/11236 (MedicalResearch Council/Griffiths et al.). Например, возможно включение доменов, соответствующих вариабельным доменам антитела, которые включают замены аминокислот, делеции, вставки, укорочения с аминоконца и с карбоксильного конца, так что эти мутации обеспечивают белки или фрагменты белков, которые сохраняют активность связывания антигена. Важным характеризующим признаком является способность каждого вариабельного домена соединяться с дополняющим его вариабельным доменом и образовывать антиген-связывающий сайт. Антитела и фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть связаны или слиты с дополнительными аминокислотными остатками. Такие аминокислотные остатки могут быть пептидной меткой, возможно для облегчения выделения. Также предусмотрены другие аминокислотные остатки для доставки антител в специфичные органы или ткани. В другом аспекте изобретения, антитела или фрагменты антитела могут быть химически или биосинтетически связаны с противоопухолевым веществом или детектируемым сигнальным веществом,особенно если антитело интернализовано. Противоопухолевые вещества, связанные с антителом, включают любые вещества, которые уничтожают или повреждают опухоль, с которой связалось антитело, или микроокружение клетки, с которой связалось антитело. Например, противоопухолевое вещество является токсичным веществом, таким как химиопрепарат или радиоизотоп. Пригодные химиопрепараты известны специалисту в данной области и включают антрациклины (например, дауномицин и доксорубицин), метотрексат, виндезин, неокарциностатин, цис-платина, хлорамбуцил, арабинозид цитозина, 5-фторуридин, мелфалан, рицин и калихемицин. Химиопрепараты конъюгируют с антителом, используя стандартные способы (См., например, Hermentin and Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197-215(1988. Детектируемые сигнальные вещества применимы для целей диагностики и in vivo, и in vitro. Сигнальное вещество дает измеримый сигнал, который обнаруживают внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Главным образом, сигнальное вещество представляет собой фермент или хромофор, или производит свет путем флюоресценции, фосфоресценции или хемилюминесценции. Хромофоры включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разложения катализируемых ферментами реакций. Изобретение далее включает антитела, в которых связаны направляющая или репортерная субъединицы. Направляющая субъединица является первым участником связывающейся пары. Противоопухолевое вещество, например, конъюгировано со вторым участником такой пары, и, тем самым, направляется туда, где связался антиген-связывающий белок. Обычным примером такой связывающейся пары являются авидин и биотин. В предпочтительном варианте реализации, биотин связывают с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и, тем самым, обеспечивают доставку противоопухолевого вещества или другой субъединицы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. Кроме того, биотин или другую такую субъединицу соединяют с антиген-связывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортерного, например, в диагностической системе, где обнаруживаемое сигнальное вещество конъюгировано с авидином или стрептавидином. Радиоизотопы, пригодные для использования в лечении опухолей, также известны специалисту в данной области техники. Например, используют 131I или 211At. Эти изотопы связывают с антителом с использованием стандартных способов (См., например, Pedley et al., Br. J. Cancer 68:69-13 (1993. В другом случае, связанное с антителом противоопухолевое вещество представляет собой фермент, который активирует пролекарство. Таким образом, вводимое пролекарство остается в его неактивной форме, пока не достигнет опухоли, где преобразуется в цитотоксическую форму, как только будет введен комплекс антитела. На практике, пациенту вводят конъюгат антитело-фермент и позволяют накопиться в участке ткани, который подлежит лечению. Затем пациенту вводят пролекарство, таким образом преобразование в цитотоксическое лекарство происходит в участке ткани, который нужно обработать. В другом случае,связанное с антителом противоопухолевое вещество представляет собой цитокин, такой как интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4) или фактор некроза опухоли альфа (TNF-). Антитело доставляет цитокин в опухоль для того, чтобы цитокин повреждал или уничтожал опухоль, не влияя на другие ткани. Цитокин соединяют с антителом на уровне ДНК, с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК. Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полинуклеотиды, кодирующие антитела или их фрагменты, описанные ранее. Изобретение включает нуклеиновые кислоты, имеющие последовательности, кодирующие специфичные антитела к PDGFR и антиген-связывающие фрагменты, содержащие один, два, три, четыре, пять и/или все шесть гипервариабельных участков, которые приведены в табл. 1. Соответственно, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется (или специфично связывается) при жестких условиях гибридизации с последовательностью из SEQID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:25. Также предусмотрены нуклеиновые кислоты,которые могли бы специфично связываться с вышеупомянутыми последовательностями, если бы не вырожденность генетического кода. Нуклеиновые кислоты могут быть достаточной длины для того, чтобы кодировать полный белок (например, полные VH или VL) или фрагмент антитела. Гибридизация при жестких условиях относится к условиям, при которых зонд будет преимущественно гибридизоваться со своей специфической последовательностью, и менее протяженно или вообще не будет гибридизоваться с другими последовательностями. Также следует понимать, что жесткие условия гибридизации и отмывки после гибридизации в отношении экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как саузерн и нозерн гибридизации зависят от последовательностей и различаются при равных параметрах окружающей среды. В данной области техники хорошо известно, как регулировать состав растворов и температуру гибридизации и отмывки так, чтобы получить жесткие условия гибридизации. Жесткость зависит от таких параметров, как размер и содержание нуклеотидов в использованном зонде. См. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, и другие источники для общих описаний и примеров. Другой справочник по гибридизации нуклеиновых кислот приведен в Tijssen, 1993, LaboratoryTechnigues in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2,Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, N.Y. Предпочтительными жесткими условиями являются такие, которые позволяют зонду гибридизоваться с последовательностью, которая более чем на примерно 90% комплементарна зонду, но не с последовательностью, которая комплементарна зонду менее чем на примерно 70%. Обычно, очень жесткие условия гибридизации и отмывки выбирают такие, которые примерно на 5 С ниже, чем точка плавления(Тпл) для специфической последовательности при определенной ионной силе и рН. Температура Тпл составляет (при определенной ионной силе и рН) температуру, при которой 50% последовательности мишени гибридизуются с полностью соответствующим зондом. Очень жесткие условия выбирают такими,которые равны Тпл для конкретного зонда. Пример жестких условий гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков на фильтре в саузерн или нозерн блоттинге, представляет собой 50% формамид с 1 мг гепарина при 42 С, гибридизацию проводят в течение суток. Примером очень жестких условий отмывки является 0,15 М NaCl при 72 С в течение примерно 15 мин. Примером жестких условий отмывки является двухкратная отмывка в SSC при 65 С в течение 15 мин (см., Sambrook et al., 1989). Часто отмывке высокой жесткости предшествует отмывка низкой жесткости, для удаления фонового сигнала зонда. Пример отмывки средней жесткости для дуплекса, например, длиннее чем 100 нуклеотидов, составляет 1 раз в SSC при 45 С в течение 15 мин. Пример отмывки слабой жесткости для дуплекса,например, длиннее, чем 100 нуклеотидов, составляет 4-6 раз в SSC при 40 С в течение 15 мин. В общих чертах, уровень сигнала и шума, который наблюдается два раза (или чаще) для неспецифичного зонда в конкретном тесте на гибридизацию, указывает на обнаружение специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом при жестких условиях, тем не менее, по меньшей мере, являются, по существу, идентичными, если, по существу, идентичны полипептиды, которые они кодируют. Это происходит, например, когда нуклеиновая кислота создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, позволяемой генетическим кодом. Соответственно, последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению включают последовательности нуклеотидов, которые по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентичны SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:25. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению. Вектор может быть вектором экспрессии, в котором нуклеиновая кислота оперативно связана с регуляторной последовательностью, такой как промотор и, возможно, энхансер. Для эффективного синтеза полипептидов антител разработан ряд векторов экспрессии в системах прокариот и эукариот, включая, но не ограничиваясь, системы на основе культур клеток дрожжей и млекопитающих. Можно использовать любой пригодный вектор экспрессии. Применимые в настоящем изобретении векторы экспрессии содержат по меньшей мере одну регулирующую экспрессию последовательность,которая оперативно связана с экспрессируемой последовательностью ДНК или ее фрагментом. Регуляторная последовательность включена в вектор для того, чтобы контролировать и регулировать экспрессию клонированной последовательности ДНК. Примеры применимых регулирующих экспрессию последовательностей включают lac систему, trp систему, tac систему, trc систему, основные операторный и промоторный участки фага лямбда, регуляторный участок белка капсида fd, промоторы генов гликолиза у дрожжей, например, промотор 3-фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например, Pho5, промоторы альфа-фактора спаривания дрожжей и производные промоторов вирусов полиомы, аденовирусов, ретровирусов и вируса обезьян, например, ранний и поздний промоторы SV40 и другие последовательности, известные в качестве регулирующих экспрессию генов в клетках прокариот или эукариот, и их вирусов, или их сочетания. Селективный маркер является геном, который кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых на селективной культуральной среде. Типичные селективные маркеры кодируют белки, которые (а) обеспечивают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, (b) компенсируют ауксотрофность или (с) обеспечивают критические питательные вещества, не доступные из сложной среды, например, ген, кодирующий рацемазу D-аланина бацилл. Особенно полезный селективный маркер обеспечивает устойчивость к метотрексату. Например, трансформированные геном DHFR клетки сначала определяют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Подходящими клетками-хозяевами для применения гена DHFR дикого типа являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), клеточной линии с недостаточной активностью DHFR, полученные и культивируемые, как описано Urlaub и Chasin (1980) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216. Трансформированные клетки затем подвергают повышенному уровню метотрексата. Это приводит к синтезу множественных копий гена DHFR и, соответственно, множественных копий другой ДНК, включающей векторы экспрессии, такой как кодирующая антитело или фрагмент антитела ДНК. Если желательна экспрессия генной конструкции в дрожжах, примером пригодного гена для селекции в дрожжах является ген trp1, присутствующий в плазмиде дрожжей YRp7. Stinchcomb et al. (1979)Nature, 282, 39; Kingsman et al. (1979) Gene 7, 141. Ген trp1 обеспечивает селективный маркер для штаммов мутантов дрожжей, не способных расти без триптофана, например, АТСС No. 44076 или РЕР 4-1.Jones (1977) Genetics 85, 12. Наличие повреждений trp1 в геноме клетке-хозяине дрожжей дает эффективную среду для обнаружения трансформации благодаря росту в отсутствие триптофана. Аналогично,штаммы дрожжей с недостаточностью Leu2 (ATCC 20,622 или 38,626), дополнены известными плазмидами, несущими ген Leu2. Примером применимого вектора дрожжей является 2-микронная плазмида. Примеры прокариотических векторов для клонирования включают плазмиды Е. coli, такие какcolE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM и RP4. Прокариотические векторы также включают производные ДНК-фагов, таких как М 13, и других филаментозных фагов с однонитевой ДНК. Некоторые антитела удобно нарабатывать в Е. coli с использованием ДНК-конструкций, которые включают в начале каждой полипептидной цепи сигнальные последовательности бактерий для секреции. Ряд бактериальных сигнальных последовательностей известен в данной области техники. Предпочтительной сигнальной последовательностью является ген pelB Erwinia carotovora. Пригодные для экспрессии в клетках млекопитающих векторы включают известные производныеSV40, аденовирусы, ДНК производные последовательностей ретровирусов и векторы-челноки, происходящие от сочетания функциональных векторов млекопитающих, таких как описанные выше, и функциональных плазмид и ДНК-бактериофагов. ДНК фрагменты, кодирующие антитела, можно клонировать,например, в векторы, содержащие для высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих промоторы и энхансеры цитомегаловируса человека (HCMV). (См., например, Bendig et al., U.S. Patent 5,840,299;Ovary Cells," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80, 4654-59 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216-20, (1980. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие ранее описанные рекомбинантные векторы экспрессии. Конкретные предпочтительные линии клеток выбирают на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии белка и минимального загрязнения белками хозяина. Применимые клетки прокариот включают, например, штаммы Е. coli, такие как Е. coli SG-936, E. coli HB 101, Е. coli W3110, Е. coli X1776, Е. coli X2282, Е. coli DHI и Е. coli MRC1,Pseudomonas, Bacillus, такие как Bacillus subtilis и Streptomyces. В качестве системы экспрессии являются доступными хорошо известные в данной области линии клеток млекопитающих, которые включают, но не ограничиваются, многие иммортализованные линии клеток, такие как клетки COS-7, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почки детенышей хомячков (ВНК), клетки PER.C6 и многие другие,включая линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомы. Пригодные дополнительные клетки эукариот включают дрожжи и другие грибы. Трансформированные клетки-хозяева выращивают в соответствии с известными в данной области методами в жидкой среде, содержащей усваиваемые источники углерода, например углеводы, такие как глюкоза или лактоза, азот, например аминокислоты, пептиды, белки или их продукты разложения, такие как пептоны, соли аммиака или тому подобное, и неорганические соли, например, сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция. Среда, кроме того, содержит, например, стимулирующие рост вещества, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и тому подобное. Изобретение также обеспечивает способ выработки антитела, включающий культивирование вышеуказанных клеток-хозяев при условиях, позволяющих экспрессию антитела. После экспрессии антител в выращиваемой в пригодной среде клетке-хозяине, их можно выделить из среды и очистить с помощью известных в данной области техники способов. Настоящее изобретение далее обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую антитело, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или подавления роста опухолей, способам лечения или регуляции у млекопитающих связанных с ангиогенезом состояний (например, роста опухоли), или способам лечения ангиогенных заболеваний, которые включают введение специфичного антагониста PDGFR. В одном варианте реализации антагонист блокирует опосредованную PDGFR стимуляцию клеток опухоли. В другом варианте реализации функция антагониста заключается в подавлении или предотвращении ангиогенеза, тем самым излечивая или регулируя связанное с ангиогенезом состояние. Обычно, эндотелий сосудов паракринным образом стимулируется факторами роста из других источников (например, клеток опухоли). Соответственно, антагонисты PDGFR являются эффективными в лечении пациентов с васкуляризованными опухолями или новообразованиями."Лечение" заболевания включает: (1) предотвращение появления заболевания у млекопитающего,которое может иметь к нему предрасположенность, но еще не испытывает или не показывает симптомов заболевания; например, предотвращение возникновения клинических симптомов; (2) подавление заболевания, например прекращение или задержку его развития; или (3) облегчение заболевания, например регрессию симптомов заболевания. Опухоли, которые можно лечить, включают первичные опухоли и метастазы опухолей, а также устойчивые опухоли. Устойчивые опухоли включают опухоли, которые не отвечают или устойчивы к лечению одними химиопрепаратами, одними антителами, одной лучевой терапией или их сочетаниями. Устойчивые опухоли также охватывают опухоли, которые оказываются подавленными при лечении такими способами, но возвращаются вплоть до пяти лет, иногда вплоть до десяти лет или дольше, после того как лечение прекращают. Специфичные антагонисты PDGFR вводят в дозировках и с частотой, достаточной для существенного насыщения рецептора-мишени или его лиганда. Существенное насыщение составляет по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 95% насыщения рецепторов-мишеней. Специфичный антагонист PDGFR вводят с частотой, достаточной для поддержания в интервале между дозами существенного насыщения на уровне по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 90%. В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист PDGFR является антителом. Для терапии режим дозировки составляет примерно от 5 до 700 мг/м 2. В другом варианте реализации режим дозировки составляет примерно от 10 о 250 мг/м 2. Специалист в данной области легко может определить подходящую дозу и режим введения, например, используя концентрацию, требуемую для достижения насыщения рецептора или нейтрализации in vitro, или путем анализа концентрации антагониста в сыворотке. В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист PDGFR вводят совместно с химиопрепаратом. Известные в данной области техники или обсуждаемые химиопрепараты можно группировать по классам на основании их мишеней или механизма действия. Например, алкилирующие агенты включают, но не ограничиваются, цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и дакарбазин. Примеры антиметаболитов включают, но не ограничиваются, доксорубицин, даунорубицин и паклитаксел, гемцитабин, и ингибиторы топоизомеразы: иринотекан (СРТ-11), аминокамптотецин, камптотецин, DX-8 951f и топотекан (топоизомераза I), этопозид (VP-16) и тенипозид (VM-26) (топоизомераза II). Специалисту в данной области известны другие пригодные химиопрепараты, включая метотрексат, виндезин, неокарциностатин,хлорамбуцил, арабинозид цитозина, 5-фторуридин, мелфалан, рицин и калихемицин. Антагонист PDGFR и химиопрепарат пациенту вводят в количествах, эффективных для подавления ангиогенеза и/или уменьшения роста опухоли. Антагонист PDGFR также можно вводить в сочетании с другими методами лечения, например, вместе с лучевой терапией. Источник излучения для излечиваемого пациента может быть как внешним (дистанционная лучевая терапия - ДЛТ), так и внутренним (брахитерапия - БТ). Доза применяемого антинеопластического средства зависит от множества факторов, включая, например, тип лекарственного вещества, тип и остроту излечиваемой опухоли и способ введении вещества. Следует подчеркнуть, тем не менее, по меньшей мере, что настоящее изобретение не ограничено никакой конкретной дозировкой. В одном варианте реализации изобретения специфичный антагонист PDGFR вводят в сочетании с антагонистом VEGFR. Примеры антагонистов VEGFR включают антитела, которые связываютVEGFR2/KDR, такие как IMC-2C6 (последовательности нуклеотидов и аминокислот VH: SEQ ID NO:33 и 34; последовательности нуклеотидов и аминокислот VL: SEQ ID NO:35 и 36) (см., WO 03/075840) и IMC1121 (последовательности нуклеотидов и аминокислот VH: SEQ ID NO:33 и 34; последовательности нуклеотидов и аминокислот VL: SEQ ID NO:37 и 38) (см., WO 03/075840). Примеры антител, которые связывают VEGFR1/Flt-1, включают 6,12 (последовательности нуклеотидов и аминокислот VH: SEQ ID NOS:39 и 40; последовательности нуклеотидов и аминокислот VL: SEQ ID NO:41 и 42) и IMC-18F1 (последовательности нуклеотидов и аминокислот VH: SEQ ID NO:43 и 44; последовательности нуклеотидов и аминокислот VL: SEQ ID NO:45 и 46). Примером специфичного для VEGF антитела является Avastin. Так же, как описано в настоящей заявке для специфичных антител к PDGFR, антагонист VEGFR уменьшает или подавляет передачу сигнала, связанную с рецептором VEGF. Механизмы ингибирования включают, но не ограничиваются, блокирование лиганда, димеризацию рецептора или образования мультимера, интернализацию рецептора, ингибирование ферментной активности (например, аутофосфорилирование, модификацию субстратов рецептора) и тому подобное. В определенных вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению имеют двойную специфичность и способны одновременно связывать два разных антигена. Разные антигены могут находиться на разных клетках или на одной и той же клетке. Перекрестное связывание антигена можно подтвердить in vitro, например, таким образом: на твердую подложку, с которой связан первый антиген,добавляют специфическое для первого антигена антитело с двойной специфичностью, добавляют второй антиген, для которого связывающий белок также является специфичным, и обнаруживают присутствие связанного второго антигена. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению способны блокировать взаимодействие между двумя рецепторами и их соответствующими лигандами. Например, специфическое антитело к PDGFR и KDR подавляет вызываемую PDGF-BB активацию клеток, а также индуцированную VEGF или P1GF миграцию клеток. По сравнению с антителами, имеющими одну специфичность, антитела с двойной специфичностью могут быть более сильными ингибиторами функций клеток. В одном аспекте изобретения антагонист PDGFR вводят совместно с антагонистом VEGFR. Данный способ эффективен для лечения солидных или не солидных опухолей, включая, такие из них, которые не васкуляризированы или еще незначительно васкуляризированы. Опухоли и новообразования, которые можно лечить одним только антагонистом PDGFR или в сочетании с антагонистом VEGFR, включают, например, злокачественные опухоли и новообразования,такие как бластомы, карциномы или саркомы, и высоко сосудистые опухоли и новообразования. Раковые заболевания, которые можно лечить способами согласно настоящему изобретению, включают, например,рак мозга, мочеполовых путей, лимфатической системы, желудка, почек, кишечника, гортани, легкого и костей. Не ограничивающие примеры далее включают опухоли эпидермиса, чешуйчатоклеточные опухоли, такие как опухоли головы и шеи, опухоли прямой кишки, опухоли простаты, опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичника и опухоли печени. Композиции также используют для лечения васкуляризованного рака кожи, включая чешуйчатоклеточные карциномы, базальноклеточные карциномы, и рака кожи, который можно лечить путем подавления роста малигнизированных кератиноцитов, таких как малигнизированные кератиноциты человека. Другие виды рака, которые можно лечить, включают саркому Капоши, новообразования ЦНС (нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и метастазы в мозг), меланому, карциномы и саркомы желудочно-кишечного тракта и почек, рабдомиосаркому, глиобластому, включая множественную глиобластому и лейомиосаркому. Примеры не солидных опухолей включают лейкемии, множественные миеломы и лимфомы. Некоторые примеры лейкемий включают острую миелоидную лейкемию (ОМЛ), хроническую миелоидную лейкемию (ХМЛ), острую лимфоцитарную лейкемию (ОЛЕ), хроническую лимфоцитарную лейкемию(ХЛЛ), эритроцитарную лейкемию или моноцитарную лейкемию. Некоторые примеры лимфом включают ходжкинские и неходжкинские лимфомы. Композиции согласно настоящему изобретению также можно использовать для лечения или предотвращения патологических состояний, характеризующихся чрезмерным ангиогенезом, включая, например, васкуляризацию и/или воспаление, такие как атеросклероз, ревматоидный артрит (РА), неоваскулярная глаукома, пролиферативные ретинопатии, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию, дегенерацию сетчатки, гемангиомы, ангиофибромы и псориаз. Другими не ограничивающими примерами неопухолевых ангиогенных заболеваний являются ретинопатии несовершеннолетних (ретролентальная фиброплазия), отторжение трансплантата роговицы, инсулин-зависимый сахарный диабет,множественный склероз, миастения гревис, болезнь Крона, аутоиммунный нефрит, первичный билиарный цирроз, острый панкреатит, отторжение аллотрансплантатов, аллергическое воспаление, контактный дерматит и реакции гиперчувствительности задержанного типа, воспалительные заболевания кишечника,септический шок, остеопороз, остеоартрит, расстройства сознания, вызываемые воспалением нейронов,синдром Ослера-Вебера, рестеноз и грибковые, паразитарные и вирусные инфекции, включая цитомегаловирусную инфекцию. Определение такого заболевания находится в пределах способностей и знания специалиста в данной области. Например, человек, который либо страдает от клинически значимого новообразования или ангиогенного заболевания, либо который имеет риск развития клинически значимых симптомов, подходит для введения антагониста PDGFR, возможно, в сочетании с антагонистом VEGFR. Клинический специалист в данной области легко может определить, например, путем использования клинических тестов, медицинского осмотра и медицинской/семейной истории, является ли личность кандидатом для такого лечения. Настоящие композиции антагонистов можно вводить с целью терапевтического лечения пациенту,страдающему от опухоли или связанного с ангиогенезом патологического состояния в количестве, достаточном для предотвращения, подавления или уменьшения прогрессии опухоли или патологического состояния. Прогрессия включает, например, рост, инвазивность, метастазирование и/или рецидив опухоли или патологического состояния. Требуемое для достижения этого количество определяют как терапевтически эффективную дозу. Эффективное количество для такого использования будет зависеть от остроты заболевания и общего состояния иммунной системы пациента. Режим введения также изменяют в зависимости от состояния заболевания и статуса пациента, и обычно колеблется от однократного введения болюса или непрерывного вливания до многократного введения в течение дня (например, каждые 4-6 ч),или так, как показано лечащим врачом и состоянием пациента. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение не ограничено любой конкретной дозировкой. Способы введения млекопитающему включают, например, пероральный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный способы введения. Специфичные антитела к PDGFR и к VEGFR могут быть химически или биосинтетически связаны с другим веществом, таким как антинеопластические или антиангиогенные средства для лечения заболевания. Связанные с антителом противоопухолевые вещества включают любые вещества, которые уничтожают или повреждают опухоль, с которой связалось антитело или микроокружение клетки, с которой связалось антитело. Например, противоопухолевое вещество является токсичным веществом, таким как химиопрепарат или радиоизотоп. Химиопрепараты связывают с антителом с использованием стандартных способов (См., например, Hermentin and Seiler (1988) Behring Inst. Mitt. 82, 197-215), включая пептидные и не пептидные линкеры. Специфичные антитела к PDGFR согласно настоящему изобретению также могут быть связаны с обнаруживаемым сигнальным веществом, применимым для целей диагностики и in vivo и in vitro. Сигнальное вещество дает измеримый сигнал, который обнаруживают внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Главным образом, сигнальное вещество представляет собой фермент или хромофор, или производит свет путем флюоресценции, фосфоресценции или хемилюминисценции. Хромофоры включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разложения катализируемых ферментами реакций. Изобретение далее подразумевает использование таких антител с лекарственными или диагностическими веществами, включенными во вторичные реагенты. Например, один элемент связывающейся пары связан с антителом изобретения. Антинеопластическое средство, например, конъюгировано со вторым участником такой пары, и тем самым направляется туда, где связалось антитело. В предпочтительном варианте реализации биотин связан с антителом согласно настоящему изобретению и, тем самым,обеспечивает доставку антинеопластического средства или другой субъединицы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. Кроме того, биотин или другую такую субъединицу соединяют с антиген-связывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортера, например, в диагностической системе, где обнаруживаемое сигнальное вещество конъюгировано с авидином или стрептавидином. Антагонист PDGFR согласно настоящему изобретению, возможно, в сочетании с антагонистомVEGFR можно вводить в сочетании с одним или более пригодными адъювантами, например, цитокинами (например, IL-10 и IL-13) или другими иммунными стимуляторами, такими как, не ограничиваясь,хемокины, связанные с опухолями антигены и пептиды. Следует представлять, однако, что введение только антитела является достаточным для предотвращения, подавления или снижения прогрессии опухоли терапевтически эффективным образом. В определенных вариантах реализации может быть желательным введение антитела согласно настоящему изобретению, которое связывает RTK и блокирует связывание лиганда в сочетании с другим антиген-связывающим белком, который связывает лиганд. Связывающие лиганд антитела хорошо известны в данной области техники и включают, например, антитела к VEGF (Avastin; бевацизумаб). В соответствии с изобретением, совместное введение специфичного антагониста PDGFR и антагониста VEGFR может сопровождаться введением антинеопластического средства, такого как химиопрепарат или радиоизотоп. Примеры применимых антинеопластических средств включают описанные выше для совместного введения со специфичными антагонистами PDGFR. При комбинированной терапии антагонист PDGFR и антагонист VEGFR можно совместно вводить в одинаковом или различающемся режиме, порознь или вместе. Возможно, антагонисты можно сочетать в единственной дозе. Возможно, антагонисты можно сочетать в единственном активном объекте(например, антителе с двумя специфичностями). Терапию антагонистом PDGFR/антагонистом VEGFR проводят до, в течение или после начала другой терапии, а также в любом их сочетании, то есть, до и в течение, до и после, в течение и после, или до, в течение и после начала другой противоопухолевой терапии. Например,для лечения опухоли или новообразования терапию антагонистомPDGFR/антагонистом VEGFR можно проводить между 1-м и 30-м днем, предпочтительно между 3-м и 20-м днем, более предпочтительно между 5-м и 12-м днем перед началом лучевой терапии. В соответствии с изобретением, химиотерапию или радиотерапию проводят параллельно, до или после терапии антагонистом PDGFR/антагонистом VEGFR. В настоящем изобретении можно использовать любой пригодный способ или путь введения антител согласно настоящему изобретению, и возможно совместное введение антинеопластического средства, антагонистов рецептора или другой фармацевтической композиции. Например, режим введения антинеопластического средства, использованный в соответствии с настоящим изобретением, включает любой режим, который, как предполагают, оптимально пригоден для лечения у пациента новообразования. Различные злокачественные опухоли могут требовать использования специфичных противоопухолевых антител и специфичных антинеопластических средств, которые будут индивидуально определены для пациента. Пути введения включают, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антинеопластического средства зависит от множества факторов, включая, например, тип лекарственного вещества, тип и остроту излечиваемой опухоли и способ введения антинеопластического средства. Следует подчеркнуть, тем не менее, по меньшей мере,что настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным способом или путем введения. Следует понимать, что антитела согласно настоящему изобретению при использовании с целью профилактики или лечения млекопитающего будут вводиться в форме композиции, возможно, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, например, один носитель или более из воды, солевого раствора, фосфатного солевого буфера,декстрозы, глицерола, этанола и тому подобного, а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее включать незначительное количество вспомогательных веществ, таких как смачиватели или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые повышают время существования или эффективность связывающих белков. Композиции для инъекции, как хорошо известно в данной области техники, можно создавать таким образом, чтобы обеспечивать быстрое, продолжительное или отсроченное высвобождение активного компонента после введения его млекопитающему. Настоящее изобретение также включает наборы для подавления роста опухоли и/или ангиогенеза,- 17019595 включающие терапевтически эффективное количество специфичного антагониста PDGFR согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации изобретения, набор далее включает антагонистVEGFR (например, антагонист VEGF, PlGF, VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/Flk-1/KDR, или VEGFR3/Flt-4). Антагонистами VEGF могут быть, например, небольшие молекулы, связывающие лиганд фрагменты рецептора или антитела. Если антагонист, который вводят человеку, является антителом, предпочтительны антитела человека, гуманизированные или химерные антитела. Наборы могут далее содержать любой пригодный антагонист, например, другой рецептор фактора роста, участвующий в канцерогенезе или ангиогенезе (например, EGFR, IGFR, NGFR, FGFR, и т.п., как описано ранее). Кроме того или дополнительно, наборы согласно настоящему изобретению могут далее включать антинеопластическое средство. Примеры пригодных антинеопластических средств в контексте настоящего изобретения описаны ранее. Наборы согласно настоящему изобретению могут далее включать адъюванты; примеры также описаны ранее. Также в объем настоящего изобретения входит применение антител in vivo и in vitro в методах исследования или диагностики, которые хорошо известны в данной области техники. Методы диагностики включают наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению. Соответственно, связывающие рецептор антитела, таким образом, можно использовать in vivo и invitro в методах исследования, диагностики, профилактики или лечения, которые известны в данной области техники. Конечно, следует понимать и ожидать, что специалист в данной области техники может сделать изменения в принципах раскрытого выше изобретения, и подразумевается, что такие модификации также входят в объем настоящего изобретения. Все публикации и патентные документы, приведенные в настоящей заявке, включены в нее в полном объеме посредством ссылки. Примеры Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Подробные описания стандартных способов, таких как те, что применялись при конструировании векторов и плазмид, введении в такие векторы и плазмиды генов, кодирующих полипептиды, введении плазмид в клетки-хозяева и экспрессии, определении генов и продуктов генов, содержатся в многочисленных публикациях, включая Sambrook J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Coligan J. et al. (1994) Current Protocols inImmunology, WileySons, Incorporated. Библиотека фагового дисплея Для скрининга антител к mPDGFR использовали библиотеку фагового дисплея Fab фрагментов человека, содержащую 3,71010 клонов (de Haard H. J. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30), в соответствии с описанной ранее процедурой (Lu D. et al., 2002, Int. J. Cancer 57:393-9; Zhu Z. et al., 1998, Cancer Res. 58:3209-14), используя иммобилизованные mPDGFR-Fc. Отдельные клоны фагов, отобранные после 2-го и 3-го раундов селекции, исследовали на наличие связи с иммобилизованным mPDGFR-Fc с помощью твердофазного ELISA. Для получения растворимого Fab использовали плазмиды с отдельными генами связывающихся белков, которыми трансформировали несупрессирующие клетки Escherichia coli штамма НВ 2151. Растворимые белки Fab очищали от экстратов периплазмы посредством аффинной хроматографии с использованием колонок Protein G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) в соответствии с протоколом изготовителя. Количественные тесты на связывание рецептора и блокирование. В тесте на связывание к покрытым mPDGFR планшетам (50 мкл при 1 мкг/мл) добавляли различное количество 1 В 3 IgG или Fab и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего планшеты 3 раза промывали PBST. Планшеты затем инкубировали при комнатной температуре в течение дополнительного 1 ч с антителом козы к -цепям Ig человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch,West Grove, PA). Планшеты промывали и обрабатывали, как описано ранее (Lu D. et al., 2002; Zhu, Z. etal., 1998). В тесте на блокирование различное количество очищенных антител сначала смешивали с фиксированным количеством mPDGFR (50 нг при 0,5 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь затем переносили в 96-луночные планшеты, покрытые PDGF-BB (0,5 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После трехкратной промывки PBST планшеты инкубировали с антителом козы к Fc-фрагментам Ig человека, конъюгированным с HRP (Jackson ImmunoResearch) в течение 1 ч и обрабатывали так, как описано в (Lu D. et al., 2002; Zhu Z. et al., 1998; LoizosmPDGFR с его лигандом. Определение аффинности антитела Кинетику связывания различных Fab и IgG с mPDGFR измеряли с использованием биосенсораBIAcore 3000 (BIACORE, Inc., Uppsala, Sweden). Вкратце, на сенсорном чипе иммобилизовали mPDGFR и добавляли растворимые антитела в концентрации, колеблющейся от 1,5 до 100 нМ. Для каждой концентрации получали сенсограммы и обрабатывали их с использованием программы BIA Evaluation 2.0. Константу аффинности Kd вычисляли как отношение скорость диссоциации (koff)/скорость ассоциации(kon) (Lu D. et al., 2002; Zhu Z. et al., 1998; Loizos N. et al., 2005). Селекция антитела человека к mPDGFR. В общей сложности 190 клонов из второго раунда и 95 из третьего раунда произвольно выбрали и протестировали на связывание mPDGFR и блокирование активности как путем твердофазного ELISA с бактериофагами, так и путем твердофазного ELISA с растворимым Fab. Оказалось, что более 72% клонов из второго раунда и 98% из третьего раунда специфично связывают mPDGFR, показывая высокую эффективность процесса селекции. Тесты на блокировку лиганд выявили, что примерно 2,5% свывающихся белков также блокируют связывание mPDGFR с его лигандом PDGF-BB. Все семь фрагментов Fab специфично связывали mPDGFR и блокировали mPDGFR от связывания с его лигандом PDGF-BB с различной силой. Значение IC50 (то есть, концентрация антитела, требуемая для блокирования 50% взаимодействия mPDGFR/PDGF-BB) составляла примерно от 4 нМ до 33 нМ (фиг. 1 В). Клон 1 В 3 с наилучшей эффективностью связывания рецептора и потенциалом блокирования взаимодействия рецептор/лиганд (табл. 1) выбрали для дальнейшего исследования. Таблица 1.SEQ ID для вариабельных доменов и гипервариабельных участков антитела (нуклеотид/аминокислота) Клонирование полноразмерного антитела IgG и его экспрессия Последовательности ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей из лучшего клона 1 В 3, амплифицировали путем ПЦР и клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область легкой(каппа) цепи человека и константную область тяжелой 1 (гамма один) цепи человека. Вектором экспрессии трансфецировали клетки миеломы NS0 и отбирали стабильные клоны экспрессирующих 1 В 3 клеток. Клетки выращивали в бессывороточной среде и очищали полноразмерный IgG 1B3 из супернатанта культуры клеток с помощью аффинной хроматографии на протеине A (Poros A, Applied Biosystems,Foster City, CA). Как и ожидалось, IgG 1B3 показывал значительно лучшую эффективность связывания с иммобилизованным mPDGFR, чем его Fab фрагмент. Значение IC50 для IgG 1B3 составляло 0,34 и 1,3 нМ - для 1 В 3 Fab (фиг. 1 А). Анализ кинетики связывания методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore выявил, что аффинность 1 В 3 для связывания mPDGFR приблизительно в 57 раз выше,чем аффинность его Fab формы (5,1 нМ для Fab и 0,0 нМ для IgG). Когда антитело 1 В 3 проверяли на связывание с PDGFR человека, не наблюдалось никакой перекрестной реактивности ни с растворимым рекомбинантным белком, ни с экспрессируемым клетками линии опухоли человека поверхностным рецептором. Далее антитело 1 В 3 не связывало PDGFR ни человека, ни мыши (данные не показаны). В тесте на блокирование антитело 1 В 3 ингибировало связывание mPDGFR с его лигандом PDGF-BB сIC50 1,2 нМ, в то время как Fab имел IC50 4,1 нМ (фиг. 1 В). Антитело 1 В 3 подавляет стимулируемое PDGF-BB фосфорилирование рецептора и передачу сигнала в тесте на клетках. Несколько клеточных линий мыши, включая NIH/3T3 (фибробласты), D122 (легочная карцинома Льюиса), 4 Т 1 (рак груди), В 16 (меланома) и H5V (PmT-трансформированные клетки эндотелия) проверяли на экспрессию PDGFR с помощью проточной цитофлюориметрии, используя 1 В 3 в качестве тестирующего агента. Клетки аликвотировали в лунки 96-луночного планшета в количестве 1106 на лунку, инкубировали с 1 В 3 (10 мкг/мл) при 4 С в течение 1 ч, затем инкубировали с антителом к Fc-фрагментам человека, конъюгированным с FITC (Jackson ImmunoResearch) в течение дополнительного часа при 4 С. После нескольких отмывок холодным PBS клетки анализировали на проточном цитометре FACSyantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA). Антитело к mPDGFR от RD использовали в качестве положительного контроля (данные не показаны). Результаты проточной цитофлюориметрии(фиг. 2 А) показали, что NIH/3T3 и D122 экспрессируют PDGFR на умеренном уровне, 4 Т 1 и В 16 экспрессируют рецептор на низком уровне, и H5V не дает никакого окрашивания. Для клеток NIH/3T3 и D122 определяли фосфорилирование рецептора. Клетки помещали на чашки 6 см и выращивали до 70-80% непрерывного слоя, после чего клетки дважды отмывали PBS и сутки культивировали в бессывороточной среде. Клетки сначала инкубировали с различными антителами при комнатной температуре в течение 30 мин, затем стимулировали PDGF-BB при 37 С в течение 15 мин. Клетки лизировали в лизисном буфере (50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% TritonX-100, 1 мМEDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,5 мМ Na3VO4, 1 г/мл леупептина, 1 г/мл пепстатина и 1 г/мл апротинина) в течение 1 ч, затем центрифугировали лизат при 12,000 об/мин в течение 10 мин при 4 С. Рецепторы подвергали иммунному осаждению из супернатанта лизата клеток с помощью антитела кmPDGFR (RD Systems Inc), затем добавляли 20 мкл бусин ProA/G-сефароза. Осажденные белкирецепторы разделяли в 4-12% геле NuPAGE Bis-Tris и переносили на мембрану из поливинилиден ди- 19019595 фторида. Фосфорилированный белок mPDGFR детектировали на блоттинге с использованием антител к фосфотирозину, конъюгированных с HRP (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Все белки-рецепторы,нанесенные на гель, проверяли антителом к mPDGFR. Для изучения нижележащего сигнального пути, лизат клеток после описанной обработки разделяли в 4-12% геле NuPAGE Bis-Tris. Фосфорилированные митоген-активирующие протеинкиназы (МАРК)MAPK, соответственно (eBioscience, San Diego, CA). Антитело 1 В 3 ингибировало стимулирумое PDGF-BB фосфорилирование рецепторов как в клеткахNIH/3T3, так и в D122, дозозависимым образом (фиг. 2 В и 2 С). Антитела также сильно ингибировало стимулирумое PDGF-BB фосфорилирование как Akt, так и р 44/42 MAP киназы в клетках D122 (фиг. 2D). Противоопухолевая активность антител к mPDGFR в моделях ксенографтных опухолей. Шесть ксенографтных моделей опухолей человека, включая три карциномы яичника (SK-OV-3, OV-CAR-5 иOV-CAR-8), одну карциному поджелудочной железы (ВРС 3), одну карциному легкого (NCI-H460) и одну карциному почки (Caki-1) использовали для определения противоопухолевой активности 1 В 3 invivo. Безтимусных мышей (nu/nu) (самки, возраст 7-8 недель) содержали в течение 7-10 дней перед имплантацией ксенографтов. Каждой мыши подкожно впрыскивали 3-10106 клеток опухоли SK-OV-3,OVCAR-5, OVCAR-8, Caki-1, BxРС 3 или NCI-H460. Когда опухоли достигали приблизительно 250-300 мм 3, мышей случайно распределяли по группам 10-12 животных в каждой и подвергали внутрибрюшинным инъекциям 2-3 раза в неделю, вводя 1 В 3, DC101 или 1 В 3 в сочетании с DC101. В качестве контрольных групп использовали IgG человека и/или солевой раствор. Размеры опухолей и вес тела мышей измеряли дважды в неделю. Объем опухоли вычисляли по формуле: /6(длинаширина 2), где длина равна самому длинному диаметру и ширина равна перпендикулярному к длине диаметру. Вычисляли отношение среднего объема опухоли в группе лечения относительно контрольной группы (Т/С%). Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента. Для изучения влияния противоопухолевой монотерапии антителами к PDGFR, мышам дважды в неделю путем внутрибрюшинной инъекции вводили 1 В 3, нормальный IgG человека или солевой раствор. В модели SK-OV-3 несущие опухоли мыши получали 1 В 3 в дозировке 6, 20 или 60 мг/кг. У мышей,получавших две более низкие дозы 1 В 3, не наблюдалось никакого ингибирования роста опухоли (фиг. 3 А). В дозе 60 мг/кг 1 В 3 полностью блокировало рост опухоли вплоть до 29 дней после после начала лечения (Р=0,0028), после чего опухоли начинали быстро расти с такой же скоростью, что в контрольной группе, получавшей IgG человека, несмотря на продолжавшееся введение антитела (фиг. 3 А). Антитело 1 В 3 (в дозе 60 мг/кг) также демонстрировало значительную противоопухолевую активность в ксенографтных моделях OV-CAR-8 и NCI-H460: оно почти полностью блокировало рост опухолей OV-CAR-8 в течение всего лечения (фиг. 3 В) (Р=0,0022) и значительно снижало рост опухолей NCI-Н 460 (фиг. 3F)(Р 0,05). С другой стороны, 1 В 3 (в дозировках 40 мг/кг три раза в неделю или 60 мг/кг дважды в неделю) не показало никакой противоопухолевой активности в ксенографтных моделях ВхРС 3, OV-CAR-5 иCaki-1 (фиг. 3 С, 3D и 3 Е). Прием 1 В 3 не вызывал никакой видимой токсичности, включая изменения веса тела и поведения животного во всех шести обследованных моделях. Расширение противоопухолевой и антиангиогенной активности антитела к VEGFR2 DC101 с помощью 1 В 3 в моделях ксенографтных опухолей. Противоопухолевая и антиангиогенная активность антител к VEGFR2 была показана на многочисленных моделях с использованием животных (Prewett, M. etal., 1999, Cancer Res. 59:5209-18). В данной работе мы продемонстрировали, что антитело 1 В 3 способно повышать противоопухолевую и антиангиогенную активность DC101 с использованием двух ксенографтных моделей: ВхРС-3 (карцинома поджелудочной железы) и NCI-H460 (немелкоклеточная карцинома легкого). Безтимусных "голых" мышей, несущих ксенографтные опухоли размером 300-350 мм 3,случайно распределяли по четырем группам лечения (n=12 на группу) и подвергали три раза в неделю внутрибрюшинной инъекции солевым раствором, 1 В 3 (40 мг/кг), DC101 (40 мг/кг) или 1 В 3 (40 мг/кг) плюс DC101 (40 мг/кг). Как ожидалось, введение DC101 значительно подавляло рост ксенографтов ВхРСЗ и NCI-H460 (Р=0,0001 и 0,0001, соответственно) (фиг. 4 А и 4 В). Монотерапия 1 В 3 продемонстрировала умеренную противоопухолевую активность в модели NCI-H460 (Т/С%=66% на 22-й день после лечения, Р=0,0062), но не показало никакой противоопухолевой активности в ксенографтах ВхРС 3. Сочетание 1 В 3 и DC101 приводило к значительно усиленному подавлению опухоли в модели ВхРС 3: Т/С% в конце терапии составляло 27,3% для мышей, которые получали комбинацию, антител по сравнению с 38,7% для мышей, получавших только DC101 (Р=0,0346). Далее, регрессию опухоли наблюдали у 7 из 12 мышей (58,3%) в группе с комбинацией антител по сравнению с 2 мышами из 11 (18,2%) в группе монотерапии DC101 и отсутствие регрессии у мышей, получавших только 1 В 3. В модели NCI-H460, сочетание 1 В 3 плюс DC101 также давало более сильную активность ингибирования опухоли, чем только 1 В 3 или только DC101: на 22-й день после лечения Т/С% составляло 22% в группе 1 В 3 плюс DC101 по сравнению с 66% в группе 1 В 3 (Р 0,0001); в конце анализа (50 дней после лечения) средний объем опухоли в группе с комбинацией антител был вдвое меньше, чем в группе с монотерапией DC101 (813,9127,8 мм 3 против 1660,9554,4 мм 3) (Р=0,025). В то время как в группе с комбинацией антител не было никаких смертей, в течение эксперимента в группе DC101 две из 12 мышей умерли (одна на 22-й день и другая на 43-й день). Иммуногистохимия препаратов опухоли Ксенографтные опухоли из получавших антитела мышей обследовали путем иммуногистохимического окрашивания на плотности сосудов и покрытие сосудов перицитами. На 34-й день (модель BxPC3) или 50-й день (модель NCI-H460) после лечения умерщвляли по шесть мышей из группы монотерапииDC101 и комбинированной терапии DC101/1B3. Опухоли удаляли, фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером при 4 С в течение суток и заливали парафином. Фиксированные опухоли микротомировали до толщины 6 мкм на микротоме Leica RM2135, затем дважды окрашивали на кровеносные сосуды, так и на покрытие перицитами/ГМК. Срезы опухоли окрашивали антителом к CD31 (для окрашивания кровеносных сосудов) и антителом к альфа актину гладких мышц (-SMA) (для окрашивания перицитов). Срезы сначала инкубировали с антителами крысы РЕСАМ-1 (антитело к CD31 мыши, Pharmingen, San Diego, CA) при 4 С в течение суток, затем инкубировали с меченными биотином антителами осла к IgG крысы, затем окрашивали конъюгатом стрептавидин-Су 3 (оба от Jackson ImmunoResearch). Срезы далее окрашивали конъюгатом антитела к -SMA и FITC (Sigma). Наконец, срезы количественно окрашивали ToPro (Molecular Probe,Leiden, Netherlands) при комнатной температуре в течение 5 мин. Иммунофлюоресцентные снимки (на увеличении 200) делали с использованием программного обеспечения EZ-C1 2,20 с помощью цифровой камеры, подключенной к конфокальному микроскопу (Nikon Eclipse TE2000U). Автоматизированный количественный учет морфологии проводили с использованием программного обеспечения Image Pro Plus (MediaCybernatics, Silver Spring, MD), анализируя каждый срез. Из каждого среза отбирали пять цифровых иммунофлюоресцентных снимков периферии и сердцевины опухоли и подсчитывали общие CD31+ сосуды, -SMA+ сосуды, зрелые сосуды (двойные CD31+/SMA+) и процент двойных CD31+/-SMA+ сосудов среди общего числа CD31+ сосудов. Для измерения степени васкуляризации отдельных срезов опухоли использовали два разных количественных метода: плотность сосудов (число сосудов/мм 3) и процент площади сосудов (% площади сосудов в общей области опухоли). Компьютеризованный количественный анализ морфологии проводили с использованием программного обеспечения Image Pro Plus. Для статистического анализа использовали двухпараметрический дисперсный анализ и критерий наименьшей значимой разности Фишера для множественных сравнений (программное обеспечение Sigma Stat 3.1 Systat Software, Inc., Point Richmond, CA). Обработка DC101 значительно уменьшала плотность CD31+ сосудов в ксенографтах опухоли ВхРС 3, главным образом в пределах сердцевины опухоли (фиг. 5 А), но оказала только слабый эффект на плотность -SMA+ сосудов (фиг. 5 В). Добавление 1 В 3 к DC101 не вызывало уменьшения плотности сосудов в сердцевине опухоли, но приводило к существенному уменьшению плотности сосудов на периферии опухоли (фиг. 5 А). Антитело 1 В 3 само по себе не показало никакого значимого эффекта на общую плотность сосудов опухоли (фиг. 5 А), но снизило число -SMA окрашенных на периферии опухоли(фиг. 5 В), привело к снижению процента двойных положительных CD31/-SMA (зрелых) сосудов (фиг. 5 С). Это указывает на то, что PDGFR-положительные перициты опухолей были избирательно ингибированы. Интересно, что в обработанных только DC101 и DC101 плюс 1 В 3 опухолях степень уменьшенияCD31+-сосудов напрямую коррелирует с уменьшением покрытия -SMA+ перицитов как в сердцевине опухоли, так и на периферии (фиг. 5 А и В). В результате, процент зрелых сосудов как на периферии опухоли, так и в сердцевине, то есть, доля двойных CD31+/-SMA+ сосудов среди общих CD31 сосудов, не оказался значительно различающимся между опухолями у мышей, получавших солевой раствор, толькоDC101 или DC101 плюс 1 В 3 (фиг. 5 С). Аналогичные явления также наблюдали на ксенографтах опухолиNCI-H460 (фиг. 5D-F). Наконец, почти идентичные наблюдения на обоих ксенографтах опухолей получили в случае, когда степень васкуляризации опухоли определяли с использованием альтернативного способа оценки, в котором измеряют процент площади сосудов среди общей площади опухоли (не показано). Селекция антитела человека к hPDGFR. Описанную выше библиотеку фагового дисплея скринировали для выявления фага с Fab-фрагментом, который связывает PDGFRP человека. Как было описано ранее для 1 В 3, последовательности ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей из лучшего связывающего hPDGFR клона 2C5 (табл. 1), амплифицировали путем ПЦР и клонировали в вектор экспрессии, содержащий константную область легкой цепичеловека и константную область тяжелой цепи 1 человека. Вектором экспрессии трансфецировали клетки миеломы NSO и отбирали стабильные клоны экспрессирующих антитело 2C5 клеток. Как было определено в ходе анализа BIAcore, антитело 2 С 5 связывает hPDGFR со сходными характеристиками связывания, что и 1 В 3 связывает mPDGFR. Подобно 1 В 3, антитело 2C5 является специфичным для PDGFR и не связывает hPDGFR. Тем не менее, по меньшей мере, в то время как 1 В 3 связывает PDGFR мыши, но не PDGFR человека, 2C5 связывает оба этих белка (фиг. 6). В одном экс- 21019595 перименте значения IC50 для антитела 2C5, определенные методом поверхностного плазмонного резонанса, составляли 1,3610-11 M для hPDGFR и 6,0510-11 М для mPDGFR. Значение IC50 для связывания 1 В 3 и hPDGFR составляло 4,1710-11 M. Антитело 2C5 также блокирует связывание PDGF-BB с PDGFR человека и мыши, как показано на фиг. 6. Значение IC50 составляло 0,55 нМ для hPDGFR и 0,35 нМ для mPDGFR. Антитело 2C5 подавляет стимулируемое PDGF-BB фосфорилирование рецептора и передачу сигнала в тесте на клетках. Способность 2C5 блокировать фосфорилирование PDGFR определяли для клеток опухоли человека Caki-1 (фиг. 7) и мыши NIH/3T3 и линии клеток D122 (фиг. 8). Антитело 2 С 5 блокировало фосфорилирование рецептора даже в самой низкой проверенной концентрации (IC501,8 мкг/мл). Антитело 2 С 5 также сильно подавляло стимулируемое PDGF-BB фосфорилирование Akt и р 44/42 MAP киназы в клетках Caki-1 (фиг. 7) и клетках D122 (фиг. 8). Противоопухолевая активность антител к PDGFR в моделях ксенографтных опухолей. Для оценки противоопухолевой активности 2 С 5 in vivo использовали пять моделей ксенографтных опухолей человека, которые описывались ранее (OVCAR-5 и OVCAR-8, ВхРС 3, NCI-H460 и Caki-1). Антитело 2 С 5, которое связывает и ингибирует рецепторы PDGFR в опухолях человека и кровеносных сосудах мыши,сравнивали с 1 В 3, которое связывается только в кровеносных сосудах мыши. Умеренное уменьшение роста опухоли наблюдали в моделях SKOV-3, OVCAR-8 и NCI-H460, но не в моделях OVCAR-5, ВхРС 3 и Caki-1 (фиг. 9, табл. 2). Таблица 2. Монотерапия антителом к PDGFR Противоопухолевая активность сочетания антител к PDGFR (2 С 5)/к mVEGFR 2 (DC101) в моделях ксенографтных опухолей. Антитело 2 С 5, которое связывает рецепторы PDGFR человека и мыши(то есть, рецепторы PDGFR как в опухоли, так и в кровеносных сосудах ксенографтов человека и хозяина-мыши), также проверили на ингибирование роста опухоли в сочетании с антителом (DC101), специфичным для рецептора VEGFR2 мыши. Использовали линии ксенографтных клеток ВxРС-3, MIAРаСа-2, Detroit-562, НСТ-8, NCI-H460, NCI-H292 и НСТ-116. Совместное введение 2 С 5 и DC101 приводило к значительно большему ингибированию роста опухоли, чем любое из антител само по себе (фиг. 10 и табл. 3). Антитело 2 С 5 подавляет стимулируемую PDGF-BB миграцию клеток в тесте на клетках. Для определения ингибиторной способности 2 С 5 на миграцию клеток использовали метод двух камер и линии клеток NCI-H4 60, OVCAR8, WS-1 и U-118. В верхнюю и нижнюю камеры добавляли коллаген (100 мкг/мл) (100 мкл в верхнюю и 150 мкл в нижнюю) и инкубировали при 37 С в течение 1 ч. После двухкратной промывки камер PBS в верхнюю камеру добавляли 100 мкл голодающих клеток (примерно 1106/мл в бессывороточной среде) и в нижнюю камеру добавляли 150 мкл бессывороточной среды, затем инкубировали при 37 С в течение 4 ч. Для стимуляции с помощью PDGF-BB, в нижнюю камеру добавляли PDGF-BB в конечной концентрации 100 нг/мл. В образцах с антителом 2C5 в верхнюю камеру добавляли 2C5 в конечной концентрации 30 мкг/мл. Немигрировавшие клетки соскабливали с мембраны в верхней камере. После трехкратной промывки PBS мигрировавшие клетки на мембране в нижней камере фиксировали 4% формалином и окрашивали красителем Hoechst (4 мкг/мл). Результаты фиксировали и клетки считали с помощью флюоресцентной микроскопии. В концентрации 30 мкг/мл антитело 2 С 5 полностью ингибировало стимулируемую PDGF-BB миграцию клеток во всех четырех линиях клеток,использованных в тесте (фиг. 11). Противоопухолевая активность сочетаний антитела к PDGFR (2 С 5)/химиопрепарата или антитела к PDGFR (2 С 5)/химиопрепарата/антитела к mVEGFR2 (DC101) в моделях ксенографтных опухолей. Антитело к PDGFR 2C5 также проверяли на ингибирование роста опухоли в сочетании с химиотерапией (гемцитабин) или химиотерапией (гемцитабин, паклитаксел или оксалиплатин) вместе с антителом кVEGFR2 (DC101). Использовали линии ксенографтных клеток NCI-H292, MIA-PaCa-2, NCI-H460 и GEO. Совместное введение 2C5 и гемцитабина приводило к большему ингибированию роста опухоли, чем 2 С 5 или гемцитабин сами по себе. Совместное введение 2 С 5, химиопрепарата и DC101 приводило к большему ингибированию роста опухоли, чем сочетание химиопрепарат/DC101 (фиг. 12 и табл. 4). Противоопухолевая активность сочетания антител к PDGFR (2C5)/PDGFR (антитело 3G3 специфическое к hPDGFR или 1 Е 10, специфическое к mPDGFR) в ксенографтных моделях опухолей. Антитело 2 С 5 к PDGFR также проверяли на ингибирование роста опухоли в сочетании с антителом к PDGFR. Ксенографтными линиями клеток являлись Caki-1, HPAC и U-118MG. Совместное применение 2 С 5 и 3G3 приводит к значительно большему ингибированию роста опухоли, чем любое из антител само по себе (фиг. 13 и табл. 5). Таблица 5. Антитело к PDGFR в сочетании с антителом к PDGFR Эффекты антитела 2 С 5 на экспрессию PDGFR, PDGF-BB и VEGF. Самкам бестимусных мышей подкожно вводили суспензию клеток NCI-Н 460 (5105 клеток/мышь). Когда опухоли достигали 250 мм 3 мышей случайно распределяли по четырем группам лечения (n=35 в каждой, для солевого раствора,2 С 5, DC101 и 2 С 5 + DC101). На 3-й, 7-й и 14-й день умерщвляли шесть животных из каждой группы и забирали их опухоли. Лизаты опухолей анализировали с помощью твердофазного ELISA для определения уровня PDGFR, PDGF-BB, mVEGFR2, mVEGF, hVEGF, FGF и HIF-1 (фиг. 14). Антитело 2 С 5 связывается с доменом 1 (D1) и доменом 2 (D2) PDGFR. Различные химерные конструкции PDGFR и PDGFR сначала создавали с помощью обмена доменов, начиная с N-конца к Сконцу, заменяя домены PDGFR на домены PDGFR. Химерные рецепторы PDGFR/ проверяли на способность связывать 2C5. Затем для подтверждения связывающего 2 С 5 домена PDGFR создали короткие варианты PDGFR, включая D1D2, D2D3 и D1D2D3. Результаты показали, что 2 С 5 связывает Таблица 6. Картирование эпитопов антитела к PDGFR