Способ получения калиевой соли пенициллина g

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛИЕВОЙ СОЛИ ПЕНИЦИЛЛИНА G Приведено описание способа получения калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме из суспензии, содержащей Pen G K, бутилацетат и метанол. Способ обеспечивает получение калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме с высоким выходом. Дус ван дер Томас (NL) Соболев А.Ю. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ СИНОКЕМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ НИДЕРЛАНДЗ Б.В. (NL) 017121 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к способу получения калиевой соли пенициллина G (Pen G K) в кристаллической форме. Сведения о предшествующем уровне техники Пенициллины обычно получают из ферментационного способа (процесса) с использованием микробных штаммов, способных продуцировать пенициллин, в присутствии подходящего предшественника боковой цепи. Например, пенициллин G продуцируется селекционированными штаммами Penicilliumchrysogenum в присутствии фенилуксусной кислоты в качестве предшественника боковой цепи. После ферментации пенициллин выделяют из ферментационной жидкой среды (бульона) в соответствии с известными способами, зависящими от типа пенициллина (US 2599401). В типичном способе выделения пенициллина G известного уровня техники (Biotechnol. Bioeng.(2002) 78, 785) полученный ферментационный бульон фильтруют и фильтровальный осадок промывают,после чего пенициллин G, присутствующий в собранном фильтрате, экстрагируют в органический растворитель, такой как н-бутилацетат или метилизобутилкетон, после подкисления этого фильтрата. Затем полученный таким образом экстракт может быть обесцвечен при помощи активированного угля, и пенициллин G обратно экстрагируют в воду после нейтрализации водным раствором соли калия, такой как ацетат калия. Этот раствор смешивают с достаточным количеством второго растворителя, например н-бутанола, после чего содержание воды уменьшают выпариванием азеотропа н-бутанол-вода, после чего образованные кристаллы пенициллина G K выделяют фильтрованием и последующим промыванием и сушкой. Недостатком этого способа известного уровня техники является то, что во время выпаривания азеотропа н-бутанол-вода происходят существенные потери Pen G K вследствие деградации Pen G K,приводящие к существенно уменьшенному выходу Pen G K (например, 92%). В другом способе известного уровня техники (WO 98/48039) кристаллический Pen G K получают непосредственно из описанного выше экстракта добавлением ацетата калия или других подходящих источников калия с последующим выпариванием азеотропа, после чего кристаллы Pen G K, которые образуются, фильтруют, суспендируют в н-бутаноле, фильтруют и сушат. Недостатком этого способа выделения известного уровня техники является то, что после выделения конечного продукта (Pen G K) маточный раствор содержит как н-бутанол, так и н-бутилацетат. Оба растворителя должны быть регенерированы; однако, поскольку н-бутанол и н-бутилацетат трудно разделить, эта стадия регенерирования растворителей требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, в этом способе, в котором кристаллы PenG K получают кристаллизацией в н-бутилацетате с последующим суспендированием кристаллов Pen G K в н-бутаноле, требуются две стадии выделения кристаллов Pen G K вместо одной стадии. Сущность изобретения Целью данного изобретения является обеспечение упрощенного и, следовательно, экономически более заманчивого способа получения калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме с достаточно высоким и предпочтительно улучшенным выходом и хорошим, предпочтительно улучшенным качеством."Выход" определяется в данном контексте как процентный выход пенициллина в виде калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме относительно пенициллина, присутствующего в экстракте."Достаточно высокий" определяется здесь как равный предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98%. Термин " хорошее качество" обозначает здесь, что конечная калиевая соль пенициллина G в кристаллической форме содержит очень мало примесей или не содержит примесей, например менее 5%(мас./мас.), более предпочтительно менее 4%, более предпочтительно менее 3%, более предпочтительно менее 2%, более предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,5%, более предпочтительно менее 0,25%, даже более предпочтительно менее 0,1%. Примесями могут быть, например,6-аминопенициллановая кислота (6-АРА), фенилуксусная кислота (РА), парагидроксипенициллин G, пеницилллиновая кислота пенициллина G, пеницилловые кислоты пенициллина G и пенилловые кислоты пенициллина G. В одном аспекте это изобретение обеспечивает способ получения калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме из суспензии, содержащей калиевую соль пенициллина G, органический растворитель и спирт, выбранный из группы, состоящей из C1-, С 2- и С 3-спирта. Неожиданно было обнаружено,что выход калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме в способе по данному изобретению был достаточно высоким, по приведенному здесь ранее определению, и таким же высоким или даже более высоким, чем в способах, известных в данной области, тогда как одновременно качество полученных кристаллов было хорошим, по приведенному здесь ранее определению. Другим преимуществом способа данного изобретения является то, что требуется только одна стадия выделения кристаллов, что способствует не только достаточно высоким выходам, но также существенному экономическому преимуществу. Органическим растворителем в способе в соответствии с данным изобретением может быть любой органический растворитель, известный квалифицированному в данной области специалисту. Примерами-1 017121 таких подходящих органических растворителей являются амилацетат, н-бутилацетат, этилацетат,метилизобутилкетон, циклогексанон, изобутанол или н-бутанол. Предпочтительно этим органическим растворителем является н-бутилацетат. Спирт в способе по данному изобретению выбран из группы, состоящей из C1-, С 2-и С 3-спиртов, и является предпочтительно метанолом, этанолом, н-пропанолом или изопропанолом. Наиболее предпочтительно этим спиртом является метанол. Пенициллин в способе получения калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме в соответствии с данным изобретением может быть получен с использованием любого подходящего способа получения, известного в данной области. Например, пенициллин G может быть получен ферментацией продуцирующего пенициллин G микроорганизма, например штамма Penicillium chrysogenum, предпочтительно в присутствии фенилуксусной кислоты в качестве предшественника боковой цепи в соответствии со способами, известными в данной области. Биомасса может быть отделена от ферментационного бульона с использованием подходящей технологии, например центрифугирования или фильтрования, с получением, таким образом, содержащей пенициллин ферментационной жидкости. Предпочтительно для отделения биомассы от бульона используют стадию фильтрования. Оставшиеся твердые вещества могут быть, необязательно, промыты. Ферментационный бульон или ферментационную жидкость подкисляют до рН в диапазоне 2-4,предпочтительно в диапазоне 2,5-3, добавлением по меньшей мере одной кислоты, такой как серная кислота, хлористо-водородная кислота или азотная кислота или любая их комбинация. Затем пенициллин отделяют от подкисленной водной фазы экстракцией в органический растворитель. Может быть использован любой подходящий органический растворитель, например амилацетат, н-бутилацетат, этилацетат,метилизобутилкетон, циклогексанон, изобутанол или н-бутанол. Предпочтительно этим органическим растворителем является н-бутилацетат. Добавление подходящего деэмульгатора может значительно улучшать экстракт."Экстракт" определяется здесь как органический растворитель, в который был экстрагирован пенициллин G. Экстракт, содержащий пенициллин, может быть необязательно обработан активированным углем для удаления примесей в соответствии со способами, известными в данной области. В одном варианте осуществления этого изобретения экстракт, содержащий пенициллин G, по приведенному здесь ранее определению, необязательно обработанный активированным углем, может быть затем смешан с подходящим источником калия для превращения пенициллина G в соответствующую калиевую соль пенициллина с получением посредством этого смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль этого пенициллина. Количество подходящего источника калия, смешанного с экстрактом, содержащим пенициллин G,является таким, что предпочтительно 0,4-3 мол.экв. калия добавляют относительно пенициллина. Предпочтительно добавляют 0,6-2 мол.экв., более предпочтительно 0,7-1,6 мол.экв., более предпочтительно 0,8-1,4 мол.экв., более предпочтительно 0,9-1,2 мол.экв. калия относительно пенициллина. Наиболее предпочтительно добавляют 1 мол.экв. калия относительно пенициллина. Подходящим источником калия является любая калиевая соль предпочтительно слабой кислоты. Примерами таких подходящих источников калия являются ацетат калия или карбонат калия. Источник калия может быть использован в твердой форме или может быть сначала растворен в воде с образованием водного раствора этого источника калия. Подходящая концентрация источника калия в водном растворе равна, например, 10-60%(мас./об.), например, 15-55% (мас./об.), например, 20-50 (мас./об.). Затем часть воды или часть азеотропа, содержащего воду и органический растворитель, например,азеотропа воды и н-бутилацетата, может быть удалена из смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль пенициллинаа G ил. Вода, которая присутствует в этой смеси, может происходить из ферментационного бульона или из органического растворителя или могла быть введена с водным раствором источника калия. Предпочтительно содержание воды смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль пенициллина G, после удаления части этой воды или этого азеотропа равно 10%(об./об.), более предпочтительно 5% (об./об.), более предпочтительно 2,5% (об./об.), более предпочтительно 1% (об./об.), еще более предпочтительно 0,5% (об./об.) и наиболее предпочтительно 0,2%(об./об.) После выпаривания части воды или азеотропа вода/органический растворитель, как описано выше,к смеси добавляют спирт, выбранный из группы, состоящей из С 1-, С 2- и С 3-спиртов, с получением суспензии, содержащей калиевую соль пенициллина G, органический растворитель и спирт. Спиртом может быть метанол, этанол, н-пропанол и изопропанол. Предпочтительно этим спиртом является метанол. Предпочтительно спирт, выбранный из группы, состоящей из C1-, С 2- и С 3-спиртов, является сухим. В данном контексте "сухой" означает, что спирт содержит менее 10% (об./об.) воды, более предпочтительно менее 5% (об./об.) воды, еще более предпочтительно менее 2% (об./об.) воды. Наиболее предпочтительно сухой спирт содержит 0% (об./об.) воды. Суспензия, содержащая калиевую соль пенициллина G, органический растворитель и спирт, может перемешиваться в течение некоторого периода времени после приведения компонентов в контакт друг с другом. Предпочтительно суспензию перемешивают в течение периода времени от 5 мин до 24 ч, пред-2 017121 почтительно от 10 мин до 12 ч, более предпочтительно от 20 мин до 8 ч, более предпочтительно от 30 мин до 6 ч, более предпочтительно от 45 мин до 3 ч. Предпочтительно суспензию перемешивают, пока не образуются белые кристаллы калиевой соли пенициллина G. Более предпочтительно суспензию перемешивают, пока не образуются белые кристаллы калиевой соли пенициллина G, без комков. Суспензия может перемешиваться при любой подходящей температуре, предпочтительно при 0-40 С, более предпочтительно 5-30 С, наиболее предпочтительно 10-25 С. В суспензии способа по данному изобретению отношение объема спирта к объему смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль пенициллина G, может быть любым подходящим соотношением. Предпочтительно это соотношение равно 1:20-1:3, предпочтительно 1:15-1:4, предпочтительно 1:10-1:6. Во время способа данного изобретения калиевая соль пенициллина G ил, может кристаллизоваться частично или полностью. Например, калиевая соль пенициллина G ил может начать кристаллизоваться после добавления подходящего источника калия к экстракту, содержащему пенициллин, и/или во время выпаривания части воды или части азеотропа вода/органический растворитель из смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль пенициллина G. Калиевая соль пенициллина G может также кристаллизоваться дополнительно или перекристаллизовываться при приведении в контакт смеси, содержащей органический растворитель и калиевую соль пенициллина G, со спиртом, выбранным из группы, состоящей из C1-, С 2- и С 3-спиртов, и/или во время перемешивания суспензии, содержащей калиевую соль пенициллина G, органический растворитель и спирт. В другом варианте осуществления кристаллы калиевой соли пенициллина G, полученные после добавления подходящего источника калия к экстракту, содержащему пенициллин G, полученному и определенному, как описано здесь ранее, и выпаривания азеотропа, содержащего органический растворитель и воду, собирают, например, фильтрованием. Кристаллы, полученные таким образом, ресуспендируют в смеси, содержащей органический растворитель, как описано здесь ранее, и спирт, выбранный из группы,состоящей из C1-, С 2- и С 3-спиртов, при тех же самых условиях (например, при том же самом отношении спирт/органический растворитель, при том же времени и той же температуре), которые описаны в предыдущем варианте осуществления. Калиевая соль пенициллина G в кристаллической форме может быть выделена из этой суспензии в любом варианте осуществления данного изобретения, любым подходящим способом, известным в данной области, например центрифугированием или фильтрованием. Затем может быть получен влажный фильтровальный осадок калиевой соли пенициллина в кристаллической форме. Этот влажный осадок необязательно промывают органическим растворителем или смесью органического растворителя и спирта, выбранного из группы, состоящей из C1-, С 2- и С 3-спиртов. При использовании стадии промывания органический растворитель является предпочтительно тем же самым, что и растворитель, используемый в экстракте, и спирт, выбранный из группы, состоящей из C1-, С 2- и С 3-спиртов, является предпочтительно тем же самым, что и в суспензии. Влажный осадок калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме может быть высушен любым подходящим способом, известным в данной области. В этом варианте осуществления этого изобретения пенициллином является предпочтительно пенициллин G. Влажный осадок, содержащий кристаллы калиевой соли пенициллина G, необязательно смешивают сводой с получением водного раствора калиевой соли пенициллина G. Затем этот водный раствор может быть сконцентрирован для удаления следов органического растворителя и/или спирта из группы, содержащей C1-, С 2- и С 3-спирты. Концентрирование включает в себя выпаривание воды, органического растворителя и/или спирта. Водный раствор калиевой соли пенициллина G может быть использован для ферментативного превращения в 6-аминопенициллановую кислоту (6-АРА) известными способами, описанными в данной области, например, как описано в Европейском патенте ЕР 0977883). Раствор,содержащий растворенную калиевую соль пенициллина G, может быть обработан подходящей пенициллинацилазой, например подходящей пенициллин G-ацилазой для деацилирования пенициллина. Было обнаружено, что организмами, продуцирующими подходящие пенициллинацилазы, являются, например,виды Acetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Aphanocladium, Bacillus sp., Cephalosporium, Escherichia,Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas или Xanthomonas. В частности, было подтверждено, что ферменты полученные из Acetobacter pasteurioanum, Alcaligenes faecalis,Bacillus megaterium, Escherichia coli, Providentia rettgeri и Xanthomonas citrii, которые были успешными в способе по данному изобретению. В литературе пенициллинацилазы называют также пенициллинамидазами. Пенициллинацилаза может быть использована в виде свободного фермента, но также и в любой иммобилизованной форме, например, как описано в ЕР 0222462 и WO 97/04086. Ферментативное превращение Pen G K пенициллинацилазой приводит к образованию 6-аминопенициллановой кислоты (6 АРА) и фенилуксусной кислоты. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Сравнительный пример. К 1000 мл обработанного активированным углем экстракта, содержащего приблизительно 100000 Оксфордских единиц пенициллина G на 1 мл (1 Оксфордская единица соответствует примерно 0,6 мкг-3 017121 пенициллина G) в н-бутилацетате, добавляли 30% (мас./мас.) раствор K2CO3 в воде таким образом, что эта смесь содержала приблизительно 1,0 мол.экв. калия относительно пенициллина G. Этот экстракт смешивали с 200 мл н-бутанола и полученную смесь нагревали в вакууме с использованием роторного пленочного испарителя (баня 50-60 С). Во время выпаривания н-бутанол добавляли порциями, так что общее количество н-бутанола было равно 200 мл. В целом выпаривали 250 мл смеси н-бутанола/вода и остаток охлаждали до комнатной температуры. Образованные кристаллы Pen G K отделяли фильтрованием, промывали н-бутанолом и сушили. Выход (по приведенному здесь определению) был равен 91%. Пример 2. Проводили серию экспериментов, в которых к 1000 мл обработанного активированным углем экстракта, содержащего приблизительно 100000 Оксфордских единиц пенициллина G на 1 мл (1 Оксфордская единица соответствует примерно 0,6 мкг пенициллина G) в н-бутилацетате, добавляли 50%(мас./мас.) раствор K2CO3 в воде таким образом, что эта смесь содержала приблизительно 1,0 мол.экв. калия относительно пенициллина G. Полученную смесь нагревали в вакууме с использованием роторного пленочного испарителя (баня 45-48 С), посредством чего выпаривали некоторое количество смеси(см. таблицу в отношении количества для каждого эксперимента). Затем к остатку добавляли метанол и смесь перемешивали в течение 1 ч при 25 С. Эту суспензию фильтровали, влажный фильтровальный осадок промывали 70 мл н-бутилацетата, после чего влажный осадок сушили. Кристаллизация Pen G K в н-бутилацетате + добавление метанола к остатку Выпаренный объем представляет собой общий объем выпаренной жидкости, а значение в скобках показывает объем водного слоя в дистилляте. Столбец содержания воды показывает содержание воды в остатке после выпаривания. Все эксперименты давали высокий выход белых кристаллов Pen G K (по приведенному выше определению) относительно содержания пенициллина в обработанном углем экстракте (=100%) и только ограниченные (небольшие) потери пенициллина в маточном растворе. Кристаллы из эксперимента 1 содержали 99,3% Pen G K (т.е. пенициллин хорошего качества). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме из суспензии, содержащей калиевую соль пенициллина G, бутилацетат и метанол, включающий в себя следующие стадии:(a) смешивание бутилацетата, содержащего пенициллин G, с калиевой солью слабой кислоты в твердой форме или в виде водного раствора для превращения пенициллина в соответствующую калиевую соль пенициллина с получением смеси, содержащей бутилацетат и калиевую соль пенициллина;(b) при необходимости, удаление части воды или части азеотропа, содержащего воду и бутилацетат;(c) добавление метанола к смеси, полученной на стадии (а) или, при необходимости, на стадии (b) с получением указанной суспензии;(d) перемешивание суспензии в течение времени от 5 мин до 24 ч при температуре от 0 до 40 С до тех пор, пока не образуются белые кристаллы калиевой соли;(e) выделение калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме из суспензии с получением влажного фильтровального осадка. 2. Способ по п.1, в котором в качестве калиевой соли слабой кислоты используют ацетат калия или карбонат калия. 3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором полученный влажный фильтровальный осадок калиевой соли пенициллина G в кристаллической форме промывают и/или сушат.