Применение конъюгатов желчной кислоты или соли желчной кислоты с жирными кислотами для лечения жировой инфильтрации печени

007565 Настоящее изобретение относится к новому применению некоторых конъюгатов желчной кислоты или соли желчной кислоты с жирными кислотами. Уровень техники Из патента Израиля 123998 известными являются конъюгаты желчной кислоты или соли желчной кислоты с жирными кислотами [BAFAC I] общей формулыW-X-G,(I) в которой G представляет радикал желчной кислоты или соли желчной кислоты, который, если нужно, конъюгирован в положении 24 с подходящей аминокислотой, W представляет один или два радикала жирной кислоты, имеющей 18-22 атома углерода, и X представляет связь NH между указанным радикалом желчной кислоты или соли желчной кислот и жирной кислотой (кислотами). Из указанного описания изобретения известно применение соединений общей формулы I и фармацевтических композиций, включающих такие соединения, для растворения холестериновых желчных конкрементов в желчи, предупреждения появления или повторного появления указанных желчных конкрементов и для снижения или профилактики атеросклероза. Известны также способы лечения указанных заболеваний. Теперь неожиданно обнаружено, что BAFAC, включающие BAFAC, в которых W представляет один или два радикала жирных кислот, имеющих 14-22 атома углерода, и X представляет подходящий связывающий член или прямую связь C=C между указанным радикалом желчной кислоты или соли желчной кислоты и жирной кислотой (кислотами) (такие конъюгаты являются соединениями общей формулы II; далее обозначенными BAFAC II), и фармацевтические композиции, включающие их, имеют дополнительные применения, а именно, их можно использовать:a - для лечения жировой инфильтрации печени;b - для снижения концентрации холестерина в крови,c - для лечения гипергликемии и диабета. Указанные BAFAC и включающие их фармацевтические композиции можно также использовать при лечении указанных заболеваний. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей конъюгат желчной кислоты или соли желчной кислоты и жирной кислоты (BAFAC) общей формулыW-X-G,(II) в которой G представляет радикал желчной кислоты или соли желчной кислоты, который может быть конъюгирован в положении 24 с подходящей аминокислотой, W представляет один или два радикала жирных кислот, имеющих 14-22 атома углерода, и X представляет подходящий связывающий член или прямую связь С=С между указанным радикалом желчной кислоты или соли желчной кислоты и жирной кислотой(кислотами), для лечения жировой инфильтрации печени, причем подходящий связывающий член обеспечивает прочную связь, которая по существу не деконъюгируется кишечными и/или бактериальными ферментами во время процесса абсорбции конъюгата. Так, например, сложноэфирная связь не является подходящей, поскольку она легко деконъюгируется. Связь, в частности, представляетNH, но может представлять также другие подходящие связывающие члены, например, S, Р, О (связь простого эфира) и т.д. Связь может иметь альфа- или бета-конфигурацию и может быть присоединена в различных положениях молекулы желчной кислоты, причем положения 3, 6, 7, 12 и 24 являются предпочтительными. Примеры жирной кислоты в BAFAC настоящего изобретения включают, не ограничиваясь указанным,бегениловую кислоту, арахидиловую кислоту и стеариновую кислоту. Примером соединения BAFAC настоящего изобретения является 3-арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овая кислота. Настоящее изобретение также относится к способу лечения жировой инфильтрации печени введением фармацевтической композиции, включающей BAFAC настоящего изобретения. Ниже приводятся история лечения жировой инфильтрации печени, а также истории лечения гиперхолестеринемии, гипергликемии и диабета и новое применение для лечения указанных заболеванийBAFAC настоящего изобретения. А. Лечение жировой инфильтрации печени Жировая инфильтрация печени является одним из наиболее обычных заболеваний печени на сегодняшний день. Это обусловлено избыточной аккумуляцией жира в печени. Это демонстрируется гистологическим способом по присутствию вариабельных количеств микро- и/или макровезикулярных жировых капель в ткани печени. Жировая инфильтрация печени может быть вызвана лекарственными средствами, химическими соединениями, заболеваниями, бактериями и т.д., но основной причиной является избыточное пищевое потребление, приводящее к ожирению (в основном туловища). Вследствие увеличивающегося преобладания избыточной массы тела в богатом социальном обществе растет распространение жировой инфильтрации печени. Жировая инфильтрации печени может развиться до стеатогепатита и цирроза с сопутствующей распространенностью болезни и смертностью. Лучшим лечением вызванной пищей жировой инфильтрации печени является непрерывная (постепенная) потеря массы. Однако, как хорошо известно, это редко достигается.-1 007565 Теперь обнаружено, что BAFAC II могут снижать жировую инфильтрацию печени и предотвращать это заболевание. Это было показано также в процессе продолжения чрезмерного потребления пищи у нескольких видов животных.B. Снижение концентрации холестерина в крови Гиперхолестеринемия является вредным для здоровья фактором. Она является причинным фактором в нескольких основных процессах заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, периферическое васкулярное заболевание, возможность удара и т.д. Снижение концентрации холестерина в крови является полезным или профилактическим в некоторых из указанных заболеваний. Современное лекарственное лечение гиперхолестеринемии является целью при снижении эндогенного синтеза холестерина в печени. Статины, используемые для этой цели, ингибируют фермент HMG СоАредуктазу. Однако, основная часть холестерина организма происходит из пищевого холестерина. Ограничения в диете заведомо являются неэффективными. Для связывания желчных кислот (продуктов катаболизма холестерина) и отделения их в кишечной полости, приводящего к их фекальной экскреции, использовали ионообменные смолы. Смолы оказывают некоторое влияние на содержание холестерина в крови, но обладают также значительными побочными действиями, которые ограничивают их использование. Теперь обнаружено, что BAFAC II снижают вызванную пищей гиперхолестеринемию у нескольких видов животных, даже когда животные продолжают потреблять корм с высоким содержанием холестерина и высоким содержанием жира.C. Лечение гипергликемии и диабета Сахарный диабет является нарушением метаболизма углеводов (глюкозы). Его схематично делят на тип 1, инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM), характеризующийся дефицитом инсулина, и тип 2,инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), в котором имеется в основном инсулиновая резистентность. NIDDM часто связан с ожирением и/или жировой инфильтрацией печени. Имеются также другие причины гипергликемии. Лечение сахарного диабета включает диету, инъекции инсулина и/или введение пероральных гипогликемических лекарственных средств. Целью терапии является нормализация уровней глюкозы в крови. Диабет, особенно плохо поддающийся лечению диабет, приводит к серьезным осложнениям. Теперь обнаружено, что BAFAC снижают и нормализуют уровни глюкозы в крови на животных моделях IDDM и NIDDM. Настоящее изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие примеры и фигуры, причем не будет ограничено ими. В приведенных примерах используемый термин обычный корм имеет следующий состав: 50% углеводов, 21% белка, 4% жира с добавками минеральных компонентов, волокна и витаминов (изготовлено Koffolk, Petach Tiqwa, Israel). На фиг. 1 А, 1 В и 1 С показаны концентрации глюкозы в крови у грызунов в голодном состоянии при различных режимах с BAFAC (150 мг/кг/день) или без BAFAC, т.е. фиг. 1 А показана для крыс (4w),фиг. 1 В показана для хомячков (3w),фиг. 1 С показана для мышей (16d) и на фиг. 2 показано отношение липид/белок в печени инбредных мышей C57J/L, получающих корм с высоким содержанием жира +/- BAFAC (150 мг/кг/день) в течение пяти недель. Пример 1. 1. Самцы хомячков. Использовали золотистых сирийских хомячков (Anilab, Rehovot, Israel) возраста 4-6 недель, весящих 90-110 г. Они получали литогенный корм ( 1), состоящий из их обычного корма, дополненногоAyyad et al., Lipids, 1992; 27:993-998) в течение 10 недель. Половина животных получала, кроме того, 3 арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овую кислоту при дозе 150 мг/кг/день, суспендированную в солевом растворе, посредством кормления через желудочный зонд. Контрольным животным аналогично давали равный объем солевого раствора. Спустя десять недель животных анестезировали, брали кровь из сердца для анализа. Удаляли печень и другие органы. Уровни холестерина в сыворотке крови определяли автоматическим анализатором. 2. Мыши. Использовали самцов инбредных мышей C57J/L (Jackson Lab., Maine, USA) возраста 4-6 недель, весящих 20-25 г. Они получали их обычный корм, дополненный (мас./мас.%) 15 молочного жира, 1 холестерина, 0,5 холевой кислоты, 2 кукурузного масла (модифицировано по Khanuja et al., Proc. Natnl. Acad.Sci. USA 1995; 92:7729-33), в течение 4-8 недель (литогенный корм 2). Половине группы животных давали, кроме того, 3-арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овую кислоту при дозе 150 мг/кг/день, суспендированную в солевом растворе, посредством кормления через желудочный зонд. Другой половине аналогично давали равный объем солевого раствора. Спустя 4-8 недель животных анесте-2 007565 зировали, брали кровь из сердца для анализа. Удаляли печень и другие органы. Уровни холестерина сыворотки крови определяли автоматическим анализатором. Другой группе самцов инбредных мышей C57J/L (Jackson Laboratories., Maine, USA) возраста 4-6 недель, весящих 20-25 г, давали литиогенный корм ( 2) в течение 8 недель и затем обычный корм в течение других 8 недель. Во время 8 недель обычного корма части животных давали 3-арахидиламидо 7,12-дигидрокси-5-холан-24-овую кислоту при дозе 150 мг/кг/день посредством кормления через желудочный зонд. Спустя всего 16 недель животных анестезировали, брали кровь из сердца для анализа. Удаляли печень и другие органы. Уровни холестерина в сыворотке крови анализировали, как указано выше. Третьей группе животных давали обычный корм на протяжении 16 недель и затем анализировали аналогично. Число животных в каждой группе и результаты приводятся в табл. 1. Таблица 1 Содержание холестерина в сыворотке (мг/%) у испытуемых животных (среднее значение + станд. отклонение) Данные, приведенные в табл. 1, показывают, что BAFAC II заметно снижают уровни холестерина в крови у различных групп мышей и хомячков. Пример 2. Способ гистологического изучения. Присутствие жировой инфильтрации печени оценивал патологоанатом, не знающий предыдущие обработки животных, оценивая в баллах поля на кодированных предметных стеклах слепым способом. Система оценки в баллах была следующей: 0 - Не имеется жировой инфильтрации печени. 1 - Минимальная жировая инфильтрация печени 5% пораженной поверхности печени. 2 - Средняя жировая инфильтрация печени от 5 до 25% пораженной поверхности печени. 3 - Заметная жировая инфильтрация печени 25-50% пораженной поверхности печени. 4 - Серьезная жировая инфильтрация печени 50% пораженной поверхности печени 1. Хомячки. Использовали самцов золотистых сирийских хомячков (Anilab, Rehovot, Israel) возраста 4-6 недель,весящих 90-110 г. Они получали литогенный корм ( 1). Половина животных получала кроме того 3 арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овую кислоту при дозе 150 мг/кг/день. Соединение давали суспендированным в солевом растворе, посредством кормления через желудочный зонд. Контрольным животным аналогично давали только солевой раствор. Спустя 10 недель животных анестезировали и умерщвляли. Печень и другие органы удаляли и помещали в формалин для гистологического изучения. 2. Мыши. Использовали самцов инбредных мышей C57 (Jackson Lab., Maine, USA) возраста 4-6 недель, весящих 20-25 г. Их кормили западным кормом (George et al. Circulation 2000, 102:1822-27), содержащим 1,5 г/кг холестерина и 42% жира, 43% углеводов и 15% белка (как % калорий). Половине мышей давали,кроме того, 3-арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овую кислоту при дозе 150 мг/кг/день,суспендированную в солевом растворе, посредством кормления через желудочный зонд. Другой половине аналогично давали только солевой раствор. Спустя 4 недели животных анестезировали и умерщвляли. Печень и другие органы удаляли и помещали в формалин для гистологического изучения. Число животных в каждой группе и гистологические результаты приводятся в табл. 2.-3 007565 Таблица 2 Оценки в баллах жировой инфильтрации печени испытуемых животных а - микровезикулярный жир,b - смешанный (микро- и макровезикулярный) жир. Данные табл. 2 показывают, что BAFAC снижают и/или предупреждают жировую инфильтрацию печени. Пример 3. Влияние BAFAC на содержание глюкозы в крови при голодании испытывали на 3 видах животных: хомячках, крысах и мышах. Животных выдерживали при обычном корме или корме с высоким содержанием жира (как указано). В каждой группе половина животных получала ежедневно дозу BAFAC (150 мг/кг), диспергированную в 0,5 мл солевого раствора, посредством кормления через желудочный зонд. Другая половина получала аналогично, посредством кормления через зонд, равный объем только солевого раствора. Всех животных выдерживали при 12 часовом цикле день/ночь при 22 С на протяжении всего эксперимента. Они имели доступ к воде ad libidum. 1. Хомячки. Самцов золотистых сирийских хомячков возраста 4 недели (90-100 г) кормили вызывающим жировую инфильтрацию печени кормом, состоящим из холестерина (1%), пальмитиновой кислоты (1,2%),масла (1,2%), свиного сала (10%) и кукурузного масла (2%), добавленным (мас./мас.) к их обычному корму. Содержание глюкозы в крови измеряли при умерщвлении их в голодном состоянии спустя 3 недели после испытания. Имелось 5 контрольных и 5 испытуемых животных. 2. Крысы. Самцам крыс Wistar возраста 4 недели (100-120 г) давали обычный корм или корм с высоким содержанием жира, обогащенный свиным жиром (10%), холестерином (2,5%) и холевой кислотой (0,5%)(мас./мас). Образцы крови и органов получали после умерщвления (в голодном состоянии) спустя 4 недели после испытания. Половина животных в каждой группе получала 150 мк/кг BAFAC, другим давали равный объем солевого раствора. Имелось 7 крыс в контрольной группе и испытуемых группах с обычным кормом и 6 крыс в каждой группе, которой давали корм с высоким содержанием жира. Хомячки и крысы, которым давали корма с высоким содержанием жира, обнаруживали жировую инфильтрацию печени (подтверждено химическим измерением жира печени), высокое содержание глюкозы в крови в голодном состоянии и представляли собой модели NIDDM. 3. Мыши. Самцам мышей ICR возраста 4 недель (приблизительно 20 г) давали обычный корм. В первый день эксперимента внутрибрюшинной инъекцией вводили 200 мг/кг стрептозотоцина. (Это индуцировало повреждение островковых клеток поджелудочной железы и моделировало IDDM). Содержание глюкозы в голодном состоянии определяли у умерщвленных животных после 16 дней испытания. Имелось 3 группы с 7 животными в каждой. Контрольные животные получали только обычный корм. Обработанные стрептозотоцином (Stz) животные получали только солевой раствор посредством кормления через зонд и обработанные стрептозотоцином животные получали 150 мг/кг/день BAFAC посредством кормления через зонд. BAFAC, используемый во всех этих изучениях гипергликемии, был конъюгатом арахидоновой и холевой кислот (в положении 3) с использованием амидной связи (С-20, BAFAC, Aramchol). Результаты 3 исследований показаны на фиг. 1 А, 1 В и 1 С (RD - обычный корм, FLD - корм, вызывающий жировую инфильтрацию печени, Stz стрептозотоцин). Очевидно, что добавка BAFAC заметно снижает содержание глюкозы в крови в голодном состоя-4 007565 нии у всех испытуемых животных. Содержание глюкозы в крови снижалось у животных с жировой инфильтрацией печени (хомячки и крысы), представляющих модель NIDDM, а также у обработанных стрептозотоцином мышей, представляющих модель IDDM. BAFAC не оказывали влияния на содержание глюкозы в крови при обычной диете (без гипергликемии или жировой инфильтрации печени). Пример 4. Использовали инбредных мышей С 57 J/L возраста 4 недели и весящих приблизительно 20 г (Jackson Lab. Maine, USA). Их кормили в течение 5 недель литогенным кормом с высоким содержанием жира, состоящим из ( масс./масс.) 1% холестерина, 0,5% холевой кислоты, 10% свиного жира, 6% масла, 1,2% пальмитиновой кислоты и 2% кукурузного масла и добавленным к их нормальному корму. Помимо указанного корма животным давали ежедневно, посредством кормления через зонд, либоBAFAC (150 мг/кг), суспендированный в солевом растворе, либо равный объем только солевого раствора. BAFACs были конъюгатами холевой кислоты (в положении 3) либо с пальмитиновой кислотой (C16), либо арахиновой кислотой (C-20) или бегеновой кислотой (С-22) с использованием амидной связи. Контроли (n=5) получали солевой раствор, испытуемые животные получали либо С 16-конъюгат (n=5),С 20-конъюгат (n=5) или С 22-конъюгат (n=3). Через 5 недель после голодания на протяжении ночи животных анестезировали с использованием кетамина и печень удаляли, животных умерщвляли посредством передозировки кетамина. 0,5 г образца печени гомогенизировали в 5 мл забуференного солевого раствора. Липиды печени экстрагировали из гомогенизата способом Folch с использованием смеси хлороформ:метанол (2:1, об./об.). Половину мл гомогенизата экстрагировали в 5 мл раствора Folch. После выпаривания растворителя липиды взвешивали и снова несколько раз подвергали упариванию до получения постоянной массы. Белки определяли количественно в другой аликвоте гомогенизата по способу Брэдфорда (Bradford M.M., Annal. Biochem. 1976, 72:248). Вычисляли отношение липида и белка (мг/мг). Результаты для каждой группы приводятся как средние значения (+ стандартное отклонение, Ст. От.). Группы имели следующие величины: контроли 7,9+/-2,32, C16-BAFAC 2,25+/-1,20, C20-BAFAC 1,44+/-1,18 и C22-BAFAC 3,00+/-1,08. Результаты иллюстрируются на фиг. 2. Данные показывают, что заявленные действия проявляют несколько конъюгатов, некоторые из них являются почти такими же сильнодействующими, как С 20-конъюгат, используемый в примерах 1, 2 и 3. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение фармацевтической композиции, содержащей конъюгат желчной кислоты или соли желчной кислоты и жирной кислоты (BAFAC) общей формулы IIW-X-G,в которой G представляет радикал желчной кислоты или соли желчной кислоты, который может быть конъюгирован в положении 24 с подходящей аминокислотой, W представляет один или два радикала жирных кислот, имеющих 14-22 атома углерода, и X представляет подходящий связывающий член или прямую связь C=C между указанным радикалом желчной кислоты или соли желчной кислоты и жирной кислотой(кислотами), для лечения жировой инфильтрации печени, причем подходящий связывающий член обеспечивает прочную связь, которая по существу не деконъюгируется во время процесса абсорбции конъюгата, при условии, что указанная связь не является связью сложного эфира. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в соединении общей формулы II связывающим членом является NH. 3. Применение по п.1, отличающееся тем, что в соединении общей формулы II жирная кислота выбрана из бегениловой кислоты, арахидиловой кислоты и стеариновой кислоты. 4. Применение по п.1, отличающееся тем, что соединением общей формулы II является 3 арахидиламидо-7,12-дигидрокси-5-холан-24-овая кислота. 5. Способ лечения жировой инфильтрации печени введением фармацевтической композиции,включающей BAFAC, охарактеризованный в п.1.