Способы и продукты, относящиеся к лечению и предупреждению инфекции вируса гепатита с

008777 Область техники Данное изобретение обеспечивает способы и продукты для лечения субъектов, хронически инфицированных вирусом гепатита С. Уровень техники Вирус гепатита С (HSV) является РНК-вирусом с положительной цепью, относящимся к семействуFlavivirus, который инфицирует гепатоциты людей и некоторых других приматов. Впервые охарактеризованный в 1989 г. (1) HSV имеет геном 9,5 т.п.н., который кодирует три структурных белка: кор (сердцевину) и два гликопротеина оболочки (Е 1 и Е 2), а также несколько неструктурных (NS) белков, которые участвуют в репликации вируса и взаимодействии с клеткой-хозяином (2).HSV является серьезной проблемой общественного беспокойства, вызывая 90% парентерального не-А, не-В-гепатита (1). Инфицировано от 0,4 до 1,5% населения мира (3,4), в том числе приблизительно 300000 канадцев (Health Canada). Эпидемиологические статистики трудно составлять, так как огромное большинство острых инфекций являются субклиническими; однако, приблизительно определено, что 5080% инфицированных HSV индивидов не способно к выведению этого вируса, и большинство из них становятся пожизненными носителями. Примерно у 50% носителей развивается хронический гепатит, и у 20% из них разовьется цирроз печени, у многих из них впоследствии разовьется гепато-клеточный рак(5-9). В Соединенных Штатах гепатит С вызывает по приблизительной оценке 8000-10000 смертей ежегодно (CDS). В Соединенных Штатах и Канаде имеются две различные схемы лечения, которые были одобрены в качестве терапии гепатита С: монотерапия альфа-интерфероном и комбинированная терапия альфаинтерфероном и рибавирином. Хотя комбинированная терапия дороже и связана с большими количеством побочными эффектов, она определенно в более высокой степени способствует поддерживаемому эффекту, чем монотерапия. Доступны несколько форм альфа-интерферона (альфа-2 а, альфа-2b и консенсусный интерферон (Alfacon. Эти интерфероны обычно вводят подкожно три раза в неделю. ПЭГилированный интерферон,т.е. альфа-интерферон, модифицированный путем присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения продолжительности существования в кровообращении, является другим интерфероном, и его вводят только один раз в неделю. В отличие от этого, рибавирин является пероральным антивирусным агентом, который вводят дважды в день в капсулах по 200 мг. Побочные эффекты альфа-интерферона включают в себя усталость, мышечные боли, головные боли, тошноту и рвоту, раздражение кожи в месте инъекции, небольшой жар, потерю массы, раздражимость, депрессию, суицид, небольшую супрессию костного мозга и потерю волос (обратимую). Побочные эффекты рибавирина включают в себя анемическую усталость и раздражимость, зуд, высыпания на коже, заложенность носа, синусит и кашель. Лечение интерфероном - отдельно или в комбинации с рибавирином - приводит к быстрому улучшению сывороточных уровней ALT (аланинаминотрансферазы) у 50-75% пациентов и исчезновению детектируемой РНК HSV из сыворотки у 30-50% пациентов. Долгосрочное улучшение в заболевании печени обычно происходит только в том случае, если РНК HSV исчезает во время терапии и остается недетектируемой в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. Комбинированная терапия приводит как к большей потере РНК HSV при лечении, так и к меньшему количеству рецидивов после завершения лечения. Однако результаты в большой степени зависят от генотипа вируса, причем лучшие результаты получают при генотипах 2 и 3 (приблизительно 90% в случае лечения в течение 1 года ПЭГилированным IFN- и рибавирином), но гораздо худшие результаты (приблизительно 40% поддерживаемого эффекта реакции) для HSV генотипа 1. В настоящее время большинство хронических носителей HSV в Северной Америке являются носителями генотипа 1. Оптимальная продолжительность лечения варьируется в зависимости от применения монотерапии интерфероном или комбинированной терапии, а также от генотипа HSV. Обычно эта продолжительность варьируется от 6 до 12 месяцев. В настоящее время нет вакцины против HSV или высокоэффективной терапии для хронической инфекции. Таким образом, существует безотлагательная потребность в эффективном лечении, которое могло бы быть использовано для лечения больных - хронических носителей инфекции HVS. Сущность изобретения Предпосылкой данного изобретения отчасти являются неожиданные открытия, включая наблюдение, что иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты могут быть использованы для лечения субъектов, которые хронически инфицированы вирусом гепатита С (HSV) и которые не отвечали на ранее назначаемые курсы нe-CpG-терапии. Кроме того, предпосылкой данного изобретения отчасти являлось наблюдение, что у таких субъектов может возникать синергическая реакция в результате комбинированного использования иммуностимуляторных CpG-нуклеиновых кислот и антивирусного агента, такого какIFN-. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, инфицированного вирусом HSV, который не поддавался прежнему лечению под действием нe-CpG-терапии, предусматри-1 008777 вающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения этой инфекции. В одном варианте осуществления нe-CpG-терапия включает в себя интерферон альфа. В родственном варианте осуществления этим интерфероном альфа является интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон альфа. В другом варианте осуществления нe-CpG-терапия включает в себя интерферон альфа и рибавирин или интерферон альфа и рибавирин и эмантидин. В некоторых важных вариантах осуществления не-CpG-терапия включает в себя ПЭГилированный интерферон альфа и антивирусный агент, такой как рибавирин. В одном варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса А. В другом варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса А. Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С. Этот способ может необязательно включать в себя введение антивирусного агента, такого как интерферон альфа, вместе с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон, но это не является ограничением. В одном варианте осуществления антивирусный агент вводят, по существу, одновременно с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. В одном варианте иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета молекулы. В родственном варианте осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В одном важном варианте осуществления иммуностимуляторная CpGнуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет. В других важных вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой класса С, имеющей полумягкий скелет. Таким образом, в другом аспекте предложен способ лечения субъекта, имеющего инфекцию HSV,которая не поддается успешному лечению под действием прежней не-CpG-терапии, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты класса С, имеющей полумягкий скелет, в количестве, эффективном для лечения этой инфекции. Еще в одном аспекте предложен способ лечения субъекта, имеющего инфекцию HSV, которая не поддается успешному лечению под действием прежней не-CpG-терапии, предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта, нуждающегося в таком лечении, с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой, в количестве, эффективном для стимуляции иммунной реакции, и повторную инфузию этих клеток субъекту. В одном варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В другом варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки. В одном варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С. В родственном варианте осуществления эта иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота имеет полумягкий скелет. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта с инфекцией HSV, который предположительно может оказаться не реагирующим на не-CpG-терапию, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения этой инфекции. В другом варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает идентификацию субъекта, который предположительно может оказаться не реагирующим на не-CpG-терапию. В одном варианте осуществления этого субъекта идентифицируют как индивида, который, возможно, не будет реагировать на не-CpG-терапию на основе анализа интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку. В другом варианте осуществления этого субъекта идентифицируют как индивида, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию на основе генотипа HSV. В одном варианте осуществления не-CpG-терапия включает в себя интерферон альфа. В родственном варианте осуществления не-CpG-терапия включает в себя интерферон альфа и рибавирин. В одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает введение субъекту антивирусного агента. В важных вариантах осуществления таким антивирусным агентом является интерферон альфа. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон альфа, но это не является ограничением. В одном варианте осуществления интерферон альфа вводят в субтерапевтическом количестве, и необязательно комбинация иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты и интерферона альфа является синергической. В одном варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой, используемой для лечения этого субъекта, является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса А,иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса В или иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С. В одном варианте осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота используется-2 008777 для идентификации того, является ли субъект индивидом, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию, и такой иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса А или иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С. В одном варианте осуществления антивирусный агент вводят субъекту, по существу, одновременно с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления интерферон альфа вводят в течение некоторого периода перед лечением иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственных вариантах осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет, а в некоторых еще более предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой класса С, имеющей полумягкий скелет. В другом аспекте обеспечен способ лечения субъекта, инфицированного HSV, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты класса С, имеющей полумягкий скелет, в количестве, эффективном для лечения этой инфекции. Еще в одном аспекте данного изобретения предусмотрен способ скрининга иммуностимуляторныхCpG-нуклеиновых кислот, применимых в лечении хронической вирусной инфекции гепатита С. Этот способ предусматривает контактирование мононуклеарных клеток периферической крови, полученной у субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, с иммуностимуляторной CpGнуклеиновой кислотой и измерение тест-реакции мононуклеарных клеток крови после воздействия. Субъектом, у которого были взяты эти мононуклеарные клетки периферической крови, являлся субъект,в отношении которого есть основания полагать, что использование прежней терапии окажется безуспешным. В одном варианте осуществления тест-реакция была выбрана из группы, состоящей из стимуляции В-клеток, секреции IL-6, секреции IL-10, секреции IL-12, секреции интерферона гамма, секреции интерферонов типа 1 (альфа + бета), секреции IP-10, активности клеток-киллеров (NK), экспрессии CD80, экспрессии CD86, экспрессии CD83 и повышающей регуляции экспрессии МНС класса II. В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В родственном варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки. Еще в одном варианте осуществления этими клетками являются дендритные клетки, и тест-реакция выбрана из группы, состоящей из секреции IL-12, секреции интерферонов типа 1,экспрессии CD80, экспрессии CD86, экспрессии CD83 и повышающей регуляции экспрессии МНС класса II. В одном варианте осуществления контактирование имеет место in vitro. В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови культивируют. Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторную CpG-нуклеиновую кислоту добавляют к культивируемым мононуклеарным клеткам периферической крови. В одном варианте предыдущая терапия является не-CpG-терапией. В другом варианте не-CpGтерапия включает в себя интерферон альфа. В другом варианте осуществления не-CpG-терапия включает в себя дополнительно рибавирин. В других вариантах осуществления интерферон альфа является ПЭГилированным интерфероном альфа. В одном варианте осуществления предыдущая терапия является терапией с CpG-нуклеиновой кислотой отличающейся последовательности или отличающегося класса. В других вариантах осуществления этот способ дополнительно предусматривает скрининг иммуностимуляторных CpG-нуклеиновых кислот на способность стимулировать контрольную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у нормального субъекта. Этот способ может дополнительно предусматривать контактирование мононуклеарных клеток периферической крови с интерфероном альфа по существу одновременно с иммуностимуляторной CpGнуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственном варианте осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В важных вариантах осуществления иммуностимуляторная CpGнуклеиновая кислота имеет полумягкий скелет. Эта иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота может быть иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой класса А, иммуностимуляторной CpGнуклеиновой кислотой класса В или иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой класса С. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С, а в других вариантах осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С с полумягким скелетом молекулы. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, имеющего-3 008777 инфекцию HSV, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию. Этот способ предусматривает подвергание мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта,имеющего вирусную инфекции гепатита С, действию иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты,измерение интерферона альфа, продуцированного этими клетками, и определение количества интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, где количество интерферона альфа, которое ниже 1,0 пг/мл, служит показателем того, что субъект, по-видимому, не будет реагировать на не-CpGтерапию. В одном варианте осуществления количество, которое ниже 0,5 пг/мл, служит показателем того, что субъект, вероятно, не будет реагировать на не-CpG-терапию. В одном варианте осуществления не-CpG-терапия включает в себя терапию интерфероном альфа. В другом варианте осуществления не-CpG-терапия включает в себя терапию рибавирином. В другом варианте осуществления интерферон альфа является ПЭГилированным интерфероном альфа. В некоторых важных вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой класса А или иммуностимуляторной CpGнуклеиновой кислотой класса С. В других вариантах осуществления мононуклеарные клетки периферической крови дополнительно подвергают действию антивирусного агента вместе с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. Антивирусным агентом может быть, не ограничиваясь им, интерферон альфа. В одном варианте осуществления интерфероном альфа является интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон альфа. В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В родственном варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки. В другом варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является острой вирусной инфекцией гепатита С. В другом варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает определение генотипа HSV. Еще в одном дополнительном аспекте предусмотрен способ идентификации субъекта, имеющего инфекцию HSV, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию, предусматривающий подвергание мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта, имеющего вирусную инфекции гепатита С, действию иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты класса А или класса С, измерение уровня интерферона альфа, продуцированного этими клетками, и определение количества интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, где количество интерферона альфа, которое ниже 1,0 пг/мл, служит признаком того, что субъект предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию. В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию гепатита С, предусматривающий введение субъекту, идентифицированному согласно способу, описанному выше, молекулы иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты в количестве,эффективном для лечения этой инфекции. В одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает введение этому субъекту интерферона альфа. В одном варианте этим интерфероном альфа является интерферон альфа 2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон. В одном варианте осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой, используемой для лечения этого субъекта, является иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса А,иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса В или иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С. В другом варианте осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственном варианте этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет. В одном варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является хронической инфекцией вируса гепатита С. В другом варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является острой инфекцией вируса гепатита С. Каждое из ограничений согласно изобретению может включать в себя различные варианты согласно изобретению. Таким образом, предполагается, что каждое из ограничений согласно изобретению,включающее в себя любой один элемент или комбинацию элементов, может быть включен в каждый аспект согласно изобретению. Эти и другие аспекты согласно изобретению описаны более подробно ниже. Краткое описание фигур На фиг. 1 показана индукция секреции IFN- из HSV-инфицированных и нормальных РВМС после стимуляции 3 классами CpG. РВМС из нормальных и HSV-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами CpG в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на пред-4 008777 мет секреции IFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Средние уровни секреции IFNдля 10 нормальных субъектов и 10 HSV-инфицированных субъектов показаны черными чертами. На фиг. 2 показаны результаты проточного цитометрического анализа свежевыделенных РВМС,полученных у хронических носителей HSV и нормальных субъектов. РВМС выделяли из крови HSVинфицированных субъектов и из нормальных здоровых доноров и проводили иммуноокрашивание флуоресцентномечеными антителами против плазмацитоидных дендритных клеток (pDC). Клетки анализировали на проточном цитометре и результаты сравнивали с данными по секреции IFN- на тех же самых субъектах при стимуляции CpG. На фиг. 3 показана индукция IFN- при стимуляции РВМС С-олигонуклеотидами класса С и мягкими олигонуклеотидами класса С. РВМС из нормальных и HSV-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами CpG в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции IFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Средние значения уровня секреции IFN- у 10 нормальных субъектов и 10 HSV-инфицированных субъектов показаны черными чертами. На фиг. 4 показана индукция IFN- после стимуляции панелью полумягких CpG класса С. РВМС,выделенные из 5 HSV-инфицированных субъектов, инкубировали с панелью полумягких олигонуклеотидов класса С в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секрецииIFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Среднее значение уровня секреции IFN- у 5HSV-инфицированных субъектов показано черными чертами. На фиг. 5 показана секреция IFN- после стимуляции тремя классами CpG. РВМС из нормальных или HSV-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами CpG в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции IFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Средние значения уровня секреции IFN- у 10 нормальных субъектов и 10 HSVинфицированных субъектов показаны черными чертами. На фиг. 6 показана индукция IFN- после стимуляции панелью полумягких CpG класса С. РВМС,выделенные из 5 HSV-инфицированных субъектов, инкубировали с панелью полумягких олигонуклеотидов класса С в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и в них анализировали секрецию IFNс использованием коммерческих наборов ELISA. Средняя секреция IFN- у 5 HSV-субъектов показана черными чертами. На фиг. 7 показана секреция IP-10 после стимуляции тремя классами CpG. РВМС из нормальных или HSV-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами CpG в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и в них анализировали секрецию IP-10 с использованием коммерческих наборов ELISA. Средние значения уровня секреции IP-10 у 10 нормальных субъектов и 10 HSVинфицированных субъектов показаны черными чертами. На фиг. 8 показано действие CpG на пролиферацию В-клеток. РВМС из HSV-инфицированных или нормальных доноров инкубировали с CpG класса А, В или С в течение 5 дней. Затем клетки подвергали импульсному воздействию 3 Н-тимидина в течение 16-18 ч перед измерением радиоактивности. Величины представлены в виде индексов стимуляции в сравнении со средой в качестве контроля (SI = имп/мин клеток, инкубированных с CpG/имп/мин клеток, инкубированных только со средой). На фиг. 9 показано действие полумягкого CpG класса С на пролиферацию В-клеток. РВМС из 5HSV-инфицированных субъектов инкубировали с CpG класса А, В, С полумягкого CpG класса С в течение 5 дней. Затем клетки подвергали импульсному воздействию 3 Н-тимидина в течение 16-18 ч перед измерением радиоактивности. Величины представлены в виде индексов стимуляции в сравнении со средой в качестве контроля (SI = имп/мин клеток, инкубированных с CpG/имп/мин клеток, инкубированных только со средой). На фиг. 10 показана секреция IP-10 после стимуляции тремя классами CpG. РВМС из нормальных или HSV-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами CpG в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции IP-10 с использованием коммерческих наборов ELISA. Средний уровень секреции IP-10 у 10 нормальных субъектов и 10 HSVинфицированных субъектов показан черными чертами. На фиг. 11 показана секреция IFN- после стимуляции HSV-инфицированных клеток рибавирином и CpG, отдельно или в комбинации с интроном А. РВМС у 10 HSV-инфицированных субъектов и 10 нормальных здоровых доноров инкубировали с интроном А, рибавирином или CpG класса С отдельно, а также с интроном А и без интрона А (очищенного экзогенного источника IFN-) в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции IFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Для количества IFN-, измеренного для интрона А отдельно для каждого субъекта,учитывали фон, и это количество вычитывали из вариантов интрон А, рибавирин + интрон А и класс С + интрон А для тех же самых субъектов перед включением этих данных в диаграмму. Средние величины для нормальных и HSV-субъектов показаны черными и белыми чертами соответственно. На фиг. 12 - синергическое действие CpG в комбинации с интроном А на секрецию IFN- HSV-5 008777 инфицированными клетками. РВМС из 15 HSV-инфицированных субъектов инкубировали с CpG класса С, отдельно или вместе с интроном А (очищенным экзогенным источником IFN-) в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции IFN- с использованием коммерческих наборов ELISA. Количество IFN-, измеренное для одного интрона А для каждого субъекта, вычитывали из CpG + интрон А для тех же самых субъектов перед включением этих данных в диаграмму. Должно быть понятно, что эти фигуры не являются необходимыми для осуществления заявленного изобретения. Подробное описание изобретения Согласно изобретению было обнаружено, что CpG-олигонуклеотиды могут активировать РВМС,полученные у пациентов, хронически инфицированных HSV, в том числе пациентов, в отношении которых прежде безуспешно применяли терапию с использованием интерферона альфа, таким же образом,как и РВМС из здоровых субъектов. Было обнаружено, что эндогенная секреция IFN- сильно индуцировалась из плазмацитоидных дендритных клеток (PDC), которые, как предполагается, инфицированы HSV, что приводит к их дисфункции и уменьшенной способности отвечать на другие стимулы. В некоторых случаях было обнаружено, что классы CpG A и С, которые индуцируют высокие уровни IFN- в РВМС здоровых добровольцев, индуцируют наивысшие уровни IFN- из pDC. Далее было обнаружено, что полумягкие CpG-ODN класса С также особенно применимы для этого действия. Эти ODN могут быть предпочтительными в некоторых вариантах, так как они не будут накапливаться в почках при повторном введении доз. Далее согласно изобретению было обнаружено, что ни экзогенный IFN- (интрон А), ни рибавирин не оказывают никаких детектируемых прямых иммунных стимуляторных действий на РВМС из нормальных субъектов или хронических носителей HSV ни при использовании по отдельности, ни при совместном использовании. Однако при совместном использовании интрона А и CpG-ODN (например,класса В или С) наблюдают сильный синергизм в отношении продуцирования эндогенного IFN-. Эти результаты показывают, что CpG-ODN являются эффективной терапией отдельно или вместе сIFN- для лечения хронической инфекции HSV. Данное изобретение обеспечивает способы и продукты для предупреждения и лечения инфекции HSV на основании этих открытий. По-видимому, хроническая инфекция обусловлена, по меньшей мере частично, быстрой скоростью мутации HSV, приводящей к образованию квази-видов, которые могут избежать иммунного надзора (10,11). У хронически инфицированных индивидов могут быть детектированы как гуморальный, так и клеточно-опосредованный (CMI) иммунитет. Хотя нейтрализующие антитела являются критическими для защиты от инфекции, клеточно-опосредованный иммунитет (CMI) играет, по-видимому, главную роль в выведении (клиренсе) вируса после возникновения инфекции. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, инфицированного вирусом гепатита С (HSV), который не был успешно вылечен прежней не-CpG-терапией. Этот способ предусматривает введение не отвечающему на прежнюю терапию субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для ингибирования этой инфекции. не-CpG-терапия означает в данном контексте терапию, в которой используются активные или неактивные соединения, которые не являются иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами. В различных вариантах не-CpG-терапия включает в себя интерферон альфа. ПЭГилированный IFN- вводят обычно HSV-субъектам (например, больным с HSV) предпочтительно в комбинации с рибавирином и необязательно амантадином. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон. Все предыдущие попытки лечения с использованием интерферона альфа включены в определение не-CpG-терапии. Субъект, лечение которого в результате прежней не-CpG-терапии оказалось безуспешным, является субъектом, который, вопреки предыдущему лечению, все еще имеет детектируемую вирусную нагрузку в кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения терапии. Эти субъекты включают в себя субъектов,которые могут отвечать на предыдущую не-CpG-терапию, но не могут побеждать инфекцию, и она впоследствии рецидивирует, о чем свидетельствует детектируемая вирусная нагрузка. В данном контексте для простоты этих субъектов называют нереспондерами, однако, этот термин должен пониматься, как определено здесь, а не так, как он понимается в клинике. Другими словами, хотя в клинике термин нереспондер определяется только как узкая субпопуляция субъектов, которая неспособна обнаруживать никакой реакции на лечение, данное изобретение относится к более широкой категории субъектов, которые, хотя, возможно, и отвечают до некоторой степени на предыдущее лечение, однако, успешному лечению не поддаются. Субъект, который считается успешно вылеченным, является субъектом, кровоток которого свободен от детектируемой вирусной нагрузки спустя 6 месяцев после прекращения лечения. Успешным лечением называют лечение, которое приводит к недетектируемому уровню вирусной нагрузки в кровотоке, который поддерживается по меньшей мере в течение 6 месяцев после прекращения лечения. Должно быть понятно, что нереспондер в данном контексте означает также "хронически инфицированный HSV".-6 008777 В данном контексте при ссылке на лечение с использованием CpG-нуклеиновых кислот подразумевают способы достижения успешного лечения субъектов. Успешное лечение субъектов с использованием CpG-лечения определяется как уменьшение вирусной нагрузки до недетектируемых уровней в кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения терапии. Интересно, что уменьшение вирусных нагрузок во время или сразу после лечения CpG может не наблюдаться, скорее может наблюдаться только уменьшение спустя некоторое время после лечения, причем конечным результатом будет то, что в кровотоке этих субъектов не будет детектируемого вируса спустя 6 месяцев после прекращения лечения. Таким образом,лечение инфекции означает уменьшение вирусной нагрузки до недетектируемого уровня в кровотоке субъекта и поддержание этого уровня в течение 6 месяцев после прекращения лечения. Таким образом,эффективные количества агентов вводят для достижения этого конечного результата. В некоторых вариантах осуществления потенциальные нереспондеры могут быть идентифицированы как предполагаемые нереспондеры в будущем (т.е. перед фактическим лечением in vivo не-CpGтерапией), и данное изобретение обеспечивает способы не только идентификации таких субъектов, но также и их лечения. Потенциальные нереспондеры могут быть идентифицированы оценкой их способности отвечать на иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты, в частности, класса А и класса С. Способность отвечать на иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты будет оцениваться по количеству интерферона альфа, которое продуцируется на одну pDC у HSV-инфицированных субъектов. Согласно изобретению было обнаружено, что HSV-инфицированные субъекты, которые вряд ли будут отвечать на не-CpG-терапию, такую как IFNтерапия, могут быть идентифицированы перед получением такого лечения. Такая возможность идентифицировать таких субъектов перед терапией in vivo исключает ненужное лечение и создает возможность обеспечить этим субъектам терапевтически выгодное лечение иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами согласно изобретению либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами для анти-HSV-терапии, в том числе, но не ограничиваясь им, IFN-. Эти субъекты меньше бы страдали от цитотоксичности, и период роста вируса также был бы сокращен в результате того, что больных не будут подвергать безуспешному лечению. Субъектов, имеющих уровень индукции IFN- на одну pDC ниже определенного уровня, вероятно, не удастся успешно лечить IFN- и,следовательно, их нужно лечить предлагаемыми здесь способами. Измерение индукции IFN- и количеств pDC описаны более подробно в примерах. Должно быть понятно, что HSV-инфицированный субъект, который успешно лечится любыми из терапевтических агентов и способов, обсуждаемых здесь, будет, возможно, все еще носителем вируса. Однако хотя этот субъект не способен полностью уничтожить этот вирус, он способен контролировать вирусную нагрузку (удерживая ее на недектируемых уровнях). Хотя и не желая связывать себя какойлибо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что поддержание недетектируемых вирусных нагрузок у таких субъектов связано с иммунной системой, которая способна контролировать репликацию и распространение вируса. Рядовой специалист в данной области с использованием предложенных здесь способов сможет определить, будет ли субъект нереспондером в отношении IFNтерапии. В качестве примера, если индукцию IFN- проводили с использованием нуклеиновой кислоты класса А, такой как нуклеиновая кислота, представленная SEQ ID NO:1, в условиях культуры, описанных в примерах, то нормальной реакцией, которая служит признаком способности отвечать на IFNтерапию, будет 1 пг/мл на одну pDC. Количество, меньшее, чем это, будет служить признаком некоторой дисфункции pDC. Количества,меньшие, чем 0,5 пг/мл на одну pDC, коррелируют с более высокой вероятностью отсутствия реакции наIFNлечение. Рядовой специалист в данной области умеет определять такие пределы для конкретного типа используемой нуклеиновой кислоты в этом анализе и, следовательно, сможет идентифицировать субъектов, в отношении которых не следует надеяться на успешное лечение IFN- (по меньшей мере) перед фактическим лечением таких субъектов подобным образом. В других вариантах способ идентификации субъекта, который предположительно будет нереспондером на не-CpG-терапию (например, IFNтерапию), может дополнительно предусматривать идентификацию генотипа HSV, которым он/она инфицированы. Например, более вероятно, что субъект, инфицированный HSV генотипа 1, не будет успешно реагировать на IFNтерапию. Таким образом, кроме оценки продуцирования IFN- на одну DC у таких субъектов, может быть также определен их генотипHSV (с использованием способов, известных в данной области), и эта комбинация информации может быть использована для идентификации субъекта, который, скорее всего, не будет отвечать на IFN-терапию. Кроме того, должно быть понятно, что в некоторых аспектах данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, который вероятнее всего не будет успешно отвечать на не-CpG-терапию(фактически без попытки лечения этого субъекта не-CpG-терапией), и затем лечения этого субъекта с использованием иммуностимуляторных CpG-нуклеиновых кислот, либо отдельно, либо в комбинации с таким неограничительным антивирусным агентом как IFN-. Описанные выше способы могут быть также использованы для скрининга субъектов на предмет их реагирования на конкретные иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты.-7 008777 В других вариантах осуществления эти способы могут предусматривать дополнительную стадию идентификации субъектов, получавших прежде не-CpG-терапию, но в результате не вылеченных. Рядовые специалисты в данной области, используя предлагаемые здесь способы, смогут идентифицировать таких субъектов. В качестве примера, такие субъекты будут иметь детектируемые вирусные нагрузки в их кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения лечения. В некоторых вариантах эти субъекты могут также демонстрировать уменьшение вирусной нагрузки сразу же после лечения, но это уменьшение не будет устойчивым. В данном изобретении подразумевается лечение субъектов, для которых предыдущая не-CpGтерапия прошла безуспешно, с использованием, помимо прочего, только иммуностимуляторных CpGнуклеиновых кислот или в комбинации с другими активными агентами, такими как описанные ранее дляHSV-инфекции. В широком смысле, иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, имеющие по меньшей мере один CpG-динуклеотидный мотив, в котором, по меньшей мере, С этого динуклеотида является неметилированным. Иммуностимуляторные CpGнуклеиновые кислоты включают в себя, не ограничиваясь ими, иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса А, класса В и класса С, как описано более полно здесь и в патентах, и патентных заявках,цитируемых здесь и включенных в качестве ссылки. Эти классы иммуностимуляторных CpGнуклеиновых кислот имеют отличающиеся свойства и профили активации. В важных вариантах осуществления иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С. Согласно данному изобретению неожиданно было обнаружено, что иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса С являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления, несмотря даже на то, что эти нуклеиновые кислоты обладают свойствами, промежуточными относительно свойств класса А и класса В. Приведенные здесь примеры показывают, что, несмотря даже на то, что pDC хронически инфицированных субъектов, не излечиваемых в результате прежней не-CpG-терапии, сами инфицированы HSV и вследствие этого являются нефункциональными в некоторых аспектах, воздействие на такие клетки иммуностимуляторных CpGнуклеиновых кислот, в частности, иммуностимуляторных кислот класса С, восстанавливает их функцию. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно также, чтобы иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты класса С были либо "мягкой", либо "полумягкой" разновидности, как описано здесь более подробно. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG является полумягкой нуклеиновой кислотой класса С. В других аспектах иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты используют в комбинации с активными агентами, которые предпочтительно включают в себя активные агенты, описанные ранее для лечения HSV. Особенно важно использование иммуностимуляторных CpG-нуклеиновых кислот с интерфероном альфа (например, интроном А). Интерфероны, которые могут быть использованы в комбинации с иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон альфа. Здесь описаны и другие антивирусные агенты. Любой из классов CpG может быть использован в этих комбинациях. В качестве примера, согласно изобретению неожиданно было обнаружено, что хотя под действием экзогенно вводимого интерферона альфа лечение этих субъектов безуспешно, при комбинировании с иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами это средство терапевтически эффективно. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой класса С. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления она является полумягкой нуклеиновой кислотой класса С. Времена введения CpG-нуклеиновой кислоты и антивирусного агента (например, интерферона альфа) могут варьировать от субъекта к субъекту и в зависимости от тяжести инфекции. Антивирусный агент может вводиться, по существу, одновременно с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой. Это означает, что эти два агента могут быть объединены перед введением или могут быть объединены в процессе введения (например, с подачей обоих в систему внутривенной инфузии субъекту), или они могут вводиться раздельно, но в пределах периода времени, которого будет достаточно для выполнения двух введений (например, времени для введения субъекту двух инъекций). Независимо от того, вводят ли эти агенты, по существу, одновременно или ступенчато, последовательность введения может варьироваться. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная CpGнуклеиновая кислота может вводиться перед антивирусным агентом, таким как IFN-, тогда как в других вариантах осуществления она может вводиться после антивирусного агента. При применении CpG-нуклеиновых кислот вместе с другими антивирусными агентами (например,IFN-) эти соединения могут вводиться в объединенном количестве, которое является терапевтически эффективным. Таким образом, количество любого соединения может быть субтерапевтическим или супертерапевтическим (т.е. ниже или выше количества, которое было бы терапевтически эффективно при раздельном введении). Альтернативно, каждое из этих соединений может вводиться в терапевтическом количестве, но комбинация этих агентов создает терапевтическое преимущество, такое как уменьшение побочных дей-8 008777 ствий. В предпочтительных вариантах, если антивирусным агентом является IFN-, его вводят в терапевтическом количестве. Независимо от фактически вводимых количеств, комбинация агентов может быть синергической. Синергической является реакция, которая является более высокой, чем аддитивная реакция, ожидаемая от комбинации этих агентов. В других аспектах и в соответствии с приведенным выше описанием, данное изобретение обеспечивает способы скрининга CpG-нуклеиновых кислот на предмет определения способности стимулировать иммунные клетки, выделенные из субъекта, хронически инфицированного HSV и не излечиваемого в результате не-CpG-терапии или который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию. Эти способы скрининга обычно выполняют in vitro путем приведения в контакт мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой в эффективном количестве, достаточном для стимуляции иммунной реакции. Иммунная реакция может быть оценена по любым показателям, в том числе по продуцированию IFN-, стимуляции В-клеток, секреции цитокинов,таких как IL-6, IL-10, IL-12, интерферон гамма, интерфероны типа 1 (альфа + бета), секреции хемокинов,таких как IP-10, активности природных клеток-киллеров (NK), экспрессии костимуляторных молекул(например, CD80, CD86) и молекул созревания (например, CD83) и повышению экспрессии МНС классаII. В некоторых важных вариантах осуществления иммунными клетками являются дендритные клетки и предпочтительно плазмацитоидные дендритные клетки (pDC), и маркеры иммунной реакции являются специфическими для этого типа клеток. Они включают в себя, не ограничиваясь ими, экспрессию костимуляторных молекул (например, CD80 и CD86), экспрессию молекул созревания (например, CD83), экспрессию и/или секрецию IL-12 и интерферонов типа 1 (альфа + бета) и повышающую регуляцию экспрессии МНС типа II. Должно быть понятно, что эти in vitro анализы не зависят от выделения дендритных клеток, таких как pDC, из остальных РВМС. Предпочтительнее эти анализы могут проводиться в гомогенных популяциях РВМС. Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, подлежащую лечению иммуностимуляторной CpGнуклеиновой кислотой. Этот способ предусматривает воздействие на мононуклеарные клетки периферической крови, полученные у субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, i) иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой и ii) иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой и антивирусным агентом (например, интерфероном альфа) и измерение реакции мононуклеарных клеток периферической крови после воздействия. Реакция на иммуностимуляторную CpG-нуклеиновую кислоту служит признаком того, что субъект подлежит лечению иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислотой, либо после, либо вместо не-CpG-I-терапии (как описано выше, но только после идентификации субъекта, который предположительно не будет реагировать на не-CpG-терапию). Реакция на иммуностимуляторную CpG-нуклеиновую кислоту вместе с антивирусным агентом (например, интерфероном альфа), которая сильнее реакции в ответ только на иммуностимуляторную CpG-нуклеиновую кислоту,служит признаком того, что субъект подлежит лечению этой комбинацией. Как здесь описано, антивирусным агентом может быть интерферон альфа, в том числе, но не только, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2 а или консенсусный интерферон альфа. Предпочтительно мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки, такие как плазмацитоидные дендритные клетки. Данное изобретение дополнительно включает в себя лечение субъектов, идентифицированных, как только что было описано, с использованием либо только иммуностимуляторной CpG-нуклеиновой кислоты, либо в комбинации с антивирусным агентом (например, IFN-), в зависимости от результата указанного скрининг-анализа. Клинические стратегии предусматривают локальное и системное введение in vivo таких нуклеиновых кислот, а также стратегии ex vivo, в которых pDC, выделенные из нечувствительных HSVинфицированных субъектов, активируют in vitro иммуностимуляторными нуклеиновыми кислотами и затем повторно инфузируют пациенту локально или системно. Эти терапевтические стратегии могут включать в себя комбинацию с другими факторами роста (IL-3, GM-CSF, flt3-лигандом и т.д.), а также с другими стимулами (суперантигенами, вирусными продуктами). Поскольку природный IFN- представляет собой семейство из более чем дюжины отдельных генных продуктов, некоторые из которых имеют уникальные профили активности, клиническое применение природного интерферона может быть предпочтительным в сравнении с рекомбинантным IFN-, полученным на основе единственного рекомбинантного гена IFN-. В данном изобретении дополнительно предусмотрен способ активации pDC из инфицированного вирусом гепатита С субъекта. Этот способ предусматривает выделение pDC из субъекта, нуждающегося в таком лечении, культивирование этих выделенных pDC in vitro, контактирование этих pDC in vitro с эффективным количеством выделенной иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты и возврат этих проконтактировавших клеток субъекту. Эти клетки могут быть также в контакте in vitro с фактором роста или цитокином. Эти иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты и условия, требующиеся для лечения с использованием IFN- в соответствии с данным аспектом изобретения, являются условиями, описанными выше.-9 008777 Сам IFN- представляет собой семейство из более чем дюжины родственных, гомологичных белков(изоформ, см. табл. 1 ниже), каждый из которых кодируется уникальным геном и каждый проявляет уникальный профиль активности. Активности различных разновидностей интерферона альфа в отношении вирусов могут отличаться в двадцать раз или более. Продукты IFN- в клиническом применении являются рекомбинантными белками или высокоочищенными природными белками единственной изоформы. В Соединенных Штатах IFN- доступен в виде рекомбинантного IFN-2 а человека (ROFERON-A),рекомбинантного IFN-2b (INTRON А) и в виде очищенного природного IFN-n3 (ALFERON N). Вне Соединенных Штатов IFN- доступен также в виде очищенного IFN-n1 (WELLFERON). Таблица 1 Семейство IFN- человека Некоторые из способов согласно изобретению требуют измерения иммунных реакций, детектирующих присутствие IFN-. Анализы на IFN- хорошо известны в данной области. Они включают в себя прямые тесты, например твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), специфичный в отношении по меньшей мере одного IFN-, и непрямые тесты, например функциональные тесты, включающие в себя активацию/цитотоксичность NK-клеток (Trinchieri G Adv Immunol 47:187-376 (1989 и фенотипирование с использованием анализа сортинга клеток с активацией флуоресценции (FACS) для МНС класса I. Дополнительные специфические способы анализов, хорошо известные в данной области, могут быть, в частности, использованы в условиях, когда интерес представляет локальная концентрация или локальное присутствие IFN-. Эти способы включают в себя, например, иммуногистохимию, гибридизацию нуклеиновых кислот (например, Нозерн-блоттинг), Вестерн-блоттинг с использованием обратной транскриптазы/полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) и ОТ/ПЦР in situ. Внутриклеточный IFN- может быть также детектирован с использованием проточной цитометрии. Данное изобретение в некоторых аспектах включает в себя измерение активации pDC. АктивацияpDC может анализироваться различными путями. Они включают в себя продуцирование IFN-, экспрессию костимуляторных молекул (например, CD80 и CD86), экспрессию молекул созревания (например,CD83), экспрессию IL-12 и повышение экспрессии МНС класса II. В отличие от введения экзогенногоIFN-, активация pDC приводит к образованию различных, если не всех, форм IFN-, а также интерферонов другого типа I, таких как IFN-. Таким образом, в некоторых вариантах pDC активируются, что определяется по их способности продуцировать интерфероны типа I, в том числе IFN-. В данном изобретении предусмотрены различные способы с использованием иммуностимуляторных нуклеиновых кислот. Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой является молекула нуклеиновой кислоты, которая при контактировании с клетками иммунной системы сама способна стимулировать контактирующие клетки иммунной системы к пролиферации и/или превращения их в активированные клетки. Это контактирование может быть прямым или опосредованным, например, такая иммуностимуляторная нуклеиновая кислота может напрямую стимулировать иммунные клетки первого типа для экспрессии продукта,который может, в свою очередь, стимулировать иммунные клетки второго типа, которые не были под- 10008777 вергнуты действию иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты или не реагируют на эту иммуностимуляторную нуклеиновую кислоту. Это иммуностимуляторное действие иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты является отдельным от действия любого продукта, который может, вероятно, кодироваться последовательностью этой иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты. Подобным образом, иммуностимуляторное действие иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты отличается от любого антисмыслового механизма и не основано на каком-либо антисмысловом механизме. Только определенные нуклеиновые кислоты являются иммуностимуляторными нуклеиновыми кислотами. Сначала считалось, что определенные палиндромные последовательности являются иммуностимуляторными. Tokunaga T. et al., Microbiol Immunol 36:55-66 (1992); Yamamoto T. et al., Antisense ResDev 4:119-22 (1994). Последующие исследования показали, что непалиндромные последовательности также являются иммуностимуляторными, при условии, что они содержат CpG-динуклеотиды в конкретных контекстах последовательности (CpG-мотивах) Krieg A.M. et al., Nature 374:546-9 (1995). Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Обычно двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот являются более стабильными in vivo, тогда как одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот имеют повышенную иммунную активность. Таким образом, в некоторых аспектах согласно изобретению предпочтительно, чтобы иммуностимуляторная нуклеиновая кислота была одноцепочечной, а в других аспектах предпочтительно, чтобы иммуностимуляторная нуклеиновая кислота была двухцепочечной. Способы и продукты, обеспеченные в соответствии с данным изобретением, относятся к применению CpG-олигонуклеотидов. CpG-ODN запускает большинство (95%) В-клеток в отношении пролиферации, секреции иммуноглобулина (Ig), IL-6 и IL-12 и делает их защищенными от апоптоза. Кроме того,CpG-ODN вызывают созревание DC, а также прямо активируют DC, моноциты и макрофаги в плане секреции IFN-/, IL-6, IL-12, GM-CSF, хемокинов и TNF-. Эти цитокины стимулируют природные клетки-киллеры (NK) в плане секреции IFN- и имеют увеличенную литическую активность. В целом CpG индуцирует сильное Th1-подобное распределение продуцирования цитокинов, в котором доминируютIL-12 и IFN-, с малой секрецией Th2-цитокинов. Кроме индукции природных иммунных реакций, CpG-ДНК усиливает также антигенспецифические реакции вследствие (i) сильного синергизма между путями передачи сигналов В-клеток, запускаемых через рецептор В-клеточного антигена, и посредством CpG, (ii) Th1-подобных цитокинов, которые заменяют или усиливают антигенспецифическую Т-помощь, усиливая как специфические для В-клеточных антигенов, так и специфические для Т-клеточных антигенов реакции, и (iii) повышающей регуляции костимуляторных молекул, которые требуются для клеточных реакций. Было показано, что CpG-ODN является сильным адъювантом для HBsAg у мышей Balb/c с явнымиTh1-подобными реакциями (преимущественно антителами IgG2a и сильными CTL) (49). Было обнаружено, что CpG-ODN превосходит другие адъюванты Тh1, такие как монофосфориллипид A (MPL, Corixa) или даже полный адъювант Фрейнда (CFA), который слишком токсичен для использования на человеке. Сходные результаты сообщались с использованием CpG-ODN со множеством других антигенов (47, 5053). Сообщалось также, что CpG-ODN изменяют направление Th2-реакции, ранее установленное иммунизацией Th2-антигеном (т.е. поверхностным антигеном Schistosomiasis) (54) или Th2-адъювантом (т.е. квасцами). Имеются по меньшей мере три основных класса CpG-ODN, которые, как обнаружено, эффективны в стимуляции РВМС здорового человека (табл. I). Они вызывают разные эффекты, которые, вероятно,ассоциированы с различными способами действия, при помощи которых CpG-ODN могут стимулировать иммунные клетки.CpG-ODN В класса синтезируются с нуклеаза-резистентными фосфоротиоатными скелетами и обычно характеризуются хорошей активацией В-клеток и DC, приводящей к продуцированию IL-12 и антитела, но только ограниченной активацией NK-клеток. Этот класс ODN хорошо функционирует в качестве вакцинного адъюванта, как уже было продемонстрировано при тестировании CpG (члена этого класса) в клиническом испытании фазы I/II (SEQ ID NO:2) в качестве адъюванта в отношении коммерческой вакцины гепатита В (60).CpG-ODN класса А синтезируются с химерным скелетом, в котором 5'- и 3'-концы являются фосфоротиоатными, а район центрального CpG-мотива является фосфордиэфирным. Эти ODN характеризуются хорошей активацией NK-клеток и DC, приводящей к большему продуцированию IFN-, но ограниченной активации В-клеток.CpG-ODN класса С синтезируются с фосфоротиоатным скелетом и имеют стимуляторные свойства,промежуточные относительно двух других классов CpG-ODN (например, хорошую активацию В-клеток,а также активацию NK-клеток и DC).- 11008777 Таблица I Характер иммунной активации in vitro, индуцируемой тремя различными классами CpG-ODNSOS-ODN приготовлены с химерным скелетом, в котором центральный CpG-содержащий район имеет фосфодиэфирные связи, а 3'- и 5'-концы ODN приготовлены с фосфоротиоатными связями 2 Способы согласно изобретению могут включать в себя использование иммуностимуляторных CpGнуклеиновых кислот класса А, класса В и класса С. Что касается CpG-нуклеиновых кислот, недавно было описано, что имеются различные классы CpG-нуклеиновых кислот. Один класс является сильным в отношении активации В-клеток, но относительно слабым в индукции активации IFN- и NK-клеток; этот класс был назван классом В. CpG-нуклеиновые кислоты класса В обычно являются полностью стабилизированными и включают в себя неметилированный CpG-динуклеотид в определенных предпочтительных контекстах оснований. См., например, патенты США 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Другой класс является сильным в индукции активации IFN- и NK-клеток, но относительно слабым в стимуляции В-клеток; этот класс был назван классом А. CpG-нуклеиновые кислоты класса А обычно имеют стабилизированные поли-G-последовательности на 5'- и 3'-концах и палиндромную фосфодиэфирную CpG-динуклеотидсодержащую последовательность по меньшей мере из 6 нуклеотидов. См., например, опубликованную патентную заявку PCT/US 00/26527 (WO 01/22990). Еще один класс CpG-нуклеиновых кислот активирует В-клетки и NK-клетки и индуцирует IFN-; этот класс был назван классом С. CpG-нуклеиновые кислоты класса С как первого охарактеризованного класса обычно являются полностью стабилизированными, включают в себя последовательность типа В-класса и GCбогатый палиндром или почти палиндром. Этот класс был описан в предварительной заявке США 60/313273, поданной 17 августа 2001 г., US 10/224523, поданной 19 августа 2002 г., содержание которых в полном объеме включено здесь в качестве ссылки. Иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса А были описаны в непредварительной патентной заявке США с регистрационным номером 09/672126 и опубликованной РСТ-заявке PCT/US 00/26527 (WO 01/22990), обе поданы 27 сентября 2000 г. Эти нуклеиновые кислоты характеризуются способностью индуцировать высокие уровни интерферона альфа, при этом минимально воздействуя на активацию В-клеток. Иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса А необязательно содержат гексамерный палиндром GACGTC, AGCGCT или AACGTT, описанные Yamamoto и сотр. (Yamamoto S. et al. J. Immunol 148:4072-6 (1992. Примеры последовательностей иммуностимуляторных нуклеиновых кислот класса А описаны в непредварительной патентной заявке США с регистрационным номером 09/672126 и опубликованной РСТзаявке PCT/US 00/26527 (WO 01/22990), обе поданы 27 сентября 2000 г. Иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса В сильно активируют В-клетки человека,но минимально воздействуют на индукцию интерферона-. Иммуностимуляторные CpG-нуклеиновые кислоты класса А были описаны в патентах США 6194388 В 1 и 6239116 В 1, поданных 27 февраля 2001 г. и 29 мая 2001 г. соответственно.CpG-олигонуклеотиды согласно изобретению являются олигонуклеотидами, которые включают в себя по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид. Олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид, является молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит неметилированную цитозин-гуанин-динуклеотидную последовательность (т.е. CpG-ДНК или ДНК, содержащую 5'-цитозин, за которым следует 3'-гуанин, связанные фосфатной связью) и активирует иммунную систему. Весь CpG-олигонуклеотид может быть неметилированным или части могут быть неметилированными, но, по меньшей мере, С мотива 5'-CG-3' должен быть неметилированным. Термины CpG-олигонуклеотид или CpG-нуклеиновая кислота в данном контексте относятся к иммуностимуляторному CpG-олигонуклеотиду или CpG-нуклеиновой кислоте, если нет другого указания. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает CpG-олигонуклеотид класса В,представленный, по меньшей мере, формулой 5' X1X2CGX3X4 3',где X1, X2, Х 3 и Х 4 являются нуклеотидами. В одном варианте осуществления Х 2 является аденином, гуанином или тимином. В другом варианте осуществления Х 3 является цитозином, аденином или тимином.- 12008777 В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает CpG-олигонуклеотид класса В,представленный, по меньшей мере, формулой 5' N1X1X2CGX3X4N2 3',где X1, X2, Х 3 и Х 4 являются нуклеотидами и N означает любой нуклеотид и N1 и N2 являются последовательностями нуклеиновой кислоты, состоящими приблизительно из 0-25 N, каждая. В одном варианте осуществления Х 1 Х 2 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из GpT, GpG, GpA,АрА, АрТ, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, ТрТ и TpG; и Х 3 Х 4 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, АрТ, TpG, ApG, CpG, ТрС, АрС, СрС, ТрА, АрА и СрА. Предпочтительно Х 1 Х 2 является GpA или GpT, a X3X4 является ТрТ. В других вариантах осуществления X1 или Х 2 оба являются пуринами, а Х 3 или Х 4 оба являются пиримидинами, или Х 1 Х 2 является GpA, а Х 3 и Х 4 оба являются пиримидинами. В другом предпочтительном варианте осуществления Х 1 Х 2 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрА, АрА, АрС, ApG и GpG. Еще в одном варианте осуществления Х 3 Х 4 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, ТрА, TpG, АрА, ApG, GpA и СрА. В другом варианте осуществления Х 1 Х 2 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, TpG, АрТ, GpC, СрС, CpT, TpC, GpT и CpG; Х 3 является нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из А и Т, а Х 4 является нуклеотидом, но при этом, когда Х 1 Х 2 является ТрС, GpT или CpG,тогда Х 3 Х 4 не является ТрС, АрТ или АрС. В другом предпочтительном варианте осуществления CpG-олигонуклеотид имеет последовательность 5' TCN1TX1X2CGX3X4 3' (SEQ ID NO:26). CpG-олигонуклеотиды согласно изобретению в некоторых вариантах осуществления включают в себя Х 1 Х 2, выбранный из группы, состоящей из GpT, GpG,GpA и АрА, а Х 3 Х 4 выбран из группы, состоящей из ТрТ, СрТ и ТрС. Последовательности CpG-нуклеиновых кислот класса В согласно изобретению являются последовательностями, широко описанными выше, а также описанными в опубликованных патентных заявках РСТ: PCT/US 95/01570 и PCT/US 97/19791 и USP 6194388 и USP 6239116 В 1, выданных 27 февраля 2001 г. и 29 мая 2001 г. соответственно. Примеры последовательностей включают в себя, не ограничиваясь ими,последовательности, описанные в этих последних заявках и патентах. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты класса С содержат по меньшей мере два отличающихся мотива и оказывают уникальные и желаемые стимуляторные действия на клетки иммунной системы. Некоторые из этих ODN имеют как традиционную "стимуляторную" CpG-последовательность, так и "GC-богатый" или нейтрализующий В-клетки мотив. Эти нуклеиновые кислоты с комбинированными мотивами оказывают иммуностимуляторные действия, которые можно расположить где-то между эффектами, связанными с традиционными CpG-ODN класса В, которые являются сильными индукторами активации В-клеток и активации дендритных клеток (DC), и эффектами, связанными с позже описанным классом иммуностимуляторных нуклеиновых кислот (CpG-ODN класса А), которые являются сильными индукторами IFN- и активации природных клеток-киллеров (NK), но относительно слабыми индукторами активации В-клеток и DC. Krieg A.M. et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas Z.K. et al. (1996) JImmunol 157:1840-5; Yamamoto S. et al. (1992) J Immunol 148:4072-6. Хотя предпочтительные CpG-ODN класса В часто имеют фосфортиоатные скелеты, а предпочтительные CpG-ODN класса А имеют смешанные или химерные скелеты, иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты с комбинированными мотивами класса С могут иметь или стабилизированные, например, фосфортиоатные, химерные или фосфодиэфирные скелеты, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления они имеют полумягкие скелеты. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты,принадлежащие этому новому классу иммуностимуляторных нуклеиновых кислот с комбинированными мотивами. Домен, стимулирующий В-клетки, определяется формулой 5' X1DCGHX2 3'. D означает нуклеотид, отличный от С. С означает цитозин, G означает гуанин. Н означает нуклеотид, отличный от G.X1 и Х 2 означают любую последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-10 нуклеотидов. X1 может включать в себя CG, и в этом случае предпочтительно, чтобы Т находился непосредственно перед этим CG. В некоторых вариантах осуществления DCG означает TCG. X1 имеет длину предпочтительно 06 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления Х 2 не содержит мотивов поли-G или поли-А. В других вариантах осуществления эта иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет поли-Тпоследовательность на 5'- или на 3'-конце. В данном контексте поли-А или поли-Т будет относиться к отрезку из четырех или более последовательных А или Т, соответственно, например, 5' АААА 3' или 5' ТТТТ 3'. В данном контексте поли-G-конец будет означать отрезок из четырех или более последовательных G, например, 5' GGGG 3', встречающихся на 5'-конце или 3'-конце нуклеиновой кислоты. В данном контексте поли-G-нуклеиновая кислота будет означать нуклеиновую кислоту, имеющую формулу 5'X1X2GGGX3X4 3', где X1, Х 2, Х 3 и Х 4 являются нуклеотидами и предпочтительно по меньшей мере один из Х 3 и Х 4 означает G. Некоторые предпочтительные конструкции стимулирующего В-клетки домена под этой формулой включают в себя TTTTTCG, TCG,TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT.- 13008777 Второй мотив этой нуклеиновой кислоты называют или Р, или N, и он расположен непосредственно со стороны 5' от X1 или непосредственно со стороны 3' от Х 2.CGG и имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. Нейтрализующий В-клетки мотив включает в себя по меньшей мере одну CpG-последовательность, в которой CG предшествует С или за ней следует G(Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12631-12636), или он является CG-содержащей ДНК-последовательностью, в которой С динуклеотида CG является метилированным. В данном контексте CpG означает 5' цитозин (С), за которым следует 3' гуанин (G), и они связаны фосфатной связью. По меньшей мере С динуклеотида 5' CG 3' должен быть неметилированным. Нейтрализующие мотивы являются мотивами, которые имеют некоторую степень иммуностимуляторной способности, когда они присутствуют в противном случае нестимуляторном мотиве, которые, при их присутствии в контексте других иммуностимуляторных мотивов, служат для уменьшения иммуностимуляторного потенциала этих других мотивов. Р является GC-богатой палиндром-содержащей последовательностью с длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов. В данном контексте палиндром и эквивалентно палиндромная последовательность будет относиться к инвертированному повтору, т.е. последовательности, такой как ABCDEE'D'С'В'А', в которой А и А' , В и В' и т.д. являются основаниями, способными образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика. В данном контексте GC-богатый палиндром относится к палиндрому, имеющему состав оснований, по меньшей мере на две трети состоящий из G и С. В некоторых вариантах осуществления GCбогатый домен находится предпочтительно со стороны 3' от "В-клетки стимулирующего домена". В случае GC-богатого палиндрома из 10 оснований, этот палиндром, следовательно, содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае GC-богатого палиндрома из 12 оснований, этот палиндром также содержит по меньшей мере 8 G и С. В случае 14-мерного GC-богатого палиндрома по меньшей мере 10 оснований этого палиндрома являются G и С. В некоторых вариантах этот GC-богатый палиндром готовят исключительно из G и С. В некоторых вариантах осуществления GC-богатый палиндром имеет состав оснований, по меньшей мере на 81% состоящий из G и С. В случае такого GC-богатого палиндрома с длиной 10 оснований этот палиндром следовательно состоит исключительно из G и С. В случае такого GC-богатого палиндрома с длиной 12 оснований предпочтительно, чтобы по меньшей мере десять оснований (83%) этого палиндрома составляли G и С. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления GC-богатый палиндром из 12 оснований приготовлен исключительно из G и С. В случае 14-мерного GC-богатого палиндрома по меньшей мере двенадцать оснований (86%) этого палиндрома являются G и С. В некоторых предпочтительных вариантах этот GC-богатый палиндром из 14 оснований готовят исключительно из G и С. Основания С в GC-богатом палиндроме могут быть неметилированными или метилированными. Обычно этот домен имеет по меньшей мере 3 С и G, более предпочтительно - по 4 каждого из них и наиболее предпочтительно - по 5 или более каждого из них. Количество С и G в этом домене не обязательно должно быть одинаковым. Предпочтительно, чтобы основания С и G в этом домене не были аранжированы таким образом, чтобы они образовывали самокомплементарный дуплекс, или палиндром,такой как CCGCGCGG. Он может прерываться А или Т, но предпочтительно, чтобы самокомплементарность была, по меньшей мере, частично сохранена, как, например, в мотивахCGACGTTCGTCG (SEQ ID NO:27) или CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO:28). Когда комплементарность не сохранена, предпочтительно, чтобы некомплементарными парами оснований были TG. В предпочтительном варианте имеется не более чем 3 последовательных основания, которые не являются частью этого палиндрома, предпочтительно не более чем 2 и наиболее предпочтительно не более чем 1. В некоторых вариантах GC-богатый палиндром включает в себя по меньшей мере один тример CGG, по меньшей мере один тример CCG или по меньшей мере один тетрамер CGCG. В других вариантах осуществленияGC-богатый палиндром не является CCCCCCGGGGGG (SEQ ID NO:29) или GGGGGGCCCCCC (SEQ IDNO:30), CCCCCGGGGG (SEQ ID NO:31) или GGGGGCCCCC (SEQ ID NO:32). По меньшей мере один из G GC-богатого района может быть заменен инозином (I). В некоторых вариантах осуществления Р включает в себя более чем один I. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет одну из следующих формул 5' NX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2N 3', 5' PX1DCGHX2 3', 5' X1DCGHX2P 3', 5'X1DCGHX2PX3 3', 5' X1DCGHPX3 3', 5' DCGHX2PX3 3', 5' TCGHX2PX3 3', 5' DCGHPX3 3' или 5' DCGHP 3'. В других аспектах данного изобретения предложены иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты,которые определяются формулой 5' N1PyGN2P 3'. N1 означает любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. Ру означает пиримидин, G означает гуанин. N3 означает любую последовательность из 0-30 нуклеотидов. Р означает GC-богатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов.N1 и N2 могут содержать более чем 50% пиримидинов и предпочтительно более чем 50% Т. N1 может включать в себя CG, и в этом случае предпочтительно, чтобы Т непосредственно предшествовал CG. В некоторых вариантах осуществления N1PyG является TCG (например, ODN 5376, который имеет 5'N1PyGN2P может включать в себя один или более инозиновых (I) нуклеотидов. Или С, или G в N1 может быть заменен инозином, но CpI является предпочтительным в сравнении с IрС. Для замен инозином, таких как IpG, оптимальная активность может быть достигнута с использованием полумягкого или химерного скелета, где связь между IG или CI является фосфодиэфирной. N1 может включать в себя по меньшей мере один мотив CI, TCI, IG или TIG. В некоторых вариантах осуществления N1PyGN2 является последовательностью, выбранной из группы, состоящей из TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT и TCGTCGT. Некоторые неограничивающие примеры нуклеиновых кислот класса С включают в себя Для облегчения поглощения в клетки иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты, в том числеCpG-содержащие олигонуклеотиды, имеют предпочтительно длину в диапазоне 8-100 оснований. Однако нуклеиновые кислоты любого размера, большего чем 8 нуклеотидов (даже длиной во много т.п.н.),способны индуцировать иммунную реакцию в соответствии с данным изобретением, если присутствует достаточное количество иммуностимуляторных мотивов, так как нуклеиновые кислоты большей длины деградируются до олигонуклеотидов внутри клеток. Предпочтительно длина иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты варьирует в диапазоне 8-100 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют в длину 12-40 нуклеотидов. В более предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют длину 8-30 нуклеотидов. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют длину 8-24 нуклеотида."Палиндромная последовательность" будет означать инвертированный повтор, т.е. последовательность, такую как ABCDEE'D'C'B'A', в которой А и А', В и В', С и С, D и D' и Е и Е' являются основаниями, способными образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика. In vivo такие палиндромные последовательности могут образовывать двухцепочечные структуры. В одном варианте осуществленияCpG-олигонуклеотид содержит палиндромную последовательность. Палиндромная последовательность в этом контексте означает палиндром, в котором CpG является частью этого палиндрома и предпочтительно является центром этого палиндрома. В другом варианте осуществления CpG-олигонуклеотид не содержит палиндрома. CpG олигонуклеотид, который не содержит палиндрома, является CpGолигонуклеотидом, в котором CpG-динуклеотид не является частью палиндрома. Такой олигонуклеотид может включать в себя палиндром, в котором CpG не является центром этого палиндрома. В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды включают в себя иммуностимуляторные мотивы, которые являются "CpG-динуклеотидами". CpGдинуклеотид может быть метилированным или неметилированным. Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой, содержащей по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид, является молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит неметилированную динуклеотидную последовательность цитозин-гуанин (т.е. неметилированный 5'-цитидин, за которым следует 3'-гуанозин, которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему; такой иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой является CpG-нуклеиновая кислота. CpG-нуклеиновые кислоты были описаны в ряде патентов,опубликованных патентных заявках и других публикациях, в том числе патентах США с номерами 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой,содержащей по меньшей мере один метилированный CpG-динуклеотид, является нуклеиновая кислота,которая содержит метилированную динуклеотидную последовательность цитозин-гуанин (т.е. метилированный 5'-цитидин, за которым следует 3'-гуанозин, которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему. В других вариантах осуществления иммуностимуляторные олигонуклеотиды не содержат CpG-динуклеотидов. Олигонуклеотиды, которые не содержат CpG-динуклеотидов, называют не-CpG-олигонуклеотидами, и они имеют не-CpG-иммуностимуляторные мотивы. Таким образом,данное изобретение включает в себя также нуклеиновые кислоты с другими типами иммуностимуляторных мотивов, которые могут быть метилированы или неметилированы. Иммуностимуляторные олигонуклеотиды согласно изобретению могут дополнительно включать в себя любую комбинацию метилиро- 15008777 ванных и неметилированных иммуностимуляторных CpG- и не-CpG-мотивов. Молекулы иммуностимуляторных нуклеиновых кислот могут иметь химерный скелет. Для целей согласно изобретению химерный скелет означает частично стабилизированный скелет, в котором по меньшей мере одна межнуклеотидная связь является фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной и в котором по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь является стабилизированной межнуклеотидной связью, причем эта по меньшей мере одна фосфодиэфирная связь или фосфодиэфироподобная связь и эта по меньшей мере одна стабилизированная связь являются различными. Поскольку сообщалось, что боранофосфонатные связи являются стабилизированными относительно фосфодиэфирных связей, для целей химерного характера скелета, боранофосфонатные связи могут быть классифицированы как фосфодиэфироподобные или как стабилизированные, в зависимости от контекста. Например, химерный скелет в соответствии с данным изобретением мог бы в одном варианте осуществления включать в себя по меньшей мере одну фосфодиэфирную (фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную) связь и по меньшей мере одну боранофосфонатную (стабилизированную) связь. В другом варианте осуществления химерный скелет в соответствии с данным изобретением мог бы включать в себя боранофосфонатные (фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные) и фосфоротиоатные (стабилизированные) связи."Стабилизированная межнуклеотидная связь" будет означать межнуклеотидную связь, которая является относительно устойчивой к деградации in vivo (например, экзо- или эндонуклеазой) в сравнении с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. Предпочтительные стабилизированные межнуклеотидные связи включают в себя, без ограничения, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные и метилфосфортиоатные связи. Другие стабилизированные межнуклеотидные связи включают в себя, без ограничения, пептидные, алкильные, дефосфо- и другие связи, описанные выше. Модифицированные скелеты, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с помощью автоматизированных способов, с использованием или фосфорамидатной, или Н-фосфонатной химии. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США 4469863; а алкилфосфотриэфиры (в которых заряженную кислородную часть алкилируют, как описано в патенте США 5023243 и европейском патенте 092574) могут быть получены путем автоматизированного твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реагентов. Способы получения других модификаций и замен скелетов ДНК были описаны. Uhlmann E. et al. (1990) Chem Rev 90:544; GoodchildJ (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Способы получения химерных олигонуклеотидов также известны. Например, такие способы описаны в патентах, выданных на имя Uhlmann et al. Смешанные ODN с модифицированными скелетами могут быть синтезированы с использованием коммерчески доступного ДНК-синтезатора и стандартной фосфорамидитной химии. (F.E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991 и M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980. После связывания PS-связи вводят путем сульфурирования с использованием реагента Beaucage (R.P. Iyer, W. Egan, J.В. Regan and S.L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990 (0,075 M в ацетонитриле) или фенилацетилдисульфида (PADS) с последующим блокированием уксусным ангидридом, 2,6-лутидином в тетрагидрофуране (1:1:8; об./об./об.) и Nметилимидазолом (16% в тетрагидрофуране). Эту стадию блокирования выполняют после реакции сульфурирования для минимизации образования нежелательных фосфодиэфирных (РО) связей в положениях,в которых должна быть расположена фосфоротиоатная связь. В случае введения фосфодиэфирной связи,например, при CpG-динуклеотиде, промежуточный фосфор-III окисляют путем обработки раствором иода в смеси вода/пиридин. После отщепления от твердого носителя и конечного удаления защитных групп обработкой концентрированным аммиаком (15 ч при 50 С) ODN анализируют при помощи ВЭЖХ на колонке Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) с использованием градиента NaCl (например, буфер А: 10 мМNaH2PO4 в смеси ацетонитрил/вода = 1:4/об./об. рН 6,8; буфер В: 10 мМ NaH2PO4, 1,5 М NaCl в смеси ацетонитрил/вода = 1:4/об./об. 5-60% В в течение 30 мин при 1 мл/мин) или капиллярного гельэлектрофореза. ODN может быть очищен при помощи ВЭЖХ или при помощи FPLC (жидкостной экспресс-хроматографии белков) на колонке Source High Performance (Amersham Pharmacia). ВЭЖХгомогенные фракции объединяют и обессоливают с использованием колонки С 18 или ультрафильтрации.ODN анализировали MALDI-TOF-масс-спектрометрией для подтверждения рассчитанной массы. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут также включать в себя другие модификации. Они включают в себя неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная часть молекулы алкилирована. Было показано, что нуклеиновые кислоты, которые содержат диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, или на одном, или на обоих концах, являются, по существу, резистентными к деградации нуклеазами. В некоторых вариантах осуществления эти олигонуклеотиды могут быть мягкими или полумягкими олигонуклеотидами. Мягким олигонуклеотидом является иммуностимуляторный олигонуклеотид,имеющий частично стабилизированный скелет, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи встречаются только в по меньшей мере одном внутреннем динуклеотиде пиримидин-пурин (YZ) или непосредственно рядом с ним. Предпочтительно YZ представляет собой YG,динуклеотид пиримидин-гуанозин (YG). Этот по меньшей мере один внутренний YZ-динуклеотид сам- 16008777 имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. Фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь, находящаяся непосредственно рядом по меньшей мере с одним внутренним YZ-динуклеотидом, может быть со стороны 5'-, со стороны 3'- или как 5'-, так и 3'относительно по меньшей мере одного внутреннего YZ-динуклеотида. В частности, фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи включают в себя внутренние динуклеотиды. Внутренний динуклеотид обычно будет означать любую пару смежных нуклеотидов, соединенных межнуклеотидной связью, в которой ни один из нуклеотидов не является концевым нуклеотидом, т.е. ни один из нуклеотидов в этой паре не является определяющим 5'- или 3'конец этого олигонуклеотида. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет длину n нуклеотидов, имеет всего n-1 динуклеотидов и только n-3 внутренних динуклеотидов. Каждая межнуклеотидная связь во внутреннем динуклеотиде является внутренней межнуклеотидной связью. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет в длину n нуклеотидов, имеет всего n-1 динуклеотидов и только n-3 внутренних динуклеотидов. Таким образом, стратегически расположенными фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями являются фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи, расположенные между любой парой нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эти фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи не расположены между любой парой нуклеотидов, ближайшей к 5'- или 3'концу. Предпочтительно фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь, встречающаяся непосредственно рядом по меньшей мере с одним внутренним YZ-динуклеотидом, сама является внутренней межнуклеотидной связью. Таким образом, для последовательности N1YZN2, где каждый из N1 и N2 независимо друг от друга являются любым единственным нуклеотидом, этот YZ-динуклеотид имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и, кроме того, (a) N1 и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда N1 является внутренним нуклеотидом, (b) Z и N2 связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда N2 является внутренним нуклеотидом, или (с) N1 и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда N1 является внутренним нуклеотидом, и Z и N2 связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда N2 является внутренним нуклеотидом. Считается, что мягкие олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением являются относительно чувствительными к нуклеазному расщеплению в сравнении с полностью стабилизированными олигонуклеотидами. Не желая связывать себя конкретной теорией или конкретным механизмом, авторы изобретения считают, что мягкие олигонуклеотиды согласно изобретению могут расщепляться до фрагментов с уменьшенной иммуностимуляторной активностью или с отсутствием иммуностимуляторной активности относительно полноразмерных мягких олигонуклеотидов. Считается, что включение по меньшей мере одной чувствительной к нуклеазам межнуклеотидной связи, в частности, вблизи середины этого олигонуклеотида, обеспечивает выключение, которое изменяет фармакокинетику этого олигонуклеотида таким образом, что уменьшается продолжительность максимальной иммуностимуляторной активности этого олигонуклеотида. Это может быть особенно ценным в тканях и в клинических приложениях, в которых желательно избегать повреждения, связанного с хроническим локальным воспалением или хронической локальной иммуностимуляцией, например, в почке. Полумягким олигонуклеотидом является иммуностимуляторный олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированный скелет, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи встречаются только внутри по меньшей мере одного внутреннего пиримидин-пурин (YZ)динуклеотида. Полумягкие олигонуклеотиды обычно обладают увеличенной иммуностимуляторной силой относительно соответствующих полностью стабилизированных иммуностимуляторных олигонуклеотидов. Вследствие более высокой силы полумягких олигонуклеотидов, полумягкие олигонуклеотиды могут использоваться, в некоторых случаях, при более низких эффективных концентрациях и имеют более низкие эффективные дозы, чем обычные полностью стабилизированные олигонуклеотиды, для достижения желаемого биологического действия. Считается, что вышеуказанные свойства полумягких олигонуклеотидов обычно увеличиваются с увеличением дозы внутренних YZ-динуклеотидов, включающих в себя фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи. Таким образом, считается, например, что обычно для конкретной олигонуклеотидной последовательности с пятью внутренними YZ-динуклеотидами олигонуклеотид с пятью внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными YZ-межнуклеотидными связями является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с четырьмя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными YG-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь,является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с тремя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными YZ-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь, является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с двумя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными YZ-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь, является более иммуностиму- 17008777 ляторным, чем олигонуклеотид с одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной YZмежнуклеотидной связью. Важно, что включение даже одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной YZ-межнуклеотидной связи считается более предпочтительным в сравнении с отсутствием фосфоэфирной или фосфодиэфироподобной YZ-межнуклеотидной связи. Кроме количества фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных связей, на силу может влиять также положение вдоль длины нуклеиновой кислоты. Мягкие и полумягкие олигонуклеотиды будут обычно включать в себя, кроме фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных связей, в предпочтительных внутренних положениях 5'- и 3'-концы, которые являются устойчивыми к деградации. Такие устойчивые к деградации концы могут включать в себя любую подходящую модификацию, которая приводит к увеличенной устойчивости против экзонуклеазной деградации в сравнении с соответствующими немодифицированными концами. Например, 5'- и 3'концы могут быть стабилизированными включением в них по меньшей мере одной фосфатной модификации скелета. В предпочтительном варианте осуществления этой по меньшей мере одной фосфатной модификацией скелета на каждом конце является независимо фосфоротиоатная, фосфородитиоатная,метилфосфонатная или метилфосфоротиоатная межнуклеотидная связь. В другом варианте осуществления устойчивый к деградации конец включает в себя одну или несколько нуклеотидных единиц, присоединенных пептидными или амидными связями на 3'-конце. Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь является типом связи, характерным для нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в природе. Как показано на фиг. 20, эта фосфодиэфирная межнуклеотидная связь включает в себя атом фосфора, фланкированный двумя образующими мостиковую связь атомами кислорода и связанный также двумя дополнительными атомами кислорода, одним заряженным и другим незаряженным. Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь является особенно предпочтительной, когда важно уменьшение полупериода существования в ткани этого олигонуклеотида. Фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь является фосфорсодержащей образующая мостик группой, которая является химически и/или диастереомерно сходной с фосфодиэфиром. Критерии сходства с фосфодиэфиром включают в себя чувствительность к нуклеазному расщеплению и способность активировать РНКазу Н. Так, например, фосфодиэфирные, но не фосфоротиоатные олигонуклеотиды являются чувствительными к нуклеазному расщеплению, хотя как фосфодиэфирные, так и фосфоротиоатные олигонуклеотиды активируют РНКазу Н. В предпочтительном варианте осуществления фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является боранофосфатная (или эквивалентно боранофосфонатная) связь. Патент США 5177198; патент США 5859231; патент США 6160109; патент США 6207819; Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. В другом предпочтительном варианте осуществления фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является диастереомерно чистый Rpфосфоротиоат. Считается, что диастереомерно чистый Rp-фосфоротиоат является более чувствительным к нуклеазному расщеплению и лучше активирует РНКазу Н, чем смешанный или диастереомерно чистыйSp-фосфоротиоат. Стереомеры CpG-олигонуклеотидов являются предметом ожидающей одновременного рассмотрения заявки на патент США 09/361575, поданной 27 июля 1999 г. и опубликованной РСТ заявки PCT/US 99/17100 (WO 00/06588). Следует отметить, что для целей согласно изобретению термин фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь специфически исключает фосфородитиоатную и метилфосфонатную межнуклеотидные связи. Как описано выше, мягкие и полумягкие олигонуклеотиды согласно изобретению могут иметь фосфодиэфироподобные связи между С и G. Одним примером фосфодиэфироподобной связи является фосфоротиоатная связь в Rp-конформации. р-Хиральность олигонуклеотида может иметь явно противоположные действия на иммунную активность CpG-олигонуклеотида в зависимости от временной точки,в которой измеряют активность. В ранней временной точке 40 мин Rp-, но не Sp-стереоизомер фосфоротиоатного CpG-олигонуклеотида индуцирует фосфорилирование JNK в клетках селезенки мыши. В противоположность этому, при тестировании в поздней временной точке 44 ч Sp-, но не Rp-стереоизомер является активным в стимуляции пролиферации клеток селезенки. Это различие в кинетике и биоактивности Rp- и Sp-стереоизомеров происходит не из различия в поглощении клеток, а скорее наиболее вероятно обусловлено двумя противоположными биологическими ролями этой р-хиральности. Во-первых,повышенная активность Rp-стереоизомера в сравнении с Sp-стереоизомером в отношении стимуляции иммунных клеток в ранних временных точках указывает на то, что Rp может быть более эффективным во взаимодействии с CpG-рецептором, TLR9, или в индуцировании ниже по ходу путей передачи сигнала. С другой стороны, более быстрая деградация PS-олигонуклеотидов Rp в сравнении с Sp приводит к гораздо более короткой продолжительности передачи сигнала, так что PS-олигонуклеотиды Sp являются,по-видимому, более биологически активными при тестировании в более поздних временных точках. Неожиданно сильное действие достигается р-хиральностью в самом CpG-динуклеотиде. В сравнении со стереорандомизированным CpG-олигонуклеотидом стереоизомер, в котором единственный CpGдинуклеотид был связан в Rp, был слегка более активным, хотя стереоизомер, содержащий Sp-связь, был почти неактивным в отношении индуцирования пролиферации клеток селезенки. Размер (т.е. количество нуклеотидных остатков вдоль длины нуклеиновой кислоты) иммуностимуляторного олигонуклеотида может также способствовать иммуностимуляторной активности этого оли- 18008777 гонуклеотида. Для облегчения поглощения в клетки иммуностимуляторный олигонуклеотид предпочтительно имеет минимальную длину 6 нуклеотидных остатков. Нуклеиновые кислоты любого размера,превышающего 6 нуклеотидов (даже с длиной многих т.п.н.), способны индуцировать иммунную реакцию в соответствии с данным изобретением, если присутствуют достаточные иммуностимуляторные мотивы, так как более длинные нуклеиновые кислоты деградируются внутри клеток. Авторы согласно изобретению считают, что полумягкие олигонуклеотиды, имеющие длину всего лишь 4 нуклеотида, могут также быть иммуностимуляторными, если они могут быть доставлены во внутреннее пространство клетки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 4-100 нуклеотидов. В типичных вариантах осуществления иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 6-40 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 6-19 нуклеотидов. Обычно иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину в диапазоне 4-100 и в некоторых вариантах осуществления 10-40 нуклеотидов. Длина может находиться в диапазоне 16-24 нуклеотида. Термин "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" включает в себя также нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с заменами или модификациями, например, в основаниях и/или сахарах. Например, они включают в себя нуклеиновые кислоты, имеющие скелетные сахара, которые ковалентно присоединены к низкомолекулярным органическим группам, другим, чем гидроксильная группа в положении 2', и другим, чем фосфатная группа или гидроксигруппа в положении 5'. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут включать в себя 2'-O-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать в себя сахара, такие как арабиноза или 2'-фторарабиноза, вместо рибозы. Таким образом, эти нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными в составе скелета, содержащими посредством этого любуювозможную комбинацию полимерных звеньев,связанных вместе, такими как пептид-нуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный скелет с основаниями нуклеиновых кислот). Нуклеиновые кислоты включают в себя также замещенные пурины и пиримидины, такие как модифицированные основания С-5-пропинпиримидин и 7-деаза-7-замещенный пурин. Wagner R.W. et al.(1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Пурины и пиримидины включают в себя, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин, тимин, 5-метилцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-фторцитозин, 2-аминопурин, 2 амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие природно встречающиеся или не встречающиеся природно нуклеооснования, замещенные и незамещенные ароматические части молекулы. Другие подобные модификации хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. Иммуностимуляторные олигонуклеотиды согласно изобретению могут включать в себя различные химические модификации и замены, в сравнении с природными РНК и ДНК, в том числе фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика, -D-рибозной единицы и/или природного нуклеотидного основания(аденина, гуанина, цитозина, тимина, урацила). Примеры химических модификаций известны специалисту с квалификацией в данной области и описаны, например, в Uhlmann E. et al. (1990) Chem Rev 90:543;"Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and PropertiesSynthesis and Analytical Techniques,S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke S.T. et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; и Hunziker J. et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Олигонуклеотид согласно изобретению может иметь одну или несколько модификаций, причем каждая модификация расположена в конкретном фосфодиэфирном межнуклеотидном мостике и/или в конкретной -D-рибозной единице и/или в конкретном положении природного нуклеотидного основания в сравнении с олигонуклеотидом той же самой последовательности, которая состоит из природных ДНК или РНК. Например, данное изобретение относится к олигонуклеотиду, который может содержать одну или несколько модификаций, причем каждая модификация независимо выбрана изa) замены фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика, локализованного при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида, модифицированным межнуклеотидным мостиком,b) замены фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика, локализованного при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида, дефосфо-мостиком,c) замены сахар-фосфатной единицы из сахар-фосфатного скелета другой единицей,d) замены -D-рибозной единицы модифицированной сахарной единицей иe) замены природного нуклеотидного основания модифицированным нуклеотидным основанием. Более подробные примеры химической модификации олигонуклеотида являются следующими. Фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, расположенный при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида,может быть заменен модифицированным межнуклеотидным мостиком, причем этот модифицированный межнуклеотидный мостик выбран, например, из фосфоротиоатного, фосфородитиоатного, NR1R2 фосфорамидатного, боранофосфатного, -гидроксибензилфосфонатного, фосфат-(С 1-С 21)-О-алкилэфирного, фосфат-[(С 6-С 12)арил-(С 1-С 21)-О-алкил]эфирного, (C1-C8)алкилфосфонатного и/или (С 6-С 12)арилфосфонатного мостиков, (С 7-С 12)гидроксиметиларила (например, описанного в WO 95/01363), где (C6C12)арил, (С 6-С 20)арил и (С 6-С 14)арил необязательно замещены галогеном, алкилом, алкокси, нитро, циа- 19008777 но, и где R1 и R2 означают независимо друг от друга водород, (C1-C18)алкил, (С 6-С 20)арил, (С 6-С 14)арил(C1-C8)алкил, предпочтительно водород, (C1-C8)алкил, предпочтительно (С 1-С 4)алкил и/или метоксиэтил,или R1 и R2 образуют вместе с атомом азота, несущим их, 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое может дополнительно содержать дополнительный гетероатом из группы О, S и N. Может быть произведена замена фосфодиэфирного мостика, расположенного при 3'- и/или при 5'конце нуклеотида, дефосфо-мостиком (дефосфо-мостики описаны, например, в Uhlmann E. and PeymanA. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed,Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff), где дефосфо-мостик выбран, например, из дефосфомостиков формацеталя, 3'-тиоформацеталя, метилгидроксиламина, оксима, метилендиметилгидразо, диметиленсульфона и/или силильных групп. Сахар-фосфатная единица (т.е. -D-рибоза и фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, образующие вместе сахар-фосфатную единицу) из сахар-фосфатного скелета (т.е. сахар-фосфатного скелета,состоящего из сахар-фосфатных единиц) может быть заменена другой единицей, причем эта другая единица является, например, подходящей для образования морфолинопроизводного олигомера (описанного, например, в Stirchak E.P. et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), т.е., например, заменой единицей морфолинопроизводного; или образования полиамидной нуклеиновой кислоты (ПНК; как описано, например, в Nielsen Р.Е. et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), т.е., например, заменой ПИК-скелетной единицей, например, 2-аминоэтилглицином.-Рибозная единица или -D-дезоксирибозная единица может быть заменена модифицированной сахарной единицей, причем эта модифицированная сахарная единица выбрана, например, из -D-рибозы,-D-2'-дезоксирибозы, L-2'-дезоксирибозы, 2'-F-2'-дезоксирибозы, 2'-F-арабинозы, 2'-О-(C1-С 6)алкилрибозы, предпочтительно 2'-О-(C1-С 6)алкилрибозой является 2'-O-метилрибоза, 2'-О-(С 2-С 6)алкенилрибозы, 2'-[О-(C1-С 6)алкил-О-(C1-С 6)алкил]рибозы, 2'-NH2-2'-дезоксирибозы, -D-ксилофуранозы, арабинофуранозы, 2,4-дидезоксиD-эритрогексопиранозы и карбоциклических (описанных, например,в Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) и/или имеющих открытую цепь аналогов сахаров (описанных,например, в Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) и/или аналогов бициклосахаров (описанных, например, в Tarkov M. et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этот сахар является 2'-О-метилрибозой, в частности, для одного или обоих нуклеотидов, связанных фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью. Нуклеиновые кислоты включают в себя также замещенные пурины и пиримидины, такие как модифицированные основания С-5-пропинпиримидин и 7-деаза-7-замещенный пурин. Wagner R.W. et al.(1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Пурины и пиримидины включают в себя, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин и тимин и другие природно встречающиеся или не встречающиеся природно нуклеооснования, замещенные и незамещенные ароматические части молекулы. Модифицированным основанием является любое основание, которое является химически отличающимся от природно встречающихся оснований, обычно обнаруживаемых в ДНК и РНК, таких как Т,С, G, А и U, но имеет общие основные химические структуры с этими природно встречающимися основаниями. Модифицированное нуклеотидное основание может быть, например, выбрано из гипоксантина,урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(C1-С 6)алкилурацила, 5-(С 2-С 6)алкенилурацила, 5-(С 2-С 6)алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5 хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(C1-С 6)алкилцитозина, 5-(С 2-С 6) алкенилцитозина, 5-(С 2-С 6)алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, N2 диметилгуанина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7 деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина, 5-гидроксиметилцитозина, N4-алкилцитозина, например, N4-этилцитозина, 5-гидроксидезоксицитидина, 5-гидроксиметилдезоксицитидина,N4-алкилдезоксицитидина, например, N4-этилдезоксицитидина, 6-тиодезоксигуанозина, и дезоксирибонуклеотидов нитропиррола, С 5-пропинилпиримидина и диаминопурина, например, 2,6-диаминопурина,инозина, 5-метилцитозина, 2-аминопурина, 2-амино-6-хлорпурина, гипоксантина или других модификаций природных нуклеотидных оснований. Имеется в виду, что этот список является примерным и не должен интерпретироваться как ограничивающий. В конкретных описанных здесь формулах определен набор модифицированных оснований. Например, буква Y используется для нуклеотида, содержащего цитозин или модифицированный цитозин. Модифицированный цитозин в данном контексте означает природно встречающийся или не встречающийся природно аналог пиримидинового основания цитозина, который может заменять это основание без нарушения иммуностимуляторной активности олигонуклеотида. Модифицированные цитозины включают в себя, но не ограничиваются ими, 5-замещенные цитозины (например, 5-метилцитозин, 5-фторцитозин,5-хлорцитозин, 5-бромцитозин, 5-иодцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 5 дифторметилцитозин и незамещенный или замещенный 5-алкинилцитозин), 6-замещенные цитозины,N4-замещенные цитозины (например, N4-этилцитозин), 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, изоцитозин,псевдоизоцитозин, аналоги цитозина с конденсированными кольцевыми системами (например, N,N'- 20008777 пропиленцитозин или феноксазин) и урацил и его производные (например, 5-фторурацил, 5-бромурацил,5-бромвинилурацил, 4-тиоурацил, 5-гидроксиурацил, 5-пропинилурацил). Некоторые предпочтительные цитозины включают в себя 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин и N4-этилцитозин. В другом варианте осуществления согласно изобретению цитозиновое основание заменено универсальным основанием (например, 3-нитропирролом, Р-основанием), ароматической кольцевой системой (например, фторбензолом или дифторбензолом) или атомом водорода (dспейсер). Буква Z используется для означения гуанина или модифицированного гуанинового основания. Модифицированный гуанин в данном контексте означает природно встречающийся или не встречающийся природно аналог пуринового основания гуанина, который может заменять это основание без нарушения иммуностимуляторной активности олигонуклеотида. Модифицированные гуанины включают в себя, но не ограничиваются ими, 7-деазагуанин, 7-деаза 7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С 2-С 6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенный гуанин, гипоксантин, N2-замещенные гуанины (например, N2-метилгуанин), 5-амино-3-метил-3 Н,6 Н-тиазоло[4,5d]пиримидин-2,7-дион, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, индол, аденин, замещенные аденины(например, N6-метиладенин, 8-оксоаденин), 8-замещенный гуанин (например, 8-гидроксигуанин и 8 бромгуанин) и 6-тиогуанин. В другом варианте осуществления согласно изобретению гуаниновое основание замещено универсальным основанием (например, 4-метилиндолом, 5-нитроиндолом и Коснованием), ароматической кольцевой системой (например, бензимидазолом или дихлорбензимидазолом, амидом 1-метил-1 Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты) или атомом водорода (d-спейсер). Эти олигонуклеотиды могут иметь один или более доступных 5'-концов. Могут быть созданы модифицированные олигонуклеотиды, имеющие два таких 5'-конца. Это может быть достигнуто, например,соединением двух олигонуклеотидов через связь 3'-3' для образования олигонуклеотида, имеющего один или два доступных 5'-конца. Связь 3'-3' может быть фосфодиэфирным, фосфоротиоатным или любым другим межнуклеотидным мостиком. Способы образования таких связей известны в данной области. Например, такие связи описаны в Seliger, H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, NucleotidesNucleotides (1991),10(1-3), 469-77 и Jiang et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, BioorganicMedicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735. Кроме того, 3'3'-связанные нуклеиновые кислоты, в которых связь между 3'-концевыми нуклеотидами не является фосфодиэфирным, фосфоротиоатным или другим модифицированным мостиком, могут быть получены с использованием дополнительного спейсера, такого как три- или тетраэтиленгликольфосфатная часть молекулы (Durand, M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA) 12 and two (dT) 12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38),9197-204, патент США 565738 и патент США 5668265). Альтернативно, этот ненуклеотидный линкер может быть произведен из этандиола, пропандиола или из неосновной дезоксирибозной (d-спейсер) единицы (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidicmoieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) с использованием стандартной фосфорамидитной химии. Эти ненуклеотидные линкеры могут быть включены один раз или множество раз или комбинированы друг с другом, что делает возможным получение любого желаемого расстояния между 3'-концами этих двух ODN. Для использования в данном изобретении олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы de novo с использованием любого ряда процедур, хорошо известных в данной области. Например, может быть использован b-цианоэтилфосфорамидитный способ (Beaucage, S.L., and Caruthers,M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); нуклеотид-Н-фосфонатный способ (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054,1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffneyet al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Эти химические способы могут выполняться с использованием различных автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, доступных на рынке. Эти олигонуклеотиды называют синтетическими олигонуклеотидами. Выделенным олигонуклеотидом обычно называют олигонуклеотид, который был отделен от компонентов, с которыми он обычно связан в природе. В качестве примера, выделенным олигонуклеотидом может быть олигонуклеотид, который выделен из клетки,из ядра, из митохондрий или из хроматина. Эти олигонуклеотиды являются частично устойчивыми к деградации (например, являются стабилизированными)."Стабилизированная молекула олигонуклеотида" должна означать олигонуклеотид, который является относительно устойчивым к деградации in vitro (например, экзо- или эндонуклеазой). Стабилизация нуклеиновых кислот может быть выполнена посредством модификации скелета. Олигонуклеотиды,имеющие фосфоротиоатные связи, обеспечивают максимальную активность и защищают этот олигонуклеотид от деградации внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами. Другие модифицированные олигонуклеотиды включают в себя фосфодиэфир-модифицированные нуклеиновые кислоты, комбинации фосфодиэфирной и фосфоротиоатной нуклеиновой кислоты, метилфосфонатные, метилфосфоротиоатные,фосфородитиоатные, п-этоксинуклеиновые кислоты и их комбинации.- 21008777 Модифицированные скелеты, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с использованием автоматизированных способов, использующих либо фосфорамидатную, либо Н-фосфонатную химию. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США 4469863,и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженную кислородную часть молекулы алкилируют, как описано в патенте США 5023243 и европейском патенте 092574) могут быть получены автоматизированным твердофазным синтезом с использованием коммерчески доступных реагентов. Способы получения других модификаций и замен скелета ДНК были описаны (например, Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem.Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990). Другие стабилизированные олигонуклеотиды включают в себя неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная часть молекулы алкилирована. Было показано также, что нуклеиновые кислоты, которые содержат диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, или на одном, или на обоих концах, являются, по существу, резистентными к деградации нуклеазами. Иммуностимуляторные олигонуклеотиды могут также содержать одну или более необычных связей между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов в молекуле. Обычной межнуклеотидной связью является связь 3'5'. Все другие связи рассматриваются как необычные межнуклеотидные связи, такие как 2'5'-,5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, 2'3'-связи. Вследствие этого, номенклатура 2'-5' выбрана в соответствии с атомом углерода рибозы. Однако, если используются необычные сахарные части молекулы, такие как расширенные кольцом сахарные аналоги (например, гексаноза, циклогексен или пираноза) или би- или трициклические сахарные аналоги, то эта номенклатура изменяется в соответствии с номенклатурой мономера. В случае аналогов 3'-дезоксиD-рибопиранозы (также называемой п-ДНК) эти мононуклеотиды связаны, например, через 4'2'-связь. Если нуклеотид содержит одну 3'3'-связь, то этот аналог олигонуклеотида будет иметь два несвязанных 5'-конца. Подобным образом, если нуклеотид содержит одну 5'5'-связь, то этот олигонуклеотид будет иметь два несвязанных 3'-конца. Доступность несвязанных концов нуклеотидов может быть более доступной для их рецепторов. Оба типа необычных связей (3'3'- и 5'5'-связи) описаны Ramalho Ortigao etal. (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46), где сообщалось, что олигонуклеотиды, имеющие 3'3'-связь, обнаруживали повышенную стабильность к расщеплению нуклеазами. Различные типы связей могут быть также объединены в одной молекуле, что может приводить к разветвлению этого олигомера. Если одна часть этого олигонуклеотида присоединена при 3'-конце через 3'3'-связь ко второй части олигонуклеотида и на 2'-конце через 2'3'-связь к третьей части олигонуклеотида этой молекулы, это приводит к разветвленному олигонуклеотиду с тремя 5'-концами (3'3'-, 2'3'разветвленному). В принципе, связи между различными частями олигонуклеотида или между различными олигонуклеотидами соответственно, могут иметь место через все части этой молекулы, пока это не влияет отрицательно на узнавание ее рецептором. Согласно природе нуклеиновой кислоты, эта связь может включать в себя сахарную часть (Su), гетероциклическое нуклеооснование (Ва) или фосфатный скелет (Ph). Таким образом, возможными являются связи типа Su-Su, Su-Ph, Su-Ba, Ba-Ba, Ba-Su, Ba-Ph, Ph-Ph, Ph-Su и PhBa. Если эти олигонуклеотиды дополнительно модифицированы определенными ненуклеотидными заместителями, эта связь может также происходить через модифицированные части этих олигонуклеотидов. Эти модификации включают в себя также модифицированные нуклеиновые кислоты, например,ПНК, ЛНК или морфолино-олигонуклеотидные аналоги. Эти связи предпочтительно состоят из С, Н, N, О, S, В, Р и галогена и содержат 3-300 атомов. Примером с 3 атомами является ацетальная связь (ODN1-3'-O-СН 2-O-3'-ODN2; Froehler and Matteucci), соединяющая, например, 3'-гидроксигруппу одного нуклеотида с 3'-гидроксигруппой второго олигонуклеотида. Примером с приблизительно 300 атомами является ПЭГ-40 (тетраконтаполиэтиленгликоль). Предпочтительными связями являются фосфодиэфирная, фосфоротиоатная, метилфосфонатная, фосфорамидатная, боранофосфонатная, амидная, простая эфирная, тиоэфирная, ацетальная, тиоацетальная, карбамидная, тиокарбамидная, сульфонамидная, состоящая из основания Шиффа, и дисульфидная связи. Другой возможностью является использование системы биоконъюгации Solulink (www.trilinkbiotech.com). Если этот олигонуклеотид состоит из двух или более частей последовательности, эти части могут быть одинаковыми или различными. Так, в олигонуклеотиде с 3'3'-связью эти последовательности могут быть идентичными 5'-ODN1-3'3'-ODN1-5' или различными 5'-ODN1-3'3'-ODN2-5'. Кроме того, химическая модификация различных частей олигонуклеотида, а также соединяющий их линкер могут быть различными. Поскольку поглощение коротких олигонуклеотидов является, по-видимому, менее эффективным, чем поглощение длинных олигонуклеотидов, связывание двух или нескольких коротких последовательностей приводит к улучшенной иммунной стимуляции. Длина коротких олигонуклеотидов равна приблизительно 2-20 нуклеотидам, более предпочтительно 3-16 нуклеотидам, но наиболее предпочтительно 5-10 нуклеотидам. Предпочтительными являются связанные олигонуклеотиды, которые имеют два или более несвязанных 5'-концов. Олигонуклеотидные частичные последовательности могут быть также связаны ненуклеотидными- 22008777 линкерами, в частности, неосновными линкерами (d-спейсеры), единицами триэтиленгликоля или единицами гексаэтиленгликоля. Дополнительными предпочтительными линкерами являются алкиламинолинкеры, такие как С 3-, С 6-, С 12-аминолинкеры, а также аликлтиоловые линкеры, такие как С 3- или С 6 тиоловые линкеры. Эти олигонуклеотиды могут быть также связаны ароматическими остатками, которые могут быть дополнительно замещены алкильными или замещенными алкильными группами. Эти олигонуклеотиды могут также содержать удвоенную или утроенную единицу (www.glenres.com.), в частности, эти олигонуклеотиды с 3'3'-связью. Разветвление этих олигонуклеотидов множественными удвоенными, утроенными или другими умноженными единицами приводит к дендримерам, которые являются следующим вариантом осуществления согласно изобретению. Эти олигонуклеотиды могут также содержать линкерные единицы, происходящие из пептидмодифицирующих реагентов или олигонуклеотидмодифицирующих реагентов (www.glenres.com.). Кроме того, они могут содержать один или несколько природных или неприродных аминокислотных остатков, которые соединены пептидными(амидными) связями. Другой возможностью связывания олигонуклеотидов является связывание; посредством сшивания гетероциклических оснований (Verma and Eckstein; Annu. Rev. Biochem. (1998) 67:99-134; page 124). Еще одной возможностью является связь между сахарной частью одной части последовательности и гетероциклическим основанием другой части последовательности (Iyer et al., Curr. Opin. Mol. Therapeutics(1999) 1: 344-358; page 352). Различные олигонуклеотиды синтезируют установленными способами, и они могут быть связаны вместе одновременно во время твердофазного синтеза. Альтернативно, они могут быть связаны вместе после синтеза отдельных частичных последовательностей. Субъект будет означать человека или позвоночное животное, в том числе, но не только, собаку,кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, курицу, примата, не являющегося человеком (например,обезьяну), рыбу (виды аквикультуры, например, лосося), кролика, крысу и мышь. Субъект, имеющий вирусную инфекцию является субъектом, который был подвергнут действию вируса и имеет острое или хроническое проявление или детектируемые уровни вируса в его теле. В предпочтительных вариантах осуществления согласно изобретению этим субъектом является субъект,имеющий хроническую вирусную инфекцию, более предпочтительно хроническую инфекцию гепатита С. В важных аспектах согласно изобретению этим субъектом является субъект, который является не отвечающим на предыдущую терапию инфекции гепатита С. Например, не отвечающий субъект (нереспондер) включает в себя субъекта, который ранее лечился по поводу инфекции гепатита С, например,IFN- (например, интроном А), но такое лечение не было успешным, как описано здесь. Данное изобретение предполагает лечение субъектов, которые являются не отвечающими (не-респондерами) на прежнюю терапию, и в некоторых случаях идентификацию субъектов, которые могли бы быть не отвечающими, для сортировки эффективного лечения. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть эффективными у любого позвоночного животного. Различные иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут вызывать оптимальную иммунную стимуляцию в зависимости от вида млекопитающего. Так, иммуностимуляторная нуклеиновая кислота, вызывающая оптимальную стимуляцию или ингибирование у людей, может не вызывать оптимальную стимуляцию или ингибирование у мыши, и vice versa. Специалист с квалификацией в данной области сможет идентифицировать большинство подходящих иммуностимуляторных нуклеиновых кислот, применимых для конкретного представляющего интерес вида млекопитающего с использованием рутинных анализов, описанных здесь и/или известных в данной области, с использованием представленного здесь руководства. Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота может непосредственно вводиться субъекту или может вводиться вместе с комплексом доставки нуклеиновых кислот. Комплекс доставки нуклеиновых кислот означает молекулу нуклеиновой кислоты, связанную (например, ионно связанную или ковалентно связанную или инкапсулированную внутри) с нацеливающим средством (например, молекулой, которая приводит к высокоаффинному связыванию с клеткой-мишенью (например, pDC или В-клетками), и/или увеличивает клеточное поглощение клетками-мишенями. Примеры комплексов доставки нуклеиновых кислот включают в себя нуклеиновые кислоты, связанные со стерином (например, холестерином), липидом (например, катионным липидом, виросомой или липосомой), или агентом специфического связывания клетки-мишени (например, лигандом, узнаваемым специфическим рецептором клетки-мишени). Предпочтительные комплексы могут быть достаточно стабильными in vivo для предотвращения значимого отсоединения до интернализации клеткой-мишенью. Однако этот комплекс может быть расщеплен при подходящих условиях в клетке, так что нуклеиновая кислота высвобождается в функциональной форме. Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота или другие терапевтические вещества могут вводиться отдельно (например, в солевом растворе или буфере) или с использованием любых носителей доставки,известных в данной области. Например, были описаны следующие носители доставки: кохлеаты; эмульсомы; ISCOM; липосомы; живые бактериальные векторы (например, Salmonella, Escherichia coli, BacillusCalmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus); живые вирусные векторы (например, Vaccinia, аденовирус,- 23008777 неrpes Simplex); микросферы; вакцины нуклеиновых кислот; полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан); полимерные кольца; протеосомы; фторид натрия; трансгенные растения; виросомы; вирус-подобные частицы. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что могут быть также использованы также другие носители доставки, которые известны в данной области. В соединении с обеспеченными здесь объяснениями, посредством выбора среди различных активных соединений и взвешивания факторов, таких как сила, относительная биодоступность, масса тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, может быть спланирована эффективная схема терапевтического лечения, которая не вызовет существенной токсичности, но все еще будет полностью эффективной для лечения конкретного субъекта, как описано выше. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание или состояние, конкретная вводимая иммуностимуляторная нуклеиновая кислота (например, иммуностимуляторная CpG-нуклеиновая кислота класса С, количество неметилированных CpG-мотивов или их местоположение в этой нуклеиновой кислоте,степень хиральности относительно олигонуклеотида и т.д.), от того, вводится ли также антиген, и от природы такого антигена, размера субъекта или тяжести заболевания или состояния. Специалист с обычной квалификацией в данной области сможет эмпирически определить эффективное количество конкретных иммуностимуляторных нуклеиновых кислот и/или другого терапевтического агента без необходимости чрезмерного экспериментирования. Для взрослых субъектов дозы соединений иммуностимуляторных нуклеиновых кислот, описанных выше, обычно находятся в диапазоне 50 мкг на дозу - 20 мг на дозу, более часто приблизительно 80 мкг на дозу - 8 мг на дозу и наиболее обычно приблизительно 800 мкг на дозу - 4 мг на дозу. Установленные в зависимости от массы тела субъекта типичные дозы находятся в диапазоне приблизительно 0,5-500 мкг/кг на дозу, более обычно приблизительно 1-100 мкг/кг на дозу и наиболее обычно приблизительно 10-50 мкг/кг на дозу. Дозы будут зависеть от факторов, включающих в себя способ введения, например,пероральное введение может требовать существенно большей дозы, чем подкожное введение. Формы согласно изобретению вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые могут рутинным образом содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферящих агентов,консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут предоставляться вместе с другими агентами,известными в данной области как применимые в лечении вирусных инфекций. Особенно важной является комбинация иммуностимуляторных нуклеиновых кислот с антивирусными агентами, такими как IFN, как показано в разделе Примеры, для обеспечения синергической реакции. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве замены рибавирина, который в настоящее время вводят вместе с IFN-. Примеры таких других агентов, используемых в настоящее время или находящихся в испытании для применения в комбинации с IFN-, включают в себя амантадин и цитокины,в том числе IL-2, IL-10, IL-12 и IFN-. Антивирусные агенты являются соединениями, которые предотвращают инфекцию клеток вирусами или репликацию вируса в клетке. Имеется гораздо меньше антивирусных лекарственных средств, чем антибактериальных лекарственных средств, так как процесс вирусной репликации настолько тесно связан с репликацией ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические антивирусные агенты часто являются токсичными для хозяина. Имеются несколько стадий в процессе вирусной инфекции, которые могут быть блокированы или ингибированы антивирусными агентами. Эти стадии включают в себя присоединение вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулином или связывающими пептидами), удаление оболочки вируса (например, амантадином), синтез или трансляцию вирусной мРНК, включающие в себя инициацию трансляции (например, интерфероном, антисмысловой нуклеиновой кислотой и рибозимом), вирусные ферменты (например, неструктурными сериновыми протеазами, РНК-полимеразами, обратными транскриптазами и геликазами), репликацию вирусной РНК или ДНК (например, аналогами нуклеозидов), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторами протеаз, такими как ингибитор сериновой протеазы BILN2061ZW из Boehringer Ingelheim, антиоксидантами, такими как Livfit (USP 6136316) и отделение и высвобождение вируса. Другие антивирусные агенты описаны в USP 6130326 и 6440985 и опубликованной патентной заявке США 2002/0095033. Аналоги рибавирина являются также антивирусными агентами, включенными в данное изобретение. Аналоги нуклеотидов являются синтетическими соединениями, которые являются сходными с нуклеотидами, но которые имеют неполную или отклоняющуюся от нормы дезоксирибозную или рибозную группу. Когда аналоги нуклеотидов находятся в клетке, они фосфорилируются с образованием трифосфата, который конкурирует с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. Как только эта трифосфатная форма аналога нуклеотида включается в растущую цепь нуклеиновой кислоты,она вызывает необратимую ассоциацию с вирусной полимеразой и, следовательно, терминацию цепи. Иммуноглобулиновую терапию обычно используют для предупреждения вирусной инфекции, но она может быть также использована для уменьшения уровней циркулирующего вируса и предотвраще- 24008777 ния инфицирования новообразованных клеток. Иммуноглобулиновая терапия для вирусных инфекций отличается от иммуноглобулиновой терапии в случае бактериальных инфекций, так как иммуноглобулиновая терапия действует посредством связывания с внеклеточными вирионами и предотвращения присоединения этих вирионов к клеткам и вхождения их в клетки, которые являются чувствительными к вирусной инфекции, а не посредством антигенспецифического действия. Эта терапия применима для уменьшения виремии (наличия вируса в крови) в течение периода времени, когда антитела присутствуют в хозяине. Обычно имеются два типа иммуноглобулиновых терапий, нормальная иммуноглобулиновая терапия и гипериммуноглобулиновая терапия. Нормальная иммуноглобулиновая терапия использует продукт антител, который получают из сыворотки нормальных доноров крови и объединяют. Этот объединенный продукт содержит низкие титры антитела к широкому диапазону вирусов человека, таких как вирус гепатита А, парвовирус, энтеровирус (в частности, у новорожденных). Для использования нормальной иммуноглобулиновой терапии для HCV эта сыворотка должна быть получена от людей, которые были ранее инфицированы HCV и которые успешно вывели эту инфекцию, либо спонтанно, либо с использованием какой-либо формы терапии. Гипериммуноглобулиновая терапия использует антитела, которые получают из сыворотки индивидуумов, которые имеют высокие титры антитела к конкретному вирусу. Затем эти антитела используют против специфического вируса. Для HCV гипериммуноглобулины могут быть получены вакцинацией добровольцев рекомбинантными белками HCV для получения иммуноглобулина гепатита С. Другие антивирусные агенты, подходящие для использования в способах согласно изобретению,изготавливают Triangle Pharmaceuticals, Inc., Gilead, ICN, Procter and Gamble и ViroPharma Incorporated. Для применения в терапии эффективное количество иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты может вводиться субъекту любым способом, который доставляет эти иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты в желаемый участок, например, через слизистую оболочку, системно. Введение фармацевтической композиции согласно изобретению может быть выполнено любым способом, известным специалисту с квалификацией в данной области. Предпочтительные способы введения включают в себя,но не ограничиваются ими, пероральный, парентеральный способы, способ введения в повреждение, местный, трансдермальный, внутримышечный, интраназальный, интратрахеальный, ингаляционный, глазной, вагинальный и ректальный способы. Для перорального введения эти соединения (т.е. иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты или другие терапевтические агенты) могут быть легко приготовлены объединением с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют приготовить соединения согласно изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов,взвесей, суспензий и т.п. для приема через рот подлежащим лечению субъектом. Фармацевтические композиции для перорального применения могут быть получены в виде твердого эксципиента с необязательным измельчением полученной смеси и обработкой этой смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящими эксципиентами являются, например, наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза,гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, и/или поливинилпирролидон (ПВП). Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия. Необязательно, эти пероральные формы могут быть также приготовлены в солевом растворе или буферах для нейтрализации внутренних кислых условий или могут быть приготовлены без каких-либо носителей. Сердцевины драже обеспечивают подходящим покрытием. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаров, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К покрытиям для таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для облегчения идентификации или для характеристики различных комбинаций доз активного соединения. Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают в себя "пушфит"-капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, герметизированные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. "Пуш-фит"-капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающими агентами, такими как крахмалы, и смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут добавляться стабилизаторы. Могут быть использованы микросферы, приготовленные для перорального введения. Такие микросферы были хорошо описаны в данной области. Все формы для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения. Для буккального введения эти композиции могут иметь форму таблеток или пастилок, приготовленных общепринятым образом.- 25008777 Для введения путем ингаляции соединения для использования в соответствии с данным изобретением могут быть удобным образом представлены в виде аэрозольного спрея из находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единичная доза может быть обеспечена с помощью клапана для доставки дозированного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть приготовлены таким образом, чтобы они содержали порошкообразную смесь рассматриваемого соединения и подходящей поршкообразной основы, такой как лактоза или крахмал. Эти соединения, при необходимости системной доставки, могут быть приготовлены для парентерального введения путем инъекции, например болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Формы для инъекции могут быть приготовлены в унифицированной дозированной форме, например в ампулах или многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Эти композиции могут быть представлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных и водных носителях и могут содержать агенты для приготовления лекарственных средств, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Фармацевтические формы для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно эта суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость этих соединений, что позволяет приготовлять высококонцентрированные растворы. Альтернативно, активные соединения могут быть в порошкообразной форме для восстановления с подходящим носителем, например, апирогенной водой, перед использованием. Эти соединения могут быть также приготовлены в виде ректальных или вагинальных композиций,таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие общепринятые основы для суппозиториев, такие как какао-масло или другие глицериды. Кроме описанных ранее форм, эти соединения могут быть также приготовлены в виде депопрепарата. Такие длительно действующие формы могут быть приготовлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или слаборастворимыми производными, например, в виде слаборастворимой соли. Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердофазные или гелеобразные носители или эксципиенты. Примеры таких носителей или эксципиентов включают в себя, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли. Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтических препаратов являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, инкохлеатированные, нанесенные на микроскопические частицы золота частицы, содержащиеся в липосомах, распыленные частицы, аэрозоли, шарики для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете для соскребания в кожу. Эти фармацевтические композиции включают в себя также гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытием, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных соединений, в приготовлении которых эксципиенты и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как дезинтеграторы, связывающие агенты, агенты покрытий, агенты, вызывающие набухание, смазывающие вещества, ароматизаторы, подслащивающие вещества или солюбилизаторы используют общепринятым образом, как описано выше. Эти фармацевтические композиции являются подходящими для использования в разнообразных системах доставки лекарственных средств. В отношении краткого обзора способов доставки лекарственных средств см. статьюLanger Science 249:1527 (1990), включенную здесь в качестве ссылки. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут вводиться per se (сами по себе) или в форме фармацевтически приемлемой соли. При использовании в медицине эти соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но также и неприемлемые фармацевтически соли могут быть удобным образом использованы для получения фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают в себя, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих кислот: хлористо-водородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфоновой,винной, лимонной, метансульфоновой, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфоновой и бензолсульфоновой. Такие соли могут быть также приготовлены в виде солей щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция карбоновых кислот. Подходящие буферящие агенты включают в себя уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об.); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об.); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об.) и фосфорную кислоту и- 26008777 соль (0,8-2% мас./об.). Подходящие консерванты включают в себя хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимерозал (0,004-0,02% мас./об.). Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтически приемлемый носитель означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или одно или несколько инкапсулирующих веществ,которые являются пригодными для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин носитель означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Эти компоненты фармацевтических композиций способны также смешиваться с соединениями согласно изобретению и друг с другом таким образом, что не происходит взаимодействие, которое могло бы существенно нарушить желаемую фармацевтическую эффективность. Различные способы введения являются доступными. Конкретный выбранный способ будет, конечно, зависеть от конкретных адъювантов или выбранного антигена, конкретного подлежащего лечению состояния и дозы, требуемой для терапевтической эффективности. Вообще говоря, способы согласно изобретению могут быть применены на практике с использованием любого способа введения, который является приемлемым в медицине, если иметь в виду любой способ, который дает эффективные уровни иммунной реакции без вызывания клинически неприемлемых побочных эффектов. Предпочтительные способы введения обсуждены выше. Эти композиции могут быть удобным образом представлены в виде унифицированной дозированной формы и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Все способы включают в себя стадию приведения этих соединений в контакт с носителем, который состоит из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Обычно эти композиции готовят однородным и основательным приведением этих соединений в контакт с жидким носителем, мелкоизмельченным твердым носителем или обоими и затем, если необходимо, приданием формы этому продукту. Жидкими дозированными единицами являются флаконы или ампулы. Твердыми дозированными единицами являются таблетки, капсулы и суппозитории. Для лечения пациента, в зависимости от активности конкретного соединения, способа введения, цели иммунизации (например, профилактической или терапевтической), характера и тяжести нарушения, возраста и массы тела пациента, могут быть необходимы различные дозы. Введение конкретной дозы может проводиться единственным введением в форме отдельной дозированной единицы или еще нескольких меньших дозированных единиц. Другие системы доставки могут включать в себя системы доставки с контролируемым временем высвобождения, системы доставки задержанного или длительно поддерживаемого высвобождения. Такие системы могут позволить избежать повторяемых введений этих соединений, что увеличивает удобство для субъекта и для врача. Многочисленные типы систем доставки с регулируемым высвобождением являются доступными и известными специалистам с обычной квалификацией в данной области. Они включают в себя системы на основе полимеров, таких как поли(лактиды-гликолиды), сополиоксилаты,поликапролактоны, полиэфирамиды, сложные полиортоэфиры, полигидроксимасляную кислоту и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны,например, в патенте США 5075109. Системы доставки включают в себя также неполимерные системы,такие как липиды, в том числе стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; системы высвобождения на основе гидрогеля; кремнийорганические системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; прессованные таблетки, использующие общепринятые связывающие агенты и эксципиенты; частично конденсированные имплантаты и т.п. Конкретные примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: (а) эрозионные системы, в которых агент согласно изобретению содержится в форме, находящейся внутри матрикса, такие как описанные в патентах США 4452775, 4675189 и 5736152, и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент выходит при контролируемой скорости из полимера, такие как описанные в патентах США 3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того, могут быть использованы системы доставки с использованием приборов на основе насоса, некоторые их которых приспособлены для имплантации. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота является модифицированной. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет модифицированный скелет по меньшей мере с одной устойчивой к нуклеазам связью. Устойчивая к нуклеазам межнуклеотидная связь может быть выбрана из группы, включающей в себя фосфоротиоатную связь, фосфородитиоатную связь, метилфосфонатную связь и пептидную связь. В некоторых вариантах осуществления модифицированная иммуностимуляторная нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере один аналог нуклеотида или по меньшей мере один аналог нуклеотида. Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота в некоторых вариантах осуществления является палиндромом, тогда как в других вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота не является палиндромом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эта иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет длину 8-100 нуклеотидов, тогда как в других предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет длину 12-40 нуклеотидов. Предпочтительные разме- 27008777 ры, последовательности и модификации описаны более подробно ниже. Следующие примеры включены для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема согласно изобретению. Примеры Целью этого исследования была оценка способности различных классов CpG-ODN (CpGолигодинуклеотидов) стимулировать РВМС у хронических носителей HCV. РВМС выделяли из цельной крови, собранной у нормальных, здоровых добровольцев и хронических носителей HCV и оценивали способность различных классов CpG-ODN, а также мягких и полумягких молекул стимулировать пролиферацию В-клеток, секрецию цитокинов (IFN-, TNF-, IL-10 и IFN-) и секрецию хемокинов (IP-10) invitro. Оценивали также иммуностимуляторные эффекты экзогенных IFN2b (интрона А) и рибавирина,каждого по отдельности, в комбинации друг с другом и в комбинации с CpG-ODN (классов В и С). Материалы и способы Олигонуклеотиды Все исходные материалы олигонуклеотидов ресуспендировали в ТЭ-буфере при рН 8,0 (OmniPer;RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY), содержащей 10% инактивированную нагреванием АВсыворотку нормального человека (Wisent Inc, St. Bruno, QC) и 1% пенициллин/стрептомицин (GibcoBRL, Grand Island, NY) непосредственно перед их использованием в клеточных анализах. Для экспериментов с экзогенным IFN- интрон А (интерферон альфа-2b, DIN 02223406, Schering Canada Inc., PointeClaire, Quebec, Canada) добавляли к растворам ODN с получением конечных концентраций 125 или 1000ME/мл. Рибавирин (Cas 36791-04-5, Calbiochem, CN Biosciences Inc., La Jolla, CA, USA) восстанавливали стерильной дистиллированной водой с получением 500 мкМ исходного раствора и разбавляли в среде,как описано выше, с получением конечной концентрации 5 мкМ в лунках. Клетки инкубировали при 37 С с 5% СО 2. Спустя 48 ч клеточные супернатанты собирали из каждой лунки и замораживали при Заменяющая фосфодиэфирную связь фосфоротиоатная связь в скелете олигонуклеотида указана (-) Выделение РВМС Цельную кровь (200 мл) собирали венозной пункцией в гепаринизированные вакутейнеры с зелеными крышками у десяти (10) нормальных, здоровых взрослых субъектов и пятнадцати (15) взрослых субъектов, хронически инфицированных HCV, которые имели предшествующий 6-месячный курс терапии на основе IFN- и либо не имели успешного результата лечения, либо отвечали на лечение, но имели рецидив. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) очищали центрифугированием черезFicoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) при 400g в течение 35 мин. Клетки ресуспендировали при концентрации 10106 на мл в полной среде RPMI, содержащей 10% АВ-сыворотку человека (инактивированную нагреванием) и 1% пенициллин/стрептомицин. Пролиферация В-клеток Клетки выделяли, как описано выше, и ресуспендировали при 1106 на мл в полной среде RPMI и 100 мкл клеток добавляли в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов. В лунки добавляли растворы ODN (100 мкл) с получением выбранного диапазона конечных концентраций (1, 3, 6 мкг на- 28008777 лунку). Клетки культивировали в течение 5 дней и затем подвергали импульсному действию 3 Нтимидина (1 мкКи на лунку) в течение 18 ч перед сбором на фильтровальную бумагу для измерения радиоактивности. Результаты сообщаются в виде индекса стимуляции (SI) относительно необработанного контроля среды. Анализы цитокинов Свежевыделенные РВМС ресуспендировали при 10106 на мл (конечная концентрация 2) и 100 мкл клеток добавляли в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета, содержащую равный объем раствора ODN (2 конечной концентрации). Диапазон концентраций (1, 3, 6 мкг/мл) испытывали на каждый ODN. Клетки инкубировали при 37 С с 5% СO2. Спустя 48 ч клеточные супернатанты собирали из каждой лунки и замораживали при -80 С до анализа. Уровни IFN-, IP-10, IL-10 и IFN- в супернатантах измеряли с использованием коммерческих наборов ELISA (RD Systems, Minneapolis, MN, USA; IP-10, Cat DIP 100, IL-10, Cat D1000, IFN-, CatDIF50 или PBL Biomedical, IFN- Cat 4110S). Когда измерения ELISA были ниже порога детектирования этого набора, указанного изготовителем, величину, равную самому низкому порогу детектирования,вводили в таблицы данных. Результаты РВМС, выделенные из крови, собранной у 15 хронически инфицированных HCV субъектов и 10 нормальных здоровых добровольцев, инкубировали при 37 С с различными классами CpG (например,классом А, В, С, мягким С, полумягким В и полумягким С) и клеточные супернатанты оценивали на присутствие цитокинов, являющееся признаком секреции цитокинов во время периода инкубации. Результаты этих экспериментов приведены ниже. Индукция секреции IFN- РВМС При испытании трех классов CpG-ODN на РВМС у нормальных добровольцев очень высокие уровни IFN- продуцировались классом A (CpG SEQ ID NO:1), умеренно высокие уровни классом С (CpGSEQ ID NO:4) и только низкие уровни индуцировались классом В (CpG SEQ ID NO:2) (фиг. 1). Основным клеточным источником IFN- является pDC. В случае РВМС, полученных из хронических носителей HCV, все три класса CpG могли индуцировать секрецию IFN-. Уровни с использованием классов В и С были такими же, что и уровни, полученные с нормальными РВМС. В противоположность этому, класс А индуцировал только приблизительно 50% нормального уровня (фиг. 1), что предполагает, что дисфункция HCV-инфицированных pDC имеет некоторое влияние на эффективность CpG класса А в индукции IFN-, но не класса С. Таким образом,либо класс А, либо класс С мог бы быть использован для лечения хронических носителей HCV, но в некоторых случаях класс С может быть предпочтительным. Количество pDC определяли с использованием анализа FACS. Линейную регрессию выполняли против этого в сравнении с количеством IFN-, секретируемым с CpG-ODN либо класса А, либо класса С, и обнаруживали приемлемую корреляцию для нормальных субъектов (например, R=0,43 и 0,58 соответственно). Кроме того, было обнаружено, что эта корреляция была несколько лучшей для ODN класса С. В отличие от этого, не наблюдали корреляции между количеством pDC и количеством IFN-, секретируемым для HCV-инфицированных субъектов (R=0,02 и 0,08 соответственно) (фиг. 3). Тем не менееHCV-инфицированные DC способны секретировать IFN- в ответ на CpG-ODN. Анализировали также действие мягких и полумягких изменений в этих ODN. Синтезировали мягкие молекулы, которые имели ряд фосфодиэфирных связей в центральном районе этой молекулы. Синтезировали полумягкие молекулы, которые имели одну или более отдельных фосфодиэфирных связей, которые находились между нуклеотидами цитозином и гуанином CpG-мотивов. Как мягкие (фиг. 3), так и полумягкие (фиг. 4) CpG-ODN класса С были способны стимулировать секрецию IFN- из нормальных РВМС или HCV-PBMC сходным образом в сравнении с исходными CpG-ODN класса С. Несколько из полумягких CpG-ODN класса С были даже более сильными, чем нормальный CpG-ODN класса С SEQ IDNO:4 (фиг. 4). Это может быть обусловлено тем, что эта молекула является все еще достаточно стабильной для того, чтобы иметь максимальную иммунную стимуляцию, и эта фосфодиэфирная связь в середине CpG-мотива может увеличивать ее активность. Индукция секреции IFN- PBMC Фиг. 5 сравнивает способность различных классов CpG индуцировать секрецию Th1-цитокина, IFN. Класс А индуцировал низкие уровни IFN-, тогда как в сравнении с ним класс В продуцировал умеренные количества, а класс С CpG стимулировал высокие концентрации IFN-. Как HCVинфицированные, так и нормальные РВМС обнаруживали сходную Th1-реакцию для всех трех классовCpG. Сходные результаты были получены с полумягкими CpG-ODN класса С (фиг. 6). Индукция секреции IP-10 РВМСIP-10, хемокин, ассоциированный с продуцированием интерферонов типа 1 и 2, также индуцируетсяCpG-ODN. Самые высокие уровни индуцируются CpG-ODN класса А, следующие высокие уровни индуцируются CpG-ODN класса С и самые низкие индуцируются CpG-ODN класса В. Независимо от классаCpG-ODN, сходные уровни IP-10 индуцируются клетками РВМС из организма нормальных субъектов и хронических носителей HCV (фиг. 7). Стимуляция В-клеток CpG-ODN Исследовали также действие CpG-ODN на стимуляцию В-клеток. Как показано на фиг. 8 и 9, CpGODN класса А был слабым стимулятором В-клеток как для HCV-инфицированной, так и для нормальной популяций. В противоположность этому, CpG-ODN классов В, С и полумягкого С сильно активировали В-клетки. Не было различий между РВМС из организма нормальных и HCV-инфицированных субъектов. Секреция IL-10 из РВМС после стимуляции посредством CpG-ODN Оценивали также продуцирование цитокина IL-10 после стимуляции CpG-ODN, и эти результаты показаны на фиг. 10. Как у HCV-инфицированных, так и у нормальных субъектов все классы CpG-ODN индуцировали значительную секрецию IL-10, и не было различий между РВМС из организма нормальных добровольцев и хронических носителей HCV. Несколько типов клеток могут продуцировать IL-10 после инкубирования с CpG; однако, поскольку В-клетки являются главными продуцентами этого цитокина, продуцирование IL-10 может быть использовано в качестве индикатора уровня активации Вклеток. Действия интрона А и рибавирина Действие in vitro рибавирина и экзогенного IFN-, интрона А, отдельно или в комбинации с CpG,испытывали на HCV-инфицированных клетках. Ни рибавирин, ни интрон А, ни отдельно, ни вместе, не приводили к индукции секреции IFN- HCV-инфицированными РВМС (фиг. 11). Как обсуждалось выше, CpG-ODN классов А и С приводят к сильной индукции секреции IFN- изCpG-ODN и интрона А наблюдали синергическую реакцию для большинства (60%) субъектов (фиг. 12). ОбсуждениеCpG-ODN способны индуцировать DC из пациентов, хронически инфицированных HCV, для секреции IFN-, с более высокими уровнями при использовании CpG-ODN классов А и С и более низкими уровнями при использовании CpG-ODN класса В. Эти уровни секретируемого IFN- сравнимы с уровнями, наблюдаемыми в случае клеток из нормальных здоровых добровольцев. IP-10 также индуцируется из стимулированных HCV-PBMC, что дополнительно указывает на иммунную активацию Тh1-типа.HCV-антигенспецифические иммунные реакции уже присутствуют в лицах, хронически инфицированных HCV. Они являются Th2-смещенными и, следовательно, не могут вызывать клиренс HCVинфицированных клеток. Реакции Th1-типа являются необходимыми для выведения (клиренса) вируса. Увеличение системных уровней Th1-цитокинов, без дополнительного антигена, позволяет лицам, хронически инфицированным HCV, развивать HCV-специфические иммунные реакции Th1-типа, которые являются инструментом вирусного клиренса. Все классы CpG-ODN (А, В и С) способны устанавливать реакции Th1-типа. Эти реакции Th1-типа являются существенными для долгосрочного клиренса хронической инфекции HCV, но их трудно индуцировать терапией экзогенным IFN-, который имеет прямые антивирусные действия, но не прямые действия на иммунную систему. Таким образом, CpG-ODN может быть использован в комбинации с экзогенным IFN- для лечения хронических носителей HCV. Альтернативно, CpG-ODN мог бы также использоваться отдельно. Благодаря индукции цитокинов,таких как IFN- и IFN-, CpG-ODN сам имеет прямые антивирусные действия, в дополнение к индукцииHCV-специфических иммунных реакций Th1-типа. В некоторых случаях, молекулы класса А и С являются предпочтительными, так как они индуцируют более высокие уровни IFN-. В зависимости от их конкретной последовательности, CpG-ODN могут предпочтительно стимулировать функции pDC, созревание и продуцирование IFN-типа I (Krug, A. et al., Eur J Immunol, 2001; 31:2154-2163). Хотя согласно изобретению показано, что два класса CpG-ODN являются предпочтительными в стимуляции продуцирования IFN-, любой CpG-ODN, независимо от скелета или последовательности CpG-ODN, мог бы быть использован в лечении хронического HCV. Контролируемое высвобождение различных изоформIFN-типа I специфическими CpG-ODN in vivo является предпочтительным относительно системного введения рекомбинантного IFN-типа I, который является единственным подтипом (например, интрон А является только IFN2b). Мягкие и полумягкие версии CpG-ODN способны стимулировать сходные уровни IFN- в сравнении с их исходной молекулой. Мягкие или полумягкие версии CpG-ODN, в частности, класса С, могли бы предпочтительно использоваться для продолжительного лечения HCV, так как они являются более легко деградируемыми, и, следовательно, можно не ожидать их накопления в органах, в частности, в печени, селезенке и почках. По меньшей мере 50% субъектов с HCV не способны отвечать на терапию экзогенным IFN-, однако, CpG-ODN (особенно классов А и С) были способны индуцировать секрецию IFN- in vitro при уровнях, сравнимых с уровнями нормальных здоровых добровольцев во всех субъектах. Таким образом, CpGODN можно было бы использовать для лечения пациентов, которые не отвечали на терапию экзогеннымIFN-, независимо от того, является ли этот IFN-ПЭГилированным или неПЭГилированным, и независимо от того, включает ли это лечение рибавирин или не включает. Классы CpG-ODN, которые индуци- 30