Низкомолекулярные ингибиторы mdm2

Изобретение относится к малым молекулам, которые функционируют как ингибиторы взаимодействия между р 53 и MDM2.(56) RU-C1-2084449 КАБАНКИН А.С. и др. Анализ связи структура - гепатозащитная активность производных индола. Химико-фармацевтический журнал, 2005, т. 39,4, М., ФОЛИУМ, с. 24-28,табл. 1, соединения 4, 10 (обучающая выборка),соединение 1 (контрольная выборка)Organic reactions (Hoboken, N.J., United States),48, 1996 [он-лайн], Найдено из БД ACS on STN,CA: 149:5550940, соединения с RN 159979-08-5,159979-09-6reducing agents. Organic reactions (Hoboken, N.J.,United States), 59 [он-лайн], Найдено из БД ACS(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ РИДЖЕНТС ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ МИЧИГАН (US) Предшествующий уровень техники Область изобретения Данное изобретение находится в области химии лекарственных средств. В частности, изобретение относится к малым молекулам, которые функционируют как антагонисты взаимодействия между р 53 иMDM2 (Murine Double Minute 2 - белок мышиных двойных микрохромосом 2), и к их применению в качестве нового класса терапевтических агентов для лечения рака и других заболеваний. Уровень техники Агрессивный фенотип раковой клетки является результатом ряда генетических и эпигенетических изменений, приводящих к нарушению регуляции внутриклеточных путей передачи сигнала (Ponder, Nature 411: 336 (2001. Общим для всех раковых клеток, однако, является их неспособность к выполнению апоптотической программы и отсутствие правильного апоптоза вследствие дефектов в нормальном механизме апоптоза является отличительным признаком рака (Lowe et al., Carcinogenesis 27: 485 (2000. Неспособность раковых клеток к выполнению апоптотической программы вследствие дефектов в нормальном механизме апоптоза, таким образом, часто связана с устойчивостью к апоптозу, индуцированному химиотерапией, облучением или иммунотерапией. Первичная или приобретенная устойчивость рака человека различного происхождения к современным терапевтическим протоколам вследствие дефектов апоптоза является основной проблемой в современной терапии рака (Lowe et al., Carcinogenesis 27: 485 (2000); Nicholson, Nature 407: 810 (2000. Соответственно, настоящие и будущие усилия в направлении проектирования и разработки новых, специфичных к молекулярной мишени противораковых терапий для улучшения выживаемости и качества жизни больных раком должны включать стратегии,которые специфично направлены на устойчивость раковых клеток к апоптозу. В этом отношении направленность на критические негативные регуляторы, которые играют центральную роль в прямом ингибировании апоптоза в раковых клетках, представляет собой высокоперспективную терапевтическую стратегию для разработки новых противораковых лекарственных средств. Опухолевый супрессор р 53 играет центральную роль в контроле прохождения клеточного цикла и апоптоза (Vogelstem et al., Nature 408: 307 (2000. Он является привлекательной терапевтической мишенью для разработки противораковых лекарственных средств, поскольку его активность как опухолевого супрессора можно стимулировать для уничтожения опухолевых клеток (Vogelstein et al., Nature 408: 307(2000); Chene, Nat. Rev. Cancer 3: 102 (2003. Новым подходом к стимуляции активности р 53 является стимуляция посредством ингибирования его взаимодействия с белком MDM2 с использованием непептидных низкомолекулярных ингибиторов (Chene, Nat. Rev. Cancer 3: 102 (2003); Vassilev et al., Science 303: 844 (2004. MDM2 и р 53 составляют часть саморегулирующейся петли обратной связи (Wu et al.,Genes Dev. 7: 1126 (1993. Транскрипция MDM2 активируется р 53, и MDM2, в свою очередь, ингибирует активность р 53 посредством по меньшей мере трех механизмов (Wu et al., Genes Dev. 7: 1126 (1993. Во-первых, белок MDM2 непосредственно связывается с доменом трансактивации р 53 и посредством этого ингибирует р 53-опосредованную трансактивацию. Во-вторых, белок MDM2 содержит сигнальную последовательность ядерного экспорта и при связывании с р 53 индуцирует экспорт р 53 из ядра, предотвращая связывание р 53 с ДНК-мишенями. В-третьих, белок MDM2 является Е 3 убиквитинлигазой и при связывании с р 53 способен стимулировать распад р 53. Следовательно, посредством функционирования в качестве эффективного эндогенного клеточного ингибитора активности р 53 MDM2 эффективно ингибирует р 53-опосредованный апоптоз, остановку клеточного цикла и репарацию ДНК. Таким образом, низкомолекулярные ингибиторы, которые связываются с MDM2 и блокируют взаимодействие между MDM2 и р 53, могут стимулировать активность р 53 в клетках с функциональным р 53 и стимулировать р 53 опосредованные клеточные эффекты, такие как остановка клеточного цикла, апоптоз или репарация ДНК(Chene, Nat. Rev. Cancer 3: 102 (2003); Vassilev et al., Science 303: 844 (2004. Хотя высокоаффинные ингибиторы на основе пептидов ранее были успешно сконструированы(Garcia-Echeverria et al., Med. Chem. 43: 3205 (2000, эти ингибиторы являются молекулами, подобными лекарствам, в связи с плохими клеточной проницаемостью и биодоступностью in vivo. Несмотря на интенсивные усилия фармацевтической промышленности, стратегии высокопроизводительного скрининга имели весьма ограниченный успех при идентификации эффективных непептидных низкомолекулярных ингибиторов. Соответственно, существует необходимость в непептидных, подобных лекарствам, низкомолекулярных ингибиторах взаимодействия p53-MDM2. Разработка непептидных низкомолекулярных ингибиторов, которые направлены на взаимодействиеp53-MDM2, продолжается в настоящее время, будучи привлекательной стратегией для разработки противораковых лекарственных средств (Chene, Nat. Rev. Cancer 5: 102 (2003); Vassilev et al., Science 303: 844 (2004. Структурная основа данного взаимодействия установлена с помощью рентгеновской кристаллографии (Kussie et al., Science 274: 948 (1996. Кристаллическая структура показывает, что взаимодействие между р 53 и MDM2 прежде всего опосредована тремя гидрофобными остатками (Phe19, Trp23 и Leu26) p53 и небольшим глубоким гидрофобным углублением MDM2. Это гидрофобное углубление является идеальным сайтом для проектирования низкомолекулярных ингибиторов, которые могут нарушать взаимодействие р 53 и MDM2 (Chene, Nat. Rev. Cancer 5: 102 (2003. Краткое изложение сущности изобретения В целом считается, что неспособность раковых клеток или их поддерживающих клеток претерпевать апоптоз в ответ на генетические повреждения или воздействия индукторов апоптоза (таких как противораковые агенты и облучение) является главным фактором в возникновении и прогрессировании рака. Индукцию апоптоза в раковых клетках или в их поддерживающих клетках (например, в неоваскулярных клетках сосудистой системы опухоли) считают универсальным механизмом действия практически всех эффективных лекарственных средств для терапии рака или лучевых терапий на рынке или в практике в настоящее время. Одной из причин неспособности клетки претерпевать апоптоз является снижение активности опухолевого супрессора р 53, которое во многих случаях является следствием ингибиторного действия MDM2 на р 53 в опухолевых клетках, содержащих функциональный р 53. Индукция активности р 53 приводит в результате к изменениям в биохимических путях апоптоза, а также регуляции клеточного цикла. Согласно настоящему изобретению предполагается, что воздействие на животных, страдающих раком, терапевтически эффективных количеств лекарственного средства (средств) (например, малых молекул), которое стимулирует функцию(и) р 53 и родственных р 53 белков (например, р 63, р 73) посредством ингибирования взаимодействия между р 53 или родственными р 53 белками и MDM2 или родственнымиMDM2 белками (например, MDMX) будет непосредственно ингибировать рост раковых клеток или поддерживающих клеток и/или делать такие клетки как популяцию более чувствительными к противораковым терапевтическим лекарственным средствам или лучевым терапиям, индуцирующим клеточную гибель. В частности, ингибиторы по изобретению могут продлевать период полураспада р 53, препятствуя взаимодействию р 53 с MDM2, что в норме стимулировало бы распад р 53. Согласно настоящему изобретению предполагается, что ингибиторы взаимодействия между р 53 или родственными р 53 белками иMDM2 или родственными MDM2 белками удовлетворят имеющуюся необходимость в лечении множества типов рака, как при введении в качестве монотерапии для индукции ингибирования клеточного роста, апоптоза и/или остановки клеточного цикла в раковых клетках, так при введении во временном взаимодействии с дополнительным агентом(ами), таким как другие противораковые терапевтические лекарственные средства или лучевая терапия, индуцирующие клеточную гибель или прерывающие клеточный цикл (комбинированная терапия), делая чувствительными к осуществлению апоптотической программы долю раковых клеток или поддерживающих клеток, большую по сравнению с соответствующей долей клеток у животного, обработанного только противораковым терапевтическим лекарственным средством или лучевой терапией отдельно. В некоторых воплощениях изобретения комбинированная терапия животных терапевтически эффективным количеством соединения по настоящему изобретению и курсом противоракового агента или лучевой терапии производит более высокий ответ на опухоль и большую клиническую пользу у таких животных по сравнению с животными, которые подвергались лечению соединением или противораковыми лекарственными средствами/лучевой терапией отдельно. Иначе говоря, поскольку эти соединения будут снижать апоптотический порог всех клеток, доля клеток, которые будут успешно выполнять апоптотическую программу в ответ на индуцирующую апоптоз активность противораковых лекарственных средств/облучения, повышается. Альтернативно, соединения по настоящему изобретению будут применять, чтобы обеспечивать возможность введения более низкой и, следовательно, менее токсичной и лучше переносимой дозы противоракового агента и/или облучения для получения такого же ответа на опухоль/клинической пользы как общепринятая доза противоракового агента и/или облучения отдельно. Поскольку дозы для всех одобренных противораковых лекарственных средств и лучевых терапий известны, в настоящем изобретении рассматриваются их различные комбинации с настоящими соединениями. Также, поскольку соединения по настоящему изобретению могут действовать, по меньшей мере частично, посредством стимуляции проапоптотических и/или ингибирующих клеточный цикл видов активности р 53 и родственных р 53 белков, время воздействия на раковые клетки и поддерживающие клетки терапевтически эффективных количеств этих соединений должно быть подобрано таким образом,чтобы совпадать с попытками клеток осуществить апоптотическую программу в ответ на противораковый агент или лучевую терапию. Таким образом, в некоторых воплощениях введение композиций по настоящему изобретению, связанное определенными временными взаимоотношениями, обеспечивает особенно эффективную терапевтическую практику. В других воплощениях изобретения ингибиторы взаимодействия между р 53 или родственными р 53 белками и MDM2 и родственными MDM2 белками могут защитить нормальные (например, не являющиеся гиперпролиферативными) клетки от токсических эффектов некоторых химиотерапевтических агентов и облучения, возможно, благодаря способности этих ингибиторов индуцировать остановку клеточного цикла. В частности, ингибиторы по изобретению могут вызывать остановку клеточного цикла в клетках, содержащих р 53 дикого типа, не оказывая при этом эффект на раковые клетки, содержащие мутированный или делетированный р 53. Этот дифференциальный защитный эффект может дать возможность более эффективного лечения рака благодаря возможности применения более высоких доз химиотерапевтических агентов или более длительного лечения ими или возможности лечения без повышения токсических побочных эффектов такого лечения. Настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются полезными для ингибирования взаимодействия между р 53 или родственными р 53 белками и MDM2 и родственными MDM2 белками и повышения чувствительности клеток к индукторам апоптоза и/или остановки клеточного цикла. Изобретение относится к применению соединений по изобретению для индукции остановки клеточного цикла и/или апоптоза в клетках, содержащих функциональный белок р 53 или белки, родственные р 53. Изобретение также относится к применению соединений по изобретению для сенсибилизации клеток к дополнительному агенту(ам), такому как индукторы апоптоза и/или остановки клеточного цикла, и химической защиты нормальных клеток посредством индукции остановки клеточного цикла перед лечением химиотерапевтическими агентами. В одном воплощении изобретение относится к способам придания нормальной клетке устойчивости к химиотерапевтическим агентам или лечению, при которых клетку приводят в контакт с соединением по изобретению. В одном воплощении изобретение относится к способам защиты нормальных клеток у животного с гиперпролиферативным заболеванием от токсических побочных эффектов химиотерапевтических агентов или лечения, при которых указанному животному вводят соединение по изобретению. В конкретном воплощении изобретение направлено на лечение, облегчение или профилактику расстройств, побочных эффектов или состояний, вызванных введением химиотерапевтических агентов в нормальные (не раковые) клетки, путем введения животному, подвергающемуся химиотерапии, соединения по настоящему изобретению. Примеры таких расстройств и состояний, вызванных химиотерапией, включают без ограничения воспаление слизистой оболочки, стоматит, ксеростомию, желудочно-кишечные расстройства и алопецию. Соединения по изобретению полезны для лечения, облегчения или профилактики расстройств, таких как те, которые способны отвечать на индукцию апоптотической клеточной гибели, например, расстройств, характеризующихся нарушением регуляции апоптоза, включая гиперпролиферативные заболевания, такие как рак. В некоторых воплощениях эти соединения могут применяться для лечения, облегчения или профилактики рака, который характеризуется устойчивостью к противораковой терапии (например, тех раковых клеток, которые являются химиорезистентными, радиорезистентными, гормонорезистентными и т.п.). В других воплощениях эти соединения могут применять для лечения гиперпролиферативных заболеваний, характеризующихся экспрессией функционального р 53 или родственных р 53 белков. В других воплощениях изобретение относится к применению соединений по изобретению для защиты нормальных (например, не являющихся гиперпролиферативными) клеток от токсических побочных эффектов химиотерапевтических агентов и лечения путем индукции остановки клеточного цикла в этих клетках. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 показано моделирование нового класса ингибиторов MDM2 на основе спиротрипростатина А. На фиг. 2 А и 2 Б показана предсказанная модель связывания соединений 1 а и 1d с MDM2. На фиг. 3 А показана кривая насыщения связывания PMDM6-F с белком MDM2. На фиг. 3 Б показаны кривые конкурентного связывания немеченого флуоресцентного зондаPMDM6 и нативного пептида р 53 с белком MDM2. На фиг. 4 показаны кривые конкурентного связывания и значения Ki ингибиторов MDM2, определенных с использованием анализа связывания на основе ФП (флуоресцентной поляризации). На фиг. 5 показаны кривые конкурентного связывания нескольких ингибиторов взаимодействия р 53 и MDM2. На фиг. 6 показано прерывание взаимодействия р 53 и MDM2 с помощью Ke-43. На фиг. 7 показана ингибиторная активность Ke-43 в отношении роста клетках рака ободочной кишки с р 53 дикого типа или без него и в нормальных клетках. На фиг. 8 показан Вестерн-блот-анализ экспрессии р 53 и продуктов его гена-мишени MDM2 и р 21 в раковых клетках в ответ на Ke-43. На фиг. 9 А и 9 Б показана клеточная гибель и апоптоз, индуцированный Ke-43 и Ke-61 в раковых клетках и в нормальных клетках. На фиг. 10 показано прогрессирование клеточного цикла клеточных линий рака ободочной кишки,экспрессирующих р 53 дикого типа или мутантный р 53, и нормальных клеток ободочной кишки после обработки Ke-43 и нутлином-3. Подробное описание изобретения Термины "противораковый агент" и "противораковое лекарственное средство", как их используют здесь, относятся к любым терапевтическим агентам (например, химиотерапевтическим соединениям и/или соединениям для молекулярной терапии), антисенс-терапиям, лучевым терапиям или хирургическим вмешательствам, применяемым при лечении гиперпролиферативных заболеваний, таких как рак(например, у млекопитающих). Термин "пролекарство", как его используют здесь, относится к фармакологически неактивному производному исходной молекулы "лекарственного средства", которое требует биологического преобразования (например, либо спонтанного, либо ферментативного) внутри физиологической системымишени с высвобождением или с превращением (например, ферментативным, физиологическим, меха-3 019566 ническим, электромагнитным путем) пролекарства в активное лекарственное средство. Пролекарства разрабатывают, чтобы преодолеть проблемы, связанные со стабильностью, токсичностью, отсутствием специфичности или ограниченной биодоступностью. Некоторые примеры пролекарств содержат саму молекулу активного лекарственного средства и маскирующую химическую группу (например, группу,которая обратимо подавляет активность лекарственного средства). Некоторые предпочтительные пролекарства представляют собой варианты или производные соединений, которые имеют группы, расщепляемые в метаболических условиях. Некоторые примеры пролекарств становятся фармацевтически активными in vivo или in vitro, когда они претерпевают сольволиз в физиологических условиях или претерпевают ферментативное разрушение или другое биологическое преобразование (например, фосфорилирование, гидрогенизацию, дегидрогенизацию, гликозилирование). Пролекарства часто имеют преимущества в отношении растворимости, тканевой совместимости или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (см., например, Bundgard, Design of Prodrugs, p. 7-9, 21-24, Elsevier, AmsterdamDiego, CA (1992. Обычные пролекарства включают производные кислот, такие как эфиры, полученные путем взаимодействия исходных кислот с подходящим спиртом (например, низшим алканолом), амиды,полученные путем взаимодействия исходного кислого соединения с амином, или основные группы, прореагировавшие с образованием ацилированного производного основания (например, низшего алкиламида). Термин "фармацевтически приемлемая соль", как его используют здесь, относится к любой соли(например, полученной путем взаимодействия с кислотой или основанием) соединения по настоящему изобретению, которая является физиологически толерантной у животного-мишени (например, млекопитающего). Соли соединений по настоящему изобретению могут быть образованы из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, но не ограничиваются указанным, соляную, бромисто-водородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-пара-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную,метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, сульфоновую, нафталин-2 сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и т.п. Другие кислоты, такие как щавелевая, хотя сами не являются фармацевтически приемлемыми, могут использоваться при получении солей, полезных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты. Примеры оснований включают, но не ограничиваются указанным, гидроксиды щелочных металлов(например, натрия), гидроксиды щелочно-земельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW4, где W представляет собой С 1-4 алкил и т.п. Примеры солей включают, но не ограничиваются указанным, ацетат, адипат, альгинат, аспартат,бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, флюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, хлорид, бромид, йодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, мезилат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и т.п. Другие примеры солей включают анионы соединений по настоящему изобретению, компаундированные с подходящим катионом, таким как Na+, NH4+ и NW4+ (где W представляет собой группу С 1-4 алкил) и т.п. Для терапевтического применения соли соединений по настоящему изобретению рассматривают как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, могут также найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения. Термин "терапевтически эффективное количество", как его используют здесь, относится к количеству терапевтического агента, достаточному для того, чтобы привести в результате к облегчению одного или более чем одного симптома расстройства, либо провести профилактику прогрессирования этого расстройства, либо вызвать регрессию этого расстройства. Например, в отношении лечения рака терапевтически эффективное количество предпочтительно обозначает количество терапевтического агента, которое снижает скорость опухолевого роста, уменьшает массу опухоли, уменьшает число метастазов, увеличивает время до прогрессирования опухоли или увеличивает продолжительность жизни по меньшей мере на 5%, предпочтительно по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100%. Термины "сенсибилизировать" и "сенсибилизирующий", как их используют здесь, относится к тому, чтобы придать животному или клетке внутри животного посредством введения первого агента большую чувствительность или большую реактивность в отношении биологических эффектов (например,стимуляции или задержки аспекта клеточной функции, включающей, но не ограниченной, деление клет-4 019566 ки, клеточный рост, пролиферацию, инвазию, ангиогенез, некроз или апоптоз) второго агента. Сенсибилизирующий эффект первого агента на клетку-мишень можно измерить как разницу требуемых биологических эффектов (например, стимуляции или задержке аспекта клеточной функции, включающей, но не ограниченной, деление клетки, клеточный рост, пролиферацию, инвазию, ангиогенез, некроз или апоптоз), наблюдаемых при введении второго агента с введением и без введения первого агента. Ответ сенсибилизированной клетки может быть повышен по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 300%,по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 450% или по меньшей мере на 500% по сравнению с ответом в отсутствие первого агента. Термин "нарушение регуляции апоптоза", как его используют здесь, относится к любому изменению в способности (например, предрасположенности) клетки претерпевать клеточную гибель посредством апоптоза. Нарушение регуляции апоптоза связано с или вызвано рядом состояний, неограничивающие примеры которых включают аутоиммунные расстройства (например, системную красную волчанку,ревматоидный артрит, болезнь трансплантат против хозяина, тяжелую миастению или синдром Шегрена), хронические воспалительные состояния (например, псориаз, астму или болезнь Крона), гиперпролиферативные расстройства (например, опухоли, В-клеточные лимфомы или Т-клеточные лимфомы), вирусные инфекции (например, герпес, папиллому или ВИЧ) и другие состояния, такие как остеоартрит и атеросклероз. Следует отметить, что, когда нарушение регуляции вызвано вирусной инфекцией или связано с ней, эта вирусная инфекция может быть или может не быть обнаруживаемой в момент, когда возникает или наблюдается нарушение регуляции. Т.е. индуцированное вирусом нарушение регуляции может возникнуть даже после исчезновения симптомов вирусной инфекции. Термин "функциональный р 53", как его используют здесь, относится к р 53 дикого типа, экспрессируемому на нормальных, высоких или низких уровнях, и к мутантному р 53, который сохраняет по меньшей мере 5% активности р 53 дикого типа, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50% или более активности дикого типа. Термин "родственный р 53 белок", как его используют здесь, относится к белкам, которые имеют по меньшей мере 25% гомологии последовательности с р 53, обладают активностью опухолевого супрессора и ингибируются в результате взаимодействия с MDM2 или родственными MDM2 белками. Примеры родственных р 53 белков включают, но не ограничиваются указанным, р 63 и р 73. Термин "родственный MDM2 белок", как его используют здесь, относится к белкам, которые имеют по меньшей мере 25% гомологии последовательности с MDM2 и взаимодействуют с р 53 или родственными р 53 белками и ингибируют их. Примеры родственных MDM2 белков включают, но не ограничиваются указанным, MDMX (murine double minute X) и HDM2 (human double minute - белок человеческих двойных микрохромосом 2). Термин "гиперпролиферативное заболевание", как его используют здесь, относится к любому состоянию, при котором локализованная популяция пролиферирующих клеток у животного не управляется обычными ограничениями нормального роста. Примеры гиперпролиферативных расстройств включают опухоли, новообразования, лимфомы и т.п. Новообразование называют доброкачественным, если оно не претерпевает инвазию или метастаз, и злокачественным, если оно претерпевает любое из них. "Метастатическая" клетка означает, что эта клетка может проникать в соседние структуры организма и разрушать их. Гиперплазия представляет собой форму клеточной пролиферации, в которую вовлечено увеличение числа клеток в ткани или органе без значительного изменения в структуре или функции. Метаплазия представляет собой форму регулируемого клеточного роста, при которой один тип полностью дифференцированных клеток замещает другой тип дифференцированных клеток. Патологический рост активированных лимфоидных клеток часто приводит в результате к аутоиммунному расстройству или к хроническому воспалительному состоянию. Как его используют здесь, термин "аутоиммунное расстройство" относится к любому состоянию, при котором организм производит антитела или иммунные клетки, которые распознают собственные молекулы, клетки или ткани организма. Неограничивающие примеры аутоиммунных расстройств включают аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, болезнь Бергера или IgA-нефропатию, глютеновую энтеропатию, синдром хронической усталости, болезнь Крона, дерматомиозит, фибромиалгию, болезнь трансплантат против хозяина, болезнь Грейвса, тиреоидит Хасимото, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру,плоский лишай, рассеянный склероз, тяжелую миастению, псориаз, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, склеродерму, синдром Шегрена, системную красную волчанку, диабет типа 1, неспецифический язвенный колит, витилиго и т.п. Термин "неопластическое заболевание", как его используют здесь, относится к любому аномальному росту клеток, который является либо доброкачественным (нераковым), либо злокачественным (раковым). Термин "нормальная клетка", как его используют здесь, относится к клетке, которая не претерпевает аномальный рост или деление. Нормальные клетки являются нераковыми и не составляют часть како-5 019566 го-либо гиперпролиферативного заболевания или расстройства. Термин "противоопухолевый агент", как его используют здесь, относится к любому соединению,которое задерживает пролиферацию, рост или распространение новообразования-мишени (например,злокачественного). Термины "проводить профилактику", "профилактический" и "профилактика", как их используют здесь, относятся к снижению встречаемости патологических клеток (например, гиперпролиферативных или неопластических клеток) у животного. Профилактика может быть полной, например, полное отсутствие патологических клеток у субъекта. Профилактика может быть также частичной, такой, чтобы встречаемость патологических клеток у субъекта была меньше, чем была бы встречаемость без настоящего изобретения. Термин "агенты, модулирующие апоптоз", как его используют здесь, относится к агентам, которые вовлечены в модулирование (например, ингибирование, уменьшение, увеличение, стимуляцию) апоптоза. Примеры агентов, модулирующих апоптоз, включают белки, которые содержат домены клеточной гибели, например, но не ограничиваясь указанным, Fas/CD95, TRAMP (tyrosine-rich acidic matrix protein богатый тирозином кислый белок матрикса), TNF R1 (tumor necrosis factor receptor - рецептор фактора некроза опухоли), DR1 (down regulator of transcription 1 - негативный регулятор транскрипции 1), DR2,DR3, DR4, DR5, DR6, FADD (Fas-associated death domain - домен смерти, ассоциированный с Fas) и RIP(receptor-interacting protein - белок, взаимодействующий с рецептором). Другие примеры агентов, модулирующих апоптоз, включают, но не ограничены указанным, TNF (tumor necrosis factor- фактор некроза опухоли), лиганд Fas, антитела к Fas/CD95 и другим рецепторам семейства TNF, TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand - лиганд, индуцирующий апопотоз, связанный с фактором некроза опухоли, также известный как лиганд Аро 2 или Apo2L/TRAIL), антитела к рецепторам TRAIL 1 или 2 (TRAIL-R1 или TRAIL-R2), Bcl-2, р 53, ВАХ, BAD, Akt, CAD, PI3 (инозитол-3-фосфат) киназу, Р 1 и белки каспазы. Модулирующие агенты в широком смысле включают агонисты и антагонисты рецепторов семейства TNF и лиганды семейства TNF. Агенты, модулирующие апоптоз, могут быть растворимыми или связанными с мембраной (например, лиганд или рецептор). Предпочтительные агенты, модулирующие апоптоз, являются индукторами апоптоза, такими как TNF или лиганд, родственный TNF, в частности лиганд TRAMP, лиганд Fas/CD95, лиганд TNFR-1 или TRAIL. Некоторые из соединений по настоящему изобретению могут существовать в виде стереоизомеров,включая оптические изомеры. В изобретение включены все стереоизомеры, как в виде чистых препаратов индивидуального стереоизомера и обогащенных препаратов каждого, так и рацемических смесей таких стереоизомеров, а также индивидуальные энантиомеры, которые можно разделить в соответствии со способами, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Соединения и способы по настоящему изобретению будут лучше понятны в связи с приведенными ниже схемами синтеза, которые иллюстрируют способы, которыми можно получить соединения по изобретению. Исходные вещества могут быть получены из коммерческих источников, либо получены с помощью детально разработанных и отписанных в литературе способов, известных обычным специалистам в данной области техники. Обычным специалистам в данной области техники будет очевидно, что соединения, определенные выше, можно синтезировать путем замены подходящих реагентов и агентов в способах синтеза, показанных ниже. Ингибиторы взаимодействия между р 53 или родственными р 53 белками и MDM2 или родственными MDM2 белками согласно настоящему изобретению можно применять для индукции апоптоза при любом расстройстве, которое можно лечить, облегчать или против которого можно провести профилактику посредством индукции апоптоза. В одном воплощении эти ингибиторы можно использовать для индукции апоптоза в клетках, содержащих функциональный р 53 или родственные р 53 белки. В некоторых воплощениях соединение вводят после терапевтического или противоракового агента,например через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 или 18 ч, через 1, 2, 3, 4, 5 или 6 суток или через 1, 2, 3 или 4 недели после введения терапевтического или противоракового агента. В некоторых воплощениях соединение и терапевтический или противораковый агент вводят согласованно, но с различным режимом, например,соединение вводят ежесуточно, тогда как терапевтический или противораковый агент вводят один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели. В других воплощениях соединение вводят один раз в неделю, тогда как терапевтический или противораковый агент вводят ежесуточно, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели. Композиции в объеме данного изобретения включают все композиции, где соединения по настоящему изобретению содержатся в количестве, которое является эффективным для достижения его предназначенной цели. Хотя индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных интервалов эффективных количеств каждого компонента находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Типично соединения можно вводить млекопитающим, например, людям, перорально в дозе от 0,0025 до 50 мг/кг массы тела млекопитающего, подлежащего лечению, в сутки, или эквивалентное количество фармацевтически приемлемой соли для расстройств, которые отвечают на индукцию апоптоза. Предпочтительно для лечения, облегчения или профилактики таких расстройств вводят перо-6 019566 рально от примерно 0,01 до примерно 25 мг/кг. Для внутримышечной инъекции доза обычно составляет примерно половину пероральной дозы. Например, подходящая внутримышечная доза будет составлять от примерно 0,0025 до примерно 25 мг/кг, и наиболее предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 5 мг/кг. Стандартная пероральная доза может содержать от примерно 0,01 до примерно 1000 мг, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 100 мг соединения. Стандартную дозу можно вводить один или более чем один раз в сутки в виде одной или более таблетки или капсулы, каждая из которых содержит от примерно 0,1 до примерно 10 мг, предпочтительно от примерно 0,25 до 50 мг соединения или его сольватов. В местном препарате соединение может присутствовать в концентрации от примерно 0,01 до 100 мг на 1 г носителя. В предпочтительном воплощении соединение присутствует в концентрации примерно 0,07-1,0 мг/мл, более предпочтительно примерно 0,1-0,5 мг/мл, наиболее предпочтительно примерно 0,4 мг/мл. Помимо введения соединения непосредственно в виде химического вещества, соединения по изобретению можно вводить как часть фармацевтического препарата, содержащего подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают обработку соединений с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтике. Предпочтительно препараты, в частности те препараты, которые можно вводить перорально или местным путем, и те, которые можно применять для предпочтительного типа введения, такие как таблетки, драже, леденцы медленного высвобождения и капсулы, полоскания для рта и промывания для рта, гели, жидкие суспензии, ополаскиватели для волос, гели для волос, шампуни, а также препараты, которые можно вводить ректально, такие как суппозитории, в также подходящие растворы для введения путем внутривенной инфузии, инъекции, местным или пероральным путем, содержат от примерно 0,01 до 99%, предпочтительно от примерно 0,25 до 75% активного соединения(й), вместе с эксципиентом. Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить любому животному, которое может испытывать благоприятные эффекты соединений по изобретению. Большинство таких животных составляют млекопитающие, например люди, хотя изобретение не предназначено для такого ограничения. Другие животные включают животных, подвергающихся ветеринарному лечению (коров, овец, свиней, лошадей, собак, кошек и т.п.). Соединения и их фармацевтические композиции можно вводить любыми способами, которые достигают предназначенной цели. Например, введение можно осуществлять парентеральным, подкожным,внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, трансдермальным, трансбуккальным, подоболочечным, внутричерепным, интраназальным или местным путем. Альтернативно или одновременно введение можно осуществлять пероральным путем. Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы реципиента, вида применяющегося одновременно лечения, если оно есть, частоты лечения и природы желаемого эффекта. Фармацевтические препараты по настоящему изобретению готовят способом, который сам по себе известен, например, с помощью общепринятых процессов смешивания, грануляции, изготовления драже,растворения или лиофилизации. Таким образом, фармацевтические препараты для перорального применения можно получить путем объединения активных соединений с твердыми эксципиентами, возможного измельчения полученной в результате смеси и обработки смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно или необходимо, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, наполнители, такие как сахариды, например лактоза или сахароза, маннит или сорбит, препараты целлюлозы и/или фосфаты кальция, например трикальция фосфат или кальция гидрофосфат, а также связующие агенты, такие как крахмальная паста, с использованием, например, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала, рисового крахмала, картофельного крахмала, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, натрийкарбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона, если желательно, могут быть добавлены разрыхляющие агенты, такие как вышеупомянутые крахмалы, а также карбоксиметил-крахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Вспомогательными веществами являются, среди прочего, агенты, регулирующие сыпучесть, и смазывающие агенты,например кремнезем, тальк, стеариновая кислота или ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или полиэтиленгликоль. Сердцевины драже обеспечены подходящими покрытиями, которые, если желательно, являются устойчивыми к желудочным сокам. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахаридов, которые могут, возможно, содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакировочные растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В целях изготовления покрытий, устойчивых к желудочным сокам, используют растворы подходящих препаратов целлюлозы, таких как ацетофталат целлюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. Красящие вещества или пигменты можно добавлять в покрытия таблеток или драже, например, для идентификации или с целью характеристики доз активного соединения. Другие фармацевтические препараты, которые можно применять перорально, включают заполненные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Эти заполненные капсулы могут содержать активные соединения в форме гранул, которые можно смешивать с наполнителями, такими как лактоза,связующими агентами, такими как крахмалы, и/или смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния, и, возможно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий вазелин. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы. Возможные фармацевтические препараты, которые можно применять ректально, включают, например, суппозитории, которые состоят из комбинации одного или более чем одного из активных соединений с основой суппозитория. Подходящими основами суппозитория являются, например, натуральные или синтетические триглицериды или парафиновые углеводороды. Кроме того, также возможно применять желатиновые ректальные капсулы, которые состоят из комбинации активных соединений с основой. Подходящие вещества основы включают, например, жидкие триглицериды, полиэтиленгликоли или парафиновые углеводороды. Пригодные препараты для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимых солей и щелочных растворов. Кроме того,можно вводить суспензии активных соединений в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Пригодные липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат, либо триглицериды, либо полиэтиленгликоль-400. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включающие, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Возможно, суспензия может также содержать стабилизаторы. Препараты местных композиций по данному изобретению готовят предпочтительно в виде масел,кремов, лосьонов, мазей и т.п. путем выбора подходящих носителей. Подходящие носители включают растительные или минеральные масла, белый вазелин (белый мягкий парафин), жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и высокомолекулярный спирт (выше, чем С 12). Предпочтительными носителями являются те, в которых растворим активный ингредиент. Можно также включать эмульгаторы, стабилизаторы, увлажнители и антиоксиданты, а также агенты, придающие цвет или аромат, если желательно. Дополнительно в этих местных препаратах можно использовать усилители трансдермальной проницаемости. Примеры таких усилителей можно найти в патентах США 3989816 и 4444762. Препараты в виде кремов предпочтительно готовят из смеси минерального масла, самоэмульгирующегося пчелиного воска и воды, с которой смешивают активный ингредиент, растворенный в небольшом количестве масла, такого как миндальное масло. Типичным примером такого крема является крем, который включает примерно 40 частей (ч.) воды, примерно 20 ч. пчелиного воска, примерно 40 ч. минерального масла и примерно 1 ч. миндального масла. Препараты в виде мазей можно готовить, смешивая раствор активного ингредиента в растительном масле, таком как миндальное масло, с теплым мягким парафином и оставляя эту смесь остывать. Типичным примером такой мази является мазь, которая включает примерно 30 мас.% миндального масла и примерно 70 мас.% белого мягкого парафина. Лосьоны обычно можно готовить путем растворения активного ингредиента в подходящем высокомолекулярном спирте, таком как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают, способы и композиции по настоящему изобретению. Другие пригодные модификации и адаптации ряда условий и параметров, которые обычно встречаются в клинической терапии и которые очевидны специалистам в данной области техники, находятся в пределах сущности и объема изобретения. Пример 1. Моделирование ингибиторов MDM2. Поскольку многие противораковыелекарственные средства либо представляют собой натуральные продукты, либо основной активный компонент лекарственного средства имеет происхождение из натуральных продуктов, провели поиск натуральных продуктов, которые могли бы дать новую основу для проектирования соединений, способных к ингибированию взаимодействия между р 53 и MDM2. Компьютерные ограничивающие исследования проводили, используя программу GOLD (версия 2.1) с функцией соответствия ChemScore. Структуры лигандов проектировали с помощью SYBYL 6.9 и энергию минимизировали с помощью силового поля Tripos. Структуру MDM2 получали на основании кристаллической структуры MDM2, связанного с р 53 (код PDB: 1YCR). Атомы водорода добавляли к белку, используя SYBYL 6.9. Активный сайт определяли как охватывающий все атомы в пределах радиуса сферы 12 , начало которой было локализовано при центре Trp23 пептида р 53. Для ограничения был выбран стандартный протокол Genetic Algorithm. Для каждого соединения проводили 20 индивидуальных пробегов ограничения. 20 полученных решений каждого лиганда ранжировали в соответствии с баллами ChemScore. Лучшее ранжированное решение каждого лиганда повторно оценивали с помощьюX-Score и использовали в дальнейшем анализе способа связывания. Спиротрипростатин А представляет собой класс природных алкалоидов, выделенных из ферментационного бульона Aspergillus fumigatus (Usui et al., Biochem. J. 33: 543 (1998 (фиг. 1). Компьютерные ограничивающие исследования показали, что спиротрипростатин А не может связываться в гидрофобном углублении MDM2, но структуру сердцевины спиро(оксиндол-3,3'-пирролидин) можно использовать в качестве жесткого каркаса для проектирования нового класса ингибиторов взаимодействия p53-MDM2. Оксиндольная единица близко имитирует остаток Trp23 как при образовании водородной связи, так и при гидрофобном взаимодействии с MDM2. Кольцо пирролидинил образует жесткий каркас, к которому могут быть присоединены две гидрофобные группы, чтобы имитировать Phe19 и Leu26 (фиг. 2 А). Ряд матричных соединений был смоделирован, используя различные группы заместителей с различными конфигурациями. Было показано, что из них соединение 1 а хорошо имитирует р 53 при образовании им водородных связей и при ключевых гидрофобных взаимодействиях с MDM2 (фиг. 2 А). Заместитель 6 хлоро на оксиндольном кольце занимает небольшой гидрофобный карман в MDM2, взаимодействие которого показано как эффективное при усилении связывающего сродства пептидных ингибиторов MDM2 на основе р 53 (Garcia-Echeverria et al., Med. Chem. 43: 3205 (2000. Пример 2. Флуоресцентный поляризационный анализ связывания. Соединение 1 а синтезировали, используя асимметрическую 1,3-биполярную реакцию в качестве ключевой стадии (Sebehar et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5666 (2000. Абсолютную стереохимию 1 а и других смоделированных аналогов определяли с помощью рентгеноструктурного анализа одного из ключевых промежуточных соединений, (1"R,2"S,2'R,3'R,3S,4'R) 6-хлор-4'-(3-хлорфенил)-1'-(2-гидрокси-1,2 дифенилэтил)-2'-(3-метилбутил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диэтиламида. Чтобы определить способность 1 а к прерыванию взаимодействия между MDM2 и р 53, проводили анализ связывания на основе флуоресцентной поляризации (ФП), используя рекомбинантный человеческий белок MDM2 и пептид на основе р 53 (Garcia-Echeverria et al., J. Med Chem. 43: 3205 (2000, меченый флуоресцентной меткой. Флуоресцентный зонд, названный PMDM6-F, имел последовательность (5Fam- Ala-Ala-Phe-Met-Aib-pTyr-(6-CI-1-Trp)-Glu-Ac3c-Leu-Asn-NH2) (SEQ ID NO:1), где Fam представляет собой карбоксифлуоресцеин, Aib представляет собой -аминоизомасляную кислоту и Ас 3 с представляет собой 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту. Значение Kd связывания этого сконструированного зонда с белком MDM2 определили как 0,001 мкМ (1 нМ 0,09), показывающее, что данный пептид связывается с поверхностным карманом белка MDM2 с очень высоким сродством (фиг. 3 А). Специфичность анализа подтвердили путем конкурентного вытеснения связывания PMDM6-F с белкомMDM2 немеченым пептидом с идентичной последовательностью. Определили, что соответствующий немеченый пептид PMDM6 (Ki=0,7 нМ 0,1) обладал значительно более высоким сродством связывания,чем пептид р 53 дикого типа (PLSQETFSDLWKLLPEN-NH2) (SEQ ID NO:2) (Ki=6,7 мкМ 1,2) (фиг. 3 Б). Рекомбинантный человеческий белок MDM2 (остатки 1-118), слитый с His-меткой при N-конце, был стабильным и растворимым, и его использовали для анализа связывания на основе ФП. Эксперименты по зависимому от дозы связыванию проводили с серийными разведениями тестируемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Пробу 5 мкл тестируемых образцов и предварительно инкубированный белок MDM2 (0,010 мкМ) и пептид PMDM6-F (0,001 мкМ) в аналитическом буфере (100 мМ фосфат калия, рН 7,5; 100 мкг/мл бычьего гамма-глобулина; 0,02% азида натрия, получен от Invitrogen Life Technology) смешивали в 96-луночных черных круглодонных планшетах Dynex(Fisher Scientific) до получения конечного объема 125 мкл. При каждом анализе использовали контроль связанного пептида, содержащий белок MDM2 и PMDM6-F (эквивалентный 0% ингибирования), и контроль свободного пептида, содержащий только свободный PMDM6-F (эквивалентный 100% ингибирования). Значения поляризации измеряли после 3 ч инкубации, когда связывание достигало равновесия, используя ULTRA READER (Tecan U.S. Inc., Research Triangle Park, NC). Значения IC50 (концентрацию ингибитора, при которой 50% связанного пептида вытесняется) определяли на основании графика, используя нелинейный анализ наименьших квадратов. Выравнивание кривой проводили, используя программное обеспечение GRAPHPAD PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Для вычисления констант сродства связывания (Ki) ингибиторов было разработано приведенное ниже уравнение для компьютерного вычисления значений Ki; использовали значения анализа связывания на основе ФП: в котором [I]50 означает концентрацию свободного ингибитора при 50% ингибирования;[L]50 означает концентрацию свободного меченого лиганда при 50% ингибирования;[Р]0 означает концентрацию свободного белка при 0% ингибирования иKd означает константу диссоциации комплекса белок-лиганд. Для точного компьютерного анализа значений ингибиторов с использованием приведенного уравнения была разработана компьютерная методика для вычисления точных значений всех параметров, требующихся в уравнении (Nikolovska-Coleska et al., Anal. Biochem. 332: 261 (2004. Также была разработана Web-основанная компьютерная программа для вычисления значений Ki ингибиторов в анализах связывания на основе ФП на основании того же уравнения. Меченый флуоресцентной меткой пептид на основе р 53 имел значение Kd 1 нМ с MDM2, что соответствует описанному ранее высокому сродству к MDM2 (Garcia-Echeverria et al., Med. Chem. 43: 3205(2000. В данном анализе связывания природный пептид р 53 (остатки 13-29), который использовали в качестве положительного контроля, и 1 а определяли как имеющие значения Kd 6,7 и 8,5 мкМ соответственно (фиг. 4). Следовательно, 1 а является достаточно эффективным ингибитором взаимодействия р 53 сMDM2. Анализ модели 1 а, связанного с MDM2 (фиг. 2), позволил предположить, что 1 а может быть дополнительно оптимизирован для лучшего взаимодействия с MDM2. Например, фенильное кольцо 1 а связывается с гидрофобным связывающим карманом, занятым боковой цепью Phe19, но в этом кармане имеется дополнительное пространство. Подобным образом, изобутильная группа 1 а заполняет гидрофобный связывающий карман, занятый боковой цепью Leu26, но гидрофобная группа большего размера была бы лучше приспособлена для этого. При попытке дополнительно оптимизировать взаимодействия на этих двух гидрофобных сайтах связывания были разработаны новые аналоги 1 а. Исследования по моделированию показали, что при введении атома хлора в мета-положение фенильного кольца в 1 а может использоваться дополнительная площадь, доступная в данном сайте связывания, и улучшается гидрофобное взаимодействие. Эти исследования также показали, что введение атома хлора либо при пара-, либо при орто-положении фенильного кольца в 1 а может предотвращать связывание с MDM2. Соединение 1b с мета-Cl синтезировали и определили как имеющее значение Ki 300 нМ. Следовательно, оно является в 28 раз более эффективным, чем 1 а (фиг. 4). Для дополнительного подтверждения предсказания моделирования синтезировали соединение с заместителем пара-Cl (1 с) и обнаружили, что оно является в 26 раз менее эффективным, чем 1b (Ki=7,7 мкМ). Как указано выше, изобутильная группа в 1 а является не оптимальной, и гидрофобное взаимодействие в данном сайте было дополнительно оптимизировано с использованием 1b в качестве матрицы. Исследования по моделированию показали, что группа 2,2-диметилпропил может усилить гидрофобное взаимодействие (фиг. 2), и полученное в результате соединение 1d было синтезировано. Обнаружено, что оно имеет значение Ki 86 нМ и, следовательно, является высокоэффективным ингибитором взаимодействия p53-MDM2, проявляя в 78 раз большую эффективность, чем природный пептид р 53. Для подтверждения значимости гидрофобного взаимодействия в данном сайте были смоделированы и синтезированы соединения 1 е и 1f, имеющие гидрофобную группу меньшего и большего размера, чем 1d, соответственно. Исследования по моделированию позволили предположить, что как 1 е, так и 1f должны быть менее эффективными, чем 1d, и, действительно, эксперименты по связыванию на основе ФП позволили определить, что 1 е и 1f, при значениях Ki 650 и 390 нМ соответственно, были существенно менее эффективными, чем 1d (фиг. 4). Пример 3. 3-Е-Бензилиден-6-хлор-1,3-дигидроиндол-2-он Общие методики. Элементные анализы проводились кафедрой химии университета Мичигана, AnnArbor, MI. В случаях, где приведены молекулярные формулы, обнаруженные элементные составы находились в пределах 0,3% теоретических значений, если не отмечено иное. Оптические вращения определяли при 589 нм при 25 С на поляриметре Perkin-Elmer 241 (в CHCl3). Рентгеновский анализ монокристалла проводили в Naval Research Laboratory, Washington, DC. Спектры 1 Н ЯМР записывали при 300 МГц, а спектры 13 С ЯМР записывали при 75 МГц на спектрометре Bruker AVANCE300. Все спектры ЯМР были получены в CDCl3, и результаты записаны в виде миллионных долей (млн 3) в нижнем поле от тетраметилсилана (ТМС). Приведенные ниже сокращения использовали для множественности сигналов ЯМР: s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, m = мультиплекс, dd = двойной дублет, dt = двойной триплет, dq = двойной квартет, br = широкий. Способ А. К раствору 6-хлор-оксиндола (1,67 г, 10,0 ммоль) в 60 мл CH2Cl2:CH3CN (1:1) добавляли бензальдегид (10,0 ммоль) и KF-Al2O3 (10 г). После 10 мин при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме и остатки вместе с колбой помещали в микроволновую печь и нагревали в течение 5 мин (60-80 Вт). Экстракцию проводили 150 мл CH3CN, твердое вещество отфильтровывали и растворитель удаляли в вакууме с получением сырого продукта, который использовали без дальнейшей очистки. Способ Б. К раствору 6-хлор-оксиндола (1,67 г, 10,0 ммоль) в 60 мл метанола добавляли бензальдегид (10,0 ммоль) и пиперидин (10 г) и полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч. Осадок отфильтровывали и промывали холодным метанолом с получением чистого продукта. 1 Н ЯМР (300 МГц, CDCl3)7.90 (br, 1 Н), 7.63 (d, J=5.67 Гц, 2 Н), 7.55 (d, J=8.27 Гц, 1 Н), 7.49 (d,J=5.87 Гц, 2 Н), 7.39 (d, J=7.85 Гц, 2 Н), 6.90 (s, 1 Н), 6.85 (d, J=8.22 Гц, 1 Н), 4.66 (s, 1H). Пример 4. При данной методике были получены приведенные ниже соединения. а) 3-Е-6-Хлор-3-(3-хлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. 1 Н ЯМР (300 МГц, CDCl3)8.08 (br, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.62-7.61 (m, 1 Н), 7.55-7.43 (m, 4 Н), 6.92 (d,J=1.52 Гц, 1 Н), 6.89 (dd, J=1.91, 8.18 Гц, 1 Н). б) 3-Е-Бензилиден-1,3-дигидроиндол-2-он. 1 Н ЯМР (300 МГц, CDCl3)8.32 (br, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.77-7.66 (m, 3 Н), 7.75-7.43 (m, 3 Н), 7.24 (td,J=1.10, 7.69 Гц, 1 Н), 6.93-6.87 (m, 2 Н). в) 3-Е-6-Хлор-3-(4-хлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. г) 3-Е-Бензилиден-6-бром-1,3-дигидроиндол-2-он. д) 3-Е-Бензилиден-6-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он. е) 3-Е-Бензилиден-6-трифторметил-1,3-дигидроиндол-2-он. ж) 3-Е-6-Хлор-3-(4-бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. з) 3-Е-6-Хлор-3-(4-метилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. и) 3-Е-6-Хлор-3-(4-метоксилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. к) 3-Е-6-Хлор-3-(4-трифторметилбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. л) 3-Е-6-Хлор-3-(3,4-дихлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. м) 3-Е-6-Хлор-3-(3,5-дихлорбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. н) 3-Е-6-Бром-3-(3-бромбензилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. о) 3-Е-6-Хлор-3-(3,3-диметилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. п) 3-Е-6-Хлор-3-(3-метилбутилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. р) 3-Е-6-Хлор-3-(2-циклогексилэтилиден)-1,3-дигидроиндол-2-он. с) 3-Е-6-Хлор-3-циклогексилметилен-1,3-дигидроиндол-2-он. т) 3-Е-6-Хлор-3-циклопентилметилен-1,3-дигидроиндол-2-он. у) 3-Е-6-Хлор-3-тиофен-2-илметилен-1,3-дигидроиндол-2-он. В атмосфере аргона в 100-мл колбу с магнитной мешалкой добавляли (2S,3R)-2,3,5,6-тетрагидро 2,3-дифенил-1,4-оксазин-6-он (1,0 г, 3,96 ммоль), 3-Е-(3-бром)бензилиден-6-бром-1,3-дигидроиндол-2-он(4,75 ммоль), 2 г свежеактивированных 4 молекулярных сит, 3,3-диметилбутиральдегид (4,75 ммоль) и толуол (50 мл). Эту смесь нагревали до 70 С и держали при этой температуре в течение 5 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и молекулярные сита отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением 1,3-биполярного продукта. Этот полученный 1,3-биполярный продукт (2,0 ммоль) растворяли в ТГФ-диметиламине (4 М, 5 мл) и полученный в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением (1"R,2"S,2'R,3'R,3S,4'R)-6 бром-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-1'-(2-гидрокси-1,2-дифенилэтил)-2-оксо-1,2 дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламида. При 0 С к раствору (1"R,2"S,2'R,3'R,3S,4'R)-6-бром-4'-(3-бромфенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-1'-(2 гидрокси-1,2-дифенилэтил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты диметиламида (2,0 ммоль) в CH2Cl2-MeOH (10 мл, 1:1) добавляли Pb(OAc)4 (1,34 г, 3,0 ммоль). Эту реакционную смесь перемешивали при 0 С в течение примерно 5-10 мин и раствор фильтровали через короткую колонку силикагеля. Растворитель удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией с получением продукта. Н ЯМР (300 МГц, CDCl3)9.47 (br, 1 Н), 7.72 (t, J=5.59 Гц, 1 Н), 7.37 (d, J=7.84 Гц, 1 Н), 7.18 (s, 1 Н),7.11 (t, J=7.77 Гц, 1 Н), 6.95 (d, J=7.74 Гц, 1 Н), 6.78 (d, J=9.04 Гц, 1 Н), 5.85 (d, J=8.96 Гц, 1 Н), 4.60 (br, 1H),4.35 (d, J=4.94 Гц, 1 Н), 3.85-3.40 (m, 8 Н), 1.75-1.65 (m, 2 Н), 1.51-1.43 (m, 1 Н), 0.90-0.88 (m, 1 Н), 0.83 (s,9H); 13 С ЯМР (75 МГц, CDCl3), 180.62, 174.19, 155.61, 141.86, 138.55, 132.04, 131.33, 130.66, 127.12,123.26, 121.14, 114.20, 111.91, 70.47, 67.14, 66.98, 65.20, 63.49, 55.96, 44.34, 36.97, 33.23, 30.55, 30.27. Пример 37. Конкурентное ингибирование взаимодействия p53 с MDM2. ФП-анализ связывания, описанный в примере 2, использовали для тестирования способности нескольких синтезированных соединений к ингибированию взаимодействия между MDM2 и р 53. Соединения Ke-43 (пример 12), Ke-61 (пример 19), PMDM6 (пример 2) и Ke-63 тестировали по сравнению с природным пептидом р 53 (пример 2). Было показано, что соединения Ke-43, PMDM6 и Ke-63 являются более эффективными, чем природный пептид р 53, при значениях Ki в диапазоне от низкого наномолярного до субнаномолярного (фиг. 5). Пример 38. Прерывание взаимодействия p53-MDM2 ингибиторами MDM2. Вестерн-блоттинг-анализы совместной иммунопреципитации (Co-IP-co-immunoprecipitaton) проводили для оценки эффектов Ke-43 в отношении взаимодействия р 53 и MDM2. После сбора и отмывки один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором клетки рака ободочной кишки НСТ 116 подвергали лизису путем озвучивания ультразвуком в холодном буфере Co-IP (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМNaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 0,5% NP-40), содержащем 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и смесь ингибиторов протеаз. Затем лизаты, обработанные ультразвуком, центрифугировали при 12000g при 4 С в течение 15 мин. Надосадочную жидкость, содержащую 2 мг белка, инкубировали в отсутствие или в присутствии Ke-43 в течение 1 ч при 4 С с последующим добавлением агарозных гранул, конъюгированных либо с антителом анти-р 53 (FL-393, Santa Cruz), либо с неспецифичным антителом. После смешивания в течение 2 ч при 4 С агарозные гранулы промывали 3 раза холодным буфером Co-IP, кипятили в буфере для нанесения образцов, после чего проводили электрофорез в полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия, и присутствие р 53 и MDM2 обнаруживали с помощью Вестерн-блоттинга с мышиными моноклональными антителами против белков р 53 и MDM-2. Повышенные концентрации Ke-43 приводили к сниженной иммунопреципитации MDM2 антителом анти-р 53, что указывает на то, что Ke43 блокирует взаимодействие между р 53 и MDM2 (фиг. 6). Пример 39. Ингибирование клеточного роста ингибиторами MDM2. Клеточные линии рака ободочной кишки RKO (р 53 дикого типа), НСТ 116 (р 53 дикого типа) и НТ 29 (мутантный р 53) высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур с плоским дном при плотности 3-4103 клеток/лунка и инкубировали в присутствии соединений в течение 4 суток. Долю ингибирования клеточного роста после обработки возрастающими концентрациями соединений определяли, используя WST-8 - (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2 Нтетразолия мононатриевую соль (Dojindo Molecular Technolories Inc., Gaithersburg, Maryland). WST-8 добавляли с конечной концентрацией 10% в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37 С в течение 2-3 ч. Поглощение образцов измеряли при 450 нм в считывающем устройстве для планшетов (MolecularDevice-TECAN ULTRA). Концентрацию соединений, которая ингибировала клеточный рост на 50%(IC50), вычисляли путем сравнения поглощения в клетках, обработанных соединениями, с необработанными клетками. Соединение Ke-43 (пример 12) показало эффективную ингибиторную активность в отношении клеточного роста для раковых клеток, экспрессирующих р 53 дикого типа (фиг. 7). Примечательно, что раковые клетки, экспрессирующие р 53 дикого типа, показали более чем 18-кратную Пример 40. Эффекты ингибиторов MDM2 на экспрессию р 53 и его генных продуктов-мишеней MDM2 и р 21. Раковые клетки обрабатывали тестируемыми соединениями или 0,1% ДМСО в течение 24 ч. Клетки собирали с помощью трипсинизации и промывали холодным фосфатно-солевым буферным раствором,рН 7,5 (Invitroren, Carlsbad, CA). Клетки подвергали лизису в течение 30 мин в охлажденном во льду лизирующем буфере (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 25 мМ фторид натрия, 1%NP-40 и 0,1% ДСН), содержащем 2 мМ ортованадат натрия, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и смесь ингибиторов протеазы (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Затем клеточные экстракты центрифугировали при 12000g при 4 С в течение 10 мин с получением осветленных лизатов. Белок оценивали с помощью красителя Bio-Rad. 35 мкг клеточного белка разделяли на 4-20% трис-глициновом геле (Invitroren, Carlsbad, CA) и переносили на мембраны из поли(винилидендифторида). Иммунологическое определение белков на мембране для переноса осуществляли с использованием мышиных моноклональных антител анти-р 53 (Ab-6, Oncorene Research Products, Boston, MA), анти-MDM2 (SMP14, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) и анти-р 21 (BD Biosciences, San Diego, CA). Антитело к -актину (Sirma, StLouis, МО) использовали для оценки нанесения белка. Когда клеточные линии рака ободочной кишкиRKO (р 53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р 53) обрабатывали Ke-43 (пример 12) в течение 24 ч, Ke-43 индуцировал аккумуляцию р 53 и его генных продуктов-мишеней только в клетках RKO, экспрессирующих р 53 дикого типа (фиг. 8). Пример 41. Клеточная гибель и апоптоз, индуцированный ингибиторами MDM2. Клеточные линии рака ободочной кишки RKO (р 53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р 53) и нормальные фибробласты ободочной кишки CCD-18 Со обрабатывали возрастающими дозами Ke-43 или Ke61 в течение 4 суток в 6-луночных чашках Петри. Для определения способности этих ингибиторов к индукции клеточной гибели проводили анализы исключения с трипановым синим. После 4 суток обработки флотирующие и прикрепленные клетки собирали и окрашивали 0,2% раствором трипанового синего(Sigma, St Louis, МО). Каждую обработку проводили с тремя повторами и считали по меньшей мере 100 клеток. Клетки, окрашенные синим цветом, или морфологически нездоровые клетки оценивали как мертвые клетки. Для оценки апоптоза субдиплоидное содержание ДНК в клетках, обработанных тестируемыми ингибиторами или без них, анализировали с помощью окрашивания пропидий йодидом (PI). После промывания один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 1 суток при -20 С. Затем клетки, фиксированные этанолом, дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором и окрашивали окрашивающим раствором, содержащим пропидий йодид (PI) в концентрации 50 мкг/мл и РНКазу А в концентрации 100 мкг/мл в ФСБ, в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Сбор клеток и анализ субдиплоидного содержания ДНК проводили путем проточной цитометрии, используя программное обеспечение CellQuest. Только раковые клетки, экспрессирующие р 53 дикого типа, претерпевали апоптоз в ответ на введение Ke-43 (фиг. 9). Пример 42. Эффект ингибиторов MDM2 на прохождение клеточного цикла клетками рака ободочной кишки. Прохождение клеточного цикла оценивали в клеточных линиях рака ободочной кишки RKO (р 53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р 53) и нормальных фибробластах ободочной кишки CCD-18Co путем определения клеток S-фазы на основании включения бромдезоксиуридина (BrdU) с последующим окрашиванием меченым флюоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) антителом анти-BrdU, и суммарного содержания ДНК на основании окрашивания 7-аминомицином D (7-AAD) в соответствии с инструкциями изготовителя (BD Biosciences, San Jose, CA). Кратко, раковые и нормальные клетки после инкубации в течение ночи выдерживали с тестируемыми соединениями или без них в течение 22 ч с последующими 2 ч инкубации с 10 мкл BrdU. Клетки собирали, фиксировали и окрашивали меченым ФИТЦ анти-BrdU и 7AAD. Распределение клеточного цикла оценивали с помощью проточной цитометрии. Клетки собирали и анализировали данные с помощью программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences). Ke-43 индуцировало зависимое от дозы истощение S-фазы в раковых клетках RKO и в нормальных клеткахфибробластах CCD-18Co ободочной кишки, где и те, и другие экспрессируют р 53 дикого типа (фиг. 10). Однако Ke-43 не обладал приемлемым эффектом на прохождение клеточного цикла клетками НТ-29,экспрессирующими мутантный р 53 (фиг. 10). Неактивный контрольный ингибитор Ke-61 не обладал значимым эффектом во всех тестируемых клетках. Теперь, после того как изобретение было полностью описано, специалистам в данной области техники будет ясно, что его можно осуществлять при широком и эквивалентном ряде условий, препаратов и других параметров, не влияющих на объем изобретения или его любого воплощения. Все патенты, патентные заявки и публикации, цитируемые здесь, полностью включены здесь путем ссылки в их полном объеме.