Пиперазинил-, пиперидинил- и морфолинилпроизводные как новые ингибиторы гистондеацетилазы

007270 Данное изобретение относится к соединениям, обладающим ферментативной активностью ингибирования гистондеацетилазы (HDAC). Оно также относится к способам их получения, к композициям,содержащим их, а также к их применению, как in vitro, так и in vivo, для ингибирования HDAC и в качестве лечебного средства, например в качестве лекарственного средства для подавления пролиферативных состояний, таких как рак и псориаз. Во всех эукариотических клетках геномная ДНК в хроматине ассоциирует с гистонами с образованием нуклеосом. Каждая нуклеосома состоит из октамера белка, состоящего из двух копий каждого из гистонов Н 2 А, Н 2 В, Н 3 и Н 4. ДНК обвивает такую белковую сердцевину с помощью основных аминокислот гистонов, взаимодействующих с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. Самой обычной посттрансляционной модификацией таких коровых гистонов является обратимое ацетилирование -аминогрупп консервативных высокоосновных N-концевых лизиновых остатков. Устойчивое состояние ацетилирования гистонов устанавливается за счет динамического равновесия между конкурирующими гистонацетилтрансферазой(ами) и гистондеацетилазой(ами), называемыми в данном описании"HDAC". Ацетилирование и деацетилирование гистонов долгое время связывали с транскрипционным контролем. Современное клонирование генов, кодирующих различные гистонацетилтрансферазы и гистондеацетилазы, дало возможное объяснение соотношения между ацетилированием гистонов и транскрипционным контролем. Обратимое ацетилирование гистонов может привести к реконструкции хроматина и, как таковое, действует как контрольный механизм транскрипции генов. Вообще, гиперацетилирование гистонов облегчает экспрессию генов, в то время как деацетилирование гистонов коррелирует с транскрипционной репрессией. Показано, что гистонацетилтрансферазы действуют как коактиваторы транскрипции, в то время как гистондеацетилазы, как было обнаружено, принадлежат к каскаду реакций транскрипционной репрессии. Динамическое равновесие между ацетилированием и деацетилированием гистонов существенно для нормального роста клеток. Ингибирование гистондеацетилазы приводит к задержке клеточного цикла,клеточной дифференцировке, апоптозу и реверсированию трансформированного фенотипа. Поэтому ингибиторы HDAC могут иметь большой терапевтический потенциал при лечении клеточнопролиферативных заболеваний или состояний (Marks et al., Nature Reviews: Cancer, 1:194-202, 2001). Исследование ингибиторов гистондеацетилаз (HDAC) показывает, что действительно эти ферменты играют важную роль в пролиферации и дифференцировке клеток. Ингибитор трихостатин А (TSA) вызывает задержку клеточного цикла в обеих фазах G1 и G2, возвращает в исходное состояние трансформированный фенотип различных клеточных линий и индуцирует дифференцировку клеток лейкоза Френда и других. Сообщалось, что TSA (и субероиланилидгидроксамовая кислота - SAHA) ингибирует рост клеток, индуцирует терминальную дифференцировку и предотвращает образование опухолей у мышей (Finnin et al., Nature, 401:188-193, 1999). Также сообщалось, что трихостатин А пригоден при лечении фиброза, например фиброза печени, и цирроза печени (Geerts et al., заявка на европейский патент ЕР 0827742, опубликована 11 марта 1998 г.). В международной заявке WO 01/38322, опубликованной 31 мая 2001 г., описываются, среди прочих, ингибиторы гистондеацетилазы общей формулы Cy-L1-Ar-Y1-C(О)-NH-Z, а также композиции и способы лечения клеточно-пролиферативных заболеваний и состояний. В международной заявке WO 01/70675, опубликованной 27 сентября 2001 г., описываются ингибиторы гистондеацетилазы формулы Сy2-Су 1-Х-Y1-W и Cy-S(О)2-NH-Y3-W, а также композиции и способы лечения клеточно-пролиферативных заболеваний и состояний. Проблема, которую следует решить, состоит в получении ингибиторов гистондеацетилазы с высокой ферментативной активностью, показывающих также такие выгодные свойства, как клеточная активность и повышенная биологическая доступность, предпочтительно оральная биологическая доступность,и имеющих слабые побочные действия или не имеющих их. Новые соединения настоящего изобретения решают описанные выше проблемы. Соединения отличаются от соединений известного уровня техники по строению. Соединения настоящего изобретения показывают in vitro превосходную ферментативную активность ингибирования гистондеацетилазы. Соединения настоящего изобретения обладают выгодными свойствами в отношении клеточной активности и специфическими свойствами в отношении ингибирования развития клеточного цикла в обеих контрольных точках G1 и G2 (способность индуцировать р 21). Соединения настоящего изобретения показывают хорошую метаболическую устойчивость и высокую биологическую доступность, и конкретнее, они показывают оральную биологическую доступность. Данное изобретение относится к соединениям формулы (I) где t равен 0, 1, 2, 3 или 4, и когда t равен 0, тогда имеется в виду непосредственная связь; каждый Q представляет собой азот или; каждый Х представляет собой азот или каждый Y представляет собой азот илиR8 представляет собой водород или C1-6-алкил;-L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NR9C(O)-, -HR9SO2- или 9 где каждый s равен независимо 0, 1, 2, 3, 4 или 5; каждый R5 и R6 выбирают независимо из группы, в которую входят водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-C1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкил, замещенный арилом и С 3-10-циклоалкилом; C1-6-алкилокси; C1-6-алкилокси-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6 алкилоксикарбонил; C1-6-алкилсульфонил; циано-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6 алкилокси; гидрокси-С 1-6-алкиламино; амино-С 1-6-алкилокси; ди(C1-6-алкил)аминокарбонил; ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино; (арил)(C1-6-алкил)амино; ди(С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилокси; ди(C1-6 алкил)амино-С 1-6-алкиламино; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкиламино-С 1-6-алкил; арилсульфонил; арилсульфониламино; арилокси; арилокси-С 1-6-алкил; арил-С 2-6-алкендиил; ди(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6 алкил)амино-С 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)амино(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)амино(C1-6-алкил)аминоС 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил(C1-6 алкил)амино-C1-6-алкил; аминосульфониламино(C1-6-алкил)амино; аминосульфониламино(C1-6 алкил)амино-С 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)аминосульфониламино(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)аминосульфониламино (C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; циано; тиофенил; тиофенил, замещенный ди(C1-6 алкил)амино-С 1-6-алкил(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом, ди(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкилом, С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкилом, гидрокси-C1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкилом, гидрокси-С 1-6-алкилокси-С 1-6-3 007270 ди(C1-6-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкилом,C1-6 алкилпиперазинил-С 1-6-алкилом,алкилоксипиперидинилом, С 1-6-алкилоксипиперидинил-С 1-6-алкилом, морфолинил-С 1-6-алкилом, гидрокси-С 1-6-алкил(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкилом или ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом; фуранил; фуранил, замещенный гидрокси-С 1-6-алкилом; бензофуранил; имидазолил; оксазолил; оксазолил, замещенный арилом и C1-6-алкилом; C1-6-алкилтриазолил; тетразолил; пирролидинил; пирролил; пиперидинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил; C1-6-алкилморфолинил; морфолинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил-C1-6 алкил; морфолинил-С 1-6-алкиламино; морфолинил-С 1-б-алкиламино-C1-6-алкил; пиперазинил; C1-6 алкилпиперазинил; C1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкилокси; пиперазинил-С 1-6-алкил; нафталинсульфонилпиперазинил; нафталинсульфонилпиперидинил; нафталинсульфонил; С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6 алкил; C1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкиламино; С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкиламино-С 1-6-алкил; C1-6 алкилпиперазинилсульфонил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкилокси; аминосульфонилпиперазинил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)аминосульфонилпиперазинил; ди(C1-6 алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6 алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилоксипиперидинил; С 1-6-алкилоксипиперидинил-С 1-6-алкил; пиперидиниламино-С 1-6-алкиламино; пиперидиниламино-С 1-6-алкиламино-С 1-6-алкил; (C1-6-алкилпиперидинил)(гидрокси-С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкиламино; (C1-6-алкилпиперидинил)(гидрокси-C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкиламино-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6 алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; (гидрокси-С 1-6-алкил)(C1-6-алкил)амино; (гидрокси-С 1-6 алкил)(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкиламино-С 1-6-алкил; ди(гидрокси-С 1-6-алкил)аминоC1-6-алкил; пирролидинил-С 1-6-алкил; пирролидинил-С 1-6-алкилокси; пиразолил; тиопиразолил; пиразолил, замещенный двумя заместителями, выбранными из числа C1-6-алкила или тригалоген-C1-6-алкила; пиридинил; пиридинил, замещенный C1-6-алкилокси, арилокси или арилом; пиримидинил; тетрагидропиримидинилпиперазинил; тетрагидропиримидинилпиперазинил-С 1-6-алкил; хинолинил; индол; фенил; фенил, замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными, независимо, из числа галогена, амино, нитро, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси, гидрокси-С 1-4-алкила, трифторметила, трифторметилокси,гидрокси-С 1-4-алкилокси,C1-4-алкилсульфонила,С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилокси,C1-4-алкилоксикарбонила, амино-С 1-4-алкилокси, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкилокси, ди(С 1-4-алкил)амино, ди(C1-4 алкил)аминокарбонила, ди(C1-4-алкил)амино-C1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкиламино-С 1-4 алкила, ди(C1-4-алкил)амино(C1-4-алкил)амино, ди(C1-4-алкил)амино(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкил(C1-4-алкил)амино,ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкил(C1-4-алкил)амино-С 1-4 алкила, аминосульфониламино(C1-4-алкил)амино, аминосульфониламино(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкила,ди(C1-4-алкил)аминосульфониламино(C1-4-алкил)амино,ди(C1-4-алкил)аминосульфониламино(C1-4 алкил)амино-С 1-6-алкила, циано, пиперидинил-С 1-4-алкилокси, пирролидинил-С 1-4-алкилокси, аминосульфонилпиперазинила,аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила,ди(C1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинила,ди(С 1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила,гидрокси-С 1-4-алкилпиперазинила,гидрокси-С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила,C1-4-алкилоксипиперидинила,С 1-4 алкилоксипиперидинил-С 1-4-алкила, гидрокси-С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинила, гидрокси-С 1-4 алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, (гидрокси-С 1-4-алкил)(C1-4-алкил)амино, (гидрокси-С 1-4 алкил)(C1-4-алкил)амино-C1-4-алкила, ди(гидрокси-С 1-4-алкил)амино, ди(гидрокси-С 1-4-алкил)амино-С 1-4 алкила, фуранила, фуранила, замещенного -СН=СН-СН=СН-, пирролидинил-С 1-4-алкила, пирролидинилС 1-4-алкилокси, морфолинила, морфолинил-С 1-4-алкилокси, морфолинил-С 1-4-алкила, морфолинил-С 1-4 алкиламино, морфолинил-С 1-4-алкиламино-С 1-4-алкила, пиперазинила, C1-4-алкилпиперазинила, C1-4 алкилпиперазинил-С 1-4-алкилокси, пиперазинил-С 1-4-алкила, C1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, С 1-4 алкилпиперазинил-С 1-4-алкиламино, С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкиламино-С 1-6-алкила, тетрагидропиримидинилпиперазинила, тетрагидропиримидинилпиперазинил-С 1-4-алкила, пиперидиниламино-C1-4 алкиламино, пиперидиниламино-С 1-4-алкиламино-С 1-4-алкила, (C1-4-алкилпиперидинил)(гидрокси-С 1-4 алкил)амино-С 1-4-алкиламино, (C1-4-алкилпиперидинил)(гидрокси-С 1-4-алкил)амино-C1-4-алкиламино-C1-4 алкила, пиридинил-С 1-4-алкилокси, гидрокси-С 1-4-алкиламино, гидрокси-С 1-4-алкиламино-С 1-4-алкила,ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкиламино, аминотиадиазолила, аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкилокси или тиофенил-С 1-4-алкиламино; каждый R5 и R6 может находиться у атома азота, замещая водород; арил, указанный выше, представляет собой фенил или фенил, замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными, каждый независимо, из числа галогена, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси, трифторметила, циано или гидроксикарбонила; их N-оксидным формам, фармацевтически приемлемым солям присоединения и стереохимически изомерным формам. Термин "ингибитор гистондеацетилазы" используется для обозначения соединения, способного взаимодействовать с гистондеацетилазой и ингибировать ее активность, конкретнее ее ферментативную активность. Ингибирование ферментативной активности гистондеацетилазы означает ослабление способности гистондеацетилазы удалять ацетильную группу из гистона. Предпочтительно такое ингибирование является специфическим, т.е. ингибитор гистондеацетилазы ослабляет способность гистондеаце-4 007270 тилазы удалять ацетильную группу из гистона в концентрации, которая ниже, чем концентрация ингибитора, которая требуется для получения некоторого другого эффекта, неродственного биологическому. Используемый в приведенных выше определениях и далее термин "галоген" является общим для фтора, хлора, брома и иода; C1-4-алкил определяет линейные и разветвленные насыщенные углеводородные радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, такие как, например, метил, этил, пропил, бутил,1-метилэтил, 2-метилпропил и т.п.; C1-6-алкил включает C1-4-алкил и его более высокие гомологи с 5-6 атомами углерода, такие как, например, пентил, 2-метилбутил, гексил, 2-метилпентил и т.п.; C1-6 алкандиил определяет двухвалентные линейные и разветвленные насыщенные углеводородные радикалы с 1-6 атомами углерода, такие как, например, метилен, 1,2-этандиил, 1,3-пропандиил, 1,4-бутандиил, 1,5 пентандиил, 1,6-гександиил, и их разветвленные изомеры, такие как 2-метилпентандиил, 3 метилпентандиил, 2,2-диметилбутандиил, 2,3-диметилбутандиил и т.п.; тригалоген-С 1-6-алкил определяетC1-6-алкил, содержащий три идентичных или разных галогенозаместителя, например трифторметил; С 2-6aлкендиил определяет двухвалентные линейные и разветвленные углеводородные радикалы, содержащие одну двойную связь и 2-6 атомов углерода, такие как, например, этендиил, 2-пропендиил, 3 бутендиил, 2-пентендиил, 3-пентендиил, 3-метил-2-бутендиил и т.п.; аминоарил определяет арил, замещенный амино; и С 3-10-циклоалкил включает циклические углеводородные группы с 3-10 атомами углерода, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил,циклогептил, циклооктил и т.п. Термин "другая Zn-хелатообразующая группа" относится к группе, способной взаимодействовать сZn-ионом, который может присутствовать в сайте связывания фермента. Фармацевтически приемлемые соли присоединения охватывают фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Подразумевается, что упомянутые выше фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот включают терапевтически активные нетоксичные формы солей присоединения кислот, которые способны образовывать соединения формулы (I). Соединения формулы (I), имеющие свойства оснований, можно превратить в их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот обработкой указанной формы основания подходящей кислотой. Подходящими кислотами являются, например, неорганические кислоты, такие как галогеноводородные кислоты, например хлороводородная или бромоводородная кислота; серная, азотная, фосфорная и подобные кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, трифторуксусная, пропановая, гликолевая, молочная, пировиноградная, щавелевая, малоновая, янтарная (т.е. бутандиовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая,памовая кислота и подобные кислоты. Соединения формулы (I), имеющие кислотные свойства, можно превратить в их фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований обработкой указанной формы кислоты подходящим органическим или неорганическим основанием. Соответствующие формы солей присоединения оснований включают, например, соли аммония, соли щелочных и щелочно-земельных металлов, например литиевые, натриевые, калиевые, магниевые, кальциевые соли, и т.п., соли с органическими основаниями, например соли бензатина, N-метил-D-глюкамина, гидрабамина, и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и т.п. Термин "соли присоединения кислот или оснований" также включает гидраты и формы присоединения растворителей, которые способны образовывать соединения формулы (I). Примерами таких форм являются, например, гидраты, алкоголяты и т.п. Термин "стереохимически изомерные формы соединений формулы (I)", используемый в данном описании, определяет все возможные соединения, состоящие из одних и тех же атомов, связанных в одной и той же последовательности связей, но имеющие разные трехмерные структуры, не являющиеся взаимозаменяемыми, которыми могут обладать соединения формулы (I). Если не упоминется или не указано иное, химическое название соединения охватывает смесь всех возможных стереохимически изомерных форм, которыми указанное соединение может обладать. Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры основной молекулярной структуры указанного соединения. Подразумевается, что все стереохимически изомерные формы соединений формулы (I) как в чистой форме, так и в форме смесей друг с другом входят в объем настоящего изобретения. Подразумевается, что N-оксидные формы соединений формулы (I) включают такие соединения формулы (I), где один или несколько атомов азота окислены до так называемого N-оксида, в частности такие N-оксиды, где N-окисленными являются один или несколько атомов азота пиперидина, пиперазина или пиридазинила. Некоторые соединения формулы (I) также могут существовать в их таутомерных формах. Подразумевается, что такие формы хотя и не указываются ясно в приведенной выше формуле, включены в объем настоящего изобретения. Когда бы ни использовался далее в настоящем описании термин "соединения формулы (I)", подразумевается, что он также включает фармацевтически приемлемые соли присоединения и все стереоизомерные формы.-5 007270 Подразумевается, что используемые в данном описании термины "гистондеацетилаза" и "HDAC" относятся к любому ферменту из семейства ферментов, удаляющих ацетильную группу из -аминогрупп лизиновых остатков в N-конце гистона. Если в контексте не указано иное, подразумевается, что термин"гистон" относится к любому белку-гистону, включая H1, Н 2 А, Н 2 В, Н 3, Н 4 и Н 5, от любого вида. Человеческие белки HDAC или генные продукты включают HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5,HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 и HDAC-10, и другие белки. Гистондеацетилаза также может происходить от источника, принадлежащего к простейшим или грибам. Первая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений:f) -L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(О)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1) или (а-20);i) каждый R5 выбирают независимо из числа водорода или фенила. Вторая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений:h) -L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(О)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1) или (а-20);k) каждый R5 выбирают независимо из числа водорода или фенила. Третья группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), гдеR1 представляет собой -C(O)NH(OH). Четвертая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I),где R1 представляет собой -C(O)NH(OH), и R2 представляет собой водород. Пятая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений:d) -L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(О)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1), (а-3), (а-4), (а-5), (а-6), (а-7), (а-8),e)g) R5 представляет собой водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-С 1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилоксикарбонил; C1-6 алкилсульфонил; гидрокси-С 1-6-алкил; арилокси; ди(C1-6-алкил)амино; циано; тиофенил; фуранил; фуранил, замещенный гидрокси-С 1-6-алкилом; бензофуранил; имидазолил; оксазолил; оксазолил, замещенный арилом и C1-6-алкилом; C1-6-алкилтриазолил; тетразолил; пирролидинил; пирролил; морфолинил; C1-6 алкилморфолинил; пиперазинил; C1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6-алкилпиперазинил; C1-6 алкилоксипиперидинил; пиразолил; пиразолил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из числа C1-6-алкила или тригалоген-С 1-6-алкила; пиридинил; пиридинил, замещенный C1-6 алкилокси, арилокси или арилом; пиримидинил; хинолинил; индол; фенил или фенил, замещенный од-6 007270 ним или двумя заместителями, выбранными независимо из числа галогена, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси или трифторметила;h) R6 представляет собой водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-С 1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилоксикарбонил; C1-6 алкилсульфонил; гидрокси-С 1-6-алкил; арилокси; ди(C1-6-алкил)амино; циано; пиридинил; фенил или фенил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными независимо из числа галогена, C1-6 алкила, C1-6-алкилокси или трифторметила. Шестая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений: а) R3 и R4, каждый независимо, выбирают из числа водорода, гидрокси, гидрокси-С 1-6-алкила, амино-С 1-6-алкила или аминоарила;b) представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1), (а-2), (а-3), (а-4), (а-5), (а-6), (а-7),(а-8), (а-9), (а-10), (а-11), (а-12), (а-13), (а-14), (а-15), (а-16), (а-17), (а-18), (а-19), (а-20), (а-21), (а-22), (а 23), (а-24), (а-25), (а-26), (а-27), (а-28), (а-29), (а-30), (а-31), (а-32), (а-33), (а-34), (а-35), (а-36), (а-37), (а 38), (а-39), (а-40), (а-41), (а-42), (а-43) или (а-44); с) каждый R5 и R6 выбирают независимо из группы, в которую входят водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-С 1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; С 1-6 алкилокси-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилсульфонил; циано-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6 алкил; гидрокси-C1-6-алкилокси; гидрокси-С 1-6-алкиламино; амино-C1-6-алкилокси; ди(C1-6 алкил)аминокарбонил; ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино; (арил)(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6 алкилокси; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкиламино; арилсульфонил; арилсульфониламино; арилокси; apилC2-6-aлкeндиил; ди(С 1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкил(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; циано; тиофенил; тиофенил, замещенный ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6 алкил(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом, ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом, C1-6-алкилпиперазинил-C1-6 алкилом или ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом; фуранил; имидазолил; C1-6-алкилтриазолил; тетразолил; пирролидинил; пиперидинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил; C1-6-алкилморфолинил; морфолинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилпиперазинил; С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6 алкилокси; С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилпиперазинилсульфонил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкилокси; аминосульфонилпиперазинил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; ди(C1-6 алкил)аминосульфонилпиперазинил; ди(C1-6-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; гидроксиС 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилоксипиперидинил; С 1-6 алкилоксипиперидинил-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6 алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; (гидрокси-C1-6-алкил)(C1-6-алкил)амино; (гидрокси-С 1-6 алкил)(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкил; пирролидинил-С 1-6-алкилокси; пиразолил; тиопиразолил; пиразолил,замещенный двумя заместителями, выбранными из числа C1-6-алкила или тригалоген-С 1-6-алкила; пиридинил; пиридинил, замещенный C1-6-алкилокси или арилом; пиримидинил; хинолинил; индол; фенил; фенил, замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными независимо из числа галогена,амино, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси, гидрокси-С 1-4-алкила, трифторметила, трифторметилокси, гидроксиС 1-4-алкилокси,C1-4-алкилокси-С 1-4-алкилокси,амино-С 1-4-алкилокси,ди(С 1-4-алкил)амино-С 1-4 алкилокси, ди(C1-4-алкил)амино, ди(С 1-4-алкил)амино-С 1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкил(C1-4 алкил)амино-С 1-4-алкила, пиперидинил-С 1-4-алкилокси, пирролидинил-С 1-4-алкилокси, аминосульфонилпиперазинила, аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинила,ди(C1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила, гидрокси-С 1-4-алкилпиперазинила, гидроксиС 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила,C1-4-алкилоксипиперидинила,С 1-4-алкилоксипиперидинил-С 1-4 алкила,гидрокси-С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинила,гидрокси-С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, (гидрокси-С 1-4-алкил)(C1-4-алкил)амино, (гидрокси-С 1-4-алкил)(C1-4-алкил)аминоC1-4-алкила, пирролидинил-С 1-4-алкилокси, морфолинил-С 1-4-алкилокси, морфолинил-С 1-4-алкила, C1-4 алкилпиперазинила, C1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкилокси, С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, гидрокси-С 1-4-алкиламино, ди(гидрокси-С 1-4-алкил)амино, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкиламино, аминотиадиазолила, аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкилокси или тиофенил-С 1-4-алкиламино. Группа предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I),где R3 и R4, каждый независимо, выбирают из числа водорода, гидрокси, гидрокси-С 1-6-алкила,амино-С 1-6-алкила или аминоарила; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1), (а-2), (а-3), (а-4), (а-5), (а-6), (а-7), (а 8), (а-9), (а-10), (а-11), (а-12), (а-13), (а-14), (а-15), (а-16), (а-17), (а-18), (а-19), (а-20), (а-21), (а-22), (а-23),(а-24), (а-25), (а-26), (а-27), (а-28), (а-29), (а-30), (а-31), (а-32), (а-33), (а-34), (а-35), (а-36), (а-37), (а-38), (а 39), (а-40), (а-41), (а-42), (а-43) или (а-44); каждый R5 и R6 выбирают независимо из группы, в которую входят водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-C1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; С 1-6 алкилокси-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилсульфонил; циано-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6 алкил; гидрокси-C1-6-алкилокси; гидрокси-С 1-6-алкиламино; амино-С 1-6-алкилокси; ди(C1-6-7 007270 алкил)аминокарбонил; ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино; арил(C1-6-алкил)амино; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6 алкилокси; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкиламино; арилсульфонил; арилсульфониламино; арилокси; apилC2-6-aлкeндиил; ди(C1-6-алкил)амино; ди(С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкил; циано; тиофенил; тиофенил, замещенный ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6 алкил(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом, ди(C1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом, С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6 алкилом или ди(гидрокси-С 1-6-алкил)амино-С 1-6-алкилом; фуранил; имидазолил; C1-6-алкилтриазолил; тетразолил; пирролидинил; пиперидинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил; C1-6-алкилморфолинил; морфолинил-С 1-6-алкилокси; морфолинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилпиперазинил; С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6 алкилокси; C1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилпиперазинилсульфонил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкилокси; аминосульфонилпиперазинил; аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; ди(C1-6 алкил)аминосульфонилпиперазинил; ди(C1-6-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-6-алкил; гидроксиС 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; C1-6-алкилоксипиперидинил; С 1-6 алкилоксипиперидинил-С 1-6-алкил; гидрокси-С 1-6-алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-C1-6 алкилокси-С 1-6-алкилпиперазинил-С 1-6-алкил; (гидрокси-С 1-6-алкил)(C1-6-алкил)амино; (гидрокси-С 1-6 алкил)(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкил; пирролидинил-С 1-6-алкилокси; пиразолил; тиопиразолил; пиразолил,замещенный двумя заместителями, выбранными из числа C1-6-алкила или тригалоген-С 1-6-алкила; пиридинил; пиридинил, замещенный C1-6-алкилокси или арилом; пиримидинил; хинолинил; индол; фенил; фенил, замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными независимо из числа галогена,амино, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси, гидрокси-С 1-4-алкила, трифторметила, трифторметилокси, гидроксиС 1-4-алкилокси,C1-4-алкилокси-С 1-4-алкилокси,амино-С 1-4-алкилокси,ди(С 1-4-алкил)амино-С 1-4 алкилокси, ди(C1-4-алкил)амино, ди(С 1-4-алкил)амино-С 1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкил(C1-4 алкил)амино-С 1-4-алкила, пиперидинил-С 1-4-алкилокси, пирролидинил-С 1-4-алкилокси, аминосульфонилпиперазинила, аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила, ди(C1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинила,ди(C1-4-алкил)аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкила, гидрокси-С 1-4-алкилпиперазинила, гидроксиС 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила,C1-4-алкилоксипиперидинила,С 1-4-алкилоксипиперидинил-С 1-4 алкила, гидрокси-С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинила, гидрокси-С 1-4-алкилокси-С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, (гидрокси-С 1-4-алкил)(C1-4-алкил)амино, (гидрокси-С 1-4-алкил)(C1-4-алкил)амино-C1-4 алкила, пирролидинил-С 1-4-алкилокси, морфолинил-С 1-4-алкилокси, морфолинил-С 1-4-алкила, C1-4-алкилпиперазинила, C1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкилокси, С 1-4-алкилпиперазинил-С 1-4-алкила, гидрокси-С 1-4 алкиламино, ди(гидрокси-С 1-4-алкил)амино, ди(C1-4-алкил)амино-С 1-4-алкиламино, аминотиадиазолила,аминосульфонилпиперазинил-С 1-4-алкилокси или тиофенил-С 1-4-алкиламино. Другая группа предпочтительных соединений состоит из соединений формулы (I),где t равен 0;-L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(O)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1), (а-3), (а-4), (а-5), (а-6), (а-7), (а-8), (а 9), (а-10), (а-11), (а-12), (а-13), (а-14), (а-15), (а-16), (а-17), (а-18), (а-19), (а-20), (а-21), (а-22), (а-23), (а-24),(а-25), (а-26), (а-28), (а-29), (а-30), (а-31), (а-32), (а-33), (а-34), (а-35), (а-36), (а-37), (а-38), (а-39), (а-40), (а 41), (а-42), (а-44), (а-45), (а-46), (а-47), (а-48) или (а-51); каждый s равен независимо 0, 1, 2, 3 или 4;R5 представляет собой водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-С 1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилоксикарбонил; C1-6 алкилсульфонил; гидрокси-С 1-6-алкил; арилокси; ди(С 1-6-алкил)амино; циано; тиофенил; фуранил; фуранил, замещенный гидрокси-С 1-6-алкилом; бензофуранил; имидазолил; оксазолил; оксазолил, замещенный арилом и C1-6-алкилом; C1-6-алкилтриазолил; тетразолил; пирролидинил; пирролил; морфолинил; C1-6 алкилморфолинил; пиперазинил; C1-6-алкилпиперазинил; гидрокси-C1-6-алкилпиперазинил; C1-6 алкилоксипиперидинил; пиразолил; пиразолил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из числа C1-6-алкила или тригалоген-С 1-6-алкила; пиридинил; пиридинил, замещенный C1-6 алкилокси или арилом; пиримидинил; хинолинил; индол; фенил или фенил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными независимо из числа галогена, C1-6-алкила, C1-6-алкилокси или трифторметила; иR6 представляет собой водород; галоген; гидрокси; амино; нитро; тригалоген-С 1-6-алкил; тригалоген-С 1-6-алкилокси; C1-6-алкил; C1-6-алкилокси; C1-6-алкилкарбонил; C1-6-алкилоксикарбонил; C1-6 алкилсульфонил; гидрокси-С 1-6-алкил; арилокси; ди(С 1-6-алкил)амино; циано; пиридинил; фенил или фенил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными независимо из числа галогена, C1-6 алкила, C1-6-алкилокси или трифторметила.-8 007270 Еще одна группа предпочтительных соединений состоит из соединений формулы (I),где t равен 0 или 1;; каждый Q представляет собой каждый Х представляет собой азот;-L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(O)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1) или (а-20); каждый s равен независимо 0 или 1; каждый R5 выбирают независимо из числа водорода или фенила. Группа более предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I),где t равен 1; каждый Q представляет собой-L- представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из числа -NHC(O)- или -NHSO2-; представляет собой радикал, выбранный из числа (а-1) или (а-20); каждый s равен независимо 0 или 1; каждый R5 выбирают независимо из числа водорода или фенила. Наиболее предпочтительными соединениями являются соединения 4, 10, 8, 6, 1, 12 и 14. Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли и их N-оксиды и стереохимически изомерные формы можно получить обычными способами. Общий путь синтеза включает, например,этапы, перечисленные далее. а). Гидроксамовые кислоты формулы (I), где R1 представляет собой -C(O)NH(OH), причем указанные соединения относят к соединениям формулы (I-а), можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (II) с подходящей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота. Указанное взаимодействие осуществляют в подходящем растворителе, таком как, например, метанол.b). Промежуточные соединения формулы (II) можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (III) с промежуточным соединением формулы (IV) в присутствии соответствующих реагентов, таких как моногидрохлорид N'-(этилкарбонимидоил)-N,N-диметил-1,3-пропандиамина (EDC) и 1-гидрокси-1 Н-бензотриазол (НОВТ). Взаимодействие можно осуществлять в подходящем растворителе, таком как смесь DCM и ТГФ. с). Промежуточные соединения формулы (III) можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (V) с подходящим основанием, таким как NaOH, в присутствии подходящего растворителя, такого как этанол. Соединения формулы (I) также можно удобно получать с использованием метода твердофазного синтеза. Вообще, твердофазный синтез включает взаимодействие промежуточного соединения при синтезе с полимерным носителем. Такое промежуточное соединение на носителе затем может проходить через ряд стадий синтеза. После каждой стадии отфильтровыванием смолы и промывкой ее несколько раз различными растворителями удаляют примеси. На каждой стадии смолу можно разделять для взаимодействия с разными промежуточными соединениями на следующей стадии, причем таким образом создается возможность синтеза большого числа соединений. После последней стадии в процедуре смолу обрабатывают реагентом или способом, отщепляющим смолу от образца. Более подробное пояснение методов, используемых в твердофазной химии, дается, например, в работах "The Combinatorial Index" (B.Bunin, Academic Press) и Novabiochem's 1999 CataloguePeptide Synthesis Handbook (Novabiochem AG,Switzerland), которые обе включены в данное описание в качестве ссылок. Соединения формулы (I) и некоторые промежуточные соединения могут содержать в своей структуре по меньшей мере один стереогенный центр. Такой стереогенный центр может присутствовать в Rили S-конфигурации. Соединения формулы (I), полученные описанными выше способами, как правило, представляют собой рацемические смеси энантиомеров, которые можно отделить друг от друга последующими процедурами разделения, известными в технике. Рацемические соединения формулы (I) можно превратить в соответствующие диастереомерные формы солей взаимодействием с подходящей хиральной кислотой. Затем указанные диастереомерные формы солей разделяют, например, селективной или фракционной кристаллизацией, и энантиомеры высвобождают из них под действием щелочи. Другой способ разделения энантиомерных форм соединений формулы (I) включает жидкостную хроматографию с использованием хиральной неподвижной фазы. Указанные стереохимически чистые изомерные формы также можно получить из соответствующих стереохимически чистых изомерных форм подходящих исходных ве- 10007270 ществ, при условии, что взаимодействие происходит стереоспецифически. Предпочтительно, если нужен определенный стереоизомер, следует синтезировать указанное соединение стереоспецифическими способами получения. В таких способах преимущественно будут использоваться энантиомерно чистые исходные вещества. Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и их стереоизомерные формы имеют ценные фармакологические свойства, проявляющиеся в том, что они обладают ингибирующим действием в отношении гистондеацетилазы (HDAC). Данное изобретение относится к способу ингибирования аномального роста клеток, в том числе трансформированных клеток, путем введения эффективного количества соединения изобретения. Аномальным является рост клеток, независимый от нормальных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования). Сюда относятся ингибирование роста опухоли как непосредственно, за счет задержки роста, терминальной дифференцировки и/или апоптоза раковых клеток, так и косвенно,путем ингибирования неоваскуляризации опухолей. Данное изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолей путем введения субъекту, например млекопитающему (в более частном случае, человеку), нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения настоящего изобретения. В частности, данное изобретение относится к способу ингибирования роста опухолей путем введения эффективного количества соединений настоящего изобретения. Примерами опухолевых заболеваний, которые можно подавлять, являются,но не ограничиваются указанным, рак легких (например, аденокарцинома и, в том числе, немелкоклеточный рак легких), раковые заболевания поджелудочной железы (например, панкреатическая карцинома, такая как, например, экзокринная панкреатическая карцинома), раковые заболевания ободочной кишки (например, колоректальные карциномы, такие как, например, аденокарцинома ободочной кишки и аденома ободочной кишки), рак предстательной железы, в том числе прогрессирующее заболевание,гемопоэтические опухоли лимфоидного ряда (например, острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточная лимфома, лимфома Беркитта), миелоидные лейкозы (например, острый миелоидный лейкоз (AML, фолликулярный рак щитовидной железы, миелодиспластический синдром (MDS), опухоли мезенхимного происхождения (например, фибросаркомы и рабдомиосаркомы), меланомы, тератокарциномы, нейробластомы, глиомы, доброкачественная опухоль кожи (например, кератоакантомы), карцинома молочной железы (например, прогрессирующий рак молочной железы), карцинома почек, карцинома яичников,карцинома мочевого пузыря и эпидермальная карцинома. Соединения по изобретению можно использовать для других лечебных целей, например дляa) сенсибилизации опухолей к радиотерапии путем введения соединения по изобретению перед, во время или после облучения опухоли для лечения рака;b) лечения артропатий и остеопаталогических состояний, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный артрит, подагра, полиартрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит и системная красная волчанка;c) ингибирования пролиферации клеток гладких мышц, в том числе васкулярных пролиферативных расстройств, атеросклероза и рестеноза;d) лечения воспалительных состояний и состояний кожи, таких как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, аллергический ринит, болезнь "трансплантат против хозяина", конъюнктивит, астма,ARDS, болезнь Бехчета, отторжение трасплантата, крапивница, аллергический дерматит, гнездная алопеция, склеродерма, экзантема, экзема, дерматомиозит, акне, диабет, системная красная волчанка, болезнь Кавасаки, рассеянный склероз, эмфизема, кистозный фиброз и хронический бронхит;e) лечения эндометриоза, маточного фиброза, дисфункционального маточного кровотечения и эндометриальной гиперплазии;m) ингибирования нервно-мышечной патологии, например амиотрофического бокового склероза;n) лечения спинально-мышечной атрофии; о) лечения других патологических состояний, поддающихся лечению путем потенциирования экспрессии гена; р) усиления генной терапии.- 11007270 Итак, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства, а также к применению указанных соединений формулы (I) для получения лечебного средства для лечения одного или нескольких из вышеуказанных состояний. Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и стереоизомерные формы могут иметь ценные диагностические свойства в том отношении, что их можно использовать для детекции или идентификации HDAC в биологическом образце, включая детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением и HDAC. В способах детекции или идентификации можно использовать соединения, помеченные веществами-метками, такими как радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и т.д. Примерами радиоизотопов являются 125I, 131I, 3H и 14 С. Ферменты, как правило, делают детектируемыми путем соединения с соответствующим субстратом, который, в свою очередь, катализирует реакцию детекции. Их примерами являются, например, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, щелочная фосфатаза, пероксидаза и малатдегидрогеназа, и предпочтительна пероксидаза из хрена. Люминесцентные вещества включают, например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люциферазу. Биологические образцы можно определить как ткань организма или жидкости организма. Примерами жидкостей организма являются цереброспинальная жидкость, кровь, плазма, сыворотка, моча, мокрота, слюна и т.п. С учетом их полезных фармакологических свойств, обсуждаемые соединения можно ввести в состав разных фармацевтических форм для целей введения. Для того чтобы получить фармацевтические композиции данного изобретения, эффективное количество определенного соединения, в форме соли присоединения основания или кислоты, в качестве активного ингредиента объединяют при тщательном перемешивании с фармацевтически приемлемым носителем, который может иметь самые разные формы, в зависимости от формы препарата, нужного для введения. Такие фармацевтические композиции представляют желательно единичную дозированную форму, подходящую предпочтительно для введения перорально, ректально, чрезкожно или путем парентеральной инъекции. Например, при получении композиций в оральной дозированной форме можно использовать любую из обычно используемых фармацевтических сред, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п., в случае оральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазывающие вещества, связующие вещества, дезинтегрирующие вещества и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Из-за легкости их введения таблетки и капсулы представляют наиболее благоприятную оральную единичную дозированную форму, и в таком случае, очевидно, используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель, как правило, будет содержать стерильную воду, по меньшей мере, в большей части, хотя можно включать и другие ингредиенты, например, способствующие растворению. Можно получить, например, растворы для инъекций, в которых носитель содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Также можно получить суспензии для инъекций, и в таком случае можно использовать соответствующие жидкие носители, суспендирующие вещества и т.п. В композициях, подходящих для чрезкожного введения, носитель необязательно содержит вещество, усиливающие проникание, и/или подходящее смачивающее вещество необязательно в сочетании с небольшими количествами подходящих добавок любой природы, которые не оказывают существенного раздражающего действия на кожу. Указанные добавки могут облегчить нанесение на кожу и/или могут быть полезными при получении нужных композиций. Такие композиции можно вводить разными способами, например в виде трансдермального пластыря, в виде капли или в виде мази. Особенно выгодно получать указанные выше фармацевтические композиции в единичной дозированной форме для облегчения введения и равномерности дозировки. Используемый в данном описании и в формуле изобретения термин "единичная дозированная форма" относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок, причем каждая единица содержит предварительно установленное количество активного ингредиента, рассчитанное на получение нужного лечебного действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных дозированных форм являются таблетки (в том числе, таблетки с насечками или с покрытием), капсулы, пилюли, порошки в пакетиках, облатки, растворы или суспензии для инъекций, чайные ложки, столовые ложки и т.п., и множество таких разделенных дозированных форм. Специалисты в данной области техники легко могут определить эффективное количество из результатов испытаний, представленных далее. Вообще, предполагается, что терапевтически эффективное количество будет составлять от 0,005 до 100 мг на кг веса тела и, в частности, от 0,005 до 10 мг на кг веса тела. Может оказаться подходящим введение требуемой дозы в виде двух, трех, четырех или большего числа субдоз через соответствующие интервалы в течение суток. Указанная субдоза может быть составлена в виде единичных дозированных форм, например, содержащих 0,5-500 мг и, в частности, 10-500 мг активного ингредиента на единичную дозированную форму.- 12007270 В другом аспекте настоящее изобретение относится к сочетанию ингибитора HDAC с другим противораковым средством, в особенности, для применения в качестве лекарственного средства, конкретнее,при лечении рака или родственных заболеваний. Для лечения вышеуказанных состояний соединения изобретения можно выгодно использовать в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами, в частности, с другими противораковыми средствами. Примерами противораковых средств являются координационные соединения платины, например цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин; таксановые соединения, например паклитаксел или доцетаксел; ингибиторы топоизомеразы I, такие как соединения камптотецина, например иринотекан или топотекан; ингибиторы топоизомеразы II, такие как противоопухолевые производные подофиллотоксина, например этопозид или тенипозид; противоопухолевые алкалоиды растения барвинок, например винбластин, винкристин или винорелбин; противоопухолевые производные нуклеозидов, например 5-флуороурацил, гемцитабин или капецитабин; алкилирующие агенты, такие как горчичный газ или нитрозомочевина, например циклофосфамид,хлорамбуцил, кармустин или ломустин; противоопухолевые производные антрациклинов, например даунорубицин, доксорубицин, идарубицин или митоксантрон; антитела к HER2, например Ttastuzumab; антагонисты эстрогеновых рецепторов или селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, например тамоксифен, торемифен, дролоксифен, фаслодекс или ралоксифен; ингибиторы ароматазы, такие как экземестан, анастрозол, летразол и ворозол; дифференцирующие агенты, такие как ретиноиды, витамин D и блокаторы метаболизма ретиноевой кислоты (RAMBA), например аккутан; ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, например азацитидин; ингибиторы киназ, например флавоперидол, иматинибмезилат или гефитиниб; ингибиторы фарнезилтрансферазы или другие ингибитоы HDAC. Термин "координационное соединение платины", используемый в данном описании, обозначает любое координационное соединение платины, ингибирующее рост опухолевых клеток, в котором платина предоставлена в форме иона. Термин "таксановые соединения" обозначает класс соединений с таксановой циклической системой, родственные или полученные из экстрактов некоторых видов деревьев тиса (Taxus). Термин "ингибиторы топоизомеразы" используется для обозначения ферментов, способных изменять топологию ДНК в эукариотических клетках. Они являются критическим фактором для важных клеточных функций и клеточной пролиферации. Существует два класса топоизомераз в эукариотических клетках, а именно типа I и типа II. Топоизомераза I представляет собой мономерный фермент с молекулярной массой приблизительно 100000. Фермент связывается с ДНК и вводит временный однонитевой разрыв, раскручивает двойную спираль (или создает возможность для ее раскручивания) и затем закрывает разрыв перед диссоциацией от цепи ДНК. Топоизомераза II имеет подобный механизм действия,который включает индукцию разрывов в цепи ДНК или образование свободных радикалов. Термин "соединения камптотецина" используется для обозначения соединений, родственных или образованных от исходного камптотецина, представляющего собой нерастворимый в воде алкалоид, полученный из дерева Chinese Camptothecin acuminata и дерева Indian Nothapodytes foetida. Термин "подофиллотоксины" используется для обозначения соединений, родственных или полученных из исходного подофиллотоксина, экстрагированного из растения мандрагоры. Термин "противоопухолевые алкалоиды растения барвинок" используется для обозначения соединений, родственных или полученных из экстрактов растения барвинок (Vinca rosea). Термин "алкилирующие агенты" охватывает группу разных химических веществ, общим свойством которых является способность в физиологических условиях отдавать алкильные группы биологически жизнеспособным макромолекулам, таким как ДНК. С помощью большинства более важных агентов, таких как горчичные газы и нитрозомочевины, активные алкилирующие группы генерируются in vivo после сложных реакций деградации, из которых некоторые являются ферментативными. Наиболее важными фармакологическими действиями алкилирующих агентов являются действия, которые нарушают фундаментальные механизмы, касающиеся пролиферации клеток, в частности синтез ДНК и деление клеток. Способность алкилирующих агентов влиять на функцию и целостность ДНК в быстро пролифирирующих тканях создает основу для их терапевтических применений и, во многих случаях, для их токсических свойств. Термин "противоопухолевые производные антрациклинов" включает антибиотики, полученные из гриба Strep. peuticus var. caesius, и их производные, характеризующиеся наличием тетрациклиновой циклической структуры с необычным сахаром даунозамином, присоединенным гликозидной связью. Показано, что амплификация белка рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER 2) при первичных карциномах молочной железы коррелирует с плохим клиническим прогнозом для не- 13007270 которых пациентов. Ttastuzumab представляет собой полученное методом рекомбинантных ДНК гуманизированное моноклональное антитело IgG1-каппа высокой степени чистоты, которое с высокой аффинностью и специфичностью связывается с внеклеточным доменом рецептора HER 2. Многие злокачественные опухоли молочной железы имеют эстрогенные рецепторы, и рост таких опухолей можно стимулировать эстрогеном. Термины "антагонисты эстрогеновых рецепторов" и "селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов" используются для обозначения конкурентных ингибиторов связывания эстрадиола с эстрогеновым рецептором (ER). Селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, когда связываются с ER, индуцируют изменение в трехмерной структуре рецептора, ингибируя его связывание с реагирующим на эстроген элементом (ERE) в ДНК. У женщин в период после менопаузы основным источником циркулирующего эстрогена является конверсия андрогенов надпочечников и яичников (андростендиона и тестостерона) в эстрогены (эстрон и эстрадиол) ферментом ароматазой в периферических тканях. Депривация эстрогена через ингибирование или инактивацию ароматазы является эффективным и избирательным лечением для некоторых пациенток с гормонзависимым раком молочной железы в период после менопаузы. Термин "антиэстроген" используется в данном описании не только для антагонистов эстрогеновых рецепторов и селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов, но также для ингибиторов ароматазы,описанных выше. Термин "дифференцирующие агенты" охватывает соединения, которые могут различными путями ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать дифференцировку. Известно, что витамин D и ретиноиды играют главную роль в регуляции роста и дифференцировке широкого ряда типов здоровых и злокачественных клеток. Блокаторы метаболизма ретиноевой кислоты (RAMBA) повышают уровни эндогенных ретиноевых кислот путем ингибирования опосредуемого цитохромом Р 450 катаболизма ретиноевых кислот. Изменения метилирования ДНК находятся в числе наиболее обычных аномалий при неоплазии человека. Гиперметилирование в промоторах селективных генов, как правило, ассоциируется с инактивацией вовлеченных генов. Термин "ингибиторы ДНК-метилтрансферазы" используется для обозначения соединений, которые действуют через фармакологическое ингибирование ДНК метилтрансферазы и реактивацию экспрессии гена супрессора опухоли. Термин "ингибиторы киназ" включает сильные ингибиторы киназ, вовлеченных в развитие клеточного цикла и запрограммированную гибель клеток (апоптоз). Термин "ингибиторы фарнезилтрансферазы" используется для обозначения соединений, сконструированных для предупреждения фарнезилирования Ras и других внутриклеточных белков. Показано, что они действуют на пролиферацию и выживаемость злокачественных клеток. Термин "другие ингибиторы HDAC" включает короткоцепные жирные кислоты, например бутират, 4-фенилбутират или вальпроевую кислоту; гидроксамовые кислоты, например субероиланилидгидроксамовую кислоту (SAHA), биарилгидроксамат А-161906, бициклические арил-N-гидроксикарбоксамиды, пироксамид, CG-1521, PXD-101,сульфонамидгидроксамовую кислоту LAQ-824, трихостатин A (TSA), оксамфлатин, скриптаид, м-карбоксициннамовую кислоту, бисгидроксамовую кислоту или аналог трапоксингидроксамовой кислоты; циклические тетрапептиды, например трапоксин, апидицин или депсипептид; бензамиды, например MS-275 или CI-994, или депудицен; и другие вещества. Для лечения рака соединения по настоящему изобретению можно вводить пациенту так, как описано выше, в сочетании с облучением. Облучение означает обработку ионизирующим излучениеми и, в частности, гамма-излучением, в особенности, испускаемым линейными ускорителями или радионуклеидами, которые обычно применяют в настоящее время. Облучение опухоли радионуклеидами может быть наружным или внутренним. Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению противоракового средства и ингибитора HDAC по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению для применения в лекарственной терапии, например для ингибирования роста опухолевых клеток. Настоящее изобретение также относится к сочетаниям по изобретению для ингибирования роста опухолевых клеток. Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у человека, включающему введение субъекту эффективного количества сочетания по изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования аномального роста клеток, в том числе трансформированных клеток путем введения эффективного количества сочетания по изобретению. Другое лекарственное средство и ингибитор HDAC можно вводить одновременно (например, в отдельных или в единых композициях) или последовательно в любом порядке. В последнем случае два соединения будут вводиться в течение периода и в количестве и способом, которые достаточны для того,чтобы иметь уверенность, что достигается благоприятный или синергический эффект. Следует иметь в- 14007270 виду, что предпочтительный способ и порядок введения и соответствующие дозировочные количества и режимы для каждого компонента сочетания будут зависеть от конкретных вводимых другого лекарственного средства и ингибитора HDAC, способа их введения, конкретной опухоли, от которой лечат, и конкретного хозяина, которого лечат. Оптимальный способ и порядок введения и соответствующие дозировочные количества и режим могут легко определить специалисты в данной области техники с использованием обычных методов и с учетом изложенной в данном описании информации. Координационное соединение платины выгодно вводить в дозировке 1-500 мг на квадратный метр(мг/м 2) площади поверхности тела, например 50-400 мг/м 2, в частности, в случае цисплатина в дозировке примерно 75 мг/м 2 и в случае карбоплатина примерно 300 мг/м 2 на курс лечения. Таксановое соединение выгодно вводить в дозировке 50-400 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 75-250 мг/м 2, в частности, в случае паклитаксела в дозировке примерно 175-250 мг/м 2 и в случае доцетаксела примерно 75-150 мг/м 2 на курс лечения. Камптотециновое соединение выгодно вводить в дозировке 0,1-400 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 1-300 мг/м 2, в частности, в случае иринотекана в дозировке примерно 100-350 мг/м 2 и в случае топотекана примерно 1-2 мг/м 2 на курс лечения. Противоопухолевое производное подофиллотоксина выгодно вводить в дозировке 30-300 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 50-250 мг/м 2, в частности, в случае этопозида в дозировке примерно 35-100 мг/м 2 и в случае тенипозида примерно 50-250 мг/м 2 на курс лечения. Противоопухолевый алкалоид растения барвинок выгодно вводить в дозировке 2-30 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, в частности, в случае винбластина в дозировке примерно 312 мг/м 2, в случае винкристина в дозировке примерно 1-2 мг/м 2 и в случае винорелбина в дозировке примерно 10-30 мг/м 2 на курс лечения. Противоопухолевое нуклеозидное производное выгодно вводить в дозе 200-2500 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 700-1500 мг/м 2, в частности, в случае 5-FU в дозировке 200-500 мг/м 2, в случае гемцитабина в дозировке примерно 800-1200 мг/м 2 и в случае капецитабина примерно 1000-2500 мг/м 2 на курс лечения. Алкилирующие вещества, такие как горчичный газ или нитрозомочевина, выгодно вводить в дозировке 100-500 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 120-200 мг/м 2, в частности, в случае циклофосфамида в дозировке примерно 100-500 мг/м 2, в случае хлорамбуцила в дозировке примерно 0,1-0,2 мг/кг, в случае кармустина в дозировке примерно 150-200 мг/м 2 и в случае ломустина в дозировке примерно 100-150 мг/м 2 на курс лечения. Противоопухолевое производное антрациклина выгодно вводить в дозировке 10-75 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, например 15-60 мг/м 2, в частности, в случае доксорубицина в дозировке примерно 40-75 мг/м 2, в случае даунорубицина в дозировке примерно 25-45 мг/м 2 и в случае идарубицина в дозировке примерно 10-15 мг/м 2 на курс лечения.Ttastuzumab выгодно вводить в дозировке 1-5 мг на квадратный метр (мг/м 2) площади поверхности тела, в частности 2-4 мг/м 2 на курс лечения. Антиэстрогенное средство выгодно вводить в дозировке примерно 1-100 мг ежесуточно, в зависимости от конкретного средства и состояния, от которого лечат. Тамоксифен выгодно вводить перорально в дозировке 5-50 мг, предпочтительно 10-20 мг, дважды в сутки, при продолжении терапии в течение времени, достаточного для достижения и поддержания лечебного эффекта. Торемифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 60 мг 1 раз в сутки при продолжении терапии в течение времени, достаточного для достижения и поддержания лечебного эффекта. Анастрозол выгодно вводить перорально в дозировке примерно 1 мг 1 раз в сутки. Дролоксифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 20-100 мг 1 раз в сутки. Ралоксифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 60 мг 1 раз в сутки. Экземестан выгодно вводить перорально в дозировке примерно 25 мг 1 раз в сутки. Указанные дозировки можно вводить, например, 1 раз, дважды или большее число раз на курс лечения, который может повторяться примерно каждые 7, 14, 21 или 28 дней. С учетом их полезных фармакологических свойств, компоненты сочетаний по изобретению, т.е. другое лекарственное средство и ингибитор HDAC, можно ввести в разные фармацевтические формы для целей введения. Компоненты можно включить по отдельности в отдельные фармацевтические композиции или в единую фармацевтическую композицию, содержащую оба компонента. Следовательно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей другое лекарственное средство и ингибитор HDAC вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями. Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению в форме фармацевтической композиции, содержащей противораковое средство и ингибитор HDAC по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями. Настоящее изобретение также относится к применению сочетания по изобретению для получения фармацевтической композиции для ингибирования роста опухолевых клеток. Настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему в качестве первого активного ингредиента ингибитор HDAC по изобретению и в качестве второго активного ингредиента противора- 15007270 ковое средство, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении пациентов, страдающих от рака. Экспериментальная часть Далее приводятся примеры в целях иллюстрации. Далее в описании "DCM" означает дихлорметан, "ДМФА" означает диметилформамид, "EtOAc" означает этилацетат, "iPrOH" означает изопропил, "МеОН" означает метанол, "EtOH" означает этанол,"TEA" означает триэтиламин, "ТФК" означает трифторуксусная кислота, "ТГФ" означает тетрагидрофуран, "BSA" означает бычий сывороточный альбумин, "ДМСО" означает диметилсульфоксид и "Hepes" означает 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота.[]D20 указывает оптическое вращение, измеренное в свете при длине волны D-линии натрия при температуре 20 С. Кроме фактического значения указываются концентрация и растворитель для раствора, который используют для измерения оптического вращения. А. Получение промежуточных соединений. Пример А 1. а). Получение Раствор [1,1'-бифенил]-4-сульфонилхлорида (0,016 моль) в DCM (50 мл) при 0 С добавляли по каплям к раствору 4-(фенилметил)-2-морфолинметанамина (0,0145 моль) и TEA (0,023 моль) в DCM (50 мл). Смесь доводили до комнатной температуры, затем перемешивали в течение ночи, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (6 г) кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили, и получали 3,1 г (62%) промежуточного соединения 1, температура плавления 128 С. Смесь промежуточного соединения 1 (0,0071 моль) и Pd/C (0,5 г) в МеОН (50 мл) и уксусной кислоте (5 мл) гидрировали при комнатной температуре в течение 5 сут. под давлением 3 бар и затем фильтровали через целит. Целит промывали смесью DCM/MeOH. Фильтрат упаривали. Остаток (3 г) растворяли в диэтиловом эфире. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали диэтиловым эфиром и сушили и получали 2,6 г (100%) промежуточного соединения 2, температура плавления 151 С. с). Получение Гидрид натрия (60%, 0,014 моль) при 0 С в токе N2 добавляли частями к смеси промежуточного соединения 2 (0,0069 моль) и ТГФ (30 мл). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1 ч. Добавляли по каплям раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,009 моль) в ТГФ(20 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали водой, сушили (MgSO4), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (3 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH, 99/5). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали. Остаток (0,6 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (хиралпак) (элюент СН 3 СN, 100). Собирали две фракции,растворитель выпаривали и получали 0,255 г (8%) промежуточного соединения 3 (А), []D20 = -32,6 (с = 0,00485, ДМФА) и 0,25 г (8%) промежуточного соединения 4 (В), []D20 = +33,8 (с = 0,005, ДМФА). Пример А 2. а). Получение Тетрагидроалюминат(1-) лития (0,04 моль) при 5 С в токе N2 добавляли по частям к ТГФ (40 мл). Добавляли по каплям раствор этилового эфира 1-бензил-4-трифенилметилпиперазин-2-карбоновой кислоты (0,01 моль) в ТГФ (40 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч, выливали в смесь EtOAc/вода и фильтровали через целит. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель и получали 4,05 г промежуточного соединения 5. Полученный продукт использовали непосредственно на следующей стадии реакции. Раствор бис(1-метилэтилового) эфира диазендикарбоновой кислоты (0,0097 моль) в ТГФ (10 мл) при 5 С в токе N2 добавляли по каплям к раствору промежуточного соединения 5 (0,0064 моль), 1 Низоиндол-1,3(2 Н)-диона (0,0097 моль) и трифенилфосфина (0,0097 моль) в ТГФ (50 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировалиEtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (11 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/EtOAc, 99/1). Чистые фракции собирали, растворитель выпаривали, и получали 2,8 г (75%) промежуточного соединения 6, температура плавления 100 С. с). Получение Моногидробромид гидразина (0,005 моль) добавляли к раствору промежуточного соединения 6(0,0025 моль) в EtOH (25 мл). Смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч и затем охлаждали до комнатной температуры. Растворитель выпаривали. Остаток обрабатывали раствором NaCl и экстрагировали смесью EtOAc/DCM. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель, и получали 3,55 г промежуточного соединения 1. Полученный продукт использовали непосредственно на следующей стадии реакции. Смесь промежуточного соединения 7 (0,0025 моль), 2-нафталинсульфонилхлорида (0,0027 моль) иTEA (0,004 моль) в DCM (20 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (3,8 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (1540 мкм) (элюент DCM/EtOAc, 98/2). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток (0,8 г) кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,693 г (41%) промежуточного соединения 8, температура плавления 219 С. е). Получение Смесь промежуточного соединения 8 (0,0009 моль) в 12 н. НСl (0,6 мл) и 2-пропанона (18 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривали растворитель. Остаток обрабатывали водой. Водный слой промывали диэтиловым эфиром, подщелачивали карбонатом калия и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (0,5 г) кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили. Остаток (0,38 г) обрабатывали смесью вода/EtOAc. Органический слой упаривали. Остаток обрабатывали диэтиловым эфиром. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,044 г (48%) промежуточного соединения 9, температура плавления 210 С. Этиловый эфир 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0029 моль) при комнатной температуре добавляли к раствору промежуточного соединения 9 (0,002 моль) и карбоната калия(0,007 моль) в ацетонитриле (50 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч,затем перемешивали при 80 С в течение ночи, охлаждали до комнатной температуры, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (2 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) Раствор 2-нафталинсульфонилхлорида (0,016 моль) в DCM (50 мл) при 0 С в токе N2 добавляли по каплям к раствору (4-фенилметил)-2-морфолинметанамина (0,015 моль) и TEA (0,024 моль) в DCM (50 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель и получали 6 г (100%) промежуточного соединения 11. Полученный продукт использовали непосредственно на следующей стадии реакции. Раствор 1-хлорэтилового эфира хлоругольной кислоты (0,016 моль) в 1,2-дихлорэтане (2 мл) при комнатной температуре добавляли к смеси промежуточного соединения 11 (0,014 моль) и 1,2 дихлорэтана (48 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин и затем при 80 С в течение 3 ч. Добавляли МеОН (100 мл). Смесь перемешивали при 80 С в течение 4 сут., выливали в воду и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (3,5 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм)(элюент DCM/MeOH/NH4OH, 92/8/0,5). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток(0,38 г, 9%) кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,21 г промежуточного соединения 12, температура плавления 140 С. Пример А 4. а). Получение Раствор [1,1'-бифенил]-4-карбонилхлорида (0,016 моль) в DCM (50 мл) при 0 С добавляли по каплям к раствору 4-(фенилметил)-2-морфолинметанамина (0,0145 моль) и TEA (0,023 моль) в DCM (50 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, промывали 10% раствором карбоната калия, сушили(МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (6,2 г) кристаллизовали из смеси СН 3 СN/диэтиловый эфир. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили. Маточный раствор упаривали. Остаток (3,3 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент(27%) вещества. Фракцию (0,39 г) кристаллизовали из смеси СН 3 СN/диэтиловый эфир. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,12 г промежуточного соединения 13, температура плавления 133 С. 1-Хлорэтиловый эфир хлоругольной кислоты (0,0066 моль) при комнатной температуре добавляли к смеси промежуточного соединения 13 (0,006 моль) и 1,2-дихлорэтана (35 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин и затем перемешивали при 80 С в течение 3 ч. Добавляли МеОН (60 мл). Смесь перемешивали при 80 С в течение 8 сут. и затем охлаждали до комнатной температуры. Растворитель выпаривали и добавляли EtOAc. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали,промывали диэтиловым эфиром и сушили и получали 1,8 г (100%) промежуточного соединения 14, температура плавления 284 С. Пример А 5. а). Получение Раствор 2-нафталинкарбонилхлорида (0,017 моль) в DCM (60 мл) при 0 С добавляли по каплям к смеси(4-фенилметил)-2-морфолинметанамина (0,015 моль) и TEA (0,026 моль) в DCM (60 мл). Смесь доводили до комнатной температуры в течение ночи и выливали в смесь воды со льдом. Органический слой отделяли, промывали 10% раствором карбоната калия, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из смеси диэтиловый эфир/DIPE. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, сушили и получали 4,6 г (85%) промежуточного соединения 15, температура плавления 104 С. Смесь промежуточного соединения 15 (0,0109 моль) и Pd/C (2 г) в МеОН (80 мл) и уксусной кислоте (8 мл) гидрировали при комнатной температуре в течение 4 сут. под давлением 3 бар и затем фильтровали через целит. Целит промывали смесью MeOH/DCM. Фильтрат упаривали. Остаток (7,2 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH/NH4OH, 97/3/0,1). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,8 г промежуточного соединения 16. Пример А 6. а). Получение- 19007270 Раствор 2-нафталинсульфонилхлорида (0,011 моль) в DCM (5 мл) при 5 С добавляли к смеси 1,1 диметилэтилового эфира 3-(аминометил)-1-пиперидинкарбоновой кислоты (0,01 моль) и TEA (0,014 моль) в DCM (15 мл). Смесь перемешивали при 20 С в течение 18 ч. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель досуха и получали 4,6 г (100%) промежуточного соединения 17. Смесь промежуточного соединения 17 (0,0089 моль) и 5 н. HCl/iPrOH (40 мл) перемешивали при 50 С в течение 15 мин и подщелачивали NH4OH. Выпаривали растворитель досуха. Остаток растворяли в DCM и раствор фильтровали. Фильтрат сушили (MgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель досуха и получали 2,9 г (100%) промежуточного соединения 18. Пример А 7. а). ПолучениеN-(Фенилметил)бензолметанамин (1 моль) растворяли в диэтиловом эфире и превращали в соль хлороводородной кислоты (1:1) с помощью 6 н. раствора НСl в 2-пропаноле. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 234 г вещества, которое добавляли к этиловому эфиру 4-оксо 1-пиперидинкарбоновой кислоты и (СН 2O)n (30 г) в уксусной кислоте (1600 мл). Смесь перемешивали в течение 110 мин при 60-65 С, затем охлаждали до комнатной температуры и выливали в смесь лед/вода/NH4 ОН. Полученный белый маслянистый осадок экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили (MgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель при комнатной температуре и получали 436 мг промежуточного соединения 19.(1500 мл). Добавляли по частям часть гидробората натрия, причем происходит экзотермическое повышение температуры до 30 С. Поэтому реакционную смесь охлаждали на бане со смесью воды со льдом и добавляли еще гидроборат натрия (в целом 1,5 моль), в то же время сохраняя температуру реакционной смеси 16 С. Реакционную смесь перемешивали в течение одного часа при 16 С. Смесь концентрировали до половины первоначального объема выпариванием. Концентрат охлаждали. Добавляли воду. Смесь концентрировали далее (сильное пенообразование) до тех пор, пока не выпарится весь этанол. Водный концентрат охлаждали и затем экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Маслянистый остаток растворяли в DIPE и обрабатывали раствором HCl/2-пропанол. Образовывался липкий осадок. Растворитель выпаривали. Остаток суспендировали в горячем ацетонитриле, затем смесь охлаждали и выпавшее в осадок вещество удаляли фильтрацией. Фильтрат упаривали. Остаток растворяли в воде, подщелачивалиNH4OH и затем экстрагировали диэтиловым эфиром. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4),фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (267 г) разделяли ВЭЖХ (элюент толуол/этанол,98,5/1,5). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Одну из фракций кристаллизовали из ацетонитрила, отфильтровывали и сушили и получали 107 г промежуточного соединения 20 (ТРАНС). с). Получение Смесь промежуточного соединения 20 (0,01 моль) и Pd/C (1,5 г) в EtOH (200 мл) гидрировали при 50 С в течение ночи при давлении 3 бар и затем фильтровали через целит. Фильтрат упаривали досуха и получали 2,1 г (100%) промежуточного соединения 21. Раствор 2-нафталинсульфонилхлорида (0,0054 моль) в DCM (2 мл) при 5 С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 21 (0,0049 моль) и TEA (0,0069 моль) в DCM (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Смесь экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали, выпаривали растворитель досуха и получали 2 г (100%) промежуточного соединения 22 (ТРАНС). е). Получение Смесь промежуточного соединения 22 (0,0043 моль) и 6 н. НСl (20 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч. Выпаривали растворитель досуха. Остаток подщелачивали 3 н. раствором NaOH. Добавляли EtOAc. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали диэтиловым эфиром и сушили и получали 1,37 г (97%) промежуточного соединения 23 (ТРАНС). В. Получение конечных соединений. Пример В 1. а). Получение Смесь промежуточного соединения 4 (0,0004 моль) и NaOH (0,0008 моль) в EtOH (10 мл) перемешивали при 80 С в течение 48 ч и затем охлаждали до комнатной температуры. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали диэтиловым эфиром и сушили и получали 0,188 г (90%) промежуточного соединения 24 (В) Na. Раствор моногидрохлорида N'-(этилкарбонимидоил)-N,N-диметил-1,3-пропандиамина (0,0005 моль) в DCM (5 мл) и затем раствор 1-гидрокси-1 Н-бензотриазола (0,0005 моль) в ТГФ (5 мл) при комнатной температуре добавляли к смеси промежуточного соединения 24 (0,0003 моль) и О-(тетрагидро-2 Н-пиран 2-ил)гидроксиламина (0,0005 моль) в DCM (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, выливали в воду и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4),- 21007270 фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (0,29 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (10 мкм) (элюент DCM/MeOH, 99/1). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,142 г (66%) промежуточного соединения 25 (В). с). Получение Смесь промежуточного соединения 25 (В) (0,0002 моль) в ТФК (1 мл) и МеОН (15 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 сут. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили. Остаток (0,08 г) растворяли в МеОН/СН 3 СN. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали МеОН, затем диэтиловым эфиром и сушили и получали 0,046 г соединения 1 (В), []D20 = +32,85 (с= 0,0047, ДМФА), температура плавления 164 С. Пример В 2. Получение Смесь промежуточного соединения 10 (0,0088 моль) и 10% Pd/C (1,3 г) в уксусной кислоте (2 мл) иEtOH (200 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 9 сут. при давлении 3 бар и затем фильтровали через целит. Фильтрат упаривали досуха. (Смесь фильтровали через целит. Фильтрат упаривали досуха.) Остаток растворяли в DCM. Органический слой промывали 10% раствором карбоната калия, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (2,7 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент толуол/iРrОН/NН 4OН, 90/10/0,2). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,29 г (8%) промежуточного соединения 26. Промежуточное соединение 26 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,065 г (51%) соединения 2, температура плавления 243 С. Гидрид натрия (60%, 0,0059 моль) при 0 С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 2 (0,0039 моль) и ТГФ (15 мл). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1 ч. Добавляли по каплям- 22007270 раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0051 моль) в ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали при 0 С в течение 2 ч, затем в течение 2 ч доводили до комнатной температуры, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили(МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (2 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH/NH4OH, 97/3/0,1). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,075 г промежуточного соединения 27, температура плавления 170 С. Промежуточное соединение 27 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,236 г (64%) соединения 4, температура плавления 163 С. Гидрид натрия (60%, 0,0043 моль) при 0 С в токе N2 добавляли по частям к смеси промежуточного соединения 2 (0,0036 моль) и этилового эфира 6-хлор-3-пиридинкарбоновой кислоты (0,0047 моль) в ДМФА (20 мл). Смесь перемешивали при 90 С в течение 12 ч, затем охлаждали до комнатной температуры и выливали в смесь воды со льдом. Добавляли EtOAc. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали водой, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (1,7 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/EtOAc, 85/15, затемDCM/MeOH/NH4OH, 97/3/0,1). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток (0,42 г) кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,36 г (22%) промежуточного соединения 28, температура плавления 186 С. Промежуточное соединение 28 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,155 г (62%) соединения 5, температура плавления 210 С. Гидрид натрия (0,0032 моль) при 0 С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 12(0,0016 моль) и ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. При 0 С добавляли по каплям раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты(0,0019 моль) в ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли лед и EtOAc. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали,и выпаривали растворитель. Остаток (0,75 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH, 99/1). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,22 г Гидрид натрия (60%, 0,0052 моль) при 0 С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 12 (0,0026 моль) и ДМФА (20 мл). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1 ч. При 0 С добавляли по каплям раствор этилового эфира 6-хлор-3-пиридинкарбоновой кислоты (0,0034 моль) в ДМФА (10 мл). Смесь доводили до комнатной температуры, затем перемешивали при 90 С в течение 12 ч, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой промывали водой, сушили (MgSO4),фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (1,4 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент циклогексан/EtOAc, 60/40). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель, и получали 0,5 г (42%) промежуточного соединения 30. Промежуточное соединение 30 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,23 г (66%) соединения 7, температура плавления 157 С. Смесь промежуточного соединения 14 (0,003 моль), этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5 пиримидинкарбоновой кислоты (0,004 моль) и карбоната калия (0,0061 моль) в ацетонитриле (30 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, выливали в воду и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (1,4 г) кристаллизовали из смеси СН 3 СN/диэтиловый эфир. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 1,1 г (79%) промежуточного соединения 31, температура плавления 184 С. Промежуточное соединение 31 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,156 г (47%) соединения 8, температура плавления 290 С.- 24007270 Гидрид натрия (0,0044 моль) при 0 С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 16(0,0022 моль) и ТГФ (15 мл). Смесь перемешивали при 0 С в течение 1 ч. Добавляли по каплям раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0029 моль) в ТГФ (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, выливали в воду и экстрагировалиEtOAc. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (1 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH/NH4OH,97/3/0,1). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,58 г (90%) промежуточного соединения 32. Промежуточное соединение 32 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,091 г (50%) соединения 9, температура плавления 246 С. Гидрид натрия (60% в масле, 0,0042 моль) при 5 С в токе N2 добавляли по частям к смеси промежуточного соединения 18 (0,0032 моль) и ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин. Добавляли раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0039 моль) в ТГФ (2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Смесь экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель досуха. Остаток (1,6 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент от DCM, 100, до DCM/MeOH, 98/2). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,9 г (60%) промежуточного соединения 33. Промежуточное соединение 33 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,19 г (50%) соединения 10, температура плавления 210 С. Гидрид натрия (0,0102 моль) при 5 С в токе N2 добавляли по частям к смеси промежуточного соединения 23 (0,004 моль) и ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч. Добавляли раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0053 моль) в ТГФ (5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Смесь экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (МgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель досуха. Остаток (1,1 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент DCM/MeOH/NH4OH, 95/5/0,1). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 0,17 г (9%) промежуточного соединения 34, температура плавления 189 С. Промежуточное соединение 34 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В 1], и получали 0,194 г (68%) соединения 11 (ТРАНС), температура плавления 176 С. В табл. F-1 перечисляются соединения, полученные согласно одному из приведенных выше примеров. В таблицах используются следующие аббревиатуры: .С 2 НF3O2 указывается в случае соли трифторацетата, соед.означаетсоединения, пp.[B] относится к такому же способу, какой описан в примерах В. Некоторые соединения характеризуются температурой плавления (т.пл.). Таблица F-1 С. Фармакологический пример. С помощью анализа in vitro на ингибирование гистондеацетилазы (см. пример C.1) измеряют ингибирование ферментативной активности HDAC, полученное с соединениями формулы (I).- 26007270 Клеточную активность соединений формулы (I) определяли на клетках опухоли А 2780 с использованием колориметрического анализа на клеточную токсичность или выживание (Mosmann Tim, Journal ofImmunological Methods, 65:55-63, 1983) (см. пример С.2). Кинетическая растворимость в водных средах определяет способность соединения оставаться в водном растворе после разведения (см. пример С.3). Исходные растворы в ДМСО разводят одним водным растворителем - буфером в 3 последовательные стадии. Для каждого разведения измеряют мутность нефелометром. Метаболизм лекарственных средств означает, что жирорастворимое соединение - ксенобиотик или эндобиотик ферментативно трансформируется в (а) полярный(е) водорастворимый(е) и экскретируемый(е) метаболит(ы). Основным органом для метаболизма лекарственных средств является печень. Продукты метаболизма часто менее активны, чем исходное лекарственное средство, или неактивны. Однако некоторые метаболиты могут обладать усиленной активностью или токсическим действием. Таким образом, метаболизм лекарственных средств может включать процессы как "детоксикации", так и "токсикации". Одну из главных ферментативных систем, определяющих способность организма обращаться с лекарственными средствами или химикатами, представляют цитохром-Р 450-монооксигеназы, которые являются NADPH-зависимыми ферментами. Метаболическую устойчивость соединений можно определить in vitro с использованием субклеточной ткани человека (см. пример С.4). В данном описании метаболическая устойчивость соединений выражается в % лекарственного средства, претерпевшего метаболизм после 15-минутной инкубации указанных соединений с микросомами. Количественно соединения определяют анализом методом ЖХ-МС. Супрессор опухолей р 53 транскрипционно активирует ряд генов, в том числе ген WAF1/CIP1, в ответ на повреждение ДНК. Продукт гена WAF1 в 21 кДа обнаружен в комплексе, включающем циклины,циклинзависимые киназы (CDK) и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), в нормальных клетках, но не в трансформированных клетках, и, как оказалось, является универсальным ингибитором активности CDK. Одним из следствий связывания p21WAF1 с CDK и ингибирования CDK является предотвращение CDK-зависимого фосфорилирования и последующей инактивации белка Rb, который важен для развития клеточного цикла. Следовательно, индукция p21WAF1 в ответ на контакт клеток с ингибитором HDAC является сильным и специфическим индикатором ингибирования развития клеточного цикла в обеих контрольных точках G1 и G2. Способность соединений индуцировать p21WAF1 измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на p21WAF1 (WAF1 ELISA of Oncogene). Анализ на p21WAF1 является "сэндвич"иммуноферментным анализом с использованием как мышиных моноклональных, так и кроличьих поликлональных антител. Кроличьи поликлональные антитела, специфические для человеческого белкаWAF1, иммобилизовали на поверхности пластиковых лунок, имеющихся в наборе. Любое количествоp21WAF1, имеющееся в анализируемом образце, будет связываться с иммобилизованными антителами. Биотинилированные идентифицирующие моноклональные антитела также узнают человеческий белокp21WAF1 и будут связываться с любым p21WAF1, который удерживается иммобилизованными антителами. Идентифицирующие антитела, в свою очередь, связываются со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой из хрена. Пероксидаза из хрена катализирует конверсию хромогенного субстрата тетраметилбензидина от бесцветного раствора до раствора синего цвета (или желтого после добавления стоп-реагента), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству белка p21WAF1, связанного с планшетом. Продукт цветной реакции определяют количественно с использованием спектрофотометра. Количество определяют, строя стандартную кривую с использованием известных концентрацийp21WAF1 (предоставляемого в лиофилизованном виде) (см. пример С.5). Пример C.1. Анализ in vitro на ингибирование гистондеацетилазы. Экстракты ядер HeLa (поставщик Biomol) инкубировали при 60 мкг/мл с 210-8 М меченного радиоактивными изотопами пептидного субстрата. В качестве субстрата для измерения активности HDAC использовали синтетический пептид, т.е. аминокислоты 14-21 гистона Н 4. Субстрат биотинилировали в NН 2 концевой части со спейсером - 6-аминогексановой кислотой, защищают в СООН-концевой части амидогруппой и специфически [3 Н]-ацетилируют в лизине 16. Субстрат биотин-(6-аминогексановая)Gly-Ala([3H]-aцeтил-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2) добавляли в буфер, содержащий 25 мМ Hepes, 1 М сахарозы,0,1 мг/мл BSA и 0,01% Тритона Х-100, при рН 7,4. Через 30 мин реакцию деацетилирования обрывали,добавляя НСl и уксусную кислоту (конечные концентрации 0,035 и 3,8 мМ соответственно). После остановки реакции свободный 3H-ацетат экстрагировали этилацетатом. После перемешивания и центрифугирования определяли радиоактивность в аликвоте верхней (органической) фазы в счетчике -частиц. Для каждого эксперимента проводили параллельно инкубацию контролей (содержащих экстракт ядер HeLa и ДМСО без соединения), "пустышек" (содержащих ДМСО, но без экстракта ядер HeLa и соединения) и образцов (содержащих соединение, растворенное в ДМСО, и экстракт ядер HeLa). В первом случае соединения испытывали в концентрации 10-5 М. Когда соединения демонстрируют активность при 10-5 М, строили кривую зависмости ответа от концентрации, где соединения испытывали в концентрациях от 10-5 до 10-12 М. В каждом испытании величину для пустышки вычитали из величин как для- 27007270 контроля, так и для образца. Контрольный образец представлял 100% деацетилирование субстрата. Для каждого образца радиоактивность выражали как процент от средней величины для контроля. В соответствующих случаях величины IC50 (концентрация лекарственного средства, необходимая для снижения количества метаболитов на 50% от контроля) вычисляли с использованием пробит-анализа для сортируемых данных. В данном случае действие испытываемых соединений выражают в виде pIC50 (значение кологарифма величины IС 50). Все испытываемые соединения имели рIС 50 7 (см. табл. F-2). Пример С.2. Определение антипролиферативной активности на клетках А 2780. Все испытываемые соединения растворяли в ДМСО и затем получали разведения в культуральной среде. Конечные концентрации ДМСО в анализах на пролиферацию клеток никогда не превышали 0,1%(об./об.). Контрольные образцы содержали клетки А 2780 и ДМСО без соединения и пустышки содержали ДМСО, но без клеток. МТТ растворяли в PBS в концентрации 5 мг/мл. Получали глициновый буфер,содержащий 0,1 М глицина и 0,1 М NaCl, забуференный до рН 10,5 NaOH (1 н.) (все реагенты от Merck). Клетки карциномы яичников человека А 2780 (получены в дар от Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase CancerCentre, Pensilvania, USA]) культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки обычным способом поддерживали в монослойных культурах при 37 С в увлажненной атмосфере с 5% СO2. Клетки пересевали 1 раз в неделю с использованием раствора трипсин/ЭДТК при отношении разделения 1:40. Все среды и добавки получали от Life Technologies. Клетки были свободны от загрязнения микоплазмами, при определении с использованием набора Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture kit (поставщик BioMrieux). Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты NUNC (поставщик Life Technologies) и оставляли прилипать к пластику на ночь. Используемая при высевании плотность клеток составляла 1500 клеток на лунку при общем объеме среды 200 мкл. После того, как клетки прилипнут к планшетам, среду заменяли и добавляли лекарственные средства и/или растворители до конечного объема 200 мкл. После четырехсуточной инкубации среду заменяли 200 мкл свежей среды, и анализировали плотность и жизнеспособность клеток с использованием анализа на основе МТТ. В каждую лунку добавляли 25 мкл раствора МТТ, и затем клетки инкубировали в течение 2 ч при 37 С. Затем среду осторожно отсасывали и синий продукт МТТ-формазан растворяли, добавляя 25 мкл глицинового буфера и затем 100 мкл ДМСО. Тестируемые микропланшеты встряхивали в течение 10 мин на планшетном шейкере и измеряли поглощение при 540 нм с использованием спектрофотометра для чтения 96-луночных планшетов Emax (поставщик Sopachem). В рамках эксперимента результаты для каждого условия эксперимента являются средними результатами повторения в 3 лунках. Для целей начального скрининга соединения испытывали в одной установленной концентрации 10-6 М. В случае активных соединений эксперименты повторяли для построения полных кривых зависимости ответа от концентрации. Для каждого эксперимента параллельно проводили инкубацию контрольных образцов (не содержащих лекарственного средства) и пустышек (не содержащих ни клеток, ни лекарственного средства). Величину для пустышки вычитали из величин для всех контролей и образцов. Для каждого образца среднюю величину роста клеток (в единицах поглощения) выражали в виде процента от средней величины роста клеток для контроля. В соответствующем случае величины IC50 (концентрация лекарственного средства, необходимая для снижения роста клеток на 50% от контроля) вычисляли с использованием пробит-анализа для сортируемых данных (Finnely D.J.,Probit Analyses, 2nd Ed., Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge, 1962). В данном случае действие испытываемых соединений выражают в виде pICso (значение кологарифма величины IC50). Большинство испытываемых соединений показывали клеточную активность при испытываемой концентрации 10-6 М, и 12 соединений имели рIС 50 5 (см. табл. F-2). Пример С.3. Кинетическая растворимость в водных средах. На первой стадии разведения 10 мкл концентрированного исходного раствора активного соединения в ДМСО (5 мМ) добавляли к 100 мкл фосфатцитратного буфера, рН 7,4 и перемешивали. На второй стадии разведения аликвоту (20 мкл) раствора с первой стадии разведения также распределяли в 100 мкл фосфатцитратного буфера, рН 7,4 и перемешивали. Наконец, на третьей стадии разведения образец (20 мкл) раствора со второй стадии разведения также разводили в 100 мкл фосфатцитратного буфера, рН 7,4,и перемешивали. Все разведения осуществляли в 96-луночных планшетах. Сразу же после последней стадии разведения с помощью нефелометра измеряли мутность трех полученных растворов с последовательных стадий разведения. Разведение повторяли трижды для каждого соединения для того, чтобы исключить случайные ошибки. На основании измерений мутности осуществляли разделение на 3 класса. Соединениям с высокой растворимостью ставили оценку 3, и для таких соединений раствор после первого разведения прозрачный. Соединения со средней растворимостью получали оценку 2. В случае таких соединений раствор после первого разведения непрозрачный, а после второго разведения прозрачный. Соединения с низкой растворимостью получали оценку 1, и в случае таких соединений раствор как после первого, так и после второго разведения непрозрачный. Измеряли растворимость 11 соединений. Оценку 3 получили шесть соединений, два соединения продемонстрировали оценку 2, и три соединения продемонстрировали оценку 1 (см. табл. F-2).- 28007270 Пример С.4. Метаболическая устойчивость. Субклеточные препараты получали согласно Gorrod et al. (Xenobiotica, 5:453-462, 1975) путем разделения на центрифуге после механической гомогенизации ткани. Ткань печени ополаскивали в охлажденном на льду буфере 0,1 М Трис-НСl (рН 7,4) для отмывания избытка крови. Затем ткань сушили, промокая, взвешивали и нарезали на крупные куски хирургическими ножницами. Куски ткани гомогенизировали в 3 объемах охлажденного на льду 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) с использованием или Potter-S (Braun, Италия), снабженного тефлоновым пестиком, или гомогенизатора Sorvall Omni-Max, в течение 710 с. В обоих случаях во время процесса гомогенизации сосуд держали во/на льду. Гомогенаты ткани центрифугировали при 9000 х g в течение 20 мин при 4 С с использованием центрифуги Sorvall или ультрацентрифуги Beckman. Полученный супернатант хранили при -80 С и обозначали "S9". Затем фракцию S9 можно центрифугировать далее при 100000 х g в течение 60 мин (4 С) с использованием ультрацентрифуги Beckman. Полученный супернатант осторожно отсасывали, делили на аликвоты и обозначали "цитозоль". Осадок ресуспендировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в конечном объеме 1 мл на 0,5 г массы исходной ткани и обозначали "микросомы". Все субклеточные фракции делили на аликвоты, сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80 С до применения. Для испытываемых образцов смесь для инкубации содержала РВS (0,1 М), соединение (5 мкМ),микросомы (1 мг/мл) и NADPH-генерирующую систему (0,8 мМ глюкозо-6-фосфата, 0,8 мМ хлорида магния и 0,8 единиц глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы). Контрольные образцы содержали те же вещества, но микросомы заменяли микросомами, инактивированными нагреванием (10 мин при 95 С). Извлечение соединений в контрольных образцах всегда составляло 100%. Смеси предварительно инкубировали в течение 5 мин при 37 С. Реакцию начинали в момент времени ноль (t=0), добавляя 0,8 мМ NADP, и образцы инкубировали в течение 15 мин (t=15). Реакцию обрывали, добавляя 2 объема ДМСО. Затем образцы центрифугировали в течение 10 мин при 900 х g, и супернатанты хранили до анализа при комнатной температуре не более 24 ч. Все инкубации повторяли дважды. Анализ супернатантов осуществляли методом ЖХ-МС. Элюирование образцов осуществляли наXterra M3 С 18 (504,6 мм, 5 мкм, Waters, США). Использовали систему ВЭЖХ Alliance 2790 (поставщик Waters, США). Элюировали буфером А (25 мМ ацетата аммония (рН 5,2) в смеси Н 2 О/ацетонитрил(95/5, причем растворителем В является ацетонитрил и растворителем С - метанол, при скорости потока 2,4 мл/мин. Используют градиент - возрастание концентрации органической фазы от 0% через 50% В и 50% С за 5 мин до 100% В за 1 мин при линейном изменении, и концентрацию органической фазы поддерживали постоянной еще в течение 1,5 мин. Общий объем загрузки образцов составлял 25 мкл. В качестве детектора использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр Quattro (поставщикMicromass, Manchester, UK), снабженный источником ESI. Температуру источника и десольватации устанавливали в 120 и 350 С, соответственно, и использовали азот в качестве распыляющего и осушающего газа. Данные получали в положительном режиме (реакция одного иона). Пик напряжения устанавливали в 10 В, и время пребывания составляло 1 с. Метаболическую устойчивость выражали в % метаболизма соединения после 15-минутной инкубации в присутствии активных микросом(Е(акт (% метаболизма = 100%Соединения, имеющие процент метаболизма менее 20, определяли как высокоустойчивые к метаболизму. Соединения, претерпевающие метаболизм на уровне от 20 до 70%, определяли как промежуточно устойчивые, и соединения, демонстрирующие процент метаболизма свыше 70, определяли как слабоустойчивые к метаболизму. Когда бы ни осуществлялась проверка на метаболическую устойчивость, всегда включали три эталонных соединения. Верапамил включали в качестве соединения с низкой метаболической устойчивостью (% метаболизма = 73%). Цизаприд включали как соединение со средней метаболической устойчивостью (% метаболизма = 45%), и пропанол включали как соединение с метаболической устойчивостью от промежуточной до высокой (25% метаболизма). Указанные эталонныеcоединения использовали для проверки достоверности анализа на метаболическую устойчивость. Испытывали десять соединений. Шесть соединений имели процент метаболизма менее 20, и четыре соединения имели процент метаболизма между 20 и 70. Пример С.5. Индуцирующая способность в отношении р 21. Для определения уровня экспрессии белка р 21 в клетках карциномы яичников человека А 2780 применяли следующий протокол. Клетки А 2780 (20000 клеток/180 мкл) высевали в 96-луночные планшеты в среде RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. За 24 ч до лизиса клеток добавляли соединения в конечных концентрациях 10-5, 10-6, 10-7 и 10-8 М. Все испытываемые соединения растворяли в ДМСО, и затем осуществляли разведения в культуральной- 29007270 среде. Через 24 ч после добавления соединений супернатанты удаляли из клеток. Клетки промывали 200 мкл охлажденного на льду PBS. Содержимое лунок отсасывали, и добавляли 30 мкл буфера для лизиса(50 мМ ТрисНСl (рН 7,6), 150 мМ NaCI, 1% Nonidet p40 и 10% глицерина). Планшеты инкубировали в течение ночи при -70 С. Соответствующее число титрационных микролунок извлекали из мешочка из фольги и помещали в свободный держатель для лунок. Получали рабочий раствор (1 х) буфера для промывки (20 х концентрат для промывки планшетов: 100 мл 20-кратного концентрированного раствора PBS и поверхностноактивного вещества, содержит 2% хлорацетамида). Лиофилизованный эталонный p21WAF восстанавливали дистиллированной Н 2O и затем разводили разбавителем для образцов (имеющимся в наборе). Образцы получали разведением их 1:4 в разбавителе для образцов. Образцы (100 мкл) и эталоныp21WAF1 (100 мкл) переносили пипеткой в соответствующие лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки промывали 3 раза 1 х буфером для промывки, и затем в каждую лунку добавляли пипеткой 100 мкл реагента идентифицирующих антител (раствор биотинилированных моноклональных антител к p21WAF1). Лунки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем три раза промывали 1 х буфером для промывки. Разводили 400 х конъюгат (конъюгат стрептавидина и пероксидазы: 400-кратный концентрированный раствор), и в лунки добавляли по 100 мкл 1 х раствора. Лунки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и затем промывали 3 раза 1 х буфером для промывки и 1 раз дистиллированной Н 2O. Добавляли в лунки раствор субстрата (хромогенного субстрата) (100 мкл), и лунки инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли стоп-раствор в том же порядке, в каком ранее добавляли раствор субстрата. Измеряли поглощение в каждой лунке при двух длинах волн 450/595 нм с использованием спектрофотометра для прочтения планшетов. Для каждого эксперимента параллельно проводили инкубацию контрольных образцов (не содержащих лекарственного средства) и пустышек (не содержащих ни клеток, ни лекарственных средств). Величину для пустышки вычитали из величин для всех контролей и образцов. Для каждого образца величину индукции p21WAF1 (в единицах поглощения) выражали в виде процента от величины дляp21WAF1, присутствующего в контрольных образцах. Индукцию в процентах свыше 130% определяли как существенную индукцию. В данном анализе проверили одиннадцать соединений. Все они показывали существенную индукцию. Таблица F-2 В табл. F-2 приводятся результаты для соединений, которые испытывали согласно примерам C.1, С.2 и С.3.D. Пример композиции: таблетки с пленочным покрытием. Получение сердцевины таблеток. Смесь 100 г соединения формулы (I), 570 г лактозы и 200 г крахмала тщательно перемешивают и затем увлажняют раствором 5 г додецилсульфата натрия и 10 г поливинилпирролидона в примерно 200 мл воды. Влажную порошкообразную смесь просеивают, сушат и снова просеивают. Затем добавляют 100 г микрокристаллической целлюлозы и 15 г гидрированного растительного масла. Все тщательно пе