Стандартизованная смесь стероидных сапонинов, способ ее получения и ее применение

008763 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к стандартизованной смеси стероидных сапонинов, полученной из надземной части Tribulus terrestris L. для применения в приготовлении лекарственных средств, проявляющих уже известный эффект усиления полового влечения в дополнение к лекарственным средствам с новыми показаниями. Данное изобретение относится также к способу получения стандартизованной смеси стероидных сапонинов, полученной из надземной части Tribulus terrestris L. Предшествующий уровень техники Известно, что существует способ выделения стандартизованной смеси стероидных сапонинов, полученной из надземной части Tribulus terrestris L. (патент BG 52085). Задачей данного способа является достижение высокого уровня концентрации фуростаноловых сапонинов в стандартизованной смеси стероидных сапонинов. Способ включает проведение экстрагирования лекарственного материала с использованием раствора низкомолекулярного спирта с концентрацией до 70%, в частности этанола, затем обработки хлороформом и экстрагирования из водного раствора с использованием насыщенного водой нбутанола, с последующим концентрированием бутанольного экстракта до 1/8 объема, после чего полученный таким образом остаток отделяют и сушат, тогда как остатки из маточных жидкостей являются водорастворимыми, и их затем добавляют непосредственно в обрабатываемый хлороформом водный раствор. В соответствии с описанными примерами, таким образом, получают стандартизованную смесь,причем указанная смесь содержит от 50 до 55% фуростаноловых сапонинов, в расчете на основе протодиосцина. Выход составляет от 1,7 до 2%, в зависимости от содержания сапонинов в растительном материале. Продукт, полученный при помощи данного способа и содержащий 50-55% фуростаноловых сапонинов, оказывает стимулирующее действие на функции репродуктивной системы. Согласно описанию изобретения полученная стандартизованная смесь стероидных сапонинов используется в приготовлении таблеток с покрытием, содержащих вещество трибестан. В литературе не описано других экспериментов, направленных на достижение более высокой концентрации фуростаноловых сапонинов в экстракте, полученном из надземной части Tribulus terrestris L.,для усиления его известной биологической активности. Задача, решенная данным изобретением, состоит в экстрагировании из надземной части Tribulusterrestris L. вещества, содержащего высокий уровень фуростаноловых сапонинов, которые можно использовать для получения новых лекарственных средств с новыми показаниями для применения. Сущность изобретения В соответствии с данным изобретением задача решена путем получения стандартизованной смеси стероидных сапонинов, содержащей более 80% фуростаноловых сапонинов. Способ получения состоит в том, что измельченный растительный материал из надземной части Tribulus terrestris L. подвергают экстрагированию с использованием водного метанольного растворителя с соотношением воды/метанола,находящимся в интервале от 1:1 до 1:99 при температуре от 50 до 55 С. Экстракт затем обрабатывают активированным углем и после фильтрования концентрируют под вакуумом до тех пор, пока метанол не удалится полностью. Водный концентрат затем подвергают экстрагированию дихлорметаном. Дихлорметан затем отгоняют и регенерируют для дальнейшего использования при данном способе. Очищенный таким образом водный раствор подкисляют соляной кислотой до рН 3-5 и подвергают экстрагированию насыщенным водой н-бутанолом известным способом. Бутанольные экстракты затем очищают с использованием двух методик. Первая методика состоит в промывании бутанольных экстрактов хлорида натрия и концентрировании под вакуумом с получением сухого остатка, который растворяют в низкомолекулярном спирте. Раствор, полученный таким образом, добавляют каплями в ацетон и оставляют при температуре 10-15 С в течение 24 ч, затем фильтруют, промывают ацетоном и сушат. Вторая методика состоит в том, что бутанольные экстракты промывают 0,5-1,5%-ным раствором гидроксида натрия и после разделения двух слоев бутанольный слой промывают водой до достижения рН 7, затем бутанольные экстракты концентрируют под вакуумом до тех пор, пока органический растворитель не будет полностью удален, и остаток сушат. Таким образом, получают мягкий и светло-желтый порошок, содержащий более 80% фуростаноловых сапонинов. Выход из высушенного на воздухе растительного материала составляет приблизительно 3%. Новый продукт согласно изобретению представляет собой стандартизованную смесь стероидных сапонинов, полученную из надземной части Tribulus terrestris L. и содержащую более 80% фуростаноловых сапонинов. Неожиданно этот новый продукт проявил качественно новые свойства в сравнении с известным продуктом, т.е. он обладает иммуномодулирующим и/или иммуностимулирующим действием. Согласно данному изобретению способ его получения включает новую последовательность приемов, а также включает новые приемы и экстрагенты, представляя собой технологию, которая легко применима в промышленных условиях и позволяет обеспечить высокое содержание фуростаноловых сапонинов при вполне удовлетворительном выходе в промышленных масштабах. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Примеры Пример 1. 1 т измельченного растительного материала из надземной части Tribulus terrestris L. подвергают-1 008763 экстрагированию с использованием 70%-ного метанольного водного раствора при 50 С до истощения. Экстракт отцеживают, затем к нему добавляют активированный уголь. Полученное пропускают через фильтр-пресс. Экстрагированный раствор концентрируют под вакуумом при 60 С до полного удаления метанола. Водный концентрат, полученный таким образом, подвергают тройному экстрагированию дихлорметаном в соотношении к воде 1:2, 1:1 и 1:1, соответственно. Органический растворитель отгоняют и регенерируют, тогда как кубовой остаток отбрасывают. Очищенный таким образом водный экстракт подкисляют соляной кислотой до рН 4 и подвергают восьмикратному экстрагированию н-бутанолом,насыщенным водой, в соотношении 1:1. Бутанольные экстракты промывают 5%-ным раствором хлорида натрия и концентрируют до получения сухого остатка под вакуумом при 60 С и затем остаток растворяют в метаноле. Полученный раствор медленно капают в ацетон, оставляют при температуре 10 С в течение 20 ч и в конце фильтруют через нутч-фильтр, промывают ацетоном и сушат. В результате получают мягкий светло-желтый порошок, содержащий 85% фуростаноловых сапонинов. Выход составляет 3% от высушенного на воздухе растительного материала. Анализ продукта выполняют, исходя из протодиосцина (R. Gyulemetova, M. Tomova, M. Simova,T. Pangarova, Pharmazie, 37, Н.4 1982). Пример 2. 1 т измельченного растительного материала из надземной части Tribulus terrestris L. подвергают экстрагированию с использованием 70%-ного метанольного водного раствора при 50 С до истощения. Экстракт отцеживают, затем к нему добавляют активированный уголь. Полученное пропускают через фильтр-пресс. Экстрагированный раствор концентрируют под вакуумом при 60 С до полного удаления метанола. Водный концентрат, полученный таким образом, подвергают тройному экстрагированию дихлорметаном в соотношении к воде 1:2, 1:1 и 1:1, соответственно. Органический растворитель отгоняют и регенерируют, тогда как кубовой остаток отбрасывают. Полученный очищенный водный экстракт подкисляют соляной кислотой до рН 4 и подвергают восьмикратному экстрагированию н-бутанолом, насыщенным водой, в соотношении 1:1. Бутанольные экстракты промывают 1%-ным раствором гидроксида натрия, при этом отношение щелочной воды к бутанольному экстракту составляет 1:1, и после разделения двух слоев бутанольный слой промывают водой до достижения рН 7. Бутанольные экстракты затем концентрируют под вакуумом до тех пор, пока не удалят бутанол полностью, после чего остаток сушат. В результате получают мягкий и светло-желтый порошок, содержащий 83% фуростаноловых сапонинов. Выход составляет 3% от высушенного на воздухе растительного материала. Анализ продукта выполняют, исходя из протодиосцина (R. Gyulemetova, M. Tomova, M. Simova,T. Pangarova, Pharmazie, 37, Н.4 1982). Результаты испытания воздействия смеси стероидов по данному изобретению на иммунную систему экспериментальных животных Материал и метод Растительный материал. Вещество, содержащее фуростаноловые сапонины (ФС), выделяли из Tribulus terrestris L. (Zigophyllaceae) в соответствии с данным изобретением. Лиофилизированные ФС хранили при 4 С защищенными от света и влаги. Раствор, используемый при экспериментах, готовили по мере потребности в физиологическом растворе. Экспериментальные животные и методика. Самцам мышей ICR (средний вес тела от 18 до 20 г) давали перорально разные дозы ФС в соответствии с описанием, представленным в табл. 1. Экспериментальная инфекция. Экспериментальную инфекцию вызывали у мыши путем подкожного введения 25-30 бактериальных клеток из 18-часовой выращенной на агаре культуры Kl. Pneumoniae (штамм 52145, Институт Пастера, Париж). Доза заражения была выбрана после предварительных экспериментов, предназначенных для определения 50%-ного уровня выживаемости. Инфекция следовала в течение до 8 дней, причем учитывали общее состояние субъекта, уровень смертности (процент), уровень выживаемости и среднюю продолжительность выживания (СПВ 8 в днях). Защитный эффект ФС оценивали по повышению уровня выживаемости и среднюю продолжительность выживания рассчитывали как разницу между результатами для экспериментальных групп и контрольных групп. Испытание in vitro на антибактериальное подавляющее действие. Чувствительность клеток Kl. Pneumoniae к ФС определяли, используя адаптированный вариант метода Бауэра (Bauer) (4). В чашки Петри (100 мм), содержащие агар, засевали 0,2 мл бактериальной суспензии (10 клеток/мл). Делали лунки (10 мм) и заполняли 0,2 мл раствора ФС с разными концентрациями. Области подавления измеряли после инкубации в течение 24 ч при 37 С. В качестве положительного контроля использовали кефлин (Lilly, США) с минимальными подавляющими концентрациями, равными 0,150 мг/мл. Фагоцитарная и микробицидная активность альвеолярных макрофагов аМа. Альвеолярные макрофаги были получены промыванием легких in situ путем вливания и извлечения 0,1-1,0 мл раствора ТСМ 199, содержащего 20 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрепто-2 008763 мицина (Flaw Lab., UK) плюс 3 Ед/мл гепарина (G. Richter, Hungary). Определяли среднее число вымытых аМа из каждой группы, и затем клетки помещали в инкубационные планшеты (BDSL, Шотландия) в концентрации 3 х 10 клеток/мл для оценки их фагоцитарной и микробицидной активности с использованием 3 Н-тимидинового радиометрического метода (5). Результаты Защитное действие от инфекции. Результаты, полученные таким образом, показывают, что ФС влияют на ход и исход экспериментальной инфекции у мышей, вызванной Kl. Pneumoniae. У леченых животных уровень смертности достигал максимума 30-40% на 4-ый - 5-ый день после инфицирования (см. нижеследующую фигуру). Пик уровня смертности в контрольных группах был значительно выше (70-80%) и наблюдался на 2-ой - 3-ий день после инфицирования. Подводя итог, введение ФС приводит к сниженной тяжести клинической картины, более низкому уровню смертности, пролонгированному времени выживания леченых животных. Противоинфекционное действие ФС меняется в соответствии с дозировкой и режимом введения(табл. 1). Наивысшая вводимая доза (625,0 мг/кг) давала самый сильный защитный эффект при всех 10 дневных режимах введения, начиная с 35, 25 или 15 дня перед инфицированием; пик эффекта наблюдали, когда последнюю дозу ФС вводили за 15 дней перед инфицированием. В противоположность заметной активности in vivo, ФС не проявлял антибактериальной активностиin vitro. Раствор ФС в физиологической сыворотке при концентрациях 0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 2,0; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 250,0 и 500,0 мг/мл не подавлял рост Kl. Pneumoniae, в отличие от заметного подавления, наблюдаемого в группе, получавшей кефлин, со средним диаметром 21,51,0 мм. Стимуляция аМа. Дозы в 625,0 мг/кг вызывают увеличение числа аМа и повышение их фагоцитарной и микробицидной активности с максимумом на 20-ый день после последнего введения ФС (табл. 2). Обсуждение В отличие от других сапонинов (3), ФС не проявляют бактерицидного эффекта. ФС влияют на главные эффекторные механизмы клеточного и гуморального иммунитета, обеспечивая, таким образом, существенную защиту от инфекции. Оптимальная доза в 625,0 мг/кг, вводимая в течение последовательных 10 дней, является очень близкой к режиму (6), применяемому у людей. Самый сильный эффект, полученный при этом режиме, когда интервал между последним приемом ФС и инфицированием составляет 15 дней, можно объяснить динамикой активации аМа. Максимальное повышение их функциональной активности наблюдается на 20-ый день, что совпадает с острой фазой инфекции (день с 3 по 5). Большое число аМа с повышенной фагоцитарной и микробицидной способностью предотвращает прогрессирование инфекции и снижает уровень смертности, одновременно повышая уровень выживаемости. Очевидно,защитный эффект ФС полностью достигается только после данного периода времени, необходимого для реакции иммунной системы. ФС активирует аМа, которые играют значительную роль в антибактериальной защите легких, в частности излечении инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, такими как Kl. Pneumoniae (6). Иммуностимулирующие свойства ФС Таблица 1 ФС-индуцированный противоинфекционный эффект в отношении экспериментальной инфекции,вызванной Kl. Pneumoniae Однократная доза ФС (мг/кг в сутки). Дни. с Доза (мг/кг).d Изменение ( ) уровня выживаемости (%). е Изменение ( ) средней продолжительности выживания (дни).-3 008763 Представленные выше результаты являются типичными данными, полученными из трех независимых экспериментов с использованием разных экспериментальных животных. Иммуномодулирующие свойства ФС Таблица 2 Активация аМа у мышей, получавших ФС Дни от последнего введения ФС в течение 10 последовательных дней в дозах 62,5 мг/кг перорально. В тысячах (x103). с Процентное содержание фагоцитарных аМа бактериальных клеток.d Процентное содержание бактериальных клеток, убитых через 1 ч после фагоцитоза аМа. е Статистически недостоверно (р 0,05 по критерию Стьюдента).f В контроли вводили только физиологическую сыворотку. Данные результаты представляют средние арифметические данных из четырех независимых экспериментов с использованием 10 экспериментальных животных для каждой группы. Литература 1. Yamaha, H. (1991) Curr. Opin. Biotechnol., 2, 203. 2. Wagner, H. (1990) Pure Appl. Chem. 131 q 117. 3. Cambell, J.В., Dede J.C. (1989) E.A.G. Lett., 5, 12. 4. Bauer, A.W., Kirby, W.M.M., Sherris, J.C, Truck, M. (1966) Am. J. Clin. 5. Dimov, V., Ivanovska, N., Bankova, V.V., Nikolov, N., Popov, S. (1991) Apidologie 22, 155. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стандартизованная смесь стероидных сапонинов, обладающая иммуномодулирующим и/или иммуностимулирующим действием, полученная из надземной части Tribulus terrestris L. и содержащая более 80% фуростаноловых сапонинов. 2. Способ получения стандартизованной смеси фуростаноловых сапонинов по п.1, включающий экстрагирование измельченного лекарственного материала из надземной части Tribulus terrestris L. с использованием низкомолекулярного спирта, обработку низшим алкилхлоридом, экстрагирование насыщенным водой н-бутанолом, концентрирование и сушку, отличающийся тем, что первое экстрагирование выполняют с использованием водного метанола с соотношением воды/метанола от 1:1 до 1:99 при температуре 50-55 С с последующей очисткой активированным углем и фильтрованием; после концентрирования фильтрата и полного удаления метанола проводят экстрагирование дихлорметаном; выполняют отгонку дихлорметана; полученный таким образом очищенный водный экстракт подкисляют до рН 3-5 с использованием соляной кислоты, затем осуществляют несколько стадий экстрагирования с использованием н-бутанола, после чего следует очистка бутанольных экстрактов посредством промывания бутанольных экстрактов раствором хлорида натрия с последующим их концентрированием до высушивания, растворения сухого остатка в низкомолекулярном спирте и добавления раствора каплями в ацетон, оставляя приблизительно на 24 ч при температуре от 10 до 15 С,фильтрования, промывания ацетоном и высушивания,или посредством промывания бутанольных экстрактов 0,5-1,5%-ным раствором гидроксида натрия и после разделения двух слоев промывания бутанольного слоя водой до достижения рН 7, вакуумконцентрирования бутанольных экстрактов до полного удаления бутанола и высушивания. 3. Применение стандартизованной смеси по п.1 в приготовлении лекарственных средств с иммуномодулирующим и/или иммуностимулирующим действием.-4 008763 Иммуномодулирующие свойства ФС Уровни смертности мышей при инфекции, вызванной Kl. Pneumoniae Уровень смертности (%)