Пара штаммов гетероталличного гриба “blakeslea trispora ” всб-129(-) и всб-130(+), продуцирующая ликопин, и способ получения ликопина

1 Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства витаминов и антиоксидантов, в частности производства ликопина. Ликопин - красный пигмент плодов томата, относится к классу природных соединений, а именно каротиноидам. Его широко применяют при изготовлении пищевых продуктов в качестве пищевого красителя. Особенно велико его значение при производстве колбас и ветчинных изделий, где он может заменить нитрит натрия. В последние годы было показано, что ликопин обладает более выраженной способностью устранять вредное воздействие синглетного кислорода по сравнению с -каротином и другими каротиноидами [1]. Активность подавлять рост раковых клеток у ликопина также выше по сравнению с -каротином [2]. Кроме того,установлено положительное влияние ликопина при комплексном лечении больных сахарным диабетом [3]. Известен способ получения ликопина из кожицы томатов путем экстракции хлористым метиленом в присутствии адсорбента [4]. Однако выход ликопина при этом незначительный,т.к. содержание ликопина в томатах невелико. Указанное делает этот способ экономически нецелесообразным. Помимо этого сезонность получения сырья для реализации данного способа можно также отнести к недостаткам. К более перспективным методам получения ликопина относятся биотехнологические способы получения ликопина, основанные на выращивании микроорганизмов-продуцентов пигмента и выделении его из биомассы органическими растворителями. Способность синтезировать ликопин обнаружена у различных видов микроорганизмов бактерий, грибов, актиномицетов. Известен штамм Streptomyces chrostomyceticus, который на минеральной среде накапливает 20-50 мг/кг ликопина [5]. Описан штамм бактерий Mycobacterium rubrum, который на среде с мелассой и кукурузным экстрактом накапливает до 7,05 мг/г суммарных каротиноидов. При этом в пигментном комплексе бактерий помимо ликопина обнаружены -, - и -каротин, ауроксантин, лютеин, криптоксантин, виолоксантин, зеаксантин, антераксантин, рубиксантин, лепротеин, неоксантин [6]. Наиболее активными продуцентами ликопина являются грибы Phycomyces blakesleanus иBlakeslea trispora. У гриба Phycomyces blakesleanus в зависимости от особенностей штамма и условий культивирования уровень накапливания ликопина колеблется в интервале 192-600 мкг/г АСВ[7]. Известны способы получения ликопина из биомассы гриба Blakeslea trispora [8, 9]. В соответствии с описанными способами выход кристаллического ликопина составляет 31-56% от 2 количества его в биомассе. Наиболее близким к заявленному изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ликопина, описанный в патенте РФ 2102416 [10]. Согласно данному изобретению выращивают штаммы гриба Blakesleatrispora A-732-3(+) и А-731-3(-) или 8 А(+) и 8 А(-) на кукурузно-соевой среде с добавлением в качестве стимуляторов ликопинообразования соединений класса аминометилпиридинов или табачной крошки. Выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 48 ч, полученный посевной материал используют в соотношении 1:9 для последующей ферментации. Получение целевого продукта осуществляют экстракцией подсолнечным маслом, кристаллизацией с использованием этанола и толуола и последующей колоночной хроматографией в системе н-гексанацетон 50:1. В соответствии с описанным способом выход ликопина составляет 0,7 г/л среды. Соотношение ликопина и -каротина составляет 11:1 или 92 и 8% соответственно. К сожалению, в патенте не указан уровень накопления биомассы гриба в единице объема питательной среды, что не позволяет оценить ликопинсинтезирующую активность культуры-продуцента. Кроме того,для накопления ликопина культурой грибаBlakeslea trispora указанными штаммами в среду добавляют стимуляторы: аминометилпиридин или табачную крошку. При этом табачная крошка является более слабым стимулятором в сравнении с аминометилпиридином, так при ее добавлении в среду культивирования уровень накопления ликопина грибом Blakeslea trispora составляет 0,4 г/л, что в 1,7 раза ниже по сравнению с аминометилпиридином. Добавление в среду культивирования производных пиридина,несмотря на их низкие концентрации (0,010,005%), нежелательно. Задачей данного изобретения является получение новой пары штаммов гетероталличного гриба BLAKESLEA TRISPORA ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), продуцирующей ликопин, и разработка более эффективного способа получения ликопина при использовании указанной пары штаммов. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в результате многоступенчатой селекции и отбора получена пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), которая при совместном глубинном культивировании на минеральной среде с глюкозой через 36 ч культивирования накапливает до 35 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы (или до 0,8 г/л культуральной среды); на кукурузносоевой среде через 48 ч от начала культивирования - до 30 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы (или до 1,5 г/л культуральной среды). При этом в среду культивирования не вносят дополнительно сти 3 муляторы ликопинообразования. Содержание ликопина составляет 92-96% от суммы каротиноидов. Ликопинсодержащую биомассу отделяют от культуральной жидкости. Экстракцию проводят смесью органических растворителей гексан-этанол. Кристаллизацию ликопина проводят в этиловом спирте. Выход кристаллического ликопина составляет 50-55% от содержания его в биомассе. Пара штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) получена из (+) и (-) форм коллекционного штамма Blakeslea trispora в результате многоступенчатой селекции с применением ультрафиолетовых лучей и N-метилN-нитро-N-нитрозогуанидина и бензилпенициллина в качестве мутагенных факторов и рассевом на чашки Петри с питательной средой сусло-агар (7 Баллинга). Через 18-24 ч выращивания изолированные колонии отсевали в пробирки на скошенный сусло-агар. Отбор колонии производили после 8-10-дневного выращивания их в пробирках при 26 С по признаку наибольшего пигментообразования с последующим определением продуктивности выделенных вариантов. Штаммы ВСБ-129 и ВСБ-130 имеют следующие характеристики. Сусло-агар. Штамм ВСБ-130(+). Рост штамма интенсивный. Воздушный мицелий развит равномерно, пушистый, бежевого цвета. Субстратный мицелий палевого цвета. Спорообразование активное. Штамм ВСБ-129(-). Рост менее активный по сравнению со штаммом ВСБ-130. Воздушный мицелий развит слабо. Спорообразование скудное. Субстратный мицелий штамма яркооранжевого цвета. При совместном росте на среде сусло-агар в месте соприкосновения (+) и (-) форм не образуется характерной полосы черных зигоспор. После соприкосновения с (+) формой вся поверхность мицелия (-) формы окрашивается в бордово-красный цвет. Выход ликопина при совместном глубинном культивировании штаммов ВСБ-129 и ВСБ 120 на минеральной среде с глюкозой через 36 ч культивирования накапливает до 35 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы (или до 0,8 г/л культуральной среды); на кукурузно-соевой среде через 48 ч от начала культивирования - до 30 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы(или до 1,5 г/л культуральной среды). Пример 1. Штаммы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129 и ВСБ-130 выращивают на косяках сусло-агар в течение 12 суток. Штамм ВСБ-129 засевают в качалочные колбы на предварительно гидролизованную кукурузно-соевую среду следующего состава: соевая мука - 4,5%; кукурузная мука - 2,3%; 4 тиаминхлорид - 2 х 10-4%. Гидролиз муки осуществляют следующим образом: кукурузную и соевую муку разводят водопроводной водой, добавляют 2,8 мл концентрированной серной кислоты и стерилизуют при 1 атм 1,5 ч. После стерилизации устанавливают рН 6,5-6,3 и добавляют КН 2 РO4. Выращивание (-) штамма ведут при 26-27 С на качалке при 200 об/мин в течение 48 ч. Выросшую культуру штамма ВСБ-129 используют как засевной материал для засева колб с кукурузно-соевой средой вышеописанного состава. Кукурузносоевую среду для основной ферментации гидролизу не подвергают. Засеянные культурой ВСБ-129 колбы выращивают на качалке 32 ч при 26-27 С при 200 об/мин. Через 32 ч от начала культивирования в колбы с выросшей культурой ВСБ-129 вносят антиоксидант и предварительно выращенный на кукурузно-соевой среде (+) штамм ВСБ-130. Количество внесенного (+) штамма составляет 1,5% от объема среды. Совместное выращивание штаммов ведут 48 ч при вышеописанных условиях. Через 48 ч концентрация биомассы составляет 50 г/л, содержание ликопина в биомассе - 30 мг/г АСВ биомассы, общий выход ликопина - 1,5 г/л культуральной среды. Содержание ликопина и-каротина составляет 92 и 8% соответственно. Пример 2. Способ получения ликопина осуществляют так же, как описано в Примере 1, но кукурузно-соевую среду для основной ферментации подвергают гидролизу. На гидролизованной среде (-) штамм ВСБ-129 выращивают в течение 24 ч, затем в выросшую культуру (-) штамма добавляют суспензию (+) штамма ВСБ-130 в количестве 1,0% от объема среды и антиоксидант. Совместное выращивание (+) и (-) штаммов ведут 40 ч при вышеописанных условиях. Через 40 ч содержание ликопина в биомассе составляет 28 мг/г АСВ биомассы, общий выход ликопина - 1,4 г/л культуральной среды. Содержание ликопина и -каротина составляет 94 и 6% соответственно. Пример 3. Способ получения ликопина осуществляют так же, как описано в Примере 1, но после выращивания на кукурузно-соевой среде штамм ВСБ-129 засевают в минеральную среду с глюкозой. Состав среды: глюкоза-15 г/л;MgSO4 - 0,34 г/л; пептон -10 г/л; тиаминхлорид - 2x10-4%. На минеральной среде (-) штамм ВСБ-129 выращивают 20 ч при 26-27 С на качалке при 200 об/мин. Затем в среду культивирования добавляют антиоксидант, 3% глюкозы и предвари 5 тельно выращенный на кукурузно-соевой среде(+) штамм ВСБ-130. Количество внесенного (+) штамма составляет 1% от объема среды. Совместное выращивание (-) и (+) штаммов ведут при вышеописанных условиях в течение 36 ч. Через 36 ч от начала совместного выращивания штаммов накопление биомассы составляет 23 г/л,содержание ликопина в биомассе - 35 мг/г АСВ биомассы, общий выход ликопина - 0,8 мг/л культуральной среды. Содержание ликопина и-каротина составляет 96 и 4% соответственно. Пример 4. Способ получения ликопина осуществляют так же, как описано в Примере 3, но (-) штамм ВСБ-129 выращивают на минеральной среде с 2% глюкозы в качестве источника углерода и энергии в течение 28 ч при температуре 26 С в колбах с отбойниками для создания оптимального режима аэрации. Через 28 ч выращивания (-) штамма в колбы с выросшей культурой (-) штамма добавляют 1,5% глюкозы,1,0% суспензии (+) штамма ВСБ-130 и антиоксидант. Совместное выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 40 ч при вышеописанных условиях. Содержание ликопина в биомассе составляет 33 мг/г АСВ биомассы, общий выход ликопина в расчете на единицу объема питательной среды - 940 мг/л. Содержание ликопина и -каротина составляет 96 и 4% соответственно. Пример 5. В колбу загружают ликопинсодержащую биомассу и смесь растворителей гексан-этанол в соотношении 4:1. Соотношение биомассы и растворителя 1:5. Экстракцию проводят в 3 ступени при t=60C в течение 30 мин на каждую ступень. Далее шрот отфильтровывают и насыщенный экстракт направляют на кристаллизацию в этиловом спирте при t=5C в течение 6 20 ч. Выход ликопина составляет около 55% от содержания его в биомассе. Доля основного вещества - 92%. Список литературы 1. Macio P.D., Devasagayam Т.Р.A., KaiserS., Sies H.Biochem. Soc. Transactions.-1990v.18. N6.-р.1055-1056. 2. 3 аявка на патент ЕР 0600544. 3. American Journal of Epidemiology 1999; 149:168-176. 4. Патент РФ 2039775. 5. Патент IT343773. 6. AC СССР 1071636. 7. B.J. Mehta, E.Cerda-OlmedoAppl.Microbiol. Biotechnol.-1995.- 42-р.836-838. 8. Патент РФ 2112747. 9. Патент РФ 2126806. 10. Патент РФ 2102416. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пара штаммов гетероталличного грибаBlakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), продуцирующая ликопин. 2. Способ получения ликопина, включающий выращивание пары штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora, продуцирующей ликопин, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, антиоксидант, с последующим выделением ликопина, отличающийся тем, что в качестве продуцента ликопина выращивают пару штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+),причем сначала выращивают (-) штамм, затем к выращенной культуре (-) штамма добавляют (+) штамм, далее осуществляют совместное выращивание штаммов и выделяют ликопин.