Способ определения лептина или лептиномиметика
Формула / Реферат
1. Способ определения лептина или лептиномиметика в пробе, включающий в себя обеспечение контакта указанной пробы с клеткой или клеточной линией, которая экспрессирует ангиопоэтин-2 (Ang-2) в ответ на лептин, и количественное определение либо Ang-2 в культуральной среде, либо клеточной мРНК, кодирующей Ang-2.
2. Способ по п.1, в котором используется эукариотическая клетка или клеточная линия.
3. Способ по п.2, в котором эукариотическая клетка или клеточная линия является клеткой или клеточной линией млекопитающего.
4. Способ по п.3, где клеточная линия выбрана из линий клеток дифференцированных адипоцитов мыши.
5. Способ по п.4, где клеточная линия представляет собой линию Swiss 3T3 F442A преадипоцитов мыши.
6. Способ по п.3, где клеточная линия выбрана из линий клеток человека.
7. Способ по п.6, где клеточная линия представляет собой линию стромальных клеток hMS2-12 костного мозга человека.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Ang-2 количественно определяют в культуральной среде с помощью иммунного анализа.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Ang-2 количественно определяют в культуральной среде с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием моноклональных и поликлональных антител против Ang-2.
10. Способ по любому из пп.1-7, в котором наличие мРНК, кодирующей Ang-2, определяют в культивируемых клетках или клеточных линиях с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).
Текст
1 Область изобретения Настоящее изобретение связано с системами анализа для определения активности лептина. Более конкретно, изобретение связано с анализом in vitro лептина или агентов, которые имитируют биологическую активность лептина(здесь: лептин-имитирующие агенты, или лептиномиметики). Такой анализ пригоден для применения, например, при обширном скрининге библиотек молекул. Основы изобретения Ожирение, определяемое как излишек жира в организме по отношению к "постной" массе тела, ассоциировано с психологической и медицинской болезненностью, причем последнее включает в себя гипертонию, повышенный уровень липидов в крови и инсулинонезависимый сахарный диабет или сахарный диабет типа II(NIDDM). В США насчитывается 6-10 миллионов индивидуумов с NIDDM, включая 18% популяции в возрасте 65 лет (Kamel, HK, et al,Clin. Geriatr. Med., 1999, 15, 265). Приблизительно 45% мужчин и 70% женщин с NIDDM имеют ожирение, причем при снижении веса проявления диабета у них существенно облегчаются или же исчезают (Harris 1991, DiabetesCare, 14, 639). Лептин, продукт гена тучности (Zhang, Y.,et al, 1994, Nature 372, 425), функционирует в качестве периферического сигнала для мозга,который регулирует поглощение пищи и энергетический обмен. Полагают, что лептин оказывает свое действие на гипоталамус через свой рецептор, OB-R (Tartaglia, L. A., et al, 1995, Cell 83, 1263). У грызунов с мутациями, которые предотвращают нормальную экспрессию либо лептина, либо полноразмерного OB-R, наблюдаются сильное ожирение, диабет и снижение скорости метаболизма (Coleman, D. L. 1978,Diabetologia 14, 141). Однако у человека ожирение возникает, вероятнее всего, не в связи с мутациями в генах, кодирующих лептин или OB-R(Considine, R. V., et al, 1995, J. Clin. Invest. 95,2986: Considine. R. V., et al, 1996, Diabetes 19,992). Несмотря на то, что мышам с мутантным геном тучности можно вернуть нормальный вес путем введения рекомбинантного лептина (Pelleymounter, M. A., et al, 1995, Science 269, 540:Halaas, J. L., et al, 1995, Science 269, 543; Campfield, L. A., et al, Science 269, 546),маловероятно, чтобы такой подход был успешным в применении к человеку с ожирением,поскольку у него уровни лептина в сыворотке хронически повышены (Maffei, M., et al, 1995,Nature Med. 1, 1155; Considine, R. V., et al, 1996,N. Engl. J. Med. 334, 292; Sinha, M. K., et al,1996, J. Clin. Invest. 98, 1277) . Таким образом,люди с ожирением, вероятнее всего, являются 2 шении, что у них не вырабатывается сигнал,пропорциональный уровню лептина в их сыворотке, возможно, из-за дефекта транспорта лептина через гематоэнцефалический барьер (Caro,J. F., et al, 1996, Lancet 348, 159) или неадекватного ответа OB-R. Количественные анализы путей передачи сигнала OB-R могут выявить альтернативные терапевтические подходы к усилению ответов OB-R для преодоления резистентности к лептину и обратимости ожирения. Лептин и OB-R являются, соответственно, членами суперсемейств четырехспирального пучка цитокинов и рецепторов (Tartaglia, L. A., et al,1995, Cell 83, 1263; Madej, Т., et al, 1995, FEBSLett. 373, 13). OB-R имеет наибольшее сходство с передающим сигнал рецептором gp130, который активируется цитокинами, такими как интерлейкин 6 и CNTF, пути передачи сигналов которых интенсивно исследовались (Kishimoto,Т., et al, 1992, Science 258, 593; Stahl. N.Yancopoulos. G. D. 1994, J. Neurobiology 25, 14 54). Рецепторы лептина транслируются в виде продуктов нескольких альтернативных сплайсингов с различными цитоплазматическими доменамиMed. 2, 585; Wang, M. Y., et al, 1996, FEBS Lett. 392, 87), но вероятно, только одна изоформа,известная как длинная форма, или OB-Rb способна к опосредованию контролирующих вес эффектов лептина (Lee, G.-H., et al, 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al, 1996, Cell 84, 491; Ghilardi, N., et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6231; Baumann, H., et al, 1996, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93, 8374). У диабетических (db) мышей с ожирением имеется мутация в OB-R,которая предотвращает экспрессию длинной сплайсированной изоформы OB-R, что делает их неспособными соответствующим образом опосредовать действие лептина (Lee, G.-H., et al,1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al, 1996, Cell 84, 491) . Изучение новых биологически активных молекул, которые используются в качестве лекарственных средств для лечения опасных для жизни заболеваний, включает в себя две основные операции: (i) более или менее случайный выбор молекулы-кандидата, полученной либо путем химического синтеза, либо путем выделения из природных источников, и (ii) тестирование молекулы-кандидата на предмет выявления у нее представляющего интерес свойства или свойств. Цикл тестирования независимо повторяется до тех пор, пока не будет идентифицирована молекула, обладающая необходимыми свойствами. В большинстве случаев выбираемые для тестирования типы молекул чаще всего принадлежат узко определенным химическим классам. Например, изучение новых пептидных гормонов включает в себя работу с пептидами; изучение новых терапевтических сте 3 роидов включает в себя работу со стероидными ядрами. В результате изучение новых функциональных молекул, которых в природе огромное количество, почти всегда является исключительно времяемким, утомительным, непредсказуемым и дорогим предприятием. В новых теориях о биологической активности утверждается, что биологические активности, а следовательно, и физиологические состояния, являются результатом явления молекулярного узнавания. Например, нуклеотиды способны образовывать комплементарные пары оснований, так, что комплементарные одноцепочечные молекулы гибридизуются, образуя структуры двойной и тройной спирали, которые, вероятнее всего, участвуют в регуляции экспрессии генов. В качестве другого примера,биологически активная молекула, называемая лигандом, связывается с другой молекулой,обычно макромолекулой, называемой акцептором лиганда (например, рецептор или фермент),и такое связывание влечет за собой целый ряд молекулярных явлений, которые обязательно отражаются на физиологическом состоянии,например, нормальном росте и дифференцировке клеток, аномальном росте клеток, ведущем к канцерогенезу, регуляции давления крови, выработке и распространении нервного импульса и т.д. Связывание между лигандом и акцептором лиганда является геометрической характеристикой, исключительно специфической, включающей в себя соответствующую аранжировку трехмерной структуры и химические взаимодействия. В настоящее время предпочтительная стратегия развития агентов, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, включает в себя обнаружение форм лигандов биологических рецепторов, ферментов или родственных макромолекул, которые имитируют такие лиганды и либо усиливают (т.е. действуют наподобие агонистов), либо тормозят (т.е. действуют как антагонисты) активность, проявляемую акцептором или рецептором. Обнаружение таких лигандов обычно осуществляется либо путем случайного скрининга молекул (продуцируемых путем химического синтеза или выделенных из природных источников, см., например, К. Nakanishi, Acta Pharm. Nord., 1992, 4,319-328), или с помощью так называемого "рационального" подхода, включающего в себя идентификацию ведущей структуры - обычно,как правило, структуры нативного лиганда, и оптимизацию ее свойств в результате многочисленных циклов структурных перестроек и биологического тестирования (см., например, Testa,В.Kier, L.B. Med. Res. Rev. 1991, 11, 3548 andRotstein, S.H.Mureko, M.A., J. Med. Chem. 1993, 36, 1700). Поскольку большинство полезных лекарственных средств было открыто не в результате "рационального" подхода, а путем скрининга случайно выбранных соединений, в настоящее время появился смешанный подход к 4 открытию лекарственных веществ, который основан на применении комбинаторной химии для построения огромных библиотек построенных наугад химических структур, которые подвергаются скринингу с целью обнаружения специфических биологических активностей (Brenner,S.Lerner, R.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992,89, 5381). Любой скрининг таких огромных библиотек созданных наугад химических структур должен представлять собой оправданный с точки зрения денежных затрат эффективный биологический количественный анализ, который поддавался бы автоматизированию. Традиционно испытание лептина производили in vivo, инъецируя его мышам ob/ob, а затем наблюдая за их потерей веса. Такое биологическое испытание является весьма обременительным, не воспроизводимым и отнимает много времени. Оно также не подходит для применения при широкомасштабном скрининге библиотек, содержащих миллионы соединений. Кроме этого, были описаны также некоторые более простые системы анализа. Например, обнаружение того, что длинная форма OB-R содержит последовательность YXXQ (Tartaglia, L.A., et al, (1995) Cell 83, 1263), являющуюся мотивом, который в точности обусловливает активацию STAT3 (Stahl, N., et al, (1995) Science 267,1349), дает возможность предположить, чтоSTAT3 является критичным для ответов, опосредованных лептином. Результаты недавних исследований позволили выявить, что STAT3 активируется как в культивируемых клетках(Vaisse, C, et al, (1996) Nature Gen. 14, 95) посредством длинной формы OB-R, но не укороченной (в результате процессинга) формы OB-R и не длинной формой OB-R с мутантным мотивом YXXQ (Baumann, H., et al, 1996) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93, 8374; White, D. W., et al,(1997) J. Biol. Chem. 272, 4065). В патентной заявке РСТWO9857177 предлагается применение активации STAT3 в качестве основы для простого биологического анализа лептина invitro. Однако STAT3 активируется также и многими другими гормонами и цитокинами, включая IL-6, CNTF, интерферон альфа и бета, гормон роста и многие другие цитокины и полипептидные гормоны. Следовательно, активацияSTAT3 не может быть использована в качестве специфического маркера активности лептина. В заявке РСТ WO9740380 описывается применение кассеты ДНК, так называемого"элемента лептинового ответа". Прикрепление этой кассеты ДНК к промотору, такому как промотор тимидинкиназы, и репортерному гену,такому как [ген] люциферазы, обеспечит соответствующий репортерный вектор. Клетки, экспрессирующие рецептор лептина OB-Rb, транс 5 фицируются репортерным вектором. Такие клетки предлагаются в качестве средства для анализа лептина in vitro. Однако согласно заявке РСТ WO9740380, предлагаемый "элемент лептинового ответа" идентичен "последовательности гамма-активации", хорошо известному элементу, который активируется многими другими цитокинами, и в частности, интерфероном гамма, интерфероном альфа и интерфероном бета. Следовательно, в анализах, основанных на последовательности гамма-активации, нельзя будет отличить активность лептиномиметика от активности, например, интерферономиметика. Еще один способ анализа in vitro основан на химерном рецепторе, состоящем из внеклеточного домена OB-R, слитом с трансмембранным доменом и с внеклеточным доменом репортерного рецептора, такого как рецептор IL-3. Показано, что IL-3-зависимые клетки, экспрессирующие указанный химерный рецептор, могут быть использованы для количественного определения лептина, который осуществляет промоцию клеточной пролиферации. Таким образом, при экспозиции с лептином указанные клетки будут пролиферировать, и их пролиферацию можно будет определить путем окрашивания МТТ или же путем включения радиоактивно меченного тимидина (Verploegen SA, et al,1997, FEBS Lett. 405, 237). Такая система анализа надежна, она используется для количественного определения лептина и пригодна для широкомасштабного скрининга. Однако молекулы,отобранные в результате такого широкомасштабного скрининга на основе указанного анализа, могут вообще не являться лептиномиметиками. Было показано, например, что агент,являющийся истинным инсулиномиметиком,обнаруженный в результате широкомасштабного скрининга, реализует свое действие путем взаимодействия с цитоплазматическим доменом инсулинового рецептора (Zhang В., et al, 1999,Science 284, 974). Следовательно, существует риск, что молекулы, отобранные с помощью химерных рецепторов, таких как указанный химерный рецептор лептин-IL-3, будут взаимодействовать с цитоплазматическим доменом,полученным из химерного IL-3, а следовательно, будут представлять собой скорее миметикиIL-3, нежели лептиномиметики. Следовательно,такой путь анализа не пригоден для скрининга имитирующих лептин агентов, лептиномиметиков. Лептин, продукт гена тучности, экспрессируется в адипоцитах и регулирует поглощение пищи и энергетический обмен через свой гипоталамический рецептор OB-Rb. Отсутствие лептина, как в случае мышей ob/ob, или же отсутствие OB-Rb, как в случае мышей db/db, приводит к болезненной полноте. Однако наиболее распространенные случаи ожирения у человека не связаны с дефицитом лептина. Фактически уровень лептина в сыворотке коррелирует с показа 004709 6 телем массы тела, а следовательно, тучные индивидуумы имеют высокий уровень лептина в сыворотке. Такая корреляция дает основание полагать, что ожирение ассоциируется с некоторой формой резистентности к лептину. Одним из возможных механизмов резистентности к лептину является неспособность лептина преодолевать гематоэнцефалический барьер. Действительно, интрацеребровентрикулярное введение лептина было значительно более эффективным в уменьшении массы жировой ткани у грызунов по сравнению с периферическими путями введения лептина. Получение лептиномиметиков, которые могут преодолевать гематоэнцефалический барьер, может решить проблему лептинорезистентности. Для этой цели полезно произвести скрининг библиотек, состоящих из никомолекулярных агентов, с целью идентификации индивидуальных агентов, которые обладают активностью лептиномиметиков. Для такого скрининга требуется простой и специфический биологический анализ активности лептина. Таким образом, как описано выше, биологическая активность лептина может быть определена только путем испытания на животных. Такие испытания являются весьма обременительными, и следовательно, не подходят для скрининга библиотек, состоящих из миллионов различных веществ. Было описано несколько вариантов испытаний in vitro, но они не являлись лептиноспецифичными. Следовательно, существует необходимость создания простого и специфического метода анализа активности лептина, который легко можно будет автоматизировать. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение, таким образом,обеспечивает способ определения наличия лептина или агента, имитирующего действие лептина (лептиномиметика), включающий в себя приведение пробы в контакт с клеткой или клеточной линией, которая в ответ на лептин экспрессирует Ang-2, и количественное определение либо Ang-2 в культуральной среде, либо клеточной РНК, кодирующей Ang-2, либо активации промотора Ang-2. Предпочтительно использовать эукариотическую клетку или клеточную линию, более предпочтительно - клетку или клеточную линию млекопитающего. Подходящими линиями клеток являются,например, линии клеток дифференцированных адипоцитов мыши, например, линия мышиных преадипоцитов Swiss 3T3 F442A, или линии клеток человека, например, линия стромальных клеток костного мозга человека hMS2-12. В соответствии с изобретением, количественное определение Ang-2 производят обычным образом в культуральной среде с использованием твердофазного иммуноферментного анализа(ELISA), включающего в себя моноклональные и поликлональные антитела против Ang-2. 7 Такой метод ELISA можно адаптировать к современным методам скрининга, таким как широкомасштабный скрининг. Наличие Ang-2-PHK определяется в культивируемых клетках или клеточных линиях обычным способом с использованием цепьевой реакции полимеразы обратной транскрипции(RT-PCR). Активацию промотора ANG-2 регистрируют, в соответствии с настоящим изобретением, путем создания конструкции, содержащей область промотора Ang-2, которая включает в себя промотор и по меньшей мере один элемент лептинового ответа, а также репортерный ген,оперативно связанный с областью промотора,предпочтительно встроенной в подходящий вектор, трансфицирующий хозяйскую клетку,которая экспрессирует Ang-2 в ответ на лептин,путем инкубирования с пробой и количественного определения экспрессии репортерного гена обычным способом. Настоящее изобретение также обеспечивает вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую промоторную область Ang-2, содержащую промотор и по меньшей мере один элемент лептинового ответа, и репортерный ген, оперативно связанный с областью промотора. Подробное описание изобретения В соответствии с данным изобретением,получены способы анализа лептина in vitro. Такие способы подходят для широкомасштабного скрининга лептиномиметиков. Обнаружено, что лептин специфически индуцирует экспрессию гена ангиопоэтина-2 в культивируемых жировых клетках. Широкомасштабный скрининг агентов, имитирующих действие лептина, достигается путем количественного определения уровня индуцируемой лептином секреции ангиопоэтина-2 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Альтернативно, активность лептина может быть установлена путем измерения активации промотора ангиопоэтина-2, связанного с репортерным геном и встроенного в культивируемые жировые клетки. В соответствии с данным изобретением,получены способы анализа лептина in vitro. Такие способы подходят также для широкомасштабного скрининга лептиномиметиков. В совместно рассматриваемой патентной заявке Израиля 131739, поданной 5 сентября 1999,описано, что лептин специфически индуцирует экспрессию гена ангиопоэтина-2 в культивируемых адипоцитах. В отсутствие лептина ангиопоэтин-2 в культивируемых адипоцитах не экспрессируется, а индукция ангиопоэтина-2 под действием лептина является весьма интенсивной и очень специфичной. Следовательно,можно количественно определить активность лептина и лептиномиметика, обработав соответствующие эукариотические клетки различными дозами лептина или агентов, имитирующих леп 004709 8 тин, и затем определив либо уровень ангиопоэтина-2 в культуральной среде, либо определив клеточную мРНК, кодирующую ангиопоэтин-2,либо измерив активацию промотора ангиопоэтина-2. Указанными соответствующими клетками млекопитающих могут быть любая клетка или линия клеток, экспрессирующих ангиопоэтин-2 в ответ на обработку лептином. Обычно предпочтительными хозяйскими клетками являются удобные для культивирования эукариотические клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, и в особо предпочтительном варианте это дифференцированные мышиные адипоциты. Самой предпочтительной линией клеток является линия Swiss 3T3 F442A мышиных преадипоцитов (Green, H., and Kehinde, О., 1975,Cell 5, 19), которые дифференцируются в зрелые адипоциты в условиях поддержания конфлуэнтных клеток в среде, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС), в течение шести дней. Другой наиболее предпочтительной линией клеток является линия стромальных клеток костного мозга человека, hMS2-12, которые экспрессируют рецептор лептина и могут быть индуцированы к дифференцировке в адипоциты (Thomas Т., et al, 1999, Endocrinology 140, 1630). Многие из общедоступных обычно применяемых способов могут быть адаптированы специалистами для определения ангиопоэтина-2 в культуральной среде, клеточной мРНК, кодирующей ангиопоэтин-2, или для количественного определения активации промотора ангиопоэтина-2. В одном из аспектов настоящего изобретения разработан метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для количественного определения мышиного ангиопиэтина-2. Для разработки метода ELISA требуется мышиное моноклональное антитело для захвата ангиопоэтина-2 на планшете ELISA. Очищенное моноклональное антитело используется в качестве первичного покрытия планшета ELISA,чтобы захватить Ang-2 из культурального супернатанта. У животных-хозяев (например, у кролика) получено поликлональное антитело против ангиопоэтина-2. Следует отметить, что ангиопоэтин-2, используемый при получении антител, должен быть получен у того же вида,что и клеточная линия, используемая для его индукции под действием лептина. Для выполнения анализа клетки, которые экспрессируют ангиопоэтин-2 в ответ на действие лептина, выращивают, например, в 96-луночных планшетах. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемый лептиномиметик добавляют в культуру, и в течение 24-96 часов проводят инкубирование. Затем отбирают аликвоты культуральной среды и переносят их на планшетыELISA, которые были предварительно покрыты указанным захватывающим моноклональным антителом, специфичным в отношении ангиопоэтина-2. Планшеты ELISA инкубируют в тече 9 ние 1-16 ч, промывают и добавляют указанное поликлональное антитело против ангиопоэтина 2. Планшеты ELISA инкубируют в течение 1-16 ч, промывают и добавляют конъюгат ферментантитело. Обычно в качестве конъюгатов используют козьи антитела против иммуноглобулина кролика, конъюгированные с пероксидазой или с щелочной фосфатазой. Планшеты ELISA инкубируют в течение 1-16 ч, промывают и проявляют добавлением соответствующего субстрата. После этого указанные планшеты ELISA подвергают автоматизированному широкомасштабному скринингу. В другом воплощении настоящего изобретения в указанных культивируемых клетках,обработанных лептином или лептиномиметиком, определяли мРНК, кодирующую ангиопоэтин-2. Специфическую мышиную мРНК, кодирующую ангиопоэтин-2, можно определить с помощью цепьевой реакции полимеразы обратной транскрипции (RT-PCR). Широкомасштабную RT-PCR можно реализовать, например, с использованием специфических "молекулярных маяков" (Research Genetics, Huntsville Alabama,USA). Существуют одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие одновременно и флуоресцентную метку, и гаситель (флуоресценции) на их 5'- и 3'-концах, соответственно. Олигонуклеотид сконструирован таким образом, чтобы включать в себя последовательность шпилечной петли, комплементарную последовательности кДНК ангиопоэтина-2. Кроме того, конструкция олигонуклеотида должна включать в себя стволовую структуру шпилечной петли так, что когда молекулярный маяк не связан с PCRамплифицированной кДНК ангиопоэтина-2,флуорофор гасится 3'-гасителем в результате передачи энергии, и флуоресценция не возникает. Однако если добавить PCR-амплифицированную кДНК ангиопоэтина-2, комплементарная петля молекулярного якоря образует более сильную связь с PCR-продуктом-мишенью,чем со стволом. Такая гибридизация приводит к конформационному изменению, отделяющему ствол и приводящему к возникновению флуоресценции (Tyagi S., and Kumar F.R., 1996, Nature Biotech., 1649). Для выполнения анализа клетки, которые экспрессируют ангиопоэтин-2 в ответ на обработку лептином, выращивают, например, в 96 луночных планшетах. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемый лептиномиметик добавляют в культуру и в течение 24-96 ч проводят инкубирование. Затем планшеты промывают, и из монослоя клеток экстрагируют тотальную РНК. Проводят обратную транскрипцию РНК с помощью случайно выбранного праймера, и полученную в результате кДНК подвергают количественной PCR со специфическими мышиными ангиопоэтин-2 праймерами. Количество ангиопоэтин-2-мРНК отражает количество PCR-продукта-мишени, 004709 10 которое измеряется с помощью указанного молекулярного маяка. Все стадии такого анализа допускают проведение автоматизированного широкомасштабного скрининга. В другом предпочтительном воплощении человеческий или мышиный промотор ангиопоэтина-2 идентифицировали и клонировали из геномной ДНК способом, известным специалистам в данной области. Указанный промотор и репортерный ген предпочтительно объединяли в тандем в реплицируемом экспрессирующем векторе млекопитающих. Однако могут встречаться последовательности, которые не мешают функционированию промотора ангиопоэтина-2. Репортерным геном может быть любой ген, кодирующий пептид, который легко поддается регистрированию или же позволяет легко регистрировать транскрипцию или трансляцию. Обычно он кодирует белок, который в клеткехозяине в природе не существует или же продуцируется в клетке-хозяине в малых количествах. Примеры хорошо известных репортерных генов включают в себя ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), зеленый флуоресцентный белок (GFP), люциферазы (либо бактериальной,либо люциферазы светлячка), и другие системы регистрации на основе ферментов, таких как бета-галактозидаза, щелочная фосфатаза и им подобных. В особо предпочтительном воплощении репортерным геном является ген люциферазы. Конструкция репортерного гена включает в себя а) область промотора ангиопоэтина-2,которая содержит промотор и по меньшей мере один элемент лептинового ответа, и b) репортерный ген, оперативно связанный с областью промотора. Ее предпочтительно помещают в подходящий вектор, используемый для трансфекции клетки-хозяина. Вектором может служить любой известный вектор, включая плазмиды, космиды и вирусные векторы, которые могут функционировать в выбранной клеткехозяине. Такой вектор составляет еще один аспект данного изобретения. Хозяйской клеткой может быть любая клетка или клеточная линия,которая экспрессирует ангиопоэтин-2 в ответ на обработку лептином. Такая клетка стабильно или транзитно трансфицируется указанным репортерным вектором. Обычно предпочтительной клеткой-хозяином является удобная для культивирования эукариотическая клетка, предпочтительно клетка млекопитающего, и в особо предпочтительном воплощении это дифференцированный адипоцит мыши. Наиболее предпочтительной линией клеток является линия преадипоцитов мыши Swiss 3T3 F442A (Green,H., and Kehinde, О., 1975, Cell 5, 19), которая дифференцируется в зрелые адипоциты при поддерживании конфлуэнтных клеток в среде,дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС), в течение шести дней. 11 Для проведения анализа клетку или клеточную линию, которая экспрессирует ангиопоэтин-2 в ответ на обработку лептином, стабильно или транзитно трансфицируют указанным репортерным вектором. Указанные клетки растут в 96-луночных планшетах и дифференцируются. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемый лептиномиметик добавляют в культуру, и инкубация продолжается. Через 24-96 ч в лунках определяют уровень продукта репортерного гена. В этом анализе активацию промотора ангиопоэтина-2 определяют путем количественного определения продукта гена указанной конструкции репортерного гена. Таким образом, уровень продукта гена соответствует уровню активности лептина или лептиномиметика. Далее настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не призваны ограничить объем изобретения. Наоборот, они приведены для лучшего уяснения того, что данное решение может включать в себя и другие воплощения, модификации и их эквиваленты, которые после ознакомления с настоящим описанием могут сами напрашиваться специалистам в данной области,не выходя за рамки данного изобретения и/или объема прилагаемой формулы изобретения. Примеры Пример 1. Количественный анализ лептина и лептиномиметиков с помощью ELISA ангиопоэтина-2. Мышиные клетки Swiss 3T3 F442A подвергали росту и дифференцировке в 96 луночных планшетах. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемый лептиномиметик добавляли в культуру в конечной концентрации 1 микрограмм/мл, и продолжали инкубировать в течение 24 ч. Затем отбирали аликвоты индуцированной лептином или лептиномиметиком культуральной среды и переносили их на планшеты ELISA, которые были предварительно покрыты указанным захватывающим моноклональным антителом, специфичным в отношении мышиного ангиопоэтина-2. Микротитрационные планшеты (Dynatech or Maxisorb, by Nunc) покрывали антимышиным моноклональным антителом против ангиопоэтина-2(бессывороточный супернатант гибридомных клеток или иммуноглобулины асцитной жидкости) и выдерживали в течение ночи при 4 С. Планшеты промывали PBS, содержащим ЭБС(0,5%) и Tween 20 (0,05%), и запирали в том же растворе по меньшей мере на два часа при 37 С. Затем отбирали аликвоты индуцированной лептином или лептиномиметиком культуральной среды и переносили их на планшеты ELISA (100 микролитров/лунку) на 4 ч при 37 С. Затем планшеты трижды промывали PBS, содержащим Tween 20 (0,05%), а потом добавляли кроличью антисыворотку против мышиного ангиопоэтина-2 (1:1000, 100 микролитров/лунку) и 12 продолжали инкубировать в течение ночи при 4 С. Планшеты трижды промывали, после чего в каждую лунку добавляли конъюгат антикроличьих козьих антител с пероксидазой хрена(HRP, Jackson Labs. 1:10,000, 100 микролитров/лунку), и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты четыре раза промывали, после чего окраска развивалась под действием(2,2'-азино-бис(3 этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты,Sigma) с использованием Н 2 О 2 в качестве субстрата. Планшеты готовы для считывания с помощью автоматического считывающего устройства для ELISA. Пример 2. Анализ лептина и лептиномиметиков с помощью RT-PCR ангиопоэтина-2 Мышиные клетки Swiss 3T3 F442A подвергали росту и дифференцировке в 96 луночных планшетах. Перед стимуляцией лептином клетки поддерживали в среде с низким содержанием сыворотки (0,5%) в течение 16 ч. Лептин (1 микрограмм/мл (положительный контроль или предполагаемый лептиномиметик добавляли в культуру и продолжали инкубировать в течение 24 ч. Планшеты осушали и с помощью набора реагентов TRJ (Molecular Research Center Inc.) выделяли тотальную РНК. Обратную транскрипцию проводили в 20 микролитровых объемах с помощью обратной транскриптазы НРНКазы (Superscript II, GIBCO-BRL,USA), используя 1 мкг случайно выбранного праймера (N)6 (New England Biolabs. USA). Аликвоту (2 микролитра) продукта обратной транскрипции использовали для PCR с ДНКполимеразой VENT (New England Biolabs) и со смысловым и антисмысловым праймерами: muангиопоэтин-2-мРНК, AF4326.gbro, нуклеотиды 637-657 и 1147-1167, соответственно. Терминирование реакций PCR производили до насыщения. Продукты PCR выделяли, в 1 М NaCl денатурировали при 72 С и проводили гибридизацию при 52 С с образованием молекулярного маяка,имеющего следующую структуру: 5'-родаминGCTGAG-CTGGAGAAGAAGCTGGTGACACTCAGC-3'-дабцил. Петля соответствует нуклеотидам 898-918 мышиной мРНК ангиопоэтина-2, регистрационныйAF004326, а температура плавления(Тm) структуры ствол-петля составляет 61,6 С. Флуоресцентная проба соответствует тем культурам, которые в ответ на действие лептина экспрессировали мРНК ангиопоэтина-2. Пример 3. Анализ лептина и лептиномиметиков с помощью репортерного вектора. Мышиные преадипоциты Swiss 3T3 F442A стабильно трансфицировали репортерным вектором, состоящим из полной области промотора мышиного ангиопоэтина-2 напротив гена зеленого флуоресцентного белка (GFP). Клетки подвергали росту и дифференцировке в 96 луночных планшетах. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемого леп 13 тиномиметика добавляли в культуру и продолжали инкубировать. Появление зеленой флуоресценции указывало на то, что клеточная культура отвечала на действие лептина или агента,имитирующего действие лептина. Пример 4. Анализ лептина или лептиномиметиков с помощью репортерного вектора. Стромальные преадипоциты человекаhMS2-12 стабильно трансфицировали репортерным вектором, состоящим из полной области промотора человеческого ангиопоэтина-2 напротив гена зеленого флуоресцентного белка(GFP). Клетки подвергали росту и дифференцировке в 96-луночных планшетах. Образец лептина (положительный контроль) или предполагаемого лептиномиметика добавляли в культуру и продолжали инкубировать. Появление зеленой флуоресценции указывало на то, что клеточная культура отвечала на действие лептина или лептиномиметика. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения лептина или лептиномиметика в пробе, включающий в себя обеспечение контакта указанной пробы с клеткой или клеточной линией, которая экспрессирует ангиопоэтин-2 (Ang-2) в ответ на лептин, и количественное определение либо Ang-2 в культуральной среде, либо клеточной мРНК, кодирующей Ang-2. 14 2. Способ по п.1, в котором используется эукариотическая клетка или клеточная линия. 3. Способ по п.2, в котором эукариотическая клетка или клеточная линия является клеткой или клеточной линией млекопитающего. 4. Способ по п.3, где клеточная линия выбрана из линий клеток дифференцированных адипоцитов мыши. 5. Способ по п.4, где клеточная линия представляет собой линию Swiss 3T3 F442A преадипоцитов мыши. 6. Способ по п.3, где клеточная линия выбрана из линий клеток человека. 7. Способ по п.6, где клеточная линия представляет собой линию стромальных клетокhMS2-12 костного мозга человека. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Ang-2 количественно определяют в культуральной среде с помощью иммунного анализа. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Ang-2 количественно определяют в культуральной среде с помощью твердофазного иммуноферментного анализа(ELISA) с использованием моноклональных и поликлональных антител против Ang-2. 10. Способ по любому из пп.1-7, в котором наличие мРНК, кодирующей Ang-2, определяют в культивируемых клетках или клеточных линиях с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).
МПК / Метки
МПК: C12N 15/85, C12Q 1/68, G01N 33/68
Метки: определения, лептина, способ, лептиномиметика
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/8-4709-sposob-opredeleniya-leptina-ili-leptinomimetika.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ определения лептина или лептиномиметика</a>
Предыдущий патент: Фармацевтическая композиция, включающая пеметрексед вместе с монотиоглицерином, l-цистеином или тиогликолевой кислотой
Следующий патент: Протеинкиназа candida albicans, обладающая активностью фосфорилирования циклинзависимых протеинкиназ, и способы ее применения
Случайный патент: Комбинированный водомер