Протеинкиназа candida albicans, обладающая активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ, и способы ее применения

Номер патента: 4710

Опубликовано: 24.06.2004

Авторы: Фай Жерар, Тюре Жан-Ив, Валей Жан Габриель, Манн Карл

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Протеинкиназа, полученная из Candida albicans, выбранная из протеинкиназы, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, и ее аллельные варианты, и определяемая следующими характеристиками:

в ней отсутствует звено GxGx(Y/F)GxV, в котором G обозначает глицин, x обозначает какую-либо аминокислоту, Y/F обозначает либо тирозин, либо фенилаланин, V обозначает валин;

она обладает активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ (Цзк).

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая протеинкиназу по п.1.

3. Нуклеиновая кислота по п.2, имеющая последовательность SEQ ID NO:1.

4. Применение нуклеиновой кислоты по п.3 для скрининга банка кДНК C.albicans.

5. Применение нуклеиновой кислоты с последовательностью SEQ ID NO:1 или комплементарной нуклеиновой кислоты для получения протеинкиназы по п.1.

6. Рекомбинантный вектор для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.2 или 3, получаемый путем встраивания указанной нуклеиновой кислоты в подходящий вектор клонирования.

7. Рекомбинантный вектор для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.2 или 3, получаемый путем встраивания указанной нуклеиновой кислоты в подходящий вектор экспрессии.

8. Способ скрининга фунгицидных продуктов, отличающийся тем, что он включает стадию, в которой измеряют активность киназы по п.1 в присутствии каждого из продуктов, у которых определяют фунгицидные свойства, и отбирают продукты, проявляющие ингибирующий эффект в отношении этой активности.

 

Текст

Смотреть все

1 Настоящее изобретение относится к новой протеинкиназе Candida albicans, обладающей активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ и к ее применению. Циклинзависимые протеинкиназы (Цзк) являются основными регуляторами цикла клеточного деления у эукариотов как при переходеG1/S/, так и при переходе G2/M клеточного цикла. Первыми идентифицированными Цзк были CDC28 Saccharomyces cerevisae и CDC2Schizosaccharomyces pombe. Активация циклинзависимых киназ требует одновременной фиксации молекулы циклина и фосфорилирования Цзк на сохраняющемся остатке треонина, расположенном в области,называемой петлей Т. Было показано, что это фосфорилирование осуществляется киназой, называемой киназой,активирующей Цзк (Кац), которая у позвоночных имеет форму гетеротримера, содержащего каталитическую субъединицу, имеющую название Cdk7, субъединицу циклинового типа,имеющую название циклин Н, и фактор МАТ-1(см. Solomon, Trends Biochem.Sci., 1994, 19, 496500). Комплекс Сdk7-циклин Н является кроме того компонентой комплекса TFIIH, необходимой для базальной транскрипции генов с помощью РНК-полимеразы II, и участвует в фосфорилировании повторяющихся последовательностей С-концевого домена (Скд) большой субъединицы этой полимеразы. У размножающихся делением дрожжейSchizosaccharomyces pombe был идентифицирован комплекс, подобный комплексу Cdk7 циклин Н, содержащий каталитическую субъединицу, называемую Crk1, и регуляторный циклин Mcs2. Было показано, что ген Crk1 является важным для жизнедеятельности клетки, a in vitro наблюдали, что комплекс Crk1-Mcs2 имеет отношение к активности Кац и активности Скдкиназы [Buck et al., EMBO J., 1955, 14(24) 617383; Damagnez еt al., EMBO J., 1995, 14(24), 616472]. У почкующихся дрожжей Saccharomycescerevisae был также обнаружен комплекс, содержащий одну киназу (Kin28) и один циклин(Ccll), родственные на уровне последовательностей, соответственно, киназам Cdk7 и Crk1 и регуляторным белкам циклину Н и Mcs2. Комплекс Kin28-Ccl1 составляет часть комплексаTFIIH и обладает активностью Скд-киназы, но не имеет отношения к активности КАЦ. Заявителем была идентифицирована киназа, ответственная за активность КАЦ у Saccharomyces cerevisae. Эта киназа была названа CIV1CIV1 [Thuret et al., Cell, 1996, 86 (4)]. Эти результаты были подтверждены другими исследовательскими группами [Kaldis et al., Cell, 1996,86(4) 553-564; Espinoza et al., Science, 1996, 273(5282), 1714-1717]. КАЦ Saccharomyces cerevisae в целом подобен семейству серин-треонинкиназ 2 и особенно протеинкиназам CDC2 и CDC28, и в то же время отличается от ранее идентифицированных КАЦ у других организмов отсутствием сохраняющегося звена с большим количеством глициновых остатков: GxGx(Y/F)GxV, которое имеется у большинства протеинкиназ, наличием вставок от 5 до 29 аминокислот, расположенных между элементами вторичной структуры, сохраняющимися у семейства Cdk, и тем фактом,что активность КАЦ Saccharomyces cerevisae не требует его включения в ферментный комплекс. Поскольку активность КАЦ у CIV1 необходима для жизнедеятельности и деления клеток, было предпринято исследование с целью выяснения, имеются ли у патогенных дрожжей гены, гомологичные генам CIV1, кодирующим протеинкиназы, обладающие активностью КАЦ. В действительности, в этом случае получение средств регуляции этой активности и особенно получение ингибиторов представило бы большой интерес для промышленности или терапевтической практики, и главным образом для получения фунгицидов. С этой целью заявитель просмотрел ряд банков ДНК патогенных дрожжей Candida albicans с использованием зондов, являющихся производными различных участков гена CIV1Saccharomyces cerevisae. Однако, ни один из использованных зондов не позволил обнаружить наличие гомологичных последовательностей в геноме Candida albicans. Тогда было проведено исследование с целью выяснения, имеет или нет Candida albicans функциональный аналог КАЦ Saccharomycescerevisae путем поиска наличия у Candidaalbicans одного или более генов, способных восстанавливать у Saccharomyces cerevisae функцию КАЦ в термочувствительном мутанте генаCIV1. Таким образом удалось идентифицировать ген у Candida albicans, который способен восполнить недостающую у мутанта функцию КАЦ. Была определена последовательность этого гена, названного CaCIV1. Она приведена в списке последовательностей в приложении под номером SEQ ID NO:l. Последовательность продукта его транскрипции, названная CaCIV1,приведена под номером SEQ ID NO:2. На фиг. 1 представлено сравнение аминокислотной последовательности (код 1-буква)CaCIV1 с аминокислотными последовательностями КАЦ Saccharomyces cerevisae (называемой ScCIV1) и киназы CDC28 Saccharomycescerevisae (называемой ScCDC28). Сохраняющиеся остатки в ScCIV1 и CaCIV1 выделены жирным шрифтом. Расшифровка обозначений на фиг. 1:CaCIV1 только 28% из них идентичны аминокислотам последовательности SaccharomycesCaCIV1 сходство позволяет определить семейство киназ, называемое далее CIV1, в которое входят белки, обладающие следующими характеристиками: в этих белках отсутствует звеноGxGx(Y/F)GxV, в котором G обозначает глицин,х обозначает какую-либо аминокислоту, Y/F обозначает либо тирозин, либо фенилаланин и V обозначает валин; белки обладают активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ (Цзк). Настоящее изобретение относится к протеинкиназам, принадлежащим к определенному выше семейству CIV1, за исключением KAЦScCIV1 Saccharomyces cerevisae. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения названная протеинкиназа может быть получена из какого-либо аскомицета, преимущественно из какого-либо гемиаскомицета, из которых предпочтение отдается Candida albicans. Протеинкиназа по изобретению представлена, например, аминокислотной последовательностью, приведенной в приложении под номером SEQ ID NO:2. Предметом настоящего изобретения является также нуклеотидная последовательность,кодирующая протеинкиназу по изобретению. Нуклеотидная последовательность по изобретению может быть, например, представлена приведенной в приложении последовательностью SEQ ID NO:l. Предметом настоящего изобретения являются также фрагменты нуклеиновой кислоты размером по меньшей мере 18 пар оснований,гомологичные или комплементарные нуклеотидной последовательности, кодирующей специфическую пептидную последовательность КАЦ по изобретению. Эти фрагменты могут быть, в частности,использованы в качестве зондов гибридизации и/или праймеров амплификации для выделения и/или клонирования из Candida albicans нуклеотидной последовательности, кодирующей КАЦ по изобретению. Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным фрагментам размером по меньшей мере 15 пар оснований, предпочтительно не менее 18 пар оснований, которые являются гомологичными и комплементарными нуклеотид 004710 4 ной последовательности, кодирующей сохраняющуюся пептидную последовательность в семействе протеинкиназ по изобретению, определенных как КАЦ CaCIV1, и протеинкиназ КАЦ ScCIV1 Saccharomyces cerevisae. Эти фрагменты могут быть, в частности,использованы в качестве зондов гибридизации и/или праймеров амплификации для выявления наличия у организмов отличных от Saccharomyces cerevisae и Candida albicans последовательностей, кодирующих киназы, родственные КАЦCaCIVl и ScCIVl, и для выделения и/или клонирования идентифицируемых таким образом генов. Изобретение относится также к полученным таким образом нуклеотидным последовательностям, а также к протеинкиназам семейства КАЦ CaCIV1 и ScCIV1, кодируемым этими последовательностями. Предметом настоящего изобретения является также любой рекомбинантный вектор и, в частности, любой вектор экспрессии, образованный путем встраивания по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в подходящий вектор. Выбор подходящего вектора может быть легко осуществлен специалистами из многочисленных имеющихся в наличии векторов в зависимости от клетки-хозяина, выбранной для размножения и/или экспрессии нуклеиновой кислоты, соответствующей настоящему изобретению. Изобретение относится также к прокариотическим и эукариотическим клеткам, трансформированным нуклеотидной последовательностью по изобретению. Эти трансформированные клетки могут быть, в частности, использованы для экспрессии киназы по изобретению,например, для ее очистки в клеточных культурах, например, с использованием методов, аналогичных методам, описанным выше авторами изобретения для CIV1 Saccharomyces cerevisae(приведенная выше ссылка Thuret et al., 1995),или же для выявления активности этой киназы с помощью подходящего теста на выживаемость клетки. Доказательство авторами изобретения функциональной гомологии киназ CaCIV1 иScCIV1 позволяет предвидеть многочисленные пути применения для этого семейства киназ. В частности, исходя из того факта, что активность не являющейся циклинзависимой КАЦ из этого семейства киназ является, повидимому, существенной для выживания и деления клеток, ингибирующие эту активность вещества могут представлять ценность в качестве фунгицидов либо в виде лекарственных препаратов, либо в виде промышленных фунгицидов. Для выявления фунгицидных веществ, таких как вещества, активные в отношении киназCandida albicans, производят, например, измерение активности киназы CaCIVl или одного из ее функциональных гомологов, образованного не 5 являющейся циклинзависимой КАЦ семействаCIV1, в присутствии каждого из продуктов, у которых определяются фунгицидные свойства,и отбирают продукты, проявляющие ингибирующий эффект в отношении этой активности. Такого рода отбор может производиться путем измерения киназной активности у КАЦ семейства CIV1 в присутствии тестируемых потенциальных активаторов или ингибиторов. Киназную активность можно, например, измерять in vitro либо путем непосредственной детекции фосфорилирования субстратного пептида или белка, например CDC28 или Cdk2 или белка МBР (основного миелинового белка) в подходящей реакционной смеси, либо опосредованно путем детекции и/или измерения активности субстратного белка в том случае, когда последняя зависит от фосфорилирования. Киназная активность может быть также измерена in vivo с использованием теста на выживаемость клеток. Например, киназную активность CaCIV1 предпочтительно измерять в трансформированных геном CaCIV1 клетках мутанта Saccharomyces cerevisae, не экспрессирующего КАЦ ScCIV1. Таким образом изобретение относится к способу скрининга фунгицидных продуктов,включающему измерение активности протеинкиназы, описанной выше, в присутствии определяемых продуктов и отбор продуктов, проявляющих ингибирующий эффект в отношении фунгицидной активности,Изобретение станет более понятным с помощью следующего ниже дополнения к описанию в виде примера, иллюстрирующего доказательство активности КАЦ CaCIV1 и клонирование соответствующего гена. Пример Штамм Saccharoroyces cerevisae, CMY975(генотип CIV1-2 ura3 leu2 trp1 lys2 ade2 ade3) содержит термочувствительную мутацию генаCIV1 и по этой причине прорастает не при 37 С,а при 24 С. Культуру этого штамма трансформируют литийацетатным методом (Schiesti и Gietz, Current Genetics, 1989, 16, 339-346) с использованием банка геномных фрагментов Sau3A CandidaYEp24 (мультикопия-URA3) (Botstein et al.,Gene, 1979, 8, 17-24). Клетки CMY975 помещают в чарки с не содержащей урацила синтетической средой и культивируют при 37 С. В названных условиях были получены десять колоний CMY975. Из каждой колонии были выделены плазмиды YEp24, содержащие включения Candida albicans, и амплифицированы в Escherichia coli. Была получена рестрикционная карта каждой из этих плазмид, которая позволила установить, что все вставки происходят из одного и того же участка генома Candida albicans. Секве 004710 6 нирование этого участка позволило выявить одну и ту же открытую рамку считывания, кодирующую протеинкиназу из 339 аминокислот,что свидетельствует о том, что все 10 отдельно полученных вставок соответствуют одному и тому же гену Candida albicans. Этот ген получил название CaCIV1. Последовательность CaCIV1 приведена в списке последовательностей в приложении под номером SEQ ID NO:l, а последовательность белка CaCIV1 представлена под номером SEQCaCIV1 с имеющимися в базе данных последовательностями дает основание полагать, что у этого белка имеется только 28% аминокислот,идентичных аминокислотам КАЦ Saccharomyces cerevisae ScCIV1 и 24% аминокислот, идентичных аминокислотам Cdk ScCDC28 Saccharomyces cerevisae и CaCDC28 Candida albicans. Геномный фрагмент BamHI-Clal размером 3 тыс. пар оснований, содержащий ген CaCIV1,был далее клонирован в центромерной плазмиде TRP1 pRS414 (Sikorski и Hieter, Genetics,1989, 122, 19-27). Эту плазмиду использовали для трансформации мутанта Saccharomyces cerevisae, в котором последовательность ScCIV1 удалена из генома и который содержит генScCIV1 на репликативной плазмиде, включающей также селекционный ген URA3 (штаммLEU2/pJG43 (URA3-ScCIV1). Трансформированные плазмидой URA3-ScCIV1 клетки жизнеспособны после контрселекции и утраты плазмиды pJG43 (URA3-ScCIV1), что подтверждает тот факт, что ген CaCIV1 может функционировать вместо основного гена ScCIV1. Следовательно, ген CaCIV1 кодирует функциональный гомолог ScCIV1 и достаточен для восстановления активности КАЦ.albicans, выбранная из протеинкиназы, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, и ее аллельные варианты, и определяемая следующими характеристиками: в ней отсутствует звено GxGx(Y/F)GxV, в котором G обозначает глицин, х обозначает какую-либо аминокислоту, Y/F обозначает либо тирозин, либо фенилаланин, V обозначает валин; она обладает активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ (Цзк). 2. Нуклеиновая кислота, кодирующая протеинкиназу по п.1. 3. Нуклеиновая кислота по п.2, имеющая последовательность SEQ ID NO:1. 4. Применение нуклеиновой кислоты по п.3 для скрининга банка кДНК С.albicans. 5. Применение нуклеиновой кислоты с последовательностью SEQ ID NO:1 или комплементарной нуклеиновой кислоты для получения протеинкиназы по п.1. 6. Рекомбинантный вектор для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.2 или 3, получаемый путем встраивания указанной нуклеиновой кислоты в подходящий вектор клонирования. 7. Рекомбинантный вектор для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.2 или 3, получаемый путем встраивания указанной нуклеиновой кислоты в подходящий вектор экспрессии. 8. Способ скрининга фунгицидных продуктов, отличающийся тем, что он включает стадию, в которой измеряют активность киназы по 10 п.1 в присутствии каждого из продуктов, у которых определяют фунгицидные свойства, и отбирают продукты, проявляющие ингибирующий эффект в отношении этой активности.

МПК / Метки

МПК: C12N 9/12

Метки: фосфорилирования, применения, обладающая, протеинкиназа, протеинкиназ, циклинзависимых, активностью, candida, albicans, способы

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/6-4710-proteinkinaza-candida-albicans-obladayushhaya-aktivnostyu-fosforilirovaniya-ciklinzavisimyh-proteinkinaz-i-sposoby-ee-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Протеинкиназа candida albicans, обладающая активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ, и способы ее применения</a>

Похожие патенты