Способ получения антиоксидантов и биологически активных соединений липидной природы

1 Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения биологически активных соединений: убихинонов Q-9 и Q-10,-каротина, ликопина, эргостерина, фосфолипидов (лецитин и др.), жирных кислот. Использование в медицинских и профилактических целях биологически активных соединений, в частности убихинонов, эргостерина,-каротина, ликопина, лецитина, полученных путем микробиологического синтеза, является актуальным. В настоящее время установлено, что убихинон-10 является перспективным кардиотоническим средством для лечения ишемической болезни сердца (1). Учитывая многочисленные исследования, предложено использование убихинона при язве желудка, для терапии эмфиземы легких, простатомегалии, облысения, в качестве хорошего радиопротекторного препарата,для лечения бронхиальной астмы, для усиления функции поджелудочной железы и других заболеваний (2, 3, 4, 5). Ликопин и -каротин - каротиноиды, широко распространенные в мире растений и микроорганизмов. В основе применения каротиноидов в медицине лежит их способность нейтрализовывать свободные радикалы и синглетный кислород, которые, как известно, реагируют с генетическим материалом клеток человека, способствуя появлению злокачественных новообразований, нарушению иммунитета, развитию процессов старения, гормональным сдвигам,диабету. Отмечается, что диета, обогащенная каротиноидами, способствует снижению риска возникновения злокачественных новообразований, повышению иммунитета, увеличению продолжительности жизни человека. Проведенные исследования показали, что ликопин более эффективно тормозит развитие раковых клеток,чем -каротин. Это свидетельствует о том, что ликопин более сильный антиоксидант, чем каротин. Кроме того, установлено, что способность тушить синглетный кислород у ликопина выше не только по сравнению с другими каротиноидами, но и такими известными антиоксидантами, как, например, токоферол (6). Эргостерин - предшественник витаминаD2, который получается при облучении эргостерина ультрафиолетовыми лучами. D2 играет важную роль в обеспечении организма кальцием, прежде всего, за счет правильного использования кальция, поступающего с пищей. При недостатке витамина D2 в организме происходит нарушение минерализации в процессе костеобразования, что приводит к серьезным изменениям в костном скелете. Любые заболевания печени, независимо от этиологии (действие алкоголя, лекарственных препаратов, промышленных и бытовых токсинов, неправильного питания, вирусных инфекций и т.д.), вызывают повреждение мембран 2 клеток с потерей фосфолипидов, которые являются основными структурными компонентами мембран. Потеря собственных фосфолипидов приводит сначала к инактивации, а затем и к гибели клеток печени. Фосфатидилхолин (лецитин), входящий в состав фосфолипидов, является основным структурным компонентом всех клеточных мембран. При прероральном введении в организм фосфатидилхолин восстанавливает целостность мембран клеток, в первую очередь, печени. Фосфатидилхолины используются во многих отраслях промышленности благодаря их прекрасным диспергирующим и эмульгирующим свойствам. Жирные кислоты имеют широкий спектр применения в парфюмерии, фармакологии, медицине. Наиболее ценными являются полиненасыщенные жирные кислоты. Они должны поступать в организм человека с пищей. При их недостаточности наблюдается отставание в росте, развиваются характерные поражения со стороны кожи и волосяного покрова. Известны многочисленные способы получения отдельных соединений (убихинонов Q-9 иQ-10, -каротина, эргостерина, фосфолипидов,жирных кислот) с использованием различных микроорганизмов-продуцентов путем проведения ряда последовательных операций: экстракции различными органическими растворителями, отделения липидной фракции, кристаллизации необходимого вещества, его выделения и очистки (7, 8, 9). В частности, известен способ получения кристаллического -каротина (патент РФ 2112808). В соответствии с изобретением, описанным в патенте РФ 2112808, экстракцию -каротина из биомассы гриба Bl. trispora ведут растительным маслом. Экстракцию начинают в реакторе в соотношении биомасса:растворитель, равном 1:3-1:15 (мас.), в течение 15-60 мин и завершают на фильтре тем же растворителем, нагретым до 60-90 С, затем насыщенные экстракты промывают в этиловом спирте в соотношении 10:1-3:1(об.) при 40-55 С, кристаллизацию ведут при 10-20 С в течение 1-3 суток. После этого полученную суспензию нагревают до 40-60 С, кристаллы фильтруют, промывают их этиловым спиртом в соотношении 1:3-1:2,5 (мас.) при 5055 С. Выход -каротина составляет 25-27%,массовая доля -каротина 90%. Недостатками способа являются получение в качестве конечного продукта только кристаллического -каротина, а также длительность процессов экстракции и кристаллизации и значительный расход растворителя на стадии кристаллизации. Известны также способы получения эргостерина и убихинона Q-9 авт.св. СССР 1739633, а также способ получения убихинона Q-10 совместно с фосфотидилэтаноламином, описанный в 3 Способ получения Q-10 (A.C.1706213) основан на выращивании бактерий р. Acetobacter methylovorans или Acetobacter methylicum. Из биомассы бактерий липиды экстрагируют хлороформом или этанолом. Экстрагент упаривают и затем фильтруют через слой адсорбента. В качестве элюата применяют хлороформ или 2% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор упаривают и фракцию убихинона Q-10 растворяют в органическом растворителе (этаноле). Кристаллизацию убихинона Q-10 ведут при 1525 С в течение 4-24 ч. Для получения продукта с содержанием основного вещества более 97% проводят 1-3 ступени перекристаллизации. После элюирования Q-10 с адсорбента элюируют фракцию фосфатидилэтаноламинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей,содержащей от 20 до 70% гидрофильного органического растворителя. Использование этого приема позволяет удалить с адсорбента фракцию фосфатидилэтаноламинов, включающую фосфатидилэтаноламин и ряд других фосфолипидов с более высокими адсорбционными свойствами, чем Q-10, но более низкими, чем фосфатидилхолины. Затем с адсорбента элюируют фракцию фосфотидилхолинов смесью гидрофобного и гидрофильного растворителей и воды, содержащей от 40 до 95% гидрофильного растворителя и от 2 до 15% воды. Данный подход позволяет получать фосфатидилхолины с высоким содержанием основного вещества (9098%). Выход Q-10 из 100 г биомассы составляет 0,06-0,08 г, фосфатидилхолинов - 0,4-0,6 г. Согласно способу получения эргостерина и Q-9 (А.С. СССР 1739633), включающему омыление липидов, выделенных из биомассы дрожжей, раствором щелочи, осуществляют экстракцию неомыленной фракции, кристаллизацию и выделение эргостерина из раствора неомыленной фракции, обработку неомыленной фракции адсорбентом, элюирование с адсорбента фракции, содержащей Q-9, отгонку растворителя и выделение Q-9 из полученной фракции. После элюирования фракции, содержащей Q-9,с адсорбента элюируют гидрофильным растворителем фракцию, содержащую эргостерин при соотношении гидрофильный растворитель:адсорбент 2:1-20:1 (по массе). Затем объединяют полученный раствор эргостерина в гидрофильном растворителе с экстрактом неомыленной фракции, а перед кристаллизацией эргостерина неомыляемую фракцию обрабатывают гидрофильным растворителем, содержащим 0,58,0% воды при соотношении растворитель:неомыляемая фракция 8:1-50:12, и отделяют нерастворимый осадок. В соответствии с предлагаемым способом выход эргостерина составляет 2,0-2,2%, убихинона 0,1-0,45%. Описанные выше способы имеют определенные недостатки. Например, в А.С. СССР 1706213 разделение липидов на фракции ведут непосредственно на хроматографической колонке 4 без предварительного разделения, что приводит к большому расходу растворителей. В А.С.1739633 предусмотрена предварительная обработка липидов дрожжей перед стадией хроматографии, однако, процесс омыления ведут при использовании токсичного реагента - метанола,что также затрудняет использование этого метода на практике. Эти три способа: патент РФ 2112808,А.С. СССР 1706213, АС. СССР 1739633 для получения отдельных компонентов, таких как убихинон Q-10, -каротин, эргостерин, в которых используют различные микроорганизмы-продуценты и для каждого из веществ разработан свой способ выделения, использованы авторами как прототипы. Задача изобретения заключается в разработке единого технологического процесса для получения определенной гаммы биологически активных соединений путем комплексного подхода к переработке микробных липидов с достижением при этом более полного использования сырья и получения биологически активных соединений, таких как убихиноны, эргостерин,-каротин, ликопин, фосфолипиды, жирные кислоты, в единой технологической цепочке,включающей культивирование, экстракцию и выделение. Данная цель достигается путем использования в качестве продуцента гриба Blakesleatrispora, а также путем ведения специального технологического процесса и подбора экстрагентов, позволяющих получить и выделить в одной схеме убихиноны, каротиноиды (каротин, ликопин), эргостерин и фосфолипиды. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Биомассу гриба Blakeslea trispora с влажностью 7-75% экстрагируют полярным растворителем (например, ацетоном или этанолом) или смесью полярного и неполярного растворителей (например, ацетон:гексан или этанол:гексан) при температуре 40-70 С в три ступени при соотношении биомасса:экстрагент,равном 1:3,5 на первой ступени, до 1:1,5 на последней. Отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60 С. После чего экстракт ставят на кристаллизацию каротиноидов в смеси полярного и неполярного растворителей при 5-20 С в течение 3-24 ч при слабом перемешивании. Выпавшие кристаллы каротиноидов отделяют фильтрованием и промывают этанолом. После отделения кристаллов каротиноидов из раствора липидов выделяют фосфолипиды при температуре 520 С в течение 1-5 ч при слабом перемешивании. Кристаллизацию фосфолипидов проводят в ацетоне или смеси ацетона и неполярного растворителя (например, гексана). Полученные фосфолипиды направляются на дальнейшее фракционное разделение в растворе этанола с 5 целью выделения фракции лецитина. Полученный раствор нейтральных липидов омыляют в среде ацетона в водном растворе гидроксида калия при 50-70 С в течение 20-60 мин. Затем омыленную фракцию разбавляют водой и гидролизуют серной кислотой для получения смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию упаривают, перерастворяют в гексане и кристаллизуют эргостерин при 0-20 С в течение 4 ч при соотношении гексан:неомыляемая фракция, равном 1:3-1:50, а затем отфильтровывают полученный в процессе кристаллизации эргостерин. Эргостерин на фильтре промывают органическим растворителем или проводят при необходимости повторную кристаллизацию. Далее эргостерин счищают с фильтра и высушивают при 60 С. После отделения эргостерина фильтрат упаривают или без предварительного упаривания наносят на колонку с адсорбентом, например силикагелем. С адсорбента элюируют неполярным растворителем побочные фракции, а затем смесью полярного и неполярного растворителя элюируют фракцию убихинонов. В качестве неполярного растворителя используют гексан, в качестве полярного - ацетон. Причем для селективного разделения фракции используют 1-5% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фракции убихинонов упаривают и кристаллизуют убихиноны в этиловом спирте при(-15)-(+5)С. Затем отделяют образовавшийся в процессе кристаллизации осадок суммарных (Q9,10) убихинонов. При необходимости проводят дальнейшую их очистку. Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают применение заявленного способа. Пример 1. Биомассу гриба Blakeslea trispora - продуцента -каротина - в количестве 100 г (влажность 7%) экстрагируют в три ступени ацетоном при 58 С. Затем экстракты объединяют, ацетон упаривают. В результате получают 57 г липидов, имеющих следующий фракционный состав(см. табл. 1). Таблица 1 Состав липидов гриба Bl. trispora Содержание, в % Показатели от суммы липидов Фосфолипиды 9,0 Свободные жирные кислоты 19,5 Триглицериды 52,5 Каротиноиды 3,8 Суммарные убихиноны, мг/г 9,0 Эргостерин 2,5 Липиды перерастворяют в ацетоне в соотношении 1:5 и охлаждают раствор до +5 С в течение 3 ч при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы отфильтровывают. Полученный 6 вым спиртом, в результате, получают кристаллы с содержанием основного вещества не менее 9092%. После отделения -каротина из раствора липидов выделяют фосфолипиды при -5 С, для чего частично упаривают растворитель до соотношения липиды:ацетон, равном 1:3, и кристаллизуют фосфолипиды в течение 5 ч. В результате процесса, получают 2,56 г фосфолипидов. Раствор липидов в ацетоне омыляют в 25% водном растворе гидроксида калия при 50 С в течение 20 мин. Омыленную фракцию разбавляют 200 мл воды и гидролизуют H2SO4. Полученные жирные кислоты экстрагируют гексаном. Неомыленную фракцию экстрагируют гексаном в три ступени по 150 мл на каждой, экстракты объединяют, частично упаривают и кристаллизуют эргостерин при 0 С и соотношении гексан:липиды, равном 1:3. Выпавший в осадок эргостерин фильтруют, промывают и сушат при 60 С, в результате, получают 1,25 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 89,9%. После отделения эргостерина фильтрат наносят на колонку с силикагелем марки АСКГ и элюируют побочные фракции гексаном. Затем элюируют фракцию убихинонов, используя 5% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фракции убихинонов упаривают и получают 4,1 г фракции. Эту фракцию растворяют в этиловом спирте при соотношении 1:20, охлаждают раствор до -15 С,выдерживают при этой температуре 24 ч. Затем отделяют выпавшие кристаллы убихинонов и промывают. В результате получают 0,48 г суммарных убихинонов. Пример 2. То же, что и в примере 1, но экстракцию биомассы проводят этанолом. Экстракцию ведут при температуре 70 С. В результате, получают 43 г липидов, имеющих следующий фракционный состав (см. табл. 2). Таблица 2 Содержание, в % Показатели от суммы липидов Фосфолипиды 32,7 Свободные жирные кислоты 14,3 Триглицериды 34,3 Каротиноиды 2,1 Суммарные убихиноны, мг/г 3,5 Эргостерин 3,8 Липиды перерастворяют в гексане и кристаллизуют при 20 С в течение суток при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы отфильтровывают. Полученные кристаллы каротина в количестве 0,6 г промывают этиловым спиртом. После отделения -каротина из раствора липидов выделяют фосфолипиды путем добавления в раствор ацетона, процесс ведут при 20 С в течение 1 ч при перемешивании. В результате, получают 11,6 г фосфолипидов,которые направляются на стадию выделения 7 фракции лецитина в растворе этанола. Раствор нейтральных липидов перерастворяют в ацетоне и омыляют в 20% водном растворе гидроксида калия при 70 С в течение 60 мин. Омыленную и неомыленную фракции обрабатывают так же,как в примере 1. Эргостерин кристаллизуют при 0 С и соотношении гексан:липиды 1:50. В результате, получают 1,16 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 89%. После отделения эргостерина липиды обрабатывают на стадии колоночной хроматографии, как описано в примере 1. Убихиноны кристаллизуют при температуре 5 С в течение суток. Получают 0,14 г кристаллов желто-оранжевого цвета. Пример 3. Биомассу гриба Blakeslea trispora - продуцента ликопина - в количестве 400 г (влажность 75%), выращенную в условиях лабораторного ферментера, экстрагируют в три ступени смесью гексан:этанол:вода=48:39:13 (мас.%) при температуре 40 С. Содержание воды в смеси рассчитывают, учитывая влажность биомассы,пошедшей на экстракцию. Экстракты со всех ступеней объединяют и получают 32 г липидов,имеющих следующий фракционный состав (см. табл. 3). Таблица 3 Содержание, в % Показатели от суммы липидов Фосфолипиды 12,7 Свободные жирные кислоты 22,1 Триглицериды 18,2 Каротиноиды 3,3 Суммарные убихиноны, мг/г 5,1 Эргостерин 3,0 Кристаллизацию ликопина ведут так же,как описано в примере 2. В результате, получают 1,1 г кристаллического ликопина. Выделение фосфолипидов ведут путем добавления в раствор ацетона, получают 3,1 г фосфолипидов. Ацетоновый раствор нейтральных липидов омыляют в 10% растворе гидроксида калия. Количество гидроксида калия рассчитывают, исходя из числа омыления для данных липидов. Процесс омыления ведут при 60 С в течение 50 мин. Омыленную фракцию обрабатывают, как описано в примере 1. Эргостерин из неомыленной фракции кристаллизуют при 20 С и соотношении гексан:липиды 1:10. Выпавший осадок эргостерина промывают и сушат при 50 С, при необходимости проводят повторную перекристаллизацию. В результате, получают 0,77 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 90,1%. После отделения эргостерина фильтрат наносят на колонку с силикагелем марки АСКГ и элюируют побочные фракции гексаном. Затем элюируют фракцию убихинонов, используя 1% раствор ацетона в гексане. Полученный раствор фрак 003212 8 ции убихинонов упаривают и получают 0,8 г фракции. Эту фракцию растворяют в этиловом спирте при соотношении 1:20, охлаждают раствор до -5 С, выдерживают при этой температуре 24 ч. Затем отделяют выпавшие кристаллы убихинонов и промывают их. В результате, получают 0,14 г суммарных убихинонов. Список литературы 1. Folkers К., Watanabe Т., Kaji M., - J. Molec. Med., 1977, v.2 2. Л.М. Коган, Е.А. Обольникова, Г.И. Самохвалов // Химикофармакологический журнал,1983 -17 -4 3. Патент 4684520 (США), 1987 г. 4. Патент 4959212 (США), 1990 г. 5. Патент 5378461 (США), 1995 г. 6. Mascio P., Kaiser S., Sies H. // Arch. Biochem. Biophys. 1989, v.264 7. Патент 4220719 (США), 1983 г. 8. Патент 2022020 (Россия), 1994 г. 9. Патент 1398398 (Россия), 1995 г. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ последовательного получения антиоксидантов и биологически активных соединений липидной природы, а именно -каротина,ликопина, фосфолипидов, жирных кислот, эргостерина и убихинонов, заключающийся в том,что осуществляют следующие стадии: а) экстрагируют биомассу гриба Blakesleatrispora с влажностью 7-75% полярным растворителем (например, ацетоном) или смесью полярного и неполярного растворителей (например, ацетона и гексана или ацетона и этанола) при температуре 40-70 С в три ступени при соотношении биомасса:экстрагент, равном 1:3,5 на первой ступени, 1:2 на второй ступени и 1:1,5 на последней ступени, и отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60 С; б) из полученного на стадии а) экстракта кристаллизуют каротиноиды (-каротин или ликопин) смесью полярного и неполярного растворителей при 5-20 С в течение 3-24 ч при слабом перемешивании и выпавшие кристаллы каротиноидов отделяют фильтрованием и промывают этанолом; в) из оставшегося раствора осаждают фосфолипиды при температуре 5-20 С в течение 1-5 ч при слабом перемешивании смесью ацетона и неполярного растворителя, например гексана, и полученные фосфолипиды направляют на дальнейшее фракционное разделение в растворе этанола с выделением фракции лецитина; г) оставшийся раствор нейтральных липидов подвергают омылению в среде ацетона с водным раствором гидроксида калия при 5070 С в течение 20-60 мин и омыленную фракцию разбавляют водой и гидролизуют серной кислотой с получением смеси жирных кислот; д) из неомыленной фракции кристаллизуют эргостерин в гексане при 0-20 С в течение 4 ч при соотношении гексан:неомыляемая фракция, равном 1:3-1:50, а затем отфильтровывают полученный в процессе кристаллизации эргостерин, промывают его органическим растворителем и высушивают; е) из фильтрата неомыленной фракции выделяют убихиноны путем элюирования их с хроматографической колонки смесью полярного 10 и неполярного растворителей, в частности гексана и ацетона, например 1-5% раствором ацетона в гексане, и ж) из элюированной фракции кристаллизуют убихиноны этиловым спиртом при (-15)(+5)С, затем отделяют образовавшийся в процессе кристаллизации осадок суммарных (Q9,10) убихинонов и при необходимости осуществляют их очистку.