Продукт конъюгации

Предложен пептид, селективно ингибирующий интегрин v3 и содержащий продукт дезамидирования пептида, содержащего мотив NGR.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МОЛЬМЕД СПА; ФОНДАЦИОНЕ ЧЕНТРО САН РАФАЭЛЕ ДЕЛЬ МОНТЭ ТАБОР (IT) 013967 Область применения изобретения Настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые могут использоваться в лечении болезней, связанных с ангиогенезом и раком. В частности, изобретение относится к внеклеточным матричным пептидам и их производным и, более конкретно, к пептидам, содержащим мотив DGR, и их изомерам. Настоящее изобретение относится также к модифицированным цитокинам, в частности к производным цитокинов, способным к "хомингу" ангиогенных полостей. Описание уровня техники Внеклеточная матрица является важным регулятором поведения клетки и ткани. Протеины внеклеточной матрицы, такие как фибронектин, витронектин, коллагены и ламинин, связаны с множеством рецепторов, которые управляют многими важными с медицинской точки зрения биологическими явлениями, такими как ангиогенез, миграция клеток, восстановление ткани, дифференциация раковых клеток,скопление плейтлитов и хоминг клеток иммунной системы и нейронные процессы относительно целевых участков. Важным семейством рецепторов, связанных с внеклеточной матрицей, являются интегрины. Фибронектины - это крупные гликопротеины внеклеточной матрицы (450 КДа), которые вовлечены в связь с интегринами. Они состоят из двух почти идентичных связанных дисульфидом субъединиц,причем каждая субъединица состоит из трех типов повторяющихся гомологичных модулей, называемых повторами FN-I, FN-II и FN-III. Кроме того, могут также присутствовать альтернативно сплайсированные модули, называемые EDA, EDB и IIICS (Mohri, 1997; Pankov and Yamada, 2002). Отдельные модули или группы модулей могут содержать связанные участки для различных молекул, включая сульфатированные гликозаминогликаны, ДНК, желатин, гепарин и фибрин (Mohri, 1997; Pankov and Yamada, 2002;Yamada, 1989). Кроме того, фибронектины содержат связанные участки для почти половины известных рецепторов интегринов клеточной поверхности (Johansson et al., 1997; Plow et al., 2000). В частности, повтор FN-III10 включает участок RGD, который может связывать 31, 51, 1, 3, 6, 81 и IIb3 интегрины, в то время как повтор FN-III9 содержит так называемый "синергический участок" PHSRN,который взаимодействует с RGD в связи 51 и IIb3 (Busk et al., 1992; Dedhar and Gray, 1990; Gardneret al., 1990; Takada et al., 1987, Vogel et al., 1990; Weinacker et al., 1994). Область FN-III14-IIICS состоит из трех участков (называемых CS1, CS5 и H1), характеризующихся присутствием мотива LDV и дополнительных участков REDV и IDA, вовлеченных в распознавание 41 и 47 (Johansson et al., 1997; Pankovand Yamada, 2002). Кроме того, повтор FN-IH5 включает последовательность KLDAPT, которая связывает 41 и 47 (Moyano et al., 1997), тогда как FN-I1-9 и FN-II1-2 содержат участки, еще не идентифицированные, которые могут взаимодействовать с 51 (Hocking et al., 1998). Анализ первичной и третичной структуры фибронектина человека показал, что этот протеин содержит две петли GNGRG, размещенные в модулях FN-I5 и FN-I7, которые сохраняются в быках, мышах,крысах, амфибиях и рыбах (Di Matteo et al.). Два дополнительных участка NGR, менее сохраняемых,также присутствуют в FN-II1 и FN-III9 человека. Последняя экспериментальная работа показала, что пептиды, содержащие мотив NGR, могут ингибировать 51- и 1-опосредованную клеточную адгезию к фибронектину (Koivunen et al., 1993). Взаимодействие между интегринами, закрепляющими клеточную поверхность, и компонентами внеклеточной матрицы было вовлечено в ангиогенез, важный процесс в неонатальном росте, и в патогенезис широкого ряда клинических заболеваний, в том числе воспаление тканей, артрит, опухолевый рост, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна вследствие неоваскуляризации сетчатки и подобных состояний. Известно, что интегрин 3, рецептор витронектина, играет критическую роль в ангиогенезе (Hynes, 2002). Соединения, способные ингибировать взаимодействие этого интегрина с протеинами внеклеточной матрицы, известны как ингибирующие ангиогенез и опухолевый рост (Brooks etal., 1994; Brooks et al., 1995; Friedlander et al., 1995; Friedlander et al., 1996; Hammes et al., 1996). Однако проблемой, связанной с этими ингибиторами, остается их перекрестная реактивность со многими видами интегринов. В свете возрастающего понимания роли внеклеточной матрицы в биологических процессах и развитии заболеваний остается необходимость в новой терапии, которая нацелена на эту область. Настоящее изобретение направлено на эту необходимость. Противоопухолевая активность некоторых цитокинов хорошо известна и описана. Некоторые цитокины уже используются терапевтически также для людей (Fiers et al., 1995). Например, такие цитокины, как интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон(IFN), проявили положительную противоопухолевую активность у пациентов с опухолями разных типов, такими как метастатическая карцинома почек, лейкимический ретикулез, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и т.п. Другие цитокины, такие как IFN, фактор некроза опухоли (TNF), TNF, IL-1, 4, 6, 12, 15 и колониестимулирующие факторы (CFSs), проявили некоторую противоопухолевую активность для некоторых типов опухолей и поэтому являются объектом дальнейшего изучения. В общем, терапевтическое использование цитокинов значительно ограничено их системной токсичностью. Например, для TNF была первоначально обнаружена его способность вызывать геморрагиче-1 013967 ский некроз некоторых опухолей (Carswell et al., 1975) и его цитотоксическое действие in vitro на различные линии опухолей (Helson et al., 1975), но, как было доказано впоследствии, он имел выраженную провоспалительную активность, которая в случае условий сверхпродуктивности могла оказывать вредное воздействие на организм человека (Tracey et al., 1993). Поскольку системная токсичность является основной проблемой при использовании фармакологически активных количеств цитокинов у людей, новые производные и терапевтическая стратегия сейчас оцениваются и направляются на снижение токсического эффекта этого класса биологических действующих факторов с сохранением в то же время терапевтической эффективности. Например, в WO 01/61017 раскрывается продукт конъюгации между TNF или IFN и лигандом рецептора CD13; в WO 03/093478 раскрывается фармацевтическая композиция, состоящая из соединения цитокина и опухоленацеливающего модуля, в которой цитокин присутствует в таком количестве, которое не вызывает механизма отрицательной обратной связи; а в WO 03/092737 раскрывается соединение различных цитокинов и опухоленацеливающих модулей. Настоящее изобретение предлагает новые соединения цитокинов, которые обладают терапевтическим потенциалом. Сущность изобретения Дезамидирование аспарагина (N), посттрансляционная модификация неферментного протеина, в общем случае рассматривается как вредный результат, связанный со старением протеина. В настоящем патенте мы показываем, что последовательность аспарагин-глицин-аргинин (NGR) внеклеточной матрицы может способствовать адгезии эндотелиальных клеток через необычный механизм, основанный на неферментном дезамидировании аспарагина, с аспаргиновой кислотой и изоаспаргиновой кислотой, генерируя новый мотив клеточной адгезии, мы показываем, что это дезамидирование связано с "усилением функции"; причем дезамидированные фрагменты способны ингибировать адгезию эндотелиальных клеток к вибронектину, ингибировать интегрин 3 и ингибировать рост опухоли. В частности, мы показали, что изомеры LisoDGR и DDGR обнаружили повышенную связь адгезии клеток и противораковые свойства, чем другие изометрические формы. Удивительно, что огромное количество пептидов содержит L энантиомер аспаргиновой кислоты. Пептид, произведенный генной экспрессией, будет всегда содержать L энантиомер. Мы также обнаружили, что цитокины, связанные с дезамидированными пептидами NGR, обладают удивительной активностью. Мы раньше обнаружили, что терапевтический показатель некоторых цитокинов может быть существенно улучшен, а их иммуннотерапевтические свойства могут быть усилены связью с лигандом, содержащим мотив NGR, такой как модифицированный лиганд рецептора аминопептидазы-N (CD13). CD13 является трансмембранным гликопротеином с 150 кДа, хорошо сохраняемым в различных видах. Он экспрессируется в нормальные клетки, а также в линии миелоидной опухоли, в ангиогенном эндотелии и представляет некоторый эпителий. Рецептор CD13 обычно идентифицируется как рецептор "NGR", в котором его лиганды пептида разделяют аминокислотный мотив "NGR". В настоящее время мы с удивлением обнаружили, что подобные или в самом деле улучшенные результаты могут быть достигнуты с использованием модифицированного лиганда, в котором аспарагиновый остаток (Asn или N) в мотиве NGR модифицирован в аспартил (Asp или D), т.е. в мотив "DGR", путем дезамидирования. TNF, связанный с таким модифицированным лигандом рецептора CD13, и IFN могут действовать синергически, таким образом, что эффективная противоопухолевая активность может наблюдаться при совместном введении в дозах, которые ниже эффективных индивидуальных доз. Кроме того,мы обнаружили, что противоопухолевая активность комбинации модифицированного TNF и другого противоопухолевого агента, такого как мефалан, или доксорубицин, или цис-платин, или гемцитабин,или таксол, возрастает при назначении IFN. Сущность изобретения Согласно первому аспекту изобретения предусмотрен пептид, селективно ингибирующий интегрин 3 и содержащий продукт дезамидирования пептида, содержащего мотив NGR. Согласно второму аспекту изобретения предусмотрен пептид, ингибирующий адгезию эндотелиальной клетки к витронектину и содержащий продукт дезамидирования пептида, содержащего мотивNGR. Согласно другому аспекту изобретения предусмотрен пептид, содержащий продукт дезамидирования протеина внеклеточной матрицы, такого как (но не ограничиваясь только этим) фибронектин, витронектин, коллаген или ламинин, или их фрагмент или производную. Предпочтительно фрагмент состоит по крайней мере из 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 последовательных аминокислот протеина дезамидированной матрицы и предпочтительно содержит дезамидированный мотив NGR упомянутого протеина. Предпочтительно пептид содержит продукт дезамидирования фибронектина, еще предпочтительней продукт дезамидирования FN-I5, FN-I7, FN-II1 или FN-III9 модуля фибронектина, еще более предпочтительно продукт дезамидирования FN-I5 модуля фибронектина, или его фрагмент, или производную,или продукт дезамидирования FN-I7 модуля фибронектина, или его фрагмент, или производную. Предпочтительно фрагмент состоит по крайней мере из 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 последова-2 013967 тельных аминокислот фибронектина и предпочтительно содержит дезамидированный мотив NGR упомянутого протеина. В одном варианте выполнения пептид состоит из продукта дезамидирования протеина внеклеточной матрицы, или его фрагмента, или производной. Согласно другому аспекту изобретения предусмотрен продукт дезамидирования пептида, содержащего последовательность XNGRX', где X выбирается из группы, состоящей из L, V, А, С, G, Y, Р, Н, K,Q и I, a X' выбирается из группы, состоящей из С, G, H, L, E, T, Q, R, S и Р. Предпочтительно пептид содержит продукт дезамидирования пептида, содержащего последовательность, выбранную из CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC, CNGRCG,LNGRE,YNGRT,LQCICTGNGRGEWKCE,LQCISTGNGRGEWKCE,CICTGNGRGEWKC,CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY, CTCVGNGRGEWTC иCTSVGNGRGEWTC. В одном варианте выполнения пептид состоит из продукта дезамидирования пептида, имеющего последовательность, выбранную из CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC,LNGRE,YNGRT,LQCICTGNGRGEWKCE,LQCISTGNGRGEWKCE,CICTGNGRGEWKC,CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY, CTCVGNGRGEWTC иCTSVGNGRGEWTC. Предпочтительно пептид содержит продукт дезамидирования, содержащий последовательность,выбранную из цикло-CVLNGRMEC, линейной CNGRC, циклической CNGRC, линейной CNGRCG и циклической CNGRCG. В одном варианте выполнения пептид состоит из продукта дезамидирования пептида, имеющего последовательность, выбранную из цикло-CVLNGRMEC, линейной CNGRC, циклической CNGRC, линейной CNGRCG и циклической CNGRCG. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен пептид, содержащий мотив DGR,в котором упомянутый пептид селективно ингибирует интегрин 3. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен пептид, содержащий мотив DGR,в котором упомянутый пептид ингибирует адгезию эндотелиальной клетки к витронектину. Предпочтительно пептид содержит последовательность XDGRX', где X выбирается из группы, состоящей из L, V, А, С, G, Y, P, H, K, Q и I, a X' выбирается из группы, состоящей из С, G, H, L, E, T, Q, R,S и Р. Предпочтительно пептид содержит последовательность, выбранную из CDGRCVSGCAGRC,DGRAHA, GDGRG, CVLDGRMEC, CDGRC, CDGRCG, LDGRE, YDGRT, LQCICTGDGRGEWKCE,LQCISTGDGRGEWKCE,CICTGDGRGEWKC,CISTGDGRGEWKC,MRCTCVGDGRGEWTCY,MRCTSVGDGRGEWTCY, CTCVGDGRGEWTC или CTSVGDGRGEWTC, более предпочтительно - последовательность, выбранную из цикло-CVLDGRMEC, линейной CDGRC, циклической CDGRC, линейной CDGRCG и циклической CDGRCG. В одном варианте выполнения пептид содержит последовательность, выбранную изCDGRCVSGCAGRC, DGRAHA, GDGRG, CVLDGRMEC, CDGRC, CDGRCG, LDGRE, YDGRT,LQCICTGDGRGEWKCE,LQCISTGDGRGEWKCE,CICTGDGRGEWKC,CISTGDGRGEWKC,MRCTCVGDGRGEWTCY, MRCTSVGDGRGEWTCY, CTCVGDGRGEWTC или CTSVGDGRGEWTC,более предпочтительно - последовательность, выбранную из цикло-CVLDGRMEC, линейной CDGRC,циклической CDGRC, линейной CDGRCG и циклической CDGRCG. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен пептид, содержащий мотивisoDGR. Предпочтительно пептид содержит последовательность XisoDGRX', где X выбирается из группы,состоящей из L, V, А, С, G, Y, P, H, K, Q и I, a X' выбирается из группы, состоящей из С, G, H, L, E, T, Q,R, S и Р. Предпочтительно пептид содержит последовательность, выбранную из CisoDGRCVSGCAGRC,isoDGRAHA, GisoDGRG, CVLisoDGRMEC, CisoDGRC, CisoDGRCG, LisoDGRE, YisoDGRT,LQCICTGisoDGRGEWKCE, LQCISTGisoDGRGEWKCE, CICTGisoDGRGEWKC, CISTGisoDGRGEWKC,MRCTCVGisoDGRGEWTCY,MRCTSVGisoDGRGEWTCY,CTCVGisoDGRGEWTC илиCisoDGRCG. В одном варианте выполнения пептид содержит последовательность, выбранную изCisoDGRCG. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен пептид, содержащий мотив LisoDGR.-3 013967 Предпочтительно пептид содержит последовательность XLisoDGRX', где X выбирается из группы,состоящей из L, V, А, С, G, Y, P, H, K, Q и I, a X' выбирается из группы, состоящей из С, G, H, L, E, T, Q,R, S и Р. Предпочтительно пептид содержит последовательность, выбранную из CLisoDGRCVSGCAGRC, LisoDGRAHA, GLisoDGRG, CVLLisoDGRMEC, CLisoDGRC5, CLisoDGRCG, LLisoDGRE, YLisoDGRT,LQCICTOLisoDGRGEWKCE, LQCISTGLisoDGRGEWKCE, CICTGLisoDGRGEWKC, CISTGLisoDGRGEWKC, MRCTCVGLisoDGRGEWTCY, MRCTSVGLisoDGRGEWTCY, CTCVGLisoDGRGEWTC иCTSVGLisoDGRGEWTC, более предпочтительно - последовательность, выбранную из циклоCVLLisoDGRMEC, линейной CLisoDGRC, циклической CLisoDGRC, линейной CLisoDGRCG и циклической CLisoDGRCG. В одном варианте выполнения пептид содержит последовательность, выбранную из CLisoDGRCVSGCAGRC, LisoDGRAHA, GLisoDGRG, CVLLisoDGRMEC, CLisoDGRC, CLisoDGRCG, LLisoDGRE, YLisoDGRT, LQCICTGLisoDGRGEWKCE, LQCISTGLisoDGRGEWKCE. CICTGLisoDGRGEWKC,CISTGLisoDGRGEWKC,MRCTCVGLisoDGRGEWTCY,MRCTSVGLisoDGRGEWTCY,CTCVGLisoDGRGEWTC и CTSVGLisoDGRGEWTC, более предпочтительно - последовательность, выбранную из цикло-CVLLisoDGRMEC, линейной CLisoDGRC, циклической CLisoDGRC, линейной CLisoDGRCG и циклической CLisoDGRCG. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен пептид, содержащий мотивD Предпочтительно пептид содержит последовательность XDDGRX', где X выбирается из группы, состоящей из L, V, А, С, G, Y, P, H, K, Q или I, a X' выбирается из группы, состоящей из С, G, H, L, E, T, Q,R, S или Р. Предпочтительно пептид содержит последовательность, выбранную из CDDGRCVSGCAGRC,GDDGRG,CVLDDGRMEC,CDDGRC,CDDGRCG,LDDGRE,YDDGRT,DDGRAHA,LQCICTGDDGRGEWKCE, LQCISTGDDGRGEWKCE, CICTGDDGRGEWKC, CISTGDDGRGEWKC,MRCTCVGDDGRGEWTCY, MRCTSVGDDGRGEWTCY, CTCVGDDGRGEWTC и CTSVGDDGRGEWTC,более предпочтительно - последовательность, выбранную из цикло-CVLDDGRMEC, линейной CDDGRC,циклической CDDGRC, линейной CDDGRCG и циклической CDDGRCG. В одном варианте выполнения пептид, содержащий мотив isoDGR, мотив LisoDGR или мотивDDGR, содержит продукт дезамидирования протеина внеклеточной матрицы, такого как (но не ограничиваясь только этим) фибронектин, витронектин, коллаген или ламинин, более предпочтительно продукт дезамидирования фибронектина, более предпочтительно продукт дезамидирования FN-I5, FN-I7, FN-II1 или FN-III9 модуля фибронектина, или их фрагмент или производные. Предпочтительно фрагмент состоит по крайней мере из 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 последовательных аминокислот протеина внеклеточной матрицы или модуля. Предпочтительно пептид по настоящему изобретению селективно ингибирует интегрин 3 и/или препятствует адгезии эндотелиальных клеток к витронектину. Предпочтительно пептид ингибирует 3,но не ингибирует 5, 51 и 11. Предпочтительно, чтобы IC50 пептида относительно ингибирования 3 было 0,5 мкМ, предпочтительно 0,2 мкМ. Предпочтительно, чтобы образец, используемый для определения IC50, определялся с использованием сопряженных комплексов стрептавидина-пероксидазы, как описано в материалах и методиках. Предпочтительно, чтобы IC50 пептида относительно 5, и/или 51, и/или 11 было 1,0 мкМ,еще предпочтительней 2,0 мкМ, 3,0 мкМ, 4,0 мкМ. Предпочтительно, чтобы пептид по настоящему изобретению ингибировал рост опухоли. Предпочтительно, чтобы пептид по настоящему изобретению ингибировал ангиогенез. В одном варианте выполнения пептид по настоящему изобретению содержит дополнительный терапевтический агент, в том числе противораковый агент цитокина. Предпочтительно, чтобы пептид по настоящему изобретению содержал цепочку, включающую остатки G и R мотива DGR. В одном варианте выполнения пептид по настоящему изобретению содержит до 350, 100, 50, 25, 15,10 или 5 аминокислот. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен продукт конъюгации, содержащий пептид по настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы этот продукт конъюгации находился между пептидом по настоящему изобретению и лекарственным средством, цитокином, токсином фрагмента цитокина, апоптотическим пептидом, радионуклидом, изменяющим биологическую реакцию, вирусной частицей, геном или подобным соединением. В одном варианте выполнения лекарственное средство является противораковым агентом, таким как доксорубицин, мелфалан, цисплатин, гемцитабин или таксол. Согласно еще одному аспекту изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически эффективное количество пептида или продукта конъюгации по настоящему изобретению, предпочтительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или-4 013967 наполнитель. Предпочтительно, чтобы композиция, по существу, не содержала пептид или конъюгат, имеющие мотив NGR. В частности, когда композиция содержит дезамидированный пептид, она предпочтительно,по существу, не содержит предшествующий пептид, т.е., по существу, исходный материал. Предпочтительно, чтобы пептид или конъюгат композиции содержали менее 40, 30, 20, 15, 10, 5, 3 или 1% исходного материала. Предпочтительны композиции по настоящему изобретению, содержащие пептиды и конъюгаты,содержащие мотивы DGR, и в основном свободные от соответствующих пептидов и конъюгатов, которые содержат соответствующий мотив NGR. Предпочтительно, чтобы содержание пептида, содержащегоDGR, относительно всего пептида (т е. пептида, содержащего DGR и NGR) было более 60%, еще предпочтительней более 70%, более предпочтительно более 80%, еще предпочтительней более 85%, еще предпочтительней более 90%, еще предпочтительней более 95%, еще предпочтительней более 97%, еще предпочтительней более 99% по весу. Композиция по настоящему изобретению может быть в форме раствора для инъекции, или суспензии, или жидкости для вливания. Композиция по настоящему изобретению может быть в форме липосом. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или диагностики пациента, страдающего от нарушений, связанных с v3, такие как остеопороз, артрит, диабетическая ретинопатия, пятнистая дегенерация, рестеноз или гемангиома, но не ограниченных ими, включающий введение пептида, продукта конъюгации или фармацевтической композиции согласно изобретению. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или диагностики пациента, страдающего от остеопороза, артрита, диабетической ретинопатии, пятнистой дегенерации,рестеноза или гемангиомы, включающий введение пептида, продукта конъюгации или фармацевтической композиции согласно изобретению. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или диагностики пациента, страдающего от рака, такого как рак легких, поджелудочной железы, молочной железы, толстой кишки, гортани или яичников, но не ограниченных ими, включающий введение пептида, продукта конъюгации или фармацевтической композиции согласно изобретению. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен продукт конъюгации между пептидом по настоящему изобретению и цитокином. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен продукт конъюгации между цитокином и нацеливающим модулем, содержащим продукт дезамидирования мотива NGR. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен продукт конъюгации между цитокином и нацеливающим модулем, содержащим мотив NGR, включая (но не ограничиваясь только ими)CDGRCG или циклическую CDGRCG. Предпочтительно мотив DGR представляет собой мотив isoDGR,более предпочтительно LisoDGR. В одном варианте выполнения мотив DGR представляет собой DDGR. Неограниченный перечень цитокинов, используемых в продукте конъюгации по настоящему изобретению, представляет собой TNF, TNF, IFN, IFN, IFN, IL-1, 2, 4, 6, 7, 12, 15, EMAP II, фактор сосудистого эндотелиального роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокин. Предпочтительно, чтобы цитокин продукта конъюгации был выбран из TNF, IFN, IL-12, IP-10, IL-7 или ЕМАР II. Более предпочтительно, чтобы цитокин был выбран из TNF, IFN или IL-12. Предпочтительно, чтобы TNF был TNF или TNF. В одном варианте выполнения цитокин дериватизирован с полиэтиленгликольным или ацильным фрагментом. В другом варианте выполнения цитокин дополнительно конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и биотина, где упомянутое антитело или его фрагмент направляется в соединение, выбранное из группы, состоящей из антигена опухоли, ангиогенного маркера опухоли или компонента внеклеточной матрицы. В другом варианте выполнения цитокин представляет собой TNF и конъюгирован с нацеливающим модулем и с соединением, выбранным из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и биотина. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция,состоящая из эффективного количества продукта конъюгации TNF по настоящему изобретению и эффективного количества IFN или полинуклеотида, кодирующего его. Предпочтительно, чтобы пептид или продукт конъюгации по настоящему изобретению были другими, чем образуемые in vivo с помощью метаболизма пептид или продукт конъюгации, содержащие мотив NGR.-5 013967 В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен пептид или продукт конъюгации по настоящему изобретению, получаемые тепловой обработкой. Композиция по настоящему изобретению может также включать другой противоопухолевый агент,такой как доксорубицин, или мелфалан, или цисплатин, или гемцитабин, или таксол, или диагностическое соединение, для визуализации опухоли, но не ограничивается ими. Подробное описание Различные преимущества и варианты выполнения настоящего изобретения будут теперь описаны с помощью примеров, которыми не ограничивается изобретение. В осуществлении настоящего изобретения будут использоваться обычные методики химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммуннологии, которыми владеет средний специалист в данной области, пока не будет указано новое. Такие методики объясняются в литературе. См., например, J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John WileySons, New York, N.Y.); B.DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Каждая из этих работ общего характера приводится здесь в виде ссылки. Мотив DGR. Хорошо известно, что аспаргиновая кислота может существовать в различных структурных изомерных формах, а именно как изоаспаргиновая кислота (см. фиг. 14). Аспаргиновая кислота и изоаспаргиновая кислота имеют хиральные молекулы, и различные изомеры могут быть упомянуты как L-Asp (LD), LisoAsp (LisoD), DAsp (DD) и DisoAsp (DisoD), где LisoD и DisoD представляют энтантиомеры изоаспаргиновой кислоты, a LD и DD представляют энтантиомеры аспаргиновой кислоты. Когда в уровне техники ссылаются на DGR, по существу, это ссылка на LDGR. Используемый здесь термин DGR относится к мотиву DGR, который включает DD и/или LisoD или их смесь и который может включать также LD и DisoD. Предпочтительно DGR возникает при дезамидировании соответствующего мотива NGR. В одном варианте выполнения мотив DGR включает по крайней мере 10 вес.% LisoDGR. В другом варианте выполнения мотив DGR включает по крайней мере 10 вес.% DDGR. Если пептид или нацеливающий модуль включают мотив isoDGR, это значит, что пептид или нацеливающий модуль содержат мотив DGR в значительной степени в форме isoDGR. По существу, это значит, что весовое соотношение в % пептида или нацеливающего модуля, содержащего мотив isoDGR ко всему DGR, составляющему пептид или нацеливающий модуль, больше 55%, предпочтительней больше 60%, еще предпочтительней больше 65%, еще предпочтительней больше 70%, еще предпочтительней больше 75%, еще предпочтительней больше 80%, еще предпочтительней больше 85%, еще предпочтительней больше 90%, еще предпочтительней больше 95%, еще предпочтительней больше 97%, еще предпочтительней больше 99%. isoDGR может содержать оба энантиомера L/DisoD, но предпочтительно содержит по крайней мере 5, еще предпочтительней по крайней мере 10, еще предпочтительней по крайней мере 30, еще предпочтительней по крайней мере 40, еще предпочтительней по крайней мере 50 вес.%LisoD. Если пептид или нацеливающий модуль включают мотив LisoDGR, это значит, что пептид или нацеливающий модуль содержат мотив DGR в значительной степени в форме LisoDGR. По существу, это значит, что весовое соотношение в % пептида или нацеливающего модуля, содержащих мотив LisoDGR ко всему DGR, составляющему пептид или нацеливающий модуль, больше 55%, предпочтительней больше 60%, еще предпочтительней больше 65%, еще предпочтительней больше 70%, еще предпочтительней больше 75%, еще предпочтительней больше 80%, еще предпочтительней больше 85%, еще предпочтительней больше 90%, еще предпочтительней больше 95%, еще предпочтительней больше 97%, еще предпочтительней больше 99%. Если пептид или нацеливающий модуль включают мотив DDGR, это значит, что пептид или нацеливающий модуль содержат мотив DGR в значительной степени в форме DDGR. По существу, это значит, что весовое соотношение в % пептида или нацеливающего модуля, содержащих мотив DDGR ко всему DGR, составляющему пептид или нацеленную половину, больше 55%, предпочтительней больше 60%, еще предпочтительней больше 65%, еще предпочтительней больше 70%, еще предпочтительней больше 75%, еще предпочтительней больше 80%, еще предпочтительней больше 85%, еще предпочтительней больше 90%, еще предпочтительней больше 95%, еще предпочтительней больше 97%, еще предпочтительней больше 99%. Мотив DGR по настоящему изобретению содержит цепочку, включающую G и R остатки. Когда мотив DGR достигается при дезамидировании соответствующего мотива NGR, предпочтительно, чтобы мотив NGR содержал цепочку, включающую G и R остатки. Соотношение структура-активность линей-6 013967 ных и циклических пептидов, содержащих мотив NGR, и их способность нацеливать на опухоли обсуждается в работе Colombo et al., J. Biol. Chem., 2002, 49, 47891-47897. Эксперименты, проводимые на животных моделях, показали, что как GNGRG, так и CNGRC, могут нацеливать TNF на опухоль. Молекулярно-динамическое моделирование циклического CNGRC показало наличие изогнутой геометрии,включающей остатки Gly3-Arg4, стабилизированной образованием дисульфидного моста. Молекулярнодинамическое моделирование того же самого пептида без дисульфидных связей показала, что самая населенная и термодинамически благоприятная конфигурация отличается наличием -цепочки, включающей остатки Gly3-Arg4. Эти результаты подсказывают, что мотив NGR обладает сильной склонностью к образованию -цепочки в линейных пептидах и может объяснить открытие, что пептид GNGRG может нацелить TNF на опухоли, хотя до более низкой степени, чем CNGRC. Анализ трехмерной структуры фибронектинового домена FN-I5 показал, что мотив GNGRG образует раскрытую петлю, вероятно, доступную для воды и рецепторов (см. фиг. 1 В). Молекулярнодинамическое моделирование NGR-пептида с фланкирующими цистеинами (CNGRC), используемыми в настоящем изобретении как молекулярный заменитель фибронектинового мотива NGR, показала, что ее структура совместима с таковой петли FN (Di Matteo et al., 2002). Дезамидирование. Дезамидирование аспарагиновых остатков вызывает превращение в изоаспартат и аспартат. Процесс показан на фиг. 14. Дезамидирование, упоминаемое здесь, может осуществляться в любых подходящих условия, легко идентифицируемых специалистом в данной области. Дезамидирование по настоящему изобретению проводится in vitro. В одном варианте выполнения дезамидирование производится путем нагревания пептида, содержащего NGR. Необходимая температура может изменяться в зависимости от точного характера пептида и легко определяется специалистом в данной области. Предпочтительно, чтобы температура была достаточна для вызова дезамидирования аспаргинового остатка, но не так высока, чтобы изменить естественные свойства пептида или повредить его. Подходящей температурой может быть, например, 25-50, 30-40 или 35-40 С. Дезамидирование может также выполняться путем инкубации пептида в базовых условиях, обычно при рН 8, например, путем инкубации в растворе бикарбоната аммония. Точная природа базовых условий может изменяться в зависимости от точной природы пептида, но они легко определяются специалистом в данной области. Предпочтительно, чтобы базовые условия были достаточны для вызова дезамидирования аспаргинового остатка, но не такими, чтобы изменить естественные свойства оставшегося пептида или повредить его. Подходящими базовыми условиями могут быть, например, диапазоны рН 7,5-9,0, 8,0-9,0 или 80-8,5. В предпочтительной форме выполнения дезамидирование производится при нагревании базового раствора. Пептид. Термин "пептид", используемый здесь, включает полипептиды и протеины. Термин "полипептиды" включает молекулы полипептида с одной цепочкой, а также мультиполипептидные комплексы, в которых отдельные составляющие полипептиды связаны ковалентными или нековалентными средствами. Термин "полипептид" включает пептиды из двух или более аминокислот, обычно имеющих длину более чем 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот. Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены терапевтически пациентам. Предпочтительно использовать пептиды, которые содержат не только природные аминокислоты, но которые модифицированы, например, для уменьшения иммуногенности, для увеличения времени полужизни в организме пациента, для усиления биоактивности и/или для усиления эффективности и/или специфичности. Множество подходов было использовано для модификации пептидов для терапевтического применения. Одним из подходов является связывание пептидов или протеинов с множеством полимеров, таких как полиэтиленгликоль (PEG) и полипропиленгликоль (PPG) - см., например, патенты США 5091176,5214131 и 5264209. Замена природных аминокислот разнообразными некодированными или модифицированными аминокислотами, такими как D-аминокислоты и N-метил аминокислоты, может также использоваться для модификации пептидов. Другим подходом является использование бифункциональных перекрестных линкеров, таких какN-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат,сукцинимидил 6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат и сульфосаккинимидил 6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (см. патент США 5580853). Может быть желательным использовать производные пептидов согласно изобретению, которые конформационно связаны. Конформационная связанность относится к стабильности и предпочтительной структуре трехмерной формы, принятой пептидом. Конформационная связанность включает местные связи, в том числе и ограниченную структурную мобильность отдельного остатка в пептиде; региональ-7 013967 ные ограничения, включая ограничение структурной мобильности группы остатков, которые могут образовывать некоторую вторичную структурную единицу; и общие ограничения, включая целую структуру пептида. Активная конформация пептида может быть стабилизирована путем ковалентной модификации, такой как циклизация или вставка гамма-лактамного или другого типа мостика. Например, боковые цепочки могут быть циклизированы относительно скелета, чтобы образовать L-гамма-лактамный модуль на каждой стороне взаимодействующего участка. См., например, Hruby et al., "Applications of Synthetic Peptides", in Synthetic Peptides. A User's Guide: 259-345 (W.H. FreemanCo. 1992). Циклизация может быть также достигнута, например, образованием цистеиновых моситиков, связыванием амино- и карбокситерминальных групп соответствующих терминальных аминокислот или связыванием аминогруппы остатка Lys или родственного гомолога с каброксильной группой Asp, Glu или родственным гомологом. Может быть также выполнено связывание альфа-амино группы полипептида с эпсилон-амино группой лизинового остатка, применение йодуксусного ангидрида. См. Wood and Wetzel, 1992, Int'l J. Peptide Protein Res 39: 533-39. Другим подходом, описанным в патенте США 5891418 является включение в структуру пептида металлоионного комплексного скелета. Обычно предпочтительный металлопептидный скелет основан на необходимом количестве специфических координирующих групп, требуемых областью координации данного составляющего иона металла. Вообще, большинство ионов металла, которые могут быть использованы, имеют координационное число от четырех до шести. Природа координационных групп в пептидной цепочке включает атомы азота с аминной, амидной, имидазольной или гуанидинной функциональностью; атомы серы тиола или дисульфидов; и атомы кислорода гидроксильной, фенольной,карбонильной или карбоксильной функциональности. Кроме того, пептидная цепочка индивидуальных аминокислот может быть химически изменена для включения координационной группы, такой как, например, оксим, гидразино, сульфгидрил, фосфат, циано, пиридино, пиперидино или морфолино. Пептидная конструкция может быть или линейной, или циклической, однако линейная конструкция обычно предпочтительней. Одним из примеров небольшого линейного пептида является Gly-Gly-Gly-Gly, который имеет четыре азота (комплексная система N4) в скелете, которая может включать ион металла с координационным числом четыре. Следующая методика улучшения свойств терапевтических пептидов представляет использование непептидных пептидомиметиков. Большое количество полезных методик может быть использовано для объяснения точной структуры пептида. Эти методики включают секвенирование аминокислот, рентгеновскую кристаллографию, масс-спектроскопию, спектроскопию ядерно-магнитного резонанса, компьютерное молекулярное моделирование, пептидную картографию и их сочетание. Структурный анализ пептида в общем обеспечивает большой объем данных, которые включают последовательность аминокислот, а также трехмерное расположение его атомных компонентов. Исходя из этой информации, могут быть разработаны непептидные пептидомиметики, которые обладают требуемыми химическими функциональностями для терапевтической активности, но более стабильны, например меньше подвержены биологической деградации. Пример такого подхода приведен в патенте США 5811512. Методы химического синтеза терапевтических пептидов по изобретению описаны в вышеприведенной ссылке, а также рассматриваются в Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251 и описаны подробно в ссылках, содержащихся в этом обзоре. Варианты пептидов. Дериваты и фрагменты. Термин "вариант" или "дериват" в отношении к последовательностям аминокислот по настоящему изобретению включает все замещения, вариации, модификации, замены, делеции или добавления одной(или более) аминокислот из или в последовательность, обеспечивающие результирующую аминокислотную последовательность, предпочтительно имеющую нацеленную активность, предпочтительно имеющую по крайней мере от 25 до 50% активности полипептидов, представленных в перечнях последовательностей, более предпочтительно сохраняли, по крайней мере, в основном ту же активность. Следовательно, последовательности могут быть модифицированы для использования в настоящем изобретении. Обычно производятся модификации, которые сохраняют активность последовательности. Таким образом, в одном варианте выполнения могут быть сделаны замещения аминокислот, например от 1, 2 или 3 до 10, 20 или 30 замещений, обеспечивающих, чтобы модифицированная последовательность сохраняла по крайней мере от 25 до 50% или в основном ту же самую активность. Однако в альтернативном варианте выполнения модификации последовательностей аминокислот полипептида по изобретению могут быть сделаны намеренно для уменьшения биологической активности полипептида. Например, могут использоваться усеченные полипептиды, которые сохраняют способность связывания с нацеленными молекулами, но может быть недостаток доменов функциональных эффекторов. В общем, предпочтительно менее 20, 10 или 5% аминокислотных остатков варианта или деривата изменяется по сравнению с соответствующим регионом, отображенным в перечнях последовательностей. Замещения аминокислот могут включать использование неестественно полученных аналогов, например, для увеличения полужизни в плазме крови терапевтически назначаемых полипептидов (см. ниже дальнейшее подробное описание производства дериватов пептидов для использования в терапии).-8 013967 Могут быть произведены консервативные замещения, например, соответствующие таблице, приведенной ниже. Аминокислоты в одном и том же блоке во второй колонке и предпочтительно в той же самой строчке в третьей колонке могут замещать друг друга. Полипептиды по изобретению также включают фрагменты вышеупомянутых полипептидов и их вариантов, включая фрагменты последовательностей. Предпочтительные фрагменты включают те, которые включают эпитоп или связующий домен. Подходящими будут фрагменты длиной по крайней мере в 5, 10, 12, 15 или 20 аминокислот. Они могут быть также длиной меньше чем 200, 100 или 50 аминокислот. Полипептидные фрагменты протеина и их аллельных и специфических вариантов могут содержать одно или более (например, 2, 3, 5 или 10) замещений, делеций или вставок, включая сохраненные замещения. Когда замещения, делеции и/или вставки сделаны, например, с помощью рекомбинантной технологии, изменяются предпочтительно менее 20, 10 или 5% аминокислотных остатков, отображенных в перечнях последовательностей. Полипептиды и продукты конъюгации по изобретению обычно создаются рекомбинантными методами, например, как описано ниже. Однако они могут создаваться также методами синтеза с использованием методики, хорошо известной специалистам в данной области, такой как твердофазный синтез. Различные способы химического синтеза пептидов рассматриваются в Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251 и подробно описываются в ссылках, содержащихся в этом обзоре. Полинуклеотиды. Полинуклеотиды для использования в изобретении включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды и продукты конъюгации по изобретению. В частности, полинуклеотиды могут кодировать предшествующие пептиды или продукты конъюгации, содержащие мотив NGR, который при дезамидировании представляет пептиды и продукты конъюгации, содержащие соответствующий мотив DGR. Квалифицированному специалисту будет понятно, что различные многочисленные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид в результате дегенерации генетического кода. Кроме того, понятно, что квалифицированный специалист может, используя традиционные методики, производить замещение нуклеотидов, которые не влияют на последовательность полипептида, кодированную полинуклеотидом согласно изобретению, чтобы отражать использование кодона любым отдельным организмом-хозяином, в котором должны быть экспрессированы полипептиды согласно изобретению. Полинуклеотиды согласно изобретению могут содержать ДНК и РНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Они могут быть также полинуклеотидами, которые включают синтетические или модифицированные нуклеотиды. Из уровня техники известно несколько разных типов модификации в олигонуклеотиды. Они включают скелеты из метилфосфоната и фосфоротиолата, дополнительно к акридиновым или полилизиновым цепочкам на 3' и/или 5' концах молекулы. Для целей настоящего изобретения следует понимать, что полинуклеотиды, описанные в нем, могут быть модифицированы любым способом, применяемым в области изобретения. Такие модификации могут производиться для того, чтобы усилить активность in vivo или продолжительность жизни полинуклеотидов. Полинуклеотиды по изобретению могут быть встроены в рекомбинантный воспроизводимый вектор. Вектор может использоваться для воспроизведения нуклеиновой кислоты в совместимой клеткехозяине. Таким образом, в следующем варианте выполнения изобретение предусмотрен способ получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида согласно изобретению в копируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к копированию вектора. Вектор может быть обратно извлечен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, такие как E.coli, дрожжи, линии клеток млекопитающих и линии других эвкариотических клеток, например клеток насекомых Sf9. Предпочтительно, чтобы полинуклеотид согласно изобретению в векторе был операбельно связан с управляющей последовательностью, которая способна обеспечить экспрессию кодирующей последовательности при помощи клетки-хозяина, т.е. чтобы вектор был экспрессивным вектором. Термин "операбельно связан" означает, что описанные компоненты находятся в соотношении, позволяющем им функционировать в присущей им манере. Регулирующая последовательность, "операбельно связанная" с кодирующей последовательностью, связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательно-9 013967 сти достигается при условии ее совместимости с управляющими последовательностями. Управляющие последовательности могут быть модифицированы, например, путем добавления дополнительных транскрипционных регуляторных элементов, чтобы сделать уровень транскрипции,управляемый управляющими последовательностями, более чувствительным к транскрипционным модуляторам. Векторы согласно изобретению могут быть трансформированы или трансфектированы в соответствующую клетку-хозяина, как описано ниже, для обеспечения экспрессии протеина согласно изобретению. Этот процесс может включать выращивание клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описано выше, в условиях, обеспечивающих экспрессию при помощи вектора кодирующей последовательности, кодирующей протеин, и при необходимости, обратное извлечение экспрессированного протеина. Векторы могут быть, например, плазмидными или вирусными векторами, снабженными источником репликации, при необходимости, промотором для экспрессии упомянутого полинуклеотида и, при необходимости, регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более селектируемых генов-маркеров, например, генов, устойчивых к ампициллину в случае бактериальной плазмиды, или генов, устойчивых к неомицину, для вектора млекопитающих. Векторы могут использоваться, например,для трансфектации или трансформации клетки-хозяина. Управляющие последовательности, операбельно связанные с последовательностям, кодирующими протеин по изобретению, включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Эти управляющие последовательности могут быть выбраны совместимыми с клеткой-хозяином, для которой предназначен вектор экспрессии, чтобы использоваться в ней. Понятие "промотор" хорошо известно в данной области и включает участки нуклеиновой кислоты по размеру и сложности от минимальных промоторов до промоторов, включающих элементы и энхансеры выше от участка цепи. Промотор обычно выбирается из промоторов, которые являются функциональными в клетках млекопитающих, хотя могут использоваться прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в других эукариотических клетках. Промотор обычно происходит из последовательностей промоторов вирусных эукариотических генов. Например, это может быть промотор, происходящий из генома клетки,в которой должна иметь место экспрессия. Что касается эукариотических промоторов, то они могут быть промоторами, которые функционируют в убиквитарной манере (такими как промоторы а-актина, bактина, тубулина) или альтернативно в тканеспецифической манере (такими как промоторы генов для пируваткиназы). Тканево-специфические промоторы, специфичные для некоторых клеток, также могут использоваться. Они могут также быть промоторами, которые соответствуют специфическим стимулам,например промоторами, которые связывают стероидные рецепторы гормонов. Могут использоваться также вирусные промоторы, например промотор повтора длинного конца вируса мышиной лейкемии Молонея (MMLV LTR), промотор повтора длинного конца вируса саркомы Рауса (RSV LYR) или промотор человеческого цитомегаловируса (CMV IE). Преимуществом промоторов может быть также то, что они могут быть индуцированы так, чтобы уровни экспрессии гетерологического гена могли регулироваться во время жизненного цикла клетки. Стимуляция означает, что уровни экспрессии, достигнутые при использовании промотора, могут регулироваться. Кроме того, любые из этих промоторов могут быть модифицированы путем добавления других регуляторных последовательностей, например энхансерных последовательностей. Могут также использоваться химерные (гибридные) промоторы, включающие элементы последовательностей из двух или более различных промоторов, описанных выше. Векторы и полинуклеотиды по изобретению могут вводиться в клетки-хозяева с целью репликации векторов/полинуклеотидов и/или экспрессии протеинов по изобретению, кодированных полинуклеотидами по изобретению. Хотя протеины по изобретению могут производиться с использованием прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, предпочтительно использовать эукариотические клетки, например дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих, особенно клетки млекопитающих. Векторы/полинуклеотиды по изобретению могут вводиться в подходящие клетки-хозяева с использованием множества методов, известных в данной области, таких как трансфекция, трансформация и электропорация. Там, где векторы/полинуклеотиды по изобретению должны вводиться животным, некоторые методы, известные в данной области, например инфекция с помощью рекомбинантных вирусных векторов, таких как ретровирусы, сложные вирусы герпеса и аденовирусы, управляют введением нуклеиновых кислот и биолистической трансформацией. Клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут использоваться для экспрессии продуктов конъюгации по изобретению. Клеткихозяева могут выращиваться в подходящих условиях, позволяющих экспрессию полипептидов и продуктов конъюгации по изобретению. Экспрессия продуктов по изобретению может быть настолько конститутивной, что они непрерывно производятся, или стимулируемой, требующей стимула для инициации экспрессии. В случае стимулируемой экспрессии производство протеина может быть начато, когда требуется, например, при введении стимулирующего вещества в среду выращивания, например дексаметазон или IPTG.- 10013967 Конъюгаты. Настоящее изобретение относится к конъюгату, который представляет собой молекулу, содержащую пептид или нацеливающий модуль согласно изобретению, связанную по меньшей мере с одним другим агентом, включающим лекарственное средство, цитокин, токсин, апоптотический пептид, радионуклид, вирусную частицу, ген или визуализирующее соединение, образованную генетическим слиянием или химическим связыванием, но не ограниченную только этим. Неограниченный перечень цитокинов,используемых в конъюгатах по настоящему изобретению, составляют TNF, TNF, IFN, IFN, IFN,IL-1, 2, 4, 6, 7, 12, 15, EMAP II, фактор васкулярного эндотелиального роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокин. Конъюгаты включают слитые протеины, в которых пептид или нацеленный модуль связаны с агентом через свой полипептидный скелет посредством генетической экспрессии молекулы ДНК, кодирующей эти протеины, непосредственно синтезируемые протеины и связанные протеины, в которых ранее образованные последовательности соединяются с перекрестно связывающим агентом. Этот термин также используется здесь, чтобы включать соединения, такие как агрегаты. Пептид или нацеливающий модуль могут присоединяться к агенту непосредственно или через разделитель, которым может быть отдельная аминокислота (например, G (глицин, последовательность аминокислот или органический остаток, такой как 6-аминокаприл-N-гидроксисаккинимид. В одном варианте выполнения пептид или нацеливающий модуль присоединяется к N-концу или Сконцу цитокина, таким образом сводя к минимуму любое вмешательство в связывание модифицированного цитокина с его рецептором. Альтернативно пептид или нацеливающий модуль могут присоединяться к аминокислотным остаткам, которые являются амидо- или карбоксилсвязывающими акцепторами,которые могут естественно присутствовать в молекуле или быть вставлены с использованием генноинженерной технологии. В одном варианте выполнения пептидный лиганд предпочтительно присоединен к N-концу или Сконцу цитокина, таким образом сводя к минимуму любое вмешательство в связывание модифицированного цитокина с его рецептором. Альтернативно пептид или нацеливающий модуль могут присоединяться к аминокислотным остаткам, которые являются амидо- или карбоксилсвязывающими акцепторами,которые могут естественно присутствовать в молекуле или быть вставлены с использованием генноинженерной технологии. Модифицированный цитокин предпочтительно приготавливается с использованием кДНК, содержащей 5'-смежную последовательность, кодирующую пептид. Согласно предпочтительному варианту изобретения предусмотрен продукт конъюгации между TNF и CDGRC, CisoDGRC, CLisoDGRC или CDDGRC пептидами. Предпочтительно, чтобы амино-конец TNF был присоединен к пептиду, предпочтительно через разделитель. Предпочтительный разделитель - G(глицин). Согласно другому предпочтительному варианту изобретения предусмотрен продукт конъюгации между IFN и CDGRC, CisoDGRC, CLisoDGRC или CDDGRC пептидами. Предпочтительно, чтобы амино-конец TNF был присоединен к пептиду, предпочтительно через разделитель. Предпочтительный разделитель - G (глицин). Согласно другому предпочтительному варианту изобретения предусмотрен продукт конъюгации между IL-12 и CDGRC, CisoDGRC, CLisoDGRC или CDDGRC пептидами. Предпочтительно, чтобы амино-конец TNF был присоединен к пептиду, предпочтительно через разделитель. Предпочтительный разделитель - G (глицин). Терапевтический индекс продуктов конъюгации TNF/DGR может быть далее улучшен путем использования мутантной формы TNF, способной селективно присоединяться к одному из двух рецепторовTNF, p75TNFR и p55TNFR. Упомянутый мутант TNF может быть получен местно направленным мутагенезом (Loetscher et al., 1993, Van Ostade et al., 1993). Фармакокинетику модифицированных цитокинов согласно изобретению можно улучшить приготовлением дериватов полиэтиленгликоля, которые позволяют увеличивать период полужизни в плазме самих цитокинов. Бифункциональные дериваты. Следующий вариант выполнения изобретения предусматривает бифункциональные дериваты, в которых пептиды или продукты конъюгации конъюгируются с антителами или их фрагментами против опухолевых антигенов или других опухолевых ангиогенных маркеров, например v интегринов, металлопротеаз или фактора васкулярного роста, или антител или их фрагментов, направленных против компонентов внеклеточной матрицы, таких как антитенаскиновые антитела или EDB домен. Приготовление продукта слияния между TNF и окружающей областью mAb в отношении связанного с опухолью антигена TAG72, экспрессированного желудочной или яичниковой аденокарциномой, недавно было изложено (Yang et al., 1995). Следующий вариант выполнения изобретения предусматривает предварительное нацеливанием на опухоль системой биотин/авидин. Согласно этому подходу на сайте опухолевого антигена находится тройной комплекс, который на разных стадиях образуется 1) биотинилированным mAb, 2) авидином (или- 11013967 стрептавидином) и 3) пептидом или продуктом конъюгации по изобретению и биотином. Многие работы доказывают, что подход с предварительным нацеливанием по сравнению с обычным нацеливанием иммуноконъюгатов может действительно увеличить отношение числа активных молекул, находящихся на цели к числу свободных активных молекул, понижая таким образом токсичность лекарства (Colombo etal., 1993; Modorati et al., 1994; Paganelli et al., 1995, 1991). Этот подход дал благоприятные результаты с биотинилированным TNF, который был способен индуцировать цитотоксичность in vitro и уменьшать рост опухолевых клеток в условиях, в которых нормальный TNF был неактивным (Moro et al., 1997; Gasparri et al., 1999). Подход с предварительным нацеливанием может также осуществляться в две фазы с использованием бисферического антитела, которое в то же время связывает опухолевый антиген и модифицированный цитокин. Использование бисферического антитела, направленное против карциноэмбрионного антигена и TNF, было недавно описано как средство для предварительного TNF опухолевого нацеливания (Robert et al., 1996). В соответствии со следующим вариантом выполнения изобретение содержит молекулу TNF, конъюгированную как с пептидом по изобретению (например, пептидом, содержащим DGR), так и с антителом или его фрагментом (непосредственно или косвенно, через биотино-авидиновый мостик), на разных субъединицах TNF, где антитело или его фрагмент антигена, экспрессированного на опухолевые клетки или другие компоненты, направлены против опухолевой стромы (связующей ткани), например тенаскинового или фибронектинового EDB домена. Это приводит к дальнейшему улучшению свойств модифицированного цитокина уменьшать опухоль и к медленному выпуску его в микроокружение опухоли путем переходов тример-мономер-тример. Как показано в предыдущей работе, фактически модифицированные субъединицы конъюгируемых с TNF веществ могут отделяться от нацеливающих комплексов и снова соединяться так, чтобы образовывать немодифицированные трехмерные молекулы TNF, которые затем диффундируют в микроокружение опухоли. Как было показано, выпуск биоактивного TNF происходил в течение 24-48 ч после нацеливания (Corti et al., 1998). Внеклеточная матрица. Термин "компонент внеклеточной матрицы" (ЕСМ), используемый здесь, обозначает молекулу, которая занимает внеклеточное пространство ткани. В одном варианте выполнения компонент ЕСМ выбирается из фибронектина, витронектина, коллагена или ламинита. Предпочтительными компонентами ЕСМ являются модули FN-I5, FN-I7, FN-II1 илиFN-III9 фибронектина или его фрагменты. Предпочтительно, чтобы фрагменты содержали мотив NGR или после дезамидирования мотив DGR. Предпочтительными компонентами ЕСМ согласно настоящему изобретению являются те, которые проявляют модифицированные свойства, такие как повышенная адгезия к эндотелиальным клеткам и/или повышенное связывание интегрина (например, v3) после деамидирования аспарагиновых остатков. Особенно предпочтительны компоненты ЕСМ те, которые содержат мотив NGR, который подвергается дезамидированию до DGR, предпочтительно LisoDGR или DDGR. Цитокины. Проникновение лекарства в опухолевые клетки критично для эффективности химиотерапии солидной опухоли. Для достижения клеток в солидной опухоли химиотерапевтические лекарства должны войти в кровеносные сосуды, пересечь стенку сосуда и, наконец, пройти через промежуточное пространство. Перфузия гетерогенной опухоли, проницаемость сосудов и плотность клетки и повышенное давление промежуточного пространства могут представлять критические барьеры, которые могут ограничивать проникновение лекарств в опухолевые клетки, а следовательно, и эффективность химиотерапии. Поэтому в настоящем изобретении используются цитокины, которые обладают эффектом воздействия на эти факторы. Неисчерпывающий перечень цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, составляют: TNF, TNF, IFN, IFN, IFN, IL-1, 2, 4, 6, 7, 12, 15, IP-10, EMAP II, васкулярный фактор эндотелиального роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокин.TNF действует как воспалительный цитокин и обладает эффектом индуцирования изменения функции эндотелиального барьера, уменьшая давление в промежуточном пространстве опухоли и повышая проникновение химиотерапевтического лекарства и повреждение сосуда опухоли. Первое предположение, что существует молекула некротизирующая опухоли, было сделано, когда было замечено, что у раковых больных случайно проявилась спонтанная регрессия опухолей после бактериальных инфекций. Последующие исследования в 1960-х гг. показали, что медиаторы, связанные с хозяином (или эндогенные медиаторы), произведенные в ответ на бактериальные продукты, были, вероятно, ответственны за наблюдаемые эффекты. В 1975 г. было показано, что бактериально возбуждаемый фактор циркуляции обладал сильной противоопухолевой активностью против опухолей, имплантируемых в кожу мышей. Этот фактор, обозначенный как фактор некроза опухоли (TNF), был впоследствии изолирован, клонирован и было обнаружено, что он является прототипом семейства молекул, которые участвуют в иммунорегуляции и воспалении. Рецепторы для TNF и других членов огромного семействаTNF также составляли огромную семью соответствующих протеинов.- 12013967 Лиганды, относящиеся к TNF, обычно участвуют в нескольких общих характеристиках. Эти характеристики не включают высокой степени полной гомологии последовательности аминокислот (аа). За исключением фактора роста нервов (NGF) и TNF, все лиганды синтезируются как трансмембранные протеины типа II (внеклеточный С-конец), которые содержат короткий цитоплазмический сегмент(10-80 аминокислотных остатков) и относительно длинную внеклеточную область (140-215 аминокислотных остатков). NGF, который структурно не относится к TNF, включен в это огромное семейство только благодаря его способности связываться с рецептором NGF низкого сродства с TNFRSF (LNGFR).NGF имеет пептид классической сигнальной последовательности и является выделенным. TNF, напротив, хотя тоже полностью выделен, имеет первичную структуру, значительно больше относящуюся к трансмембранным протеинам типа II. TNF может рассматриваться как протеин II с нефункциональным или неэффективным трансмембранным сегментом. В общем, члены TNFSF образуют трехмерные структуры, а их мономеры состоят из -цепочек, которые ориентированы в структурах с двумя листами. В качестве последовательности трехмерной структуры этих молекул предлагается, чтобы лиганды и рецепторы огромных семейств TNSF и TNFRSF "образовывали кластеры" во время трансдукции сигнала.TNF. Человеческий TNF является остатком 233 аминокислот, негликосилатированным полипептидом, который существует или как трансмембранный, или как растворимый протеин. Экспрессируемый как 26-кДа связанный с мембраной протеин, TNF состоит из цитоплазматического домена с 29 аминокислотным остатком, трансмембранного сегмента с 28 аминокислотным остатком и внеклеточной областью с 176 аминокислотным остатком. Растворимый протеин создается в случае протеолитического расщепления через 85-кДа энзим, преобразующий TNF (TACE), который генерирует 17-кДа молекулу с 157 аминокислотным остатком, которая нормально циркулирует, как гомотример.TNF/LT. TNF, иначе известный как лимфотоксин- (LT-), представляет собой молекулу, клонированную одновременно с молекулой TNF. Хотя TNF циркулирует, как 171 аминокислотный остаток, 25-кДа гликосилатированный полипептид, было обнаружено, что он имеет большую форму, длиной из 194 аминокислотных остатков. Человеческая TNF кДНК кодирует для открытого считывания рамку из 205 аминокислотных остатков (202 у мыши), и, по-видимому, какой-то тип протеолитической обработки имеет место во время выделения. Как и при TNF, циркулирующий TNF существует как нековалентно связанный тример и, как известно, связан с теми же самыми рецепторами, что и TNF. В одном варианте выполнения TNF является мутантной формой TNF, способной селективно присоединяться к одному из рецепторов TNF (Loetscher H. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26350-7; Van OstadeX. et al. (1993) Nature 361:266-9). Максимально допустимая доза болюса TNF для человека составляет 218-410 мкг/м 2 (Fraker et al.,1995), около 10 раз ниже, чем эффективная доза для животных. На основе данных из моделей на мышах можно полагать, что доза по крайней мере в 10 раз выше необходима для получения противоопухолевых эффектов у человека (Schraffordt Koops et al., 1998). В первом клиническом исследовании по изолированной гипертермической перфузии конечности были достигнуты высокие значения реакции с единственной дозой 4 мг TNF в сочетании с мелфаланом и интерфероном(Lienard et al., 1992). Другие работы показали, что интерферонможет быть опущен и что даже более низких доз TNF может быть достаточно для вызова терапевтической реакции (Hill et al., 1993; Eggermont et al., 1996). Так как два цитокина оказывают синергическое действие на эндотелиальные клетки, их объединенное селективное нацеливание на них вызовет, вероятно, более сильную противоопухолевую активность, позволяя, следовательно,разрешить проблемы системной интоксикации, обычно возникающей в раковой терапии с теми же самыми цитокинами, используемыми в сочетании. Более того, известно, что TNF может снизить барьерную функцию эндотелиальных стенок сосудов, повышая, следовательно, их проницаемость к макромолекулам. Принимая во внимание преимущества более низкой токсичности лекарства с молекулами модифицированного TNF, в соответствии с изобретением, и их свойства хоминга сосудов опухоли, альтернативным применением является их использование для повышения проницаемости сосудов опухолевых для других соединений или для терапевтических или диагностических целей. Например, модифицированный TNF может использоваться для повышения выхода радиомеченных антител опухоли или гормонов (соединений, предполагающих опухоль) в радиоиммуносцинтинграфии или радиоиммунотерапии опухолей. Альтернативно выход хемотерапевтических лекарств, иммунотоксинов, лекарств или генов,несущих липосомы, или других противораковых лекарств может быть также увеличен, так что их противоопухолевый эффект повысится. Многие другие воспалительные цитокины также обладают свойством повышенной проницаемости эндотелиальных сосудов и следует принять во внимание, что изобретение можно применить к таким цитокинам, вместе с агентами, которые увеличивают экспрессию таких цитокинов. Воспалительные цитокины, также известные как провоспалительные цитокины, представляют множество полипептидов и гликопротеинов с молекулярными весами между 5 и 70 кДа. Они обладают стимулирующим воздействием на воспалительную реакцию. Самыми важными воспалительными цитокинами являются TNF, IL-1, IL-6 и IL-8. Таблица некоторых цитокинов, классифицируемых как воспалительные цитокины, приведена ниже.CNTF: мерцательный пейротрофический фактор, PF-4: тромбоцитарный фактор 4; РВР: плейтлитный базовый протеин, NAP-2: протеин 2, активирующий нейтрофил; P-TG: 3-тромбоглобулин; Mff: протеин,возбуждающий макрофаги; МСР: моноцитный хемопритягательный протеин. Повышающая регуляция воспалительного ответа также выполняется с помощью IL-11, IFN, IFN и особенно членами суперсемейства хемокинов. TGF- в некоторых ситуациях имеет несколько воспалительных активностей, в том числе хемоаттрактивное влияние на нейтрофилы, Т-лейкоциты и неактивированные моноциты.IFN. Многие данные доказывают, что интерферон- (IFN), плеотрофический цитокин, производимый главным образом Т-лимфоцитами и являющийся естественным убийцей клеток (Farrar, et al., 1993,Boehm et al., 1997), может способствовать противоопухолевым реакциям (Curnis et al., 2005). Например,INF может вызывать антипролиферативное и проапоптическое действие на многие типы опухолевых клеток, может препятствовать ангиогенезу опухоли и активизировать естественного убийцу клеток и макрофаги для убийства различных целей клеток опухоли. IFN также является важным регуляторомCD4+ T вспомогательных клеток, является основным физиологическим фактором, активирующим макрофаги, и может увеличивать экспрессию MHC-I и II на раковых и эндотелиальных клетках. В пределах опухолевой стромы IFN может индуцировать секрецию цитокина и хемокина, включая IP-10 (IFNиндуцируемый протеин 10), ангиостатический протеин и хемоаттрактивный фактор для лимфоцитов и моноцитов. Были получены данные, подтверждающие, что IFN, производимый макрофагами, инфильтрующими опухоль, играет роль в разрушении кровеносных сосудов опухоли. Комбинированное лечение эндотелиальных клеток с помощью IFN и фактора- некроза опухоли (TNF) вызывает синергический цитотоксический эффект, вероятно важный для разрушения сосудистой сети опухоли. IFN может также увеличивать производство TNF с помощью активированных макрофагов, а также экспрессию TNF в различного вида клетках. Как следствие этого влияния на сосудистую сеть опухоли и на клетки иммунной системы, IFN может активировать воспалительную/иммунную реакцию против образовавшихся опухолей и препятствовать росту опухоли.IFN существует как гомодимер из двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Первичная последовательность человеческого IFN дикого типа (huIFNG) была изложена Gray et al., 1982;Taya et al., 1982; Devos et al., 1982; и Rinderknecht et al., 1984 и в Европейских пагентах ЕР 77670,ЕР 89676 и ЕР 110044. Трехмерная структура huIFNG была описана Ealick et al., 1991.IL-12. Интерлейкин 12 (IL-12) также относящийся к фактору, стимулирующему естественное убийство клеток ("NKSF"), или к фактору цитотоксичного лимфоцитного созревания ("CLMF"), представляет собой сильно действующую иммунорегуляторную молекулу, которая играет роль в широком диапазоне болезней. Человеческий IL-12 был охарактеризован как цитокин с уникальной структурой и плейотрофическими эффектами (Kobayashi, et al., 1989; Seder, et al., 1993; Ling, et al., 1995; Podlaski, et al., 1992).IL-12 играет критическую роль и патологически связан с некоторыми болезнями, включающими иммунную и воспалительную реакции. Обзор A IL-12, его биологической активности и его роли в болезнях можно найти в работе Gately et al., 1998. Важной ролью IL-12 in vivo является его способность индуцировать производство IFN обоими естественными убийцами (NK) и Т-клеток. Структурно IL-12 представляет собой гетеродимерный протеин, содержащий 35-кДа субъединиц(р 35) и 40-кДа субъединиц (р 40), причем оба связаны дисульфидным мостиками (обозначенным как"субъединица р 70"). Гетеродимерный протеин производится в первую очередь клетками, представляющими антиген, такими как моноциты, макрофаги и дендритные клетки. Эти типы клеток также выделяют в избытке субъединицу р 40 относительно субъединицы р 70.IL-2. Благодаря центральной роли системы IL-2/IL-2R в посредничестве между иммунной и воспалительной реакциями, очевидно, что мониторинг и манипуляция этой системы имеют важное диагностическое и терапевтическое значение. IL-2 подает надежду как противораковое средство в силу своей способности стимулировать пролиферацию и активности клеток, атакующих опухоль LAK и TIL (лимфоцитов, инфильтрующих опухоль). Однако проблемы токсичности IL-2 все еще остаются и заслуживают исследования. Настоящее изобретение обращается к этим проблемам.IL-15. Интерлейкин 15 (IL-15) - это новый цитокин, который обладает многими биологическими свойствами IL-2, за исключением гомологичности последовательности аминокислот. IL-15 был первоначально идентифицирован в среде, обусловленной линией эпителиальных клеток почек обезьян (CVI/EBNA),основанной на ее митогенной активности на линии Т-клеток мышей CTLL-2. IL-15 был также независимо обнаружен как цитокин, производимый линией клеток лейкемии человеческих зрелых Т-клеток (HuT102), который стимулирует пролиферацию Т-клеток, и был обозначен как IL-T. Благодаря своей активности как стимулятора Т-клеток, NK-клеток, LAK-клеток и TILs, IL-2 в настоящее время проходит клиническое испытание на возможное применение в лечении рака и вирусных инфекций. Благодаря подобной биологической активности, IL-15 должен иметь подобный терапевтический потенциал. Хемокины. Хемокины представляют суперсемейство в основном мелких выделенных протеинов, функция которых заключается в перемещении, пополнении и рециркуляции лейкоцитов. Они также играют критическую роль во многих патофизиологических процессах, таких как аллергические реакции, инфекционные и автоиммунные болезни, ангиогенез, воспаление, опухолевый рост и гематопоиэтическое развитие. Приблизительно 80% этих протеинов в своей зрелой форме имеют от 66 до 78 аминокислот. Остальные являются большими с дополнительными аминокислотами, расположенными выше ядра протеина или как часть расширенного С-концевого сегмента. Все хемокины передают сигналы через семь рецепторов трансмембранного домена, связанных G-протеином. Имеется по крайней мере 17 известных рецепторов хемокинов, и многие из этих рецепторов препятствуют свойствам случайного связывания, когда некоторые различные хемокины могут передавать сигналы через тот же самый рецептор. Хемокины делятся на подсемейства на основе мотивов обратных последовательностей аминокислот. Большинство членов семейств имеют по крайней мере четыре сохраненных цистеиновых остатка,которые образуют две внутримолекулярные дисульфидные связи. Подсемейства определяются положением первых двух цистеиновых остатков: подсемейство , называемое также СХС хемокинами, имеет одну па, разделяющую два первых цистеиновых остатка. Эта группа может быть далее подразделена на основе наличия или отсутствия мотива glu-leu-arg (ELR) па, предшествующего сразу же первому цистеиновому остатку. В настоящее время имеется пять СХС-специфических рецепторов, и они обозначаются от CXCR1 до CXCR5. ELR+ хемокины связываются с CXCR2 и в общем действуют как хемоаттрактивные нейтрофилы и активаторы. ELRхемокины связывают CXCR3-5 и действуют в первую очередь на лимфоциты. Во время написания этого в научной литературе было сообщено о 14 разных человеческих генах, кодирующих СХС хемокины, с некоторым дополнительным разнообразием, вносимым альтернативным сплайсингом; в подсемействе , называемом также СС хемокинами, первые два цистеина смежны друг с другом без вмешательства па. В настоящее время имеется 24 отдельных члена человеческого подсемействе . Рецепторы для этой группы обозначаются от CCR1 до CCR11. Нацеленные клетки для различных членов семейства СС включают большинство типов лейкоцитов. Известны два протеина с хемокинной гомологией, которые находятся вне подсемействи . Лимфотактин является единственным членом гамма-класса (С хемокин), который потерял первый и третий цистеины. Рецептор лимфотактина обозначается как XCR1. Фракталкин, единственный известный член дельта-класса (СХ 3 С хемокин), имеет три промежуточные па между двумя цистеиновыми остатками. Эта молекула единственная среди хемокинов, в которой имеется трансмембранный протеин с хемокинным доменом с N-концом, слитый с длинным муцин-подобным каркасом. Рецептор фракталкина известен какVEGF. Настоящее изобретение применимо также к фактору эндотелиального роста сосудистой сети(VEGF). Ангиогенез представляет процесс развития новых кровеносных сосудов из ранее существующей сосудистой сети. Он играет существенную роль в эмбриональном развитии, нормальном росте тканей,исцелении ран и женском репродуктивном цикле (т.е. овуляции, менструации и развитии плаценты), а также основную роль во многих болезнях. Особый интерес сосредоточен на раке, поскольку опухоль не может расти больше нескольких миллиметров в размере без развития нового кровяного питания. Ангио- 15013967 генез также необходим для распространения и роста метастаз опухолевой клетки. Одним из самых важных факторов роста и выживания для эндотелия является VEGF. VEGF индуцирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток, а это играет важную роль в регуляции васкулогенеза. VEGF является гликопротеином, связанным с гепарином, который выделяется как гомодимер 45 кДа. Большинство типов клеток, но, как правило, не сами эндотелиальные клетки, выделяютVEGF. Поскольку первоначально открытый VEGF, VEGF-А, повышает васкулярную проницаемость, он был известен как фактор васкулярной проницаемости. Кроме того, VEGF вызывает вазорасширение, отчасти через стимуляцию синтеза окиси азота в эндотелиальных клетках VEGF может также стимулировать миграцию клеток и препятствовать апоптозу. Имеется несколько сплайсированных вариантовVEGF-A. Основной вариант содержит 121, 165, 189 и 206 аминокислот (па), каждая из которых содержит дополнение специфического экзона.EMAPII. Полипептид-II, активизирующий эндотелиальный моноцит (ЕМАР-Н), представляет цитокин, который является антиангиогенным фактором в васкулярном развитии опухоли и в значительной степени препятствует росту опухоли. Рекомбинантный человеческий ЕМАР-II является 18,3 кДа протеином, содержащим 166 аминокислотных остатков. Было также обнаружено, что ЕМАР повышает проницаемость эндотелиальных сосудов.PDGF. Было также выдвинуто предположение о том, что антагонисты фактора роста, происходящего от тромбоцита (PDGF), могут увеличить эффект накопления лекарственного средства и терапевтический эффект широкого ряда противоопухолевых агентов в обычных солидных опухолях. PDGF представляет собой 30 кДа цитокин и высвобождается тромбоцитом при ранении и стимулирует соседние клетки для роста и заживления раны.PD-ECGF. Как предполагает его название, фактор роста эндотелиальных клеток, происходящего от тромбоцита (PD-ECGF), был первоначально изолирован от тромбоцита на основе его способности индуцировать митоз в эндотелиальных клетках. Его соответствующий протеин - глиостатин. Антитела. Используемый здесь термин "антитела" относится к протеину, содержащему один или более полипептидов, кодированных в основном генами иммуноглобулина или фрагментами генов иммуноглобулина. Антитела могут существовать как целые иммуноглобулины или как несколько фрагментов, включая и те хорошо отличимые фрагменты, продуцируемые при усвоении различными пептидазами. В то время как фрагменты антител определяются в терминах усвоения целого антитела, специалисту в данной области будет понятно, что фрагменты антител могут быть синтезированы de novo или химическим способом, или с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, термин "антитело", используемый здесь, также включает фрагменты антител, полученных или путем модификации целых антител, или синтезом de novo с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Фрагменты антител,охватываемые при использовании термина "антитела", включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv,dsFv diabody и Fd, но не ограничиваются ими. Изобретение предусматривает также моноклональные или поликлональные антитела против поверхностных протеинов. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает также способ получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам по изобретению. Если желательны поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, кролик,коза, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным полипептидом, несущим эпитоп(ы). Сыворотку из иммунизированного животного собирают и обрабатывают согласно известным методикам. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к эпитопу, содержит антитела других антигенов, поликлональные антитела могут быть очищены иммуноаффинной хроматографией. Методы получения и обработки поликлональных противосывороток известны в данной области. Для того чтобы такие антитела могли быть произведены, изобретение предусматривает также полипептиды согласно изобретению или их фрагменты, гаптенизированные по отношению к другому полипептиду, для использования в качестве иммуногенов у животных или людей. Моноклональные антитела, направленные против связывания поверхностных эпитопов клеток в полипептидах, могут быть также легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Бессмертные линии клеток, производящие антитела, могут быть созданы слиянием клеток, а также другими способами, такими как прямая трансформация лимфоцитов В с помощью онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эйнштейна-Барра. Наборы с моноклональными антителами, полученными против эпитопов, могут быть подвергнуты скринингу в отношении различных свойств, т.е. сродства с изотопами и эпитопами. Альтернативный способ включает дисплейные библиотеки фагов, подвергнутых скринингу, где,например, фаг экспрессирует фрагменты scFv на поверхность их оболочек с большим разнообразием комплементарности, определяющим регионы (CDRs). Эти методы хорошо известны в данной области. Для целей настоящего изобретения термин "антитела", если не указано другое, включает фрагмен- 16013967 ты целых антител, которые сохраняют свою связывающую активность для нацеленного антигена. Как упоминалось выше, такие фрагменты включают фрагменты Fv, F(ab') и F(ab')2, а также антитела с одной цепочкой (scFv). Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными антителами, как описано, например, в Европейской заявке ЕР-А-239400. Агент. Используемый здесь термин "агент" включает соединение, такое как испытуемое соединение, которое может быть получено или произведено из любого подходящего источника, природного или нет, но не ограничивается этим. Агент может быть определен или получен из библиотеки соединений, которые могут содержать пептиды, а также другие соединения, такие как мелкие органические молекулы и особенно новые ведущие соединения. Например, агент может быть природным веществом, биологической макромолекулой или экстрактом, полученным из биологических материалов, таких как бактерии, грибки или клетки либо ткани животных (особенно млекопитающих), органическая или неорганическая молекула, синтетическое испытуемое соединение, полусинтетическое испытуемое соединение, структурный или функциональный миметик, пептид, пептидомиметик, производное испытуемое соединение, пептид,отделенный от целого протеина, или пептиды, синтезированные синтетически (такие как, в примере, или использующие синтезатор пептидов) или с помощью рекомбинантных способов или их комбинации, рекомбинантное испытуемое соединение, природное или неприродное испытуемое соединение, слившийся протеин или его эквивалент и мутанты, дериваты или их комбинации. Агент может быть также последовательностью аминокислот или ее химическим дериватом. Вещество может даже быть органическим соединением или другим химическим веществом. Агент может даже быть последовательностью нуклеотидов, которая может быть смысловой последовательностью или антисмысловой последовательностью. Фармацевтические формы. Настоящее изобретение предусматривает также фармацевтическую композицию для лечения индивидуумов, в которой композиция состоит из терапевтически эффективного количества пептида, полинуклеотида, конъюгата и комбинации лекарственных средств согласно настоящему изобретению. Композиция по настоящему изобретению, содержащая пептид или конъюгат, содержащий мотив isoDGR, в основном свободна от пептидов или конъюгатов, содержащих другие формы DGR. "В основном свободна" означает, что % по весу содержания пептида, содержащего isoDGR, или конъюгата (т.е. пептида или конъюгата, в котором мотив DGR представлен целиком в форме isoDGR), в композиции относительно общего количества DGR, составляющего пептид или конъюгат (т.е. во всех изометрических формах),присутствующего в композиции, больше чем 50%, предпочтительней больше чем 55%, еще предпочтительней больше чем 60%, еще предпочтительней больше чем 65%, еще предпочтительней больше чем 70%, еще предпочтительней больше чем 75%, более предпочтительно больше чем 80%, еще более предпочтительно больше чем 85%, еще предпочтительней больше чем 90%, еще более предпочтительно больше чем 95%, еще предпочтительней больше чем 97%, более предпочтительно более 99%. Композиция по настоящему изобретению, содержащая пептид или конъюгат, содержащий мотивLisoDGR, в основном свободна от пептидов или конъюгатов, содержащих другие формы DGR. "В основном свободна" означает, что % по весу содержания пептида, содержащего LisoDGR, или конъюгат (т.е. пептид или конъюгат, в котором мотив DGR представлен целиком в форме LisoDGR), в композиции относительно общего количества DGR, составляющего пептид или конъюгат (т.е. во всех изометрических формах), присутствующего в композиции, больше чем 50%, предпочтительней больше чем 55%, еще предпочтительней больше чем 60%, еще предпочтительней больше чем 65%, еще предпочтительней больше чем 70%, еще предпочтительней больше чем 75%, более предпочтительно больше чем 80%, еще более предпочтительно больше чем 85%, еще предпочтительней больше чем 90%, еще более предпочтительно больше чем 95%, еще предпочтительней больше чем 97%, более предпочтительно более 99%. Композиция по настоящему изобретению, содержащая пептид или конъюгат, содержащий мотивDDGR, в основном свободна от пептидов или конъюгатов, содержащих другие формы DGR. "В основном свободна" означает, что % по весу содержания пептида, содержащего DDGR, или конъюгата (т.е. пептида или конъюгата, в котором мотив DGR представлен целиком в форме DDGR), в композиции относительно общего количества DGR, составляющего пептид или конъюгат (т.е. во всех изометрических формах),присутствующего в композиции, больше чем 50%, предпочтительней больше чем 55%, еще предпочтительней больше чем 60%, еще предпочтительней больше чем 65%, еще предпочтительней больше чем 70%, еще предпочтительней больше чем 75%, более предпочтительно больше чем 80%, еще более предпочтительно больше чем 85%, еще предпочтительней больше чем 90%, еще более предпочтительно больше чем 95%, еще предпочтительней больше чем 97%, более предпочтительно более 99%. Фармацевтическая композиция может быть использована для человека и животных. Обычно врач определяет фактическую дозировку, которая была бы наиболее подходящей для отдельного пациента и будет изменяться в зависимости от возраста, веса и реакции конкретного индивидуума. Композиция может при необходимости содержать фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель, наполнитель или адъювант. Выбор фармацевтического носителя, разбавителя или наполнителя может осуществляться в соответствии с назначенным путем введения и стандартной фармацевтической- 17013967 практикой. Фармацевтические композиции могут содержать в качестве (или дополняться ими) носителя,разбавителя или наполнителя любые подходящие связующие, вещества, придающие скользкость, суспендирующие агенты, покрывающие агенты, агенты, влияющие на растворимость, и другие агентыносители, которые могут помочь или увеличить ввод вирусов в целевое место (такие как, например, система доставки липидов). Подходящие носители и наполнители включают изотонические солевые растворы, например фосфато-буферную соль. Подробности о наполнителях можно найти в The Handbook ofPharmaceutical Excipients, 2nd Edn, Eds WadeWeller, American Pharmaceutical Association. Там, где это приемлемо, фармацевтические композиции могут вводиться любым одним или более путем: ингаляцией, в форме суппозитория или пессария, топически в форме примочки, раствора, крема,мази или присыпки, использованием пластыря, орально в форме таблеток, содержащих наполнители,такие как крахмал или лактоза, или в капсулах или в яйцеклетках или отдельно, или в смесях с наполнителями, или в форме эликсиров, растворов или суспензий, содержащих отдушки или красящие агенты,или они могут впрыскиваться парентерально, например, внутрь каверн, внутривенно, внутримышечно или подкожно. Для парентерального введения композиции могут быть наилучшим способом использованы в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество соли или моносахаридов, чтобы приготовить изотонический раствор с кровью. Для глотания или подъязычного назначения композиции могут вводиться в форме таблеток или лепешек,которые могут быть сформованы обычным способом. Формы для орального или парентерального введения предпочтительны. Формы для парентерального назначения включают впрыскиваемые растворы или суспензии и жидкости для вливания. Для приготовления парентеральных форм эффективное количество активного ингредиента должно быть растворено или суспендировано в стерильном носителе, с добавлением при необходимости носителей, таких как солюбилизаторы, агенты изотоничности, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы или диспергаторы, и это будет затем распределяться в герметизированные флаконы или ампулы. Композиция может быть составлена таким образом, чтобы введение дневное, недельное или месячное обеспечивало требуемую дневную дозу. Понятно, что композиция может быть удобно составлена для менее частого приема, такого как каждые 2, 4, 6, 8, 10 или 12 ч. Полинуклеотиды/векторы, кодирующие полипептидные компоненты, могут вводиться прямо в виде конструкта нуклеиновой кислоты в чистом виде, предпочтительно также содержащего боковые последовательности, гомологичные с геномом клетки-хозяина. Накопление конструкта нуклеиновой кислоты в чистом виде клетками млекопитающих усиливается с помощью некоторых известных способов трансфекции, например, таких, которые включают использование агентов трансфекции. Примеры таких агентов включают катионные агенты (напрмер, фосфат кальция DEAE-декстран) и липофектанты (например, липофектам и трансфектам). Обычно конструкты нуклеиновой кислоты смешиваются с агентом трансфекции для получения композиции. Предпочтительно, чтобы полинуклеотид или вектор по изобретению сочетался с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем для производства фармацевтической композиции. Подходящие носители и наполнители включают изотонические солевые растворы, например фосфат-буферную соль. Композиция может быть сформована для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного или транскожного введения. Описанные пути введения и режимы дозировки предназначены только для руководства, поскольку квалифицированный практик будет в состоянии легко определить оптимальный путь введения и режимы дозировки для каждого конкретного пациента и состояния. Приготовление пептидов и особенно цитокинов в форме липосом может улучшить их биологическую активность. Фактически наблюдалось, что ацилирование TNF аминогрупп вызывает повышение их гидрофобности без потери биологической активности in vitro. Более того, сообщалось, что связь TNF с липидами не влияет на цитотоксичность in vitro, иммуномодулирующие эффекты и снижение токсичности in vivo (Deb et al., 1989, 1990). Предпочтительно, чтобы композиции по настоящему изобретению, содержащие пептиды и конъюгаты, которые содержат мотивы DGR, соответствующие настоящему изобретению, были в основном свободны от соответствующих пептидов и конъюгатов, которые содержат соответствующий мотив NGR. Предпочтительно, чтобы соотношение пептида, содержащего DGR, относительно общего пептида (т.е.DGR и NGR содержащего пептида) составляла более 60%, более предпочтительно 70%, более предпочтительно 80%, более предпочтительно 85%, более предпочтительно 90%, более предпочтительно 95%,более предпочтительно 97%, более предпочтительно 99% по весу. Лечение. Пептиды, конъюгаты и композиции по изобретению могут использоваться в терапевтическом лечении. Понятно, что все ссылки здесь на лечение включают целительное, паллиативное и профилактическое лечение. Предпочтительно пациент, леченый по настоящему изобретению во многих его вариантах выпол- 18013967 нения, является пациентом человеком, хотя понятно, что принцип изобретения показывает, что изобретение эффективно по отношению ко всем млекопитающим, которые могут быть включены в термин "пациент". В этом контексте понимается, что млекопитающие включают виды млекопитающих, у которых желательно лечение болезней, связанных с ангиогенезом, особенно сельскохозяйственные и домашние виды млекопитающих. В одном варианте выполнения пептиды, конъюгаты или фармацевтические композиции могут использоваться для лечения или предотвращения рака, включая рак легких, поджелудочной железы, молочной железы, толстой кишки, гортани или яичников, но не ограничиваясь этим. Предпочтительно рак включает солидную опухоль. В другом варианте выполнения пептиды и/или конъюгаты могут использоваться для лечения или предотвращения болезней, включающих ангиогенез, таких как болезни, связанные с экспрессией v3. Ангиогенез является процессом васкуляризации тканей, который включает рост вновь образовавшихся кровеносных сосудов в ткани, и также обозначается как неоваскуляризация. Процесс связан с инфильтрацией эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры. Полагают, что процесс происходит одним из трех путей: сосуды могут ответвляться от ранее существующих сосудов, может происходить новое развитие сосудов из клеток-предшественников (васкулогенезис), или существующие мелкие сосуды могут увеличиться в диаметре (Blood et al., 1990). Имеется множество болезней, в которых ангиогенез, как полагают, является важным, относящимся к ангиогенным болезням, включая (но не ограничиваясь ими) воспалительные нарушения, такие как иммунное и неиммунное воспаление, артрит, нарушения, связанные с несоответствующей или неподходящей инвазией сосудов, такой как диабетическая ретинопатия, мышечная дегенерация, неоваскулярная глаукома, рестеноз, капиллярная пролиферация в атеросклеротических бляшках и остеопороз, и рак, связанный с нарушениями, такой как солидные опухоли, метастазы солидных опухолей, ангиофибромы,ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, саркома Капоши и подобные нарушения, которые требуют неоваскуляризации для поддержки роста опухоли. Таким образом, способы, ингибирующие ангиогенез в больных тканях, уменьшают симптомы заболевания и в зависимости от болезни могут способствовать лечению болезни. В другом относящемся к изобретению варианте ткань, подлежащая лечению, является тканью сетчатки пациента с диабетической ретинопатией, мышечной дегенерацией или неоваскулярной глаукомой,и ангиогенез, который должен быть ингибирован, является ангиогенезом ткани сетчатки, где имеется неоваскуляризация ткани сетчатки. В дополнительном относящемся к изобретению варианте ткань, подлежащая лечению, является опухолевой тканью пациента с солидной опухолью, метастазами, раком кожи, раком молочной железы,гемангиомой или ангиофибромой и подобным раком, и ангиогенез, который должен быть ингибирован,является ангиогенезом опухолевой ткани, где имеется неоваскуляризация опухолевой ткани. Типичные ткани солидной опухоли, подвергающиеся лечению представленными способами, включают ткани легких, поджелудочной железы, молочной железы, толстой кишки, гортани, яичников и т.п. ткани. Примерный ангиогенез опухолевых тканей и его ингибирование описаны в примерах. Ингибирование ангиогенеза опухолевой ткани является особенно предпочтительным вариантом выполнения, благодаря важной роли, которую неоваскуляризация играет в росте опухоли. В отсутствии неоваскуляризации опухолевой ткани опухолевая ткань не получает требуемых питательных веществ,замедляет свой рост, прекращает дополнительный рост, регрессирует и в конце концов становится некротической, что приводит к гибели опухоли. Эти способы также особенно эффективны против образования метастазов, потому что (1) их образование требует васкуляризации первичной опухоли, с тем чтобы метастазные раковые клетки могли выходить из первичной опухоли и (2) их установление во вторичном месте требует неоваскуляризации для поддержки роста метастазов. В соответствующем варианте выполнения изобретение предполагает выполнение способа в сочетании с другими методами терапии, такими как обычная химиотерапия, направленная против солидных опухолей и для контроля образования метастазов. Прием ангиогенезного ингибитора обычно проводится во время или после химиотерапии, хотя предпочтительно ингибировать ангиогенез после режима химиотерапии в те моменты, когда опухолевая ткань будет реагировать на токсическую атаку при индуцировании ангиогенеза для восстановления путем обеспечения подачи крови и питательных веществ к опухолевой ткани. Кроме того, предпочтительно назначать способы ингибирования ангиогенеза после операции,когда солидные опухоли удалены, как профилактику против метастазов. Поскольку настоящие способы применимы к ингибированию неоваскуляризации опухоли, эти способы могут также применяться к ингибированию роста опухолевой ткани, к ингибированию образования опухолевых метастазов и к регрессии установившихся опухолей. Рестеноз - это процесс миграции клеток гладкой мускулатуры (SMC) и пролиферации на месте подкожной транслюминальной коронарной ангиопластики, который препятствует успеху ангиопластики. Миграция и пролиферация SMC во время рестеноза можно рассматривать как процесс ангиогенеза, который ингибируется настоящими способами. Поэтому изобретение предусматривает также ингибирования- 19013967 рестеноза путем ингибирования ангиогенеза в соответствии с настоящими способами у пациента, следующего процедурам ангиопластики. Пептиды, конъюгаты и фармацевтические композиции по изобретению могут использоваться в комбинации, отдельно или последовательно, а также с другими диагностическими или терапевтическими веществами. Комбинации TNF/IFN. Следующий аспект настоящего изобретения относится к использованию комбинации модифицированного TNF и IFN. Эта комбинация может использоваться в сочетании, отдельно или последовательно с другими препаратами. Выгодно применять комбинацию также с другими диагностическими или терапевтическими веществами, в лечении или диагностике рака, с такими как доксорубицин и мефалан. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую комбинацию модифицированного TNF и IFN и при необходимости другие вещества для диагностики опухолей или противоопухолевые терапевтические вещества. Эта комбинация, опять же, может использоваться в сочетании, отдельно или последовательно с другими препаратами. В нашем Международном патентеWO 03/093478 мы показали, что нацеленный ввод пикограммовых доз цитокинов усиливает проникновение химиотерапевтических лекарств, обеспечивая новую удивительную стратегию повышения терапевтического индекса химиотерапевтических лекарственных средств. Публикация Международного патентаWO 03/093478 включена здесь в целом ссылкой. Если более подробно, мы показали, что ввод очень низких доз цитокинов в опухоли и связанное с опухолью окружение, включая опухолевую сосудистую систему, представляет новый подход к избежанию негативного механизма обратной связи и к сохранению их способности изменять барьеры проникновения лекарства. В одном варианте этого аспекта настоящего изобретения конъюгат по настоящему изобретению может быть введен в дозах от 0,5 до 500 нг/кг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 50 нг/кг, более предпочтительно в диапазоне от 5 до 15 нг/кг. В альтернативном варианте этого аспекта настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению в комбинации с IFN, в которой конъюгат присутствует в таком количестве, что конъюгат или его метаболит поставляется в плазму крови пациента, подлежащего лечению, в количестве не больше чем 35000 нг/день, предпочтительно около 3500 нг/день, еще предпочтительней около 1000 нг/день. Вышеуказанная дозировка относится к дозировке для пациента весом 70 кг. Специалист в данной области может легко изменить указанную дозировку для пациента, имеющего массу, отличную от 70 кг. Описанные пути введения и режимы дозировки приводятся только для руководства, поскольку квалифицированный практик будет в состоянии легко определить оптимальные пути введения и режимы дозировки для любого конкретного пациента и состояния. Описание чертежей Фиг. 1. Схематическое представление, трехмерная структура и первичная последовательность фибронектиновых фрагментов.(А) Повторы в каждом фрагменте и в фибронектиновой субъединице представляют схематически: повторы I типа (прямоугольники); повторы II типа (овалы); повторы HI типа (квадраты). Модули, содержащие NGR и RGB последовательности, указаны. Естественные фрагменты, полученные путем протеолитического слияния с катепсином (FN-70 KDa) или с катепсин-трипсином (FN-45 и FN-30 KDa), показаны схематически. Также представлены ретронектин, фрагмент рекомбинантного FN-I4-5 и синтетический FN-I5.(B) трехмерная PDB-структура FN-I4-5 (код банка данных протеинов: lFBR.pdb). Показаны боковые цепочки мотива NGR (Asn263, Gly264 и Arg265).(C) Первичная последовательность синтетического FN-Is и пептиды Loop-GNGRG и Loop-RGGNG,а также FN-I7 и пептид Loop-GNGRG (см. "Способы"). Фиг. 2. Свойства, способствующие адгезии клеток, фрагментов природного фибронектина. Микротитровальные пластинки, покрытые природными протеолитическими фрагментами (FN-70KDa, FN-45 KDa и FN-30 KDa), содействуют адгезии эндотелиальных клеток EA.hy926. Фиг. 3. Ускоренное старение фрагментов FN улучшает их проадгезионные свойства. Адгезия клеток EA.hy926 к микротитровальным пластинкам, покрытым различными пептидами и протеинами, до и после ускоренного старения. Ускоренное старение было выполнено инкубацией пептидов в 0,1-М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 в течение 16 ч при 37 С ("тепловая обработка"). Адгезия к рекомбинантному FN-I4-5 или контрольному протеину (FN-I4-5 (SGS (А), синтетическому FN-I5(В), рекомбинантному NGR-TNF, CNGRCG-TNF1-11 и контрольному CARACG-TNF1-11 пептиду (С),DGR-TNF (D). Продукты с тепловой обработкой (37 С) и необработанные продукты (-20 С) были адсорбированы на пластмассовой поверхности микротитровальных лунок (в течение ночи при 4 С). Микрофотография лунок, покрытых 30 мкг/мл обработанного тепловой обработкой FN-I5 или BSA (В, справа) или 10 нг/мл рекомбинантного NGR-TNF или DGR-TNF (С, справа), увеличенная в 200 раз. Испытание адге- 20013967 зии клеток было выполнено, как описано в "Материалах и способах". Фиг. 4. Проадгезионные свойства фрагментов FN подавляются PIMT. Микротитровальные пластинки были покрыты FN-I5 или NGR-TNF (А), обработанными тепловой обработкой, природным FN-30 KDa, FN-45 KDa или ретронектином (RN) (В). Адсорбированные протеины были затем обработаны энзимом PIMT в течение 16 ч при 37 С. После инкубации раствор энзима был удален промывкой. Затем было выполнено испытание адгезии клеток ЕА.hy926, как описано в "Материалах и способах". Фиг. 5. Стабильность мотивов NGR, DGR и isoDGR.RP-HPLC анализ NGR-pep и его синтетических продуктов дезамидирования (DGR-pep и isoDGRpep) до и после инкубации в течение 4 ч при 37 С в 0,1-М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 (А и В) и inDMEM, рН 7,3 (А, вставка) RP-HPLC был выполнен в колонне С-18 (РерМар CIS, PerSeptive Biosystem) следующим образом: буфер А, 0,1% трифторацетатная кислота (TFA) в воде; буфер В, 95% ацетонитрил, 0,1% TFA; 0% В в течение 10 мин, линейный градиент 20-40% В за 30 мин, 100% В в течение 10 мин, 0% В в течение 15 мин (скорость потока 0,5 мл/мм) Пики 1, 2 и 3 были идентифицированы остриями NGR-pep, после 2 ч инкубации с равным количеством указанного пептида, Q. NGR-pep (пик 1), быстро преобразуемого в соединения, соответствующие DGR-pep (пик 2) и isoDGR-pep (пик 3) (полужизнь 24 ч). Фиг. 6. FN-I5 и пептиды, содержащие мотив NGR, связанные с интегрином v3 после ускоренного старения.(A) Связывание CNGRC-TNF, обработанного тепловой обработкой, и TNF с твердыми фазами, покрытыми очищенными человеческими интегринами. Были использованы одна концентрация (5 мкг/мл) или разные концентрации (вставка) CNGRC-TNF и TNF. Связывание обнаруживалось анти-TNF антителами, как описано в "Материалах и способах".(B) Связывание биотинилированного CNGRC-TNF1-11, CARAC-TNF1-11 и FN-I5 (в комплексе со стрептавидином-пероксидазой) с очищенными человеческими интегринами. Связывание обнаруживалось хромогенной реакцией с о-фенилэндиаммином.(C) Конкурирующее связывание биотинилированных FN-I5/стрептавидина-пероксидазных комплексов с пластинками, покрытыми v3, с различными количествами FN-I4-5 или FN-I4-5SGS (верхняя панель) или пептидов, соответствующих петле NGR (остатки 258-271) FN-I5 до и после тепловой обработки(нижняя панель). Фиг. 7 Конкурирующее связывание NGR-TNF с v3 с NGR-pep и его дезамидированными продуктами с v3. Биотинилированный NGR-TNF (4 нг/мл) смешивался с разным количеством указанных пептидов и добавлялся к пластинкам, покрытым v3. Связывание обнаруживалось, как описано в "Материалах и способах". IC50 определялся анализом нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Кинетика дезамидирования FN-I5 определялась на основании графика зависимости ингибиторной концентрации (IC50) от времени инкубации. Полосы представляют доверительные интервалы для каждого определенного IC50. Фиг. 8. Дезамидированный фрагмент FN-I5 подавляет in vitro адгезию клетки с витронектином и рост опухоли в модели.(A) Подавление адгезии клеток EA.hy926 с витронектином с помощью FN-I5, обработанного тепловой обработкой. Витронектин (3 мкг/мл) был адсорбирован на микротитровальной пластинке, и анализ адгезии клеток был выполнен, как описано в "Материалах и способах".(B) Противоопухолевые эффекты повторного назначения FN-Is, прошедших тепловую обработку,на мышей с RMA-опухолью. Животных (5/группа) лечили 200 мкг "обработанного теплом" FN-I5 (i.p.) в указанное время (стрелки), начиная с 4 дней после имплантации опухоли.р=0,0003 на 14-й день, статистический анализ путем t-испытания с двумя концами. Фиг. 9. RP-HPL-анализ NGR-TNF.RP-HPLC-анализ NGR-TNF обнаружил два главных пика, F2 и F4, и два маленьких пика, F1 и F3. Наличие дезамидированных форм в этих пиках было идентифицировано путем измерения количестваisoAsp в этих фракциях. Результаты показали, что в F2 содержалось намного больше isoAsp, чем в F4(табл. 1). Фиг. 10. RP-HPLC и SDS-PAGE пиков F2 и F4. А) Re-хроматография F2 и F4 с помощью анализа RP-HPLC показала, что настрой сохранения не изменился после разделения В) Кумасси-окрашивание несокращающейся SDS-PAGE обнаружило главную полосу 17-18 кДа в обоих продуктах F2 и F4, как ожидалось для мономеров TNF. Фиг. 11. Противоопухолевая активность F2 в RMA модели лимфомы. Были проведены эксперименты (примеры 1 и 2). Мыши C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco,Italy) весом 16-18 г были подвергнуты подкожной инъекции в левый бок 7104 RMA живых клеток, 10 дней спустя мыши были обработаны 0,25 или 100 пг F2 (100 мкл) через 2 ч после приема мелфалана (50 мкг в 100 мкл). Были обнаружены значения размеров опухолиSE (5 животных/группа).- 21013967 Фиг. 12 RP-HPLC анализ NGR-TNF после обработки при 37 С в буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 в течение разного времени.NGR-TNF был разведен в 0,1 М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 и инкубирован при 37 С в течение разного времени. Обработанный теплом NGR-TNF был подвергнут анализу RP-HPLC. Фиг. 13. RP-HPLC (А) и SDS-PAGE (В) рекомбинантных DGR-TNF и NGR-TNF. Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение. Пример 1. Материалы и способы для примеров 1-7. Линии клеток и реагенты. Клетки RMA лимфомы мышей и клетки EA.hy926 (человеческие эндотелиальные клетки, слитые с клетками А 549 человеческой карциномы легких) были выращены, как описывалось ранее (Cumis et al.,2005; Ljunggren and Karre, 1985). Кристалл фиолетовый (Fluka Chemie); альбумин бычьей сыворотки(BSA), конъюгат козьих антикроличьих IgG с пероксидазой хрена, фрагменты FN-70 KDa, FN-45 KDa и(Immunological Sciences); страптавидин-пероксидаза (Societa Prodotti Antibiotici). Приготовление и характеристика рекомбинантных FN-I4-5 и FN-I4-5SGS. КДНК, кодирующая человеческий фибронектин повторы 4-5-й тип I (FN-L40-5; остаток 184-273 фибронектина), была приготовлена с помощью RT-PCR на MSR-3-mel клетках общей РНК (Tanzarella etal., 1999) с использованием следующих праймеров: 5'-CTGGATCCGAGAAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGG (верхний) и 5'-TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCC (нижний). Контрольный фрагмент с NGR, замененным SGS (FN-I4-5SGS), был индуцирован PCR на FN-I4-5 плазмиде с использованием вышеупомянутого верхнего праймера и следующего нижнего праймера: 5'-TATATTAAGCTTTCAGTGCCTCTCACACTTCCACTCTCCACTGCCGCTG. Усиленные фрагменты были клонированы в pRSET-A плазмиду (инвитроген), экспрессированную в клетки BL21(DE3)pLysS E. coli как растворимые протеины (с His-tag на N-конце), и очищены от экстрактов клеток металло-хелатной аффинной хроматографией. Приготовление и характеристика синтетических пептидов. Различные пептиды (биотинилизированные и небиотинилизированные) были приготовлены химическим синтезом с использованием пептидного синтезатора Прикладной биосистемы, модель 433 А. Были использованы аминокислоты L-конфигурации, за исключением особо указанных. Синтетический пептид, соответствующий повтору 5-го типа I человеческого фибронектина (FN-Is), остатки 230-274 зрелого протеина (номер доступа Р 02751, Swiss-Prot), был также синтезирован с дополнительным ацетилглицином с N-концом и с Glu250 вместо Asp250. Чтобы стимулировать образование дисульфида между(удаляемыми трифторацетатной кислотой после снятия защиты боковой цепочки и очистки от смолы), в то время как Cys231 и Cys260 были защищены S-ацетамидометиловыми группами (удаляемыми обработкой иодином). После RP-HPLC очистки пептида был образован дисульфидный мостик Cys258-Cys270 инкубированием 20 мкмоль пептида в 300 мл 8%-го DMSO с рН 7 (при комнатной температуре в течение всей ночи). Затем пептид был очищен RP-HPLC и лиофилизирован. Для образования второго дисульфидного мостика Cys231-Cys260,13,5 мкмоль пептида было растворено в 67 мл 80%-ной по объему уксусной кислоты и смешано с 0,135 мл 1 N соляной кислоты. Затем 21 мг иодина, растворенного в 2 мл метанола, был добавлен к раствору пептида при помешивании. Спустя 90 мин был добавлен 1 ммоль аскорбиновой кислоты, чтобы погасить иодин. Затем пептид был очищен при помощи RP-HPLC. Все пептиды растворялись в стерильной воде и хранились в аликвотах при -20 С. Чистота пептидов анализировалась RP-HPLC. Свободные сульфгидриловые группы в приготовлениях всех пептидов составляли 0,1%, как было проверено титрацией при помощи реагента Эллмана (Pierce, Rockford, Illinois). Идентичность пептидов проверялась MALDI-TOF или ESI-MS масс-спектрометром. Молекулярная масса пептидов, используемая в этой работе, была подобна ожидаемому значению. ESI-MS анализ FN-I5 показал наличие дополнительного компонента +144 Da, соответствующего FN-I5 с неудаленными ацетамидометиловыми группами. Приготовление и характеристика CNGRC-TNF, CDGRC-TNF и CNGRC-TNF1-11 конъюгатов.TNF и CNGRC-TNF мышей (содержащие TNF мышей, слитые с С-концом CNGRCG) были приготовлены технологией рекомбинантных ДНК, как описано Curnis et al., 2000. КДНК, кодированная для CDGRC-TNF (TNF мышей, слитый с С-концом CDGRCG), была приготовлена при помощи PCR на CNGFIC-TNF плазмиде (Curnis et al., 2000) с использованием следующих праймеров: 5'-CACCATGGGCAACGGCCGTGGCGGCGTC (верхний),5'-TCAGGATCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGAC (нижний). Усиленная кДНК была клонирована в плазмиду pET101/D-TOPO (инвитроген), экспрессирована в клетки BL21(DE3) E.coli (новаген) и очищена от экстрактов клеток аффинной хроматографией на растворимом рецепторе p75-TNF-сефарозе, в основном, как описано ранее для CNGRC-TNF (Colombo et al.,2002). И CNGRC-TNF, и CDGRC-TNF были подвергнуты процедуре раскладки, как описано ранее (Cur- 22013967nis et al., 2000). Чистота и идентичность протеина были проверены SDS-PAGE, электрораспылительным массспектроматром и гель-фильтрационной хроматографией. Цитолитическая активность in vitro CNGRCTNF и CDGRC-TNF, измеренная стандартным цитолитическим испытанием с L-M мышиными фибробластами (Corti et al., 1994), равнялась 2,96 (0,56)108 У/мг и 2,59 ( 0,69) 108 У/мг, соответственно.CNGRC-TNF1-11, соответствующий последовательности NGR-TNF с N-концом (при недостатке активности TNF), и CARAC-TNF1-11 пептид были приготовлены химическим синтезом, как описано выше. Ускоренное старение (тепловая обработка) фрагментов фибронектина и пептидов. Фрагменты фибронектина, пептидов и конъюгатов пептида-TNF были разведены в 0,1-М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5, инкубированы в течение 16 ч при 37 С и хранились при -20 С до анализа. На эти продукты здесь дается ссылка как на "обработанные теплом". Определение количества изоаспартата (isoAsp). Содержание isoAsp в необработанном и "обработанном теплом" CNGRC-TNF и пептидах определялось с использованием набора для определения изоаспартата ISOQUANT (Promega). Испытание на адгезию клеток и обработка PIMT. Необработанные и "обработанные теплом" фрагменты фибронектина, пептиды и конъюгаты пептид-TNF были разведены до желательной концентрации 150 мМ поваренной соли, 50 мМ фосфата натрия с рН 7,3 и добавлены к полихлорвиниловым микротитровальным пластинам с 96 лунками (Falcon, BectonDickinson). После инкубации в течение ночи при 4 С пластины были промыты, засеяны клеткамиEA.hy926 в DMEM, содержащем 0,1% BSA (40000 клеток/лунка) и оставлены для инкубации в течение 23 ч при 37 С, 5% СО 2 Прикрепленные к субстрану клетки были зафиксированы и оставлены с кристаллом фиолетовым, как описано (Curnis et al., 2005). Влияние протеина L-isoAsp/D-AspO-метилтрансферазы (PIMT) на проадгезионные свойства различных фрагментов исследовалось следующим образом, микротитровальные пластины покрывались различными продуктами, как описано выше, и промывались 0,9%-ной поваренной солью. Затем каждая лунка была заполнена 45 мкл раствора, содержащего 0,02 мМ S-аденосил-L-метионина в 150 мМ поваренной соли, 50 мМ буфера фосфата натрия с рН 6,8, и 5 мкл раствора PIMT (из набора для определения количества изоаспартата, Promega) (окончательный объем 50 мкл/колодец), и инкубирован при 37 С в течение 16 ч. После инкубации пластины были промыты 0,9%-ной поваренной солью, и было проведено испытание адгезии клеток, как описано выше. Связывание пептидов и протеинов с интегринами. Растворы человеческих интегринов v3, v5, 51 и 11, 0,5-2 мкг/мл в фосфатно-буферной соли с Са 2+ и Mg2+ (DPBS, Cambrex) были добавлены к поливинилхлоридным микротитровальным пластинам с 96 лунками (50 мкл/лунка) и оставлены для инкубации в течение ночи при 4 С. Все последующие шаги выполнялись при комнатной температуре. Пластины были промыты DPBS и затем инкубированы сDPBS содержащим 3% BSA (200 мкл/лунка, 1 ч). Затем пластины были промыты и заполнены растворами CNGRC-TNF или TNF (5 мкг/мл, 50 мкл/лунка в 3%-ном BSA-DPBS) и оставлены для инкубации на 2 ч. После промывки DPBS каждая лунка была инкубирована с очищенным кроличьим антимышинымTNF IgGs в 3%-ном BSA-DPBS, содержащем 1% нормальную козью сыворотку (10 мкг/мл, 50 мкл/лунка,1 ч), за чем следовал конъюгат козьей антикроличьей пероксидазы в том же самом буфере (50 мкл/лунка,1 ч). Связь пероксидазы обнаруживалась при добавлении хромогенного субстрата о-фенилэндиамина. Связывание биотинилизированных пептидов (CNGRC-TNF1-11, CARAC-TNF1-11 и FN-I5) с очищенными интегринами изучалась с использованием комплексов конъюгатов со стрептавидин-пероксидазой. Комплексы приготавливались путем смешивания разных количеств (0,5-1 мкг) обработанных теплом биотинилизированных пептидов в DPBS, содержащем 3%-ный BSA с 0,03 единицами стрептавидинпероксидазы (объем связывания: 1 мкг биотин/единица стрептавидин-пероксидазы) (окончательный объем 15 мкл). Комплексы разводились в 3%-ном BSA-DPBS (1:500), добавлялись к микротитровальным пластинам, покрытым интегринами, как описано выше, и инкубировались в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки DPBS связанная пероксидаза обнаруживалась хромогенной реакцией, как описано выше. Каждое испытание проводилось трижды. Исследование in vivo. Исследования на моделях животных были одобрены Комитетом по этике института San Raffaele HScientific Institute и выполнялись согласно предписаниям. Мыши C57BL/6N (Charles River Laboratories,Calco, Italy) весом 16-18 г были подвергнуты подкожной инъекции в левый бок 7104 RMA живых клеток; 4 дня спустя, мышей лечили ежедневно 200 мкг обработанного теплом FN-Is (100 мкл) в 0,9%-ной поваренной соли (i.p.). Рост опухолей контролировался путем измерения опухолей кронциркулем, как описано ранее (Gasparri et al., 1999). Животные умерщвлялись прежде, чем опухоли достигали 1,0-1,3 см в диаметре. Размеры опухолей показаны как среднее значение SE (5 животных/группа). Пример 2. Ускоренное старение фрагментов фибронектина возбуждает места адгезии в зависимости от NGR. Ускоренное старение фрагментов фибронектина возбуждает места адгезии в зависимости от NGR.- 23013967 Изучалась адгезия клеток EA.hy926 с природными, рекомбинантными и синтетическими фрагментами фибронектина с мотивом NGR. В первую очередь были изучены следующие протеолитические фрагменты фибронектина: a) FN-70 KDa, содержащий FN-I1-9 и FN-II1-2 повторы; b) FN-30 KDa, содержащий FN-I1-5 повторы; с) FN-45 KDa, содержащий FN-I6-9 и FN-II1-2 (см. фиг. 1 для схематического представления). Все фрагменты после адсорбции на микротитровальные пластины подвергались адгезии клеток и распределению (фиг. 2), допуская присутствие проадгезионных мест в этих зонах. Для исследования роли мотива NGR в повторе FN-I5 мы затем анализировали проадгезионные свойства фрагментов FN-I5, FN-I4-5 и FN-I4-5SGS, причем последние соответствовали мутанту с SGS вместо NGR (остатки 263-265). Рекомбинантный FN-I4-5, но не мутант SGS, ускорял адгезию клеток(фиг. 3 А). Когда мы инкубировали эти фрагменты в 0,1-М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 в течение 16 ч при 37 С (отсюда эта обработка называется "тепловой обработкой"), мы наблюдали повышение адгезии клеток с FN-I4-5, но не с FN-I4-5SGS (фиг. 3 А). Это означает, что место адгезии клеток, как-то связанное с последовательностью NGR, было порождено ускоренным старением. Подобные результаты были получены с синтетическим FN-I5 (фиг. 3 В). Чтобы оценить, было ли достаточно мотива NGR для поддержания этого явления, мы исследовали проадгезионные свойства коротких пептидов, содержащих NGR, до и после тепловой обработки. Поскольку маловероятно, что трипептид NGR разложен и связан с микротитровальными пластинами, мы ввели два боковых цистеина. Идея использования боковых цистеинов была основана на том факте, что рассчитанная путем молекулярного динамического моделирования структура пептида CNGRC подобна таковой GNGRG петли FN-I5 повтора (Colombo et al., 2002). Более того, мы сливали этот пептид с TNF(CNGRC-TNF) или с первыми 11 остатками TNF (CNGRC-TNF1-11, лишенного активности TNF) для возможности адсорбции на микротитровальных пластинах. Как и ожидалось, тепловая обработка CNGRCTNF увеличила адгезию клеток (фиг. 3 С). Никакой адгезии одиночного TNF не наблюдалось ни до, ни после тепловой обработки (данные не показаны). Подобным образом, тепловая обработка CNGRCTNF1-11, но не CARAC-TNF1-11 (контрольного пептида) увеличивала адгезию клеток (фиг. 3 С, справа). Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что мотива NGR достаточно для ускорения адгезии клеток после тепловой обработки. Интересно, что конъюгат CDGRC-TNF, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, был полностью неактивным (фиг. 3D) даже после тепловой обработки(не показано), наводя на мысль, что Asn является критическим остатком для усиленной активности. В заключение, эти результаты означают, что структурные изменения, каким-то образом относящиеся к остатку Asn мотива NGR в FN-I5 приводят к порождению проадгезионного участка. Пример 3. Дезамидирование NGR, связанное с повышенной адгезией клеток. Хорошо известно, что остатки Asn, особенно, когда за ними следует Gly, могут подвергаться неэнзиматическому дезамидированию при физиологической рН (Robinson and Robinson, 2001; Robinson et al.,2004; Stephenson and Clarke, 1989; Tyler-Cross and Schirch, 1991). Эта реакция приводит к образованиюAsp или isoAsp, L-Asp (LD), L-isoAsp, (LisoD), D-Asp (DD), и D-isoAsp (DisoD), хотя преобладает Lконфигурация (Geiger and Clarke, 1987). Соответственно мы обнаружили, что молекулярная масса пептидов FN-I5, CNGRC-TNF и CNGRC увеличилась примерно на 1 Да, при анализе масс-спектрометрией, после тепловой обработки. Кроме того, isoAsp анализ CNGRC-TNF показал наличие 0,5 пмольisoAsp/моль субъединицы CNGRC-TNF после тепловой обработки. Чтобы оценить, зависят ли усиленные адгезионные свойства FN-I5 после тепловой обработки от дезамидирования NGR, мы инкубировали "обработанные теплом" FN-I5 и CNGRC-TNF с протеин LisoAsp/D-AspO-метилтрансферазой (PIMT), энзим, который преобразует L-isoAsp и D-Asp остатки в LAsp (Aswad, 1984; Galletti et al., 1988; Lowenson and Clarke, 1992; McFadden and Clarke, 1987; Murray andClarke, 1984). PIMT почти полностью ингибирует проадгезионную активность обработанных теплом FNI5 и CNGRC-TNF (фиг. 4 А). Кроме того, эта энзиматическая обработка частично подавляла проадгезионные свойства природного FN-30 KDa (фиг. 4 В) и фрагмента FN-45 KDa (не показан), полагая,что дезамидирование Asn может также иметь место в фрагментах натурального фибронектина. Чтобы оценить особенности этой реакции, мы оценили также влияние PIMT на ретронектин, фрагмент FN, который, как известно, способствует адгезии клеток через ROD (см. фиг. 1). Как и ожидалось, в этом случае не наблюдалось никакого ингибирования после энзиматической обработки (фиг. 4 В). Напротив, в этом случае мы наблюдали умеренное, но существенное увеличение. Это было вообще неожиданностью,так как RGD также мог подвергнуться изомеризации остатков Asp с образованием isoAsp и потерей функции (Geiger and Clarke, 1987; Lanthier and Desrosiers, 2004; Reissner and Aswad, 2003; Stephenson andClarke, 1989). Таким образом, ожидается, что в этом случае PIMT "восстановит" RGD и увеличит адгезию клеток. В заключение, эти результаты означают, что дезамидирование NGR, в противоположность изомеризации RGD, связана с "усилением функции" в испытании на адгезию клеток. Пример 4. Кинетика дезамидирования NGR. Стабильность NGR и кинетика образования LisoDGR или DDGR при рН 7,3 (DMEM) и рН 8,5 (бикарбонат аммония) затем были исследованы. С этой целью пептид CNGRCGVRY (называемый NGR-pep) был синтезирован и проанализирован с помощью реверс-фазы HPLC до и после инкубации при 37 С. Остатки GVRY были добавлены к С-концу CNGRC, чтобы сделать возможной адсорбцию в лунке. Кро- 24013967 ме того, пять пептидов, называемых DGR-pep, D-DGR-pep, isoDGR-pep, D-isoDGR и SGR-рер, соответствующих той же последовательности NGR-pep, за исключением присутствия D, D-D, L-isoD, D-isoD и S,соответственно были приготовлены в месте N. Полужизнь NGR-pep при рН 7,3 и 8,5, оцененная, исходя из высоты масс-хроматографического пика (пика 1), была около 4 и 2 ч соответственно (фиг. 5 А, вставка). Пептиды, соответствующие продуктам дезамидирования, были стабильными при этих условиях(фиг. 5 В). Для идентификации пиков и проверки того, что измеренная полужизнь соответствует Asn дезамидированию, а не другим структурным изменениям, мы проанализировали обработанный теплом пептидNGR-pep обогащенных свежим NGR-pep, или DGR-pep или isoDGR-pep пептидов. Результаты показали,что пики 1, 2 и 3, наблюдаемые после инкубации NGR-pep, соответствуют пептидам NGR-pep, DGR-pep и isoDGR-pep соответственно. Заметим, что NGR-pep был стабилен в течение более одной недели при 37 С, когда хранился в воде. Пример 5. v3, являющийся рецептором мотивов DisoDGR и DDGR. Связывание обработанного теплом FN-I5, CNGRC-TNF и коротких пептидов с очищенными интегринами v3, v5, 51 и v1 было затем исследовано с помощью прямого и сравнительного ELISA с интегринами, адсорбируемыми на микротитровальных пластинах. Мы наблюдали связывание всех молекул, содержащих NGR (обработанный теплом), с ccyps, но мало или совсем не наблюдали с другими интегринами (фиг. 6 А и В). Не наблюдалось связывания с обработанным теплом TNF или с контрольным пептидом CARAC-TNF1-11 (фиг. 6 А и В), наводя на мысль, чтоNGR был критическим. Заметим, что мы наблюдали связывание CNGRC-TNF с v3 даже до тепловой обработки (данные не показаны), хотя в более низкой степени, возможно, благодаря дезамидированию,имеющему место во время приготовления и/или инкубации образца. Для проверки важности NGR-петли FN-I5 для связывания интегринов мы выполнили сравнительные эксперименты по связыванию с рекомбинантными FN-I4-5 и FN-I4-5SOS, причем в последнем не былоNGR. Как и ожидалось, только фрагмент с NGR мог быть полностью связан FN-I5 с v3 (фиг. 6 С). Выполнение связывания наблюдалось также с пептидом, соответствующим целой петле 256-271 FN-I5 (см. фиг. 1 С), но не с контрольным пептидом с зашифрованной последовательностью на участке GNGRG(фиг. 6 С),Соответственно, это связывание было эффективно выполнено с DDGR-рер и isoDGR-pep (EC50,0,1 мкМ) и обработанным теплом FN-I5 (EC50, 0,4 мкМ) и менее эффективно с DisoDGR-pep или DGRpep, NGR-pep, SGR-pep (EC50,10 мкМ) (фиг. 7). Учитывая, что пептиды isoDGR-pep или DDGR-pep стабильны при таких условиях испытания, эти результаты означают, что isoDGR-pep или DDGR-pep являются мотивами новых лигандов v3. Пример 6. Кинетика образования мест связывания интегринов в FN-I5. Для исследования кинетики мест связывания интегринов в FN-I5 мы провели дополнительное сравнительное изучение связывания с разными дозами FN-I5, инкубированного в течение разного времени при 37 С в DMEM. Интересно, что, когда построили график ингибиторной концентрации (IC50) в зависимости от времени инкубации, мы заметили, что максимальная сравнительная активность связывания достигалась спустя 24-48 ч после инкубации (полужизнь 3,4 ч) (фиг. 7 В). Это значение очень хорошо согласуется с полужизнью NGR-pep дезамидирования, описанного выше, и дальше поддерживает концепцию, что связующие свойства интегрина обработанного теплом FN-I5, в самом деле, относятся кNGR-дезамидированию. Пример 7. Дезамидированные фрагменты FN-Is подавляют адгезию клеток in vitro с витронектином и рост опухоли в модели мыши. Хорошо известно, что интегрин v3, рецептор витронектина, играет критическую роль в ангиогенезе (Hynes, 2002). Соединения, способные ингибировать взаимодействие этого интегрина с протеинами ЕСМ, как известно, ингибируют ангиогенез и рост опухоли (Brooks et al., 1994; Brooks et al., 1995; Friedlander et al., 1995; Friedlander et al., 1996; Hammes et al., 1996). Мы заметили, что фрагменты дезамидированного FN-I5 могут ингибировать адгезию клеток EA.hy926 с витронектином (фиг. 8 А). Более того, этот фрагмент, когда он ежедневно вводился мышам с лимфомой RMA, существенно подавлял рост опухолиin vivo (фиг. 8 В). Эти результаты означают, что дезамидированные фрагменты FN могут играть роль в адгезии клеток и биологии опухоли. Пример 8. Изоляция дезамидированной формы NGR-TNF. Для приготовления мышиного Cys-Asp-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (DGR-TNF) и Cys-isoAsp-Gly-ArgCys-Gly-TNF (isoDGR-TNF) мы клонировали и экспрессировали Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGRTNF) в клетки E.coli и очищенные дезамидированные формы (спонтанно продуцируемые во время процесса производства) из этого продукта. кДНК, кодированная для NGR-TNF (содержащего TNF, слитый с С-концом CNGRCG), была сначала приготовлена с помощью технологии рекомбинантных ДНК с использованием клеток E.coli и очищена, как описано (Curnis et al., 2000). Для изоляции дезамидированных форм из этого приготовления мы выполнили следующий шаг по очистке на основе обратнофазной высокоэффективной жидкостной хро- 25013967 матографии (RP-HPLC) на колонне С-4 (Hipore колонна реверсивной фазы, 2504,6 мм, Biorad), следующим образом: мобильная фаза А; 5 мМ буфер фосфата натрия с рН 6,8, содержащий 5% ацетонитрила в воде; мобильная фаза В, 5 мМ буфер фосфата натрия с рН 6,8, содержащий 70% ацетонитрила в воде; 0% В в течение 10 мин, 30% В для 5 мм, линейный градиент 30-65% В за 35 мин, 100% В для 10 мм, 0% В в течение 10 мин, скорость потока 2 мл/мин. Отклонение наблюдалось на 214 нм и 280 нм (HPLC, LC-126 нМ, Beckman Coulter). RP-HPLC для NGR-TNF обнаружил два главных пика, обозначенных F2 и F4, и два маленьких пика, обозначенных F1 и F3 (фиг. 9). Присутствие дезамидированных форм в этих пиках было идентифицировано путем измерения количества isoAsp в этих фракциях. Результаты показали, чтоF2 содержал намного больше isoAsp, чем F4 (табл. 1).Re-хроматография F2 и F4 с помощью RP-HPLC показала, что время замедления не изменилось после разделения, наводя на мысль, что эти продукты стабильны. Аналитический двумерный электрофорезSDS-PAGE с кумасси-окрашиванием обнаружил главную полосу 17-18 кДа в продуктах как F2, так и F4,как ожидалось для мономеров TNF (фиг. 10, вставка). Биохимические и биологические свойства F2 и F4 были затем оценены (табл. 1). Анализ с электрораспылительным масс-спектрометром показал, что молекулярная масса F2 была на 1 Да больше, чем таковая F4. Кроме того, цитолитические активности F2 и F4 против L-M клетки были подобны. Этот результат, наряду с данными о содержании isoAsp, означает, что F2 соответствует дезамидированной форме NGR-TNF. Чтобы оценить, имеет ли место дезамидирование в домене CNGRC с N-концом, мы выполнили анализ последовательности N-конца методом деградации Эдмена (не показано). Результаты подтвердили,что дезамидирование имеет место на N-конце, так как был обнаружен Asp2 вместо Asn2. Эти и вышеприведенные данные показывают, что F2 является смесью isoDGFL-TNF (75%) и DGR-TNF с остатками изоаспартила и аспартила в положении 2. Противоопухолевые свойства in vivo F2 были затем исследованы с использованием модели RMA лимфомы. Изучение на животных было одобрено Комитетом по этике института San Raffaele H ScientificInstitute и выполнены в соответствии с предписаниями. Мыши C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco,Italy) весом 16-18 г были подвергнуты подкожной инъекции в левый бок 7104 RMA живых клеток; 10 дней спустя мыши были обработаны 0,25 или 100 пг F2 (100 мкл), через 2 ч после чего следовало введение мелфалана (50 мкг в 100 мкл) (Glaxo Wellcome Operations, Dartford, Great Britain). Все лекарства, разведенные в 0,9%-ной поваренной соли, содержащей 100 мкг/мл альбумина человеческой сыворотки, свободной от эндотоксина (Farma-Biagini SpA, Lucca, Italy), вводились внутриперитонально. Рост опухолей контролировался ежедневно путем измерения опухолей кронциркулем, как описано ранее (34). Животные умерщвлялись прежде, чем опухоли достигали 1,0-1,3 см в диаметре. Размеры опухолей показаны как среднее значениеSE (5 животных/группа). Результаты показали, что очень низкие дозы (25 пг) F2 могут индуцировать противоопухолевые эффекты при назначении в комбинации с мелфаланом (фиг. 11). Пример 9. Приготовление isoDGR-TNF/DGR-TNF путем обработки NGR-TNF 0.1-М буфером бикарбоната аммония. Буферная композиция, ионная сила, рН и температура могут повысить скорость дезамидирования/изомеризации Asn остатка. Таким образом, для разработки быстрого способа приготовления F2(iDGR-TNF/DGR-TNF) мы развели TNF в 0,1-М буфере бикарбоната аммония с рН 8,5 и инкубировали при 37 С в течение разного времени. Обработанный теплом NGR-TNF был подвержен анализу при помощи RP-HPLC. На фиг. 12 показано, что F4 был быстро превращен в F2 после этой обработки. Замечательно, что не наблюдалось никакой потери цитолитической активности после 4 ч обработки, что показывает, что этот процесс может быть использован для производства isoDGR-TNF/DGR-TNF. Пример 10. Приготовление DGR-TNF путем технологии рекомбинантных ДНК. КДНК, кодирующая для DGR-TNF (мышиного TNF, слитого с С-концом CDGRCG) была получена при помощи PCR на NGR-TNF плазмиде с использованием следующих праймеров: 5' CACCATGTGCGACGGCCGTTGCGGC 3' (5' праймер); 5' CTGGATCCTCACAGAGCAATGATCCCAAAG '3 (3' праймер). Оба праймера были предназначены для обеспечения направленного клонирования в экспрессионный набор плазмиды pETlOl/D-ТОРО (инвитроген). Подчеркнутая последовательность в праймере 5' содержит последовательность, необходимую для осуществления направленного клонирования и начальной трансляции кодона, в то время как праймер 3' содержит стоп-кодон (подчеркнуто). PCR реакция и процедура клонирования были выполнены, как рекомендовано инструкцией изготовителя. DGR-TNF кДНК была экспрессирована в клетки BL21(DE3) E.coli (новаген) и очищена от экстрактов клеток аффинной хроматографией на растворимом рецепторе p75-TNF сефарозы следующим образом: 10 мг коммерчески поставляемого рекомбинантного рецептора p75-TNF (Embrel) были соединены с 2,5 мл сефарозы, активированной СН (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany) согласно инструкции изготовителя. Колонна была экстенсивно промыта 100-мМ Tris-HCl буфером, имеющим рН 8,0, загружена DGRTNF неочищенным экстрактом, разведенным в 20-мМ Tris-HCl буфером. 2 мМ EDTA рН 8,0, и десорби- 26013967 рована элюцией с 7 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Затем DGR-TNF был разложен, как описано(1). Кратко, денатурированные продукты были диализированы 2,33 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, рН 8,0 при 4 С (140 мин), за чем последовали 1,55 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, рН 8,0 (140 мин) и 1 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH,8 (140 мин). Наконец продукты были диализированы 100 мМ Tris-HCl,рН 8,0 (48 ч). Продукты были центрифугированы при 13000g (10 мин, 4 С) и концентрированы ультрафильтрацией через 10 КДа отсекающий фильтр. Все растворы, используемые на этапах очистки и разложения, приготовлялись на стерильной и свободной от эндотоксина воде (S.A.L.F. Laboratorio Farmacologico SpA, Bergamo, Italy). Концентрация протеинов измерялась с использованием реагента BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, Illinois). Чистота протеина и идентичность были проверены при помощи SDS-PAGE, электрораспылительного масс-спектрометра (ESI-MS) и аналитической гельфильтрационной хроматографии. Результаты подтвердили идентичность продукта (данные не показаны). Цитолитическая активность in vitro DGR-TNF (2,5108 U/мг) измерялась на стандартном цитологическом образце с L-M мышиными фибробластами.RP-HPLC DGR-TNF показал, что его время замедления было подобно таковому F2, полученному из Электрораспылительным масс-спектрометром. С цитолитическим образцом, использующим L-M мышиные фибробласты (1). с) Изоаспартиловые остатки оценивались энзимным испытанием (ISOQUANT, набор для определения дезамидирования протеина, Promega) и экспрессировались как пмоль isoAsp/пмоль пептида (%). На все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, приведены ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и систем по настоящему изобретению будут очевидны для специалистов в данной области, исходя из объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными вариантами выполнения,должно быть понятно, что изобретение, как оно заявлено, не будет ограничено ненадлежащим образом такими специфическими вариантами выполнения. В самом деле, различные модификации описанных режимов для осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов по биохимии и биотехнологии или смежным областям, будут попадать в объем следующей далее формулы изобретения. Ссылки