Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклеотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством вышеуказанных объектов (варианты)
Номер патента: 17611
Опубликовано: 30.01.2013
Авторы: Тиссот Катрин, Кноблох Марлен, Нитш Рогер, Гримм Ян, Эсслингер Кристоф, Хок Кристоф
Формула / Реферат
1. Выделенное антитело, которое специфично связывается с неоэпитопом белка, ассоциированного с расстройством, но, по существу, не узнает указанный белок в его форме, не ассоциированной с расстройством, где указанное расстройство является неврологическим расстройством и указанное антитело связывает бета-амилоидные бляшки, цереброваскулярный амилоид, диффузные бета-амилоидные отложения, нейрофибриллярные клубки, гиперфосфорилированный тау-протеин, положительные на альфа-синуклеин тельца Леви или белковые агрегаты, связанные с дистрофичными нейритами, где указанное антитело или кодирующая его кДНК происходит из B-клеток или клеток памяти, полученных от пациента с отсутствием симптомов, но подверженного риску развития заболевания, или от пациента с необычно стабильным течением заболевания, и где антитело идентифицировано путем связывания с препаратом патологически измененных клеток или ткани с заранее определенными клиническими характеристиками, причем указанное антитело содержит последовательности VH и VL области, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45.
2. Антитело по п.1, которое способно связывать бета-амилоидные фибрилы, но не бета-амилоидные мономеры.
3. Антитело по любому из пп.1, 2, которое выбрано из группы, включающей одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')2 фрагмент.
4. Антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий последовательность аминокислот VH и/или VL области, каждый из которых содержит три гипервариабельных участка (CDR) и где по крайней мере один из шести CDR указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит последовательность аминокислот, как это показано в табл. 4 описания, или включает последовательность аминокислот VH и/или VL области, как показано в табл. 2 и 3 описания.
5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое:
а) специфично связывается с тем же неоэпитопом бета-амилоида, что и антитела сравнения, где антитело сравнения содержит последовательности VH и VL области, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45;
б) конкурентно ингибирует связывание неоэпитопа бета-амилоида и антител сравнения, где антитела сравнения содержат последовательности VH и VL области, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45; или
с) содержит антигенсвязывающий фрагмент, идентичный антигенсвязывающему фрагменту антитела, которое содержит последовательности VH и VL области, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45.
6. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5.
7. Полинуклеотид по п.6, кодирующий, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5.
8. Вектор, включающий полинуклеотид по п.7.
9. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид по п.6 или 7 или вектор по п.8.
10. Способ получения специфично связывающего бета-амилоид антитела или его антигенсвязывающего фрагмента либо по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающего вышеуказанный белок, включающий:
а) культивирование клетки по п.9 и
б) выделение указанной связывающей молекулы, антитела или его связывающего фрагмента либо по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина из культуры.
11. Антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент, кодируемые полинуклеотидом по п.6 или 7 или полученные способом по п.10.
12. Антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5 или 11, которые содержат:
а) детектируемую метку или
б) связаны с лекарственным средством.
13. Антитело или связывающий фрагмент по п.12, в которых указанная детектируемая метка выбрана из группы, включающей фермент, радиоактивный изотоп, флуорофор и тяжелый металл.
14. Композиция, включающая антитело или связывающий фрагмент по любому из пп.1-5, 11 или 13.
15. Композиция, включающая полинуклеотид по п.6 или 7.
16. Композиция, включающая вектор по п.8.
17. Композиция, включающая клетку-хозяин по п.9.
18. Композиция по любому из пп.14-17, которая:
а) является фармацевтической композицией и дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель или
б) является диагностической и дополнительно включает реактивы, обычно применяемые в иммунологических или основанных на нуклеиновых кислотах способах диагностики.
19. Композиция по любому из пп.14-18, которая дополнительно включает дополнительный агент, эффективный для лечения болезни Альцгеймера и выбранный из группы, включающей малые органические молекулы, анти-бета-амилоидное антитело и их комбинации.
20. Композиция по любому из пп.14-19, которая является фармацевтической композицией для лечения неврологического расстройства, характеризующегося аномальным накоплением и/или отложением белка в центральной нервной системе.
21. Композиция по п.20, в которой указанное расстройство выбрано из группы, включающей болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, умеренное когнитивное нарушение, церебральную амилоидную ангиопатию, сосудистую деменцию, мультиинфарктную деменцию, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Крейцфельда-Якоба, кистозный фиброз и болезнь Гоше.
22. Композиция по п.20, в которой введение осуществляют способом, выбранным из группы, включающей внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраперитонеальное, интраназальное, парентеральное введения и введение в виде аэрозоля.
23. Применение антитела или связывающего фрагмента по любому из пп.1-5, 11 или 13 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера.
24. Применение полинуклеотида по п.6 или 7 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.
25. Применение вектора по п.8 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.
26. Применение клетки-хозяина по п.9 для получения фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования болезни Альцгеймера, и/или для снижения выраженности симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, и/или для диагностирования или скрининга организма субъекта на наличие болезни Альцгеймера, и/или для установления риска развития болезни Альцгеймера у субъекта.
27. Применение по любому из пп.23-26, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят способом, выбранным из группы, включающей внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраперитонеальное, интраназальное, парентеральное введения и введение в виде аэрозоля.
Текст
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ, СПЕЦИФИЧНОЙ К БЕЛКУ,АССОЦИИРОВАННОМУ С РАССТРОЙСТВОМ, ИЛИ АНТИТЕЛА ИЛИ ЕГО СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФРАГМЕНТА ИЛИ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА, СВЯЗЫВАЮЩИХ ВЫШЕУКАЗАННЫЙ БЕЛОК (ВАРИАНТЫ),СВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА, АНТИТЕЛО, ЦЕПЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА ИЛИ ИХ СВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ (ВАРИАНТЫ), АНТИГЕН, ПОЛИНУКЛЕОТИД, ВЕКТОР И КЛЕТКА-ХОЗЯИН, ИХ ВКЛЮЧАЮЩИЕ КОМПОЗИЦИЯ И НАБОР И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ ПОСРЕДСТВОМ ВЫШЕУКАЗАННЫХ ОБЪЕКТОВ (ВАРИАНТЫ) Предусмотрены новые специфичные связывающие молекулы, в особенности антитела человека,а также их фрагменты, производные и варианты, которые распознают неоэпитопы связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков, но преобладают в организме пациента в измененной форме и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. Кроме того, описаны фармацевтические композиции, включающие такие связывающие молекулы, антитела и их мимики, и способы обнаружения новых связывающих молекул, которые могут быть или не быть антителами, а также мишени при лечении неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЮНИВЭСЭТИ ОФ ЦЮРИХ (CH) 017611 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к новым специфичным связывающим молекулам, в особенности к антителам человека, а также к их фрагментам, производным и вариантам, которые узнают связанные с заболеванием эпитопы, включая неоэпитопы, белков, которые происходят от нативных эндогенных белков и которые преобладают в организме пациента в измененной форме и/или вне рамок их нормального физиологического контекста. Вдобавок, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим такие связывающие молекулы, антитела и имитирующие их молекулы (мимики), и к способам обнаружения (скрининга) новых связывающих молекул, которые могут быть или не быть антителами,мишенями и лекарственными препаратами, для лечения различных расстройств, в частности неврологических расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, амилоидоз и бета-амилоидная патология. Сведения о предшествующем уровне техники Успешность получения моноклональных антител основывается на эффективном и избирательном(селективном) слиянии стимулированных антигеном B-клеток с линией клеток миеломы мыши с последующим отбором (селекцией) стабильных продуцирующих антитела гибридов, что первоначально было описано у Khler и Milstein, Nature 256 (1975), 495-497. Тем не менее, терапевтической полезности для человека антител мышиного происхождения препятствует отклик антител человека против антител мыши (HAMA) ввиду их нечеловеческого происхождения. Подходы для получения человеческих, или подобных человеческим, моноклональных антител стали доступными благодаря генетической инженерии. Тем не менее, способы, доступные до настоящего времени, имеют недостаток, состоящий в том, что они не подходят для получения антител со свойствами (характеристиками) таковых, продуцируемых в ходе физиологического иммунного ответа человека. Более того, такие антитела могут быть недостаточно специфичными вследствие перекрестной реакции с другими белками и/или целевым белком в условиях нормальной физиологической функции. В случае болезни Альцгеймера или Паркинсона, например, антитела, которые также вступают в перекрестную реакцию с высоким сродством (аффинностью) с физиологическими производными белка-предшественника амилоида (APP) или альфа-синуклеина, рассматриваются как проявляющие побочные эффекты по отношению к нормальным функциям физиологических целевых структур. В этом отношении нежелательное аутоиммунное заболевание, очевидно, будет индуцировано - с трудом предвидимый риск при разработке концепции экспериментов активной иммунизации с участием белковых структур, которые в измененной форме также встречаются физиологически. Побочными эффектами, не связанными со структурой мишени, являются, например, анафилактические реакции, которые ожидаются как нежелательные и опасные побочные эффекты при системном введении экзогенных белков. Согласно недавним открытиям это также может происходить в случае так называемых гуманизированных антител, которые первоначально были разработаны на основе не принадлежащих к человеческому роду организмов, обычно мышей. С другой стороны, активная иммунизация соответствующими патологическими антигенами вызывает значительный риск выработки у пациентов антител и развития Т-клеточных ответов, которые также узнают физиологические варианты таких белков и в результате приводят к опасному и неконтролируемому аутоиммунному ответу. Таким образом, существует необходимость обеспечения агентов, которые специфичны к мишени,участвующей в расстройстве, и которые не отторгаются организмом человека. Сущность изобретения Объектом изобретения является способ идентификации, проверки и получения диагностически и терапевтически полезных связывающих молекул, в особенности антител, которые направлены против патологических вариантов эндогенных белков. В частности, изобретение относится к способу выделения специфичной к связанному с заболеванием белку связывающей молекулы, согласно которому происходит:(a) приведение во взаимодействие образца, полученного от пациента, у которого отсутствуют симптомы, или который клинически необычно стабилен, но который страдает или подвержен риску развития расстройства, с препаратом патологически измененных клеток или тканей с заранее определенными патологическими характеристиками; и(b) идентификация и, возможно, выделение связывающей молекулы, которая связывается с указанным препаратом, но не связывается с соответствующими клетками или тканями без таких патологических характеристик, которые могут быть выделены из здорового субъекта. Известен факт, что, в случае аутоиммунных заболеваний, антитела направлены против аутологических клеток и белков или других соединений, таких как гликолипиды, экспрессируемых указанными клетками, обходя известные механизмы толерантности. Также известен факт, что, в случае эндогенного развития новообразований, может развиться клеточный и гуморальный иммунитет к неопластическим клеткам, и он может таким образом повлиять на эндогенный иммунологический механизм защиты против дегенерации неопластической ткани. В основе создания изобретения лежит неожиданно обнаруженный факт, что антитела могут также быть направлены против патофизиологически значимых вариантов эндогенных белков, в частности против неоэпитопов, которые образуются в процессе патологически измененной транскрипции, трансляции или посттранскрипционной или посттрансляционной модификации, или протеолитического процессинга,-1 017611 или агрегации. Такие антитела направлены против эндогенных белков, которые вследствие их новой структуры, которая отклоняется от нормальной физиологии, становятся патофизиологически значимыми посредством развития патологических эффектов. Ввиду иммунологической толерантности, антитела,связанные с соответствующим иммунным ответом на неоэпитопы в таких патологических вариантах,обычно не вступают в какие-либо перекрестные реакции с физиологически функциональными белками,тем не менее, это противоположно случаю аутоиммунных заболеваний. Это происходит вследствие того,что образование потенциально вступающих в перекрестную реакцию антител специфично подавляется известными механизмами толерантности, тогда как развитие иммунного ответа на патологические неоэпитопы может избежать толерантности. Следовательно, изобретение относится к новому подходу идентификации диагностически, терапевтически и превентивно активных связывающих молекул, особенно антител и фрагментов антител, выделенных из заранее выбранных по симптоматике людей посредством взаимодействия с идентифицируемыми патологическими структурами. Изобретение, таким образом, направлено на антитела или антигенсвязывающие фрагменты и сходные антигенсвязывающие молекулы, которые способны распознавать эпитопы, включая неоэпитопы,связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков и преобладают в организме пациента в измененной форме, например в виде патологического белка и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. Более того, изобретение относится к композициям, включающим указанные антитела, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам применения таких композиций. Более того, при идентификации антител способ согласно изобретению можно применять без учета предшествующей гипотезы об идентичности молекулярных целевых структур для антител, учитывая исключительно связи этих антител с патологически значимыми структурами. Помимо возможности, таким образом, выявить молекулярные целевые структуры, до настоящего времени неизвестные, для конкретных заболеваний, дополнительное преимущество антител, которые исключительно направлены против патологических структур, заключается в том, что на их фармакодинамическую доступность не оказывает негативного влияния связывание с не подвергшимися заболеванию тканями таким образом, чтобы антитело оказывалось забуференным в отношении его концентрации и эффектов разбавления, препятствуя, таким образом, определению терапевтически эффективных концентраций. Более того, антитело и связывающие молекулы согласно изобретению предпочтительно характеризуются тем, что они реагируют с измененной формой связанного с заболеванием белка in vivo или с клеткой или клеточной мембраной и на срезе пораженной болезнью ткани с патологическими характеристиками соответственно, но не реагируют или в значительно меньшей степени реагируют с физиологическим вариантом родственного белка; см. также, например, пример 2. Поскольку изобретение позволяет идентификацию и выделение молекулярных целевых структур из пораженных болезнью клеток и тканей, дополнительный вариант реализации относится к антигену и патологическому белку, т.е. связанному с заболеванием белку соответственно, который связывается специфичным к неоэпитопу антителом согласно изобретению. Особенно предпочтительным вариантом реализации является антитело человека, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое проявляет свойства иммунологического связывания любого из антител,характеризуемых вариабельными областями VH и/или VL, описанными ниже в табл. 2 и 3. В качестве альтернативы указанное антитело представляет собой гуманизированное, ксеногенное или химерное антитело человека и мыши, последнее из перечисленных особенно полезно для диагностических способов и исследований, проводимых на животных. Изобретение также охватывает терапевтические композиции,включающие указанное антитело или его активные фрагменты, или агонисты и родственные молекулы,или наоборот, антагонисты указанного антитела, и способы применения таких композиций для предотвращения, диагностики или лечения заболевания с применением этих композиций, характеризующиеся тем, что эффективное количество указанной композиции вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Антигенсвязывающим фрагментом антитела может быть одноцепочечный Fv фрагмент, F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')2 фрагмент, или любой другой антигенсвязывающий фрагмент. В конкретном варианте реализации, описанном ниже, антитело или его фрагмент представляет собой антитело человека изотипа IgG. Разумеется, изобретение распространяется на иммортализованные B-лимфоцит памяти и B-клетку человека соответственно, которые продуцируют указанное антитело, имеющее различные и уникальные характеристики, как определено ниже. Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела согласно изобретению. Предпочтительно указанная вариабельная область включает по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) VH и/или VL вариабельной области, описанных ниже в табл. 2 и 3. Соответствующий набор CDR приведен в табл. 4 ниже. Соответственно в объем изобретения также входят векторы, включающие указанные полинуклеотиды, и клетки-хозяева, трансформированные ими, а также их применение для получения антитела и эк-2 017611 вивалентных связывающих молекул, которые специфичны к неоэпитопам, которые являются характерными и/или вызывающими расстройство, в частности для расстройства мозга, такого как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Антитело, цепь (цепи) иммуноглобулина, их связывающие фрагменты и антиген, связывающийся с указанным антителом, можно применять в фармацевтических и диагностических композициях для иммунотерапии и диагностики соответственно. Применение вышеупомянутых композиций для получения медикамента, тем не менее, является предпочтительным. Следовательно, конкретным объектом изобретения является обеспечение способов лечения или предотвращения неврологического расстройства, описываемого аномальным накоплением и/или отложением белка в центральной нервной системе, без нарушения природной функции соответствующего белка. Указанные способы включают введение эффективной концентрации антитела или производного антитела субъекту, в котором антитело связывается с патологической формой белка или с отложением белка с существенно более высокой аффинностью, чем с нормальной физиологической формой указанного белка. В предпочтительном варианте реализации изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения или замедления начала заболеваний, связанных с накоплением и отложением бетаамилоидного пептида у субъекта, таких как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, умеренное когнитивное нарушение, церебральная амилоидная ангиопатия, сосудистая деменция, мультиинфарктная деменция. Указанные способы включают введение эффективной концентрации антитела или производного антитела субъекту, в котором антитело связывается с патологической формой белка или отложением белка с более высокой аффинностью, чем с нормальной физиологической формой белка. Подобные терапевтические подходы предусмотрены для лечения болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Крейцфельда-Якоба, кистозного фиброза, болезни Гоше и т.п. Дополнительные варианты реализации изобретения будут очевидны из следующего описания. Перечень чертежей и иных материалов На фиг. 1 показано антитело против бета-амилоида. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против бета-амилоида человека. Клинически необычно стабильные пациенты с болезнью Альцгеймера имеют антитела к бета-амилоидным бляшкам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из клинически необычно стабильных пациентов срезов мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с бета-амилоидными бляшками, что подтверждается известным антителом против бетаамилоида человека. Фиг. 2 - антитело против нейрофибриллярных клубков. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против тау-протеина человека. Здоровые люди имеют антитела к нейрофибриллярным клубкам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из здоровых субъектов срезов мозга, полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с нейрофибриллярными клубками, что подтверждается известным антителом против тау-протеина человека. Фиг. 3 - антитело против дистрофичных нейритов. А: антитела человека. В: контрольное окрашивание известным антителом против тау-протеина человека. Здоровые люди имеют антитела к дистрофичным нейритам. Иммуногистохимическое окрашивание антителами из здоровых субъектов срезов мозга,полученных от пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, позволяет обнаружить антитела, которые связываются с дистрофичными нейритами. Фиг. 4 - антитело против бета-амилоида. На чертеже показано специфичное связывание рекомбинантного антитела человека NI-101.11, которое было выделено из клинически необычно стабильного пациента с болезнью Альцгеймера, с мозговыми бета-амилоидными бляшками. Срезы мозга, полученные от пациента с нейропатологически подтвержденной болезнью Альцгеймера, окрашивали рекомбинантным антителом человека в указанных концентрациях. Связывание антитела с бета-амилоидными бляшками в концентрациях, равных 50 пМ, позволяет предположить высокую аффинность связывания. Фиг. 5 - со связыванием рекомбинантного антитела человека NI-101.11 с бета-амилоидными бляшками не конкурируют линейные синтетические N-концевые бета-амилоидные полипептиды. Со связыванием рекомбинантного антитела против мозгового бета-амилоида (0.5 нМ) не конкурирует полипептид,полученный из N-концевого бета-амилоида, представляющий собой положения с 1 по 16, в концентрации вплоть до 1 мкМ. Фиг. 6 - рекомбинантное антитело человека NI-101.11 распознает конформационный бетаамилоидный эпитоп, который отсутствует в мономерном бета-амилоиде. Со связыванием NI-101.11 с бета-амилоидными бляшками на срезах мозга могут конкурировать бета-амилоидные фибриллы 1-42(аминокислоты с 1 по 42), но не линейные синтетические бета-амилоидные мономеры 1-42. Фиг. 7 - рекомбинантное антитело человека NI-101.11 не связывается с линейным, мономерным синтетическим бета-амилоидом на вестерн-блотах. Препараты мономерного бета-амилоида разделяли на неденатурирующем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ). Перенесенный на мембрану белок инкубировали с рекомбинантным антителом человека против бета-амилоида и контрольными антителами против N-концевых линейных последовательностей бета-амилоида (6E10). Не было обнаружено свя-3 017611 зывания NI-101.11 с мономерным бета-амилоидом. Это наблюдение позволяет предположить, что указанное антитело узнает конформационный бета-амилоидный эпитоп. Фиг. 8 - антитело человека NI-101.11 связывает искусственные амилоидные фибриллы, полученные из синтетических бета-амилоидных пептидов 1-42. Синтетические бета-амилоидные фибриллы или мономерный синтетический бета-амилоид, нанесенные на поверхность планшетов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) при равных плотностях покрытия, инкубировали с рекомбинантными антителами человека против мозгового бета-амилоида в указанных концентрациях. Активность связывания антитела человека против мозгового бета-амилоида с искусственными амилоидными фибриллами(пустые квадраты) более чем в 100 раз выше по сравнению с мономерным бета-амилоидом (залитые квадраты). Контрольное антитело 22C4 предпочтительно связывается с мономерным бета-амилоидомNI-101.11 узнает конформационный эпитоп, который также присутствует на искусственных амилоидных фибриллах, полученных из синтетических бета-амилоидных пептидов. Фиг. 9 - отсутствие перекрестной реакции рекомбинантного антитела человека NI-101.11 с клеточным полноразмерным белком-предшественником амилоида (APP) или с любой из его физиологических производных, встречающихся в культивируемых клетках. В противоположность контрольному антителуAPP, присутствующим на клеточных поверхностях, отсутствует. Эти результаты показывают отсутствие перекрестной реакции NI-101.11 с физиологическим клеточным полноразмерным APP. Фиг. 10 - отсутствие связывания NI-101.11 с мономерным бета-амилоидом показывали с помощью гель-хроматографии. На графиках А и В показано отсутствие связывания NI-101.11 или неродственного контрольного антитела с мономерным FITC-меченым бета-амилоидом 1-42, тогда как на графике С показано значительное связывание антитела 22C4, которое распознает линейный эпитоп, присутствующий на С-конце бета-амилоида. Фиг. 11 - конкурентный ELISA, который показал, что связывание антитела 6E10, антитела, направленного против линейного эпитопа на N-конце бета-амилоида, может быть полностью блокировано в результате предварительной инкубации с избыточными концентрациями мономерных бета-амилоидных пептидов, тогда как предварительная инкубация с избыточными концентрациями этих препаратов мономерных бета-амилоидных пептидов не нарушала связывания NI-101.11. Фиг. 12 - связывание NI-101.13 А и NI-101.13B со срезами мозга, полученными из трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах Tg2676. Фиг. 13 - ELISA, который показал предпочтительное связывание NI-101.13 А и NI-101.13 В с искусственными амилоидными фибриллами по сравнению с мономерным бета-амилоидом. Фиг. 14 - на диаграмме А методом ELISA показано связывание рекомбинантного NI-101.12 с синтетическим бета-амилоидным пептидом 1-42. На диаграмме В показано, что связыванию NI-101.12 составлял конкуренцию избыточный бета-амилоидный пептид 1-42. Фиг. 15 - рекомбинантное антитело человека NI-101.11 против мозгового бета-амилоида пересекает гематоэнцефалический барьер в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах и связывается с мозговыми бета-амилоидными бляшками in vivo. Фиг. 16 - рекомбинантное антитело человека NI-101.11 улучшает аномальное познавательное поведение в трансгенной модели болезни Альцгеймера на мышах. Мышам arcAbeta в возрасте 24 месяца вводили еженедельно интраперитонеально 3 мг/кг антитела в течение 2 месяцев. Поведенческое тестирование в У-образном лабиринте выполняли до и после завершения лечения. Фиг. 17 - прохождение гематоэнцефалического барьера и окрашивание амилоидных бляшек с помощью периферического введения NI-101.11. NI-101.11 может пересекать гематоэнцефалический барьер и связываться с бета-амилоидными отложениями у мышей, которым вводили NI-101.11 (левая часть),тогда как такого окрашивания не видно у животных, которым вводили контрольное антитело человека(правая часть). Рекомбинантное антитело человека NI-101.11 уменьшает содержание бета-амилоидных бляшек в мозге после системной терапии в течение двух месяцев. Фиг. 18 - пассивная иммунизация NI-101.11 уменьшает содержание бета-амилоида у arcAbeta мышей. (A, B) Анализы на содержание бляшек с помощью красителей тиофлавина S (Тио-S) и конго красного показали значительное их уменьшение более чем на 50% по сравнению с животными, которым вводили контрольное антитело (U-критерий Манна-Уитни; p=0.02 для коры головного мозга, p=0.009 для гиппокампа для анализа с помощью Тио-S и p=0.009 для коры головного мозга и p=0.04 для гиппокампа для анализа с помощью конго красного). Измерительная линейка: 200 мкм (C-E). Анализ с помощью тиофлавина S показал значительное снижение бета-амилоидной нагрузки (C), числа бета-амилоидных бляшек (D) и среднего размера бляшек (E) у arcAbeta мышей, которым вводили NI-101.11, по сравнению с животными, подвергшимися контрольной обработке. U-критерий Манна-Уитни: p=0.02 для площади бляшек в коре головного мозга; p=0.009 для площади бляшек в гиппокампе; p=0.047 для числа бляшек в коре головного мозга; p=0.047 для числа бляшек в гиппокампе; p=0.009 для размера бляшек в коре головного мозга; p=0.009 для размера бляшек в гиппокампе. Фиг. 19 - уменьшение содержания бета-амилоида сопровождается пониженным астроцитозом и-4 017611 микроглиозом. На диаграмме А видно, что количественный анализ анти-GFAP окрашивания выявил значительное уменьшение числа реактивных астроцитов в коре головного мозга мышей arcAbeta, которым вводили NI-101.11, по сравнению с трансгенными животными, подвергшимися контрольной обработке. На диаграмме В видно, что количественный анализ окрашивания Iba-1 показал тенденцию к уменьшению числа активированной микроглии у мышей, которым вводили NI-101.11, в коре головного мозга и гиппокампе. Измерительная линейка: 200 мкм. Фиг. 20 - не было выявлено увеличения количества мозговых микрокровоизлияний после двух месяцев лечения рекомбинантным антителом человека NI-101.11. Мышам arcAbeta в возрасте 24 месяцев с подтвержденной массивной конгофильной амилоидной ангиопатией вводили еженедельно интраперитонеально 3 мг/кг антитела в течение 2 месяцев. Типичная картина мозгового микрокровоизлияния у arcAbeta мышей, выявленная с помощью окрашивания берлинской лазурью (слева). Количественный анализ показал значительно повышенную частоту микрокровоизлияний у arcAbeta трансгенных мышей по сравнению с однопометными мышами дикого типа. Длительное лечение NI-101.11 не приводило к повышенной частоте микрокровоизлияний. Измерительная линейка: 20 мкм. Фиг. 21 - рекомбинантное антитело человека NI-101.11 ингибирует образование синтетических бета-амилоидных фибрилл in vitro. Эффект рекомбинантного антитела человека NI-101.11 на образование бета-амилоидных фибрилл анализировали путем измерения тиофлавина S, связанного с агрегированным бета-амилоидом, с помощью флуоресцентного анализа. Фиг. 22 - опосредованный антителом зависимый от дозы фагоцитоз FITC-бета-амилоидных фибрилл 1-42 BV-2 микроглиальными клетками измеряли при ингибировании системы фагоцитарного рецептора. NI-101.11 инициирует эффективный зависимый от дозы фагоцитоз бета-амилоидных фибрилл,опосредованный Fc-гамма рецептором. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияI. Определения. Стоит заметить, что употребление неопределенного артикля относится к единственному или множественному числу; например, "антитело" следует понимать представляющим одно или более антител. В силу этого, термины с неопределенным артиклем, "один или более" и "по меньшей мере один" можно применять взаимозаменяемо в данной заявке. В данной заявке термин "полипептид" следует понимать охватывающим единственный "полипептид", а также множество "полипептидов", и он относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин "полипептид" относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не указывает на конкретную длину продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "цепь аминокислот" или любой другой термин, применяемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение "полипептида", и термин "полипептид" можно применять вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин "полипептид" также подразумевается относящимся к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления или модификации не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид можно получить из природного биологического источника или получить с помощью рекомбинантной технологии, но он не обязательно должен быть транслирован из соответствующей последовательности нуклеиновых кислот. Его можно получить любым способом, включая химический синтез. Полипептид согласно изобретению может иметь размер, составляющий приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют подобную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют уложенными, и полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но предпочтительнее могут принимать большое число различных конформаций, называют развернутыми. В данной заявке термин гликопротеин относится к белку, соединенному по меньшей мере с одной молекулой углевода, которая присоединена к белку с помощью боковой цепи аминокислотного остатка,содержащей атом кислорода или азота, например остаток серина или остаток аспарагина. Под термином "выделенный (изолированный)" полипептид или его фрагмент, вариант или производное подразумевают полипептид, который более не находится в своем природном окружении. Не требуется определенный уровень очистки. Например, выделенный полипептид можно удалить из его нативной или природной среды. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, рассматриваются как выделенные для целей изобретения, так же, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были разделены, фракционированы или частично или, по существу, очищены с помощью любой подходящей методики. Также включены в качестве полипептидов согласно изобретению фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеупомянутых полипептидов и любая их комбинация. Термины "фрагмент", "вариант",-5 017611"производное" и "аналог", когда они употребляются по отношению к антителам или полипептидам антител согласно изобретению, включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующей нативной связывающей молекулы, антитела или полипептида. Фрагменты полипептидов согласно изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, вдобавок к специфичным фрагментам антител, описанным гделибо еще в данной заявке. Варианты антител и полипептидов антител согласно изобретению включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными последовательностями аминокислот вследствие замен, делеций или вставок аминокислот. Варианты могут встречаться в природе или могут быть не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получить, применяя известные в данной области методики мутагенеза. Измененные полипептиды могут включать консервативные или неконсервативные замены, делеции или вставки аминокислот. Производные от специфичных к неоэпитопам связывающих молекул, например антител и полипептидов антител согласно изобретению,представляют собой полипептиды, которые были изменены таким образом, что они проявляют дополнительные свойства, не обнаруживаемые у нативного полипептида. Примеры включают слитые белки. Измененные полипептиды также могут быть названы в данной заявке "аналогами полипептидов". В данной заявке термин "производное" связывающей молекулы или ее фрагмента, антитела или полипептида антитела относится к указанному полипептиду, имеющему один или более остатков, химически измененных с помощью реакции функциональной боковой группы. Также включены в термин "производные" такие пептиды, которые содержат одно или более встречающихся в природе производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может замещать пролин; 5-гидроксилизин может замещать лизин; 3-метилгистидин может замещать гистидин; гомосерин может замещать серин и орнитин может замещать лизин. Термин "полинуклеотид" следует понимать охватывающим единственную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и относящимся к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может включать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, такую как обнаруженная в пептид-нуклеиновых кислотах (ПНК. Термин "нуклеиновая кислота" относится к любому одному или более сегментам нуклеиновых кислот, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под "выделенной (изолированной)" нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из природной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антитело, содержащийся в векторе,рассматривается как выделенный для целей изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клеткаххозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов согласно изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно изобретению дополнительно включают подобные молекулы, полученные синтетически. Вдобавок, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции. В данной заявке термин "кодирующий участок" обозначает часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или TAA) не транслируется в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующего участка, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующего участка. Два или более кодирующих участков согласно изобретению могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например на отдельных (различных) векторах. Более того, любой вектор может включать один кодирующий участок или может включать два или более кодирующих участков, например один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Вдобавок,вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота согласно изобретению может кодировать гетерологичные кодирующие участки, либо слитые, либо неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающую молекулу, антитело, или его фрагмент, вариант или производное. Гетерологичные кодирующие участки включают, без ограничения, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. В некоторых вариантах реализации указанный полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК, полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, обычно может включать промотор и/или другие регуляторные элементы транскрипции или трансляции, функционально связанные с одним или более кодирующими участками. Функциональная связь означает, что кодирующий участок для продукта гена, например полипептида, связан с одной или более регуляторными последовательностями таким образом, что экспрессия продукта гена находится под влиянием или контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (такие как участок,кодирующий полипептид, и промотор, связанный с ним) являются "функционально связанными", если-6 017611 индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желаемый продукт гена, и если природа связи между двумя указанными фрагментами ДНК не препятствует способности экспрессионных регуляторных последовательностей направлять экспрессию продукта гена или не препятствует способности ДНК-матрицы транскрибироваться. Таким образом, промоторная область будет функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен влиять на транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотором может быть специфичный для определенного типа клеток промотор, который направляет значительную транскрипцию ДНК лишь в определенных клетках. Другие транскрипционные регуляторные элементы, кроме промотора, например энхансеры,операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом, чтобы направлять специфичную для определенного типа клеток транскрипцию. Подходящие промоторы и другие контролирующие транскрипцию участки описаны в данной заявке. Множество участков, контролирующих транскрипцию, известно специалистам в данной области. Они включают, без ограничения, участки, контролирующие транскрипцию, которые функционируют в клетках позвоночных, таких как, но не ограниченных перечисленными, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (предранний промотор, совместно с интроном-А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие участки, контролирующие транскрипцию, включают участки, полученные из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока, гормона роста крупного рогатого скота и -глобина кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие участки, контролирующие транскрипцию, включают тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами). Аналогично, множество трансляционных регуляторных элементов известно средним специалистам в данной области. Такие элементы включают, но не ограничены перечисленными, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы, или IRES, также называемый CITE последовательностью). В других вариантах реализации полинуклеотид согласно изобретению представляет собой РНК, например, в виде матричной РНК (мРНК). Кодирующие участки полинуклеотидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть связаны с дополнительными кодирующими участками, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом согласно изобретению. Согласно гипотезе сигнальной последовательности белки, секретируемые клетками млекопитающих,имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которые отщепляются от зрелого белка сразу после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Для рядовых специалистов в данной области будет очевидно, что полипептиды,секретируемые клетками позвоночных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от целого или "полноразмерного" полипептида и дает секретируемую или "зрелую" форму этого полипептида. В некоторых вариантах реализации применяют нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию функционально связанного с ним полипептида. В качестве альтернативы можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть замещена на лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA) человека или -глюкуронидазы мыши. Если не указано иначе, термины "расстройство" и "заболевание" используются взаимозаменяемо в данной заявке. Термин "связывающая молекула" в контексте изобретения относится в первую очередь к антителам и их фрагментам, но может также относиться к отличным от антител молекулам, которые связываются с неоэпитопом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, гормоны, рецепторы, лиганды,молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), шапероны, такие как белки теплового шока(БТШ), а также молекулы межклеточной адгезии, такие как члены суперсемейств кадгеринов, интегринов, лектинов C-типа и иммуноглобулинов (Ig). Таким образом, исключительно с целью ясности и без ограничения объема изобретения, большинство из следующих вариантов реализации обсуждается в отношении антител и подобных антителам молекул, которые представляют собой предпочтительные связывающие молекулы для разработки терапевтических и диагностических агентов. Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются взаимозаменяемо в данной заявке. Антитело или иммуноглобулин представляет собой антигенсвязывающую молекулу, которая включает, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и обычно включает, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры иммуноглобулинов у позвоночных относительно хорошо известны, см., например, Harlow и др., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-e изд. 1988).-7 017611 Как более подробно описано ниже, термин "иммуноглобулин" включает различные обширные классы полипептидов, которые можно различить биохимически. Для специалиста в данной области будет очевидно, что тяжелые цепи классифицированы как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (, , , , ) с некоторыми подклассами среди них (например, 1-4). Именно природа этой цепи определяет "класс" антитела как IgG, IgM, IgA IgG или IgE соответственно. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д. подробно описаны, и известно, что они определяют функциональную специализацию. Измененные варианты каждого из этих классов и изотипов хорошо различимы для специалиста в данной области ввиду настоящего описания и соответственно входят в объем изобретения. Все классы иммуноглобулинов явно входят в объем изобретения, последующее описание будет в основном направлено на класс IgG молекул иммуноглобулинов. В отношении IgG стандартная молекула иммуноглобулина включает два идентичных полипептида легких цепей, имеющих молекулярный вес приблизительно 23000 Да, и два идентичных полипептида тяжелых цепей, имеющих молекулярный вес 53000-70000. Четыре указанные цепи обычно соединены дисульфидными связями в "Y" конфигурации,при этом легкие цепи захватывают в "вилку" тяжелые цепи, начиная с расхождения "Y" и продолжаясь до конца вариабельной области. Легкие цепи классифицируют как каппа, либо лямбда (, ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан либо с каппа, либо с лямбда легкой цепью. Как правило, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, и "хвостовые" части двух тяжелых цепей связаны друг с другом с помощью ковалентных дисульфидных связей или нековалентных связей, когда иммуноглобулины получены с помощью либо гибридом, либо B-клеток, либо генетически измененных клеток-хозяев. В тяжелой цепи последовательности аминокислот начинаются с N-конца на вилкообразном конце Y конфигурации и заканчиваются C-концом внизу каждой цепи. Как легкая, так и тяжелая цепи делятся на области структурной и функциональной гомологии. Термины "константная" и "вариабельная" применяют в зависимости от функции. В этом отношении должно быть очевидно, что вариабельные домены участков как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют распознавание антигена и специфичность. Наоборот, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) обеспечивают важные биологические свойства, такие как секреция, способность проходить через плаценту, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента и т.п. По соглашению нумерация доменов константной области возрастает с удалением от сайта связывания антигена или от аминоконца антитела. N-концевая часть представляет собой вариабельную область и C-концевая часть представляет собой константную область; CH3 и CL домены фактически составляют карбоксильный конец тяжелой и легкой цепи соответственно. Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно узнавать и специфично связывать эпитопы на антигенах. А именно, VL домен и VH домен, или совокупность гипервариабельных участков (CDR), антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный сайт связывания антигена. Эта четвертичная структура антитела образует сайт связывания антигена, присутствующий на конце каждого плеча Y. В частности, сайт связывания антигена определяется тремя CDR на каждой из VH и VL цепей. Любой фрагмент антитела или иммуноглобулина, который содержит структуру, достаточную для специфичного связывания с антигеном, именуется в данной заявке взаимозаменяемо как "антигенсвязывающий фрагмент" или "иммуноспецифичный фрагмент". Во встречающихся в природе антителах, шесть "гипервариабельных участков" или "CDR", присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие, не непрерывные последовательности аминокислот, которые специфично располагаются с образованием антигенсвязывающего домена, по мере того, как антитело принимает трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые "каркасными" областями, проявляют меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные области в значительной степени принимают складчатую конформацию и CDR образуют петли, которые соединяются с ней, и в некоторых случаях формируют часть -складчатой структуры. Таким образом, каркасные области образуют каркас, который обеспечивает позиционирование CDR в правильной ориентации, посредством межцепочечных, нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный позиционированными CDR, определяет поверхность, комплементарную к эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с родственным эпитопом. Аминокислоты, составляющие CDR и каркасные области, соответственно может легко идентифицировать рядовой специалист в данной области для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они были точно определены (см., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E. и др.,U.S. Department of Health and Human Services (1983) и Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987),которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки). В случае, когда существует два или более определений термина, который используется и/или принят в данной области, определение термина, используемого в данной заявке, следует понимать включающим все такие значения, за исключением случаев, когда четко указано противоположное. Конкретным примером является использование термина "гипервариабельный участок" ("CDR") для описания не-8 017611 непрерывных антигенсвязывающих центров, обнаруживаемых в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эта конкретная область была описана у Kabat и др., U.S. Dept. of Health andHuman Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) и у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), которые включены в данную заявку посредством ссылки, в которых определения включают перекрывающиеся аминокислотные остатки или их совокупность, если сравнивать эти определения друг с другом. Тем не менее, применение любого из определений по отношению к CDR антитела или его вариантам следует понимать входящим в объем термина, определенного и используемого в данной заявке. Подходящие аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, определенные в каждой из цитированных выше ссылок, приведены ниже в табл. 1 для сравнения. Точное количество остатков, которые охватывает конкретный CDR, будет изменяться в зависимости от последовательности и размераCDR. Специалисты в данной области могут легко определить, какие остатки включены в конкретныйCDR, образуя последовательность аминокислот вариабельной области антитела. Таблица 1 Определения CDR1 1 Нумерация для всех определений CDR в табл. 1 дана согласно соглашениям о нумерации, описанным у Kabat и др. (см. ниже).Kabat и др. также определили систему нумерации для последовательностей вариабельного домена,которая применима для любого антитела. Рядовой специалист в данной области может однозначно применить эту систему "нумерации по Kabat" к любой последовательности вариабельного домена, без опоры на какие-либо экспериментальные данные, кроме самой последовательности. В данной заявке "нумерация по Kabat" относится к системе нумерации, предложенной Kabat и др., U.S. Dept. of Health and HumanServices, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983). Если не указано иначе, ссылки на нумерацию конкретных положений аминокислотных остатков в молекуле антитела или его антигенсвязывающем фрагменте, варианте или производном согласно изобретению даны согласно системе нумерации по Kabat. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноспецифичные фрагменты, варианты или производные согласно изобретению включают, но не ограничены перечисленными, поликлональные,моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например Fab, Fab' иF(ab')2, Fd, Fvs, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fvs (sdFv), фрагменты, включающие либо VL, либо VH домен, фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам, описанным в данной заявке). Молекулы scFv известны в данной области и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител согласно изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. В одном варианте реализации антитело согласно изобретению не является IgM или его производным с пятивалентной структурой. В частности, в конкретных применениях согласно изобретению, особенно при терапевтическом применении, IgM являются менее полезными, чем IgG и другие бивалентные антитела или соответствующие связывающие молекулы, поскольку IgM вследствие их пятивалентной структуры и отсутствия созревания аффинности часто вступают в неспецифичные перекрестные реакции и проявляют очень низкую аффинность. Фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и) отдельно или в комбинации с целой или частью следующих областей: шарнирная область, CH1, CH2 иCH3 домены. Также включены в изобретение антигенсвязывающие фрагменты, также включающие лю-9 017611 бую комбинацию вариабельной области(ей) с шарнирной областью, CH1, CH2 и CH3 доменами. Антитела или их иммуноспецифичные фрагменты согласно изобретению могут иметь любое животное происхождение, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела представляют собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или цыпленка. В другом варианте реализации вариабельная область может происходить из хрящевых рыб (например, из акул). В данной заявке антитела "человека" включают антитела, имеющие последовательность аминокислот иммуноглобулина человека и включают антитела, выделенные из людей-пациентов, библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или более иммуноглобулинам человека и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано ниже и, например, в патенте США 5939598 у Kucherlapati и др. Антитело человека все еще является "человеческим", даже если сделаны замены аминокислот в указанном антителе, например, для улучшения характеристик связывания. В данной заявке термин "часть тяжелой цепи" включает последовательности аминокислот, полученные из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, включающий часть тяжелой цепи, включает по меньшей мере один из перечисленных: CH1 домен, шарнирный домен (например, верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную области), CH2 домен, CH3 домен или их вариант или фрагмент. Например,связывающий полипептид для применения в настоящем изобретении может включать полипептидную цепь, включающую CH1 домен; полипептидную цепь, включающую CH1 домен, по меньшей мере часть шарнирного домена и CH2 домен; полипептидную цепь, включающую CH1 домен и CH3 домен; полипептидную цепь, включающую CH1 домен, по меньшей мере часть шарнирного домена и CH3 домен,или полипептидную цепь, включающую CH1 домен по меньшей мере часть шарнирного домена, CH2 домен и CH3 домен. В другом варианте реализации полипептид согласно изобретению включает полипептидную цепь, включающую CH3 домен. Дополнительно, в связывающем полипептиде для применения в настоящем изобретении может отсутствовать по меньшей мере часть CH2 домена (например, весь или часть CH2 домена). Как указано выше, для рядового специалиста в данной области будет очевидно,что эти домены (например, части тяжелой цепи) можно модифицировать таким образом, что они будут отличаться по последовательности аминокислот от встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина. В некоторых антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в данной заявке, части тяжелой цепи одной полипептидной цепи мультимера идентичны таковым на второй полипептидной цепи мультимера. В качестве альтернативы мономеры, содержащие части тяжелой цепи согласно изобретению, не идентичны. Например, каждый мономер может включать различный сайт связывания мишени, образуя, например, биспецифичное антитело. Части тяжелой цепи связывающего полипептида для применения в способах диагностики и лечения, описанных в данной заявке, можно получить из различных молекул иммуноглобулинов. Например,часть тяжелой цепи полипептида может включать CH1 домен, полученный из молекулы IgG1, и шарнирную область, полученную из молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать шарнирную область, полученную частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать химерный шарнир, полученный частично из молекулыIgG1 и частично из молекулы IgG4. В данной заявке термин "часть легкой цепи" включает последовательности аминокислот, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. Предпочтительно часть легкой цепи включает по меньшей мере один из VL или CL доменов. Минимальным размером пептидного или полипептидного эпитопа для антитела считают приблизительно четыре-пять аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы предпочтительно содержат по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 9 и наиболее предпочтительно между по меньшей мере приблизительно 15 и приблизительно 30 аминокислотами. Поскольку CDR может узнавать антигенный пептид или полипептид в его третичной структуре, аминокислоты, составляющие эпитоп, не должны располагаться непрерывно, и, в некоторых случаях, могут даже не быть на одной и той же пептидной цепи. В настоящем изобретении пептидный или полипептидный эпитоп, узнаваемый антителами согласно изобретению, содержит последовательность из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5,по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 8, по меньшей мере 9,по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или между приблизительно 15 и приблизительно 30 непрерывных или не непрерывных аминокислот -амилоида (A). Термин "неоэпитоп" в соответствии с настоящим изобретением обозначает эпитоп, который уникален для клинической картины болезни и содержится или образован белком, связанным с расстройством,который представляет собой патологический вариант в противном случае непатологического белка и/или отклоняется от физиологии здорового состояния. Указанные патофизиологические варианты могут образовываться в результате патологически измененной транскрипции, патологически измененной трансляции, посттрансляционной модификации, патологически измененного протеолитического процессинга,патологически измененного образования комплекса с физиологическими или патофизиологическими взаимодействующими партнерами или клеточными структурами в смысле измененной колокализации,- 10017611 или в результате патологически измененной структурной конформации - как, например, агрегация, олигомеризация или фибриллообразование, в которой трех- или четырехмерная структура отличается от структуры физиологически активной молекулы. Более того, патофизиологический вариант может также характеризоваться тем, что он не находится в обычной физиологической среде или компартменте клетки. В качестве примера неоэпитопы могут быть расположены в явно патологических структурах в областях тканей мозга, которые очевидно претерпевают или уже перенесли функциональное повреждение. Имеет ли данная структура, например клетка или ткань либо белок, неоэпитоп, можно проверить путем реверсирования способа, описанного ниже для выделения и характеристики специфичной молекулы, связывающей белок, связанный с расстройством, в котором связывающая молекула, например антитело, идентифицированное с помощью указанного способа, применяется для скрининга образца на связывание с указанным антителом, тем самым позволяя определить присутствие неоэпитопа. Фразы "специфичный к белку, связанному с заболеванием" и "специфичный к неоэпитопу" используются взаимозаменяемо в данной заявке с термином "специфично распознающий неоэпитоп". В данной заявке термины, такие как "отсутствие перекрестной реакции", "специфичный", "специфично распознающий", "специфично связывающий", "предпочтительно связывающий" и т.п., относятся к способности связывающей молекулы проводить различие между неоэпитопом белка, связанного с расстройством,и нативным белком дикого типа и природной среде. Таким образом, связывающая молекула согласно изобретению имеет предпочтительную аффинность связывания с неоэпитопом, чем с нативным белковым антигеном, большую по меньшей мере в два раза, предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, обычно более чем в 10 раз, особенно предпочтительно в 50 раз и еще более предпочтительно больше чем в 100 раз. Более того, относительная KD связывающей молекулы, например антитела, для специфичного целевого эпитопа, например неоэпитопа, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз меньше, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз меньше или больше, чем KD связывания этого антитела с другими лигандами или с нативным аналогом связанного с заболеванием белка. Под терминами "специфично связывает" или "специфично распознает", используемыми взаимозаменяемо в данной заявке, обычно подразумевают, что связывающая молекула, например антитело, связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание включает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, говорят, что антитело "специфично связывается" с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом, посредством своего антигенсвязывающего домена, лучше, чем оно бы связывалось с произвольным неродственным эпитопом. Термин "специфичность" используется в данной заявке, чтобы определить относительную аффинность, с которой некоторое антитело связывается с некоторым эпитопом. Например, антитело "A" может считаться имеющим более высокую специфичность к данному эпитопу, чем антитело "B", или можно сказать, что антитело "A" связывается с эпитопом "C" с более высокой специфичностью, чем оно имеет по отношению к родственному эпитопу "D". Под "предпочтительно связывает" подразумевается, что связывающая молекула, например антитело, специфично связывается с эпитопом лучше, чем оно бы связывалось с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое "предпочтительно связывается" с данным эпитопом, будет скорее связываться с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может вступать в перекрестную реакцию с родственным эпитопом. В качестве неограничивающего примера может считаться, что связывающая молекула, например антитело, предпочтительно связывает первый эпитоп, если она связывает указанный первый эпитоп с константой диссоциации (KD), которая меньше, чем KD указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый антиген, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок меньше, чем KD указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка меньше, чем KD указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что связывающая молекула, например антитело, предпочтительно связывает первый эпитоп, если она связывает указанный первый эпитоп со скоростью диссоциации (k(off, которая меньше, чем k(off) указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере, может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок меньше, чем k(off) указанного антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере может считаться, что антитело предпочтительно связывает первый эпитоп, если оно связывает указанный первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка меньше чем k(off) указанного антитела для второго эпитопа. Можно сказать, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данной заявке, связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант, со скоростью диссоциации (k(off, меньшей или равной 510-2 с-1, 10-2 с-1, 510-3 с-1 или 10-3 с-1. Более предпочтительно можно сказать, что антитело согласно- 11017611 изобретению связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью диссоциации (k(off, меньшей или равной 510-4 с-1, 10-4 с-1, 510-5 с-1 или 10-5 с-1, 510-6 с-1, 10-6 с-1, 510-7 с-1 или 10-7 с-1. Можно сказать, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данной заявке, связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью ассоциации (k(on, большей или равной 103 М-1 с-1, 5103 М-1 с-1, 104 М-1 с-1 или 5104 М-1 с-1. Более предпочтительно можно сказать, что антитело согласно изобретению связывает целевой полипептид, описанный в данной заявке, или его фрагмент либо вариант со скоростью ассоциации (k(on, большей или равной 105 М-1 с-1, 5105 М-1 с-1,106 М-1 с-1, или 5106 М-1 с-1, или 107 М-1 с-1. Говорят, что связывающая молекула, например антитело, конкурентно ингибирует связывание антитела для сравнения с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом в такой мере, что оно блокирует, до некоторой степени, связывание антитела для сравнения с эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определить любым способом, известным в данной области, например с помощью конкурентных тестов ELISA. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание антитела для сравнения с данным эпитопом на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 50%. В данной заявке термин "аффинность" относится к мере силы связывания отдельного эпитопа сCDR связывающей молекулы, например молекулы иммуноглобулина, см., например, Harlow и др., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е изд. 1988) на с. 27, 28. В данной заявке термин "авидность" относится к суммарной стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигеном, а именно к силе функционального объединения смеси иммуноглобулинов с антигеном, см., например, Harlow на с. 29-34. Авидность относится как к аффинности отдельных молекул иммуноглобулинов в популяции к конкретным эпитопам, так и к валентностям иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между бивалентным моноклональным антителом и антигеном с многократно повторяющейся структурой эпитопа, таким как полимер, будет иметь высокую авидность. Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, можно также описать или определить в контексте их способности вступать в перекрестные реакции. В данной заявке термин "способность вступать в перекрестные реакции" относится к способности антитела, специфичного к одному антигену, реагировать со вторым антигеном; мера родства между двумя различными антигенными веществами. Таким образом, антитело вступает в перекрестные реакции, если оно связывается с эпитопом, отличным от того, который индуцировал образование этого антитела. Вступающий в перекрестные реакции эпитоп, как правило, содержит многие из тех же комплементарных структурных особенностей, что и индуцирующий эпитоп, и, в некоторых случаях, возможно фактически лучше подходит, чем исходный. Например, некоторые антитела имеют некоторую степень способности вступать в перекрестные реакции, заключающуюся в том, что они связывают родственные, но не идентичные эпитопы, например эпитопы с по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%,по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и с по меньшей мере 50% идентичностью (рассчитывали, применяя способы, известные в данной области и описанные в данной заявке) с эпитопом для сравнения. Можно сказать, что антитело имеет небольшую или не имеет вовсе способности вступать в перекрестные реакции, если оно не связывает эпитопы с менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50% идентичностью (рассчитывали,применяя способы, известные в данной области и описанные в данной заявке) с эпитопом для сравнения. Антитело может считаться "высокоспецифичным" к некоторому эпитопу, если оно не связывает любой другой аналог, ортолог или гомолог этого эпитопа. Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению, можно также описать или определить в контексте их аффинности связывания с полипептидом согласно изобретению. Предпочтительные аффинности связывания включают такие,которые имеют константу диссоциации илиKd меньше чем 510-2 М, 10-2 М, 510-3 М, 10-3 М, 510-4 М, 10-4 М, 510-5 М, 10-5 М, 510-6 М, 10-6 М, 510-7 М, 10-7 М,510-8 М, 10-8 М, 510-9 М, 10-9 М, 510-10 М, 10-10 М, 510-11 М, 10-11 М, 510-12 М, 10-12 М, 510-13 М, 10-13 М, 510-14 М, 10-14 М, 510-15 М или 10-15 М. Как было указано ранее, субъединичные структуры и трехмерная конфигурация константных областей иммуноглобулинов различных классов хорошо известны. В данной заявке термин "VH домен" включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и термин "СН 1 домен" включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. CH1 домен расположен рядом с VH доменом и находится с аминоконцевой стороны от шарнирной области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. В данной заявке термин "CH2 домен" включает часть молекулы тяжелой цепи, которая продолжает- 12017611 ся, например, от приблизительно остатка 244 до остатка 360 антитела, если использовать обычные схемы нумерации (остатки с 244 по 360, система нумерации по Kabat; и остатки 231-340, европейская система нумерации; см. Kabat E.A. и др. в цитируемой работе). CH2 домен уникален тем, что он не спарен тесно с другим доменом. Скорее, две связанные по N-концам разветвленные углеводные цепи находятся между двумя CH2 доменами интактной нативной молекулы IgG. Также доказано, что CH3 домен продолжается от CH2 домена к C-концу молекулы IgG и включает приблизительно 108 остатков. В данной заявке термин "шарнирная область" включает часть молекулы тяжелой цепи, соединяетCH1 домен с CH2 доменом. Эта шарнирная область включает приблизительно 25 остатков и является гибкой, таким образом позволяя двум N-концевым антигенсвязывающим областям перемещаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Roux и др., J. Immunol. 161:4083 (1998. В данной заявке термин "дисульфидная связь" включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин включает тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG, CH1 и CL области связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 в системе нумерации по Kabat (положение 226 или 229, европейская система нумерации). В данной заявке термин "сконструированное антитело" относится к антителу, в котором вариабельный домен либо в тяжелой, либо в легкой цепи, либо в обеих изменен с помощью, по меньшей мере, частичного замещения одного или более CDR от антитела с известной специфичностью и, если это необходимо, с помощью частичного замещения каркасной области и изменения последовательности. Хотя CDR можно получить от антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, от которого происходят каркасные области, предусмотрено, что CDR будут получены от антитела другого класса и предпочтительно от антитела из другого вида. Сконструированное антитело, в котором один или более "донорных"CDR из не принадлежащего человеку антитела с известной специфичностью привит на каркасную область тяжелой или легкой цепи антитела человека, называется в данной заявке "гуманизированным антителом". Замещение всех CDR на целые CDR из донорной вариабельной области для переноса антигенсвязывающей способности от одного вариабельного домена на другой необязательно. Предпочтительнее может быть необходимым только перенос таких остатков, которые необходимы для поддержания активности сайта связывания мишени. Учитывая объяснения, приведенные, например, в патентах США 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, будет вполне в рамках компетенции специалистов в данной области, либо путем проведения обычных экспериментов, либо методом проб и ошибок, получить функциональное сконструированное или гуманизированное антитело. В данной заявке термин "правильно уложенный полипептид" включает полипептиды, в которых все функциональные домены, составляющие полипептид, являются отдельно активными. В данной заявке термин "неправильно уложенный полипептид" включает полипептиды, в которых по меньшей мере один из функциональных доменов полипептида не активен. В одном варианте реализации правильно уложенный полипептид включает полипептидные цепи, связанные с помощью по меньшей мере одной дисульфидной связи, и, наоборот, неправильно уложенный полипептид включает полипептидные цепи, не связанные по меньшей мере одной дисульфидной связью. В данной заявке термин "сконструированное" включает манипулирование над молекулами нуклеиновых кислот или полипептидов с помощью средств синтеза (например, с помощью рекомбинантных методик, пептидного синтеза in vitro, путем ферментативного или химического сшивания пептидов или с помощью некоторой комбинации этих методик). В данной заявке термины "связанные", "слитые" или "слияние" используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению двух или более элементов или компонентов с помощью любых средств, включая химическое сопряжение или рекомбинантные средства. "Слияние с сохранением рамки считывания" относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (OPC) полинуклеотидов с образованием непрерывной более длинной OPC таким образом, что сохраняется правильная трансляционная рамка считывания исходных ОРС. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой один белок, содержащий два или более сегмента, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными OPC (эти сегменты обычно не соединены подобным образом в природе). Хотя рамка считывания, таким образом, сделана непрерывной на протяжении всех слитых сегментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, с помощью линкерной последовательности, сохраняющей рамку считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR вариабельной области иммуноглобулина могут быть слиты с сохранением рамки считывания, но разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные CDR области при условии, что "слитые" CDR совместно транслируются как часть непрерывного полипептида. В контексте полипептидов, "линейная последовательность" или "последовательность" представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от аминоконца к карбоксильному концу, в котором остатки, находящиеся рядом друг с другом в последовательности, расположены непрерывно в- 13017611 первичной структуре полипептида. Термин "экспрессия" в данной заявке относится к процессу, с помощью которого ген продуцирует биохимическую молекулу, например РНК или полипептид. Указанный процесс включает любое проявление функционального присутствия гена внутри клетки, включая, без ограничения, нокдаун гена, а также как временную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничения, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК),малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию таких мРНК в полипептид(ы). Если конечный желаемый продукт представляет собой биохимическую молекулу, экспрессия включает создание этой биохимической молекулы и любых предшественников. Экспрессия гена дает "генетический продукт". В данной заявке термин генетический продукт может обозначать либо нуклеиновую кислоту, например матричную РНК, полученную путем транскрипции гена, либо полипептид,который транслирован из транскрипта. Генетические продукты, описанные в данной заявке, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например полиаденилирование, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилирование, гликозилирование, добавление липидов, связывание с другими субъединицами белка, протеолитическое расщепление и т.п. В данной заявке термины "лечить" или "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, целью которых является предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательное физиологическое изменение или расстройство, такое как развитие или распространение рака. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничены перечисленными: купирование симптомов, сокращение продолжительности заболевания, стабилизирование (т.е. отсутствие ухудшения) состояния болезни, приостановку или замедление прогрессирования заболевания, снижение выраженности или временное облегчение болезненного состояния, и ремиссию(частичную либо полную), либо детектируемые, либо недетектируемые. "Лечение" может также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствии данного лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже находится в патологическом состоянии или имеет расстройство, а также тех, кто подвержен патологическому состоянию или расстройству, или тех, у которых надо предотвратить проявление патологического состояния или расстройства. Под "субъектом", или "индивидуумом", или "животным", или "пациентом", или "млекопитающим" подразумевается любой субъект, в особенности млекопитающий, например пациент-человек, которому требуется диагностика, прогноз, предотвращение патологического состояния или терапия.II. Способы идентификации связывающих молекул. Изобретение в целом относится к средствам и способам обнаружения терапевтически эффективных антител в заранее выбранных по симптоматике людях. Как показано в примерах, антитела человека против аномальных структур при заболеваниях мозга человека можно выделить из фенотипически здоровых, или клинически необычно стабильных, пациентов и соответствующие рекомбинантные антитела можно успешно применять для лечения, снижения выраженности патологии и предотвращения нарушения мозговой функции без значительных побочных эффектов. Клиническую стабильность или отсутствие прогрессирования заболевания можно определить в качестве примера с помощью измерения в динамике по времени клинического, например когнитивного, статуса (путем нейропсихологического тестирования, например); установления общего функционального уровня; оценки способностей к самообслуживанию или расстройств поведения; объемного (волюметрического) анализа структур мозга; измеренияin vivo патологических отложений аномальных белков в мозге (например, визуализации бета-амилоида с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ или биохимических изменений в биологических жидкостях (например, тау-протеины или бета-амилоидные пептиды) и путем сравнения с естественным течением/историей болезни. Таким образом, изобретение обеспечивает антитела и связывающие молекулы, которые способны узнавать неоэпитопы связанных с заболеванием белков, которые происходят из нативных эндогенных белков и преобладают в организме пациента в измененной форме, например в виде патологического белка и/или вне рамок их нормального физиологического состояния. В частности, обеспечены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые проявляют свойства иммунологического связывания и/или биологические свойства, которые перечислены для антитела, описанного в примерах. Когда встречается термин "свойства иммунологического связывания" или другие характеристики связывания антитела с антигеном, во всех грамматических формах, он относится к специфичности, аффинности, способности вступать в перекрестные реакции и другим характеристикам связывания антитела. Разумеется, изобретение распространяется на продуцирующие антитела линии клеток, а также на рекомбинантные клетки. Изобретение дополнительно относится к диагностическим тестам и наборам, которые включают связывающую молекулу согласно изобретению, и к терапевтическим способам и терапевтическим оценкам, основанным на них. Изобретение основывается на наблюдении, что у людей и пациентов, заранее выбранных согласно особым клиническим критериям, которые несут риск развития неврологического расстройства, такого как старческая болезнь Альцгеймера, что относится к гуморальной защите, могут также обнаруживаться антитела к эндогенным патофизиологическим вариантам, таким как агрегаты бета-амилоидных пептидов, нейрофибриллярные клубки, дистрофичные нейриты и- 14017611 дополнительные клеточные структуры, которые являются нейропатологической характерной особенностью для данного расстройства. Эти структуры можно обнаружить отдельно или в комбинации с другими патологическими структурами, и они могут, как в случае агрегатов бета-амилоида и предшественников нейрофибриллярных клубков, привести к развитию патологических эффектов. Тем не менее, те антитела, которые специфично узнают указанные структуры, не проявляют или проявляют значительно меньшую способность вступать в перекрестные реакции с нормальными физиологически функциональными формами белков, лежащих в основе патологических структур, в противоположность известному случаю аутоиммунного ответа. Без привязки к теории, на основании экспериментов, выполненных в соответствии с настоящим изобретением, можно предположить, что расстройство не обязательно очевидно и заметно фенотипически, как в случае инфекции, чтобы привести к экспериментально измеримой активности гуморальной иммунной системы, как, например, продукция или активация специфичных B-клеток или B-клеток памяти. В случае опухолевых клеток или дифференцированных клеток, которые должны быть физиологически утилизированы, уже известны механизмы, в которых партнеры, такие как T4-хелперные клетки, цитотоксические T-клетки и естественные клетки-киллеры клеточной иммунной системы, действуют совместно, чтобы индуцировать апоптоз. Следует предположить, что, также у здорового человека, опухолевые клетки или их предшественники образуются ежедневно путем мутации. Тем не менее, они незамедлительно подвергаются апоптозу посредством гуморальных и клеточных механизмов таким образом,что опухоль не детектируется. В этом смысле термин "здоровый, или клинически необычно стабильный,пациент" не должен пониматься обозначающим индивидуума, у которого не происходят приводящие к заболеванию события, но обозначает индивидуума, у которого разнообразные приводящие к заболеванию события контролируются с помощью механизмов блокирования или защиты перед тем, как они смогли бы фенотипически проявиться. Ввиду сказанного выше, была выдвинута гипотеза в соответствии с настоящим изобретением, что должно оказаться возможным выявить антитело или продуцирующую антитело клетку у особых групп пациентов или здоровых субъектов, которые были заранее выбраны согласно клиническим критериям,без предварительного изучения молекулярной природы эпитопа целевой структуры, например неоэпитопа, при этом указанное антитело в случае уже преобладающей толерантности у донорного организма,что, например, доказано отсутствием аутоиммунных реакций, можно успешно применять против заболевания в виде полученного рекомбинантным способом агента. Идентификацию такого антитела можно,таким образом, осуществить без предварительного изучения молекулярного эпитопа целевой структуры,но скорее лишь с помощью его связывания с неоэпитопами очевидных патологических структур в хорошо клинико-патологически описанных срезах тканей, полученных из пациентов-людей или из моделей соответствующего заболевания на животных. Соответственно в первом аспекте изобретение относится к способу выделения связывающей молекулы, специфичной к белку, связанному с расстройством, включающему:(a) приведение во взаимодействие образца, полученного от пациента, у которого отсутствуют симптомы, или который клинически необычно стабилен, но который страдает или подвержен риску развития расстройства или эффективно подавляет проявление или вспышку расстройства, с препаратом патологически или физиологически измененных клеток или ткани с заранее определенными клиническими характеристиками; и(b) идентификацию и возможно выделение связывающей молекулы, которая предпочтительно связывается с указанным препаратом, и не связывается или связывается со значительно более низкой аффинностью с соответствующими клетками или тканями без подобных патологических характеристик,которые можно получить из здорового субъекта. Способ согласно изобретению можно осуществить, как описано в разделе "Примеры", используя средства, хорошо известные специалисту в данной области. Например, образец в жидком агрегатном состоянии, полученный от пациента, можно пропустить через первое отверстие трубки, которая контактирует с препаратом с целевой структурой, прочно закрепленным в камере для препарата, позволяя, тем самым, предполагаемым связывающим молекулам, присутствующим в образце, либо в растворимой форме, либо экспрессируемым на поверхности и мембране клетки, соответственно связываться с указанной целевой структурой. Образец в жидком агрегатном состоянии может содержать, например, лимфоциты и/или антитела, тогда как препаратом может быть срез ткани или мембрана, покрытая молекулами или комбинациями молекул, которые являются отличительными для патологической целевой структуры. Любую несвязавшуюся субстанцию можно удалить через второе отверстие трубки. В то же время,температуру камеры для препарата можно контролировать с помощью термостата для камеры для препарата, например, на таком уровне температуры, при котором происходит естественное связывание предполагаемой связывающей молекулы с неоэпитопом антигена, специфичным к препарату, в организме человека. С помощью движения потока, например пропускания образца в жидком агрегатном состоянии,содержащего связывающие молекулы, предпочтительно при температуре тела, через целевую структуру,можно стимулировать природные системы связывающих взаимодействий. Тем не менее, другие способы инкубации образца с препаратом, такие как с помощью шейкера или вращающейся платформы, можно- 15017611 также успешно применять. В частности, преимущество вышеупомянутой системы состоит в том, что она позволяет прерывание метаболических процессов в любое время путем повышения температуры камеры для препарата с помощью термостата камеры для препарата. При этом температуру камеры для препарата можно снизить, например, до 2-10C, в частности до 4C. Соответствующий прибор, который можно применять в соответствии со способом изобретения, описан в европейской заявке на патент EP 1069431A2. Следовательно, способ согласно изобретению позволит идентификацию и характеристику сливающихся клеток, а также одновременную идентификацию и характеристику молекулярных классов, молекулярных групп и/или молекулярных частей, требующихся для процесса связывания, т.е. целевых структур препарата, которые до настоящего времени могли оставаться неизвестными. Это не только позволит открыть новые возможные способы диагностики, но также обеспечит новую тест-систему для терапевтических подходов на молекулярном уровне. В качестве пациента можно определить в соответствии с настоящим изобретением группу здоровых добровольцев, если специфичные суррогатные маркеры предсказывают высокую вероятность статуса заболевания, которое, на удивление - и возможно вследствие специфичного эндогенного иммунного ответа, - тем не менее, не проявилось клинически. В этом смысле, как подверженный различным заболеваниям, здоровый пожилой человек будет индивидуумом, у которого еще не проявилось нейродегенеративное заболевание, как, например, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона, но у которого доклиническое развитие патофизиологических вариантов белка, т.е. белков, связанных с расстройством, и в вышеупомянутом смысле посредством раннего вмешательства гуморальной иммунной системы с вовлечением или без клеточных компонентов иммунной системы, было ограничено или отсрочено до такой степени, что, к моменту участия здоровых, но не доклинических пациентов, в данном исследовании,клиническое проявление заболевания еще не произошло. Предпочтительно не привлекающих внимания добровольцев, у которых ни не было диагностировано аутоиммунологических процессов, ни возникало в качестве побочных эффектов других возможных патологических состояний, привлекали в качестве доноров образцов в первом примере. В принципе, можно использовать образцы от пациентов, которых подвергли активной иммунизации вариантами физиологических белков или пептидов, у которых выработка антител была форсирована иммунизацией. Антитела, например, можно идентифицировать и выделить из пациентов с болезнью Альцгеймера,которых вакцинировали бета-амилоидным пептидом, см., например, Hock и др., Nature Medicine 8:12801275 (2002), Hock и др., Neuron 38:547-554 (2003) и WO 2004/095031, каждая полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Тем не менее, может оказаться предпочтительным применение образцов из добровольцев, которые не получали такую иммунизацию или соответствующее лечение, относящееся к расстройству, связанному и/или вызванному измененным патологическим белком. Согласно изобретению образцы пациента, например индивидуумов, которые были заранее выбраны по симптоматике, анализируют на присутствие связывающих молекул, специфично узнающих препарат очевидной патологической структуры, например, ex vivo в ткани из клинико-патологически описываемых пациентов-людей или в моделях на животных, как, например, трансгенные мыши, или in vitro в клеточных структурах, или в патологической аллогенной или ксеногенной ткани. Предпочтительно указанным пациентом и/или в качестве указанного субъекта, из которого получают препарат, выступает человек, наиболее предпочтительно оба - люди. Характерный препарат патологически или физиологически измененного образца, клетки или ткани предпочтительно обнаруживают оптическими методами после реакции со связывающей молекулой, например антителом согласно изобретению. Препарат можно получить в качестве/из образца клеток, среза ткани, клеточного мазка, образца клеток или ткани из модели заболевания человека на животном или культивированных in vitro клеток и ткани. Предпочтительно по меньшей мере один из указанных препаратов присутствует в камере для препарата в положениях для сканирования, при этом каждое положение для сканирования соответствует конкретной патологической структуре и по меньшей мере два положения для сканирования параллельно подвергают детектированию реакции с антителом. В качестве примера антитела к нейропатологическим отличительным признакам таких нейродегенеративных заболеваний,как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или тауопатии - включая бета-амилоидные бляшки, тельца Леви, нейрофибриллярные клубки и дистрофичный нейрит, можно обнаружить на срезах, полученных из мозговой ткани человека после смерти с клинико-патологически подтвержденным диагнозом, соответствующих связанных с заболеванием структур. Это осуществляют путем наклеивания небольших палочек залитой в парафин ткани на предметные стекла, которые затем инкубируют с образцами из пациента или здорового донора. Детектирование реакции с антителом осуществляют, следуя стандартным процедурам иммуногистохимии и сканирования с помощью микроскопа. На предметном стекле можно собрать множество микросрезов тканей, составляющих пораженные различными болезнями человека ткани, чтобы получить микрочип с множеством тканей. Аналогично,дополнительные препараты образцов тканей из моделей заболеваний человека на животных, клеточного мазка или клеток могут быть залиты в парафин и приклеены на предметные стекла отдельно или в комбинации с описанной выше мозговой тканью или рядом тканей, полученных из человека с болезнью- 16017611 Альцгеймера после его смерти. Таким образом, одно исследуемое положение на предметном стекле может включать смешанный ряд тканей и других препаратов, включающих очевидные патологические структуры. Чтобы повысить пропускную способность теста, на предметное стекло приклеивают препараты более чем в одном исследуемом положении. Предпочтительно препараты приклеивают на предметные стекла в восьми исследуемых положениях в формате два на четыре, подходящем для 96-луночного или микротитровального формата. Более подробное описание этого совместимого с микротитровальным форматом тканевого микрочипа можно найти ниже в дополнительном разделе методов. Как уже упоминалось, образец, который нужно проанализировать, может включать биологическую жидкость, образец клеток или супернатант образца клеток или его производное. Биологические жидкости, такие как люмбальная спинно-мозговая жидкость (CSF), плазма или моча, можно собрать, следуя стандартным клиническим процедурам после получения информированного согласия пациентов. Наиболее предпочтительно образец включает или получен из B-клеток или B-клеток памяти и/или включает антитела. Предпочтительно указанный пациент был определен как пораженный еще не проявляющимся расстройством или подвержен риску развития этого расстройства с помощью выявления присутствия или отсутствия суррогатного маркера, или путем установления необычно стабильного течения заболевания. Клинические критерии должны рассматриваться совместно с суррогатными маркерами, показывающими либо повышенную вероятность возникновения или проявления заболевания согласно изобретению в смысле доклинического состояния, либо, наоборот, доказывающими невозможность такого заболевания,уже случившегося, например, так как существует совокупность генетических факторов, вызывающих заболевание, или подвергание экстремальному воздействию или образ жизни делает фенотипическое развитие заболевания вероятным. В случае болезни Альцгеймера это означает, что согласно изобретению у таких волонтеров-людей ищут B-клетки или B-клетки памяти против белковых комплексов, связанных с нейропатологией, таких как агрегаты бета-амилоида, олигомерные виды бета-амилоида и бетаамилоидные фибриллы в бета-амилоидных бляшках, ищут филаменты из тау-протеина в нейрофибриллярных клубках, альфа-синуклеин в тельцах Леви или компоненты, до настоящего времени не идентифицированные на молекулярном уровне, эти добровольцы, в зависимости от возраста, принадлежат к группе индивидуумов, для которых либо частота заболевания болезнью Альцгеймера особенно высока,либо которые происходят генетически из популяции, несущей высокий риск болезни Альцгеймера. Это,например, люди старше 75 лет, не имеющие вовсе или имеющие лишь незначительные нейропсихологически измеримые когнитивные нарушения, или в случае выявления опухоли, люди, имеющие высоко показательные опухолевые маркеры, например генетические опухолевые маркеры, но не страдающие от заболевания (Alloul и др., Arch. Gerontology Geriatrics 27 (1998), 189; Dunn и др., Immunity 21 (2004) 137148). В случае умеренного когнитивного нарушения это пациенты, которые оставались клинически, нейропсихологически или когнитивно стабильными в течение многих лет, несмотря на ежегодный статистический риск, составляющий более чем 20% для развития нейродегенеративного заболевания, которое проявляется клинически и прогрессирует при дальнейшем течении. Таким образом, в одном варианте реализации указанный суррогатный маркер выбирают из группы, состоящей из пожилого возраста, мозговой амилоидной нагрузки, генотипа АроЕ, генотипа APP, генотипа PS1, уровня бета-амилоидного пептида в биологических жидкостях, изопростанов, тау-протеина и фосфорилированного тау-протеина. Особенным подходом для применения способа согласно изобретению является исследование образцов B-клеток и B-клеток памяти из заранее выбранных по симптоматике добровольцев на чипах с препаратами очевидно патологических тканей, полученных от субъектов с совершенно различными или родственными первичными заболеваниями. В частности, такие патологические ткани получены из пациентов-людей, страдающих от нейродегенеративных заболеваний, заболеваний, связанных с неправильной укладкой белка, амилоидоза ткани и других заболеваний, связанных с патологическими отложениями, аутоиммунных расстройств, воспалительных заболеваний, гиперпролиферативных и неопластических заболеваний, например опухолей, болезней накопления и инклюзионных болезней, а также из моделей заболеваний человека на животных, в частности из мышей, генетически измененных патологически значимыми генами человека. Водном особенно предпочтительном варианте реализации изобретение фокусируется на болезни Альцгеймера. В этом варианте реализации образец получают из субъекта, предпочтительно удовлетворяющего следующим критериям:b) имеет все когнитивные способности и хорошее здоровье;c) не имеет клинических признаков деменции; илиd) имеет необычно низкую скорость прогрессирования заболевания, несмотря на присутствие установленного клинического диагноза вероятной болезни Альцгеймера; илиe) имеет необычно низкую скорость перехода от умеренного когнитивного нарушения (УКН) к болезни Альцгеймера с развернутой клинической картиной. В дополнительном варианте реализации способ согласно изобретению дополнительно включаетa) очистки B-клеток или B-клеток памяти из образца, который был определен как содержащий связывающие молекулы, например антитела, которые предпочтительно связываются с указанным препаратом, но не связываются или связываются со значительно более низкой аффинностью с соответствующими клетками или тканью здорового субъекта;b) получения репертуара генов иммуноглобулинов, кодирующих указанные антитела из указанныхc) применения указанного репертуара для экспрессирования указанных антител, и возможно при этом этап (b) включает этапы:d) получения мРНК из указанных B-клеток или B-клеток памяти;e) получения кДНК из мРНК этапа (iv);f) применения реакции удлинения праймера для амплификации по указанной кДНК фрагментов,соответствующих тяжелым цепям (НС) и каппа/лямбда легким цепям (LC) указанных антител. Способы получения клонов иммортализованных B-клеток и B-лимфоцитов памяти человека, включающие этап трансформации B-лимфоцитов памяти человека с помощью вируса Эпштейн-Барр (EBV) в присутствии поликлонального активатора B-клеток, суммированы в международной заявке WO 2004/076677. Эта международная заявка также описывает способы получения последовательности нуклеиновых кислот, которая кодирует интересующее антитело, включающее этапы получения иммортализованного клона B-клетки и получения/секвенирования нуклеиновой кислоты из клона B-клетки, которая кодирует интересующее антитело, а затем вставки нуклеиновой кислоты в хозяина или применения нуклеиновой кислоты для получения хозяина для экспрессии, который может экспрессировать интересующее антитело, культивирования или субкультивирования хозяина для экспрессии в условиях, когда интересующее антитело экспрессируется, и возможно очистки интересующего антитела. В этой заявке не упоминается, что над нуклеиновой кислотой можно совершать дополнительные манипуляции, чтобы ввести сайты рестрикции, изменить использование кодона и/или ввести или оптимизировать регуляторные последовательности транскрипции и/или трансляции. Например, последовательности нуклеиновых кислот можно получить с помощью обратной трансляции полипептидной последовательности согласно изобретению, применяя программное обеспечение, такое как программное обеспечение Vector NTI, для получения последовательностей нуклеиновых кислот, которые оптимизированы по использованию кодона и оптимизированы по стабильности РНК. Все эти методики соответствуют существующему уровню техники, и их может осуществить специалист в данной области без чрезмерных усилий. Дополнительные способы иммортализации B-клеток человека хорошо известны в данной области, например конструирование человеческих гибридом или химерных гибридом человека и мыши. В дополнительном аспекте изобретение относится к связывающей молекуле, которая способна селективно распознавать эпитоп связанного с заболеванием белка, включая неоэпитоп связанного с заболеванием белка, который предпочтительно можно получить или подтвердить с помощью способа согласно изобретению, описанного в данной заявке ранее и описанного в примерах. Преимущественно связывающая молекула согласно изобретению, по существу, не узнает указанный белок в не связанной с расстройством форме; см. также выше. Средства и способы рекомбинантного получения связывающих молекул, в частности антител и их мимиков, а также способы скрининга на конкурирующие связывающие молекулы, которые могут быть или могут не быть антителами, известны в данной области и суммированы, например, в международной заявке WO 2006/103116 в отношении антител против бета-амилоида и лечения/диагностики болезни Альцгеймера, содержание описания которой включено в данную заявку посредством ссылки в рамках конструирования антител и введения для терапевтических или диагностических применений. Тем не менее, в данной заявке, в частности, в отношении терапевтического применения у человека антитело согласно изобретению представляет собой антитело человека. В этом контексте измененный патологический белок, распознаваемый антителом, предпочтительно является связанным с неврологическим расстройством, предпочтительно мозговым расстройством. Более того, как показано в примерах 3-5, связывающая молекула согласно изобретению, в частности антитело, имеет некоторые преимущественные биологические свойства, одно или большее количество которых достигнуто настоящим изобретением впервые, например, она способна:(ii) связывать бета-амилоидные бляшки, цереброваскулярный амилоид, диффузные бетаамилоидные отложения, нейрофибриллярные клубки, гиперфосфорилированный тау-протеин, положительные на альфа-синуклеин тельца Леви или белковые агрегаты, связанные с дистрофичными нейритами;(iii) удалять бета-амилоидные бляшки из мозга и/или предотвращать образование амилоидных бляшек в мозге;(iv) по существу, восстанавливать нормальное поведение и/или(v) не вызывать микрокровоизлияний. В особенно предпочтительном варианте реализации антитело или эквивалентную связывающую- 18017611 молекулу согласно изобретению можно отличить от других антител по одному или более из следующих свойств, например, она способна: 1) пересекать, по меньшей мере, в небольших количествах гематоэнцефалический барьер в местах патологических событий; 2) связываться с одной или большим количеством патофизиологически значимых внеклеточных или клеточных структур; 3) приводить к уменьшению патофизиологически значимой структуры in vitro или in vivo; 4) приводить к уменьшению патофизиологически значимой структуры и к снижению связанной с ней токсичности; 5) приводить к блокированию или задержке процесса заболевания; 6) приводить к восстановлению клеточных, органоспецифичных и организменных функций и, возможно, к вторичному предотвращению рецидива исходной патофизиологии после ликвидации токсичности, связанной с патофизиологически значимыми структурами и/или 7) не связана с повышением числа микрокровоизлияний. Более того, отсутствие перекрестной реакции с физиологическими предшественниками или производными приводит к таким результатам, что, во-первых, концентрации можно предсказать, так как эффекты разбавления в здоровых тканевых структурах устранены, и, во-вторых, что аутоиммунные ответы в смысле нежелательных побочных эффектов, по существу, отсутствуют. Вдобавок, в предыдущих сообщениях предположили связь церебральной амилоидной ангиопатии (CAA) с аномальной сосудистой реактивностью в трансгенной модели на мышах с CAA (Mueggler и др., J Neurosci 22 (2002), 7218-24.). При тяжелой CAA, обнаруживаемой у старых arcA мышей (Knobloch и др., Neurobiol. Aging 28:12971306 (2007) электронная публикация от 31 июля, 2006), может, таким образом, ограничиваться приводящая к расширению сосудов гибкость поврежденных кровеносных сосудов. В соответствии с настоящим изобретением разумно ожидать, что лечение антителами согласно изобретению может улучшить вазореактивность и мозговой кровоток у старых APP-трансгенных мышей. Это можно подтвердить, используяarcA модель на мышах, описанную у Knobloch и др. (2006), выше, и описанную в заявке на патент США"Transgenic animal model for Alzheimer's disease", Grimm и др., серийный номер 60/934291, поданной 11 июня, 2007, содержание описания которой включено в данную заявку посредством ссылки.III. Антитела. Изобретение дополнительно направлено на связывающие молекулы, например антитела и их связывающие фрагменты, варианты и производные, показанные в табл. 2 и 3. Изобретение особенно направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело специфично связывается с тем же неоэпитопом белка, связанного с расстройством, что и эталонное антитело, выбранное из группы, состоящей из NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI101.12F6A, NI-101.13 А и NI-101.13 В. Изобретение дополнительно направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A,NI-101.13 А и NI-101.13 В, с неоэпитопом белка, связанного с расстройством. Изобретение также направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, при этом указанное антитело включает антигенсвязывающий домен, идентичный таковому для антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI101.12F6A, NI-101.13 А и NI-101.13 В. Изобретение дополнительно служит примером некоторых таких связывающих молекул, например антител и их связывающих фрагментов, которые можно охарактеризовать тем, что в их вариабельную область, например в связывающий домен, включен по меньшей мере один гипервариабельный участок(CDR) VH и/или VL вариабельной области, включающей любую из последовательностей аминокислот,представленных в табл. 2 (VH) и табл. 3 (VL). Соответствующие последовательности нуклеотидов, кодирующие идентифицированные выше вариабельные области, приведены в приложенном списке последовательностей. Типичный набор CDR вышеуказанных последовательностей аминокислот VH и/или VL области, представленных в табл. 2 и 3, дан в табл. 4. Тем не менее, как описано далее, специалисту в данной области понятно, что в качестве дополнения или альтернативы можно применять CDR, которые отличаются по своей последовательности аминокислот от приведенных в табл. 4 по одной, двум, трем или даже большему количеству аминокислот в случае CDR2 и CDR3.- 20017611 Таблица 4 Обозначение белковых последовательностей CDR по номенклатуре по Kabat В одном варианте реализации антитело согласно изобретению представляет собой любое из антител, включающих последовательность аминокислот VH и/или VL области, представленную в табл. 2 и 3. В качестве альтернативы антитело согласно изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое конкурирует за связывание с неоэпитопом по меньшей мере с одним из антител, имеющих VH и/или VL области, такие как показано в табл. 2 и 3. Эти антитела могут быть мышиными, а также, тем не менее, предпочтительно гуманизированными, ксеногенными или химерными антителами человека и мыши, в частности, для терапевтических применений. Антигенсвязывающим фрагментом указанного антитела может быть, например, одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')2 фрагмент. Для некоторых применений требуются только вариабельные области антитела, которые можно получить путем обработки указанного антитела подходящими реактивами, чтобы получить Fab', Fab, или F(ab")2 части. Такие фрагменты достаточны для применения,например, в иммунодиагностических процедурах, включающих связывание иммуноспецифичных частей иммуноглобулинов с детектируемыми реактивами, такими как радиоактивные изотопы. Изобретение дополнительно направлено на выделенные полипептиды, которые составляют антитела согласно изобретению. Антитела согласно изобретению включают полипептиды, например последовательности аминокислот, составляющие специфичные антигенсвязывающие области, полученные из молекул иммуноглобулинов. Полипептид или последовательность аминокислот, "полученные из" указанного белка, относится к происхождению полипептида, имеющего некоторую последовательность- 21017611 аминокислот. В некоторых случаях полипептид или последовательность аминокислот, которая получена из конкретного изначального полипептида или последовательности аминокислот, имеет последовательность аминокислот, которая, по существу, идентична изначальной последовательности, или ее части, при этом указанная часть состоит по меньшей мере из 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот, по меньшей мере 30-50 аминокислот, или которая любым другим способом может быть идентифицирована рядовым специалистом в данной области как происходящая от изначальной последовательности. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина(VH), при этом по меньшей мере один VH-CDR вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два VH-CDR вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. В качестве альтернативы VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 области VH по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 тяжелой цепи из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область тяжелой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, родственные группам последовательностей, представленных в табл. 4 выше. Хотя в табл. 4 представлены VH-CDR, определенные по системе Kabat, другие определения CDR, например VH-CDR, определенные по системеChothia, также включены в изобретение и их может легко определить рядовой специалист в данной области, используя данные, представленные в табл. 2 и 3. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина(VH), в которой VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 области имеют полипептидные последовательности,которые идентичны группам последовательностей VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, представленных в табл. 4. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина(VH), в которой VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 области имеют полипептидные последовательности,которые идентичны группам последовательностей VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, представленных в табл. 4, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или шести замен аминокислот в любом из VHCDR. В некоторых вариантах реализации указанные замены аминокислот являются консервативными. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL),при этом по меньшей мере один VL-CDR вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два изVL-CDR вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот для сравнения легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3 из антител,описанных в данной заявке. В качестве альтернативы VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 области VL по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот легкой цепи для сравнения VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 из антител, описанных в данной заявке. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельная область легкой цепи согласно изобретению имеет полипептидные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, родственные полипептидам, представленным в табл. 4 выше. Хотя в табл. 4 представлены VL-CDR, определенные по системе Kabat, другие определения CDR, например VL-CDR, определенные по системе Chothia, также включены в изобретение. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL),в которой VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 области имеют полипептидные последовательности, которые идентичны группам последовательностей VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, представленным в табл. 4. В другом варианте реализации изобретение обеспечивает выделенный полипептид, включающий,состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL),в которой VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 области имеют полипептидные последовательности, идентичные группам последовательностей VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, представленным в табл. 4, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти или шести замен аминокислот в любом из VL-CDR. В некоторых вариантах реализации указанные замены аминокислот являются консервативными. Иммуноглобулин или кодирующие его кДНК могут быть дополнительно модифицированы. Таким образом, в дополнительном варианте реализации способ согласно изобретению включает любой этап(ы) получения химерного антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента,биспецифичного антитела, слитого антитела, меченого антитела или некоторого аналога любого из перечисленных. Соответствующие способы известны специалисту в данной области и описаны, например, уHarlow и Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Если производные указанных антител получали с помощью методики фагового дисплея, поверхностный плазмонный резонанс, который используется в системе BIAcore, можно применять для повышения эффективности фаго- 22017611 вых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из антител, описанных в данной заявке (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 713). Получение химерных антител описано, например, в международной заявке WO 89/09622. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в европейской заявке EP-A1 0239400 и международной заявке WO 90/07861. Дополнительным источником антител, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, являются так называемые ксеногенные антитела. Основной принцип получения ксеногенных антител, таких как антитела человека в мышах, описан, например, в международных заявках WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735. Как обсуждалось выше, антитело согласно изобретению может существовать во множестве форм помимо целых антител; включая, например, Fv, Fab и F(ab)2, а также в виде отдельных цепей; см., например, международную заявку WO 88/09344. Антитела согласно изобретению или соответствующую их иммуноглобулиновую цепь (цепи) можно дополнительно модифицировать, применяя обычные методики, известные в данной области, например с помощью делеции (делеций), вставки (вставок), замены (замен), добавления (добавлений) и/или рекомбинации (рекомбинаций) аминокислот и/или любой другой модификации(й), известных в данной области, либо отдельно, либо в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащую в основе последовательности аминокислот цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалисту в данной области; см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates и Wiley Interscience, N.Y. (1994). Модификации антитела согласно изобретению включают химическое и/или ферментативное получение производных по одной или большему количеству составляющих аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации остова и N- и C-концевые модификации, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение молекул углеводов или липидов, кофакторов и т.п. Подобным образом, в объем изобретения входит получение химерных белков, которые включают описанное антитело или некоторый его фрагмент, слитый по аминоконцу с гетерологичной молекулой, такой как иммуностимулирующий лиганд на карбоксильном конце; см., например, международную заявку WO 00/30680 для соответствующих технических подробностей. Дополнительно, в объем изобретения входят небольшие пептиды, включая такие, которые содержат связывающую молекулу, как описано выше, например содержат CDR3 область вариабельной области любого из упомянутых антител, в частности CDR3 тяжелой цепи, поскольку часто наблюдали, что CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) представляет собой область, имеющую большую степень вариабельности и доминирующее участие во взаимодействии антиген-антитело. Такие пептиды можно легко синтезировать или получить рекомбинантными способами, чтобы получить связывающий агент, полезный согласно изобретению. Такие способы хорошо известны рядовым специалистам в данной области. Пептиды можно синтезировать, например, применяя автоматизированные синтезаторы пептидов, которые доступны для приобретения. Пептиды можно получить с помощью рекомбинантных методик путем введения ДНК,кодирующей указанный пептид, в вектор экспрессии и трансформации клеток вектором экспрессии, чтобы получить пептид. Следовательно, изобретение относится к любой связывающей молекуле, например антителу или связывающему фрагменту, которую можно получить в соответствии с вышеописанными способами и которая проявляет упомянутые свойства, т.е. которая специфично узнает неоэпитоп. Такие антитела и связывающие молекулы можно подвергнуть тестам на их специфичность связывания и аффинность, например, применяя способ выделения специфичных к неоэпитопу связывающих молекул, описанный ранее в данной заявке. В качестве альтернативы получению иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных B-клеток или B-клеток памяти иммортализованные клетки можно использовать в качестве источника перестроенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетического манипулирования. Перестроенные гены антитела можно подвергнуть обратной транскрипции из соответствующих мРНК с получением кДНК. Если это необходимо, константную область тяжелой цепи можно заменить на таковую из отличного изотипа или вовсе удалить их все. Вариабельные области могут быть связаны так, чтобы они кодировали одноцепочечные Fv области. Множество Fv областей можно связать, чтобы придать способность связывания более чем c одной мишенью, или можно использовать химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. Как только генетический материал стал доступен, разработка аналогов, описанных выше, которые сохраняют способность связываться с желаемой мишенью, не вызывает затруднений. Способы клонирования вариабельных областей антитела и получения рекомбинантных антител известны специалисту в данной области и описаны, например, у Gilliland и др., TissueAntigens 47 (1996), 1-20; Doenecke и др., Leukemia 11 (1997), 1787-1792. Как только получен подходящий генетический материал и, если это необходимо, модифицирован таким образом, чтобы он кодировал аналог, кодирующие последовательности, включая такие, которые кодируют, как минимум, вариабельные области тяжелой и легкой цепи, можно вставить в системы экспрессии, содержащиеся на векторах, которыми можно трансфецировать стандартные рекомбинантные- 23017611 клетки-хозяева. Можно применять множество таких клеток-хозяев; для эффективного процессинга, тем не менее, клетки млекопитающих являются предпочтительными. Типичные линии клеток млекопитающего, полезные для этой цели, включают, но не ограничены перечисленными, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки почки эмбриона человека (HEK 293) или клетки мышиной миеломы (NSO). Получение антитела или аналога затем осуществляют путем культивирования модифицированного рекомбинантного хозяина при условиях культивирования, подходящих для роста клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Антитела затем получали путем выделения из культуры. Системы экспрессии предпочтительно разработаны таким образом, что они включают сигнальные пептиды, так что полученные антитела секретируются в среду; тем не менее, внутриклеточное получение также возможно. Как только целевая структура, например связанный с заболеванием белок, была помечена при взаимодействии с образцом соответствующей связывающей молекулой, содержащейся в нем, ее можно идентифицировать средствами и способами, хорошо известными в данной области, например, применяя масс-спектрометрические (MS) методики, такие как описанные в международной заявке WO 00/11208 и особенно описанные у Hock и др., Nat Med 8 (2002), 1270-1275; Hock и др., Neuron 38 (2003), 547-554. Таким образом, в случае если антитело, идентифицированное в соответствии с настоящим изобретением,полученное in vitro, связывается с патологическими структурами, например с бета-амилоидными бляшками, в срезах пораженной патологией области мозга, но не связываются значительно со здоровыми тканями, тогда идентифицировано перспективное антитело-кандидат, молекулярную целевую структуру которого можно затем выделить в достаточном количестве и очистить за счет ее свойства связывания с антителом из патологических тканей и, в итоге, можно идентифицировать и описать посредством аналитических белковых и масс-спектрометрических способов, как, например, MALDI/TOF (Williams, MethodsCell. Biol. 62 (2000), 449-453; Yates, J. Mass. Spectrom. 33 (1998), 1-19). Соответственно в другом варианте реализации изобретение относится к антигену, который узнается связывающей молекулой, особенно антителом согласно изобретению, ранее описанным в данной заявке,и который предпочтительно представляет собой по меньшей мере часть белка, связанного с расстройством. В соответствии с вышесказанным изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антиген или связывающую молекулу согласно изобретению, в случае антитела, предпочтительно, по меньшей мере, вариабельную область цепи иммуноглобулина антитела, описанного выше. Обычно указанная вариабельная область, кодируемая полинуклеотидом, включает по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) VH и/или VL вариабельной области указанного антитела. Для специалиста в данной области очевидно, что каждый вариабельный домен (тяжелая цепь VH и легкая цепь VL) антитела включает три гипервариабельные области, иногда называемые областями, определяющими комплементарность, или "CDR", окруженные (фланкированные) четырьмя относительно консервативными каркасными областями или "FR", и относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельные области или CDR антитела человека IgG подтипа включают аминокислотные остатки из остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, что было описано уof Health, Бетесда, Мэриленд (1991), и/или остатки из гипервариабельной петли, например остатки 26-32(L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, что было описано у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Каркасные или FR остатки представляют собой такие остатки в вариабельном домене, которые отличны от захватывающих в "вилку" остатков гипервариабельной области. Термин "специфичное связывание" относится к связыванию антител с заранее определенным антигеном. Обычно, антитело связывается с константой диссоциации (KD), равной 10-7 М или менее, и связывается с заранее определенным антигеном с KD, которая по меньшей мере в два раза меньше, чем его KD для связывания с неспецифичным антигеном (например, бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин или любой другой известный полипептид), отличным от заранее определенного антигена. Формулировки "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное к антигену" используются взаимозаменяемо в данной заявке с термином"антитело, которое специфично связывается с антигеном". В данной заявке "высокоспецифичное" связывание обозначает, что относительная KD указанного антитела к определенному целевому эпитопу, например неоэпитопу, по меньшей мере в 10 раз меньше, чем KD связывания этого антитела с другими лигандами или с нативным аналогом связанного с заболеванием белка. Аффинность или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально, применяя любой подходящий способ; см., например, Berzofsky и др., "Antibody-Antigen Interactions" в FundamentalFreeman and Company, Нью-Йорк, Нью-Йорк (1992), и способы, описанные в данной заявке. Основные методики измерения аффинности антитела к антигену включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и поверхностный плазмонный резонанс. Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может изменяться, если измерения проводились при раз- 24017611 личных условиях, например концентрации соли, pH. Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена, например KD, IC50, предпочтительно осуществляют в стандартизованных растворах антитела и антигена и в стандартизованном буфере. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что вариабельный домен антитела,имеющего вышеописанный вариабельный домен, можно применять для конструирования других полипептидов или антител с желаемой специфичностью и биологической функцией. Таким образом, в объем изобретения также входят полипептиды и антитела, включающие по меньшей мере один CDR из вышеописанного вариабельного домена, и который преимущественно имеет, по существу, такие же или подобные свойства связывания, что и антитело, описанное в прилагаемых примерах. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что, используя вариабельные домены или CDR, описанные в данной заявке, можно сконструировать антитела согласно способам, известным в данной области, например описанным в европейских заявках на патент EP 0451216 A1 и EP 0549581 A1. Более того, для специалиста в данной области очевидно, что аффинность связывания можно усилить, осуществляя замены аминокислот внутри CDR или внутри гипервариабельных петель (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196(1987), 901-917), которые частично перекрываются с CDR, определенными у Kabat. Таким образом, изобретение также относится к антителам, в которых один или более из упомянутых CDR включает одну или более, предпочтительно не более чем две, замены аминокислот. Предпочтительно антитело согласно изобретению включает в одной или обеих цепях иммуноглобулина два или все три CDR вариабельных областей, описанных в табл. 4. Связывающие молекулы, например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты,или производные согласно изобретению, что известно рядовым специалистам в данной области, могут включать константную область, которая опосредует одну или более эффекторных функций. Например,связывание C1 компонента системы комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и разрушения (лизиса) клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может также участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Дополнительно, антитела связываются с рецепторами на различных клетках посредством Fc области, при этом сайт связывания Fc-рецептора на Fc-области антитела связывается с Fc-рецептором (FcR) на клетке. Существует ряд Fc-рецепторов, которые специфичны к различным классам антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эпсилон-рецепторы), IgA (альфарецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток инициирует ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, очищение (клиренс) от иммунных комплексов, лизис покрытых антителами целевых клеток клетками-киллерами (называемый антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью, или ADCC), высвобождение воспалительных медиаторов, передачу через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов. Соответственно некоторые варианты реализации изобретения включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в котором, по меньшей мере, фракция одного или более доменов константной области была удалена или другим способом изменена таким образом, чтобы обеспечить желаемые биохимические характеристики, такие как пониженные эффекторные функции,способность к нековалентной димеризации, повышенная способность сосредотачиваться в месте возникновения опухоли, пониженное время полужизни в сыворотке, или повышенное время полужизни в сыворотке по сравнению с целым, неизмененным антителом с приблизительно такой же иммуногенностью. Например, некоторые антитела для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, представляют собой антитела с удаленными доменами, которые включают полипептидную цепь, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но в которой отсутствует по меньшей мере часть одного или более доменов тяжелой цепи. Например, в некоторых антителах один домен константной области модифицированного антитела будет полностью удален, например весь или часть CH2 домена будет удалена. В других вариантах реализации некоторые антитела для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, имеют константную область, например константную область тяжелой цепи IgG, которая изменена, чтобы исключить гликозилирование, такие антитела называют где-либо в данной заявке агликозилированными или "агли"-антителами. Такие "агли"-антитела можно получить ферментативно, а также путем конструирования консенсусного сайта(ов) гликозилирования в константной области. Без привязки к теории, полагают, что "агли"-антитела могут иметь улучшенный профиль безопасности и стабильности in vivo. Способы получения агликозилированных антител, имеющих желаемую эффекторную функцию, можно найти, например, в WO 2005/018572, которая полностью включена посредством ссылки. В некоторых антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в данной заявке, Fc часть можно мутировать, чтобы снизить эффекторную функцию, применяя методики, известные в данной области. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других способов) домена константной области может уменьшить связывание с Fc-рецептором циркулирующего модифицированного антитела, тем самым повышая опухолевую локализацию. В других случаях может быть, что модификации константной области в соответствии с настоящим изобрете- 25017611 нием уменьшают связывание комплемента и, таким образом, уменьшают время полужизни в сыворотке и неспецифичное связывание сопряженного цитотоксина. Еще другие модификации константной области можно применять для модификации дисульфидных связей или молекул олигосахаридов, что позволит усилить локализацию вследствие повышенной антигенной специфичности или гибкости антитела. Полученный физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций,такие как опухолевая локализация, биораспределение и время полужизни в сыворотке, можно легко измерить и определить количественно, применяя хорошо известные иммунологические методики без проведения лишних экспериментов. Модифицированные формы антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных согласно изобретению можно получить из целых предшественников или родительских антител, применяя методики, известные в данной области. Типичные методики обсуждаются более подробно в данной заявке. В некоторых вариантах реализации как вариабельные, так и константные области антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных согласно изобретению являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела можно получить, применяя методики, которые известны в данной области и описаны в данной заявке. Например, полностью человеческие антитела против конкретного антигена можно получить путем введения антигена трансгенному животному, которое было изменено таким образом, что оно продуцирует такие антитела в ответ на антигенный стимул,но чьи эндогенные локусы были отключены. Типичные методики, которые можно применять для получения таких антител, описаны в патентах США 6150584; 6458592; 6420140. Другие методики известны в данной области. Полностью человеческие антитела можно подобным образом получить с помощью различных методик дисплея, например с помощью фагового дисплея или других вирусных систем дисплея, описанных более подробно где-либо еще в данной заявке. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты, или производные согласно изобретению можно получить или производить, применяя методики, которые известны в данной области. В некоторых вариантах реализации молекулы антител или их фрагменты "получены рекомбинантным способом", т.е. получены с применением технологии рекомбинантных ДНК. Типичные методики для получения молекул антител или их фрагментов обсуждаются более подробно где-либо еще в данной заявке. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению также включают производные, которые модифицированы, например, путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу таким образом, что ковалентное присоединение не предотвращает специфичное связывание антитела с родственным эпитопом. Например, но не с целью ограничения,производные антител включают антитела, которые были модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связи с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций можно осуществить с помощью известных методик, включая, но не ограничиваясь перечисленными, специфичное химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Дополнительно, указанное производное может содержать одну или более неклассических аминокислот. В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению не будут вызвать опасный иммунный ответ у животного, которого нужно лечить, например у человека. В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению получают из пациента, например пациента-человека, и затем используют в том же виде организма, из которого они были получены, например человека, уменьшая или минимизируя возникновение опасных иммунных ответов. Деиммунизацию можно также применять для снижения иммуногенности антитела. В данной заявке термин "деиммунизация" включает изменение антитела для модификации T-клеточных эпитопов (см.,например, WO 9852976A1, WO 0034317A2). Например, анализировали VH и VL последовательности из изначального антитела и "карта" T-клеточных эпитопов человека для каждой V области показывала расположение эпитопов по отношению к гипервариабельным областям (CDR) и другим ключевым остаткам внутри последовательности. Отдельные T-клеточные эпитопы из карты T-клеточных эпитопов анализировали, чтобы идентифицировать альтернативные замены аминокислот с низким риском изменения активности конечного антитела. Был разработан диапазон альтернативных последовательностей VH и VL,включающих комбинации замен аминокислот, и эти последовательности затем были включены в диапазон связывающих полипептидов, например неоэпитопспецифичных антител или их иммуноспецифичных фрагментов, для диагностического и лечебного применения в способах, описанных в данной заявке, которые затем тестировали на функционирование. Обычно получали и тестировали от 12 до 24 вариантов антител. Целые гены тяжелой и легкой цепи, включающие модифицированные V и человеческие С области, затем клонировали в векторы экспрессии и полученные плазмиды вводили в линии клеток для получения целого антитела. Антитела затем сравнивали в подходящих биохимических и биологических анализах, и идентифицировали оптимальный вариант.- 26017611 Моноклональные антитела можно получить, применяя большое разнообразие методик, известных в данной области, включая применение гибридомных, рекомбинантных методик и методик фагового дисплея, или их комбинации. Например, моноклональные антитела можно получить, применяя гибридомные методики, включая известные в данной области и описанные, например, у Harlow и др., Antibodies: AAntibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (указанные ссылки полностью включены в данную заявку посредством ссылки). Термин "моноклональное антитело" в данной заявке не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, которое получено от одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не к способу, которым оно было получено. Таким образом, термин"моноклональное антитело" не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Моноклональные антитела можно получить, применяя большое разнообразие методик, известных в данной области. В некоторых вариантах реализации антитела согласно изобретению получали изB-клеток человека, которые были иммортализованы путем трансформации вирусом Эпштейн-Барр, как описано в данной заявке. В хорошо известном процессе получения гибридом (Kohler и др., Nature 256:495 (1975 относительно короткоживущие, или смертные, лимфоциты из млекопитающего, например B-клетки, полученные из человека, как описано в данной заявке, сливают с бессмертной опухолевой линией клеток (например, миеломной линией клеток), таким образом получают гибридные клетки или "гибридомы", которые как бессмертны, так и способны продуцировать генетически кодированное антитело из B-клетки. Полученные гибриды сортируют на отдельные генетические штаммы с помощью селекции, разведения и повторного выращивания, при этом каждый отдельный штамм включает определенные гены для получения одного антитела. Они продуцируют антитела, которые являются гомогенными против желаемого антигена и, в отношении их генетически чистого происхождения, называются "моноклональными". Клетки гибридомы, полученные таким образом, высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживаемость неслитых, родительских клеток миеломы. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что реактивы, линии клеток и среды для получения, селекции и выращивания гибридом доступны для приобретения из ряда источников и стандартизованные протоколы являются общепринятыми. Как правило, культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют для получения моноклональных антител против желаемого антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют с помощью in vitro тестов, таких как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или тесты на связывание неоэпитопа, описанные в данной заявке. После того как клетки гибридомы, которые продуцируют антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, были идентифицированы, указанные клоны можно субклонировать с помощью процедур лимитирующих разведений и выращивать стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, AcademicPress, с. 59-103 (1986. Дополнительно должно быть очевидно, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, перитонеальной жидкости или сыворотки с помощью обычных процедур очистки, таких как, например, протеин-A, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. Фрагменты антител, которые узнают специфичные эпитопы, можно получить известными методиками. Например, Fab и F(ab')2 фрагменты можно получить рекомбинантным способом или путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов, применяя ферменты, такие как папаин (для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2 фрагментов). F(ab')2 фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и CH1 домен тяжелой цепи. Полностью человеческие антитела, такие как описанные в данной заявке, являются особенно подходящими для терапевтического лечения пациентов-людей. Антитела человека можно получить с помощью множества способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея, описанные выше, применяя библиотеки антител, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человека,см. также, патенты США 4444887 и 4716111 и публикации PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741; каждая из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Антитела человека согласно изобретению выделяют,например, из пациентов, которые не проявляют симптомов, но подвержены риску развития расстройства,например болезни Альцгеймера, или из пациента с расстройством, но с необычно стабильным течением заболевания. В другом варианте реализации ДНК, кодирующую желаемые моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать, применяя обычные процедуры (например, с помощью применения олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Выделенные и субклонированные клетки гибридом служат предпочтительным источником таких ДНК. Сразу после выделения ДНК можно ввести в векторы экспрессии, которыми затем трансфецируют прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, такие как, но не огра- 27017611 ниченные перечисленными, клетки E. coli, клетки африканской зеленой мартышки (COS), клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулины. А именно, выделенную ДНК (которая может быть синтетической, как описано в данной заявке) можно применять, чтобы клонировать последовательности константной и вариабельной областей для производства антител, как описано у Newman и др., патент США 5658570, поданный 25 января, 1995, который включен в данную заявку посредством ссылки. По существу, эта процедура включает экстрагирование РНК из выбранных клеток, перевод в кДНК и амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР), с применением Ig-специфичных праймеров. Подходящие для этой цели праймеры также описаны в патенте США 5658570. Как более подробно описано ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие желаемое антитело, можно выращивать в относительно больших количествах, чтобы обеспечить клинические и коммерческие поставки указанного иммуноглобулина. В одном варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере одинCDR тяжелой или легкой цепи молекулы антитела. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере два CDR из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере три CDR из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере четыре CDR из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере пять CDR из одной или более молекул антител. В другом варианте реализации антитело согласно изобретению включает по меньшей мере шесть CDR из одной или более молекул антител. Типичные молекулы антител, включающие по меньшей мере один CDR, которые могут быть включены в антитела согласно изобретению, описаны в данной заявке. В конкретном варианте реализации, последовательность аминокислот вариабельных доменов тяжелых и/или легких цепей можно тщательно изучить, чтобы выявить последовательности гипервариабельных участков (CDR) с помощью способов, которые хорошо известны в данной области, например путем сравнения с известными последовательностями аминокислот других вариабельных областей тяжелых и легких цепей, чтобы определить области гипервариабельности последовательности. Применяя обычные методики рекомбинантной ДНК, один или более CDR можно ввести в каркасные области, например в каркасные области человека. Каркасные области могут быть встречающимися в природе или консенсусными каркасными областями и предпочтительно каркасными областями человека (см., например, Chothia и др., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) для списка каркасных областей человека). В некоторых вариантах реализации полинуклеотид, полученный путем комбинирования каркасных областей и CDR, кодирует антитело, которое специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом желаемого полипептида. В некоторых вариантах реализации можно сделать одну или более замен аминокислот внутри каркасной области, чтобы, например, улучшить связывание антитела с его антигеном. Дополнительно, такие способы можно применять для совершения аминокислотных замен или делеций одного или более цистеиновых остатков вариабельной области, участвующих во внутрицепочечных дисульфидных связях, чтобы получить молекулы антител, в которых отсутствует одна или более внутрицепочечных дисульфидных связей. Другие изменения полинуклеотида предусмотрены настоящим изобретением и находятся в рамках компетентности в данной области. В качестве альтернативы методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США 4694778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988) и Ward и др., Nature 334:544-554 (1989 можно адаптировать для получения одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела получают путем сшивки фрагментов Fv области тяжелой и легкой цепи посредством аминокислотного мостика, что дает одноцепочечное антитело. Методики сборки функциональных Fv фрагментов в E. coli также можно применять (Skerra и др., Science 242:1038-1041 (1988. В другом варианте реализации с помощью микроманипуляций можно отобрать лимфоциты и изолировать вариабельные гены. Например, мононуклеары периферической крови можно выделить из иммунизированного или естественно иммунного млекопитающего, например человека, и культивировать в течение приблизительно 7 дней in vitro. Культуры можно подвергнуть скринингу на специфичные IgG,которые удовлетворяют критериям скрининга. Клетки из положительных лунок можно выделить. Отдельные Ig-продуцирующие B-клетки можно выделить с помощью сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) или путем их идентификации в тесте на опосредованное комплементом образование гемолитических бляшек. Можно проводить микроманипуляции в пробирке над B-клетками, продуцирующими Ig, и VH и VL гены можно амплифицировать, применяя, например, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). VH и VL гены можно клонировать в вектор экспрессии антител и трансфецировать им клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии. В качестве альтернативы продуцирующие антитело линии клеток можно подвергнуть селекции и культивировать, применяя методики, хорошо известные специалисту в данной области. Такие методики описаны во множестве практикумов и первичных публикаций. В этом отношении, методики, подходящие для применения в настоящем изобретении, как описано ниже, описаны в Current Protocols in Immunology, Coligan и др., ред., Green Publishing Associates и Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991), которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки, включая дополнительные материалы. Антитела согласно изобретению можно получить с помощью любого способа, известного в данной области для синтеза антител, в частности с помощью химического синтеза или предпочтительно с помощью методик рекомбинантной экспрессии, описанных в данной заявке. В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное согласно изобретению включает синтетическую константную область, в которой один или более доменов частично или полностью удалены ("антитела с удаленными доменами"). В некоторых вариантах реализации совместимые модифицированные антитела будут включать конструкции с удаленным доменом или варианты, в которых весь CH2 домен был удален (CH2 конструкции). Для других вариантов реализации короткий соединяющий пептид может замещать удаленный домен, чтобы обеспечить гибкость и свободу движения вариабельной области. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что такие конструкции особенно предпочтительны вследствие регуляторных свойств CH2 домена,влияющих на скорость катаболизма антитела. Конструкции с удаленным доменом можно получить, используя вектор, кодирующий константный домен IgG1 человека (см., например, WO 02/060955 A2 и WO 02/096948 A2). Этот вектор сконструирован, чтобы удалить CH2 домен и обеспечить синтетический вектор, с которого экспрессируется константная область IgG1 с удаленным доменом. В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные согласно изобретению представляют собой миниантитела. Миниантитела можно получить,применяя способы, описанные в данной области (см., например, патент США 5837821 или WO 94/09817 А 1). В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное согласно изобретению включает тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую делецию или замену нескольких или даже одной аминокислоты при условии, что это не нарушает связь между мономерными субъединицами. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях CH2 домена может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание Fc и тем самым повысить опухолевую локализацию. Аналогично, может оказаться желательным просто удалить ту часть одного или более доменов константной области, которая контролирует эффекторную функцию (например, связывание комплемента). Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке), при этом оставляя другие требуемые функции, связанные с описываемым доменом константной области, интактными. Более того, как упоминалось выше, константные области описанных антител могут быть синтетическими, вследствие мутации или замены одной или более аминокислот, которая усиливает профиль итоговой конструкции. В этом отношении может оказаться возможным нарушение активности, обеспеченной консервативным сайтом связывания (например,связывания Fc), при, по существу, неизменной конфигурации и иммуногенном профиле модифицированного антитела. Еще другие варианты реализации включают добавление одной или более аминокислот к константной области, чтобы усилить желаемые характеристики, такие как эффекторная функция, или обеспечить присоединение большего количества цитотоксинов или углеводов. В таких вариантах реализации может оказаться желаемым вставить или реплицировать отдельные последовательности, полученные из выбранных доменов константной области. Изобретение также обеспечивает антитела, которые включают, по существу состоят или состоят из вариантов (включая производные) молекул антител (например, VH областей и/или VL областей), описанных в данной заявке, такие антитела или их фрагменты иммуноспецифично связываются с полипептидом, связанным с расстройством, или его фрагментом или вариантом. Стандартные методики, известные специалистам в данной области, можно применять для введения мутаций в последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело, включая, но не ограничиваясь перечисленными, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез, которые приводят к заменам аминокислот. Предпочтительно указанные варианты (включая производные) кодируют менее чем 50 замен аминокислот, менее чем 40 замен аминокислот, менее чем 30 замен аминокислот, менее чем 25 замен аминокислот, менее чем 20 замен аминокислот, менее чем 15 замен аминокислот, менее чем 10 замен аминокислот, менее чем 5 замен аминокислот, менее чем 4 замены аминокислот, менее чем 3 замены аминокислот или менее чем 2 замены аминокислот относительно эталонной VH области, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL область,VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3. "Консервативная замена аминокислоты" представляет собой такую замену, при которой аминокислотный остаток замещается на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющие боковые цепи с аналогичными зарядами, были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями(например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В качестве альтернативы мутации
МПК / Метки
МПК: A61K 39/395, C07K 16/18, A61P 25/28
Метки: получения, связывающих, фрагмент, антиген, вектор, вышеуказанный, неврологических, связывающей, молекулы, посредством, варианты, лечения, диагностики, меньшей, одной, клетка-хозяин, белок, расстройств, вышеуказанных, включающие, способ, антитела, белку, молекула, мере, связывающая, полинуклеотид, композиция, цепи, расстройством, ассоциированному, набор, фрагмента, специфичной, цепь, антитело, связывающего, иммуноглобулина, связывающий, объектов
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-17611-sposob-polucheniya-svyazyvayushhejj-molekuly-specifichnojj-k-belku-associirovannomu-s-rasstrojjstvom-ili-antitela-ili-ego-svyazyvayushhego-fragmenta-ili-po-menshejj-mere-odnojj-cep.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклеотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством вышеуказанных объектов (варианты)</a>
Предыдущий патент: Способ повышения прочности трубобетонной конструкции
Следующий патент: Переработка биомассы
Случайный патент: Способ и система для осуществления технического обслуживания мембраны, используемой в методе ограниченного давлением осмоса