Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде"

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки В настоящем изобретении предлагается иммуногенная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии масло в воде,где указанная эмульсия масло в воде содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,25-1,25%(об./об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объема композиции, а также ее применение при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. Также предложен способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему, иммуногенной композиции по изобретению. Баллоу Уилльям Рипли, мл., Ханон Эммануэль Жюль (BE) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) 015817 Область изобретения Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине и иммуногенным композициям и к их применению в медицине. В частности, изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим адъювант в виде эмульсии масло в воде, и их применению в медицине, в частности их применению для усиления иммунных ответов на различные антигены, и к способам получения, где эмульсия масло в воде содержит токол, сквален и эмульгатор. Предшествующий уровень техники Существует неизменная потребность в новых композициях или вакцинах с улучшенной иммуногенностью. В качестве одной стратегии адъюванты использовали для достижения и улучшения иммунного ответа, генерируемого на какой-либо заданный антиген и/или для снижения реактогенности/токсичности в организме хозяина. Эмульсии масло в воде сами по себе хорошо известны в данной области техники и предложены как полезные в качестве адъювантных композиций (EP 399843; WO 95/17210). В WO 95/17210 раскрыты эмульсии масло в воде, содержащие 2-10% сквалена, 2-10% токоферола и 0,3-3% Твин 80 и их применение самих по себе или в комбинации с QS21 и/или 3D-MPL(3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A). В WO 99/12565 раскрыты эмульсионные композиции масло в воде, содержащие метаболизируемое масло, сапонин и стерол. Эмульсии масло в воде дополнительно содержат 3D-MPL. В WO 99/11241 раскрыты эмульсии масло в воде, содержащие метаболизируемое масло и сапонин, где масло и сапонин присутствуют в соотношении от 1:1 до 200:1. Все еще существует потребность в улучшенных вакцинных и иммуногенных композициях, которые обеспечивают подходящий иммунный ответ и являются менее реактогенными в организме хозяина. Краткое изложение сущности изобретения Авторы изобретения обнаружили, что можно использовать вакцинные или иммуногенные композиции, содержащие более низкие количества каждого компонента эмульсии масло в воде, поддерживая сравнимый иммунный ответ против антигена или антигенной композиции в указанной композиции. Преимуществом этого является поддержание уровня иммуногенности к антигену, в то время как реактогенность в организме хозяина-реципиента понижена. Соответственно в первом аспекте настоящего изобретения предлагается иммуногенная композиция,содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии масло в воде, где указанная эмульсия масло в воде содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,251,25% (об /об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объема композиции. Предпочтительно токол представляет собой -токоферол. Предпочтительно эмульгатор представляет собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, наиболее предпочтительно полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат выбран из группы, включающей Polysorbate 80 или Tween 80. Предпочтительно антиген или антигенную композицию получают из вируса гриппа. Предпочтительно доза иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению, предназначенная для введения человеку, составляет 0,4-1,5 мл, более предпочтительно объем дозы составляет 0,5,0,7 или 1,0 мл. В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение иммуногенной композиции по изобретению в качестве лекарственного средствоа для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. В дополнительном аспекте изобретения предлагается применение иммуногенной композиции по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему,иммуногенной композиции по изобретению. Краткое описание графических материалов Фиг. 1: Клиническое испытание: средние геометрические значения титров (GMTs) анти-HA антител в разные моменты времени (ATP (According to protocol (согласно протоколу-группа исследования иммуногенности). Фиг. 2: Клиническое испытание: уровень серопротекции (SPR) для титра HI-антител с 95% доверительным интервалом на 0 и 21 сутки (ATP-группа исследования иммуногенности). Фиг. 3: Клиническое испытание: уровень сероконверсии (SCR) для титра HI-антител с доверительным интервалом 95% на 21 сутки (ATP-группа исследования иммуногенности). Фиг. 4: Клиническое испытание: фактор сероконверсии (SCF) для титра HI-антител с 95% доверительным интервалом на 21 сутки (ATP-группа исследования иммуногенности). Фиг. 5: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинина (GMT+/-IC95) у мышиBALB/c, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз AS03).-1 015817 Фиг. 5 А: Титры анти-A/New Caiedonia/20/99 HI; Фиг. 5 Б: Титры анти-A/Panama/2007/99 HI. Фиг. 5 В: Титры анти-B/Shandong/7/97 HI. Фиг. 6: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинина (GMT +/- IC95) у C57BI/6 мыши, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз AS03). Фиг. 7: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (CD4+ T ceII) в PBMC (мононуклеары периферической крови) из мыши C57BI/6, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз AS03). Фиг. 8: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (CD4+T-клетки) в PBMC от мышиC57BI/6, праймированной гетеросубтипическими штаммами и иммунизированной низкой дозой антигена(0,5 мкг), адъювантированного интервалом доз AS03. Фиг. 9: Исследование на мышах: ELISA Титры (А и Б) H5N1-специфического сывороточного lg и анти-H5N1 lgG1 (В и Г) и lgG2b (Д и Е) изотипических ответов на 14 сутки после иммунизации (GMT+/IC95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А, В и Д) или 0,38 мкг (Б, Г и Е). Фиг. 10: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинации (GMT +/- IC95) на 21 сутки после иммунизации (GMT+/-IC95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А) или 0,38 мкг (Б). Фиг. 11: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (CD4+ T-клетки) у ранее не подвергавшейся воздействию мыши C57BI/6, иммунизированной разными дозами H5N1-вакцины (1,5 или 0,38 мкг), адъювантированной интервалом доз AS03: (А) 1,5 мкг HA Ag (антиген) или (Б) 0,38 мкг HA Ag(антиген). Фиг. 12: Исследования на свиньях. Тест ингибирования гемагглютинина (GMT+/-IC95) у свиней,праймированных гомологичными штаммами (интервал доз AS03). Подробное описание изобретения Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании изобретения, как предполагается авторами, в каждом случае являются возможно заменяемыми терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" соответственно. Воплощения в данном описании изобретения, относящиеся к "вакцинным композициям" по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к "иммунногенным композициям" по изобретению, и наоборот. Компонент в виде эмульсии масло в воде Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаруживается в больших количествах в жире из печени акулы, и в более низких количествах в оливковом масле, масле зародышей пшеницы, масле рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в данном изобретении. Сквален является метаболизируемым маслом, поскольку представляет собой промежуточный продукт в биосинтезе холестерина (Merck index, 10th Edition, entry no.8619). Количество сквалена в иммунногенной композиции может быть выражено в виде процента от общей композиции. Подходящим образом сквален присутствует в иммуногенной композиции в количестве 0,25-1,25% (об./об.) от общего объема композиции. В еще одном конкретном воплощении метаболизируемое масло присутствует в конечном количестве 1,25% от общего объема иммунногенной композиции. В еще одном конкретном воплощении метаболизируемое масло присутствует в конечном количестве 0,25% (об./об.) от общего объема композиции. С целью пояснения, концентрации, приведенные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация сквалена 5%(об./об.) эквивалентна концентрации сквалена 4,28% (мас./об.). Эмульсия масло в воде содержит токол. Токолы хорошо известны в данной области техники и описаны в EP0382271. Подходящим образом токол представляет собой -токоферол или его производное, такое как -токоферола сукцинат (также известный как сукцинат витамина E). Количество токола может быть представлено в виде процента от общего объема иммунногенной композиции. Подходящим образом токол присутствует в имууногенной композиции в количестве от 0,25 до 1,25% (об./об.) от общего объема иммуногенной композиции. В конкретном воплощении токол присутствует в конечном количестве примерно 1,25% от общего объема вакцинной или иммунногенной композиции. В еще одном конкретном воплощении токол присутствует в конечном количестве 0,25% (об./об.) общего объема или 1,25% (об./об.) в объеме дозы 0,5 мл,или 0,9% (об./об.) в объеме дозы 0,7 мл, или 0,5% (об./об.) в 0,5 мл дозе или 0,35-0,37%, предпочтительно 0,36%, в 0,7 мл вакцинной или иммунногенной дозе. С целью пояснения, концентрации, приведенные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация -токоферола 5%(об./об.) эквивалентна концентрации -токоферола 4,8% (мас./об.). Эмульсия масло в воде дополнительно содержит эмульгатор. Эмульгатор подходящим образом может представлять собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. В конкретном воплощении эмульгатор может быть выбран из группы, содержащей Polysorbate 80 или Tween 80.-2 015817 Количество эмульгатора может быть выражено в виде процента от общего объема иммуногенной композиции. Подходящим образом эмульгатор присутствует в иммунногенной композиции в количестве 0,125-0,7% (об./об.) от общего объема композиции, предпочтительно 0,08-0,05, или 0,1-0,7, или 0,2-0,6,или 0,25-0,55, или 0,3-0,52, или 0,4-0,5% (об./об.) от общего объема. В конкретном воплощении эмульгатор присутствует в количестве 0,7, 0,5 или 0,2% (об./об.) от общего объема вакцинной или иммунногенной композиции. С целью пояснения, концентрации, указанные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация полисорбата 80 1,8%(об./об.) эквивалентна концентрации полисорбата 80 1,91% (мас./об.). В конкретном воплощении 0,5 мл объем вакцинной или иммуногенной содержит 0,45% (об./об.)Tween 80, и 0,7 мл объем дозы содержит 0,315% (об./об.) Tween 80. В еще одном конкретном воплощении 0,5 мл доза содержит 0,18% (об./об.) эмульгатора и 0,7 мл доза вакцинной или иммунногенной композиции содержит 0,126% (об./об.) эмульгатора. Под термином "доза, предназначенная для человека" подразумевается доза, которая представлена в объеме, пригодном для применения у человека. Как правило, она составляет от 0,25 до 1,5 мл. В одном воплощении доза, предназначенная для человека, составляет 0,5 мл. В дополнительном воплощении доза, предназначенная для человека, выше 0,5 мл, например 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В дополнительном воплощении доза, предназначенная для человека, составляет от 1 до 1,5 мл. В еще одном воплощении, в частности, если иммуногенная композиция предназначена для педиатрической популяции, доза, предназначенная для человека, может быть меньше 0,5 мл, такой как 0,25-0,5 мл. Изобретение отличается тем,что каждый или все отдельные компоненты адъюванта в составе иммуногенной композиции присутствует/присутствуют на более низком уровне, чем считалось пригодным ранее, и обычно представляет/представляют собой перечисленные выше. Особенно подходящие композиции содержат следующие адъювантные компоненты в следующих количествах в конечном объеме дозы, предназначенной для человека, 0,5 мл: Таблица 1 В изобретении дополнительно предлагается адъювантная композиция, содержащая отдельные компоненты, как определено выше в данном описании изобретения, и в количестве, определенном выше,например, но исключительно так, как поясняется в табл. 1. Обычно такая адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы, предназначенной для человека. Если адъювант находится в жидкой форме для объединения с жидкой формой антигенной композиции, то адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы, предназначенной для человека, который представляет собой часть предполагаемого конечного объема дозы, предназначенной для человека, например,приблизительно половину предполагаемого конечного объема дозы, предназначенной для человека, например объем 350 мкл для предполагаемой дозы, предназначенной для человека, 0,7 мл, или объем 250 мкл для предполагаемой дозы, предназначенной для человека, 0,5 мл. Адъювантную композицию разбавляют при объединении с антигенной композицией с получением конечной дозы вакцины, предназначенной для человека. Конечный объем такой дозы будет, конечно, варьироваться в зависимости от начального объема адъювантной композиции и объема антигенной композиции, добавленной к адъювантной композиции. В альтернативном воплощении жидкий адъювант используют для разведения лиофилизированной антигенной композиции. В данном воплощении подходящий объем дозы, предназначенной для человека, адъювантной композиции приблизительно равен конечному объему дозы, предназначенной для человека. Жидкую адъювантную композицию добавляют во флакон, содержащий лиофилизированную антигенную композицию. Конечная доза, предназначенная для человека, может варьироваться между 0,5 и 1,5 мл. Способ изготовления эмульсий масло в воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно такой способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор PBS/TWEEN80, с последующей гомогенизацией с применением гомогенизатора, специалисту в данной области техники понятно, что способ, включающий пропуска-3 015817 ние смеси дважды через иглу шприца будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (аппарат M1 10S Microfluidics,максимум 50 проходов в течение 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (6105 Па) (выходное давление примерно 850 бар (8,5107 Па может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптирование может быть выполнено посредством обычного экспериментирования, включающего проведение замеров в образующейся эмульсии до тех пор, пока не получают препарат с масляными каплями требуемого диаметра. В эмульсии масло в воде масло и эмульгирующее вещество должны быть в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, фосфатно-солевой буферный раствор. Предпочтительно эмульсионные системы масло в воде по настоящему изобретению имеют небольшой размер масляной капли в субмикронном диапазоне. Подходящие размеры капель находятся в диапазоне 120-750 нм, более предпочтительны размеры от 120 до 600 нм в диаметре. Более предпочтительно эмульсия масло в воде содержит масляные капли при интенсивности, из которых по меньшей мере 70% по количеству имеют менее диаметр 500 нм, более предпочтительно по меньшей мере 80% по интенсивности имеют диаметр менее 300 нм, более предпочтительно по меньшей мере 90% по интенсивности находятся в диапазоне от 120 до 200 нм диаметром. Размер масляной капли, то есть диаметр, согласно настоящему изобретению приведен по интенсивности. Существует несколько способов определения диаметра размера масляной капли посредством интенсивности. Интенсивность измеряют, используя устройство для определения размера, удобно посредством динамического рассеяния света, такого как Malvern Zetasizer 4000 или предпочтительно MalvernZetasizer 3000HS. Подробная методика приведена в примере II.2. Первая возможность состоит в определении ZAD - среднего диаметра по z, посредством динамического рассеяния света (PCS-фотонкорреляционная спектроскопия); такой способ дополнительно дает индекс полидисперсности (PDI), иZAD и PDI рассчитывают при помощи кумулянтного алгоритма. Данные значения не требуют знания показателя преломления частицы. Второй способ состоит в расчете диаметра масляной капли путем определения полного распределения частиц по размерам посредством другого алгоритма, либо Contin, либоNNLS, либо автоматического алгоритма "Malvern" (алгоритма по умолчанию, предусмотренного для устройства для измерения размера). Большей частью, так как показатель преломления частиц сложной композиции неизвестен, принимают во внимание только распределение интенсивности, и в случае необходимости среднее значение интенсивности, возникающее из этого распределения. Антигены и антигенная композиция Иммуногенные композиции содержат антиген или антигенную композицию, способную вызывать иммунный ответ против человеческого или животного патогена. Соответственно, указанный антиген или антигенная композиция происходит из одного или более из нижеперечисленного: HIV-1 (такого как gag или его фрагменты, такие как p24, tat, nef, gp120 или gp160 или фрагменты любого из них), вирусы герпеса человека, такие как gD или его производные, или предранний белок, такой как ICP27 из HSV1 или HSV2, цитомегаловирус особенно человеческий) (такой как gB или его производные), ротавирус (включая живые аттенуированные вирусы), вирус ЭпштейнаБарр (такой как др 350 или его производные), вирус ветряной оспы (такой как gpI, II и IE63), или вируса гепатита, такого как вирус гепатита B (например поверхностный антиген гепатита B или его производное), вирус гепатита A, вирус гепатита C и вирус гепатита E, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такой как белки F, N, M и G или их производные), вирус SARS (тяжелый острый респираторный синдром), вирус парагриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирусы папилломы человека (например HPV6, 11, 16, 18), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вирус гриппа (цельный живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или в MDCK-клетках (клетки почек собак Madin-Darby), или цельные виросомы гриппа(как описано у R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки HA, NP, NA, или M, или их комбинации), или происходящие из бактериальных патогенов, таких как виды Neisseria, включая N. gonorrhea и N. meningitidis (например, капсулярные сахариды и их конъюгаты, трансферрин-связывающие белки, лактоферрин-связывающие белки, PilC, адгезины); S. pyogenes (например, M-белки или их фрагменты, протеаза C5A, липотейхоевые кислоты), S. agalactiae, S.mutans; H. ducreyi; виды Moraxella, включая М. catarrhalis, также известную как Branhamella catarrhalisB. pertussis (например, пертактин, токсин коклюша или их производные, нитевидный гемагглютинин,аденилатциклаза, фимбрии), В. parapertussis и B. bronchiseptica; виды Mycobacterium, включая M. tuberculosis (например ESAT6, антиген 85A, -B или -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M.(например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагическую E. coli, энтеропатогенную E. coli (например шигаподобный токсин или его производные); виды Vibrio, включая V. cholera (например, токсин холеры или егоCorynebacterium, включая C. diphtheriae (например, дифтерийный токсин и его производные); виды Borrelia, включая B. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (например, OspA, OspC,DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB,), B. andersonii (например, OspA, OspC,DbpA, DbpB), B. hermsii; виды Ehrlichia spp., включая E. equi и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; виды Rickettsia, включая R. rickettsii; виды Chlamydia, включая C. trachomatis (например, MOMP,гепарин-связывающие белки), C. pneumoniae (например, MOMP, гепарин-связывающие белки), C.psittaci; виды Leptospira, включая L. interrogans; виды Treponema, включая T. pallidum (например, минорные белки наружной мембраны), T. denticola, T. hyodysenteriae; или происходящие из паразитов, таких как виды Plasmodium, включая P. falciparum; виды Toxoplasma, включая T. gondii (например, SAG2,SAG3, Tg34); виды Entamoeba, включая E. histolytica; виды Babesia, включая B. microti; виды Trypanosoma, включая T. cruzi; виды Giardia, включая G. lamblia; виды Leshmania, включая L. major, виды Pneumocystis, включая P. carinii; виды Trichomonas, включая T. vaginalis; виды Schisostoma, включая S. mansoni, или происходящие из дрожжей, таких как виды Candida, включая C. albicans; виды Cryptococcus,включая C. neoformans. Композиции по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения аллергии. Такие вакцины должны содержать аллергенспецифические и аллергеннеспецифические антигены. Другие предпочтительные конкретные антигены для M. tuberculosis представляют собой, например,Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 и hTCC1 (WO 99/51748). Белки для M.tuberculosis также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два, предпочтительно три полипептида M. tuberculosis слиты в более крупный белок. Предпочтительные слитые белки содержатRa12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL,DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748). Наиболее предпочтительные антигены для Chlamydia включают, например, высокомолекулярный белок (HMW) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), и предполагаемые мембранные белки (Pmps). Другие антигены Chlamydia в вакцинной композиции могут быть выбраны из группы, описанной в WO 99/28475. Предпочтительные бактериальные вакцины содержат антигены, происходящие из Streptococcusspp., включая S. pneumoniae (например, PsaA, PspA, стрептолизин, холин-связывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342) и их мутантные детоксифицированные производные (WO 90/06951; WO 99/03884). Другие предпочтительные бактериальные вакцины содержат антигены, происходящие из Haemophilus spp.,включая H. influenzae типа B, нетипичную H. influenzae, например OMP26, высокомолекулярные адгезины, P5, P6, белок D и липопротеин D, и фимбрин и происходящие от фимбрина пептиды (US 5843464) или их многократно копированные варианты или слитые белки. Производные поверхностного антигена гепатита B хорошо известны в данной области техники и включают, в частности, антигены PreS1, PreS2 S, описанные в заявках на европейский патент EP-A414374; EP-A-0304578 и EP 198-474. В одном предпочтительном аспекте вакцинная композиция по изобретению содержит антиген HIV-1, gp120, особенно при экспрессии в клетках CHO (яичника китайского хомяка). В дополнительном воплощении вакцинная композиция по изобретению содержит gD2t, как определено выше в данном описании изобретения. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения вакцины, содержащие заявленный адъювант, содержат антиген, происходящий из вируса папилломы человека (HPV), считающийся ответственным за остроконечные кондиломы (HPV 6 или HPV 11 и другие) и вирусов HPV, ответственных за рак шейки матки (HPV16, HPV18 и другие). Особенно предпочтительные формы профилактической или терапевтической вакцины для остроконечной кондиломы содержат белок L1 и слитые белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из HPV белков E1 , E2, E5, E6, E7, L1 и L2. Наиболее предпочтительные формы слитого белка представляют собой L2E7, раскрытый в WO 96/26277, и белок D(1/3)-E7, раскрытый в WO99/10375. Предпочтительная HPV инфекция шейки матки или рак, профилактическая или терапевтическая вакцина, композиция может содержать антигены HPV 16 или 18. Особенно предпочтительные HPV 16 антигены содержат ранние белки E6 или E7 в слиянии с носителем белка D с образованием слияний белок D-E6 или E7 из HPV 16 или их комбинаций; или комбина-5 015817 ций E6 или E7 с L2 (WO 96/26277). Альтернативно ранние белки E6 и E7 HPV 16 или 18 могут быть представлены единственной молекулой, предпочтительно слиянием белок D-E6/E7. Такая вакцина возможно может содержать любой из двух или оба из белков E6 и E7 из HPV 18, предпочтительно в форме слитых белков белок D -E6 или белок D - E7 или слитого белка белок D-E6/E7. Вакцина по настоящему изобретению может дополнительно содержать антигены из других штаммов HPV, предпочтительно из штаммов HPV 31 или 33. Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат антигены, происходящие из паразитов, которые вызывают малярию, например антигены из Plasmodia falciparum, включая белок циркумспорозоита (CS-белок), RTS,S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 и TRAP.RTS представляет собой гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок белка циркумспорозоита (CS) из P. falciparum, присоединенный с помощью четырех аминокислот областиpreS2 поверхностного антигена гепатита B к поверхностному (S) антигену вируса гепатита B. Его полная структура раскрыта в международной патентной заявке PCT/EP92/02591, опубликованной под номером WO 93/10152, с заявленным приоритетом патентной заявки UK 9124390.7. При экспрессии в дрожжах RTS продуцируется в виде липопротеиновой частицы, и когда его коэкспрессируют с антигеном S изHBV, то получают смешанную частицу, известную как RTS,S. Антигены TRAP описаны в международной патентной заявке PCT/GB89/00895, опубликованной в рамках WO 90/01496. Антигены Plasmodia,которые являются подходящими кандидатами в компоненты мультистадийной противомалярийной вакцины, представляют собой P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin,PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 и их аналоги в Plasmodium spp. Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой малярийную вакцину, где антигенный препарат содержит белок RTSS или CS или его фрагмент, такой как CS-участок из RTS,S, в комбинации с одним или более дополнительными малярийными антигенами, причем любой из них или оба вместе могут быть прикреплены к субъединице шигатоксина В согласно изобретению. Один или более чем один дополнительный малярийный антиген может быть выбран, например, из группы, состоящей из MPS1, MSP3, AMA1, LSA1 или LSA3. Композиции могут также содержать противоопухолевый антиген и быть полезными для иммунотерапевтического лечения раковых заболеваний. Например, адъювантная композиция находит применение с антигенами отторжения опухоли, такими как антигены для раков простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки или меланомы. Типичные антигены включают MAGE 1 и MAGE 3 или другие антигены MAGE (для лечения меланомы), PRAME, BAGE илиNational Cancer Institute 89, p. 293. В действительности такие антигены экспрессируют в широком спектре типов опухолей, таких как меланома, карцинома легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря. Другие опухолеспецифические антигены подходят для использования с адъювантами по настоящему изобретению и включают, но без ограничения ими, опухолеспецифические ганглиозиды, простатоспецифический антиген (PSA) или Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, маммаглобин, MUC-1, раковоэмбриональный антиген (CEA), p501S (простеин). Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая адъювантную композицию по изобретению и антиген отторжения опухоли. В одном аспекте опухолевый антиген представляет собой Her-2/neu. В одном аспекте настоящего изобретения предложены вакцины, содержащие опухолевый антиген таких видов рака, как рак простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки, яичника или меланому. Соответственно, композиции могут содержать опухолеассоциированный антиген, а также антигены, ассоциированные с опухолеподдерживающими механизмами(например, ангиогенез, инвазия опухоли). Кроме того, антигены, особенно подходящие для вакцин в терапии рака, также содержат простатоспецифический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток простаты (PSCA), p501S (постеин), тирозиназу, сурвивин, NY-ESO1, простазу, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Кроме того, указанный антиген может представлять собой аутологичный пептидный гормон, такой как полноразмерный гонадотропинвысвобождающий гормон (GnRH, WO 95/20600), короткий пептид, длиной 10 аминокислот, полезный в лечении многих видов рака, или в иммунокастрации. Вакцинация Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно использовать для защиты или лечения млекопитающего, подверженного инфекции, посредством введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного, внутрибрюшинного, интрадермального или подкожного способов; или посредством мукозального введения в пероральный/пищевой, дыхательный, мочеполовой тракты. Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде однократной дозы, ее компоненты также могут быть введены вместе одновременно или в разные моменты времени (например, конъюгаты пневмококкового сахарида можно вводить раздельно, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бак-6 015817 териального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить IM в праймирующих дозах иIN в бустерных дозах. Содержание белковых антигенов в вакцине типично находится в диапазоне 1-100 мкг, предпочтительно 5-50 мкг, более типично в диапазоне 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько повторных иммунизации, надлежащим образом разделенных во времени. Вакцинный препарат в целом описан в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton,патент US 4235877. Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизировать. Предпочтительно раствор лиофилизируют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Кроме того,предпочтительно их лиофилизировать и восстанавливать непосредственно перед применением. В одном аспекте изобретения предлагается вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано в данном описании изобретения. В этом аспекте изобретения предусматривается, что адьювант будет использоваться для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции. Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ID) образует одно воплощение настоящего изобретения. Кожа человека содержит наружную"загрубевшую" кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Под поверхностью этого эпидермиса находится слой, называемый дермой, который, в свою очередь, покрывает подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, который также может быть связан с рядом дополнительных преимуществ. Внутридермальная вакцинация вакцинами, описанными в данном описании изобретения, образует предпочтительный аспект настоящего изобретения. Обычная техника внутридермальной инъекции, "методика Манту", включает стадии очистки кожи и затем натягивание одной рукой, затем с фаской малоразмерной иглы (26-31 размер), направленной вверх, иглу вводят под углом в 10-15. Как только фаска иглы введена, корпус иглы опускают и продвигают дальше, обеспечивая небольшое давление для повышения его под кожей. Затем жидкость очень медленно инъецируют, образуя таким образом пузырек или выпуклость на поверхности кожи, затем иглу медленно извлекают. Совсем недавно были описаны устройства, которые спроектированы специально для введения жидких агентов в или через кожу, например устройства, описанные в WO 99/34850 и EP 1092444, также устройства безыгольного впрыскивания, описанные, например, в WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312,335, US 5503627, US 5064413 US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Альтернативные способы интрадермального введения вакцинных препаратов могут включать обычные шприцы и иглы, или устройства, предназначенные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или трансдермальные пластыри (WO 97/48440; WO 98/28037); или нанесение на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка WO 98/20734;WO 98/28037). Если вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу, или более конкретно внутрь дермы, такая вакцина находится в малом объеме жидкости, конкретно в объеме между примерно 0,05 мл и 0,2 мл. Содержание антигенов в кожных или интрадермальных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, найденным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или интрадермальных вакцин является то, что композиции могут быть "низкодозовыми". Соответственно, белковые антигены в "низкодозовых" вакцинах предпочтительно присутствуют в концентрации, достигающей от 0,1 до 10 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные(предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг, и предпочтительно от 0,01 до 0,5 мкг сахарида на дозу. При использовании в данном описании изобретения термин "интрадермальная доставка" означает доставку вакцины к области дермы в коже. Однако вакцина необязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный между примерно 1,0 и примерно 2,0 мм от поверхности кожи человека, но существует некоторая величина изменчивости между индивидуумами и в разных частях тела. Как правило, можно ожидать, что она достигнет дермы, проходя 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем ниже. В зависимости от способа доставки вакцина в конечном итоге может быть локализована исключительно или в основном в пределах дермы, или в конечном итоге она может быть распределена внутри эпидермиса и дермы. Количество каждого антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунопротективный ответ без значительных вредных побочных эффектов типичных вакцин. Такое-7 015817 количество будет варьироваться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется и как он представлен. В дополнительном воплощении предложен способ лечения индивидуума, подверженного заболеванию или страдающего от него, путем введения композиции, как, по существу, описано в данном описании изобретения. Также предложен способ профилактики человека от заболевания, выбранного из группы, включающей инфекционные бактериальные и вирусные заболевания, паразитарные заболевания, в частности внутриклеточное патогенное заболевание, пролиферативные заболевания, такие как рак простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки, яичника или меланома; нераковые хронические расстройства, аллергию, включающий введение указанному человеку композиции, как, по существу, описано в данном описании изобретения. Данное изобретение дополнительно описано посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры: пример I описывает способы иммунологического считывания, использованные в исследованиях на мышах, хорьках, свиньях и человеке; пример II описывает приготовление эмульсии масло в воде и адъювантных композиций, использованных в приведенных в качестве примера исследованиях; пример III демонстрирует клиническое испытание во взрослой популяции с возрастом 18-59 лет вакциной, содержащей препарат антигена расщепленного вируса гриппа и различные дозы адъювантаAS03; пример IV показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса гриппа (содержащих различные дозы адъюванта AS03) в праймированных мышах BALB/c; пример V показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса (содержащих различные дозы адъюванта AS03) в праймированных мышах C57BI/6; пример VI показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса (содержащих различные дозы адъюванта AS03 и низкую дозу антигена) в праймированных мышах C57BI/6; пример VII показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса H5N1 (содержащих различные дозы адъюванта AS03 и антигена) у неподвергавшихся воздействию C57 В 1/6 мышей; пример VIII показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных гриппозных вакцин в праймированных свиньях Large White (Крупная белая). Пример I. Иммунологические способы считывания. 1.1. Способы исследования на мышах 11.1. Тест ингибирования гемагглютинации Принцип проведения испытаний (классический способ). Титры антител к гемагглютинину для трех (сезонных) штаммов вируса гриппа определяют, используя тест ингибирования гемагглютинации (HI). Принцип теста HI основан на способности специфических антигриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (RBC) с помощью гемагглютинина вируса гриппа (HA). Инактивированную нагреванием сыворотку обрабатывают каолином и RBC для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубируют с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляют эритроциты и оценивают ингибирование агглютинации. Титры выражают как эквивалент самого высокого разведения сыворотки, который полностью подавлял гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляет 1:20, неопределяемый уровень оценивают как титр, равный 10. Адаптация для H5N1 (частное описание HI с использованием эритроцитов лошадей). Так как установлено, что классический анализ HI для определения анти-HA антител функционирует должным образом для штамма H5N1, использовали адаптированный протокол с использованием лошадиных RBC. Для пандемических штаммов H5N1 используют эритроциты лошадей. 0,5% (конечная концентрация) суспензии эритроцитов лошади в фосфатном буфере, содержащем 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин, конечная концентрация). Эту суспензию готовят ежедневно, промывая эритроциты тем же фосфатным буфером и с последующей стадией центрифугования (10 мин, 2000 об./мин). Данную стадию промывания следует повторить еще раз. После добавления лошадиных эритроцитов к реакционной смеси сыворотки и вирусной суспензии планшеты следует инкубировать при комнатной температуре(комнатная температура, 20C +/- 2C) в течение 2 ч из-за низкой скорости осаждения лошадиных эритроцитов. Статистический анализ Статистический анализ выполняли на поствакционных титрах HI, используя UNISTAT. Протокол,применяемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом: логарифмическое преобразование данных; тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормально-8 015817 сти распределения групп; тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах); дисперсионный анализ выбранных данных; тест взаимодействия двухфакторного ANOVA (дисперсионного анализа); тест Тьюки (HSD) для множественных сравнений. 1.1.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов Данный способ позволяет количественно оценить антигенспецифические T-лимфоциты на основе продукции цитокинов: эффекторные T-клетки и/или эффекторные T-клетки памяти продуцируют IFNи/или центральные T-клетки памяти продуцируют IL-2. PBMCs собирают на 7 сутки после иммунизации. Лимфоидные клетки еще раз стимулируют in vitro в присутствии ингибитора секреции (брефелдин). Затем эти клетки обрабатывают с помощью традиционного иммунофлуоресцентного способа, используя флуоресцентные антитела (CD4, CD8, IFN- и IL-2). Результаты представляют как частоту встречаемости цитокинположительных клеток среди CD4/CD8 T-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов Tклеток выполняли на PBMC через 7 суток после второй иммунизации. Кровь собирали от мышей и объединяли в гепаринированной среде RPMI+ Add. Для крови RPMI + Add-разбавляющие PBL суспензии наслаивали на градиент Lympholyte-Mammal согласно рекомендуемому протоколу (центрифугирование 20 мин при 2500 об./мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки на поверхности удаляли, промывали 2 раза в RPMI + Add и PBMCs суспензии доводили до 2106 клеток/мл в RPMI 5% фетальной телячьей сыворотке. Антигенную стимуляцию PBMCs in vitro осуществляли при конечной концентрации 1107 клеток/мл (пробирка FACS) с цельным FI (1 мкг HA/штамм) и затем инкубировали 2 ч при 37C с добавлением анти-CD28 и анти-CD49d (1 мкг/мл для каждого). После стадии антигенной повторной стимуляции PBMC инкубировали в течение ночи при 37C в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37C для ингибирования секреции цитокина. Окрашивание IFN- /IL-2/CD4/CD8 выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл PBS 1% FCS, содержащего 2% Fc-блокирующего реагента (1/50; 2.4G2). Через 10 мин инкубирования при 4C, добавляли 50 мкл смеси анти-CD4-PE (2/50) и анти-CD8 perCp(3/50) и инкубировали 30 мин при 4C. После промывания в PBS 1% FCS, клетки пермеабилизировали путем ресуспенидования в 200 мкл Cytofix-Cytoperm (набор BD) и инкубировали 20 мин при 4C. Затем клетки промывали Perm Wash (набор BD) и ресуспендировали с 50 мкл смеси анти-IFN-APC (1/50) + анти-IL-2FITC (1/50), разведенной в Perm Wash. После инкубирования в течение минимум 2 ч, максимум в течение ночи при 4C, клетки промывали Perm Wash и ресуспендировали в PBS 1% FCS + 1% параформальдегида. Анализ образцов выполняли посредством FACS. Живые клетки пропускали (FSC/SSC), и обнаружение осуществляли на 20000 событий (лимфоциты) или 35000 событий на CD4+ T-клетках. Процентное содержание IFN- + или IL2+ рассчитывали на CD4+ и CD8+ на популяциях клеток, дающих сигнал выше порогового значения. 1.1.3. Анти-H5N1 ELISA. Количественную оценку титров анти-Н 5N1 lg, lgG1 и lgG2b антител выполняли при помощиELISA, используя расщепленный вирус H5N1 в качестве покрытия. Растворы вируса и антител использовали в количестве 100 мкл на лунку. Расщепленный вирус H5N1 разводили с конечной концентрации 1 мкг/мл в PBS и адсорбировали в течение ночи при 4C на лунки 96-луночного микротитровального планшета (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37C с 200 мкл на лунку PBS, содержащего 1% BSA и 0,1% Твин 20 (насыщенный буфер). Двенадцать двукратных разведений сыворотки в насыщенном буфере добавляли к планшетам, покрытым H5N1, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37C. Планшеты промывали четыре раза PBS 0,1% Твин 20. Биотинилированный-конъюгированный антимышиный lg (Прозан-E0413), разведенный 1/500, или биотинилированный-конъюгированный антимышиный lgG1 (Imtech 1070-08), или биотинилированный антимышиныйlgG2b (Imtech 1090-08), разведенный 1/4000 в PBS с 1% BSA, 0,1% Tween 20, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1,30 ч при 37C; после стадии промывания, планшеты инкубировали 30 мин со конъюгированной стрептавидин-биотин-пероксидазой (Прозан P0397), разведенной 1/10000 в PBS с 1%BSA Твин 20. Для колориметрического обнаружения планшеты инкубировали 20 мин при 22C с раствором ортофенилдиамина (Sigma P4664) 0,04% H2O2 0,03% в 0,1 М цитратном буфере pH 4,2. Реакцию останавливали 2 н. H2SO4 и считывали микропланшеты при 490-630 нм. 1.2. Методы с использованием хорьков. 1.2.1. Тест ингибирования гемагглютинации (HI) Способ проведения испытаний. Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли, используя тест ингибирования гемагглютинации (HI). Принцип теста HI основывают на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию куриных эритроцитов (RBC) гемагглюти-9 015817 нином вируса гриппа (HA). Сыворотку сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (RDE) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма гриппа. Затем добавляли куриные эритроциты и рассчитывали ингибирование агглютинации. Титры выражали как эквивалент самого высокого разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, неопределяемый уровень рассчитывали как титр, равный 5. Статистический анализ Статистический анализ выполняли на титрах HI (41 сутки, до контрольного заражения), используяUNISTAT. Протокол, используемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом: логарифмическое преобразование данных; тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормальности распределения групп; тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах); дисперсионный анализ выбранных данных; тест взаимодействия двухфакторного ANOVA (дисперсионного анализа); тест Тьюки (HSD) для множественных сравнений. 1.2.2. Мониторинг температуры тела Индивидуальные температуры контролировали в течение периода контрольного заражения с датчиками и при помощи телеметрической регистрации. Все импланты проверяли и обновляли, и новую калибровку выполняли с помощью DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, TheNetherlands) перед помещением во внутрибрюшинную полость. Все животные были размещены по отдельности в индивидуальных клетках во время данных исследований. Температуры регистрировали каждые 15 мин, начиная с 4 суток до контрольного заражения вплоть до 7 суток после контрольного заражения. 1.2.3. Назальные промывания. Назальные промывания выполняли путем введения 5 мл PBS в обе ноздри проснувшимся животным. Инокулят собирали в чашки Петри и помещали в контейнеры для образцов на сухой лед. Титрование вирусов в назальных промываниях Все назальные образцы сначала стерильно фильтровали через Spin X фильтры (Costar) для удаления любого бактериального загрязнения. 50 мкл последовательных десятикратных разведений назальных промываний переносили в микротитровальные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем добавляли в каждую лунку 100 мкл клеток MDCK (2,4105 клеток/мл) и инкубировали при 35C в течение 5-7 суток. Через 5-7 суток инкубирования культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл среды, содержащей 1/20 WST-1, и инкубировали в течение еще 18 ч. Интенсивность желтого формазанового окрашивания, получаемого при восстановлении WST-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в лунке в конце анализа по титрованию вирусов, и количественно определяется путем измерения поглощения каждой лунки при подходящей длине волны (450 нм). Пороговое значение определяют как среднее значение OD неинфицированных контрольных клеток - 0,3 OD (0,3 OD соответствует +/-3 StDev(стандарное отклонение) OD неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда OD ниже порогового значения и, наоборот, негативную оценку определяют, когда OD выше порогового значения. Титры вирусного шеддинга определяли с помощью "Reed and Muench" и представляли в виде Log TCID50/мл. 1.3. Методики с использованием свиней. 1.3.1. Тест ингибирования гемагглютинации (HI). Методика проведения испытаний. Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли, используя тест ингибирования гемагглютинации (HI). Принцип теста HI основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию куриных эритроцитов (RBC) гемагглютинином вируса гриппа (HA). Сыворотку сначала нагревали с 25% раствором нейраминидазы (RDE) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма гриппа. Затем добавляли куриные эритроциты и оценивали ингибирование агглютинации. Титры представляли в виде обратной величины наибольшего разведения иммунной сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, неопределяемый уровень рассчитывали как титр, равный 5. Статистический анализ. Статистический анализ выполняли на титрах HI (41 сутки, до контрольного заражения), используяUNISTAT. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом: логарифмическое преобразование данных; тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормальности распределения групп; тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах); тест взаимодействия однофакторного ANOVA; тест Тьюки (HSD) для множественных сравнений. 1.4. Анализы для оценки иммунного ответа у людей. 1.4.1. Анализ ингибирования гемагглютинации. Иммунный ответ определяли путем измерения HI антител, используя способ, описанный в WHOCollaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991). Измерения титра антител производили на оттаявших образцах замороженной иммунной сыворотки стандартизованным и полностью утвержденным микрометодом, используя 4 ингибирующие гемагглютинацию единицы (4 HIU) соответствующих антигенов и 0,5% суспензию эритроцитов домашней птицы. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли при помощи тепловой обработки и фермента, разрушающего рецептор. Полученную сыворотку оценивали на уровни антител HI. Начиная с первого разведения 1:10, серии разведений (с коэффициентом 2) готовили вплоть до конечного разведения 1:20480. За конечную точку титрования принимается стадия наибольшего разведения, которая показала полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы выполняли в двух экземплярах. 1.4.2. Анализ ингибирования нейраминидазы. Анализ выполняли в микротитровальных планшетах, покрытых фетуином. Получали серии 2 кратных разведений антисыворотки и смешивали со стандартизованным количеством вируса гриппа AH3N2, H1N1 или вируса гриппа B. Тест был основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления терминальной нейраминовой кислоты -D-галактоза-N-ацетилгалактозамин был демаскирован. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (HRP) арахисовый агглютинин из Arachis hypogaea, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связанного агглютинина может быть детектировано и количественно определено в субстратной реакции с тетраметилбензидином (TMB). Было показано, что самое высокое разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, представляет собой титр NI. 1.4.3. Анализ нейтрализующих антител. Определение нейтрализующих антител проводили на оттаявших образцах замороженной сыворотки. Нейтрализацию вирусов антителами, содержащимися в иммунной сыворотке, определяли в анализе микронейтрализации. Сыворотку использовали в анализе без дополнительной обработки. Каждую сыворотку тестировали в трех параллелях. Стандартное количество вируса смешивали с последовательными разведениями сыворотки и инкубировали, чтобы обеспечить связывание антител с вирусом. Затем клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток MDCK, добавляли к смеси вируса и антисыворотки и инкубировали при 33C. После инкубационного периода вирусную репликацию визуализировали с помощью гемагглютинации куриных эритроцитов. Титр сыворотки с 50% нейтрализации рассчитывали способом Рида и Мюнха (Reed and Muench). 1.4.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали посредством проточной цитометрии цитокинов (CFC). Антигенспецифические T-клетки CD4 и CD8 из периферической крови можно повторно стимулировать in vitro для продуцирования IL-2, CD40L, TNF-альфа и IFN при инкубировании с соответствующим антигеном. Затем антигенспецифические T-клетки CD4 и CD8 можно пересчитать посредством проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного маркирования клеточного фенотипа, а также внутриклеточного продуцирования цитокинов. В настоящем исследовании антиген гриппозной вакцины, а также пептиды, происходящие из специфического белка вируса гриппа, использовали в качестве антигена для повторного стимулирования T-клеток, специфичных к вирусу гриппа. Результаты выражают в виде количества цитокин(цитокины)-положительных T-клеток CD4 или CD8 в субпопуляцииT-клеток CD4 или CD8. 1.4.5. Статистические способы. 1.4.5.1. Первичные конечные точки. Процентное содержание, интенсивность и отношение к вакцинации ожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 7-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 6 последующих суток) после вакцинации и в целом. Процентное содержание, интенсивность и отношение к вакцинации неожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 21-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 20 последующих суток) после вакцинации и в целом.- 11015817 Частота серьезных нежелательных явлений в течение всего исследования. 1.4.5.2. Вторичные конечные точки. Для гуморального иммунного ответа: Наблюдаемые показатели: в сутки 0 и 21: титры ингибирования сывороточной гемагглютинации (HI) и титры N1-антител, исследованные отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антиH1N1, анти-H3N2 и анти-B-антитела); в сутки 0 и 21: титры нейтрализующих антител, исследованные отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине. Производные показатели (с 95%-ными доверительными интервалами): среднее геометрическое титров (GMTs) сывороточных HI-антител (с 95%-ными доверительными интервалами): (95% ДИ) перед и после вакцинации; уровни сероконверсии с 95% ДИ на 21 сутки; факторы конверсии с ДИ 95% на 21 сутки; уровни серопротекциис ДИ 95% на 21 сутки;GMTs' сывороточных антител к NI (с 95%-ными доверительными интервалами) во всех точках времени. Уровень сероконверсии, определенный как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 сутки по сравнению с 0 сутками для каждого вакцинного штамма. Фактор конверсии, определенный как кратное увеличение сывороточных HI GMTs на 21 сутки по сравнению с сутками 0 для каждого вакцинного штамма. Уровень серопротекции определяли как процент вакцинированных с титром сыворотки HI равным 40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимается как указывающий на протекцию. Следует понимать, что для некоторых клинических испытаний реактогенность/безопасность могут являться вторичными конечными точками, и иммуногенность может являться первичной конечной точкой. Для клеточно-опосредованного иммунного ответа (CMI). Наблюдаемый показатель. В сутки 0 и 21: количество цитокин-положительных клеток CD4/CD8 на 106 в разных тестах. Каждый тест определяет в количественном выражении ответ T-клеток CD4/CD8 на: пептидный антиген вируса гриппа (pf) (точная природа и происхождение этих антигенов нуждаются в установлении/объяснении); антиген расщепленного вируса гриппа (sf); антиген целого вируса гриппа (wf). Производные показатели: клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (CD40L, IL-2, IFN, TNF); клетки, продуцирующие, по меньшей мере, CD40L и другой цитокин (IL-2, TNF, IFN); клетки, продуцирующие по меньшей мере IL-2 и другой цитокин (CD40L, TNF, IFN); клетки, продуцирующие по меньшей мере IFN и другой цитокин (IL-2, TNF, CD40L); клетки, продуцирующие по меньшей мере TNF и другой цитокин (IL-2, CD40L, IFN). 1.3.5.3. Анализ иммуногенности. Анализ иммуногенности был основан на всей вакцинированной группе. Для каждой обработанной группы рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами): среднее геометрическое титров (GMTs) HI и NI антител в 0 и 21 сутки; среднее геометрическое титров (GMTs) нейтрализующих антител в 0 и 21 сутки; факторы конверсии на 21 сутки; уровни сероконверсии (SC) на 21 сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров HI на 21 сутки по сравнению с 0 сутками; уровни протекции на 21 сутки, определенные в виде процента вакцинированных с сывороточнымHI титром =1:40; количество T-лимфоцитов CD4/CD8, секретируемых в ответ, обобщали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы в каждый контрольный момент времени (сутки 0, сутки 21) и для каждого антигена (пептида вируса гриппа (pf), расщепленного вируса гриппа (sf) и цельного вируса гриппа (wf; описательная статистика индивидуальной разности между ответами в контрольные моменты времени (Post-Pre) для каждой вакцинированной группы и каждого антигена (pf, sf, и wf) в каждом из 5 разных тестов; непараметрический тест (тест Крускал-Уоллиса) использовали для сравнения значений локальной- 12015817 разницы между 3 группами, и статистическое значение p рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. Значения p меньше или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые. Пример II. Получение эмульсии масло в воде и адъювантных композиций. Если не оговаривается иное, эмульсию масло/вода, используемую в следующих примерах, составляют органическая фаза, приготовленная из 2 масел (-токоферола и сквалена), и водная фаза PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), содержащая Твин 80 в качестве эмульгатора. Если не оговаривается иное, эмульсионные масло в воде адъювантные композиции, используемые в следующих примерах,готовили содержащими следующий эмульсионный масло в воде компонент (приведены конечные концентрации): 2,5% сквалена (об./об.), 2,5% -токоферола (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата (об./об.) (Твин 80), см. WO 95/17210. Такую эмульсию, называемую AS03 в следующих примерах,получали, как указано ниже в виде концентрата двукратного сгущения. 2.1. Получение эмульсии SB62. Данный способ использовали в исследованиях, описанных в разделах клинических и доклинических примеров. Препарат эмульсии SB62 изготавливают посредством смешивания при энергичном перемешивании масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (DLтокоферол и сквален), и водной фазы, содержащей водорастворимые компоненты (анионный детергент Твин 80 и PBS mod (модифицированный), pH 6,8). Во время перемешивания масляную фазу (1/10 общего объема) переносят в водную фазу (9/10 общего объема) и смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем полученную смесь подвергали воздействию усилия сдвига, ударной силы и кавитации в камере для взаимодействия микрофлуидайзер (15000 PSI - 8 циклов, или 3 цикла в адъюванте, используемом в клиническом испытании, описанном в примере III) для получения субмикронных капель (распределение между 100-200 нм). Полученный pH составляет 6,80,1. Затем эмульсию SB62 стерилизовали фильтрацией через мембрану 0,22 мкм, и стерильную нерасфасованную эмульсию хранили замороженной в контейнерах Cupac при 2-8C. Стерильным инертным газом (азотом или аргоном) продували мертвый объем конечного наливного контейнера для эмульсии SB62 в течение по меньшей мере 15 с. Конечная композиция эмульсии SB62 является следующей; Твин 80: 1,8% (об./об.) 19,4 мг/мл; сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл;-токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл; PBS: NaCl 121 мМ, KCl 2,38 мМ, Na2HPO4 7,14 мМ, KH2PO4 1,3 мМ; pH 6,80,1. Пример III. Клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа и различные дозы адъюванта AS03 (Flu-LD-004) на взрослой популяции в возрасте 18-59 лет. 3.1. Введение.II фазу контролируемого рандомизированного простого слепого исследования проводили в 2006 г. на взрослой популяции в возрасте 18-59 лет, чтобы оценить иммуногенность, безопасность и реактогенность низкодозовой (то есть содержащей 5 мкг HA на штамм) кандидатной вакцины против гриппа с двумя дозами адъюванта AS03 от GlaxoSmithKline Biologicals. Гуморальный иммунный ответ (то есть анти-гемагглютинин) определяли на 21 сутки после внутримышечного введения одной дозы адъювантной вакцины AS03. Fluarix использовали в качестве эталона. 3.2. Дизайн исследования. Три группы субъектов параллельно внутримышечно получали следующую вакцину: одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой вакцины на основе расщепленного вируса гриппа, содержащей 5 мкг HA, адъювантированной AS03 (FluLD1/1); одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой вакцины на основе расщепленного вируса гриппа, содержащей 5 мкг HA, адъювантированной половиной дозы AS03 (AD03 1/2)(FluLD1/2); одна группа из 100 субъектов, получающая одну дозу Fluarix (Флюарикс). Режим: одна IM инъекция гриппозной вакцины в сутки 0, посещения центра клинических исследований в сутки 0 и сутки 21 с отбором образца крови (определение HI-антител) и дополнительный телефонный контакт в сутки 30 (завершение исследования). Стандартная расщепленная трехвалентная гриппозная вакцина Fluarix, используемая в данном исследовании, представляет собой имеющуюся в продаже вакцину, разработанную и производимуюGlaxoSmithKline Biologicals с 2006 г. 3.3. Цели исследования. 3.3.1. Первичная цель. Оценить гуморальный иммунный ответ, индуцируемый исследуемыми вакцинами, в единицах титров антител к гемагглютинину: Наблюдаемые показатели в сутки 0 и 21: титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию. Производные показатели (с 95%-ными доверительными интервалами):- 13015817 среднее геометрическое титров (GMTs) сывороточных антител в сутки 0 и 21; уровни сероконверсии на 21 сутки; факторы конверсии на 21 сутки; уровни протекции на сутки 0 и 21. Уровень сероконверсии иммунного ответа на гемагглютинин определяют как процент вакцинированных, которые имеют либо довакционный титр менее 1:10 и поствакционный титр больше или равный 1:40, либо довакционный титр больше или равный 1:10 и по меньшей мере четырехкратное увеличение поствакционного титра. Фактор конверсии определяют как кратность увеличения сывороточных HI GMTs после вакцинации по сравнению с сутками 0. Уровень протекции определяют как процент вакцинированных с титром сывороточного HI более 40 после вакцинации, что обычно принимают как индикатор защиты. 3.3.2. Вторичная цель. Оценить безопасность и реактогенность исследуемых вакцин с точки зрения ожидаемых местных и генерализованных нежелательных явлений, неожидаемых нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений: 1. Появление, интенсивность и отношение к вакцинации ожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в продолжение 7-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 6 последующих суток) после каждой вакцинации в каждой группе. 2. Появление, интенсивность и отношение к вакцинации неожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 30-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 29 последующих суток) после вакцинации в каждой группе. 3. Появление и взаимосвязь серьезных нежелательных явлений в течение всего периода исследования в каждой группе. 3.4. Вакцинная композиция и введение. 3.4.1. Вакцинный препарат. Неадъювантная вакцина против гриппа представляет собой трехвалентный расщепленный вирион,инактивированную вакцину против гриппа, состоящую из смесей трех моновалентных вирусных антигенных продуктов (полученных соответственно из штаммов гриппа A/H1N1, A/H3N2 и B). Антигены,присутствующие в такой вакцине, являются такими же, что и в лицензированной вакцине Fluarix, которая продается под торговой маркой Fluarix (-Rix) с 1992 г и содержит 15 мкг HA/штамм на дозу. Штаммы гриппа, включенные в клинические партии FluLD, представляют собой штаммы, которые были выбраны для 2006/2007 Северного полушария:- B/Malaysia/2506/2004. Антигены производят из вирусов, выращенных в яйцах. Расщепление выполняют дезоксихолатом натрия перед стадией инактивации, которую выполняют посредством последовательного воздействия дезоксихолата натрия и формальдегида. Низкодозовая вакцина против гриппа (FluLD) (клинические серии), адъювантированная AS03, основана на имеющейся в продаже вакцине Fluarix (полученной соответственно из штаммов гриппаA/H1N1, A/H3N2 и B), но с более низким содержанием антигена и адъювантированной GSK адъювантной системе AS03. AS03 состоит из эмульсии масло в воде (SB62), которая содержит два биоразлагаемых масла, сквален и -токоферол (витамин E), и поверхностно-активное вещество полисорбат 80 (Твин 80). Антигены вируса гриппа включены в водную фазу адъювантной системы посредством простого смешивания с эмульсией. Были испытаны две композиции, отличающиеся количеством адъюванта, введенного с антигенами Flu в партию вакцины. Адъювантные вакцины содержат 5 мкг гемагглютинина(HA) каждого штамма вируса гриппа на дозу, объединенных с полной дозой (AS03) или половиной дозы(AS03 1/2) адъювантной системы AS03. Эксципиенты следующие: полисорбат 80 (Твин 80), октоксинол 10 (Тритон X-100), -токоферилгидросукцинат, хлорид натрия, натрия гидрофосфат, дигидрофосфат калия, хлорид калия, вода для инъекций. Низкодозовые вакцины против гриппа, адъювантированные AS03(FluLD, полная или половинная доза AS03), представляют собой вакцины, не содержащие консерванта. Однако они содержат следовые количества тиомерсала (1,25 мкг Hg на дозу) с ранних стадий производственного процесса. Они обе присутствуют в виде однодозовых вакцин в стеклянных (тип 1) предварительно наполненных шприцах с объемом 0,5 мл/доза. 3.4.1.1. Композиция гриппозной вакцины, адъювантированной AS03 Одна доза FluLD (полная или половинная доза AS03) соответствует 0,5 мл. Композиция представлена в табл. 3. Содержание HA на дозу составляет 5 мкг для обеих композиций, единственным огличием является количество AS03, присутствующего в конечных контейнерах.- 14015817 Таблица 3. Композиция низкодозовой гриппозной вакцины, адъювантированной AS03 (полная доза и половина дозы AS03) Сокращения: HA = гемагглютинин. Общее содержание в Полисорбате 80 соответствует 4,972 мг на дозу, когда используют полную дозу AS03, и 2,547 мг на дозу, когда используют половину дозы AS03. 3.4.1.2. Получение антигенного препарата расщепленного инактивированного вируса гриппа. Вирусы гриппа идентичны вирусам, включенным в Fluarix (вакцина против вируса гриппа). Моновалентные продукты состоят из очищенных инактивированных расщепленных вирусов, которые получают из рабочих посевов трех штаммов вируса гриппа, типа A (H1N1 и H3N2) и типа B, которые выращивают по отдельности в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. Такие рабочие посевы происходят из штаммов, которые получают из Центра сотрудничества BOЗ, следуя ежегодным рекомендациямBOЗ. Информация по способу получения антигенов, в качестве иллюстрации, дается в WO 02/097072. Объемы трех моновалентных продуктов основаны на содержании HA, измеренном в каждом моновалентном продукте перед приготовлением препарата, и на нужном объеме производства. 10-Кратно концентрированный фосфатно-солевой буферный раствор (pH 7,4 при однократной концентрировании) и премикс Твин 80 и -токоферилгидросукцината разводят в воде для инъекций, затем перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре. Затем три концентрированных моновалентных продукта последовательно разводят в полученном растворе из фосфатно-солевого буферного раствора/Твин 80 токоферилгидросукцината до концентрации 20 мкг HA каждого моновалентного продукта A (H1N1, H3N2) 23,32 мкг HA моновалентного продукта B на миллилитр промежуточного трехвалентного продукта (5 мкг HA каждого моновалентного продукта A и 5,83 мкг HA B/500 мкл трехвалентного конечного продукта). Между добавлениями каждого моновалентного продукта смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре и в течение 15-30 мин после добавления последнего моновалентного продукта. Данный трехвалентный промежуточный продукт, упоминаемый также как "предварительный пул", может храниться при +2 - +8C или далее перерабатываться на конечной стадии получения препарата в тот же день. Конечный объем предварительного пула составляет 250 мкл на дозу. 3.4.1.3. Получение вакцинных композиций с адъювантом AS03. Адъювантная вакцина: LD AS03 1/1 (табл. 4). 10-кратно концентрированный PBS mod (pH 7,4 при однократном концентрировании; 137 мМ NaCl,2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, pH 7,4), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон X100 и VES (количества с учетом поверхностно-активного вещества, присутствующего в штаммах) добавляют к воде для инъекций. Через 5-30 мин перемешивания добавляют 20 мкг HA на мл каждого штаммаH1N1 и H3N2 и 23,32 мкг HA на мл штамма B с 10-30 минутным перемешиванием между каждым добавлением. Через 15-30 мин перемешивания небольшой объем так называемого "промежуточного продукта" отбирали для анализа и хранили между +2 и +8C. Промежуточную смесь помещают в PBS mod 1-кратно концентрированный. Целевые концентрации поверхностно-активных веществ составляют 488 мкг Твин- 15015817 80 на мл, 73,6 мкг Тритон X-100 на мл и 66,6 мкг VES на мл. Затем получают конечную композицию: эквивалентный объем SB62 (получение смотри в примере 2) добавляют к каждым 250 мкл предварительно объединенной промежуточной смеси и смешивают в течение 30-60 мин при комнатной температуре. pH сверяют с диапазоном 6,8-7,5. Композицию продувают азотом и затем хранят при +2 - +8C перед заполнением. Таблица 4. Низкодозовая вакцина, адъювантированная AS03(1): Буферная композиция конечной смеси представляет собой: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl,8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, pH 7,4. Адъювантная вакцина. LD AS03 1/2 (табл. 5). 10-кратно концентрированный PBS mod (pH 7,4 при однократном концентрировании (см. вышеуказанную композицию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон X-100 и VES (количества, взятые с учетом поверхностно-активного вещества, присутствующего в штаммах), добавляют к воде для инъекций. Через 5-30 мин перемешивания добавляют 20 мкг HA на мл каждого штамма H1N1 и H3N2 и 23,32 мкг HA на мл штамма B с 10-30-минутным перемешиванием после каждого добавления. Через 15-30 мин перемешивания небольшой объем так называемой "промежуточной смеси" исключают для анализа и хранят при +2 и +8C. PBS mod 1-кратно концентрируют в промежуточной смеси. Целевые концентрации поверхностно-активных веществ составляют 488 мкг Твин 80 на мл, 73,6 мг Тритон X-100 на мл и 66,6 мкг VES на мл. Затем получают конечную композицию: SB62 сначала разводят буфером PBS mod и перемешивают в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Эквивалентный объем такой разведенной SB62 добавляют затем к каждым 250 мкл предварительно объединенной промежуточной смеси. Через 30-60 мин перемешивания при комнатной температуре pH сверяют с диапазоном 6,8-7,5. Композицию продувают азотом и затем хранят при +2 -+ 8C перед заполнением. Конечный объем обеих композиций составляет 500 мкл на дозу и конечная концентрация HA составляет 10 мкг каждой моновалентной продукта A и 11,66 мкг моновалентной продукта В на мл трехвалентной конечной продукта. Конечные целевые концентрации Твин 80, Тритон X-100 (остаток от производства монопродукта H3N2) и -токоферила гидросукцината (-токоферола гидросукцинат представляет собой эфирную форму RRR (D изомера)токоферола) составляют 244, 58,6 и 33,3 мкг/мл соответственно.(1): Буферная композиция конечной смеси представляет сооои: 137 мМ NACL, 2,7 мМ KCl,8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, pH 7,4. 3.4.2. Введение вакцины. Вакцину заполняют в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы типа 1 (Евр. Фарм). Каждый шприц заполняют до целевого объема 0,57 мл (интервал: 0,54-0,60 мл). Вакцины вводили внутримышечно в дельтовидную область недоминирующей руки. Все вакцины были представлены в виде предварительно заполненных шприцев (0,5 мл). Чтобы обеспечить правильную IM инъекцию вакцины использовали иглу по меньшей мере 25G и длиной по меньшей мере 2,5 см. 3.5 Результаты исследования популяции. В данное исследование зачислили всего 300 субъектов: по 100 субъектов в каждой из 3 групп. Среднее значение возраста общей вакцинированной когорты на момент вакцинации составляло 36,7 лет со стандартным отклонением 13,67 лет. Средний возраст и тендерное распределение субъектов по 3 группам вакцин было аналогичным. 3.6 Результаты по иммуногенности. Анализ иммуногенности выполняли на ATP-группе исследования иммуногенности (297 субъектов). Гуморальный иммунный ответ Чтобы оценить гуморальный иммунный ответ, индуцируемый низкодозовой кандидатной вакцины против гриппа, адъювантированной AS03, рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами) для каждой группы обработки: среднее геометрическое титров (GMTs) титров антител HI в сутки 0 и 21; уровни сероконверсии (SC) в сутки 21; факторы конверсии в сутки 21; уровни протекции в сутки 0 и 21. 3.6.1 Среднее геометрическое титров HI (GMT).GMT между группами показаны в табл. II. Довакционные GMTs HI-антител для всех 3 вакцинных штаммов находились в одном диапазоне в 3 группах обработки. Наблюдаемые GMT на 21 сутки для адъювантированных групп обычно были более высокими, чем в группе Fluarix, для всех 3 штаммов со статистическим расхождением (без перекрывания 95% ДИ, и скорректированное соотношение GMT не включает значение 1) между FluLD1/1 и Fluarix для- 17015817 вакцинного штамма A/Wisconsin. Статистическое расхождение (скорректированное отношение GMT не включает значение 1) наблюдали также между FluLD1/2 и Fluarix для вакцинного штамма B/Malaysia. Таблица I. Коэффициенты серопозитивности и среднее геометрическое титров (GMT) для анти-HA антител в сутки 0 и 21 (ATP-группа исследования иммуногенности)FluLD1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с полной дозой адъюванта AS03;FluLD1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/ штамм) с половиной дозы адъюванта AS03;GMT = среднее геометрическое титра антител;PI (D21) = после вакцинации в сутки 21. Таблица II. Скорректированные соотношения GMT между группами для каждого вакцинного штамма на 21 сутки (ATP-группа исследования иммуногенности)FluLD1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с полной дозой адъюванта AS03;FluLD1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/ штамм) с половиной дозы адъюванта AS03;Fluarix = вакцина Флюарикс; Скорректированное GMT = среднее геометрическое титра антител, скорректированное с учетом исходного титра;N = нисло субъектов с действительными как довакционными, так и поствакционными результатами; 95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал для скорректированного соотношения GMT (модельANCOVA: корректировка с учетом исходного титра - объединенная дисперсия для более чем 2 групп);LL = нижний предел, UL = верхний предел. 3.6.2 Факторы конверсии титров антител HI, коэффициенты серопротекции и уровни сероконверсии(коррелирует с защитой, как установлено для гриппозной вакцины у людей). Результаты представлены в табл. 6 - на фиг. 2 для уровней серопротекции, в табл. 7 - на фиг. 3 для уровней сероконверсии и в табл. 8 - на фиг. 4 для факторов конверсии. Пороговое значение, указанное европейскими организациями для уровней серопротекции (70%),достигалось во всех группах (по меньшей мере 94,9%). Для каждого вакцинного штамма уровни серопротекции на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне. Пороговое значение, указанное европейскими организациями для уровней сероконверсии (40%),достигалось во всех группах (по меньшей мере 65%). Для вакцинного штамма A/New Caledonia SCR на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне. Для вакцинного штамма A/Wisconsin SCR на 21 сутки для группы FluLD1/1 обычно были более высокими по сравнению с группой Fluarix. SCR на 21 сутки для группы FluLD1/2 находились в таком же диапазоне по сравнению с группой Fluarix. Для вакцинного штамма B/Malaysia SCR на 21 сутки для группы FluLD1/2 обычно были более высоким по сравнению с группой Fluarix. SCR в 21 сутки для группы FlulLD1/1 находились в таком же диапазоне по сравнению с группой Fluarix. Пороговое значение, указанное европейскими организациями для факторов сероконверсии (2,5),достигалось во всех группах (по меньшей мере 6,2). Для вакцинного штамма A/New Caledonia SCF на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне. Значение, наблюдаемое для группы FluLD1/2, было ниже значения, наблюдаемого для группыFluarix, но может быть объяснено более высоким уровнем серопротекции до вакцинации в группеFluLD1/2. Для вакцинного штамма A/Wisconsin SCF на 21 сутки для группы FluLD1/1 обычно были более высоким по сравнению с группой Fluarix. SCF в 21 сутки для группы FluLD1/2 находился в таком же диапазоне по сравнению с группой Fluarix. Для вакцинного штамма B/Malaysia SCF на 21 сутки для двух адъювантированных групп обычно были более высоким по сравнению с группой Fluarix. Таблица 6. Уровни серопротекции (SPR) для титра HI-антител в сутки 0 и сутки 21 (ATP-группа исследования иммуногенности).FluLD1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с полной дозой адъюванта AS03;FluLD1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с половиной дозы адъюванта AS03;FluLD1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с полной дозой адъюванта AS03.FluLD1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/ штамм) с половиной дозы адъюванта AS03.Fluarix = вакцина Флюарикс. Сероконверсию определяли как: для изначально серонегативных субъектов титр антител 40 1/DIL после вакцинации; для изначально серопозитивных субъектов, титр антител после вакцинации в 4 раза выше титра антител до вакцинации;N= число субъектов с действительными результатами до и после вакцинации;FluLD1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (о мкг HA/штамм) с полной дозой адъюванта AS03;FluLD1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг HA/штамм) с половиной дозы адъюванта AS03;N = число субъектов с действительными результатами до и после вакцинации;= фактор сероконверсии или среднее геометрическое отношения(значение[log10(PI(D21)/PRE)]); 95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал, LL = нижний предел, UL = верхний предел. 3.7 Выводы по безопасности. Более высокая реактогенность в показателях ожидаемых (местных/генерализованных) и неожидаемых симптомов в группах адъювантных вакцин по сравнению с группой Fluarix являлась общей тенденцией, наблюдаемой в данном исследовании. Понижение содержания AS03 в адъювантной вакцине оказывает значительное влияние на степень всех генерализованных и на 3 локальных симптома. Появление неожидаемых симптомов обычно было более высоким в группах адъювантных вакцин(55 и 47% субъектов) по сравнению с группой Fluarix (35%). Из этих результатов можно заключить, что реактогенность и профиль безопасности кандидатных вакцин является удовлетворительным и клинически приемлемым. 3.8. Общие выводы. 3.8.1. Результаты по иммуногенности. Главной целью данного исследования было оценить гуморальный иммунный ответ (титры анти-HI антител), вызываемый низкодозовой вакциной против гриппа с двумя разными концентрациями адъюванта AS03 и вакциной Fluarix. На 21 сутки три вакцины превысили требования европейских организаций для ежегодной регистрации вакцин против гриппа на основе расщепленного вириона ("Note for Guidance on Harmonisation of Re- 20015817quirements for influenza Vaccines" для иммунологической оценки ежегодных изменений штаммов CPMP/BWP/214/96). GMT обычно были более высокими в адъювантных группах по сравнению с группой Fluarix, со статистически значимым различием, наблюдаемым для вирусных штаммов A/Wisconsin(FluLD1/1 по сравнению с Fluarix) и B/Malaysia (FluLD1/2 по сравнению с Fluarix), Аналогичные уровни серопротекции наблюдались во всех трех группах вакцин, в интервале от 94,9 до 99%. Наблюдаемые уровни сероконверсии и факторы сероконверсии были выше в адъювантных группах, чем в группеFluarix. Данные, полученные в этом испытании, также выявили, что иммуногенность, индуцированная вакциной с половиной дозы адъюванта AS03, была сравнима с иммуногенностью, индуцированной полной дозой адъюванта 3.8.2. Результаты по реактогенности и безопасности. Введение низкодозовой противогриппозной кандидатной вакцины, адъювантированной AS03, было безопасным и клинически хорошо переносилось в вошедшей в исследование популяции, то есть у взрослых людей в возрасте 18-59 лет. Вакцина с половиной дозы адъюванта показала значительное уменьшение частоты возникновения ожидаемых местных и генерализованных симптомов по сравнению с вакциной с полной дозой адъюванта. Пример IV. Доклиническая оценка адъювантированных и неадъювантированных расщепленных противогриппозных вакцин (содержащих различные дозы адъюванта AS03) на праймированных мышахBALB/c. 4.1. Дизайн и цель эксперимента. Эксперименты на праймированных гриппом мышах выполняли для того, чтобы оценить усиление посредством AS03 гуморальных ответов, индуцированных противогриппозными вакцинами, приготовленными с данным адъювантом "масло-в-воде". Для моделирования ситуации у человека эксперимент выполняли, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами. 4.1.1. Обработка/группа (табл. 9). Группы из 27 взрослых мышей BALB/c женского пола праймировали интраназально (объем 20 мкл) в 0 сутки трехвалентным целым вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг HA на каждый штамм). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг HA целого инактивированного H1N1 A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sydney/5/97, В/Harbin/7/94) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой кандидатной вакцины внутримышечно с общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентные расщепленные простые), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные двумя дозами AS03 (полной или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены H1N1 A/New Caledonia/20/99,H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1,5 мкг/штамм, 1/10 дозы, предназначенной для человека). Таблица 9 4.1.2. Получение вакцинных композиций. Готовят премикс Твин 80, Тритон X100 и Витамина E сукцината (VES) для того, чтобы достичь конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твин 80, 110 мкг/мл Тритон X100 и 100 мкг/мл VES. Количества, использованные в премиксе, рассчитывают, принимая во внимание количества поверхностноактивного вещества и VES, уже присутствующее в штаммах. Получение 1 л 10-кратно концентрированного солевого буфера (PBS pH 7,4): к 0,800 л воды для инъекций добавляют 80 г NaCl, 2 г KCl, 11,44 г Na2HPO4, 2 г KH2PO4. После растворения доводят до 1,0 л водой для инъекций. При 10-кратном разведении pH будет составлять 7,4.- 21015817 Трехвалентный расщепленный/простой Композицию одной 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4) + премикс, 5 мин перемешивания магнитной мешалкой при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штаммаH1N1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штаммаH3N2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штамма В, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления. Трехвалентный расщепленный /AS03 Готовили премикс Твин 80, Тритон X100 и Витамин E сукцината (VES) с достижением конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твин 80, 110 мкг/мл Тритона X100 и 100 мкг/мл VES. Количества,используемые в премиксе, рассчитывают, учитывая количества поверхностно-активного вещества и VES,уже присутствующих в штаммах. Композицию однократной 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штамма H1N1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штамма H3N2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг HA штамма B, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 25 мкл эмульсии SB62 для полной дозы AS03 или 5 мкл эмульсии SB62 для 1/5 дозы AS03, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления. 4.1.3. Считывания (табл. 10). Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию оценивали перед иммунизацией (28 сутки) и через 14 суток после иммунизации (27 мышей/группа). Образцы сыворотки испытывали с помощью теста ингибирования гемагглютинации (HI). Таблица 10 4.2. Результаты. 4.2.1. Гуморальный иммунитет. Результаты представлены на фиг. 5. В данной модели гетеросубтипируемого заражения мышей с последующей однократной вакцинацией, было показано, что AS03 и его разведения индуцировали более высокие титры HI по сравнению с простой вакциной. Для всех штаммов вируса гриппа A наблюдалось статистически значимое увеличение HI-титров (p0,05). Для штамма H1N1 также наблюдалось значимое различие HI-титров между AS03 и AS03 1/5 (p0,05). Пониженная доза AS03 не увеличивала титры HI для всех трех штаммов по сравнению с простой вакциной. Очень низкие ответы наблюдались против штамма B (B/Shangdong); это, вероятно, может быть обусловлено значительным антигенным дрейфом штаммов B, использованных для праймирования, и вакцины. 4.3. Краткое изложение результатов и выводы. В заключение, увеличение HI-титров наблюдалось у животных, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами, при использовании вакцин, адъювантированных AS03, по сравнению с простой вакциной. Полная доза AS03 была оптимальной для получения устойчивых HI-титров против трех штаммов гриппозной вакцины. Пример V. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных расщепленных гриппозных вакцин (содержащих различные дозы адъюванта AS03) у праймированных мышей C57BI/8 5.1. Дизайн и цель эксперимента. Эксперименты на мышах, праймированных вирусом гриппа, выполняли, чтобы оценить усиление посредством AS03 гуморального и клеточного ответов, индуцированных гриппозными вакцинами, приготовленными с данным адъювантом "масло-в-воде". Для моделирования ситуации у человека эксперимент проводили, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами. 5.1.1. Обработка/группа (табл. 11). Группы из 25 взрослых самок мышей C57BI/6 праймировали интраназально (объем 20 мкл) в сутки 0 трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг HA на каждый штамм). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг HA цельного инактивированного H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой вакциныкандидата внутримышечно с общим объемом 100 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентный расщепленный простой), или композициями,- 22015817 содержащими расщепленные антигены, адъювантированные тремя дозами AS03 (полная, 1/2 или 1/5),Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены H1N1 A/New Caledonia/20/99,H3N2 A/New York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1,5 мкг/штамм, 1/10 дозы, предназначенной для человека). Таблица 11 5.1.2. Получение вакцинных композиций. Трехвалентная расщепленная/простая. Композицию 100 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4, полученный,как указано в примере IV) + Флюарикс клиническая серия DFLUA014 (1,5 мкг на штамм в конечной дозе). Трехвалентная расщепленная/AS03. Композиции 100 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4, полученный,как указано в примере IV) + Флюарикс клиническая серия DFLUA014 (1,5 мкг на штамм в конечной дозе) + 25 мкл эмульсии SB62 для полной дозы или 12,5 мкл эмульсии SB 62 для 1/2 дозы или 5 мкл эмульсии SB62 для 1/5 дозы. Композиции вводят в течение 1 ч после окончания приготовления. 5.1.3. Считывания (табл. 12). Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию оценивали через 21 сутки после иммунизации (10 мышей/группа), и образцы сыворотки испытывали с помощью теста ингибирования гемагглютинации(HI). Клеточный иммунный ответ проверяли через 7 суток после иммунизации с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS). Таблица 12 5.2. Результаты. 5.2.1. Гуморальный иммунитет (10 мышей/группа). Результаты представлены на фиг. 6. В данной модели на мышах было показано, что гетеросубтипическое праймирование с последующей однократной вакцинацией, AS03 и его разведениями (1/2 и 1/5),индуцировали более высоких титры HI по сравнению с простой вакциной. Для всех трех штаммов не наблюдалось различия HI-титров между мышами, получавшими вакцину, адъювантированную полной дозой AS03 или уменьшенными дозами AS03. 5.2.2. Клеточный иммунитет (15 мышей/группа). Результаты представлены на фиг. 7. Независимо от разведения AS03, более высокие CD4+Tклеточные ответы наблюдались у мышей, иммунизированных AS03-адъювантной трехвалентной расщепленной вакциной, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом, индуцированным у мышей, иммунизированных трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной полной дозой AS03, обычно наблюдались более низкие клеточные ответы, когда мышей иммунизировали трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной более низкими дозами AS03. 5.3. Краткое изложение результатов и выводы. В заключение, усиление гуморального и клеточного ответов наблюдали у животных, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами, при использовании AS03-адъювантных вакцин по сравнению с простой вакциной. Аналогичную величину иммунного ответа наблюдали у мышей, иммунизированных полной дозой или дробными дозами адъюванта AS03. Однако уменьшение дозы адъюванта было связано с обычно пониженной величиной CD4+ T-клеточного ответа.- 23015817 Пример VI. Доклиническая оценка клеточного иммунного ответа, индуцированного адъювантными и неадъювантными расщепленными гриппозными вакцинами (содержащими различные дозы адъювантаAS03 и низкую дозу антигена) у праймированных мышей C57B9/6. 6.1. Дизайн и цель эксперимента. Эксперименты на мышах, праймированных вирусом гриппа, выполняли для того, чтобы оценить усиление посредством AS03 клеточных иммунных ответов, индуцированных гриппозными вакцинами,содержащими низкую дозу антигена (0,5 мкг/штамм, 1/30 дозы, предназначенной для человека) и приготовленными с указанным адъювантом масло-в-воде. Для моделирования ситуации у человека эксперимент проводили, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами. 6.1.1. Обработка/группа (табл. 13). Группы из 15 самок мышей C57BI/6 праймировали интраназально (объем 20 мкл) в 0 сутки трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг HA для каждого штамма). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг HA цельного инактивированного H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой вакцины-кандидата внутримышечно с общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентными расщепленными простыми), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные тремя дозами AS03 (полной, 1/2 или 1/5). Штаммы,использованные для иммунизации, включали вирусные антигены H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 6.1.2. Получение вакцинных композиций. Трехвалентный расщепленный/беспримесная. Композиции для 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4, полученный как указано в примере IV) + Fluarix, клиническая серия DFLUA014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе). Трехвалентный расщепленный/AS03. Композиции для дозы 50 мкл готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4, полученный как указано в примере IV) + Флюарикс, клиническая серия DFLUA014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе) + 25 мкл эмульсии SB62 для полной дозы или 12,5 мкл эмульсии SB 62 для 1/2 дозы или 5 мкл эмульсии SB62 для 1/5 дозы. Композиции вводят в течение 1 ч после завершения приготовления. 6.1.3. Считывания (табл. 14). Клеточный иммунный ответ испытывали через 7 суток после иммунизации с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина. Таблица 14 6.2. Результаты. 6.2.1. Клеточный иммунитет. Результаты представлены на фиг. 8. Незначительно более высокие ответы CD4+ T-клеток наблюдались у мышей, иммунизированных трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной AS03(полная доза или 1/2 дозы), по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом, индуцированным у мышей, иммунизированных трехвалентной расщепленной простой или адъювантированной полной дозой или половиной дозы AS03 вакциной,более высокие клеточные ответы наблюдались, когда мышей иммунизировали трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной 1/5 дозы AS03. 6.3. Краткое изложение результатов и выводы. В заключение, минимальное усиление ответов CD4+ T-клеток наблюдали у гетеросубтипически- 24015817 праймированных животных при использовании AS03-адъювантных вакцин по сравнению с простой вакциной. В данном эксперименте не наблюдалось ответа на дозу адъюванта, и действительно, 1/5 дозыAS03 индуцировала более высокую концентрацию антигенспецифических CD4+T-клеток, чем наблюдалось при более высоких дозах адъюванта. В целом эти данные не согласуются с другими доклиническими экспериментами и могут указывать на техническую проблему данного конкретного эксперимента. Пример VII. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных вакцин на основе расщепленного H5N1 (включающих различные дозы адъюванта AS03 и антигена) у мышей C57BI/6, ранее не подверженных воздействию. 7.1. Схема и цель эксперимента. Эксперименты на мышах, ранее не подверженных воздействию H5N1, выполняли, чтобы оценить усиление гуморального и клеточного иммунных ответов под влиянием AS03, индуцированных вакцинами на основе расщепленного H5N1, приготовленных в виде препарата с указанным адъювантом "маслов-воде". В случае пандемии ожидается, что вся мировая популяция иммунологически будет представлять собой ранее не подверженную воздействию нового циркулирующего пандемического штамма гриппа. Вследствие такого, ранее не подверженного воздействию иммунного статуса для пандемической вакцины возможно потребуются две вакцинные дозы для защиты субъектов от инфекции и тяжелого заболевания, вызванного новым штаммом гриппа. Чтобы представлять данное отсутствие предшествующего воздействия, для определения иммуногенности вакцины была разработана модель на мышах, ранее не подверженных воздействию. 7.1.1. Обработка/группа (табл. 15). Группы из 15 взрослых самок мышей C57BI/6, ранее не подверженных воздействию, иммунизировали в сутки 0 и 28 пандемической H5N1 вакциной-кандидатом внутримышечно общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены H5N1 (H5N1 расщепленная простая), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные разными дозами AS03 (двойной, полной, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации,включали вирусный антиген H5N1 A/Vietnam/1194/04 (1,5 или 0,38 мкг/штамм, соответствующие 1/10 дозы, предназначенной для человека). Композицию с двойной дозой AS03 не готовили, но делали одновременную инъекцию 50 мкл H5N1 расщепленной/полная доза AS03 + доза 50 мкл AS03. Таблица 15 7.1.2. Получение вакцинных композиций. Получение одного литра конечного основного буфера (PBS pH 7,20,2): к 0,800 л воды для инъекций добавить 7,699 г NaCl, 0,200 KCl г, 0,100 г MgCl2 6H2O, 2,600 г Na2HPO412H2O, 0,373 г KH2PO4. После растворения довести до 1,0 л водой для инъекций. Расщепленный H5N1/простая. Приготовление дозы 50 мкл: Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тритон X100 добавляли к конечному основному буферу. Твин 80 не добавляют, так как заданное значение содержания в композиции достигается посредством концентрации Твина в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 368 мкг/мл для Твина 80 и 35 мкг/мл для Тритона X100 в 1,5 мкг дозе композиции. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 93 мкг/мл для Твина 80 и 8,9 мкг/мл для Тритона X100 в 0,38 мкг дозе композиции. Через 5-30 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляют 1,5 или 0,38 мкг HA(штамм H5N1). Композиции перемешивают в течение 30-60 мин. Проверяют pH. Инъекции осуществляют в течение 1 ч после окончания приготовления композиции. Расщепленный H5N1/AS03. Получение дозы 50 мкл: Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тритон X100 добавляют к конечно- 25015817 му основному буферу. Твин 80 не добавляют, так как заданное значение содержания в композиции достигается посредством концентрации Твин в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 368 мкг/мл для Твина 80 и 35 мкг/мл для Тритона X100 в 1,5 мкг дозы композиции. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 93 мкг/мл для Твина 80 и 8,9 мкг/мл для Тритона X100 в 0,38 мкг дозе композиции. Через 5-30 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляли 1,5 или 0,38 мкг HA(штамм H5N1). Через 30-60 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляют 25 или 12,5 или 5 мкл эмульсии SB62. Композиции перемешивают в течение 30-60 мин. Проверяют рН. Инъекции осуществляют в течение 1 ч после окончания приготовления композиции. 7.1.3. Считывания (табл. 16). Гуморальный иммунный ответ оценивали через 14 суток после иммунизации (10 мышей/группа) по титрам анти-lg, lgG1 и lgG2b антител (фиг. 9 A-F). Гуморальный иммунный ответ оценивали также через 21 день после иммунизации (10 мышей/группа) с помощью анализа ингибирования гемагглютинации анти-H5N1 (фиг. 10 A-B). Клеточный иммунный ответ испытывали через 6 суток после иммунизации (5 пулов из 3 мышей на группу) с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина (ICS) антигенспецифических CD4+ Tклеток, количественно определяемого при помощи поточной цитометрии (фиг. 11 A-B). Таблица 16 7.2. Результаты. 7.2.1. Гуморальный иммунный ответ: ELISA и изотипы. Результаты представлены на фиг. 9. Для каждой дозы расщепленной H5N1 вакцины все адъювантные группы индуцировали более высокие титры анти-Н 5N1lg, lgG1 и lgG2b антител по сравнению с неадъювантной расщепленной H5N1 вакциной (фиг. 9A-F). Для каждой дозы расщепленной H5N1 вакцины; образование анти-Н 5N1 lgG1 антител было в 4-5 раз выше, чем образование анти-lgG2b H5N1 антител (фиг. 9 C-F). При дозе 1,5 мкг HA расщепленнойH5N1 вакцины и комбинированной для каждой дозы адъюванта не наблюдалось различий анти-H5N1 lg,lgG1 и lgG2b ответов антител (фиг. 9A, C и E). При дозе 0,38 мкг HA расщепленной H5N1 вакцины, обычно были получены более высокие антиH5N1 lg титры после иммунизации расщепленной H5N1 вакциной, адъювантированной двумя полными дозами, по сравнению с ответом, индуцированным расщепленной H5N1 вакциной, адъювантированнойAS03/2 (p = 0,7315) и AS03 1/5 (p = 0,9744) (фиг. 9-В). Данная тенденция также наблюдалась для антиH5N1 lgG1 антител (фиг. 9D). Однако сила не была достаточной для наблюдения статистически значимого различия (25% силы для 1,7-кратного различия, или 47% для 2-кратного различия). 7.2.2. Гуморальный иммунный ответ: титры HI. С дозой 1,5 мкг HA/мышь: Для каждой дозы адъюванта все мыши, иммунизированные AS03-адъювантной расщепленнойH5N1 вакциной, индуцировали более высокие титры HI по сравнению с ответом, полученным у мышей,иммунизированных неадъювантной расщепленной H5N1 вакциной (фиг. 10A). Не наблюдалось различия титров HI, когда расщепленную H5N1 вакцину адъювантировали с диапазоном доз AS03 (фиг. 10 А). С дозой 0,38 мкг HA/дозу. Для каждой дозы адъюванта у всех мышей, иммунизированных AS03-адъювантной расщепленнойH5N1 вакциной, индуцировались более высокие титры HI по сравнению с ответом, полученным у мышей, иммунизированных неадъювантной расщепленной H5N1 вакциной (фиг. 10 Б). Значительно более высокие титры HI наблюдались в случае расщепленной H5N1 вакцины, адъювантированной двумя полными дозами AS03 по сравнению с ответом, полученным в случае расщепленной H5N1 вакцины, адъювантированной AS03/2 (p=0,032 для 4-кратного отличия) (фиг. 10 Б). Не наблюдалось различия титров HI у мышей, иммунизированных вакциной на основе расщепленного H5N1, адъювантированной двумя полными дозами AS03 или полной дозой AS03, или мышей, иммунизированных вакциной на основе расщепленного H5N1, адъювантированной AS03/2 или AS03/5(фиг. 10 Б). Сравнение доз антигенов (1,5 мкг или 0,38 мкг): Не наблюдалось различия титров HI мышей, иммунизированных любой HA дозой расщепленной H5N1 вакцины, адъювантированной AS03, AS03/2 или AS03/5, за исключением мышей, иммунизированных 1,5 мкгHA расщепленного H5N1, адъювантированного AS03/5, и мышей, иммунизированных 0,38 мкг HA расщепленного H5N1, адъювантированного двумя полными дозами AS03 (фиг. 10). Титры HI были значительно бо- 26015817 лее высокими после иммунизации 0,38 мкг HA расщепленного H5N1, адъювантированного двумя полными дозами AS03, по сравнению с более высокой дозой антигена, комбинированной с более низкой дозой адъюванта (1,5 мкг HA в случае AS03/5, p=0,0193 для 4-кратного различия) (фиг. 10). 7.2.3. Клеточный иммунный ответ. Результаты представлены на фиг. 11. Для каждой дозы расщепленной H5N1 вакцины (1,5 или 0,38 мкг) наблюдались более высокие ответы CD4+ T-клеток у мышей, иммунизированных расщепленной H5N1 вакциной, адъювантированной различными дозами AS03, по сравнению с мышами, иммунизированными неадъювантной расщепленнойH5N1 вакциной (фиг. 11). При дозе 1,5 мкг расщепленной H5N1 вакцины понижение доз AS03 соответствовало снижению концентрации CD4+ T-клеток (фиг. 11A). Однако при дозе 0,38 мкг расщепленной H5N1 вакцины у мышей, иммунизированных AS03-адъювантными расщепленными H5N1 вакцинами (фиг. 11B), не наблюдалось различия в ответах CD4+ T-клеток между разными дозами адъюванта. 7.3. Краткое изложение результатов и выводы. Исследования иммуногенности на мышах показали, что адъювантная расщепленная H5N1 вакцина индуцировала значительно более высокие гуморальный (анти-H5N1 ELISA и титры HI) и клеточный(CD4+T-клетки) ответы, чем ответы, индуцированные неадъювантной расщепленной H5N1 вакциной. Не наблюдалось отсутствия влияния дозы антигена на гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных 1,5 и 0,38 мкг адъювантной расщепленной H5N1 вакцины, что позволило предположить, что в данной модели в присутствии адъюванта могут требоваться даже более низкие дозы HA для наблюдения влияния дозы на ответ. Наблюдалось значительное усиление ответов CD4+ T-клеток у мышей, ранее не поверженных воздействию, при использовании AS03-адъювантной пандемической H5N1 вакцины по сравнению с простой H5N1 вакциной. Не наблюдалось влияния разведения AS03, когда дозу 0,38 мкг H5N1 расщепленной вакцины использовали в качестве вакцины-кандидата, в то время как наблюдалось уменьшение ответов CD4+ T-клеток, когда 1,5 мкг расщепленной H5N1 вакцины адъювантировали пониженной дозойAS03. Как отмечалось ранее, не наблюдалось различия гуморального и клеточного иммунных ответов у мышей, иммунизированных расщепленной H5N1 вакциной (при любой дозе антигена), адъювантированной полной дозой AS03 или AS03/2. Некоторое усиление иммунного ответа было обнаружено, когда в вакцинной композиции использовали двойную полную дозу AS03 и, соответственно, было обнаружено снижение иммунного ответа, когда в вакцинной композиции использовали AS03/5. В целом, данные, представленные в данном описании изобретения, подтверждают эффективность данной новой адъювантной системы в данной вакцинной композиции. Пример VIII. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных вакцин против гриппа у праймированных свиней Large White. 8.1. Дизайн и цель эксперимента. Эксперимент на мышах, праймированных вирусом гриппа, проводили для оценки усиления посредством AS03 гуморальных ответов, индуцированных вакцинами против гриппа, приготовленных в виде препарата с указанным адъювантом "масло-в-воде". Свиней использовали, чтобы оценить диапазон доз AS03 в модели на животных, близкой человеку. Свиньи демонстрируют длинный перечень биологических аналогий, что определяет это животное как физиологически наиболее близкое к человеку с очень незначительными исключениями (Douglas R.,1972). Кроме того, у свиней обычно наблюдается проявление гриппозной инфекции. 8.1.1. Обработка/группа (табл. 17). Группы из 10 взрослых самок большой белой свиньи праймировали в сутки 0 трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (25 мкг HA для каждого штамма), интраназально,общим объемом 200 мкл. Праймирующие штаммы состояли из штаммов, гомологичных вакцинным штаммам (25 мкг HA цельного инактивированного H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2A/Panama/2007/99 и B/Shangdong/7/97). Через двадцать восемь суток свиней вакцинировали одной дозой вакцины-кандидата внутримышечно общим объемом 500 мкл. Свиней иммунизировали композициями,содержащими только расщепленные антигены (трехвалентная расщепленная простая), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные диапазоном доз AS03 (полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизаций, включали вирусные антигены H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 и B/Shangdong/7/97 (15 мкг HA для штаммов H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 и 17,5 мкг штамма B/Shangdong/7/97 в качестве одной дозы, предназначенной для человека). Группы (10 свиней/группа): 8.1.2. Получение вакцинных композиций. Трехвалентная расщепленная/простая. Премикс Твина 80, Тритона X100 и Витамина E сукцината (VES) готовят для достижения конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона X100 и 100 мкг/мл VES. В количествах, использованных в премиксе, учитывают их содержание в штаммах. Композицию одной дозы 500 мкл получают для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4, полученный как указано в примере IV) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг HA штамма H1N1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг HA штамма H3N2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 17,5 мкг HA штамма B, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления. Трехвалентная расщепленная /AS03. Премикс Твина 80, Тритона X100 и Витамина E сукцината (VES) готовят для достижения конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона X100 и 100 мкг/мл VES. В количествах, использованных в премиксе, учитывают их содержание в штаммах. Композицию одной дозы 500 мкл получают для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный PBS pH 7,4 получали, как указано в примере IV) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг HA штамма H1N1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг HA штамма H3N2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 17,5 мкг HA штамма B, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 250 мкл эмульсии SB62 для полной дозы AS03 или 125 мкл эмульсии SB62 для 1/2 дозыAS03 или 50 мкл эмульсии SB62 для 1/5 дозы AS03, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления. 8.1.3. Считывания (табл. 18). Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию измеряли перед интраназальным праймированием(сутки 0), перед иммунизацией (сутки 28) и через 14 суток после иммунизации (10 свиней/группа). Образцы сыворотки тестировали посредством теста ингибирования гемагглютинации (HI). Таблица 18 8.2. Результаты и выводы. 8.2.1. Гуморальный иммунитет. Результаты представлены на фиг. 12. Независимо от разведения адъюванта AS03-адъювантные трехвалентные расщепленные композиции индуцировали более сильный HI-ответ на все штаммы, чем простая трехвалентная композиция в данной модели гомологичного праймирования, хотя статистическая значимость не всегда достигалась для всех трех штаммов. Влияние дозы адъюванта наблюдалось с незначительными различиями между штаммами. Для менее иммуногенных штаммов, таких какB/Shangdong, только трехвалентная расщепленная вакцина, адъювантированная полной дозой AS03, была значимо отличной от простой вакцины в отличие от трехвалентной расщепленной вакцины, адъювантированной полной дозой AS03, пониженная доза AS03 не увеличивала HI-титры для всех трех штаммов выше, чем простая вакцина. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуногенная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии масло в воде, где указанная эмульсия масло в воде содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,25-1,25% (об./об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объ- 28015817 ема композиции. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где токол представляет собой -токоферол. 3. Иммуногенная композиция по любому из пп.1 или 2, где эмульгатор представляет собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. 4. Иммуногенная композиция по п.3, где полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат выбран из группы,включающей Polysorbate 80 или Tween 80. 5. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-4, где антиген или антигенную композицию получают из вируса гриппа. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, доза которой, предназначенная для введения человеку, составляет 0,4-1,5 мл. 7. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 0,5 мл. 8. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 0,7 мл. 9. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 1,0 мл. 10. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 в качестве лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. 11. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. 12. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему, иммуногенной композиции по любому из пп.1-9.