Блокада cd154 как лечение синдрома ингибирования терапевтических белков

1 Настоящая заявка является частичным продолжением более ранней заявки США 60/ 050 276, зарегистрированной 10 июня 1997 г. Идеи ранее зарегистрированной временной патентной заявки включены в настоящий документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение относится в целом к подавлению нежелательных иммунных ответов, особенно противоадаптивных иммунных ответов, опосредованных Т-лимфоцитами. Настоящее изобретение относится, в частности, к предотвращению, лечению, подавлению и реверсированию иммунологического ингибирования терапевтической активности экзогенно вводимых белков или других биологических терапевтических агентов. Гемофилия А представляет из себя наследственную болезнь дефицита, связанную с Ххромосомой, и поражает от одного до двух мужчин на каждые 10 000 живорождений. Лица,страдающие гемофилией А, имеют частичный или полный функциональный дефицит эндогенного фактора свертывания крови VIII (ФVIII) и должны получать заместительную терапию очищенным или рекомбинантным ФVIII. Lusheret al. (1993), 328 N. Engl. J. Med. 453-459. Приблизительно у 15% лиц, страдающих гемофилией А, на применение терапевтического ФVIII развиваются ответы с высоким титром антител(т.е.10 BU/мл). Эти лица упоминаются какal. (1988), 71 Blood 344-348. Такие антитела,названные ингибиторами ФVIII, блокируют функцию (биологическую активность) заместительного терапевтического агента ФVIII путем связывания с введенным экзогенным ФVIII. Этот противоадаптивный гуморальный иммунный ответ делает весьма проблематичным лечение эпизодов кровотечения у высокоотвечающих индивидуумов. Незначительные эпизоды кровотечения (например, гемартрозы) часто успешно лечатся концентратами активированного протромбинового комплекса (например,Autoplex или FEIBA, ингибитор обходной активности ФVIII), однако, тяжелые кровотечения с помощью этих агентов держать под контролем трудно. Brettler (1996), 9 Clin.Hematol. 319-329. Большинство высокоотвечающих индивидуумов имеют низкие уровни антител, ингибирующих ФVIII, до тех пор, пока не получат впоследствии инфузию ФVIII, которая стимулирует (активно иммунизирует) выработку блокирующих антител. Таким образом, реиндукцию ингибирующих антител у высокоотвечающих индивидуумов можно предсказать с большой точностью.Brettler (1996), 9 Clin.Hematol. 319-329. Было показано, что профилактика с помощью ФVIII снижает частоту интраартикулярных кровотечений и хронической артропатии у лиц, страдающих гемофилией. Liesner et al. (1996), 92 2 ответа у высокоотвечающих индивидуумов, они не могут получать профилактическое лечение с помощью ФVIII. Высокоотвечающих индивидуумов с индуцируемым бурным иммунным ответом на ФVIII часто лечат регулярными ифузиями очень больших доз ФVIII по схемам, предназначенным для индуцирования "толерантности" к экзогенному ФVIII. Brettler (1996), 9 Clin.Hematol. 319-329. В некоторых случаях к схемам толерантности добавляют иммуномодулирующие агенты (глюкокортикоиды, циклофосфамид,внутривенный иммуноглобулин (в/в Ig). Толерантная терапия эффективна для 50-80% высокоотвечающих индивидуумов. Mariani et al.(1994), 72 Thromb. Haemostasis 155-158. Стоимость такого лечения варьирует от 200 000 почти до миллиона долларов США на пациента. Поскольку инфузия ФVIII индуцирует очень высокие уровни ингибиторов у высокоотвечающих особей, во время периода индуцирования толерантности, который часто длится от трех до восьми месяцев, этих пациентов нельзя лечить с помощью ФVIII, если у них все же возникает кровотечение. Brettler (1996), 9Clin.Hematol. 319-329. После успешной индукции толерантности пациенты часто получают поддерживающую терапию путем профилактических инфузий ФVIII от двух до трех раз в неделю. Brettler(1996), 9 Clin.Hematol. 319-329. Механизм индуцирования толерантности с помощью этих схем остается неясным, но может вовлекать индукцию антиидиотипических антител (Gilles etal. (1996), L.Clin.Invest. 1382-1388)или более прямое подавление В-клеточных клонов, производящих антитела, ингибирующие ФVIII. Помимо этого, препараты в/в Ig содержат антиидиотипические антитела к ингибиторам ФVIII, что может объяснить эффективность этой терапии у некоторых высокоотвечающих особей. Sultan et al. (1991), 91 Am.J.Med. 5A35S-5A-39S. В очень тяжелых и угрожающих жизни случаях, при которых необходимо применение терапии с помощью ФVIII по поводу кровотечения, ингибиторы ФVIII можно удалить путем экстракорпоральной иммуноабсорбции на колонках с анти-Ig или белком A. KnobiGjorstrup et al. (1991), 61 Vox Sang 244-250. Эти схемы требуют больших затрат времени и вызывают 50-75% снижение общих уровней сывороточных иммуноглобулинов (Ig) (Knobl et al.(1995), 74 Tromb.Haemostasis 1035-1038), что потенциально повышает риск возникновения инфекции. Сходные осложнения заместительной терапии белком следует учитывать при лечении других врожденных или приобретенных заболеваний, связанных с дефицитом белка, включая дефициты других факторов свертывания крови,белков крови или плазмы, факторов роста и т.п. 3 Более того, с аналогичными осложнениями приходится считаться и в других медицинских учреждениях, в таких, где в лечебных целях вводят пациентам рекомбинантные копии эндогенных, но редких или секвестрированных белков. Например, с аналогичными осложнениями приходится считаться и в случае терапии, включающей в себя введение пациенту рекомбинантных цитокинов, лимфокинов, факторов роста или ферментов. Примером может служить введение эритропоэтина (ЭПО) для лечения анемии. Другой пример -введение интерферона(IFN ) для лечения рассеянного склероза(PC). Еще одним примером является введение человеческого гормона роста (чГР) для ускорения роста. Также следует считаться с аналогичными осложнениями, когда вводят пациенту микробный белок в терапевтических целях, например стрептокиназу, для лечения инсульта или другого типа окклюзии сосудов. Соответственно, существует потребность в разработке улучшенного или более эффективного иммуносупрессивного или иммуномодулирующего лечения для минимизации или подавления выработки ингибирующих антител, которые связываются и блокируют терапевтическую активность экзогенно вводимых белков. В частности, существует потребность в лечении, которое не требует тотальной иммуносупрессии Тклеток, т.е. такого лечения, которое не делает реципиента уязвимым для злокачественных новообразований и оппортунистических инфекций. Более конкретно, существует потребность в реверсировании или подавлении ингибиторных синдромов, которые мешают введению нужных белковых лекарств, таких как ФVIII, индивидиуумам, которые в этом нуждаются. Целью настоящего изобретения является создание иммуномодулирующего агента, который смягчает противоадаптивные Т-клеточные ответы без необходимости тотальной иммуносупрессии Т-клеток. Другой целью является создание иммуномодулирующего агента, который смягчает тяжесть противоадаптивного гуморального иммунного ответа на введение нужного экзогенного белкового лекарства. Другой целью является создание иммуномодулирующего агента, который задерживает начало противоадаптивного гуморального иммунного ответа на введение нужного экзогенного белкового лекарства. Другой целью является создание иммуномодулирующего агента, который подавляет или реверсирует противоадаптивный гуморальный иммунный ответ на введение нужного экзогенного белкового лекарства. Еще одной целью является создание иммуномодулирующего агента, который прерывает доставку костимулирующего сигнала к активированным Т-клеткам,особенно, костимулирующего сигнала для выработки иммуноглобулинов. Конкретной целью является создание блокатора связыванияCD154, для применения в терапии, особенно для терапевтического применения с целью смягчить, отсрочить начало или реверсировать противоадаптивный ингибирующий антительный ответ на введение нужного экзогенного белкового лекарства, такого как ФVIII. Настоящее изобретение базируется на открытии того факта, что применение блокатора связывания CD40:CD154, такого как агент, блокирующий CD154, ослабляет, смягчает, подавляет, предотвращает, задерживает или реверсирует противоадаптивные ингибирующие антительные ответы на белковые антигены, без необходимости тотального подавления иммунной системы реципиента. Более точно, настоящее изобретение базируется на открытии того факта,что агент, блокирующий CD154, ослабляет,смягчает, подавляет, предотвращает, задерживает или реверсирует нежелательный ингибирующий гуморальный иммунитет, который блокирует биологическую активность белковых лекарств, вводимых пациенту для замещения или усиления нативной биологической активности эндогенного, но дефектного белка, такого как фактор свертывания крови, например, ФVIII. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и композициям для иммуномодулирующего лечения синдромов ингибирования экзогенного белка. Первый способ ослабляет или смягчает тяжесть синдрома ингибирования экзогенного белка. Второй способ подавляет побочные эффекты этого синдрома. Третий способ предотвращает развитие этого синдрома. Четвертый способ задерживает начало этого синдрома. Пятый способ ингибирует развитие этого синдрома. Шестой способ реверсирует этот синдром. Седьмой способ сохраняет терапевтическую эффективность экзогенного белка, такого как терапевтический белок, вводимый пациенту для замещения или добавления нативного, но дефектного белка. Восьмой способ восстанавливает терапевтическую эффективность такого экзогенного белка. Все упомянутые выше способы включают в себя лечение пациента, входящего в группу риска или страдающего развитием синдрома ингибирования экзогенного белка, под которым подразумевается противоадаптивный гуморальный иммунный ответ, который блокирует (препятствует) биологическую активность экзогенного белка, с помощью блокатора связывания CD40:CD154, под которым подразумевается любой агент, который прерывает связывание лиганда CD40 (т.е.,CD40L, также известный как CD154 или антиген 5 с 8, иногда упоминаемый как gр 39) с его родственными рецепторами или противорецепторами (здесь CD40). Предпочтительно, блокатором связывания является агент, блокирующийCD154 (CD40L), под которым подразумевается любой агент, который связывается с CD154 и предотвращает или препятствует его связыванию с противорецепторами (например, CD40). 5 Примером агента, блокирующего CD154, является моноклональное антитело (МАb), в частности, антитело, обладающее антигенспецифичными связывающими характеристиками 5 с 8 МАb, описанное в патенте США 5 474 771, идеи которого включены в настоящий документ в виде ссылки. Как было упомянуто выше, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для ослабления или улучшения синдромов ингибирования, направленных против экзогенных белков, которые вводят пациенту для замещения или усиления биологической активности нативного (эндогенного) белка, являющегося дефектным. Настоящее изобретение также можно осуществлять на практике для ослабления или улучшения синдромов ингибирования, направленных против других экзогенных белков,включая экзогенный белок, который вводят пациенту с лечебными целями. Например, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для подавления, реверсирования или ингибирования ингибирующего ответа, направленного против любого рекомбинантного белкового лекарства, особенно белкового лекарства, имеющего первичную структуру (аминокислотную последовательность), в основном, сходную (например, практически идентичную) с нативным, функциональным, но редким белком,или нативным белком, который в природе секвестрирован в конкретную структуру организма или компартмент, такой как костный мозг, лимфатический узел или центральная нервная система. Подобно этому, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для подавления, реверсирования или ингибирования ингибирующего ответа на рекомбинантную версию нативного белка, который временно экспрессируется или экспрессируется только в ответ на конкретные раздражители окружающей среды или в конкретные периоды развития организма. Таким образом, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для ослабления или улучшения ингибирующего ответа на гормон роста, фактора заживления ран (например, фактор регенерации тканей или фактор дифференцировки), цитокин или лимфокин (например,колониестимулирующий фактор, фактор стволовых клеток, интерферон или интерлейкин),фермент (например, глюкоцереброзидазу), фактор свертывания крови (например, тромбин,протромбин, фактор V, фактор VII, фактор VIII,фактор IX, фактор X, фактор XI или факторXII), или другой компонент плазмы (например,альбумин, тканевый активатор плазминогена). Далее, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для ослабления или улучшения ингибирующего ответа на чужеродный белок,особенно на бактериальный белок (например,стрептокиназу), который вводят пациентам с лечебной целью (например, для лечения сосудистой окклюзии). Предпочтительным субъектом 6 для практического осуществления настоящего изобретения является человек. В частности, настоящее изобретение можно осуществлять на практике для ослабления или улучшения ингибирующих синдромов, которые развиваются при введении факторов свертывания крови лицам, страдающим гемофилией. Упомянутые выше и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения, а также само изобретение, можно более полно понять благодаря следующему описанию его предпочтительных вариантов. Активация Т-клеток и зависящие от нее иммунологические процессы требуют как наличия опосредованных Т-клеточными рецепторами (ТКР) сигналов, так и наличия одновременно доставляемых костимулирующих сигналов. Важный костимулирующий сигнал доставляется путем лигирования CD40 на антигенпредставляющую клетку, такую как В-клетка, посредством CD40L (CD154) на Т-клетке. CD40 человека представляет из себя белок клеточной поверхности с молекулярным весом 50 кДа, который экспрессируется зрелыми В-клетками, а также макрофагами и активированными эндотелиальными клетками. CD40 принадлежит к классу рецепторов, участвующих в запрограммированной смерти клетки, который включает в себя также рецепторы Fas/CD95 и фактора некроза опухолей (TNF) альфа. CD154 (CD40L) представляет из себя гликопротеин мембраны типа II с молекулярным весом 32 кДа, обладающий гомологичностью в отношении TNF альфа, который временно экспрессируется главным образом активированными Т-клетками. Было установлено, что связывание CD40:CD154 требуется для всех ответов, сопровождающихся выработкой антител, зависящих от Т-клеток. В частности, связывание CD40:CD154 создает антиапоптотические и/или лимфокиновые стимулирующие сигналы. Важность связывания CD40:CD154 в возникновении зависящих от Т-клеток биологических ответов была оценена более полно, когда было установлено, что связанный с Х гиперIgМ-синдром (X-ГIGM) у человека представляет из себя фенотип, возникающий в результате генетического отсутствия функциональногоCD154. Страдающие этим синдромом лица имеют нормальные или высокие уровни IgM, но не могут вырабатывать антитела IgG, IgA илиIgЕ, и страдают от рецидивирующих, иногда тяжелых, бактериальных и паразитарных инфекций, а также среди них наблюдается повышенная частота возникновения лимфом и абдоминальных раков. Сходный фенотип наблюдается и у животных, нуллизиготных по гену, кодирующему CD154 (нокаутные животные). Вклетки нуллизиготных по CD154 животных могут вырабатывать IgM в отсутствии связыванияCD40:CD154, но не способны переносить изотипическое разнообразие или нормально выжи 7 вать после созревания аффинности. Гистологически герминальные центры лимфатических узлов не могут развиваться должным образом, и В-клетки памяти отсутствуют или развиваются слабо. Функционально эти дефекты вносят свой вклад в серьезное ослабление или отсутствие вторичного (зрелого) антительного ответа. Наблюдаются также дефекты клеточного иммунитета, что проявляется повышенной частотой возникновения бактериальных и паразитарных инфекций. Многие из этих клеточноопосредованных дефектов могут быть реверсированы путем введения IL-12 или IFN-гамма. Эти наблюдения подтверждают точку зрения о том, что нормальное связывание CD40:CD154 ускоряет развитие иммунных ответов I типа с участием Т-хелперов. Блокада взаимодействия CD40:CD154 во время иммунизации белковыми антигенами может специфически блокировать антительный ответ на этот антиген у мышей. Foy et al. (1993),178 Д. Ехр. Мео. 1567-1575. Например, aнтиCD154-антитела могут блокировать индукцию антиколлагеновых антител при коллагениндуцированном артрите. Durie et ql. (1993), 261Science 1328-1330. Aнти-CD154-aнтитeлa могут снижать антитела против двунитевой ДНК и антинуклеосомные аутоантитела у мышей со спонтанной волчанкой. Mohan et al. (1995), 154J. Immunol. 1470-1480. Помимо этого, aнтиCD154-aнтитeлa могут вызвать редукцию симптомов у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), который является моделью PC. Сообщали о сходных результатах на грызунах со смоделированной болезнью трансплантат против хозяина, гломерулонефритом, индуцированным хлоридом ртути и воспалительным заболеванием кишечника. Таким образом, блокада CD40:CD154 может обеспечивать потенциально мощную терапию для ослабления или улучшения нежелательных гуморальных иммунных ответов, особенно, в контексте аутоиммунных заболеваний,или, действительно, если антигеном-мишенью является белок, применяемый с лечебными целями, осуществлению которых мешает противоадаптивный иммунный ответ. Однако, несмотря на многочисленные сообщения о многообещающих результатах, исследования на грызунах со смоделированным индуцированным противоадаптивным иммунологическом заболеванием(например, аутоиммунитетом) плохо коррелируют с результатами испытаний в контексте актуальных заболеваний, или даже на доклинических модельных системах на больших животных (например, приматах). В настоящем документе описаны доклинические исследования, в которых оценивались эффекты предпочтительного агента, блокирующего CD154, гуманизированного МАb, обладающего антиген-специфичными связывающими свойствами МАb 5 с 8 (Lederman et al., J. Exp.Med. 175:1091-1101, 1992), с использованием моделей, которые, как полагают, могут предсказывать терапевтическую эффективность при лечении синдромов ингибирования активности экзогенного белка. В частности, эти модели включают в себя терапию с помощью блокадыCD154 для ослабления или улучшения биоингибирующего гуморального иммунитета, специфичного в отношении факторов свертывания крови (например, ФVIII) и лимфокинов (например, IFN ). Эти модели обычными способами можно адаптировать для применения с целью установления эффективности терапии с помощью блокады CD40:CD154154 для ослабления или улучшения ингибирующего гуморального иммунитета, направленного против любого белка, имеющего терапевтическую ценность. Следующая дискуссия иллюстрирует и приводит примеры различных контекстов и обстоятельств, в которых может осуществляться на практике настоящее изобретение, а также доказательных исследований, включающих в себя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения. Индивидуумы, подвергающиеся лечению Настоящее изобретение может применяться для лечения или профилактики у любого млекопитающего, которое нуждается в этом или уже получает заместительную белковую терапию на самом деле любую белковую терапию. Соответственно, индивидуумы, подвергавшиеся лечению, страдали или входили в группу повышенного риска развития синдрома ингибирования активности экзогенного белка. Например,лица, страдающие гемофилией, которых лечат экзогенным ФVIII, существенно рискуют стать"высокоотвечающими индивидуумами", после чего ФVIII теряет эффективность в отношении своего предназначения, т.е. в отношении борьбы с эпизодами кровотечения. Соответственно, настоящее изобретение является особенно пригодным для применения у лиц, страдающих гемофилией. Методики, с помощью которых можно установить, развился ли у пациента с гемофилией ингибирующий ответ на терапевтическое применение ФVIII и/или не стал ли он высоко-отвечающим индивидуумом, хорошо известны. Смотри, например, Hematology: Clinical and Laboratory Practice, vol.2, Bick, ed.,Mosby-Year Boock, Inc., publ. (1993), pp. 15441548. Предпочтительно, субъект лечения является приматом, более предпочтительно высшим приматом, наиболее предпочтительно человеком. В других вариантах осуществления настоящего изобретения этот субъект может быть другим млекопитающим, страдающим от или входящим в группу повышенного риска развития синдрома ингибирования активности экзогенного белка, особенно млекопитающим,имеющим коммерческую значимость или домашним животным или другим ценным животным, таким как животное, принадлежащее к 9 виду, находящемуся под угрозой исчезновения. Таким образом, субъекты также включают в себя не ограничиваясь ими овец, лошадей,крупный рогатый скот, коз, свиней, собак, кошек, кроликов, морских свинок, хомячков, песчанок, крыс и мышей. Примеры блокаторов связыванияCD40:CD154 Терапевтические соединения, пригодные для осуществления на практике настоящего изобретения, включают в себя любое соединение, которое блокирует взаимодействие CD40 клеточной поверхности (например, на Вклетках) с экспрессируемым CD40L (CD154),например, на поверхности активированных Тклеток. Соединения, прерывающие связываниеCD154, которые конкретно рассматриваются,включают в себя поликлональные антитела и моноклональные антитела (МАb), а также производные антител, такие как химерные молекулы, гуманизированные молекулы, молекулы с редуцированными эффекторными функциями,биспецифичные молекулы и конъюгаты антител. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело имеет антиген-специфичные характеристики связывания МАb 5 с 8, как описано в патенте США 5 474 771, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном в настоящее время варианте осуществления настоящего изобретения этим антителом является гуманизированное 5 с 8. Другие известные антитела против CD154 включают в себя антитела ImxM90, ImxM91 и ImxM92(полученные от компании Immunex), антиСD40L МАb, которые можно приобрести в компании Ancell (клон 24-31,в каталоге 353-020 бBayport, MN) и анти-СD40L МАb, которые можно приобрести в компании Genzyme (Cambridge, MA,в каталоге 80-3703-01). Имеются в продаже также анти-СD40L МАb от компанииPharMingen (San Diego,в каталоге 33580D). Также были получены и охарактеризованы многие другие анти-СD40L-антитела (см., например, W 96/23071, Bristol Myers Squibb, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки). Настоящее изобретение включает также применение агентов, блокирующих CD154, других типов, таких как полные Fab-фрагменты соединения F(ab)2, участки VH, участки FV, одноцепочечные антитела (см., например, WO 96/23071), полипептиды, слитые конструкции полипептидов, слитые конструкции CD40 (такие как CD40Ig, как описано у Hollenbaugh et al., J.Immunol. Meth. 188:1-7, 1995, что включено в настоящий документ в качестве ссылки), а также малые молекулы, такие как малые полупептидные соединения или непептидные соединения, которые способны блокировать или прерывать связывание CD40:CD154. Процедуры про 002512 10 ектирования, скрининга и оптимизации малых молекул представлены в патентной заявкеPCT/US 96/10664, зарегистрированной 21 июня 1996 г., описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Таким образом, можно осуществлять настоящее изобретение на практике с использованием полученных из Mab агентов, блокирующих CD154, с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК (Winter and Milstein, Nature 349:293-99, 1991). Один класс таких агентов, блокирующих CD154, включает в себя химерные антитела или слитые белки, построенные путем соединения нуклеиновой кислоты,кодирующей антиген-связывающий домен антитела млекопитающего, не являющегося человеком (например, антитела мыши или крысы) желаемой специфичности с нуклеиновой кислотой, кодирующей постоянный участок иммуноглобулина человека (Ig). Cabilly et al., патент США 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl.Acad. Sci. 81:6851-55 б 1984. Полипептиды химерных антител, экспрессируемые подобными конструкциями, обычно обладают более низкой иммуногенностью при использовании для лечения или профилактики у человека, чем антитела животных, из которых была получена химера. Второй класс таких агентов, блокирующихCD154, включает в себя рекомбинантные "гуманизированные" или "приматизированные" антитела. Гуманизированные или приматизированные антитела представляют из себя антитела,полученные от млекопитающего, не являющегося человеком, с помощью методики рекомбинантной ДНК, которые обладают желаемой специфичностью, путем замены некоторых или всех кодонов аминокислот, которые не требуются для связывания антигена, на кодоны аминокислот из соответствующих участков гена легкой или тяжелой цепи Ig человека или примата. Другими словами, они являются химерами, включающими в себя главным образом, последовательности человеческого иммуноглобулина, в которые генетически вставлены участки,ответственные за специфичное связывание с антигеном (см., например, РСТ патентную заявку VO 94/04679). Гуманизированные антитела обычно имеют еще более низкую иммуногенность in vivo по сравнению с химерными антителами. В настоящее время гуманизированное Mab, обладающее практически такой же антигенной специфичностью, что и Mab 5 с 8 (здесь, чел 5 с 8), является предпочтительными для практического осуществления настоящего изобретения. Другой класс полученных из Mab агентов,блокирующих CD154, пригодных для настоящего изобретения, включает в себя человеческие антитела, которые могут быть получены у трансгенных животных, не являющихся человеком, в которые интегрированы один или более трансгенов иммуноглобулинов человека. Таких 11 животных можно использовать как источник спленоцитов для получения гибридом, как описано в патенте США 5 569 825. Разумеется, любой антиген-специфичный связывающий фрагмент одного из ранее упомянутых Mab или полученный из Mab терапевтический агент может использоваться в настоящем изобретении, при условии, что этот фрагмент является достаточно большим, чтобы пространственно препятствовать связыванию CD154 с его противорецептором. Таким образом, можно использовать фрагменты Mab и унивалентные МАb. Унивалентные антитела включают в себя димер тяжелой и легкой цепей, связанный с участком Fc (или стволом) второй тяжелой цепи. "Участок Fab" относится к тем частям цепей,которые приблизительно эквивалентны или аналогичны последовательностям, которые включают в себя участки Y-ветвей тяжелой цепи, и легкую цепи целиком, и которые, как было показано, вместе (в агрегатах) демонстрируют активность антител. Белок Fab включает в себя агрегаты одной тяжелой и одной легкой цепи(широко известные как Fab'), а также тетрамеры,которые соответствуют сегментам антитела Y,состоящим из двух ветвей, (широко известные как F(ab)2), каждые из которых ковалентно или нековалентно агрегированы, так, что эти агрегаты способны селективно реагировать с определенным антигеном или семейством антигенов. Помимо этого, можно использовать обычные методики рекомбинантной ДНК для изменения аффинного связывания рекомбинантных антител с их антигенами, путем изменения аминокислотных остатков поблизости от антигенсвязывающих участков. Антиген-связывающая аффинность гуманизированного антитела может быть повышена путем мутагенеза на основе молекулярного моделирования (Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 86:10029-33, 1989; РСТ патентная заявка VO 94/04679). Может быть желательным повысить или понизить аффинность антител к CD40L, в зависимости от типа тканимишени или от конкретной применяемой схемы лечения. Это можно осуществить путем применения методики дисплея фагов (см., например.Schier et al., J.Mol.Biol. 255:28-43, 1996, включенную в настоящий документ в качестве ссылки). Например, может быть выгодным в полупрофилактических целях лечить пациента с помощью постоянных уровней антител с пониженном аффинностью к CD40L. Подобно этому,антитела с повышенной аффинностью к CD40L могут иметь преимущества при кратковременном лечении. Пути введения Блокаторы связыванияCD40:CD154,включая агенты, блокирующие CD154, которые используются в настоящем изобретении, можно вводить любым приемлемым с медицинской точки зрения путем. В зависимости от конкрет 002512 12 ных обстоятельств может быть желательным местное или системное введение. Предпочтительно, этот агент вводят парентеральным путем, таким как внутривенная, внутриартериальная, подкожная, внутримышечная, интраорбитальная, интравентрикулярная, интраперитонеальная, подкапсульная, интракраниальная, интраспинальная или интраназальная инъекция,инфузия или ингаляция. Этот агент также можно вводить путем имплантации инфузионной помпы или биосовместимого или биодеградируемого имплантата с замедленным высвобождением активного агента, в организм реципиента-хозяина, или до или после имплантации донорской ткани. Альтернативно, определенные соединения настоящего изобретения или содержащие их композиции могут подходить для перорального или энтерального введения. Некоторые другие соединения настоящего изобретения могут подходить для местного введения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения блокатор связыванияCD40:CD154 вводят реципиенту не напрямую, а в виде вектора или другого экспрессируемого генетического материала, кодирующего блокатор. Генетический материал интернализуется и экспрессируется в клетках или ткани реципиента, вырабатывая, таким образом, блокатор insitu. Например, подходящая конструкция нуклеиновой кислоты должная включать в себя последовательность, кодирующую одну или более цепей иммуноглобулина (Ig) МАb 5 с 8, как описано в патенте США 5 474 771. Другие подходящие конструкции должны включать в себя последовательности, кодирующие химерные или гуманизированные варианты цепей МАb 5 с 8 Ig или их антиген-связывающие фрагменты. Другие подходящие конструкции должны включать в себя последовательности, кодирующие часть или все другие специфичные в отношении CD154 МАb. Такая конструкция доставляется системно или местно, например, в участок поблизости от места имплантации инсулин-экспрессирующей ткани. Альтернативно, вектор или другой генетический материал, кодирующий блокатор, интернализуется в подходящую популяцию изолированных клеток для получения клеток-хозяев,продуцирующих блокатор. Эти клетки-хозяева затем имплантируются или переливаются реципиенту, или местно, или системно, для обеспечения выработки блокатора связыванияCD40:CD154 in situ. Подходящие клеткихозяева включают в себя культивируемые клетки, такие как иммортализованные клетки, а также клетки, полученные у реципиента (например,клетки периферической крови или лимфатических узлов, такие как натуральные киллеры 13 Композиция Обычно соединение (соединения), применяющееся в практическом осуществлении настоящего изобретения, суспендируют, растворяют или диспергируют в фармакологически приемлемом носителе или наполнителе. Получающаяся терапевтическая композиция не оказывает неблагоприятного воздействия на гомеостаз реципиента, в частности, на баланс электролитов. Так, примером носителя может быть нормальный физиологический солевой раствор(0,15 М NaCl, pH от 7,0 до 7,4). Другим примером носителя может быть 50 мМ фосфат натрия,100 мМ хлорид натрия. Многие другие приемлемые носители хорошо известны специалистам и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co.,990. Приемлемые носители могут включать в себя биосовместимые, инертные или биопоглощаемые соли, буферные агенты, олиго- или полисахариды, полимеры, агенты, улучшающие вязкость, консерванты и т.п. Любой блокатор связывания CD40:CD154,такой как агент, блокирующий CD154, который используется в практической осуществлении настоящего изобретения, помещают в композицию таким образом, чтобы обеспечивалась доставка фармацевтически эффективного или терапевтически эффективного количества или дозы,что представляет из себя количество, достаточное для оказания выраженного, предпочтительно благоприятного в медицинском отношении,воздействия на реципиента. Благоприятные в медицинском отношении эффекты должны включать в себя предотвращение, задержку или ослабление ухудшения или выраженное улучшение состояния здоровья реципиента. В качестве примера, титр ингибирующих антител,специфичных в отношении нужного экзогенного белкового лекарственного средства, можно подавить или понизить. Так, например, эффективное количество терапевтического соединения настоящего изобретения, такого как агент,блокирующий CD40:CD154154, представляет из себя любое количество, которое заметно восстанавливает терапевтическую эффективность белкового лекарственного средства. Оптимальным эффективным количеством является такое количество, которое практически освобождает пациента от противоадаптивных антител, которые вызывают синдром ингибирования. Дозировки и частота введения Количество и частота дозирования любого конкретного соединения, предназначенного для применения в практике настоящего изобретения, находится в компетенции специалистов в области медицины, таких как терапевты. Среднюю дозировку и схему введения устанавливают в ходе доклинических и клинических испытаний, которые включают в себя обширные, но рутинные исследования, направленные на определение эффективных, например, оптимальных 14 параметров введения для конкретного соединения. Даже после получения таких рекомендаций практикующий врач будет часто изменять эти дозировки для различных реципиентов, основываясь на различных соображениях, таких как возраст реципиента, состояние его здоровья,вес, пол и одновременное лечение другими лекарственными средствами. Определение эффективной дозы и схемы введения для каждого блокатора связывания CD40:CD154, который применяется для подавления отторжения трансплантата, является обычным вопросом для специалиста в области фармацевтики и медицины. Дозировки и продолжительность курса лечения должны быть достаточными для получения клинически благоприятного изменения одного или более показателей состояния здоровья реципиента. Примеры продолжительности курса лечения и схем дозирования представлены далее в результатах предварительных исследований,включенных в настоящий документ. Для иллюстрации соображений по поводу дозирования анти-CD154 соединения далее приводятся примеры стратегии введения антиСD154-МАb. Дозировки можно затем легко рассчитать для других типов соединенийблокаторов CD154 в общем, предполагаются однократные дозы приблизительно от 0,05 до 50 мг/кг веса тела пациента, наиболее часто, в пределах 1-20 мг/кг. Для начала терапии путем блокады CD154 в профилактических целях, когда пациент находится в состоянии ремиссии,или для неотложного лечения острого состояния эффективная доза Маb варьирует в пределах приблизительно от 1 мг/кг веса тела до 20 мг/кг веса тела, ежедневно или с интервалами от двух до пяти дней, в течение приблизительно трех недель. После этого терапию можно поддерживать путем прерывистого введения Маb в количестве приблизительно от 0,1 мг/кг веса тела до 20 мг/кг веса тела. С целями поддерживающего лечения интервал между введениями доз может варьировать приблизительно от одной недели до трех месяцев. В настоящее время предпочтителен интервал между введениями доз в один месяц (четыре недели). Терапию путем блокады CD154 можно поддерживать, если это желательно, сериями или в комбинации с обычной иммуносупрессивной терапией. Обычный иммунодепрессант(например, кортикостероид или ингибитор кальцинейрина) может вводиться совместно в любое время в течение терапии путем блокадыCD154, когда сочтет нужным лечащий врач. Альтернативно, Маb, блокирующие CD154,можно конъюгировать с обычно применяющимся для этой цели агентом. Это позволяет вводить обычный агент в меньшем количестве по сравнению с обычной дозировкой, например,приблизительно менее 50% от стандартной дозы, если агент вводится в качестве монотерапии. Соответственно, можно избежать многих по 15 бочных эффектов, связанных с этим агентом. Таким образом, согласно настоящему изобретению, Mab, блокирующие CD154, можно применять вместе с другими агентами, направленными на В-клетки, такими как анти-CD19, антиCD28 или анти- СD20-антитело (неконъюгированное или радиоактивно меченное), антагонисты IL-14, LJP394 (блокатор рецепторов LaJollaPharmaceuticals), IL-1116 (малая молекула Takeda) и анти-Ig идиотипические моноклональные антитела. Альтернативно эти комбинации могут включать агенты, нацеленные на Т-клетки и В-клетки, такие как CTLA4Ig, антагонисты IL2, антагонисты IL-4, антагонисты IL-6, антагонисты рецепторов, анти- CD80/ CD86 моноклональные антитела, TNF, антагонисты LFA1/ICAM, антагонисты VLA4/VCAM, бреквинар и конъюгаты IL-2 и токсина (например, DAB),преднизон, анти- CD3 Mab (OKT3), микофенолят мофетила(MMF), циклофосфамид и другие иммунодепрессанты, такие как блокаторы кальцинейринового сигнала, включая, но не ограничиваясь им такролимус (FK506). Комбинации могут также включать в себя агенты, нацеленные на Т-клетки, такие как антагонисты CD4,антагонисты CD2 и IL-12. Доклинические модельные системы для оценки схем лечения блокатором связыванияCD40:CD154 Предпочтительные в настоящее время примеры модельных систем для тестирования эффективности соединения, прерывающего связывание CD40:CD154 (например, анти-СD40L соединения или агента, блокирующего CD154,такого как МАb, обладающего специфичностью Маb 5 с 8), представлены ниже. В каждой системе можно сделать обычные модификации или приспособления, чтобы они соответствовали опубликованным методикам, необходимым для оценки воздействий, блокатора CD40:CD154 на состояние ингибирующих белок титров у экспериментального животного. Некоторые примеры модификаций упомянуты в следующих кратких резюме; однако, многие другие очевидные модификации очевидны для специалиста и подразумеваются настоящим документом. Модель гемофилии А на нокаутных мышах Недавно исследователи Американского Красного Креста вывели колонию мышей, нуллизиготных ("нокаутных") по нативному мышиному ФVIII. Bi et al. (1995), 10 Nature Genetics 119. У этих мышей имеются все болезненные проявления, свойственные гемофилии А человека. Более того, эта мышиная модель точно имитирует этиологию проявлений этой болезни: наследственное или врожденное отсутствие биологически активного нативного ФVIII. Болюсное введение ФVIII человека, способом,принятым при обычной заместительной терапии с помощью ФVIII, как сообщается, запускает выработку ингибирующих ФVIII антител у этих мышей. Quian et al. (1996), 88 Blood 656a(suppl.). Другие способы введения, особенно конструктивное замещение посредством интеграции аденовирусного вектора, кодирующего функциональный ФVIII, как представляется в настоящее время, представляют собой белковую терапию в менее иммуногенном контексте. Connely et al. (1998), 91 Blood 3273-3281. Воздействие агента,блокирующегоCD154, например, антимышиных CD154, на появление "высокоотвечающих особей" в популяции описанных выше мышей с гемофилией,можно оценивать следующим образом: антиген(ФVIII) можно инъецировать в виде болюсной дозы (например, 0,2 мкг) на день исследования 0 и 14. На 54 день исследования или около того,можно изъять образец крови и исследовать его(с помощью обычной методики иммуноферментного твердофазного анализа) на наличие ингибирующих ФVIII антител. После этого, испытуемой группе (например, 5 или более животных; приблизительно такое же количество животных может быть отобрано для создания одной или более подходящих контрольных групп) можно ввести подходящую дозу антимышиных CD154 (например, 250 мкг, в/б или в/в), например, на день исследования 55 и/или 57 или около того. Провокационную дозу ФVIII можно ввести на день исследования 56 или около того. После этого можно изъять образцы крови и исследовать их в соответствующие дни исследования для оценки развития и, в контрольной группе, подавления или реверсирования вторичного ответа ингибирующих антител против ФVIII. Например, кровь можно получать на день исследования 74, 81 и 96, или около того. С учетом некоторых индивидуальных различий среди животных экспериментальной группы ожидается, что терапия путем блокады CD154 будет значительно смягчать или подавлять вторичный гуморальный иммунитет в отношении ФVIII. Химерная мышиная модель SCID-чел Эта химерная мышиная модельная система, о которой первыми сообщили Mosier et al.(1998), 335 Nature 256-259, основывается на иммунологическом лечении (функциональном восстановлении) тяжелого сочетанного иммунодефицита (SCID)y мышей путем приживления нормальных лейкоцитов периферической крови (PBLs) человека, что приводит к формированию стабильной химеры мышь-человек. Эту систему применяют для многочисленных исследований поведения и динамических взаимодействий лимфоцитов человека in vivo. Важно, что эта модельная система применялась для изучения воздействия связывания CD40:CD154 на ответ нормальных лейкоцитов человека на мышиные эритроциты (которые использовали как модельный антиген). Chen et al. (1995), 155J. Immunol. 2833-2840. В этом исследовании было установлено, что анти-СD49 и анти 17 СD154-Маb обеспечивают понижающую регуляцию общей выработки Ig человека. Эта модельная система позволяет оценить воздействие анти-СD154 человека, например,чел 5 с 8, на Т-клетки человека in vivo, с использованием любого желаемого белка в качестве тест-антигена. В одной подходящей модификации, мышиные химеры SCID чел могут быть созданы путем приживления PBLs человека от лиц, страдающих гемофилией, таких как высокоотвечающие особи. Разумеется, этот подход может применяться с использованием PBLs от любого человека, страдающего синдромом ингибирования активности экзогенного белка. В случае мышей SCID-чел, полученных с помощью высокоотвечающей особи с гемофилией,подходящее количество мышей (например, от 2 до 5 или более) можно распределить в экспериментальные группы следующим образом: группа А (чел 5 с 8 и ФVIII); группа В (только чел 5 с 8); группа С (только ФVIII); группа D (только носитель); группа Е (контрольный Ig и ФVIII); группа F (только контрольный Ig). Испытуемое соединение и/или контроль смешивали с челЛПК ко времени приживления и вводили в/б на день исследования 2 и/или 4 или около того. Кинетику возникающего ингибирующего ФVIII ответа можно отслеживать с помощью стандартных методик (иммуноферментного твердофазного анализа) с отбором образцов крови с подходящими интервалами в течение несколько недель. Ожидалось, что лечение с помощью чел 5 с 8 смягчит или уничтожит вторичный гуморальный иммунитет к ФVIII. Модели на приматах, не являющихся человеком Модель AVONEX (IFN ) Макаки-резус или обезьяны Cynomologus разбивались на подходящие экспериментальные группы, например, по две-четыре обезьяны на группу, следующим образом: группа 1 (контрольный антиген (HAS); 50 мкг/кг и чел 5 с 8; 5 мг/кг), группа 2 (носитель и чел 5 с 8; 5 мг/кг),группа 3 (AVONEX; 50 мкг/кг и чел 5 с 8; 5 мг/кг), группа 4 (AVONEX; 50 мкг/кг и чел 5 с 8; 5 мг/кг), группа 5 (носитель и чел 5 с 8; 5 мг/кг). Группы 1, 2 и 3 получали чел 5 с 8, начиная со дня исследования 1 и приблизительно на каждый второй или третий день после этого. Группы 4 и 5 получали чел 5 с 8, начиная со дня исследования 17 и приблизительно на каждый второй или третий день после этого. Все группыAVONEX получали AVONEX q.o.d., начиная со дня исследования 3 или около того. Развитие и кинетику антител, ингибирующих AVONEX,отслеживали с помощью стандартных методик(иммуноферментного твердофазного анализа). Ожидались четкие различия между группамиAVONEX, леченными или не леченными с помощью чел 5 с 8. Конкретно, предварительное лечение с помощью чел 5 с 8, как ожидалось, значительно смягчит или устранит выработку анти 002512 18 тел, ингибирующих AVONEX. Отсроченное лечение с помощью чел 5 с 8, как ожидалось, будет значительно подавлять или реверсировать вторичный гуморальный иммунитет кAVONEX. Описанная выше модель может быть легко обычными способами адаптирована для оценки воздействия чел 5 с 8 или другого агента, блокирующего CD154, на первичные и/или вторичные ингибирующие ответы на другие модельные антигены, включая экзогенные белковые лекарственные средства. Например, могут быть осуществлены обычные, подходящие модификации протокола и уровней дозирования для оценки поведения ФVIII или другого фактора свертывания крови у приматов, получающих профилактические или терапевтические схемы лечения путем блокады CD154. Эквиваленты Настоящее изобретение можно практически осуществлять в других специфических формах, без отступления от его идеи или главных характеристик. Представленные выше варианты осуществления раскрытого в настоящем документе изобретения, таким образом, со всех точек зрения являются иллюстративными, а не ограничивающими. Объем настоящего изобретения, таким образом, указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в представленном выше описании, и все изменения, которые подпадают под значение и рамки эквивалентности формулы изобретения, охватываются настоящим изобретением. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ ослабления тяжести синдрома ингибирования экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту, страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где указанный синдром ингибирования белка вызван экзогенным белком,который является терапевтическим белком. 2. Способ подавления побочных эффектов синдрома ингибирования экзогенного белка,включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связыванияCD40:CD154 субъекту, страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома,где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где указанный синдром ингибирования белка вызван экзогенным белком, который является терапевтическим белком. 3. Способ предотвращения развития синдрома ингибирования экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту, страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где указанный синдром ингибирования белка вызван экзогенным белком, который является терапевтическим белком. 4. Способ задержки появления синдрома ингибирования экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту, страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где указанный синдром ингибирования белка вызван экзогенным белком,который является терапевтическим белком. 5. Способ ингибирования развития синдрома ингибирования экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту, страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где синдром ингибирования экзогенного белка вызван экзогенным белком, который является терапевтическим белком. 6. Способ реверсирования синдрома ингибирования экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту,страдающему указанным синдромом или входящему в группу повышенного риска развития указанного синдрома, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается сCD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где синдром ингибирования экзогенного белка вызван экзогенным белком,который является терапевтическим белком. 7. Способ сохранения терапевтической активности экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту,получающему лечение указанным экзогенным 20 белком, где указанный блокатор связыванияCD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается с CD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где синдром ингибирования экзогенного белка вызван экзогенным белком, который является терапевтическим белком. 8. Способ сохранения терапевтической активности экзогенного белка, включающий в себя стадию введения эффективного количества блокатора связывания CD40:CD154 субъекту,получающему лечение указанным экзогенным белком, на который у указанного субъекта развился иммунный ответ, где указанный блокатор связывания CD40:CD154 представляет собой антитело, которое специфически связывается сCD154, его антиген-связывающий фрагмент или производное и где синдром ингибирования экзогенного белка вызван экзогенным белком,который является терапевтическим белком. 9. Способ по п.8, при котором указанным антителом является моноклональное антитело. 10. Способ по п.9, при котором моноклональное антитело имеет антиген-специфические связывающие свойства антитела 5 с 8, продуцируемого АТСС подНВ 10916. 11. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,при котором экзогенный белок вводят для замещения эндогенного, но дефективного белка. 12. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,при котором экзогенный белок имеет практически ту же первичную структуру, что и соответствующий эндогенный белок, и вырабатывается изолированной клеткой-хозяином, несущей экспрессируемую рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный экзогенный белок. 13. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,при котором экзогенный белок имеет бактериальное происхождение. 14. Способ по п.11, при котором экзогенным белком является фактор свертывания крови. 15. Способ по п.14, при котором фактором свертывания крови является фактор VIII или фактор IX. 16. Способ по п.12, при котором экзогенным белком является гормон роста, фактор заживления ран, фактор роста, цитокин, лимфокин, фермент, фактор свертывания крови или компонент плазмы. 17. Способ по п.13, при котором экзогенным белком является стрептокиназа. 18. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,при котором субъектом является человек. 19. Способ по п.18, при котором человек страдает гемофилией. 20. Способ по любому из пп.1-8, при котором указанный терапевтический белок является аллергеном.