Способ выявления допустимых для человека и животных доз трал­коксидима и его производных

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДОПУСТИМЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ ДОЗ ТРАЛКОКСИДИМА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных на основе воспроизведения in vitro липолитической составляющей акта пищеварения, и может быть использовано для предварительного тестирования токсичности новых биологически активных соединений, обладающих пестицидной активностью. В соответствии с изобретением описывается способ выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных на основе моделирования условий пищеварения, заключающийся в выявлении изменения активности панкреатической фосфолипазы A2,путем определения содержания метаболитов фосфолиполиза при участии метгемоглобина в кинетическом режиме с использованием разностной спектрофотометрии (D405-423), и включающий: а) подготовку первой контрольной пробы, содержащей эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина при соотношении фосфолипид/желчная кислота 1:2-3 в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере,подготовку второй контрольной пробы, содержащей фосфолипазу А 2 и эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; б) подготовку третьей опытной пробы, содержащей раствор исследуемого пестицида в подходящем растворителе, фосфолипазу А 2, эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и четвертой опытной пробы, содержащей указанный растворитель и, при необходимости. исследуемый пестицид,эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; в) последующий расчет изменения установленного в контроле уровня активности фермента известными приемами и определение пестицида как безопасного при условии изменения активности фермента в его присутствии в пределах не ниже 20% от контроля. В качестве исследуемого соединения может использоваться действующее вещество или препаративная форма пестицида. В качестве желчных кислот используют 3,12-ди- и 3,7,12 Литвинко Наталья Михайловна,Скоростецкая Лидия Адамовна,Герловский Денис Олегович (BY)(56) ЛИТВИНКО Н.М. и др. Влияние граминицида "грасп" на активность панкреатической фосфолипазы А 2. Известия Нац. академии наук Беларуси. Сер. хим. наук, 2007,3,с. 82-87, реферат, Найдено в Интернет: nasb.gov.byUA-U-26675 ПРОДАНЧУК Н.Г. и др. Принципы и пути оценки опасности комплексного и комбинированного действия пестицидов на организм человека. Современные проблемы токсикологии,2001, 2,с. 1-8,[Найдено в Интернет 06.07.2010], Найдено в Интернет URL:http://www.medved.kiev.ua/(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY)vitro фосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипидов пищи позволяет достоверно оценивать безопасность пестицида для организма животных и человека. Разработанный экспресс-метод имеет явные преимущества, поскольку не требует длительных испытаний на лабораторных животных и создает благоприятные условия для определения среди широкого ассортимента средств защиты растений безопасных для человека пестицидов новых поколений. 017271 Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных на основе воспроизведения in vitro липолитической составляющей акта пищеварения, и может быть использовано для предварительного тестирования токсичности новых биологически активных соединений, обладающих пестицидной активностью. Токсичность пестицидов изучают согласно Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [1]. Острое отравление моделируют методом однократного введения препарата в желудок экспериментальных животных при помощи иглы-зонда. В опытах используют различные концентрации раствора препарата в дистиллированной воде. Вводимые дозы рассчитывают по действующему ингредиенту, чтобы объемно они не превышали физиологической вместимости желудка [2]. Каждую дозу в острых опытах испытывают на 6-12 животных с последующим наблюдением в течение 14 суток с учетом характера симптомов интоксикации, количества погибших животных, срока их гибели. Количественные параметры острой токсичности препаратов определяют пробит-анализом по методу Литчфильда-Уилкоксона в изложении М.Б. Беленького [3] с уточнением характеристик потенциальной опасности смертельного отравления. Острое ингаляционное отравление пестицидами проводят путем динамической ингаляционной затравки крыс в камерах Н.Ф. Боярчука. Опыты предусматривают 4-часовую динамическую затравку в двух-трех концентрациях препаратов. Контрольные животные находятся в аналогичных условиях при подаче в камеру водно-воздушного аэрозоля. Аллергенную активность, оценку местно-раздражающих и кожно-резорбтивных свойств синтезированных препаративных форм пестицидов осуществляют в однократных и повторных опытах на белых крысах и кроликах в соответствии с действующей Инструкцией 1.1.11-12-35-2004 [1]. Изучение аллергизирующей способности продуктов проводят на модели воспроизведения сенсибилизации на белых мышах при внутрикожном введении в основание хвоста опытным животным изучаемого продукта в дозе по 100 мкг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1. В качестве растворителя использовали дистиллированную воду. Контрольным животным аналогично вводится дистиллированная вода и ПАФ. Выявление гиперчувствительности замедленного типа проводят на 6-е сутки опыта внутрикожным тестом опухания лапы до и через 24 ч после внутрикожного введения в апоневроз задней лапы разрешающей дозы препаратов (по 130 мкг на животное). Субхроническое отравление пестицидами воспроизводят в условиях 30-суточного введения препарата в желудок белых крыс в дозе, равной 1/10 ЛД 50. Для оценки функционального проявления кумулятивного действия препаратов в эксперименте регистрировали ряд показателей (физиологические, гематологические, биохимические, относительные коэффициенты массы тела) перед началом экспериментов и на 30-е сутки опыта. Таким образом, существующие методы определения биобезопасности пестицидов многоступенчаты и трудоемки, требуют больших временных затрат и большого количества экспериментальных животных(мышей, крыс, кроликов), а также специальных реактивов, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения уровня токсичности применяемых в растениеводстве современных средств защиты растений. Панкреатическая фосфолипаза A2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА 2) - фермент, который расщепляет фосфолипиды пищи, в норме находится в неактивном состоянии и активизируется только для участия в пищеварении. При патологии ФЛА 2 выделяется ацинарными клетками поджелудочной железы уже в активном состоянии. Активация выше нормы липолитических реакций с участием ФЛА 2 отражает степень патологического состояния организма человека при многих болезнях, в том числе остром некротическом панкреатите [4], поскольку является основным фактором, ответственным за повреждение клеточных мембран и способствующим проникновению в клетку панкреатических липаз, что сопровождается изменением структуры клеточной мембраны, увеличением агрегационной способности тромбоцитов с образованием микротромбов, изменением просвета кровеносных сосудов и их проницаемости, возрастанием внутриклеточной активности ионизированного кальция на фоне образования простагландиновых субстанций. За последние два десятилетия в 40 раз увеличилась частота развития острого панкреатита. В настоящее время среди хирургических заболеваний органов брюшной полости, требующих неотложной медицинской помощи, острый панкреатит по частоте встречаемости стоит на третьем месте после острого аппендицита и холецистита. Общая летальность при остром панкреатите достигает 21%, а при деструктивных формах - 80%. Среди выживших больных у 50-73% возникает утрата трудоспособности или выход на инвалидность на длительный период, поскольку наиболее часто заболевают люди активного трудоспособного возраста (20-60 лет). Установление на основе изменения активности ФЛА 2 возможных причин возникновения острого некротического панкреатита, который может развиться при попадании пестицидов в организм, следует отнести к приоритетным медико-социальным проблемам [4]. При пищеварении, в процессе которого под действием панкреатической ФЛА 2 гидролизуются фосфолипиды, происходит эмульгирование пищи желчными кислотами. Таким образом, мицеллообразование и липолитические реакции имеют определяющее физиологическое значение для функционирования живого организма и поэтому могут быть индикатором негативного воздействия пестицидов на организм человека и животных, т.е. определения их биобезопасности при попадании в организм.-1 017271 Описан способ выявления эффекторного действия тралкоксидима - действующего вещества пестицида "грасп" и его производных путем воздействия на активность панкреатической ФЛА 2, включающий разделение продуктов фосфолипазной реакции с использованием тонкослойной хроматографии с последующим количественным определением лизофосфатидилхолина, характеризующего активность фермента (прототип) [5]. Способ дал положительный результат, однако оказался применимым для определения безопасности ограниченного числа пестицидов в связи с низкой чувствительностью. Указанный способ позволяет определить 100 мкг пестицида. Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности способа выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных при расширении спектра исследуемых соединений. Поставленная задача решается способом выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных на основе моделирования условий пищеварения, заключающимся в выявлении изменения активности панкреатической фосфолипазы А 2, путем определения содержания метаболитов фосфолиполиза при участии метгемоглобина в кинетическом режиме с использованием разностной спектрофотометрии (D405-423) и включающим: а) подготовку первой контрольной пробы, содержащей эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина при соотношении фосфолипид/желчная кислота 1:2-3 в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2, и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, подготовку второй контрольной пробы, содержащей фосфолипазу A2 и эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; б) подготовку третьей опытной пробы, содержащей раствор исследуемого пестицида в подходящем растворителе, фосфолипазу A2, эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствииCaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и четвертой опытной пробы, содержащей указанный растворитель и, при необходимости исследуемый пестицид, эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; в) последующий расчет изменения установленного в контроле уровня активности фермента известными приемами и определение пестицида как безопасного при условии изменения активности фермента в его присутствии в пределах не ниже 20% от контроля. В качестве исследуемого соединения может использоваться действующее вещество или препаративная форма пестицида. В качестве желчных кислот используют 3,12-ди- и 3,7,12-тригидроксихолановые кислоты(дезоксихолевую и холевую кислоты соответственно). Неожиданно было установлено, что в процессе фосфолиполиза с участием ФЛА 2 в пробах, содержащих пестициды или их метаболиты (опытная проба), и в их отсутствие (контрольная проба) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты - превращение метгемоглобина в гемихром происходит дозозависимо, что регистрируется по изменению в разной степени амплитуды дифференциального спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются пропорциональным изменением разностного спектра, который позволяет по спектральному сдвигу в области полосы Соре метгемоглобина провести измерение активности ФЛА 2 как индикатора изменений при переваривании фосфолипидов пищи в присутствии исследуемого пестицида и без него. В процессе фосфолиполиза с участием ФЛА 2 в пробах, содержащих пестициды или их метаболиты(опытная реакция) и в их отсутствие (контрольная реакция) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты - происходит превращение метгемоглобина в гемихром, что регистрируется по изменению спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются пропорциональным изменением разностного спектра. Заявляемый способ позволяет выявить изменения активности панкреатической ФЛА 2 путем установления содержания метаболитов фосфолиполиза при участии метгемоглобина в кинетическом режиме без отбора отдельных проб с использованием разностной спектрофотометрии (D405-423) за счет моделирования условий пищеварения путем эмульгирования экзогенного субстрата в виде мицелл фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина желчными кислотами в буферном растворе с рН 8,0 в присутствии раствора CaCl2 в качестве кофактора и раствора метгемоглобина в качестве индикатора, с последующим внесением в реакционную смесь исследуемого пестицида и ФЛА 2 в опытную кювету, а пробы без пестицидов - в контрольную кювету с параллельной дифференциальной регистрирующей спектрофотометрией и последующим расчетом снижения установленного в контроле уровня активности определяемого фермента известными приемами. Заявляемый способ позволяет использовать 1-10 мкг пестицида для определения его безопасности.-2 017271 Таким образом, заявленный способ позволяет по спектральному сдвигу в области полосы Соре метгемоглобина провести измерение активности ФЛА 2 как индикатора изменений при переваривании фосфолипидов пищи в присутствии тестируемого пестицида и без него и обеспечивает достижение результата с высокой чувствительностью (более чем в 100 раз превышающей чувствительность способапрототипа) на небольшом количестве доступного сырья без использования лабораторных животных. На фиг. 1 представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина в присутствии и в отсутствие исследуемого пестицида. На фиг. 2 представлена кинетика ингибирующего действия исследуемого соединения на активность ФЛА 2. На фиг. 3 представлена зависимость "доза-эффект" соединений I и II на активность ФЛА 2. На фиг. 4 показаны пределы чувствительности заявляемого способа на основе зависимости "дозаэффект" для соединения VII. Приведенные ниже примеры подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1. Определение активности ФЛА 2 в присутствии 5-(2,4,6-триметилфенил)-2-(1-этоксииминопропил)циклогексан-1,3-диона (тралкоксидим, соединение I) - действующего вещества пестицида "Грасп". Для проведения реакции готовят следующие реактивы. 1. 0,05 М Трис-HCl-буфер, рН 8,0. 2. Раствор фосфатидилхолина яичного желтка (ФХ) или фосфатидилсерина (ФС) в хлороформе с исходной концентрацией 30-50 мкмоль/мл. 3. 2% водный раствор холата натрия или дезоксихолата. 4. Раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, исходная концентрация - 30-100 мкМ (по гему). Взвешивают лиофилизованный метгемоглобин, исходя из расчета, что 1 мг сухого порошка дает около 28 нмоль по гему. Добавляют буферный раствор до концентрации 0,5-1 мг/мл. Оставляют на 2-3 ч для набухания, после чего раствор хорошо перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для отделения нерастворившегося белка и апогемоглобина. Регистрируют спектр поглощения разведенного в 20-40 раз супернатанта на Спекорде uv-vis либо определяют А 406 на спектрофотометре. Рассчитывают содержание метгемоглобина (по гему) с учетом разведения и длины оптического пути, используя коэффициент молярной экстинкции метгемоглобина 162000 М-1 см-1. 5. 0,1 М раствор CaCl2. 6. Исследуемое соединение в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО). Далее готовят реакционную смесь. Для этого выпаривают исходный раствор ФХ (ФС) в виде тонкой пленки в количестве, эквивалентном 0,756 мкмоль. Оставляют на воздухе на 30-60 мин для удаления паров хлороформа. Солюбилизируют 50 мкл 2% холата натрия в течение нескольких часов или ночи до полной прозрачности. Добавляют 0,05 М Трис-HCl буферный раствор, рН 8,0, 63 мкл 0,1 М CaCl2 и в последнюю очередь рассчитанное количество раствора метгемоглобина. Конечный объем реакционной смеси - 6,3 мл. Разливают по 1 мл в кюветы спектрофотометра. В опытную кювету добавляют раствор соединения I, а в кювету сравнения - такое же количество растворителя (ДМСО). Было показано, что добавление данного пестицида не оказывает влияния на спектральные свойства метгемоглобина в интересующей области. Проводят преинкубацию при 20 С (37 С) в течение 5-20 мин, после чего начинают реакцию внесением от 1 до 4 мкг панкреатической ФЛА 2 свиньи с параллельной дифференциальной регистрирующей спектрофотометрией. Количество фермента выбирают таким образом, чтобы прирост продукта реакции (D/t) первые несколько минут был линейным. Параллельно проводят контрольную реакцию (без добавления пестицида) той же реакционной смеси с таким же количеством фосфолипазы А 2 на другой паре кювет. На фиг. 1 А представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина, регистрируемые через 2 мин после начала реакции в контрольных образцах (пунктир) и в пробах, содержащих 100 мкг (в условиях способа-прототипа) соединения I в 1 мл реакционной смеси (сплошная линия), при следующих условиях реакции: [ФХ]=0,12 мМ, [Hb]=5 мкМ, [Са 2+]=1 мМ, t=20C. Разностный спектр определяют спектрофотометрически ("Specord uv-vis", ГДР) в режиме пропускания (Т, 75-125%) в диапазоне длин волн 360-450 нм. Его характеризует положение максимума при =423 нм с соответствующей интенсивностью поглощения D1 и положение минимума при =405 нм с интенсивностью поглощения D2. Изменение амплитуды дифференциального спектра (D405-423=D1+D2) пропорционально концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2 (фиг. 1). Сравнение амплитуды разностных спектров метгемоглобина в процессе ферментативного гидролиза ФХ в отсутствие и в присутствии соединения I показывает снижение интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобина (D) в присутствии исследуемого соединения (во всех этих случаяхD405-423 в опытной пробе меньше D405-423 контрольной пробы), что свидетельствует об ингибировании ФЛА 2 в условиях реакции. Сравнивая ход кинетической кривой контрольной реакции (1, фиг. 2) и в присутствии соединения I (2, фиг. 2) определяют степень изменений в активности фермента под влиянием-3 017271 эффектора (пестицида). Пример 2. В условиях примера 1 проводят исследование 2-пропаноил-5-(2,4,6-триметилфенил)циклогексан 1,3-диона - предшественника в химическом синтезе тралкоксидима (соединение II). На фиг. 1 Б представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина, регистрируемые через 2 мин после начала реакции в контрольных образцах (пунктир) и в пробах, содержащих 100 мкг соединения II в 1 мл реакционной смеси (сплошная линия), при следующих условиях реакции: [ФХ]=0,12 мМ, [Hb]=5 мкМ,[Са 2+]=1 мМ, t=20C. Разностный спектр определяется спектрофотометрически ("Specord uv-vis", ГДР) в режиме пропускания (Т, 75-125%) в диапазоне длин волн 360-450 нм. Его характеризует положение максимума при =423 нм с соответствующей интенсивностью поглощения D1 и положение минимума при=405 нм с интенсивностью поглощения D2. Изменение амплитуды дифференциального спектра(D405-423=D1+D2) пропорционально концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2 (фиг. 1). Сравнение амплитуды разностных спектров метгемоглобина в процессе ферментативного гидролиза ФХ в отсутствие и в присутствии соединения II показывает снижение интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобина (D) в присутствии исследуемого соединения (во всех этих случаях D405-423 в опытной пробе меньше D405-423 контрольной пробы), что свидетельствует об ингибировании ФЛА 2 в условиях реакции. Пример 3. Установление зависимости "доза-эффект" при определении биобезопасности испытуемых пестицидов заявляемым способом. На фиг. 3 представлено ингибирующее действие соединений I и II на липолиз в зависимости от дозы. Ингибиторный эффект определяли как относительную активность (в % от контроля), выраженную в условных единицах - изменения интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобина в присутствии соединений I и II (D опытн/t) и без них (D контр/t). Представлены кинетические кривые, полученные для соединения I (фиг. 2) в дозе 100 мкг и без него (первичный график). Аналогичные графики служили для расчета ингибиторного эффекта в случае каждой дозы эффекторов от 1-1000 мкг при установлении зависимости "доза-эффект" (фиг. 3, вторичный график). Существенное подавление активности фермента под действием соединений I, II от 40 до 80%, как следует из кривых на фиг. 3, наблюдается при количестве исследуемых веществ от 200 мкг, что соответствует превышению допустимой дозы (ДСД 0,002 мг/кг массы тела человека [6]) в 2 раза и выше. Следовательно, пестицид может считаться биобезопасным при условии изменения активности ФЛА 2 в среднем на 20%. Пример 4. В условиях примера 1 и 3 исследованы соединенияVI - гидрохлорид 2-(1-аминопропилиден)-5-(2,4,6-триметилфенил)циклогексан-1,3-дион и подтверждено их эффекторное действие в тех же пределах. Пример 5. В условиях примера 1 и 3 исследован водный раствор соединения VII - N-фосфориметилглицина глифосат-действующее вещество пестицидов "Раундап" и "Шквал". В связи с тем что добавление данного пестицида оказывает влияние на спектральные свойства метгемоглобина в интересующей области, для уравновешивания исходных спектров соединение VII добавлялось в обе кюветы до внесения в опытную пробу ФЛА 2. На фиг. 4 показана зависимость "доза-эффект" для соединения VII, которая показывает высокую чувствительность заявляемого способа - возможность определять исследуемый пестицид в количестве менее 1 мкг с высокой точностью. Таким образом, на примере известных пестицидов установлено, что использование in vitro фосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипидов пищи позволяет достоверно оценивать безопасность пестицида для организма животных и человека. Разработанный экспресс-метод имеет явные преимущества, поскольку не требует длительных испытаний на лабораторных животных и создает благоприятные условия для определения среди широкого ассортимента средств защиты растений безопасных для человека пестицидов новых поколений.-4 017271 Источники информации, принятые во внимание. 1. Инструкция 1.1.11-12-35-2004. "Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ". 2. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. М.: Медицина, 1971. 3. Беленький М.Б. Количественные элементы фармакологического анализа. - Рига: Изд. АН Лат.1969. 4. Владимиров В.Г., Сергиенко В.И. Острый панкреатит. Экспериментально-клинические исследования, М., 1986. 5. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н., Герловский Д.О., Рубинов Д.Б., Желдакова Т.А. Влияние граминицидов на активность панкреатической фосфолипазы А 2//Весцi Нацыянальнай акадэмii навук Беларусi Сер. хiм. Навук, 2007, с. 82-87. 6. Белан С.Р., Грапов А.Ф., Мельникова Г.М. Новые пестициды: Справочник. М., 2001. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ выявления допустимых для человека и животных доз тралкоксидима и его производных на основе моделирования условий пищеварения путем воспроизведения in vitro липолитической составляющей акта пищеварения в присутствии исследуемых веществ, включающий выявление изменения активности панкреатической фосфолипазы А 2 в присутствии пестицида, отличающийся тем, что проводят: а) подготовку первой контрольной пробы, содержащей эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина при соотношении фосфолипид/желчная кислота 1:2-3 в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, подготовку второй контрольной пробы, содержащей фосфолипазу A2 и эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; б) подготовку третьей опытной пробы, содержащей раствор исследуемого пестицида в подходящем растворителе, фосфолипазу A2, эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствииCaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и четвертой опытной пробы, содержащей указанный растворитель и, при необходимости, исследуемый пестицид, эмульгированные желчными кислотами мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина в буферном растворе при рН 7,4-8,2 в присутствии CaCl2 и раствор метгемоглобина в трис-HCl-буфере, и регистрацию разностного спектра (D405-423) указанных проб; в) определяют продукты фосфолиполиза путем измерения спектра метгемоглобина в присутствии пестицида по сравнению с разностной спектрофотометрией спектра метгемоглобина в отсутствие пестицида с последующим расчетом изменений в опытной пробе установленного в контроле уровня активности фермента известными приемами и определяют пестицид как безопасный при условии изменения активности фермента в его присутствии в пределах не ниже 20% от контроля. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исследуемого пестицида используют действующее вещество или препаративную форму пестицида. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве желчных кислот используют 3,12-ди- или 3,7,12-тригидроксихолановые кислоты.