Способ выявления и диагностики злокачественного новообразования, включающий праймеры и зонды для специфичного выявления маркера mage-a3

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ПРАЙМЕРЫ И ЗОНДЫ ДЛЯ СПЕЦИФИЧНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРА MAGE-A3 Изобретение относится к праймерам и зондам, специфичным в отношении MAGE-A3, для применения в новых диагностических наборах и способах. Изобретение также относится к иммунотерапевтическому лечению определенных популяций пациентов со злокачественными новообразованиями, страдающих от MAGE-A3-экспрессирующих опухолей. Бер Габриэле Аннемари (DE), Кош Тьерри, Грузелль Оливье (BE),Салонга Деннис, Стивенс Крейг Лоуренс (US) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) 016347 Изобретение относится к диагностическому способу выявления MAGE-А 3. Изобретение также относится к иммунотерапевтическому лечению популяций пациентов, страдающих от MAGE-А 3 экспрессирующих опухолей, при котором пациенты, имеющие MAGE-А 3-экспрессирующую опухолевую ткань, идентифицированы с применением диагностического способа, описанного здесь. Предшествующий уровень техники Семейство генов MAGE (антигена меланомы) было изначально идентифицировано благодаря обнаружению в цитотоксических лимфоцитах, имеющих происхождение от лимфоцитов крови пациентов со злокачественными новообразованиями (Van der Bruggen et al 1991). В настоящее время семейство геновMAGE включает более 20 членов и состоит из генов MAGE А, В, С и D (Scanlan et al., (2002) ImmunolRev. 188:22-32; Chomez et al., (2001) Cancer Res. 61(14):5544-51). Они сгруппированы на X-хромосомеUSA 92:4987-4991; Pold et al, 1999 Genomics 59:161-167; Rogner et al 1995 Genomics 29:725-731), и их функция до сих пор не установлена (Ohman et al. 2001 Exp Cell Res. 265(2): 185-94). Гены MAGE высоко гомологичны, и, в особенности, члены семейства MAGE-A обладают 60-98% гомологией. Гены MAGE не экспрессированы во всех нормальных клетках, за исключением экспрессии в сперматогониях и плаценте (Haas et al. 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi et al. 1995 Cancer Res 55:3478382). Реактивация экспрессии генов MAGE при злокачественном новообразовании обусловлена аномальным деметилированием промотора (De Smeet et al. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93(14):7149-53; De Smeetet al. 1999 Mol Cell Biol. 19(11):7327-35). 12 генов MAGE-A аберрантно сверхэкспрессированы при следующих злокачественных новообразованиях: переходноклеточном раке, раке пищевода, меланоме, раке мочевого пузыря и немелкоклеточном раке легкого (NSCLC) (Scanlan et al. 2002 Immunol Rev. 188:22-32). Сверхэкспрессия и специфичность экспрессии MAGE в тканях злокачественных новообразований привели к тому, что белок MAGE-А 3 используют в качестве антигена для вакцин от злокачественных новообразований (Scanlan et al. 2002 Immunol Rev. 188:22-32). Тем не менее, ввиду широкого диапазона экспрессии, обнаруживаемой у пациентов со злокачественными новообразованиями, следует точно оценивать уровень экспрессии MAGE-А 3 у каждого пациента для того, чтобы направлять вакцинацию на пациентов, экспрессирующих белок. MAGE-А 3 часто взаимозаменяемо называют MAGE-3; здесь использованы оба названия. Меланома У пациентов со злокачественной меланомой с отдаленными метастазами (IV стадия в соответствии с классификацией Американского объединенного комитета по злокачественным новообразованиям(American Joint Committee on Cancer (AJCC среднее время выживания составляет один год, а показатель длительного выживания лишь 5%. Даже при стандартной химиотерапии для IV стадии меланомы уровни терапевтического ответа составляют лишь 8-25%, но без эффекта на общую выживаемость. У пациентов с регионарными метастазами (III стадия) среднее время выживания составляет от двух до трех лет с очень малой вероятностью длительного выживания, даже после адекватного хирургического лечения первичной опухоли и регионарных метастазов (Balch et al, 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). У большинства пациентов с I-III стадией меланомы опухоль удаляют хирургически, но у этих пациентов сохраняется существенный риск рецидива. Таким образом, сохраняется потребность в предотвращении прогрессирования меланомы и потребность в улучшенных схемах лечения метастатической меланомы и способах адъювантной терапии для пациентов, у которых была удалена первичная опухоль. Рак легкого Существует два типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и мелкоклеточный рак легкого (SCLC). Названия просто описывают тип клеток, обнаруживаемых в опухолях. NSCLC включает плоскоклеточный рак, аденокарциному и крупноклеточный рак и составляет приблизительно 80% раков легкого. NSCLC труден в лечении, и доступные способы лечения направлены, согласно тенденции, на продление жизни настолько, на сколько возможно, и на облегчение симптомов заболевания. NSCLC является наиболее распространенным типом рака легкого и связан с неблагоприятными исходами. Из всех пациентов с NSCLC приблизительно 25% имеют локальнорегионарное заболевание, на момент постановки диагноза еще поддающееся хирургическому удалению (стадии IB, IIA и IIB в соответствии с классификацией AJCC). Тем не менее, у более чем 50% этих пациентов в течение двух лет после полного хирургического удаления разовьется рецидив. Таким образом, существует потребность в обеспечении лучшего лечения для этих пациентов. Экспрессия MAGE-A3 Ранее несколько способов были направлены на измерение экспрессии генов MAGE-A3 как в клеточных линиях, так и в образцах опухолей. Применяли полуколичественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR) (De Plaen et al. 1994 Immunogenetics 40(5):360-9), другие основанные на полимеразной цепной реакции (PCR) методики и также микропанели низкой плотности(Zammatteo et al. 2002 Clinical Chemistry 48(1) 25-34). Тем не менее, во многих из этих исследований основной проблемой была очень высокая гомология между членами семейства MAGE, приводящая к лож-1 016347 ноположительным результатам. Для крупных исследований II и III фазы желательно количественное исследование с высокой производительностью, позволяющее специфично идентифицировать MAGE-А 3 экспрессирующие образцы и снижающее вероятность возникновения ложноположительных результатов. Другое затруднение возникает при использовании зафиксированной в формалине заключенной в парафин (FFPE) опухолевой ткани, что является обычным способом фиксации опухолевой ткани в клинических центрах. Фиксация в формалине изменяет структуру молекул РНК в ткани, вызывая образование перекрестных сшивок и также частичную деградацию. Частичная деградация приводит к появлению меньших фрагментов РНК, протяженностью 100-300 пар оснований. Эти структурные изменения РНК затрудняют использование РНК, выделенной из FFPE-ткани, в обычных диагностических методиках. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 - специфичность MAGE-А 3 RT-PCR TaqMan праймеров среди членов семейства MAGE-A; фиг. 2 - специфичность зонда TaqMan RT-PCR, связывающего малую бороздку, (MGB-зонда) в отношении экспрессии MAGE-A3; фиг. 3 - специфичность тестирования праймеров MAGE-А 3 в присутствии плазмид MAGE-А 3 иMAGE-6; фиг. 4 - опухолевая экспрессия MAGE-А 3, как измерено количественной TaqMan PCR (TaqMan полимеразной цепной реакцией); фиг. 5 - тест на экспрессию MAGE-A3; фиг. 6 а - специфичность MAGE-А 3 праймеров, разработанных для использования с FFPE-тканью; фиг. 6 б - тестирование линейности праймеров с использованием дифференциальных количеств РНК; фиг. 7 - сравнение исследования с использованием RNAIater и замораживания и PCR с использованием FFPE-ткан; фиг. 8 - относительное сравнение MAGE-А 3 исследования с использованием RNAIater и замораживания и MAGE-А 3 исследования на основе FFPE; фиг. 9 - нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, содержащий фрагмент липопротеина D, фрагмент Mage3 и гистидиновый хвост, и соответствующая ей аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:35 и 36); фиг. 10 - слитый белок NS1-MAGE3 и гистидиновый хвост (SEQ ID NO:37); фиг. 11 - ДНК, кодирующая слитый белок NS1-MAGE3-His (SEQ ID NO:38); фиг. 12 - слитый белок CLYTA-MAGE3-гистидин (SEQ ID NO:39); фиг. 13 - ДНК, кодирующая слитый белок CLYTA-MAGE3-His (SEQ ID NO:40); фиг. 14 - выравнивание последовательностей семейства генов MAGE-A для разработки RT-PCR праймеров и зондов для MAGE-A3; фиг. 15 - выравнивание последовательностей MAGE-А 3 и MAGE-A6 для идентификации областей,содержащих целевые последовательности (заключнный в рамку шрифт); фиг. 16 - классы полуколичественной MAGE-А 3 RT-PCR: пример того, как пять классов могут быть присвоены полуколичественному MAGE-А 3 RT-PCR исследованию; фиг. 17 - графическое сравнение значений Ct от плазмид MAGE-A с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК; фиг. 18 - графическое сравнение значений разности Ct относительно MAGE-A3 для других плазмидMAGE-A с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК; фиг. 19 - линейность FFPE Xenograft GERL РНК - 2-кратные серийные разведения от 100-0,1 нг внесенной РНК. На фиг. 20 показан график зависимости значения разности Ct между MAGE-А 3 и -актина от логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК. Описание таблиц и последовательностей Табл. 1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для полуколичественной MAGE RT-PCR. Табл. 2. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для TaqMan количественной RT-PCR. Табл. 3. Сравнение MAGE-А 3 полуколичественной ПЦР и количественной TaqMan PCR. Табл. 4. Сравнение значений Ct и разности Ct с использованием ПЦР-смеси 1 и ПЦР-смеси 2. Табл. 5. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для MGB TaqMan количественной RT-PCR с использованием замороженной ткани. Табл. 6. Классы полуколичественной MAGE-А 3 RT-PCR: пример того, как пять классов могут быть присвоены полуколичественному MAGE-А 3 RT-PCR исследованию (относится к фиг. 16). Табл. 7. Последовательности COBAS TaqMan MAGE-А 3 праймеров и зондов. Табл. 8. Последовательности COBAS TaqMan праймеров и зондов для бета-актина. Табл. 9. Действительный диапазон СТ для образцов и контролей COBAS TaqMan. Табл. 10. COBAS TaqMan температурный профиль циклов -температурный профиль ПЦР для эксперимента исключительности MAGE-A3. Табл. 11. Температурный профиль RT-PCR для экспериментов линейности и эффективности RT-2 016347PCR, расчетной чувствительности (предела выявления), корреляции способов и воспроизвоимости. Табл. 12. Значения Ct от MAGE-A плазмид с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК. Табл. 13. Значения разности Ct относительно MAGE-А 3 для других MAGE-A плазмид с использованием 20, 2, 0,2, 0,02 пг ДНК. Табл. 14. Проверка достоверности эксперимента исключительности MAGE-A3. Табл. 15 и 16. Подробности эксперимента исключительности MAGE-A3. Табл. 17. Линейность Ct и разности Ct MAGE-А 3 и -актина от 10 репликатов на 11 уровнях. Табл. 18. Эффективность RT-PCR-амплификации MAGE-А 3 и -актина. Табл. 19. Проверка достоверности эксперимента линейности/эффективности RT-PCR. Табл. 20, 21 и 22. Подробности эксперимента линейности/эффективности RT-PCR. Табл. 23. Число положительных результатов по Ct MAGE-А 3, N = 24 для каждого условия. Табл. 24. Процент положительных результатов по Ct MAGE-А 3, N = 24 для каждого условия. Табл. 25. Число положительных результатов по Ct -актина, N = 24 для каждого условия. Табл. 26. Процент положительных результатов по Ct -актина, N = 24 для каждого условия. Табл. 27. Значения Ct для FAM контролей гена MAGE. Табл. 28. Значения Ct для HEX контролей -актина. Табл. 29, 30 и 31. Подробности эксперимента предела выявления. Табл. 32. Краткое изложение образцов при перекрестной проверке достоверности. Табл. 33. Число положительных и отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте COBAS и прототипном тесте. Табл. 34. Число положительных и отрицательных результатов в тесте COBAS и прототипном тесте согласно проценту совпадения с исследованием сравнения, с тестом замороженных образцов, для принятия решения по дискордантным результатам. Табл. 35. Значения Ct экспериментальных контролей гена MAGE. Табл. 36. Значения Ct экспериментальных контролей гена -актина. Табл. 37, 38 и 39. Подробности эксперимента корреляции способов/перекрестной проверки достоверности. Табл. 40. Опыт 1 - пороговая экспрессия MAGE-А 3 от GERL РНК контролей. Табл. 41. Опыт 1 - сигнал экспрессии MAGE-А 3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости. Табл. 42. Опыт 2 - пороговая экспрессия MAGE-А 3 от GERL РНК контролей. Табл. 43. Опыт 2 - сигнал экспрессии MAGE-А 3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости. Табл. 44. Проверка достоверности воспроизводимости. Табл. 45, 46 и 47. Подробности эксперимента воспроизводимости.SEQ ID NO:1 - MAGE3-E2F (праймер для полуколичественного исследования MAGE3) (табл. 1).SEQ ID NO:2 - MAGE3-E3R (праймер для полуколичественного исследования MAGE3) (табл. 1).SEQ ID NO:4 - Е 3 MAGE3 TMR (обратный праймер для 3 экзона MAGE-А 3; этот праймер представляет собой обратный комплемент последовательности того экзона MAGE-А 3, который он распознает) (табл. 2).SEQ ID NO:6 - I3 MAGE3 TMR (обратный праймер для 3 интрона MAGE-А 3; этот праймер представляет собой обратный комплемент последовательности того интрона MAGE-А 3, который он распознает) (табл. 2).SEQ ID NO:8 - MAGEA3-849R (обратный праймер для MAGE-А 3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности MAGE-А 3, которую он распознает) (табл. 5).SEQ ID NO:10 - MAGEA3e-1037R (обратный праймер для MAGE-А 3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности MAGE-А 3, которую он распознает) (табл. 5).SEQ ID NO:12 - MAGEA3f-697R (обратный праймер для MAGE-А 3; этот праймер представляет собой обратный комплемент той последовательности MAGE-A3, которую он распознает) (табл. 5).SEQ ID NO:35 - нуклеотидная последовательность слитого белка фрагмент липопротеина Dфрангмент МАСЕ 3-гистидиновый хвост (фиг. 9).SEQ ID NO:37 - аминокислотная последовательность слитого белка NS1-MAGE3-гистидиновый хвост (фиг. 10).SEQ ID NO:39 - аминокислотная последовательность слитого белка CLYTA-MAGE3-гистидин (фиг. 12).SEQ ID NO:40 - нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок CLYTA-MAGE3 гистидин (фиг. 13).SEQ ID NO:57 - последовательность зонда HW RGIBACT H для -актина (табл. 8). Краткое изложение сущности изобретения Авторы настоящего изобретения разработали исследование для идентификации пациентов, имеющих MAGE-А 3-экспрессирующую опухолевую ткань, которые могут, таким образом, извлечь пользу изMAGE-А 3-специфичной иммунотерапии. В одном воплощении настоящего изобретения предложен праймер, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:3-12. В другом воплощении предложен набор праймеров, содержащий одну или более из следующих пар праймеров: а) SEQ ID NO:3 и 4; б) SEQ ID NO:5 и 6; в) SEQ ID NO:7 и 8; г) SEQ ID NO:9 и 10; и д) SEQ ID NO:11 и 12. В другом аспекте настоящего изобретения предложен зонд, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:13-17, 53 или 54. В другом воплощении предложен набор, содержащий:(3) зонд,где компоненты (1), (2) и (3) способны к гибридизации с целевой последовательностью MAGE-А 3 в строгих условиях, и где по меньшей мере одна из целевых последовательностей для (1), (2) или (3) отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью всех других нуклеотидных последовательностей MAGE А, и где набор может быть применен для различения MAGE-А 3 и MAGE-A6. Дополнительно предложен набор, содержащий:-4 016347 строгих условиях, и где по меньшей мере одна из целевых последовательностей для (1), (2) или (3) отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью нуклеотидной последовательности MAGE-A6, и где набор может быть применен для различения MAGE-А 3 и MAGE-A6. В одном воплощении набор по настоящему изобретению может содержать следующие компоненты:(1) по меньшей мере один праймер или набор праймеров, как описано здесь; и (3) по меньшей мере один зонд, как описано здесь. В одном примере компонент (1) содержит SEQ ID NO:3 и 4; и компонент (2) содержит SEQ ID NO:13; альтернативно, компонент (1) содержит SEQ ID NO:5 и 6; и компонент (2) содержит SEQ ID NO:14; или компонент (1) содержит SEQ ID NO:7 и 8; и компонент (2) содержит SEQ IDNO:15; или компонент (1) содержит SEQ ID NO:9 и 10; и компонент (2) содержит SEQ ID NO:16; или компонент (1) содержит SEQ ID NO:11 и 12; и компонент (2) содержит SEQ ID NO:17; или компонент (1) содержит SEQ ID NO:11 и 12; и компонент (2) содержит SEQ ID NO:53 или SEQ ID NO:54. В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ определения присутствия или отсутствия MAGE-А 3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером, как описано здесь, набором праймеров, как описано здесь, зондом, как описано здесь, или набором, как описано здесь. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ определения присутствия или отсутствия MAGE-А 3-положительной опухолевой ткани посредством исследования биологического образца с использованием праймера, зонда или набора праймеров, как описано здесь. В другом аспекте предложен способ диагностирования пациента, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером, как описано здесь, набором праймеров,как описано здесь, зондом, как описано здесь, или набором, как описано здесь, и оценки того, экспрессирован ли MAGE-А 3 в образце. Способ может дополнительно включать стадию амплификации нуклеотидной последовательности и выявления в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности. В еще одном аспекте предложен способ определения присутствия или отсутствия MAGE-А 3 положительной опухолевой ткани, включающий приведение в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером или зондом, как описано здесь. Способ может дополнительно включать стадию определения того, гибридизуется ли выделенная нуклеотидная последовательность по меньшей мере с одним праймером или зондом в строгих условиях, выявляя таким образом, является ли опухолевая тканьMAGE-А 3-положительной. В одном воплощении способ может дополнительно включать стадию применения гибридизации in situ для выявления того, гибридизуется ли выделенная нуклеотидная последовательность по меньшей мере с одним праймером или зондом. Способы, как описано здесь, могут быть применены на биологическом образце, представляющем собой замороженную ткань; альтернативно или дополнительно, способы, описанные здесь, могут быть осуществлены на биологическом образце, представляющем собой ткань, зафиксированную в парафине,например, зафиксированную в формалине заключенную в парафин (FFPE) ткань. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения пациента, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента MAGE-А 3, с применением способа, как описано здесь, и затем введение пациенту композиции, содержащей MAGE-А 3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, как описано здесь. В другом воплощении предложен способ лечения пациента, предрасположенного к рецидивуMAGE-А 3-экспрессирующей опухоли, прошедшего лечение для удаления/излечения MAGE-А 3 экспрессирующей опухолевой ткани, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента MAGE-A3, с применением способа, как описано здесь, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей MAGE-А 3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, как описано здесь. В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащейMAGE-A3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от MAGE-A3-экспрессирующей опухоли, где у пациента установлено наличие MAGE-A3-экспрессирующей опухолевой ткани с применением способа, как описано здесь. В еще одном воплощении предложено применение композиции, содержащей MAGE-A3 иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, предрасположенного к рецидиву MAGE-A3-экспрессирующей опухоли, где у пациента установлено наличие MAGE-A3-экспрессирующей опухолевой ткани с применением способа, как описано здесь. В одном воплощении предложен способ лечения или применение, как описано здесь, где композиция, содержащая MAGE-A3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, содержит антигенMAGE-A3 или его пептид. В одном воплощении антиген MAGE-A3 или его пептид содержит или состо-5 016347 ит из пептида EVDPIGHLY. Антиген или пептид MAGE-A3 для применения в настоящем изобретении может быть слит или конъюгирован с белком-носителем. В одном воплощении белок-носитель может быть выбран из белка D,NS1 или CLytA, или их фрагментов. В одном воплощении настоящего изобретения композиция, содержащая MAGE-A3-иммунотерапию или иммунотерапевтическое средство, может дополнительно содержать адъювант. Например, адъювант может содержать одну или более комбинации из: 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида A (3DMPL); солей алюминия; CpG-содержащих олигонуклеотидов; сапонин-содержащих адъювантов, таких как QS21 или иммуностимулирующие комплексы (ISCOM); эмульсий типа "масло в воде"; и липосом. В одном воплощении адъювант может содержать 3D-MPL, CpG-содержащие олигонуклеотиды и QS21. Подробное описание изобретения При использовании здесь термин "целевая последовательность" представляет собой область последовательности нуклеиновой кислоты MAGE-А 3 (или ДНК, или РНК, например, геномной ДНК, информационной РНК, или их амплифицированных форм), которой частично (то есть, с некоторой степенью несоответствия) или полностью идентична последовательность зонда или праймера; хотя обратный праймер является обратным комплементом (или, как указано выше, имеет некоторую степень несоответствия) распознаваемой им последовательности. Целевая последовательность в большинстве случаев относится к области последовательности MAGE-A3, отличающейся по меньшей мере одним нуклеотидом при сравнении с другой или со всеми другими нуклеотидными последовательностями MAGE-A. Тем не менее, в некоторых воплощениях настоящего изобретения целевая последовательность может, для одного или нескольких праймеров и зонда, быть идентичной у нуклеотидных последовательностей MAGE-A,при условии, что по меньшей мере один или два используемых праймера и зонд распознают целевую последовательность, отличающуюся у дифференцируемых генов. Таким образом, в одном воплощении определенный праймер или зонд может связывать целевую последовательность MAGE-A3 без несоответствий и связывать эквивалентную область другой последовательности MAGE-A, например, последовательности MAGE-A6, с несоответствиями одной или более пар оснований. Целевая последовательность для праймеров или зонда по настоящему изобретению может представлять собой последовательность, обладающую большинством различий (несоответствий) между двумя генами, чтобы сделать возможным выявление MAGE-A3 с очень высокой специфичностью. В одном воплощении настоящего изобретения целевые последовательности расположены в областях, обозначенных текстом в рамке на фиг. 15. Подходяще, праймер или зонд может быть по меньшей мере на 95% идентичен целевой последовательности на всем протяжении длины праймера или зонда, подходяще, более чем на 95% идентичен, как например на 96, 97, 98, 99%, и наиболее предпочтительно обладает 100% идентичностью целевой последовательности MAGE-A3 на протяжении всей своей длины. Праймеры или зонды по изобретению могут быть идентичны целевой последовательности во всех нуклеотидных положениях праймера или зонда или могут обладать 1, 2 или более несоответствиями в зависимости, например, от длины зонда, температуры,условий реакции и условий исследования. Конечно, при условии, что обратный праймер удовлетворяет этим условиям в отношении области, представляющей собой обратный комплемент последовательности праймера. Подходяще, каждый нуклеотид праймера или зонда может образовывать водородную связь с эквивалентным ему целевым нуклеотидом. Предпочтительно, комплементарность праймера или зонда целевой последовательности оценивают по степени спаривания оснований А:Т и G:C так, что адениновый (А) нуклеотид образует пару с тимином (Т), и так, что гуаниновый (G) нуклеотид образует пару с цитозином (С), или наоборот. В форме РНК Т может быть заменен на U (урацил). Там, где в универсальных зондах используют, например, инозин, комплементарность также может быть оценена по степени взаимодействий инозин (зонда) - целевой нуклеотид. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен праймер, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:1-12, как показано в табл. 1 и 2. Термин "праймер" использован здесь для обозначения любой одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, которая может быть использована в качестве праймера, например, в методике ПЦР. Таким образом, "праймер" по изобретению относится к одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, способной действовать в качестве точки инициации для синтеза продукта удлинения праймера, по существу идентичного (для прямого праймера) или по существу представляющего собой обратный комплемент (для обратного праймера) копируемой цепи нуклеиновой кислоты. Конструкция (длина и конкретная последовательность) праймера будут зависеть от природы ДНК и/или РНК мишеней и от условий, в которых используют праймер (таких как температура и ионная сила). Праймеры могут состоять из нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1-12,или могут представлять собой 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или более пар оснований, включающих или находящихся в пределах последовательностей SEQ ID NO:1-12, при условии, что они явля-6 016347 ются подходящими для специфичного связывания целевой последовательности в пределах нуклеотидной последовательности MAGE-A3 в строгих условиях. Если необходимо, для поддержания специфичности и чувствительности, необходимых в данных обстоятельствах, могут быть произведены незначительные модификации праймеров или зондов в отношении длины или последовательности. Зонды и/или праймеры, перечисленные здесь, могут быть увеличены или уменьшены по длине, например, на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов в любом направлении. При использовании здесь термин "строгие условия" обозначает любые условия гибридизации, позволяющие праймерам специфично связываться с нуклеотидной последовательностью в пределах нуклеотидной последовательности MAGE-A3, но не с какими-либо другими нуклеотидными последовательностями MAGE. "Специфичное связывание" или "специфичная гибридизация" зонда с областью нуклеотидной последовательности MAGE-A3 обозначает то, что праймер или зонд образует дуплекс (двухцепочечную нуклеотидную последовательность) с частью этой области или со всей областью в используемых экспериментальных условиях и что в этих условиях праймер или зонд не образует дуплекс с другими областями нуклеотидной последовательности, присутствующей в анализируемом образце. Следует понимать, что праймеры и зонды по настоящему изобретению, разработанные для специфичной гибридизации в области нуклеотидной последовательности MAGE-A3, могут полностью находиться в пределах указанной области или могут в значительной степени перекрываться с указанной областью (то есть образовывать дуплекс с нуклеотидами как за пределами, так и в пределах указанной области). Подходяще, специфичная гибридизация зонда и целевой области нуклеиновой кислоты происходит в "строгих" условиях гибридизации, таких как трехкратный (3 Х) раствор цитрата и хлорида натрия(SSC), 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) при 50 С. Специалисту в данной области техники известно,как изменить параметры температуры, длины зонда и концентрации солей, таким образом, чтобы сделать возможным выполнение специфичной гибридизации. Условия гибридизации и отмывания хорошо известны и проиллюстрированы, например, в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), в частности, в его 11 главе. Согласно настоящему изобретению также предложен набор праймеров, включающий одну или более из следующих пар праймеров. Согласно настоящему изобретению также предложен зонд, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:13-17, 53 или 54. Термин "зонд" использован здесь для обозначения любой одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности, которая может связывать нуклеиновую кислоту и может быть использована в качестве зонда, например, в методике ПЦР. Зонды могут состоять из нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:13-17, 53 или 54, или могут представлять собой 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 75, 100 или более пар оснований, включающих или находящихся в пределах последовательностей SEQ ID NO:13-17, 53 или 54, при условии, что они являются подходящими для специфичного связывания целевой последовательности в пределах нуклеотидной последовательности MAGE-A3. В одном воплощении изобретения, в котором зонд следует применять в способе в комбинации с парой праймеров, пара праймеров должна делать возможной амплификацию части или всего полинуклеотидного фрагмента MAGE-A3, который могут связывать зонды или с которым зонды иммобилизуют на твердой подложке. Праймер и/или зонд может дополнительно содержать маркер, позволяющий выявлять зонд. Примеры маркеров, которые могут быть использованы, включают: флуоресцентные маркеры, например, 6-карбоксифлуоресцеин (6FAM), NED (Applera Corporation), HEX или VIC (Applied Biosystems); маркеры TAMRA (Applied Biosystems, CA, USA); хемилюминесцентные маркеры, например зонды с рутением; и радиоактивные метки, например тритий в форме меченного тритием тимидина. 32 Фосфор также может быть использован в качестве радиоактивной метки. В одном воплощении настоящего изобретения зонд может содержать флуоресцентный репортерный краситель на своем 5'-конце и гасящий краситель на своем 3'-конце. Флуоресцентный репортерный краситель может содержать 6-карбоксифлуоресцеин (6FAM), и гасящий краситель может содержать нефлуоресцентный гаситель (NFQ). Возможно, к зонду, например к 3'-концу зонда, может быть присоединен белок, связывающий малую бороздку, (Minor Groove Binder protein (MGB; Applied Biosystems, CA,USA. В одном воплощении может быть использован зонд MGB Eclipse Probe (Epoch Biosciences, WA,USA). Зонды MGB Eclipse снабжены гасителем Eclipse Dark Quencher и группировкой MGB, рас-7 016347 положенной на 5'-конце зонда. Флуоресцентный репортерный краситель расположен на 3'-конце зонда. В одном воплощении последовательности праймера и зонда по настоящему изобретению могут включать или содержать встречающиеся в природе нуклеотидные структуры или основания, например,аденин (А), цитозин (С), гуанин (G), тимин (Т) и урацил (U). В другом воплощении в последовательность зонда могут быть включены синтетические или модифицированные аналоги нуклеотидных структур или оснований. Под синтетической или модифицированной подразумевают не встречающуюся в природе нуклеотидную структуру или основание. Такие синтетические или модифицированные основания могут замещать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все основания последовательности зонда. В одном воплощении цитозин может быть заменен на 5-метил dC и тимин может быть заменен на 5-пропинил dU. В последовательность может также быть включен гаситель BHQ2Quencher. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен набор, содержащий следующие компоненты: (1) по меньшей мере один праймер или набор праймеров, как описано здесь; и (2) по меньшей мере один зонд, как описано здесь. В одном воплощении набор содержит один прямой праймер, один обратный праймер и последовательность зонда, целевая последовательность которой расположена в области, амплифицируемой прямым и обратным праймерами. В этом воплощении набор праймеров способен амплифицировать часть (ампликон) последовательности MAGE-A3, и зонд способен гибридизоваться в строгих условиях с ампликоном. Последовательности MAGE-A3 и MAGE-A6 высоко гомологичны и обладают 98% выравниванием их нуклеотидных и 95% выравниванием их белковых последовательностей. С целью специфичного распознавания последовательностей MAGE-A3 необходимо установить праймеры и зонды, способные различать MAGE-A3 и MAGE-A6. В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор праймеров и/или зондов,специфично гибридизующихся с целевой последовательностью MAGE-A3 в строгих условиях, где по меньшей мере одна из целевых последовательностей праймера или зонда отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью всех других нуклеотидных последовательностей MAGE А и где набор позволяет различать MAGE-A3 и MAGE-A6. В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор праймеров и/или зондов,специфично гибридизующихся с целевой последовательностью MAGE-A3 в строгих условиях, где по меньшей мере одна из целевых последовательностей праймера или зонда отличается по меньшей мере одним нуклеотидом по сравнению с эквивалентной областью нуклеотидной последовательности MAGEA6, и где набор позволяет различать MAGE-A3 и MAGE-A6. В одном воплощении целевая последовательность по меньшей мере одного праймера или зонда может отличаться одним нуклеотидом в целевой последовательности MAGE-A3 по сравнению с эквивалентной областью MAGE-А 6. В другом воплощении целевая последовательность по меньшей мере одного праймера или зонда может отличаться двумя нуклеотидами по сравнению с эквивалентной областьюMAGE-A6. В одном воплощении набор, содержащий два праймера и один зонд, может иметь следующие отличия в целевых последовательностях праймера и зонда:(1) целевая последовательность одного из двух праймеров или зонда отличается у MAGE-A3 и(2) целевая последовательность праймеров или зонда, не названных в части (1), отличается у(3) целевая последовательность оставшегося праймера или зонда идентична как для MAGE-A3, так и для MAGE-A6. Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:(1) целевая последовательность праймера А отличается у MAGE-A3 и MAGE-A6 на один нуклеотид;(2) целевая последовательность праймера Б отличается у MAGE-A3 и MAGE-A6 на два нуклеотида; и(3) целевая последовательность зонда В идентична как для MAGE-A3, так и для MAGE-A6. Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:(1) целевая последовательность праймера А отличается у MAGE-A3 и MAGE-A6 на два нуклеотида;(2) целевая последовательность праймера Б идентична как у MAGE-A3, так и у MAGE-A6; и(3) целевая последовательность зонда В отличается у MAGE-A3 и MAGE-А 6 на один нуклеотид. Например, в одном воплощении набор, содержащий праймер А, праймер Б и зонд В, может включать следующие различия в целевых последовательностях:(1) целевая последовательность праймера А идентична как у MAGE-A3, так и у MAGE-A6;(2) целевая последовательность праймера Б отличается у MAGE-A3 и MAGE-A6 на один нуклео-8 016347 тид; и(3) целевая последовательность зонда В отличается у MAGE-A3 и MAGE-А 6 на два нуклеотида. В одном воплощении набор может содержать: пару праймеров с последовательностями SEQ IDNO:3 и 4, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью SEQ ID NO:13, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO:5 и 6, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью SEQ ID NO:14, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO:7 и 8, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью SEQ ID NO:15, или содержащий эту последовательность; пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO:9 и 10, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью SEQ ID NO:16, или содержащий эту последовательность; и/или пару праймеров с последовательностями SEQ ID NO:11 и 12, или содержащих эти последовательности, и зонд с последовательностью SEQ ID NO:17, или содержащий эту последовательность. В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ определения присутствия или отсутствия MAGE-A3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию контакта нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, по меньшей мере с одним праймером или по меньшей мере одним набором праймеров, или зондом, как описано здесь. Под MAGE-A3-положительной опухолевой тканью подразумевают любые опухоли или опухолевые клетки, экспрессирующие антиген MAGE-A3, которые были выделены от пациента. Способ, как описано здесь, может быть использован для определения того, содержит ли или состоит ли биологический образец из MAGE-A3-положительной опухолевой ткани. Под биологическим образцом подразумевают образец ткани или клеток от пациента, который был удален или выделен от пациента. Дополнительно предложен способ диагностирования пациента, включающий стадию контакта нуклеотидной последовательности, полученной или имеющей происхождение из биологического образца, с по меньшей мере одним праймером или по меньшей мере одним набором праймеров, или зондом, как описано здесь, и оценки того, экспрессирован ли MAGE-A3 в образце. В одном воплощении нуклеотидную последовательность выделяют или она была выделена из биологического образца. При использовании здесь, подразумевают, что термин "полученный или имеющий происхождение из/от" используют включительно. Таким образом, подразумевают, что он включает любую нуклеотидную последовательность, непосредственно выделенную из опухолевого образца, или любую нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение из образца, например с применением обратной транскрипции для образования информационной РНК (иРНК) или комплементарной ДНК (кДНК). Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать амплификацию нуклеотидной последовательности и выявление в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности. Альтернативно или дополнительно, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать приведение в контакт выделенной или амплифицированной нуклеотидной последовательности с одним или более зондами, как описано здесь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность выделена или очищена из образца опухоли. При RT-PCR контаминация геномной ДНК может привести к ложноположительным результатам. В одном воплощении геномную ДНК удаляют или в значительной степени удаляют из тестируемого образца или образца, включенного в способы по настоящему изобретению. Способы по настоящему изобретению являются подходящими для выявления MAGE-A3 положительной опухолевой ткани. В одном воплощении настоящего изобретения MAGE-A3 положительная ткань может быть выявлена с применением гибридизации in situ. Под гибридизацией insitu подразумевают реакцию гибридизации, проводимую с использованием праймера или зонда по настоящему изобретению на интактных хромосомах, клетках или тканях, выделенных от пациента, для непосредственной визуализации морфологического расположения определенных последовательностей ДНК или РНК. Гибридизация полинуклеотидов может быть проведена с применением любых подходящих способов гибридизации и системы выявления. Примеры систем гибридизации включают обычные способы дот-блоттинга, саузерн-блоттинга и сендвич-анализа. Например, подходящий способ может включать способ обратной гибридизации, где типоспецифичные зонды фиксируют на твердой подложке в определенных известных местах (точках, линиях или других фигурах) и амплифицированные полинуклеиновые кислоты помечают с целью выявления гибридообразования. Определенные последовательности нуклеиновых кислот MAGE-A3, например, зонд или праймер, как описано здесь, могут быть помечены биотином, и гибрид может быть выявлен посредством сочетания биотин-стрептавидин с нерадиоактивной системой развития окраски. Тем не менее, также могут быть применены другие системы обратной гибридизации, например, как показано в Gravitt et al. (Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(10): 3020-3027),содержание чего полностью включено посредством ссылки. Стандартная гибридизация и условия отмывания описаны в Kleter et al., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(8): 2508-2517 и будут оптимизированы в данных условиях для поддержания необходимых специфичности и чувствительности посредст-9 016347 вом длины и последовательности зонда (зондов) и праймера (праймеров). В одном воплощении способ по настоящему изобретению может включать применение: а) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:3 и 4; и зонда, содержащего SEQ ID NO:13; б) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:3 и 4; и зонда, содержащего SEQ ID NO:17; в) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:3 и 4; и зонда, содержащего SEQ ID NO:53; г) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:3 и 4; и зонда, содержащего SEQ ID NO:54; д) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:5 и 6, и зонда, содержащего SEQ ID NO:14; е) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:7 и 8, и зонда, содержащего SEQ ID NO:15; ж) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:9 и 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO:16; з) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:11 и 12, и зонда, содержащего SEQ ID NO:17; и) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:11 и 12, и зонда, содержащего SEQ ID NO:53; и/или к) пары праймеров, содержащей SEQ ID NO:11 и 12, и зонда, содержащего SEQ ID NO:54. Способы, описанные здесь, являются подходящими для применения со свежей тканью, замороженной тканью, тканью, зафиксированной в парафине, и/или тканью, зафиксированной в этаноле. Для выделения РНК или ДНК из образца доступны хорошо известные методики выделения и очистки (например,в Sambrook et al., 1989). РНК или ДНК могут быть использованы непосредственно после выделения из образца или, более предпочтительно, после стадии амплификации полинуклеотида (например, ПЦР). В определенных случаях, как например для исследований с обратной гибридизацией, может быть необходима обратная транскрипция РНК в кДНК перед амплификацией. В обоих последних случаях амплифицированный полинуклеотид "имеет происхождение" из образца. В одном воплощении, где образец представляет собой ткань, зафиксированную в парафине, могут быть использованы следующие наборы праймеров и зондов: а) пара праймеров, содержащая SEQ ID NO:7 и 8, и зонд, содержащий SEQ ID NO:15; б) пара праймеров, содержащая SEQ ID NO:9 и 10, и зонд, содержащий SEQ ID NO:16; в) пара праймеров, содержащая SEQ ID NO:11 и 12, и зонд, содержащий SEQ ID NO:17; г) пара праймеров, содержащая SEQ ID NO:11 и 12, и зонд, содержащий SEQ ID NO:53; и/или д) пара праймеров, содержащая SEQ ID NO:11 и 12, и зонд, содержащий SEQ ID NO:54. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения пациента, включающий: определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента MAGE-A3, с применением способа,как описано здесь, и введение указанному пациенту композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена MAGE-A3 или MAGE-A3-специфиченое антитело или иммуноглобулин. Пациент может иметь опухолевую ткань, экспрессирующую MAGE-A3, (терапия активного заболевания) или может представлять собой пациента, прошедшего лечение для удаления/излечения MAGE-A3 экспрессирующей опухолевой ткани, предрасположенного к рецидиву MAGE-A3-экспрессирующей опухоли (адъювантная терапия). Согласно настоящему изобретению также предложено применение композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена MAGE-A3 или MAGE-A3-специфиченое антитело или иммуноглобулин, в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от MAGE-A3 экспрессирующей опухоли или предрасположенного к рецидиву MAGE-A3-экспрессирующей опухоли,где у пациента, с применением диагностического способа, набора, праймера или зонда, как описано здесь, установлено наличие MAGE-A3-экспрессирующей опухолевой ткани, или установлено, что у пациента была MAGE-A3-экспрессирующая опухолевая ткань. Композиция, содержащая антиген, эпитоп или производное антигена MAGE-A3, может содержать антиген MAGE-A3 или его пептид. В одном воплощении антиген MAGE-A3 или его пептид содержит или состоит из пептида EVDPIGHLY. Антиген или пептид MAGE-A3 может быть слит или конъюгирован с белком-носителем, который может быть выбран из белка D, NS1 или CLytA или их фрагментов. В одном воплощении композиция может дополнительно содержать адъювант; например, адъювант,содержащий одно или более, или комбинацию из: 3-де-О-ацилированного монофосфорил липида A (3DMPL); солей алюминия; CpG-содержащих олигонуклеотидов; сапонин-содержащих адъювантов, таких как QS21 или иммуностимлуирующие комплексы (ISCOM); эмульсий типа "масло в воде"; и липосом. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ скрининга, в клинических применениях, образцов тканей от пациента-человека на присутствие или отсутствие экспрессии MAGEA3. Такие образцы могут состоять, например, из материалов пункционных биопсий, образцов после хирургического удаления или ткани лимфатических узлов. Например, эти способы включают получение биопсийного материала, возможно, фракционированного изготовлением срезов в криостате для обогащения опухолевыми клетками до приблизительно 80% от всей популяции клеток. В определенных воплощениях, нуклеиновые кислоты могут быть выделены из этих образцов с применением методик, хорошо известных в данной области техники. В других воплощениях нуклеиновые кислоты, выделенные из образца ткани, могут быть амплифицированы с применением методик, хорошо известных в данной области техники. Уровень экспрессии MAGE-A3 может быть выявлен и может быть сопоставлен со статистически достоверными группами и/или контролями от MAGE-A3-отрицательных пациентов. В одном воплощении диагностический способ включает определение того, экспрессирует ли субъ- 10016347 ект продукт гена MAGE-A3, например, выявлением соответствующей иРНК и/или уровня белка продукта гена. Например, с применением методик, таких как нозерн-блот анализ, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR), полуколичественная RT-PCR, количественная RT-PCR, TaqManPCR (TaqMan полимеразная цепная реакция), гибридизация in situ, иммунопреципитация, вестерн-блот анализ и иммуногистохимия. В соответствии с таким способом, от пациента могут быть получены клетки или ткань, и уровень иРНК и/или белка может быть сопоставлен с таковыми ткани, не экспрессирующейTaq-ДНК-полимераза обладает 6'-3'-экзонуклеазной активностью. В анализе TaqMan PCR эту экзонуклеазную активность используют для расщепления зондов с двойными метками, ренатурированных с целевыми последовательностями в течение ПЦР-амплификации. Кратко, из образца выделяют РНК и синтезируют кДНК (обратная транскрипция). кДНК затем добавляют к ПЦР-реакционной смеси, содержащей стандартные ПЦР-компоненты (см., например, компоненты, поставляемые Roche (CA, USA) для Taqman PCR). Реакционная смесь дополнительно содержит зонд, ренатурирующий с матричной нуклеотидной последовательностью между двумя праймерами (то есть, в пределах "ампликона", последовательности, амплифицируемой посредством ПЦР-реакции). Зонд содержит флуоресцентный репортерный краситель на 5'-конце и гасящий краситель на 3'-конце. Гаситель способен гасить флуоресценцию репортера, но только если два красителя расположены близко друг к другу: это происходит для интактных зондов. В течение и после амплификации зонд деградирует под действием Taq-ДНК-полимеразы, и любая флуоресценция становится выявляемой. Для количественных измерений используют число циклов ПЦР, при котором флуоресценция достигает порогового уровня, в 10 раз превышающего стандартное отклонение исходной эмиссии. Это число циклов, называемое пороговым числом циклов (Ct), обратно пропорционально исходному количеству целевой кДНК и позволяет измерить количество кДНК. По существу, чем большее количество РНК присутствует в образце, тем меньше получаемое число Ct. Измерения, получаемые для значения Ct, сравнивают с таковыми, получаемыми для конститутивного гена. Это допускает любые ошибки, основанные на количестве всей РНК, добавляемой к каждой реакции обратной транскрипции, (на основании поглощения при длине волны) и ее качестве (то есть,деградации): ничто из этого не является надежным параметром для измерения исходного материала. Таким образом, транскрипты обязательного гена оценивают количественно в качестве эндогенного контроля. Бета-актин является одним из наиболее часто используемых неспецифических конститутивных генов,хотя могут быть использованы и другие. В еще одном воплощении изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего отMAGE-A3-экспрессирующей опухоли, включающий: определение, посредством применения способа по настоящему изобретению, того, экспрессирует ли пациент белок MAGE-A3; и последующее введение композиции, содержащей антиген, эпитоп или производное антигена MAGE-A3 или MAGE-A3 специфиченое антитело или иммуноглобулин, для предотвращения или облегчения рецидива заболевания. Пациент может сначала получить лечение, такое как хирургическое удаление любой опухоли или другое лечение химиотерапией или лучевой терапией. Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложено применение MAGE-A3 специфичной иммунотерапии в изготовлении лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих от MAGE-A3-экспрессирующей опухоли, или пациентов, получающих лечение (хирургическое, химиотерапию или лучевую терапию) для удаления или излечения MAGE-A3-экспрессирующей опухоли,где, посредством применения диагностического способа, набора, праймера или зонда по настоящему изобретению, у указанного пациента установлено наличие MAGE-A3-экспрессирующей опухолевой ткани. Таким образом, настоящее изобретение может быть применено для пациентов с MAGE-A3 экспрессирующими злокачественными новообразованиями, такими как меланома; рак молочной железы; рак мочевого пузыря, включая переходно-клеточный рак; рак легкого, включая немелкоклеточный рак легкого (NSCLC); рак головы и шеи, включая рак пищевода; плоскоклеточный рак; рак печени; множественная миелома; и рак ободочной кишки. В одном воплощении, изобретение может быть применено в лечении пациентов в адъювантной (послеоперационной) терапии при таких раках, в частности, при раке легкого и меланоме. Изобретение также находит применение в лечении метастатических видов рака. Иммунотерапия Композиции, подходящие для использования в способах лечения пациентов по настоящему изобретению, представляют собой таковые, способные увеличивать MAGE-A3-специфичный иммунный ответ. Композиция будет содержать по меньшей мере один эпитоп из продукта гена MAGE-A3. Такой эпитоп может быть представлен как пептидный антиген, возможно, ковалентно связанный с носителем. Альтернативно, могут быть использованы большие белковые фрагменты. Фрагменты и пептиды для использования должны, тем не менее, при подходящем представлении, быть способны вызывать иммунный ответ против MAGE-A3, например MAGE-A3-специфичный иммунный ответ.- 11016347 Примеры пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают следующие пептиды MAGE-A3. В одном воплощении антиген может содержать пептид или белок MAGE, связанный с иммунным слитым фрагментом или партнером-энхансером экспрессии. Белок MAGE может представлять собой белок MAGE-A3 полной длины или может содержать фрагмент MAGE3, например аминокислоты 3-314MAGE3 (в общей сложности 312 аминокислот). Антиген и партнер могут быть химически конъюгированы или могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка. В одном воплощении, где антиген и партнер экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка, это может делать возможной выработку в системе экспрессии на более высоких уровнях по сравнению с неслитым белком. Таким образом, партнер по слиянию может способствовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунный партнер по слиянию), предпочтительно Тхелперных эпитопов, распознаваемых людьми, и/или способствовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с большим выходом, чем нативный рекомбинантный белок. В одном воплощении, партнер по слиянию может являться как иммунным партнером по слиянию, так и энхансером экспрессии. В одном воплощении изобретения иммунный партнер по слиянию, который может быть использован, имеет происхождение от белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilusinfluenza В (WO 91/18926), или его производного. Производное белка D может содержать первую 1/3 белка, или приближенно первую 1/3 белка. В одном воплощении первые 109 остатков белка D могут быть использованы в качестве партнера по слиянию для снабжения антигена MAGE-A3 дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и повышения уровня экспрессии в Е. Coli (действуя, таким образом, также в качестве энхансера экспрессии). В альтернативном воплощении производное белка D может содержать первые N-концевые 100-110 аминокислот или приближенно первые N-концевые 100110 аминокислот. В одном воплощении белок D или его производное могут быть липидированы, и может быть использован липопротеин D: липидный хвост может обеспечить оптимальное представление антигена антиген-представляющим клеткам. В одном воплощении MAGE-A3 может представлять собой белок D-MAGE-A3/His, слитый белок из 432 аминокислотных остатков. Этот слитый белок содержит аминокислоты с 1 по 109 белка D, липопротеин, присутствующий на поверхности грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В, 312 аминокислот из белка MAGE-A3 (аминокислоты 3-314), спейсер и полигистидиновый хвост, который может облегчать очистку слитого белка в течение процесса изготовления, например:(1) сигнальную последовательность из 18 остатков и первые 109 остатков процессированного белкаD, причем сигнальную последовательность отщепляют от слитого белка в процессе изготовления, оставляя первые 109 остатков;(2) два неродственных остатка (метионин и аспарагиновую кислоту);(4) два глициновых остатка, функционирующих как шарнирная область;(5) семь гистидиновых остатков. В альтернативном воплощении может быть использована описанная выше конструкция, за исключением того, что (1) может быть заменен последовательностью, содержащей первые N-концевые 100-110 аминокислот или приближенно первые N-концевые 100-110 аминокислот белка D.MAGE-A3 может быть экспрессирован в виде слитого белка с белком D на N-конце и последовательностью из семи гистидиновых остатков (гистидиновым хвостом) на С-конце. Белок D представляет собой белок массой 42 кДа, связывающий иммуноглобулины D, экспонированный на поверхности грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В. В другом воплощении иммунный партнер по слиянию, белок D, может быть заменен на белок, известный как LytA. LytA имеет происхождение от Streptococcus pneumonia, синтезирующего N-ацетил-Lаланинамидазу, амидазу LytA (кодируемую геном LytA (Gene, 43 (1986) page 265-272, аутолизин, специфично разрушающий определенные связи в основе пептидогликанов. С-концевой домен белка LytA обеспечивает аффинность к холину или некоторым аналогам холина, таким как DEAE. Это свойство было использовано для разработки C-LytA-экспрессирующих плазмид у Е. Coli, применимых для экспрессии слитых белков. Была описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LytA на их Nконце (Biotechnology: 10, (1992) page 795-798). В одном воплощении может быть использована С- 12016347 концевая часть молекулы. В воплощении может быть использована повторяющаяся часть молекулыLytA, обнаруженная на С-конце, начиная с остатка 178. В одном воплощении часть LytA может включать остатки 188-305. В одном воплощении настоящего изобретения белок MAGE-A3 может содержать дериватизированный свободный тиол. Такие антигены были описаны в WO 99/40188. В частности, могут быть использованы карбоксиамидированные или карбоксиметилированные производные. В одном воплощении настоящего изобретения опухоль-ассоциированный антиген включает молекулу MAGE-A3-белок D. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности этой молекулы показаны на фиг. 9 (SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36). Этот и приведенные ниже антигены описаны более подробно в WO 99/40188. В другом воплощении настоящего изобретения опухоль-ассоциированный антиген может содержать любой из следующих слитых белков: слитый белок NS1-MAGE3 и гистидиновый хвост, например, как показано на фиг. 10 и 11 (SEQ IDNO:37 и SEQ ID NO:38); слитый белок CLYTA-MAGE3-гистидин, например, как показано на фиг. 12 и 13 (SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40). Другое воплощение настоящего изобретения включает применение иммунотерапевтического средства из нуклеиновой кислоты, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую MAGE-A3 специфичный опухоль-ассоциированный антиген, как описано здесь. В одном воплощении настоящего изобретения последовательности могут быть введены в подходящий вектор экспрессии и использованы для ДНК/РНК-вакцинации. Микробные векторы, эспрессирующие данную нуклеиновую кислоту, могут также быть использованы в качестве векторно доставляемых иммунотерапевтических средств. Примеры подходящих вирусных векторов включают ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденовирус-ассоциированные, герпесвирусные, включая векторы вируса простого герпеса, альфавирусные, поксвирусные, такие как Canarypox (вирус оспы канареек), и системы на основе вирусов коровьей оспы. Методики переноса генов с использованием этих вирусов известны специалистам в данной области техники. Ретровирусные векторы, например, могут быть использованы для стабильной интеграции полинуклеотида по изобретению в геном хозяина, хотя такая рекомбинация не является предпочтительной. Дефектные по репликации аденовирусные векторы, напротив, остаются эписомными и, таким образом, делают возможной транзиторную экспрессию. Могут быть использованы векторы, способные стимулировать экспрессию в клетках насекомых (например, бакуловирусные векторы), в клетках человека,дрожжей или в бактериях, с целью изготовления больших количеств белка MAGE-A3, кодируемого полинуклеотидами по настоящему изобретению, например, для применения в качестве субъединичных вакцин или в иммунологических исследованиях. В предпочтительном воплощении аденовирус, используемый в качестве живого вектора, представляет собой дефектный по репликации аденовирус обезьян. Обычно эти вирусы содержат делецию Е 1 и могут быть выращены на клеточных линиях, трансформированных с использованием гена Е 1. Предпочтительные аденовирусы обезьян представляют собой вирусы, выделенные от шимпанзе. В частности,С 68 (также известный как Pan 9) (см. патент США 6083716) и Pan 5, 6, и Pan 7 (WO 03/046124) предпочтительны для использования в настоящем изобретении. Таким образом, эти векторы могут быть использованы для введения гетерологичного гена по изобретению таким образом, продукт гена может быть экспрессирован. Применение, приготовление и изготовление таких рекомбинантных аденовирусных векторов подробно изложено в WO 03/046142. Обычные рекомбинантные методики получения последовательностей нуклеиновых кислот и изготовление векторов экспрессии описаны в Maniatis et al, Molecular Cloning-A Laboratory Manual; ColdSpring Harbor, 1982-1989. Для иммунотерапевтических средств на основе белков предложены белки по настоящему изобретению либо растворимые в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме. Каждая человеческая доза может содержать от 1 до 1000 мкг белка. В одном воплощении доза может содержать 30-300 мкг белка. Иммунотерапевтическое средство, как описано здесь, может дополнительно содержать вакцинный адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин. В продаже имеются подходящие вакцинные адъюванты для использования в настоящем изобретении, такие как, например, неполный адъювант Фрейнда ("Freund's Incomplete Adjuvant") и полный адъювант ("Complete Adjuvant") (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.,Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, 5 Philadelphia, PA); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфориллипид А и липид A ("quil А"). Цитокины, такие как гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или интерлейкин-2, -7 или -12, и хемокины могут также быть использованы в качестве адъювантов. В композициях по изобретению может быть желательным, чтобы адъювантная композиция вызывала иммунный ответ преимущественно Th1-типа. Высокие уровни цитокинов Th1-типа (например, ин- 13016347 терферона- (IFN-), фактора некроза опухоли(TNF), интерлейкина-2 (IL-2) и интерлейкина-12 (IL12 имеют тенденцию способствовать индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на введенный антиген. В одном воплощении с ответом преимущественно Th1-типа уровень цитокинов Th1 типа будет повышаться в большей степени, чем уровень цитокинов Th2-типа. Уровни этих цитокинов могут легко быть оценены с применением стандартных исследований. Для обзора семейств цитокинов см. Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989. Соответственно, подходящие адъюванты, которые могут быть использованы для стимуляции ответа преимущественно Th1-типа, включают, например, комбинацию монофосфориллипида А, такого как 3-деО-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), вместе с солью алюминия. 3D-MPL или другие лиганды толл-подобных рецепторов 4 (TLR4), такие как аминоалкил-глюкозаминид фосфаты, как раскрыто в WO 9850399, WO 0134617 и WO 03065806, могут также быть использованы сами по себе для вызова ответа преимущественно Th1-типа Другие известные адъюванты, способные вызывать иммунный ответ преимущественно Th1-типа,включают антагонисты TLR9, такие как неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды. Данные олигонуклеотиды характеризуются тем, что CpG-динуклеотид неметилирован. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны в, например, WO 96/02555. Подходящие олигонуклеотиды включают:CpG-содержащие олигонуклеотиды могут также быть использованы сами по себе или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию CpG-содержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности, комбинацию CpG и QS21, как раскрыто в WO 00/09159 и WO 00/62800. Композиция может дополнительно содержать эмульсию типа "масло в воде" и/или токоферол. Другой подходящий адъювант представляет собой сапонин, например, QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), который может быть использован сами по себе или в комбинации с другими адъювантами. Например, усиленная система включает комбинацию монофосфорил липида А и производного сапонина, как например комбинация QS21 и 3D-MPL, как описано в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 нейтрализован холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие подходящие композиции включают эмульсию типа "масло в воде" и токоферол. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии типа "масло в воде",описана в WO 95/17210. В другом воплощении адъюванты могут быть изготовлены в липосомной композиции. Используемое количество 3D-MPL в большинстве случаев невелико, но, в зависимости от иммунотерапевтической композиции, может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу. В одном воплощении адъювантная система содержит три иммуностимулятора: CpGолигонуклеотид, 3D-MPL и QS21, представленные или в липосомной композиции, или в эмульсии типа"масло в воде", как описано в WO 95/17210. Количество CpG или иммуностимулирующих олигонуклеотидов в адъювантах или иммунотерапевтических средствах по настоящему изобретению в большинстве случаев невелико, но, в зависимости от иммунотерапевтической композиции, может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу и более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу. Количество сапонина для использования в адъювантах по настоящему изобретению может составлять 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу, более предпочтительно от 1 до 250 мкг на дозу и наиболее предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу. В большинстве случаев, каждая человеческая доза может содержать 0,1-1000 мкг антигена, например 0,1-500 мкг, 0,1-100 мкг или от 0,1 до 50 мкг. Оптимальное количество для конкретного иммунотерапевтического средства может быть установлено стандартными исследованиями, включая наблюдение соответствующих иммунных ответов у вакцинированных субъектов. После первичной вакцинации субъекты могут пройти одну или несколько вторичных иммунизаций через соответствующие интервалы времени. Другие подходящие адъюванты включают Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOM (CSL), MF-59 (Chiron), Ribi Detox, RC-529 (GSK, Hamilton, MT) и другие аминоалкил-глюкозаминид 4-фосфаты (AGP). Соответственно, предложена иммуногенная композиция для применения в способе по настоящему- 14016347 изобретению, содержащая антиген, как раскрыто здесь, и адъювант, где адъювант содержит одно или более из 3D-MPL, QS21, CpG-олигонуклеотида, простого или сложного эфира полиэтилена, или комбинацию двух или более из этих адъювантов. Антиген в иммуногенной композиции может быть представлен в эмульсионном наполнителе типа "масло в воде" или типа "вода в масле" или в липосомной композиции. В одном воплощении адъювант может содержать одно или более из 3D-MPL, QS21 и иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида. В одном воплощении присутствуют все три иммуностимулятора. В другом воплощении 3D-MPL и QS21 представлены в эмульсии типа "масло в воде", и в отсутствии CpGолигонуклеотида. Композиция для использования в способе по настоящему изобретению может содержать фармацевтическую композицию, содержащую опухоль-ассоциированный антиген, как описано здесь, или слитый белок в фармацевтически приемлемом эксципиенте. На всем протяжении данного описания и последующей формулы изобретения, если контекст не требует иного, под словом "содержать" и вариациями, такими как "содержит" или "содержащий", будут понимать включение установленного целого или стадии, или группы установленных целых или стадий,но не исключение какого-либо другого целого или стадии, или группы целых или стадий. Изобретение будет в дальнейшем описано посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры, в которых RT-PCR относится к полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Примеры Пример 1. Полуколичественная ПЦР - замороженные образцы ткани. Праймеры: SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Выделение РНК: способ очистки РНК жидким азотом Маленький кусочек ткани быстро замораживали в жидком азоте и затем помещали в ступку для механического измельчения толкушкой. 100 мг полученного порошка добавляли к 100 мкл TriPure реагента для выделения и РНК выделяли в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Venlo, Netherlands). Концентрацию РНК определяли по значению оптической плотности при 260 нм. Полуколичественная MAGE-A3 RT-PCR Полуколичественную RT-PCR проводили, как описано De Plaen et al (Immunogenetics 40:360, 1994). Синтез кДНК из 2 мкг всей РНК проводили в 20 мкл смеси, содержащей 1 х первый стандартный буфер,0,5 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP), 10 мМ дитиотриетола, 20 ЕД ингибитора РНКаз, 2 мМ олиго(dT)15 и 200 ЕД обратной транскриптазы M-MLV, в течение 1 ч 30 мин при 42 С. 50 нг кДНК амплифицировали посредством ПЦР в 25 мкл смеси, содержащей праймеры, специфичные в отношении MAGE-А 3 (SEQ ID NO:1 и 2). 10 мкл аликвоту каждой реакции использовали для электрофореза на 1% агарозном геле и визуализировали флуоресценцией с бромидом этидия. Размеры ампликонов составляют 725 пар оснований (bp) и 805 bp при амплификации иРНК и геномной ДНК (гДНК) соответственно. Положительные контроли для полуколичественной MAGE-A3 RT-PCR Для этих экспериментов были введены три положительных контроля.(1) К каждой ПЦР-реакционной смеси добавляли клонированный фрагмент геномной ДНК MAGEA3. Это приводит к образованию фрагмента 805 bp (на 80 bp больше фрагмента, образуемого из кДНК),всегда присутствующего при отсутствии ингибирования ПЦР. Это действует в качестве положительного контроля для проверки эффективности ПЦР в MAGE-A3-отрицательных образцах.(2) Для каждого MAGE-A3-исследования синтез кДНК проводили параллельно на опухолевых образцах и на РНК, выделенной из "Gerl" меланомной клеточной линии MZ-2-3.0. Для признания "положительными" опухолевые образцы должны давать сигнал, составляющий 1% от уровня кДНК Gerl клеточной линии MZ-2-3.0.(3) ПЦР на бета-актин (табл. 1) проводили на каждом образце с целью выявления образцов со значительно деградированной РНК. Если сигнал бета-актина, получаемый от MAGE-A3-отрицательного опухолевого образца, был слабее сигнала, получаемого от MZ-2-3.0, то число циклов корректировали для клинического образца таким образом, чтобы интенсивность ампликона бета-актина достигала необходимого уровня. Отрицательные контроли для полуколичественной MAGE-A3 RT-PCR Для этих экспериментов были введены три отрицательных контроля:(1) РНК, выделенная из клеточной культуры LB 23-1/2, которая, как известно, MAGE-A3 отрицательна;(2) контроль водой в реакции обратной транскрипции (RT-реакции); и(3) контроль водой на стадиях ПЦР. Интерпретация данных 50 нг образец иРНК из опухолевого образца признавали MAGE-A3-положительным, если количество ампликона 725 bp было равным или превышало количество ампликона, полученного с использованием 0,5 нг РНК от Gerl клеточной линии MZ-2-3.0 РНК (то есть, эквивалентно 0,1% Gerl РНК; см. положительные контроли). Количества оценивали флуоресценцией с бромидом этидия. Добавляли положитель- 15016347 ные и отрицательные контроли. Классы полуколичественной MAGE-A3 RT-PCR: пять стандартных классов (De Plaen et al., 1994) присваивали полуколичественному MAGE-A3 RT-PCR исследованию. Они являются субъективной оценкой и представляли собой, от наименьшей экспрессии к наибольшей, -, -/+, +, , . Пример того,как могут быть присвоены эти классы, показан на фиг. 16: на этой фиг. классы присвоены в соответствии с полоской, образуемой положительным контролем, как показано в табл. 6 ниже. Таблица 6SEQ ID NO:6; зонд: SEQ ID NO:14 (интрон). Полуколичественная ПЦР (для сравнительных исследований). Праймеры: SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Материалы и методы. Пациенты и сбор образцов Биопсийный материал от IБ и II стадий немелкоклеточных раков легкого (NSCLC) получали хирургически. Пациенты были включены в два клинических исследования, GSK 249553/004 (MAGE3-AS02B004) и Epidemio-M AGE3-153; пациенты пописывали информированное согласие и им объясняли суть и возможные последствия исследований. Биопсийный материал погружали в РНК-стабилизирующий раствор (RNA-later, Ambion, Cambridge, UK) непосредственно после хирургического удаления и хранили при -20 С.RNAIater представляет собой реагент для хранения тканей, стабилизирующий и защищающий клеточную РНК в интактных, незамороженных образцах ткани. RNAIater устраняет необходимость немедленно замораживать образцы в жидком азоте. Выделение РНК: способ очистки РНК с использованием шаровой мельницы ("Mixer Mill") Образец ткани удаляют из RNALater и добавляют к TriPure Isolation Reagent (Roche, Vilvoorde, Belgium). Ткань затем добавляют в шаровую мельницу, содержащую вольфрамовые шарики. После разрушения в шаровой мельнице всю клеточную РНК выделяли из максимум 100 мг ткани с использованием реагента TriPure в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Venlo, Netherlands). Концентрацию РНК определяли по значению оптической плотности при 260 нм. Исследование MAGE-A3 TaqMan RT-PCR - замороженная ткань кДНК, соответствующую 50 нг всей РНК, амплифицировали посредством ПЦР в 25 мкл смеси, содержащей буфер TaqMan, 5 мМ MgCl2, 0,4 мМ дезоксиуридинтрифосфата (dUTP), 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,625 ЕД ДНК-полимеразы Ampli Taq Gold, 0,05 ЕД урацил-ДНК-гликозилазы (UNG), 0,2 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 0.2 мкМ зонда TaqMan. Использовали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды (табл. 2; SEQ ID NO:3, 4 и 13 и SEQ ID NO:5, 6 и 14). Зонды мечены красителями FAM, NED и VIC (Applied Biosystems, CA, USA) и обладают группировкой, связывающей малую бороздку, (MGB; также от Applied Biosystems, CA, USA). Дополнительные эксперименты в настоящее время проводят с использованием красителя FAM вместо NED для MAGE-специфичных зондов. Экзон MAGE-A3 и ген бета-актина амплифицировали количественной ПЦР с использованием химии TaqMan на системе 7700 или 7900 (РЕ Applied Biosystems, Warrington, UK). ПЦР-амплификацию также проводили в интроне гена MAGE-A3 для проверки отсутствия контаминации геномной ДНК. Профиль амплификации представлял собой 1 цикл в течение 2 мин при 50 С, 1 цикл в течение 12 мин при 95 С и 35 циклов, включающих 15 с при 95 С и 1 мин при 60 С. Флуоресцентный сигнал, генерируемый деградацией зонда TaqMan, выявляли в реальном времени в течение всех стадий элонгации. Проверка достоверности исследования TaqMan RT-PCR для определения специфичности в отношенииMAGE-A3 Праймеры: SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4; зонд: SEQ ID NO:13 (экзон) -TaqMan RT-PCR. Праймеры: SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 (полуколичественная ПЦР - для сравнительных исследований). Плазмиды и клеточные линии Используемые плазмиды содержали полной длины кДНК генов MAGE-A1 (MAGE-1; Genbank accession NM 004988), MAGE-A2 (MAGE-2; Genbank accession L18920), MAGE-A3 (MAGE-A3; Genbankaccession NM 005363), MAGE-A8 (MAGE-8; Genbank accession NM 005364), MAGE-A9 (MAGE-9; Genbank accession NM 005365), MAGE-A10 (MAGE-10; Genbank accession NM 021048). MAGE-A11 (MAGE11; Genbank accession NM 005366) и MAGE-A12 (MAGE-12; Genbank accession NM 005367). Клеточные линии MZ-2-3.0 (MAGE-A3-положительная) и LB 23-1/2 (MAGE-A3-отрицательная) были любезно предоставлены Professor Thierry Boon, Ludwig institute, Brussels, Belgium.- 16016347 Специфичность способа MAGE-A3 TaqMan тестировали с использованием 1104, 1105 и 1106 копий плазмид, содержащих полной длины кДНК генов MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 и 12. Сравнение последовательностей генов MAGE-A (MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 и 12) в области разработанных MAGE-A3 ПЦР-праймеров и зондов показано на фиг. 14. Последовательности прямого и обратного MAGE-A3 праймеров подчеркнуты; последовательность MAGE-A3 зонда заключена в рамку. Обратные праймеры комплементарны области последовательности, которую они распознают, то есть А означает Т, G означает С, Т означает А, и С означает G. Положительные контроли MAGE-A3 TaqMan RT-PCR: (1) фрагмент геномной ДНК MAGE-A3, и(2) известные количества РНК, выделенные из Gerl клеточной линии MZ-2-3.0 (MAGE-A3 положительной меланомной клеточной линии). Отрицательные контроли MAGE-A3 TaqMan RT-PCR: (1) РНК, выделенная из клеточной культурыLB 23-1/2, которая, как известно, MAGE-A3-отрицательна, (2) контроль водой в RT-реакции, и (3) контроль водой на стадиях ПЦР. Проводили 40 циклов RT-PCR. Отрицательный контроль должен быть 35. Некоторые из результатов экспериментов TaqMan были представлены как 1/Ct. Статистика: сравнение двух методик ПЦР Для сравнения результатов полуколичественной RT-PCR (праймеры SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2) и количественной TaqMan PCR в реальном времени (праймеры: SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4; зонд: SEQID NO:13), с использованием методик, описанных здесь, была создана 22 таблица сопряжнности признаков (табл. 3). Переменная номинальной шкалы принимала два значения: положительное и отрицательное. Отрицательные значения включали ноль и пограничные значения; под пограничным значением подразумевают значение от 0,8% до 1,2% Gerl при полуколичественной RT-PCR и результаты менее 1% при исследовании TaqMan. Положительные значения сортировали на основании визуальной оценки полосок на геле относительно экспрессии бета-актина для способа полуколичественной RT-PCR, и положительные значения включали все результаты 1% при исследовании TaqMan. Совпадение по обоим способам вычисляли как отношение суммы числа двойных положительных и двойных отрицательных образцов к общему числу образцов. Для сравнения соотношений дискордантных пар (отрицательныеположительные) применяли тест McNemar. Вычисляли доверительные интервалы (CI). Оптимизация количественной TaqMan RT-PCRSybr green является компонентом, связывающим ампликоны неселективно, без специфичного в отношении последовательности зонда. RT-PCR в реальном времени проводили на генных клонах семействаMAGE-A с использованием четырех различных разведений клонов MAGE-A (20 пг, 2 пг, 0,2 пг и 0,02 пг)(фиг. 1, где результаты показаны как 1/Ct по оси Y). Положительный результат был получен для MAGEA3 при Ct 14, и для MAGE-A6 было получено значение Ct 16 (с 20 пг плазмид). Для MAGE-A4, А 8 и А 9 был показан уровень Ct 30, и для других генов MAGE была показана очень слабая экспрессия с Ct 35 и выше.TaqMan RT-PCR на MAGE-A3 с использованием специфичного в отношении последовательности зонда С использованием тех же MAGE-A3 праймеров (SEQ ID NO:3 и 4), но с зондом (SEQ ID NO:13),тестировали эффективность различения MAGE-A3 и А 6, используя различные разведения соответствующих колонов членов семейства MAGE-A (фиг. 2). Во-первых, в каждом из разведений было установлено ожидаемое снижение MAGE-A3 Ct. Клон MAGE-A6 не демонстрирует высокого 1/Ct при использовании зонда, что указывает на отсутствие перекрестной реактивности. Введение 1106 MAGE-A6 плазмиды в раствор MAGE-A3 плазмиды, как показано на фиг. 3, не оказывает никакого эффекта, и результат повторяет результат титрования MAGE-A3 плазмиды. Это указывает на отсутствие конкурентного эффекта MAGE-A6 в присутствии MAGE-A3 с применением TaqManPCR. Результаты Опухолевая экспрессия MAGE-A3, сравнение полуколичественного и количественного способов Достоверность TaqMan-специфичной количественной ПЦР дополнительно проверяли в сравнении со стандартной полуколичественной RT-PCR на MAGE-A3 (с использованием праймеров SEQ ID NO:1 и 2). 71 образец опухоли от пациентов с NSCLC использовали для непосредственного сравнения количественного (с использованием праймеров SEQ ID NO:3 и 4 и зонда SEQ ID NO:13) и полуколичественного способов оценки экспрессии MAGE-A3 (с использованием праймеров SEQ ID NO:1 и 2). Результаты указывают на хорошую конкордантность двух способов на уровне 95,8% (табл. 3) при совпадении 68/71. Количественное TaqMan RT-PCR и полуколичественное RT-PCR исследование были дискордантны для трех образцов, с завышением положительности результатов при полуколичественнойRT-PCR. Тем не менее, при тесте McNemar было выявлено симметричное перераспределение этих трех дискордантных результатов (р=0,25), указывая на то, что ни одна из методик не имела тенденции приводить к более дискордантным результатам по сравнению с другой методикой. При более подробном исследовании непостоянный уровень экспрессии бета-актина в этих образах приводил к ложноположительным результатам в способе полуколичественной RT-PCR.- 17016347 Для представления распределения данных TaqMan PCR для каждого класса, определенного полуколичественной RT-PCR была использована ящичковая диаграмма ("box plot", фиг. 4). Хотя конкордантность обоих способов, на основании 22 таблицы сопряжнности признаков, была отличной, по ящичковым диаграммам было выявлено некоторое перекрывание различных классов, указывая, что полуколичественная оценка не совпадала полностью с количественным измерением TaqMan RT-PCR. Перекрывание может быть обусловлено тем фактом, что оценку проводили разные операторы при разных обстоятельствах, что может увеличивать вариабельность. В этом смысле, количественное исследование TaqMan RTPCR является значительно более независимым от этих факторов и, следовательно, является более воспроизводимым. Пример 3. Анализ ткани, зафиксированной в парафине, (FFPE) посредством RT-PCR Материалы и методы РНК выделяли из FFPE-образцов с применением патентованного способа Response Genetics Inc., как раскрыто в патентах США US 6613518; US 6610488; US 6428963; US 6248535, включенных сюда посредством ссылки. Альтернативно, РНК может быть получена из ткани, зафиксированной в парафине, в соответствии с любым опубликованным способом. Например, срезы тканей могут быть удалены из парафина с использованием d-лимонена или другого лизирующего буфера и затем отмыты в растворе на основе этанола. Срезы могут затем быть обработаны протеиназой К в течение ночи и затем отмыты, и РНК может быть очищена колоночной хроматографией. TaqMan RT-PCR в реальном времени проводили на образцах с использованием праймеров SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и зонда SEQ ID NO:13; праймеры и зонды разработаны для использования в замороженной ткани (см. пример 2 выше). Результаты: экспрессия Mage A3 В табл. 4 показаны результаты, выраженные как значения Ct, для зафиксированной в формалине заключенной в парафин (FFPE) ткани. Числа по оси Y обозначают образцы человеческих опухолей 990118990784. В анализ были также включены положительные контроли: ТС 1 (Mage3); Gerl (MAGE-A3 меланомная клеточная линия); и CRL 1675 (меланомная клеточная линия). Значения Ct превышают те, которые можно было ожидать для MAGE-A3 праймеров для полуколичественной RT-PCR замороженной ткани. Для целей этих экспериментов верхним пределом чувствительности признают уровень Ct 36-37. Положительный контроль Gerl MAGE-A3 имеет Ct 31 в рамках предела чувствительности, но значительно ниже, чем в полуколичественном RT-PCR исследовании. С этими уровнями праймеры и зонд для количественной оценки MAGE-A3 в замороженной ткани (табл. 2, праймеры SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и зонд SEQ ID NO:13, специфичные в отношении 3 экзона MAGE-A3) не могут быть достаточно чувствительными для выявления экспрессии MAGE-A3 в FFPE-образцах опухолей: образцы, являющиесяMAGE-A3-положительными, но экспрессирующие MAGE-A3 лишь в небольшой степени, не могут быть выявлены. В эксперимент были включены образцы положительных контролей из FFPE-ткани: ТС 1 (Mage3) иGerl (MAGE-A3-положительный контроль), и CRL 1675. Человеческие опухоли 990118-990784 анализировали количественной Taqman RT-PCR с использованием праймеров для замороженной ткани SEQ IDNO:3 и SEQ ID NO:4 и зонда SEQ ID NO:13, с использованием РНК из ткани, зафиксированной в парафине. Результат этого анализа показан на фиг. 5. Доработка праймеров MAGE-A3 TaqMan для использования в FFPE-ткани Размер ампликона для основанного на RNALater MAGE-A3 исследования замороженной ткани(описанного в примере 2) превышает 100bp. С целью получения более чувствительных результатов для деградированной РНК, обнаруженной в FFPE-образцах, были разработаны новые праймеры для уменьшения размера ампликона с целью повышения чувствительности MAGE-A3 исследования (табл. 5). Для обоих исследований, описанных в Примерах 2 и 3, использовали зонд MGB (Minor Groove Binding) для увеличения специфичности исследований. Зонд MGB связывает малую бороздку ДНК, образуя чрезвычайно стабильный дуплекс, что приводит к повышению специфичности праймера. Тестирование новых MAGE-A3 праймеров на специфичность и чувствительность Наборы заново разработанных праймеров (табл. 5) тестировали на кДНК членов семейства геновMage-А (фиг. 6 а), где набор 1 представляет собой праймеры SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, зонд SEQ IDNO:15; Набор 2 представляет собой праймеры SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, зонд SEQ ID NO:16; набор 3 представляет собой праймеры SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, зонд SEQ ID NO:17; и набор 4 представляет собой праймеры SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, зонд SEQ ID NO:13. Как показано на фиг. 6 а, праймеры SEQ ID NO:7 и 8 имеют высокие уровни Ct в отношении MAGEA3, но также в отношении Mage-2 и Mage-12. Праймеры SEQ ID NO:9 и 10 имеют высокие уровни Ct в отношении MAGE-A3 и незначительное Ct в отношении MAGE-A6, но это выходит за нормальные рамки экспрессии MAGE-A3. Праймеры SEQ ID NO:11 и 12 незначительно менее чувствительны, чем SEQID NO:9 и 10. Таким образом, в настоящих экспериментах праймеры SEQ ID NO:9 и 10 были выбраны для дальнейшего тестирования в FFPE-ткани. Эти праймеры SEQ ID NO:9 и 10 в дальнейшем тестировали в серии разведений РНК и для них была показана хорошая линейная область вплоть до более низких разведений, указывая на то, что праймеры должны иметь хорошую чувствительность и являются подхо- 18016347 дящими для исследования (фиг. 6 б). Сравнение TaqMan исследований на MAGE-A3 с использованием замороженной и FFPE-ткани Сорок два FFPE опухолевых образца сравнивали с использованием праймеров SEQ ID NO:9, SEQID NO:10 и зонда SEQ ID NO:16, выполняя то же исследование с замороженной тканью с использованием праймеров SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и зонда SEQ ID NO:13 (фиг. 7). Уровень положительности исследования установлен на 1% gerl (положительный контроль) и, при непосредственном сравнении, повидимому, между двумя исследованиями существует некоторая конкордантность. Есть несколькоMAGE-A3-положительных пациентов MAGE-A3, результаты которых не совпали с MAGE-А 3 исследованием замороженной ткани; это может быть объяснено макроскопическим удалением опухолевых областей, приводящим к увеличению чистоты опухолевых клеток, экспрессирующих MAGE-A3. Удаление большей части разбавляющих нормальных клеток приводило к MAGE-A3-положительному результату. Было продемонстрировано значение R2 (статистический тест линейной корреляции) 0,92 между FFPEтканью и RNAIater-замороженной тканью, указывая на хорошую корреляцию двух способов (фиг. 8). Пример 4. Тест COBAS Taqman MAGE-A3 Test. Таблица 7. Последовательности MAGE-A3 праймеров и зонда для COBAS Taqman Е=репортерный краситель FAM, F=5-метил dC, Q = гаситель BHQ2, L = 5-пропинил dU, Р = фосфат,I = репортер HEX. Последовательность зонда MAGEA3F-646MOD содержит следующие модфицированные нуклеотиды (SEQ ID NO:54): 5' - TCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTC-3'. Таблица 8. Последовательности праймеров и зонда COBAS Taqman для бета-актина- 19016347 Таблица 10. Температурный профиль циклов. Температурный профиль ПЦР для эксперимента исключительности Таблица 11. Температурный профиль RT-PCR для экспериментов линейности и эффективности RT-PCR,расчетной чувствительности (предела выявления), корреляции способов и воспроизводимости Относительно высокую температуру отжига в 63 С использовали для улучшения MAGE-A3 специфичности относительно других членов семейства MAGE-A. Анализ данных Значения Ct для MAGE-A3 и -актина вычисляют с использованием программного обеспеченияAMPLILINK 3.1 (Roche, CA, USA) на рабочей станции COBASTM TaqMan 48 Analyzer (Roche, CA, USA),на основании параметров исследования, определенных в Test Definition File. Анализ данных для экспрессии генов будут проводить, получая значения Ct для MAGE-A3 и (3-актина из AMPLILINK для последующих вычислений для определения экспрессии гена MAGE-A3 относительно гена -актина. Для каждого опыта будут включены контроли для установления пороговой экспрессии MAGE-A3, которая должна быть достигнута или превышена для того, чтобы назвать образец MAGE-A3-положительным. В качестве положительного контроля используют РНК из клеточной линии GERL. GERL РНК разводят в воде 1:100 (1% GERL) и определяли Ct MAGE-A3. В дополнение, неразведенную GERL РНК (100%GERL) тестируют без разведения для измерения Ct -актина. Вычисляют значение разности Ct между Ct-актина от 100% GERL контроля и Ct MAGE-А 3 от 1% GERL контроля и определяют относительную экспрессию MAGE-А 3 на основании следующего вычисления: Для заключенных в парафин образцов будет использована та же контрольная стратегия, за исключением того, что для установления пороговой экспрессии РНК от клеточной линии GERL будет заменена на РНК от GERL FFPE Xenograft, выделенную с применением способа Q1AGEN FFPE. Поскольку тест COBAS Taqman MAGE-А 3 представляет собой сложную реакцию, значения Ct для MAGE-А 3 и -актина получают из одной реакционной пробирки. Для каждого тестируемого образца относительную экспрессию MAGE-А 3 вычисляют по следующему уравнению: Если экспрессия MAGE-А 3 в тестируемом образце больше или равна пороговому уровню экспрессии MAGE-А 3, установленному на основании GERL РНК контролей, то образец называют положительным в отношении MAGE-A3. Если экспрессия MAGE-А 3 в тестируемом образце меньше порогового уровня экспрессии MAGE-А 3, установленного на основании контролей, то образец называют отрицательным в отношении MAGE-A3. Экспрессию MAGE-А 3 будут определять, устанавливая средние значения Ct MAGE-А 3 и Ct актина от репликатов для каждого образца для вычисления разности Ct (Ct -актина - Ct MAGE-А 3). Если для репликата Ct MAGE-А 3 или Ct -актина ниже Ct отсечки данного теста, но для другого репликатаCt MAGE-A3 или Ct -актина выше Ct отсечки, образец будут тестировать заново. Если для обоих реп- 20016347 ликатов значения Ct -актина выше Ct отсечки, то образец маркируют как образец с Ct -актина, выходящим за пределы, и результат не устанавливают. Если для обоих репликатов значения Ct MAGE-А 3 выше значения Ct MAGE-А 3 отсечки, но экспрессия MAGE-А 3 превышает пороговую, то образец помечают как образец с Ct MAGE-А 3, выходящим за пределы, и результат не устанавливают. Эта стратегия анализа данных согласуется с исследованиями по перекрестной проверке достоверности для корреляции способов, описанными в разделе "Корреляция способов" ниже. Для теста COBAS Taqman MAGE-A3, Human QPCR Human Reference Total RNA (UHR) от Slralagene может быть использована в качестве положительного контроля и для установления пороговой экспрессии на основании экспрессии MAGE-A3 в этой хорошо охарактеризованной РНК. Разведенную UHR можно тестировать в каждом опыте совместно с GERL РНК контролями для установления подходящего порога экспрессии с контролем UHR. Условия хранения образцов и реагентов Все РНК и ДНК, включая плазмиды, Р 53-положительную контрольную ДНК, клиническую РНК изFFPE-ткани (FFPET РНК), UHR, GERL и STAC хранят при -80 С. Все реагенты для теста, включая Universal RNA Master Mix, смесь праймеров/зонда, смесь ко-факторов и разбавитель для образцов/отрицательный контроль хранят при 2-8 С. Исключительность MAGE-A3. Экспериментальное тестирование праймеров и зондов с использованием ДНК плазмид,содержащих членов семейства MAGE-A Цель. Определение способности теста специфично амплифицировать ген MAGE-A3 при исключении значимой ко-амплификации/выявления других родственных генов. Материал образцов. Будут тестировать плазмидную ДНК, содержащую MAGE-A3 и родственные члены семейства (более подробно о плазмидах см. Пример 2 выше). Методика. Экспериментальная оценка теста COBAS TaqMan MAGE-A3 Test с использованием ДНК плазмид, содержащих членов семейства MAGE-A, для определения того, происходит ли амплификация родственных генов и их выявление в значимых количествах. Каждый образец плазмидной ДНК тестировали трижды при четырех различных концентрациях ДНК (20, 2, 0,2, 0,02 пг). Температурный профиль проведения циклов, показанный в табл. 10, был модифицирован для удаления стадии обратной транскрипции при 60 С в течение 20 минут. Концентрацию плазмидной ДНК определяли посредством анализа Nanodrop. Анализ Для MAGE-A3 плазмиды определяли значения Ct и сравнивали со значениями Ct от плазмидMAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A11 и MAGEA12. Разность Ct вычисляли вычитанием из Ct MAGE-AX (каждого родственного члена семейства) CtMAGE-А 3. Для вычисления Ct и разности Ct использовали средние значения Ct от четырех репликатов. Критерии приемлемости Значения разности Ct между MAGE-A3 и всеми другими плазмидами, за исключением MAGE-A6,должны быть больше или равны 10. Результаты исключительности MAGE-A3 В табл. и графических материалах, приведенных здесь, в некоторых случаях термин "CURIE" используют вместо "MAGE"; тем не менее, во всех случаях подразумевают термин "MAGE". Значения Ct для всех тестированных MAGE плазмид показаны в табл. 12 и фиг. 17, показанных ниже. Тем плазмидам, с которыми не было амплификации, было присвоено значение Ct 55, поскольку температурный профиль циклов состоит из 55 циклов. Как и ожидали, значения Ct MAGE-A3 являются наименьшими для всех тестируемых уровней (табл. 12 и фиг. 17). Значения разности Ct превышали 10 циклов для MAGE-A3 и всех других плазмид, за исключением MAGE-A6 (табл. 13 и фиг. 18). В значении разности Ct между MAGE-A3 и MAGE-A6 не было необходимости, поскольку 95% пациентов, экспрессирующих MAGE-A6, также экспрессируют MAGE-A3. Значение разности Ct между MAGE-A3 и MAGE-A6 для 20 пг, 2 пг, 0,2 пг и 0,02 пг внесенной плазмидной ДНК составляло 9,3, 8,4, 7,8, и 8,2 циклов, соответственно. Поскольку было показано, что большинство значений Ct MAGE-A3 для РНК от FFPE-образцов превышало 27,2, для тестированныхFFPE-образцов сигнал от MAGE-A6 будет минимальным, так как задержка в 8,2 цикла будет приводить к значению Ct, выходящему за пределы исследования. Критерии приемлемости для исключительности были соблюдены. В табл. 14 показана проверка достоверности эксперимента исключительности MAGE-A3; контрольные значения Ct находились в пределах достоверного диапазона. Эксперимент прошел проверку достоверности. На табл. 15 и 16 показаны подробности эксперимента исключительности MAGE-A3. Линейность и эффективность RT-PCR Цель. Определение линейности и эффективности обратной транскрипции теста. Материал образцов. Для исследований линейности и эффективностей RT-PCR использовали серийные разведения FFPE Xenograft GERL РНК.- 21016347 Методика: FFPE Xenograft GERL РНК разводили 2-кратными серийными разведениями от 100 нг до 0,1 нг и тестировали с использованием теста COBAS TaqMan MAGE-А 3 Test для определения линейной области исследования. Тестировали десять репликатов при каждом уровне концентрации. Анализ Значения Ct для каждого репликата, как для MAGE-А 3, так и для -актина, наносили на график против логарифма (по основанию 2) внесенной концентрации РНК для вычисления углового коэффициента линии и эффективностей RT-PCR. Эффективность RT-PCR-амплификации вычисляли с использованием уравнения: Эффективность амплификации 2 эквивалентна 100%. Значения разности Ct (Ct MAGE-А 3 - Ct актина) для каждого репликата наносили на график против логарифма (по основанию 2) внесенной концентрации РНК для определения углового коэффициента разности Ct. От всех десяти репликатов для CtMAGE-А 3, Ct -актина и разности Ct вычисляли средние величины, стандартное отклонение и процентный коэффициент вариации (%CV). Критерии приемлемости для линейности Линейную область исследования определяли на основании следующих критериев: Критерии приемлемости для эффективности RT-PCR Эффективность амплификации MAGE-А 3 RT-PCR80%. Эффективность амплификации RT-PCR на -актин 80%. Разность эффективности RT-PCR-амплификации между MAGE-А 3 и -актином в пределах 10%. Результаты линейности/эффективности RT-PCR На фиг. 20 показан график логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК против значений Ct для MAGE-А 3 и -актина. Тест COBAS TaqMan MAGE-А 3 Test линеен при внесенных значениях 100-0,1 нг GERL РНК, выделенной из FFPE Xenograft с использованием способа QIAGEN, на основании значений R2. Значения R2 составляли 0,983 для MAGE-А 3 и 0,998 для -актина. Эти значения превосходят требуемое значение R20,95. В дополнение как Ct MAGE-А 3, так и Ct -актина для всех 10 репликатов на каждом тестируемом уровне меньше требуемого значения CV5%, как показано в табл. 17. Эффективность RT-PCR-амплификации MAGE-А 3 и -актина вычисляли на основании углового коэффициента линии, образованной нанесением на график логарифма (по основанию 2) внесенной РНК против значений Ct для MAGE-А 3 и -актина, показанных на фиг. 19. Эффективность амплификации при RT-PCR может быть вычислена с использованием следующего уравнения: Эффективность амплификации составляла 2,14 (107%) и 2,06 (103,1 для MAGE-А 3 и -актина, соответственно. АЕ превышала требуемое значение 80% для MAGE-А 3 и -актина. Разность АЕ между двумя генами составляла 3,9%, что также было в пределах требуемого значения +10%. На фиг. 20 показан график логарифма (по основанию 2) внесенного количества РНК против разности Ct между MAGE-А 3 и -актином. Угловой коэффициент разности Ct составляет 0,0474, находясь в пределах требуемого значения углового коэффициента от -0,10 до 0,10. При двух наиболее низких тестированных уровнях внесенной РНК (0,2 и 0,1 нг) %CV для разности Ct был выше требуемого значения 20%. В результате, последние два уровня внесенной РНК не были включены в линейную область исследования. Линейная область исследования с использованием GERL Xenograft РНК составляет 100 нг- 0,39 нг РНК. На основании этих данных, критерии приемлемости для линейности и эффективности RT-PCR были соблюдены. В табл. 18 показана эффективность RT-PCR-амплификации MAGE-A3 и -актина; Табл. 19 представляет собой проверку достоверности эксперимента линейности/эффективности RT-PCR. Контрольные значения Ct находились внутри достоверного диапазона. Эксперимент прошел проверку достоверности. На табл. 20, 21 и 22 представлены подробности эксперимента линейности/эффективности RT-PCR. Расчетная чувствительность (предел выявления) Цель. Установление наименьшей концентрации РНК, при которой экспрессия гена MAGE-A3 мо- 22016347 жет быть выявлена тестом COBAS TaqMan MAGE-A3 Test в по меньшей мере 95% случаев. Материал образцов. Расчетную чувствительность оценивали с использованием РНК, выделенной из ткани FFPE Xenograft с использованием набора QIAGEN RNeasy FFPE Kit с дополнительной ДНКазной стадией. РНК выделяли из двух FFPE-ксенотрансплантатов ("FFPE xenografts"), имеющих происхождение от двух различных РНК клеточных линий. Один ксенотрансплантат, называемый GERL, экспрессирует MAGE-A3. Другой ксенотрансплантат, называемый STAC, не экспрессирует MAGE-A3. РНК от этих двух ксенотрансплантатов, использовали в смешанных экспериментах для тестирования 5% GERL РНК в 95% STAC РНК, 1 % GERL РНК в 99% STAC РНК и 0,5% GERL РНК в 99,5% STAC РНК. Эти три различные смеси GERL и STAC РНК тестировали при четырех различных уровнях общей РНК. Метод. Результаты двадцати четырех тестов получали от 4 независимых разведений серий смесейGERL и STAC РНК. Тестировали четыре уровня внесенной РНК (100, 50, 25 и 12,5 нг). Для каждого уровня тестировали шесть репликатов. Анализ. Определение уровня РНК, при котором частота положительных результатов для MAGEA3, основанных на значении Ct в пределах достоверного диапазона данного исследования, превышает 95%. Критерии приемлемости. LOD50 нг всей внесенной РНК для выявления 1%GERL Результаты для предела выявления Частоту положительных результатов определяют как значение Ct в пределах достоверного диапазона данного исследования на основании экспериментов линейности, описанных в этом сообщении. Для определения границы диапазона Ct усредняли значения Ct MAGE-A3 и -актина от уровня внесенной РНК из исследования линейности 0,39 нг (граница линейной области) и вычисляли 95% доверительные интервалы для значений Ct MAGE-А 3 и -актина. На основании этих вычислений для образца, признаваемого положительным, Ct MAGE-A3 должно быть меньше или равно 35,2 и Ct -актина должно быть меньше 32,1. Частота положительных результатов для MAGE-A3 и -актина показана в табл. 23 и табл. 25. Процент положительных результатов для MAGE-A3 и -актина показан в табл. 24 и табл. 26. Там, где 1% GERL РНК, разведенную в 99% STAC РНК, выявляют в 95 % случаев на основанииCt MAGE-A3, предел выявления составляет 50 нг внесенной РНК, что входит в достоверный диапазон данного исследования. Критерии приемлемости для расчетной чувствительности (предела выявления) соблюдены. Проверка достоверности эксперимента предела выявления. Значения Ct для FAM-контролей геновMAGE показаны в табл. 27; значения Ct для НЕХ-контролей -актина показаны в табл. 28. Контрольные значения Ct входят в достоверный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности. В табл. 29; табл. 30; и табл. 31 показаны подробности эксперимента предела выявления. Корреляция способов Цель. Сопоставить и провести перекрестную проверку достоверности теста COBAS TaqManMAGE-A3 Test и прототипного исследования Prototype Assay на клинических FFPET-образцах. Материал образцов. Приблизительно 120 клинических FFPET образцов соответствующего качества были проанализированы с использованием теста COBAS TaqMan MAGE-A3 Test и с использованием прототипного исследования. Методика. РНК выделяли с использованием набора QIAGEN RNeasy FFPE Kit с дополнительной ДНКазной стадией. Для каждого FFPET-образца проводили одно выделение, образец делили на части и одну аликвоту оценивали с использованием теста COBAS TaqMan MAGE-A3 Test, и одну аликвоту тестировали с использованием прототипного исследования. Для обоих исследований использовали идентичные контроли для установления пороговой экспрессии MAGE-A3. Анализ Сигнал MAGE-A3 для каждого образца записывали как положительный или отрицательный на основании пороговой экспрессии MAGE-A3, полученной от GERL РНК контролей. Результаты двух исследований сравнивали для установления положительного или отрицательного согласно значениям процента совпадения с исследованием сравнения в тесте RMS. Для вычисления процента совпадения для принятия решения по дискордантным результатам использовали результаты, полученные с использованием двустадийного RT-PCR исследования для замороженной ткани. Положительные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения = число образцов, правильно названных экспрессорами MAGE-A3/ число тестированных образцов 100. Отрицательные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения = число образцов, правильно названных не экспрессирующими MAGE-A3 / число тестированных образцов 100. Критерии приемлемости Положительные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения 85%. Отрицательные согласно проценту совпадения с исследованием сравнения 85%. Для оценки положительных и отрицательных согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте COBAS TaqMan MAGE-A3 Test проводили перекрестную оценку достоверности клиниче- 23016347 ских образцов из клинического исследования NSCLC. MAGE-A3 прототипное RT-PCR исследование использовали в качестве исследования сравнения для этих исследований. В случае дискордантности результатов для принятия решения по дискордантным результатам использовали предшествовавшие результаты, полученные для того же образца в виде свежезамороженной ткани, не подвергнутой ручной микродиссекции. Из 131 клинического FFPE-образца, подвергнутого ручной микродиссекции, выделяли РНК с применением способа QIAGEN RNeasy FFPE со стадией расщепления ДНКазой I. Каждый образец затем разделяли на равные части для RMS и RGI для тестирования с использованием теста RMS COBASTaqMan MAGE-A3 Test и RGI прототипного исследования. Анализ данных проводили, как описано в Разделе 3 данного сообщения, где пороговую экспрессию MAGE-A3 определяли на основании контроля 1% GERL РНК. Результаты корреляции способов/перекрестной проверки достоверности Образцы РНК выделяли из 131 NSCLC FFPE клинического образца. В семи образцах контаминация геномной ДНК превышала 25% на основании RGI контроля RT-реакции. Эти образцы были исключены из положительных и отрицательных согласно вычислениям процента совпадения с исследованием сравнения. В дополнение, в исследовании COBAS было 6 промежуточных результатов, и в прототипном исследовании было 15 промежуточных результатов, где для каждого образца не было достаточного данных, поскольку Ct для -актина выходило за пределы линейной области исследования, или экспрессияMAGE-A3 для образца превышала пороговое значение, но Ct MAGE-A3 выходило за пределы линейной области. В результате было получено 117 результатов в исследовании COBAS и 108 результатов в прототипном исследовании с данными, которые могли быть использованы для перекрестной проверки достоверности для сравнения двух различных тестов (табл. 32). Общая конкордантность исследования COBAS и прототипного исследования составляла 98/107 или 91,6% (табл. 33). Число положительных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте COBAS с использованием прототипного исследования в качестве "золотого стандарта" составляло 59/64 или 92,2%, в то время как число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения составляло 39/43 или 90,7% (табл. 33). В случае дискордантных результатов исследования COBAS и прототипного исследования, разрешения дискордантности использовали результаты, полученные посредством анализа замороженных образцов ткани (табл. 34). Из 9 образцов с дискордантными результатами исследования COBAS и прототипного исследования 7 продемонстрировали конкордантность исследования COBAS и исследования замороженных образцов,и 2 продемонстрировали конкордантность прототипного исследования и исследования замороженных образцов. В результате, при использовании результатов исследования замороженных образцов для разрешения дискордантности, число положительных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в исследованиях COBAS увеличивается до 63/64 или 98,42%, и число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения увеличивается до 42/43 или 97,7% (табл. 34). Число положительных и число отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения в тесте COBAS TaqMan MAGE-A3 Test были выше требуемых значения, превышавших или равных 85%. Критерии приемлемости для числа положительных и числа отрицательных результатов согласно проценту совпадения с исследованием сравнения были соблюдены. Контрольная проверка достоверности корреляции способов/перекрестной проверки достоверности Полученные в эксперименте контрольные значения Ct для гена MAGE показаны в табл. 30; полученные в эксперименте контрольные значения Ct для гена -актина показаны в табл. 31. Контрольные значения Ct входят в достоверный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности. Подробности эксперимента корреляции способов/перекрестной проверки достоверности показаны в табл. 37, 38 и 39. Воспроизводимость Цель. Продемонстрировать воспроизводимость и надежность теста в наборах данных, полученных разными операторами в разные дни разными партиями реагентов и разными инструментами. Материал образцов 12 образцов от NSCLC FFPE клинических образцов, подвергнутых ручной микродиссекции, выделяли с применением набора QIAGEN RNeasy FFPE Kit со стадией расщепления ДНКазой I и амплифицировали/выявляли с использованием теста COBAS TaqMan MAGE-A3 Test. Методика Исследование состояло из двух репликатов на образец. Две партии реагентов тестировали для приготовления образцов QIAGEN и реагентов TaqMan. Эксперимент проводили два разных оператора в два разных дня на двух разных анализаторах COBAS TaqMan 48 Analyzer. Анализ Экспрессию MAGE-A3 для каждого клинического образца вычисляли на основании среднего от- 24016347 двух RT-PCR-репликатов. В дополнение сигнал MAGE-А 3 оценивали для каждого репликата от каждого образца. Воспроизводимость также была основана на сравнении экспрессии гена MAGE-A3, вычисленной по значению разности Ct между MAGE-A3 и геном -актина. Сравнение экспрессии MAGE-A3 для образцов, тестированных разными партиями реагентов, инструментами, операторами и в разные дни проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Критерии приемлемости 90% конкордантность сигнала MAGE-A3 между образцами, по меньшей мере в 3 раза превышающими предел выявления теста (3% GERL), от опыта к опыту и в пределах используемых репликатов. Коэффициент корреляции Пирсона 90% между образцами. Результаты воспроизводимости Пороговая экспрессия MAGE-A3 представляет собой уровень отсечки для экспрессии MAGE-A3,определяющий то, будет ли пациент получать MAGE-A3-специфичную иммунотерапию. Пациенты с экспрессией MAGE-A3, равной или превышающей пороговое значение, будут иметь положительный сигнал MAGE-A3 и получать лечение. Пациенты с экспрессией MAGE-A3, ниже порогового значения,будут иметь отрицательный сигнал MAGE-A3 и не будут получать лечение. Исследования воспроизводимости теста были основаны на сигнале экспрессии MAGE-A3 для каждого образца с использованием следующих уравнений: пороговая экспрессия MAGE-A3=2 (Ct -актина контроля 100% GERL -Ct MAGE-A3 контроля 1%GERL); экспрессия MAGE-A3 для клинического образца = 2 (Ct -актина образца - Ct MAGE-A3 образца). В дополнение, воспроизводимость исследования оценивали сравнением корреляции экспрессииMAGE-A3 от двух опытов по коэффициенту корреляции Пирсона по смешанным моментам (r). В табл. 40 и табл. 37 показана пороговая экспрессия MAGE-A3, полученная от GERL РНК контролей, тестированных в 1 и 2 опытах, на основании разности Ct -актина и MAGE-A3. В табл. 41 и табл. 43 показан сигнал MAGE-A3 для каждого из 12 образцов, тестированных в 1 и 2 опытах. В табл. 42 показан 2 опыт - пороговая экспрессия MAGE-A3 от GERL РНК контролей; в табл. 43 показан 2 опыт - сигнал экспрессии MAGE-A3 для образцов, использованных в эксперименте воспроизводимости. У всех тестированных образцов была 100% корреляция сигнала экспрессии MAGE-A3 в двух опытах. В дополнение, воспроизводимость исследования оценивали сравнением корреляции экспрессииMAGE-A3 в двух опытах по коэффициенту корреляции Пирсона по смешанным моментам (r). Коэффициент корреляции Пирсона составлял 0,987 при сравнении экспрессии MAGE-A3 в двух разных опытах. Критерии приемлемости для воспроизводимости были соблюдены. В табл. 44 показана проверка достоверности воспроизводимости; контрольные значения Ct входят в доверительный диапазон. Эксперимент прошел проверку достоверности. Подробности эксперимента воспроизводимости показаны в табл. 45, 46 и 47. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Набор праймеров для определения MAGE-A3, содержащий праймер, состоящий из SEQ IDNO:11, и праймер, состоящий из SEQ ID NO:12. 2. Набор, включающий набор праймеров по п.1 и по меньшей мере один зонд, выбранный из зонда,состоящего из SEQ ID NO:53 или состоящего из SEQ ID NO:17 с флуоресцентным репортерным красителем на 5'-конце и нефлуоресцентным гасителем на 3'-конце. 3. Набор по п.2, где указанный зонд состоит из SEQ ID NO:17 с 6-карбоксифлуоресцеином на 5'конце и нефлуоресцентным гасителем на 3'-конце. 4. Способ определения MAGE-A3-положительной опухолевой ткани, включающий стадию приведения в контакт выделенной нуклеотидной последовательности, полученной или происходящей из опухолевого образца, с набором праймеров по п.1. 5. Способ по п.4, где указанный опухолевый образец представляет собой зафиксированную в формалине заключенную в парафин (FFPE) опухолевую ткань. 6. Способ по п.4 или 5, дополнительно включающий стадию амплификации нуклеотидной последовательности и выявления в образце амплифицированной нуклеотидной последовательности. 7. Способ лечения пациента, включающий определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента MAGE-A3, с применением способа по любому из пп.4-6, и затем введение пациенту композиции, содержащей MAGE-A3-специфичное иммунотерапевтическое средство. 8. Способ лечения пациента, предрасположенного к рецидиву MAGE-А 3-экспрессирующей опухоли, прошедшего лечение для удаления/лечения MAGE-A3-экспрессирующей опухолевой ткани, включающий определение того, экспрессирует ли опухолевая ткань пациента MAGE-A3, с применением способа по любому из пп.4-6, и затем введение указанному пациенту композиции, содержащей MAGE-A3 специфичное иммунотерапевтическое средство.