Моносоль малеиновой кислоты антивирусного агента и содержащая ее фармацевтическая композиция
Формула / Реферат
1. Моносоль малеиновой кислоты 3-[({1-[(2-амино-9Н-пурин-9-ил)метил]циклопропил}окси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-3l5-фосфанон-1-илпивалата.
2. Моносоль малеиновой кислоты по п.1 в форме кристаллического твердого вещества.
3. Моносоль малеиновой кислоты по п.2, имеющая пики при 2q 5,6, 12,1, 17,5 и 20,9° в ее порошковой рентгенограмме.
4. Моносоль малеиновой кислоты по п.3, имеющая пики при 2q 5,6, 10,0, 12,1, 13,1, 17,5, 18,8, 20,9, 22,8, 24,3, 25,1 и 26,5° в ее порошковой рентгенограмме.
5. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусных инфекций, которая содержит моносоль малеиновой кислоты по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. Композиция по п.5, где вирусом является HBV.
7. Композиция по п.5, где вирусом является ВИЧ.
Текст
МОНОСОЛЬ МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ АНТИВИРУСНОГО АГЕНТА И СОДЕРЖАЩАЯ ЕЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛ ДЖИ ЛАЙФ САЙЕНСИЗ ЛТД. (KR) Настоящее изобретение относится к моносоли малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9 ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-3 5-фосфанон-1-илпивалата и содержащей ее фармацевтической композиции. 015269 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к моносоли малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9 ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата нижеследующей формулы (1) и содержащей ее фармацевтической композиции: Предшествующий уровень техники Свободное основание, соответствующее указанному выше соединению формулы (1), т.е. соединение, которое не соединено с кислотой, является новым антивирусным соединением, которое описано в патенте Кореи 0441638 и WO 02/057288. Это свободное основание в настоящее время подвергают клиническому исследованию. Оно обладает сильным антивирусным действием, особенно против вируса гепатита В (HBV) и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Однако это свободное основание является нестабильным при нагревании и влажных условиях, что вызывает проблемы при разработке применения данного соединения в качестве фармацевтического лекарственного продукта. Описание изобретения Авторы настоящего изобретения исследовали различные пути разрешения проблем при применении свободного основания. В результате своего исследования они обнаружили, что моносоль малеиновой кислоты формулы (1) настоящего изобретения может иметь кристаллические свойства и превосходную растворимость, является негигроскопичной и является очень стабильной при нагревании. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение моносоли малеиновой кислоты формулы (1). Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции, содержащей моносоль малеиновой кислоты формулы (1) в качестве активного ингредиента. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана порошковая рентгенограмма одного варианта осуществления моносоли малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7 диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата настоящего изобретения; на фиг. 2 - результат дифференциальной сканирующей калориметрии одного варианта осуществления моносоли малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата настоящего изобретения; на фиг. 3 - изменение содержания (%) 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата в виде свободного основания и одного варианта осуществления его моносоли малеиновой кислоты в зависимости от времени и температуры; на фиг. 4 - результат активности и цитотоксичности in vitro против вируса гепатита В 3-[(1-[(2 амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата в виде свободного основания и одного варианта осуществления его моносоли малеиновой кислоты. Лучший способ осуществления изобретения Настоящее изобретение относится к моносоли малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9 ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата следующей формулы (1): Если не указано иначе, в настоящем изобретении термин "моносоль малеиновой кислоты формулы(1)" означает соль, в которой 1 экв. соответствующего свободного основания [т.е. свободным основанием моносоли малеиновой кислоты формулы (1)] соединен с 0,7-1,3 экв., предпочтительно 0,9-1,1 экв., более предпочтительно 1 экв. малеиновой кислоты. Моносоль малеиновой кислоты формулы (1) можно получить способом, который включает стадию-1 015269 смешивания свободного основания и малеиновой кислоты с органическим растворителем, причем данный способ является хорошо известным в данной области (см. Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Donald C. Monkhouse et al., 1, 66(1), 1977 и Salt selection for basic drugs, International Journalof Pharmaceutics, Philip L. Gould, 201, 33, 1986). В частности, моносоль малеиновой кислоты формулы (1) можно получить растворением свободного основания в органическом растворителе в отношении от 50 до 1000 мг свободного основания на 1 мл растворителя, добавлением к раствору (предпочтительно по каплям) малеиновой кислоты в указанном ниже количестве и перемешиванием смеси с получением твердого вещества. Органический растворитель можно выбрать без ограничения из общепринятых органических растворителей, которые можно применять для получения соли, но предпочтительно выбирают из группы, состоящей из этилацетата, бутилацетата, ацетонитрила, хлороформа, ацетона, метанола, этанола, пропанола, изопропанола, тетрагидрофурана, метилэтилкетона, изопропилацетата, диоксана, н-гексана, циклогексана, диэтилового простого эфира,трет-бутилового простого эфира и их смесей. Количество добавляемой малеиновой кислоты не ограничивается конкретным количеством, но предпочтительно количеством является 0,7-1,3 экв., более предпочтительно 0,9-1,2 экв. и наиболее предпочтительно 1,0-1,1 экв. относительно 1 экв. свободного основания. Образовавшееся твердое вещество подвергают общепринятым способам обработки, таким как фильтрование, промывание, сушка и т.д. Моносоль малеиновой кислоты формулы (1), полученную указанным выше способом, предпочтительно получают в виде кристаллического твердого вещества. То есть моносоль малеиновой кислоты настоящего изобретения может иметь характеристическую кристаллическую структуру, обнаруживающую значимые пики у 2 5,6, 12,1, 17,5 и 20,9 (2, +/-0,2) на порошковой рентгенограмме. Более предпочтительно моносоль малеиновой кислоты имеет кристаллическую структуру, обнаруживающую значимые пики у 2 5,6, 10,0, 12,1, 13,1, 17,5, 18,8, 20,9, 22,8, 24,3, 25,1 и 26,5 (2, +/-0,2) на порошковой рентгенограмме (см. фиг. 1). Эта кристаллическая форма имеет эндотермический начальный пик точки плавления при 129 С в дифференциальной сканирующей калориметрии (10 С/мин) (см. фиг. 2). Моносоль малеиновой кислоты формулы (1) является негигроскопичной и имеет лучшую растворимость и лучшую стабильность при нагревании и влажных условиях, чем соответствующее свободное основание или другие его соли. Она находится также в форме кристаллического твердого вещества. Поэтому физико-химические свойства моносоли малеиновой кислоты формулы (1) делают ее подходящей для разработки в качестве фармацевтического лекарственного продукта. Как объясняется более подробно в нижеследующих экспериментах, свободное основание, разработанное в качестве антивирусного агента, является очень нестабильным при нагревании и влажных условиях, и поэтому его трудно применять в качестве исходного вещества для получения фармацевтического лекарственного продукта. Соответственно этому, имеется трудность при разработке свободного основания в качестве лекарственного вещества. Авторы настоящего изобретения пытались разрешить эти проблемы со свободным основанием получением нескольких типов фармацевтически приемлемых солей. Во время получений было обнаружено, что некоторые из солей нельзя было легко получить в виде кристаллического твердого вещества. Авторы настоящего изобретения добились успеха при получении солей с малеиновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, метансульфоновой кислотой, нафталинсульфоновой кислотой или этансульфоновой кислотой в виде кристаллических твердых веществ. Авторы изобретения провели испытания на термическую стабильность при напряженных условиях для свободного основания и нескольких солей, полученных в виде кристаллических твердых веществ. Испытания показали, что свободное основание и соли, за исключением моносоли малеиновой кислоты, являются очень нестабильными при нагревании. Моносоль малеиновой кислоты остается почти нетронутой, без разложения в течение вплоть до 8 недель при высокой температуре 60 С, тогда как свободное основание разложилось полностью, через 8 недель остался приблизительно 1% соединения. Другие кристаллические соли почти разложились за 2 недели. Таким образом, моносоль малеиновой кислоты настоящего изобретения проявляет превосходную термостабильность по сравнению со свободным основанием или другими органическими солями. Кроме того, нелегко было получить кристаллические твердые вещества из других солей, а кристаллическое твердое вещество моносоли малеиновой кислоты можно было легко получить согласно указанному выше способу. То есть способ получения моносоли малеиновой кислоты можно было легко применять в промышленном масштабе. Моносоль малеиновой кислоты настоящего изобретения обнаруживает также повышенную растворимость, не зависящую от уровней рН. В частности, свободное основание проявляет высокую стабильность, 36 мг/мл или больше при низком значении рН 2 или меньше, но растворимость резко снижается,когда величина рН повышается, т.е. растворимость составляет 1 мг/мл или меньше при рН 6 или больше. Вследствие таких характеристик свободное основание полностью растворяется и абсорбируется в желудке, но имеется риск того, что соединение может осаждаться, когда оно перемещается во внутренние органы, которые имеют более высокий уровень рН. Однако моносоль малеиновой кислоты настоящего изобретения обладает относительно постоянной растворимостью, приблизительно 7-3 мг/мл в диапазоне рН 2-6,5. Фактически растворимость моносоли малеиновой кислоты при рН 6,5 в три раза выше, чем рас-2 015269 творимость свободного основания. Это позволяет предположить, что в аспекте лекарственной эффективности моносоль малеиновой кислоты будет больше абсорбироваться в организме, и риск осаждения после абсорбции может быть исключен даже при изменении рН. То есть моносоль малеиновой кислоты настоящего изобретения обладает превосходной растворимостью даже при различных уровнях рН по сравнению со свободным основанием. Вследствие указанных выше физических, физиологических свойств имеются огромные преимущества при применении моносоли малеиновой кислоты настоящего изобретения для профилактики или лечения вирусных инфекций. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения вирусной инфекции, которая содержит терапевтически эффективное количество моносоли малеиновой кислоты формулы (1) и фармацевтически приемлемый носитель. Вирусом, который наиболее эффективно подвергается воздействию фармацевтической композиции настоящего изобретения, является вирус из группы, состоящей из HBV и ВИЧ. Пероральное введение является наиболее предпочтительной формой введения фармацевтической композиции, содержащей моносоль малеиновой кислоты формулы (1) в качестве активного ингредиента,особенно в форме таблетки или капсулы."Терапевтически эффективное количество" моносоли малеиновой кислоты формулы (1) в качестве активного ингредиента варьирует в зависимости от пола, возраста и питания пациента-субъекта, тяжести подвергаемого лечению заболевания и т.д., его может легко клинически определить специалист в данной области. На патент Кореи 0441638 и WO 02/057288, в каждом из которых описано соответствующее свободное основание и его действие, можно сослаться в связи с фармакологическим действием, диапазоном эффективных доз, способом введения фармацевтической композиции, содержащей моносоль малеиновой кислоты формулы (1) в качестве активного ингредиента. Настоящее изобретение более конкретно объясняется следующими примерами и экспериментами,которые предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Условия ВЭЖХ Содержания свободного основания 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата и его солей измеряли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Ниже перечислены конкретные условия измерения. Колонка: Waters Symmetry Shield C18 (4,6250 мм, 5 мкм). Температура колонки: 30 С. Скорость потока: 1,0 мл/мин. Длина волны детектирования: УФ 309 нм. Элюенты: А - тетрагидрофуран/вода 3/7,В - тетрагидрофуран/вода 8/2 (об./об., градиентное элюирование). Отношение элюентов при смешивании на протяжении времени Условия для дифференциальной сканирующей калориметрии Кривую ДСК получали с применением системы Mettler-Toledo DSC821. Термическое поведение изучали нагреванием 2-5 мг образца в алюминиевой кювете для образца при пропускании потока газа азота в температурном интервале 25-250 С и скорости нагревания 10 С/мин. Крышка кюветы для образца имела малое отверстие для предотвращения повышения давления внутри кюветы для образца. Условия рентгенодифракции Образец (приблизительно 20 мг) помещали на держатель образца, который затем вставляли в генератор рентгеновских лучей Philips (PW1710). Дифрактограмму образца получали в диапазоне от 3 до приблизительно 40/2. Детали условий анализа перечислены ниже. Время шага: 0,5. Размер шага: 0,03. Способ сканирования: шаговый. Напряжение/электрический ток: 40 кВ/30 мА. 2/ отражение.Cu-мишень (Ni-фильтр). Щель источника: 1,0 мм. Щели детектора: 0,15 мм, 1,0 мм. Сравнительный пример 1. Свободное основание 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Указанное в заголовке соединение получали согласно способу, описанному в патенте Кореи 0441638 и WO 02/057288. Пример. Моносоль малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Свободное основание, полученное в сравнительном примере 1 (100 мг), растворяли в этилацетате(1 мл). Добавляли малеиновую кислоту (1 экв.) и смесь перемешивали в течение 1 ч до получения твердого вещества. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали этилацетатом и сушили, получая при этом 111,4 мг (выход 91,3%) моносоли малеиновой кислоты в виде кристаллического твердого вещества. Содержание: 99,3%. Дифференциальная сканирующая калориметрия: 129 С (эндотермический эффект: 111 Дж/г). 1 Н-ЯМР (CD3OD):8,64 (с, 1 Н), 8,35 (с, 1 Н), 6,30 (с, 2 Н), 5,62 (м, 4 Н), 4,37 (с, 2 Н), 4,17 (д, 2 Н), 1,20(с, 18 Н), 0,99 (м, 4 Н). Спектр порошковой рентгенодифракции: 2 5,6, 10,0, 12,1, 13,1, 17,5, 18,8, 20,9, 22,8, 24,3, 25,1 и 26,5 (2, +/-0,2). Сравнительный пример 2. Трисоль малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Свободное основание, полученное в сравнительном примере 1 (5 г), растворяли в этилацетате(50 мл). Добавляли малеиновую кислоту (3 экв.). Смесь перемешивали в течение 12 ч и к ней добавляли н-гексан (20 мл) до получения твердого вещества. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали н-гексаном и сушили, получая при этом 6,52 г (выход 78,6%) трисоли малеиновой кислоты. Содержание: 98,7%. 1(1 мл). Добавляли п-толуолсульфоновую кислоту (1 экв.) и смесь перемешивали в течение 1 ч до получения твердого вещества. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали этилацетатом и сушили, получая при этом 106,4 мг (выход 78,2%) моносоли п-толуолсульфоновой кислоты. Содержание: 99,43%. 1(50 мл). Добавляли п-толуолсульфоновую кислоту (2 экв.) и смесь перемешивали в течение 1 ч до получения твердого вещества. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали этилацетатом и сушили, получая при этом 7,01 г (выход 81,5%) дисоли п-толуолсульфоновой кислоты. Содержание: 97,8%. 1(д, 2 Н), 2,37 (с, 6 Н), 1,20 (с, 18 Н), 0,99 (м, 4 Н). Сравнительный пример 5. Моносоль метансульфоновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9 ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Свободное основание, полученное в сравнительном примере 1 (100 мг), растворяли в этилацетате(1 мл). Добавляли по каплям метансульфоновую кислоту (1 экв.) и смесь перемешивали в течение 1 ч до получения твердого вещества. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали этилацетатом и сушили, получая при этом 95,2 мг (выход 80,6%) моносоли метансульфоновой кислоты. Содержание: 97,6%. 1(с, 18 Н), 1,01 (м, 4 Н). Сравнительный пример 6. Моносоль нафталинсульфоновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9 ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Свободное основание, полученное в сравнительном примере 1 (5 г), растворяли в этилацетате(30 мл). Нафталинсульфоновую кислоту (1 экв., 1,97 г) растворяли в воде (5 мл) и раствор затем добавля-4 015269 ли по каплям. После перемешивания смеси в течение 15 ч растворитель тщательно удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли этанол и диэтиловый простой эфир для осаждения продукта в виде белых кристаллов. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали смесью растворителей этанола и диэтилового эфира и сушили, получая при этом 6,2 г (выход 90,0%) моносоли нафталинсульфоновой кислоты. Содержание: 91,4%. 1 Н-ЯМР (CD3OD):8,48 (с, 2 Н), 8,44 (с, 1 Н), 7,95 (д, 1 Н), 7,83 (м, 3 Н), 7,50 (м, 2 Н), 5,63 (м, 4 Н),4,23 (с, 2 Н), 3,95 (д, 2 Н), 1,18 (с, 18 Н), 1,01 (м, 4 Н). Сравнительный пример 7. Моносоль этансульфоновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. Свободное основание, полученное в сравнительном примере 1 (5 г), растворяли в этилацетате(30 мл). К раствору добавляли этансульфоновую кислоту (1 экв., 1,05 г) и тщательно растворяли. После перемешивания смеси в течение 1 ч растворитель тщательно удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли этанол, диэтиловый простой эфир и н-гексан для осаждения продукта в виде белых кристаллов. Образовавшееся твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали смесью растворителей этанола и диэтилового простого эфира и сушили, получая при этом 5,0 г (выход 82,8%) моносоли этансульфоновой кислоты. Содержание: 90,0%. 1 Н-ЯМР (CDCl3):8,60 (с, 1 Н), 8,51 (с, 1 Н), 5,63 (м, 4 Н), 4,32 (с, 2 Н), 4,00 (д, 2 Н), 2,92 (м, 2 Н), 1,29(м, 3 Н), 1,19 (с, 18 Н), 1,01 (м, 4 Н). Эксперимент 1. Сравнительное испытание на стабильность при нагревании и влажных условиях. От 30 до приблизительно 70 мг каждого из: моносоли малеиновой кислоты примера, свободного основания и солей сравнительных примеров 1-5 вводили в стеклянную пробирку и выдерживали при 402 С и 755% RH (относительная влажность). Через 1, 4 и 8 недель отбирали по 5 мг каждого образца,растворяли в смеси растворителей тетрагидрофуран/вода (1/1, об./об.) и анализировали ВЭЖХ. Результаты суммированы в следующей табл. 1. Таблица 1 Результаты испытания на стабильность для моносоли малеиновой кислоты формулы (1),ее свободного основания и других солей при 40 С/75% RH (остаточное содержание, %) Как видно из результатов табл. 1, моносоль малеиновой кислоты формулы (1) обладает превосходной термостабильностью по сравнению с соответствующим свободным основанием и другими солями. Результаты стабильности моносоли малеиновой кислоты и свободного основания показаны на фиг. 3. Эксперимент 2. Сравнительное испытание 2 на стабильность при нагревании и влажных условиях. От приблизительно 5 до приблизительно 6 мг каждого из: моносоли малеиновой кислоты примера,свободного основания и солей сравнительных примеров 6 и 7 вводили в стеклянную пробирку и выдерживали при температуре 60 С. Через 1 или 2, 4 и 8 недель брали каждый образец в стеклянной пробирке,растворяли в смеси растворителей тетрагидрофуран/вода (1/1, об./об.) и анализировали ВЭЖХ. Результаты суммированы в следующей табл. 2.-5 015269 Таблица 2 Результаты испытания на стабильность для моносоли малеиновой кислоты формулы (1),ее свободного основания и других солей при 60 С (остаточное содержание, %) Результаты табл. 2 показывают, что моносоль малеиновой кислоты формулы (1) обладает превосходной термостабильностью по сравнению с соответствующим свободным основанием и другими солями при высокой температуре. Эксперимент 3. Испытание на растворимость при различных значениях рН. От 5 до приблизительно 23 мг каждого из: моносоли малеиновой кислоты примера и свободного основания сравнительного примера 1 помещали в стеклянный сосуд. В него добавляли 500 мкл каждого из различных фосфатных буферных растворов и растворов фосфорной кислоты, имеющих определенную величину рН. Стеклянный сосуд помещали в воду для поддержания постоянной температуры 25 С и смесь перемешивали в течение 1,5 ч. После фильтрования состав фильтрата анализировали ВЭЖХ и измеряли значение рН раствора. Измеренные величины рН и растворимость моносоли малеиновой кислоты и свободного основания представлены в следующей табл. 3. Таблица 3 рН-Зависимая растворимость моносоли малеиновой кислоты формулы (1) и свободного основания (мг/мл) Эксперимент 4. Фармакологическое действие и цитотоксичность моносоли малеиновой кислоты и свободного основания. 1. Культура клеток и обработка соединением. Продуцирующую вирус гепатита В клеточную линию, HepG22.2.15 (М.A. Shells, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 84, 1005 (1987, культивировали в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла; Life Technologies), содержащей 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки), 1% АВАМ (антибиотика-антимикотика) и генетицин, конечная концентрация которого при измерении была 400 мкг/мл. Клетки культивировали до достижения конфлюэнтности, обрабатывали трипсином и распределяли в 96-луночном микропланшете при плотности 2104 клеток на лунку. Через 24 ч среду заменяли и обработку соединением проводили с интервалами 2 дня при серийных трехкратных разведениях свободного основания сравнительного примера 1 и моносоли малеиновой кислоты примера так, чтобы конечная концентрация была от 50 мкМ до 8 нМ в 200 мкл среды. Анализ каждого испытуемого образца проводили в двух повторах. Через 8 дней от первой обработки лекарственным средством культуральную среду собирали и клетки лизировали нагреванием клеток до 100 С в течение 10 мин. Для минимизации веществ,которые препятствуют реакции амплификации ДНК, культуральную среду разводили в десять раз с применением воды. Контрольную группу, среду для культивирования клеток которой не обрабатывали лекарственным средством, обрабатывали таким же способом, как описано выше.-6 015269 2. Определение фармакологического действия: количественный анализ с применением реакции ПЦР в реальном времени. Культуральную среду (6 мкл), которую предварительно обрабатывали, как указано выше, добавляли к смеси полимераза/забуференный раствор [10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 200 мкМ dNTP,200 нМ праймеров, 200 нМ зонда, 3 мМ MgCl2, 1 единица ДНК-полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA)]. С применением аппарата для проведения реакции ПЦР в реальное время (Rotorgene 2000 Real-time Cycler: CORBETT Research.) реакцию проводили при 95 С в течение 3 мин и затем реакции повторяли при 95 С/20 с-56 С/30 с-85 С/20 с 45 раз. Флуоресценцию реакции полимеризации детектировали при 85 С. и(Genotech) применяли в качестве 5'-праймера и 3'-праймера соответственно и применяли в качестве зонда флуоресценции. Автоматически вычисленное количество ДНК HBV в образце анализировали вычислением относительной величины рассматриваемого образца относительно величины образца, не обработанного лекарственным средством, и с применением статистической программы PRISM (GraphPad Software, Inc.). 3. Определение цитотоксичности. Величину СС 50 лекарственного средства определяли удалением среды, добавлением к остатку 100 мкл 0,1 мг/мл МТТ (синий тиазолилбромид тетразолия: Sigma), окрашиванием остатка в течение 2 ч при 37 С, добавлением 100 мкл ДМСО (диметилсульфоксид: Sigma), растворением образовавшейся смеси перемешиванием в течение 2 ч при комнатной температуре и измерением поглощения при 540 нм. Величины ЕС 50 и СС 50 для свободного основания сравнительного примера 1 и моносоли малеиновой кислоты примера, полученные из вышеописанного эксперимента, представлены в следующей табл. 4. Таблица 4 Как можно видеть из результатов табл. 4, испытание in vitro внутриклеточной фармакологической активности показало, что как свободное основание сравнительного примера 1, так и моносоль малеиновой кислоты примера обладают одинаковой активностью (приблизительно 1 мМ) и цитотоксичностью(приблизительно 7 мМ). Промышленная применимость Моносоль малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата настоящего изобретения проявляет превосходную стабильность при влажных условиях и нагревании и сохраняет постоянную растворимость при различных уровнях рН. Следовательно, фармацевтическая композиция настоящего изобретение для профилактики или лечения вирусных инфекций, таких как инфекция HBV или ВИЧ, может сохранять высокое качество активного ингредиента на протяжении длительного периода времени. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моносоль малеиновой кислоты 3-[(1-[(2-амино-9 Н-пурин-9-ил)метил]циклопропилокси)метил]-8,8-диметил-3,7-диоксо-2,4,6-триокса-35-фосфанон-1-илпивалата. 2. Моносоль малеиновой кислоты по п.1 в форме кристаллического твердого вещества. 3. Моносоль малеиновой кислоты по п.2, имеющая пики при 2 5,6, 12,1, 17,5 и 20,9 в ее порошковой рентгенограмме. 4. Моносоль малеиновой кислоты по п.3, имеющая пики при 2 5,6, 10,0, 12,1, 13,1, 17,5, 18,8, 20,9,22,8, 24,3, 25,1 и 26,5 в ее порошковой рентгенограмме. 5. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусных инфекций, которая содержит моносоль малеиновой кислоты по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель. 6. Композиция по п.5, где вирусом является HBV. 7. Композиция по п.5, где вирусом является ВИЧ.
МПК / Метки
МПК: A61K 31/52, A61P 31/12, A61P 31/18
Метки: моносоль, агента, антивирусного, содержащая, кислоты, фармацевтическая, малеиновой, композиция
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/10-15269-monosol-maleinovojj-kisloty-antivirusnogo-agenta-i-soderzhashhaya-ee-farmacevticheskaya-kompoziciya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Моносоль малеиновой кислоты антивирусного агента и содержащая ее фармацевтическая композиция</a>
Предыдущий патент: Замороженное кондитерское изделие
Следующий патент: Способ получения промежуточных соединений хлорамфеникола или его аналогов
Случайный патент: Способ и установка для непрерывного приготовления целлюлозной пульпы