Композиция, содержащая щелочную сфингомиелиназу, для применения в качестве диетического препарата, пищевой добавки или фармацевтического продукта

1 Настоящее изобретение относится к применению щелочной сфингомиелиназы для получения композиций, предназначенных для пищевого, диетического и собственно терапевтического применения, а также к композициям,приготовленным таким образом. Следовательно, данные композиции могут быть в виде и могут действовать в качестве пищевых добавок, диетической основы или собственно лекарственных препаратов, в зависимости от того, предназначены ли они действовать в качестве поддержки или профилактического воздействия, или собственно лекарственных препаратов у конкретных индивидуумов, для которых композиция предназначена. К настоящему времени установлено наличие трех различных типов сфингомиелиназы(SМазы). Имеется кислая сфингомиелиназа, которая представляет лизосомальный фермент (с оптимумом при рН 4,5-5), недостаток которой вызывает болезнь Ниманна-Пика, и имеется нейтральная сфингомиелиназа, с оптимумом при рН 7,5, для которой описаны две изоформы. Одна из этих изоформ находится в цитоплазматической мембране и является зависимой от магния, в то время как другая находится в цитозоле и не зависит от катионов. Обе - кислая и нейтральная - сфингомиелиназы обнаружены во многих тканях и клетках и являются широко распространенными ферментами, регулирующими многочисленные клеточные функции. Третий тип назван щелочной сфингомиелиназой, поскольку, главным образом, она активна при рН 9. Она не является зависимой от магния и была обнаружена в щеточной каемке кишечника и в желчи. Щелочная сфингомиелиназа отсутствует в желудке, двенадцатиперстной кишке или поджелудочной железе, но она обнаружена в кишечнике, особенно в дистальной части тощей кишки. Заметная активность щелочной сфингомиелиназы также установлена в ободочной и прямой кишке. Высокие уровни щелочной сфингомиелиназы также обнаружены в желчи, но, по-видимому, это характерно только для людей. Данный двойной источник сфингомиелиназы делает людей очень эффективными в отношении гидролиза сфингомиелина(SM), вводимого с пищей, по сравнению с другими существами. До настоящего времени полагали, что щелочная сфингомиелиназа не может продуцироваться кишечными бактериями, поскольку не было установлено различий между обычными и стерильными животными (см. R.D.Duan, Scand. J. Gastroenterology, 33 (1998) pp. 673-683). Помимо щелочной сфингомиелиназы, которая находится в кишечнике и которая присутствует в желчи, остаются неизвестными другие щелочные сфингомиелиназы, которые можно было бы использовать для получения композиций, предназначенных для пищевого, диетиче 005166 2 ского и собственно терапевтического применения. Кроме того, кислую и нейтральную сфингомиелиназы нельзя использовать вследствие их различающихся свойств (см. последующую таблицу). Кислая Оптимум рН Зависимость от Мg Устойчивость к трипсину Термическая стабильностьSМаза Цитоплазматиче- Кишечник и ская мембрана желчь человека 7,4 9 Уже известно применение сфингомиелиназы для косметических и дерматологических целей. В патенте Японии 63216813 описываются косметические композиции, которые включают в себя сфингомиелиназу и предназначены для противодействия физиологическому снижению активности этого фермента, которое имеет место в коже при старении, и способствования его трансформации в керамид,который, в свою очередь, оказывает полезное увлажняющее действие на эпидермис. В международной заявке на патент РСТWO 98/22082 описывается применение сфингомиелиназы для получения дерматологических композиций, пригодных для лечения кожных заболеваний, таких как дерматит, псориаз, ихтиоз и подобные состояния. Кроме того, в данной заявке описывается получение сфингомиелиназы из штаммов грамотрицательных бактерий, грамположительных бактерий и молочнокислых бактерий, с четкими преимуществами по сравнению с ранее известными способами, в которых в качестве сырья использовались органы высших животных, такие как мозг и печень. В настоящее время неожиданно было установлено, что в некоторых бактериях имеются высокие уровни щелочной сфингомиелиназы и что прием их внутрь будет полезным для хозяина. Данные бактерии можно принимать внутрь живыми или в виде экстрактов при условии, что они являются ферментативно активными, возможно, в сочетании с другими бактериями, такими как молочно-кислые бактерии, вместе с SM и/или продуктами питания, содержащими SM. Следовательно, одной из целей настоящего изобретения является обеспечение диетической,пищевой или фармацевтической композиции,которая включает в себя щелочную сфингомиелиназу в количестве, которое достаточно для проявления диетического, питательного или терапевтического действия у индивидуума, который в ней нуждается. В частности, данная композиция пригодна для профилактики и/или лечения нарушений,связанных с развитием кишечника, опухолевых 3 процессов, нарушений иммунного ответа, воспалительных процессов и процессов апоптоза в кишечнике и связанных с ним структурах, нарушений, связанных с синтезом холестерина,нарушений за счет гидрофобной природы поверхностей желудочно-кишечного тракта, аллергических заболеваний желудочно-кишечного тракта, нарушений, относящихся к процессам пищеварения, воспалительных заболеваний кишечника, полипоза, в частности семейного полипоза, гиперхолестеринемии, инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, нарушений неонатального развития, нарушений, связанных с гомеостазом кишечника, и заболеваний центральной и периферической нервной системы. Композиция также пригодна для применения в педиатрическом питании и/или энтеральном кормлении. В педиатрическом питании композицию можно вводить, например, в сочетании с искусственным молоком, сгущенным молоком, соевым молоком, сухим молоком, частично гуманизированным молоком и с продуктами питания для детей в целом. Композиция предпочтительно включает в себя щелочную сфингомиелиназу бактериального происхождения, и бактерии, содержащие щелочную сфингомиелиназу, выбраны из грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и молочно-кислых бактерий или из их смесей. Конкретнее, щелочная сфингомиелиназа композиции получена из молочно-кислых бактерий, и они выбраны из группы, включающей в себя Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis,Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillusraffinolactis и Streptococcus thermophilus. Особенно предпочтительным штаммом среди указанных молочно-кислых бактерий является Lactobacillus brevis CD2, хранящийся с 6 февраля 1998 года под регистрационным номером DSM 11988 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM) вBraunschweig, Германия, по Будапештскому соглашению, или его мутанты и производные. Согласно предпочтительному воплощению данного изобретения молочно-кислые бактерии используются в композиции в качестве живых,лиофилизированных или обработанных ультразвуком бактерий. 4 Композиция предпочтительно содержит от 1 х 102 до 1 х 103 КОЕ молочно-кислых бактерий на грамм композиции. Особенно предпочтительная композиция содержит 200 х 109 Streptococcus thermophilus, 150 х 109Bifidobacteria и 4 х 109 Lactobacillus acidophilus на грамм композиции. Композиция согласно изобретению может также включать в себя желчные кислоты, в частности урсодезоксихолевую кислоту, пектин,сфингомиелин или его производные, лекарственные препараты или продукты питания, содержащие сфингомиелин, аргининдезиминазу,жирные кислоты, полиненасыщенные жирные кислоты, неферментированные сахара, в частности лактулозу, ингибиторы холестерина, ингибиторы церамидазы, ингибиторы протеазы,иммуномодуляторы, противоопухолевые препараты, витамины, факторы роста, поверхностноактивные вещества, злаковые, клетчатку, эмульгаторы, стабилизаторы, липиды, антиоксиданты,консерванты, нейтрализаторы свободных радикалов и/или вазопротекторы. Композицию согласно изобретению можно вводить перорально в качестве пищевой добавки или же перорально или парентерально в качестве лекарственного препарата. Изобретение также относится к применению щелочной сфингомиелиназы для получения диетической, пищевой или фармацевтической композиции, пригодной для профилактики и/или лечения нарушений, связанных с развитием кишечника, опухолевых процессов, нарушений иммунного ответа, воспалительных процессов и апоптоза кишечника и связанных с ним структур, нарушений, связанных с синтезом холестерина, нарушений за счет гидрофобной пироды поверхностей желудочно-кишечного тракта, аллергических заболеваний желудочнокишечного тракта, нарушений, связанных с процессами пищеварения, воспалительных заболеваний кишечника, полипоза, в частности семейного полипоза, гиперхолестеринемии, инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, нарушений неонатального развития, нарушений,связанных с гомеостазом в кишечнике, и заболеваний центральной и периферической нервной системы. Данная композиция также пригодна для применения в педиатрическом питании и/или энтеральном кормлении. В педиатрическом питании композицию можно вводить, например, в сочетании с искусственным молоком, сгущенным молоком, соевым молоком, сухим молоком,частично гуманизированным молоком и продуктами питания для детей в целом. Использованная щелочная сфингомиелиназа предпочтительно имеет бактериальное происхождение, и бактерии, содержащие ее,выбраны из грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и молочно-кислых бактерий или из их смесей. 5 Конкретнее, использованные молочно-кислые бактерии выбраны из группы, включающей в себя Lactobacillus acidophilus, Lactobacillusplantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis,Streptococcus raffinolactis и Streptococcus thermophilus. Особенно предпочтительным штаммом среди указанных молочно-кислых бактерий является Lactobacillus brevis CD2, хранящийся с 6 февраля 1998 г. под регистрационным номеромDSM 11988 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM) вBraunschweig, Германия, по Будапештскому соглашению, или его мутанты и производные. Согласно предпочтительному воплощению данного изобретения молочно-кислые бактерии используются в композиции в качестве живых,лиофилизованных или обработанных ультразвуком бактерий. Использованная композиция предпочтительно содержит от 1 х 102 до 1 х 1013 КОЕ молочно-кислых бактерий на грамм композиции. Особенно предпочтительная композиция содержит 200 х 109 Streptococcus thermophilus,150 х 109 Bifidobacteria и 4 х 109 Lactobacillusacidophilus на грамм композиции. Проводили следующие опыты для подтверждения наличия и эффективности щелочной сфингомиелиназы в бактериях согласно настоящему изобретению. Эти опыты включали в себя детектирование щелочной сфингомиелиназы, фермента, ответственного за образование церамида в коже человека. Методы Анализ кислой, нейтральной и щелочной сфингомиелиназы в молочно-кислых бактериях и биопсийном материале кишечника 10 мг лиофилизованных бактерий StreptococcusMgCl2, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ Nа 3VO4,0,1 мМ Na2MoO4, 30 мМ паранитрофенилфосфата, 10 мМ -глицерофосфата, 750 мМ АТФ, 1 мкМ PMSF, 10 мкМ лейпептина, 10 мкМ пепстатина (от Sigma Chemical Co.) и 0,2% тритона Х-100 (для определения активности нейтральной SMaзы) или 500 мкл 0,2% тритона Х-100(для определения активности кислой SMaзы). Для определения щелочной SMaзы бактерии и 6 кишечника суспендировали в 0,25 М сахарозном буфере, содержащем 5 мМ MgCl2, 0,15 М KСl,50 мМ KН 2 РО 4, 1 мМ PMSF и 1 мМ бензамидина (рН 7,4). Приготовленные таким образом пробы затем подвергали лизису путем обработки ультразвуком (в течение 30 мин, в течение которых 10-секундные периоды включения чередовались с 10-секундными периодами выключения) с использованием ультразвукового дезинтегратора Vibracell (Sonic и Materials Inc.,Danbury, CT). Обработанные ультразвуком пробы затем центрифугировали в течение 30 мин при 14000 об./мин при 4 С, супернатант удаляли и определяли концентрацию белка с помощью набора, изготовленного Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Для определения нейтральной SМазы 100 мкг пробы инкубировали в течение 2 ч при 37 С в буфере (конечный объем: 50 мкл), содержащем 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ MgCl2, pH 7,4, и 2,25 мкл [N-метил-14 С]-сфингомиелина (SM)(0,2 мккюри/мл, удельная активность: 56,6 мкюри/ммоль, Amersham). Для определения активности кислой сфингомиелиназы 100 мг бактериального лизата инкубировали в течение 2 ч при 37 С в буфере[W-метил-14 С]-SM. Для определения щелочной SМазы пробы добавляли к 375 мкл Трис-ЭДТА буфера (pH 9) до конечного объема 0,4 мл, содержащего 50 мМ Трис, 0,15 М NaCl, 2 мМ ЭДТА и смесь 3 мМ желчных солей ТС:TDC:GC:GCDC в молярном соотношении 3:2:1/8:1. Установили, что данная смесь желчных солей обладает наибольшим стимулирующим действием на щелочную SМазу. Добавление ЭДТА к буферу служило для ингибирования активности нейтральнойSМазы, которая является Мg-зависимой с оптимумом при pH 7,5. 14 С-SМ растворяли в этаноле, высушивали в атмосфере азота и суспендировали в буфере для анализа, содержащем смесь 3% тритона Х-100 и 3 мМ желчных солей. Реакцию останавливали добавлением 2 мл смеси хлороформ-метанол 2:1. Фосфолипиды экстрагировали и анализировали методом ТСХ на пластинках, одновременно количественно оценивали гидролиз SМ путем авторадиографии и подсчета в жидкостном сцинтилляторе. SМазу,присутствующую в обработанных ультразвуком бактериях и в биопсийном материале кишечника, выражали в пмоль гидролизованного SМ в час на мг белка. Активность SМазы из Streptococcus thermophilus На фиг. 1 показана активность сфингомиелиназы в обработанных ультразвуком бактериях. Не было обнаружено активности кислойSМазы, но установили оцениваемые уровни как нейтральной, так и щелочной SМазы в пробах бактерий, тестированных в использованных 7 экспериментальных условиях (различные значения pH и в присутствии и в отсутствие MgCl2). Щелочная SМаза, обнаруженная в биопсийном материале кишечника На фиг. 2 показано, что анализ активностиSМазы в биопсийном материале кишечника выявил высокую активность щелочной SМазы,зависимой от желчных солей, которую невозможно было установить при отсутствии желчных солей. Уровни ферментативной активности в тканях пациента, страдающего болезнью Крона, показали пониженный уровень щелочнойSМазы по сравнению с контрольной пробой. Действие Streptococcus thermophilus на кишечную щелочную SМазу Как представлено на фиг. 3, анализ активности SМазы в пробах Streptococcus thermophilus в экспериментальных условиях, используемых для определения активности кишечнойSМазы, показал, что на бактериальный фермент не влияет присутствие или отсутствие желчных солей. Кроме того, когда активность SМазы бактерий и активность SМазы кишечника определяли одновременно, гидролиз SМ возрастал аддитивно. Аналогичные результаты (не представлены) получали со штаммом Lactobacillusbrevis CD2, хранящимся с 6 февраля 1998 г. под регистрационным номером DSM 11988 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM) в Braunschweig, Германия,по Будапештскому соглашению, или его мутантами и производными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Диетическая, пищевая или фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит щелочную сфингомиелиназу в количестве, достаточном для проявления диетического, питательного, профилактического и/или терапевтического действия при нарушениях, связанных с развитием кишечника, с процессами при злокачественных опухолях, с нарушениями иммунного ответа, с воспалительными процессами и апоптозом в кишечнике и ассоциированных с ним структурах, при нарушениях, связанных с синтезом холестерина, нарушениях, обусловленных гидрофобной природой поверхностей желудочно-кишечного тракта, при аллергических нарушениях желудочно-кишечного тракта, нарушениях, связанных с процессами пищеварения, воспалительных заболеваниях кишечника, при полипозе, в частности семейном полипозе, при гиперхолестеринемии, инфекциях, вызываемых Helicobacter pylori, при нарушениях, связанных с гомеостазом кишечника, и при заболеваниях центральной и периферической нервной системы,при условии, что фармацевтическая композиция не является дерматологической композицией. 8 2. Композиция по п.1, используемая для лечения детей. 3. Композиция по п.1, используемая для энтерального кормления. 4. Композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что щелочная сфингомиелиназа имеет бактериальное происхождение, а бактерии, из которых получена щелочная сфингомиелиназа, выбраны из грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и молочно-кислых бактерий или из их смесей. 5. Композиция по п.4, отличающаяся тем,что молочно-кислые бактерии выбраны из группы, включающей в себя Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri,Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme,Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus,Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii,Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii,Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae,Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum,Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii,Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum,Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,BifidobacteriumStreptococcus thermophilus. 6. Композиция по п.5, отличающаяся тем,что бактерии представляют собой штаммLactobacillus brevis CD2, DSM 11988. 7. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что включает в себя также желчные кислоты, в частности урсодезоксихолевую кислоту, пектин, сфингомиелин или его производные, лекарственные препараты или продукты питания, содержащие сфингомиелин, аргининдезиминазу, жирные кислоты, полиненасыщенные жирные кислоты, неферментированные сахара, в частности лактозу, ингибиторы холестерина, ингибиторы церамидазы, ингибиторы протеазы, иммуномодуляторы, противоопухолевые препараты, витамины, факторы роста,поверхностно-активные вещества, злаковые,клетчатку, эмульгаторы, стабилизаторы, липиды, антиоксиданты, консерванты, нейтрализаторы свободных радикалов и/или вазопротекторы. 8. Композиция по любому из пп.1-7, которую можно вводить перорально или парентерально. 9. Способ введения композиции по п.2, отличающийся тем, что композицию вводят в сочетании с искусственным молоком, сгущенным молоком, соевым молоком, сухим молоком, гуманизированным молоком и с продуктами питания для детей. 10. Диетическая, пищевая или фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что включает в себя содержащие щелочную сфингомиелиназу живые, лиофилизованные или об 9 работанные ультразвуком молочно-кислые бактерии в количестве, достаточном для проявления диетического, питательного, профилактического и/или терапевтического действия при нарушениях, связанных с развитием кишечника, с процессами при злокачественных опухолях, с нарушениями иммунного ответа, с воспалительными процессами и апоптозом в кишечнике и ассоциированных с ним структурах, при нарушениях, связанных с синтезом холестерина,нарушениях, обусловленных гидрофобной природой поверхностей желудочно-кишечного тракта, при аллергических нарушениях желудочно-кишечного тракта, нарушениях, связанных с процессами пищеварения, воспалительных заболеваниях кишечника, при полипозе, в частности семейном полипозе, при гиперхолестеринемии, инфекциях, вызываемых Helicobacter pylori, при нарушениях, связанных с гомеостазом кишечника, и при заболеваниях центральной и периферической нервной системы,при условии, что фармацевтическая композиция не является дерматологической композицией. 11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что содержит от 1 х 102 до 1 х 1013 КОЕ молочно-кислых бактерий на грамм композиции. 12. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что содержит 200 х 109 StreptococcusLactobacillus acidophilus на грамм композиции. 13. Композиция по любому из пп.10-12,отличающаяся тем, что включает в себя также желчные кислоты, в частности урсодезоксихолевую кислоту, пектин, сфингомиелин или его производные, лекарственные препараты или продукты питания, содержащие сфингомиелин,аргининдезиминазу, жирные кислоты, полиненасыщенные жирные кислоты, неферментированные сахара, в частности лактозу, ингибиторы холестерина, ингибиторы церамидазы, ингибиторы протеазы, иммуномодуляторы, противоопухолевые препараты, витамины, факторы роста, поверхностно-активные вещества, злаковые, клетчатку, эмульгаторы, стабилизаторы,липиды, антиоксиданты, консерванты, нейтрализаторы свободных радикалов и/или вазопротекторы. 14. Композиция по любому из пп.10-13,которую можно вводить перорально или парентерально. 15. Применение щелочной сфингомиелиназы для получения диетической, пищевой или фармацевтической композиции, пригодной для профилактики и/или лечения нарушений, связанных с развитием кишечника, опухолевых процессов, нарушений иммунного ответа, вос 005166 10 палительных процессов и апоптоза в кишечнике и связанных с ним структурах, нарушений, связанных с синтезом холестерина, нарушений за счет гидрофобной природы поверхностей желудочно-кишечного тракта, аллергических нарушений желудочно-кишечного тракта, нарушений, связанных с процессами пищеварения,воспалительных заболеваний кишечника, полипоза, в частности семейного полипоза, гиперхолестеринемии, инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, нарушений, связанных с гомеостазом кишечника, и заболеваний центральной и периферической нервной системы,при условии, что фармацевтическая композиция не является дерматологической композицией. 16. Применение по п.15, отличающееся тем, что композиция предназначена для лечения детей. 17. Применение по п.15, отличающееся тем, что композиция предназначена для энтерального кормления. 18. Применение по любому из пп.15-17,где щелочная сфингомиелиназа имеет бактериальное происхождение, а бактерии, из которых получена щелочная сфингомиелиназа, выбраны из грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и молочно-кислых бактерий или из их смесей. 19. Применение по п.18, отличающееся тем,что молочно-кислые бактерии выбраны из группы, включающей в себя Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri,Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme,Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus,Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii,Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii,Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus minutus,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae,Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum,Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii,Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum,Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,BifidobacteriumStreptococcus thermophilus. 20. Применение по п.19, отличающееся тем, что бактерии представляют собой штаммLactobacillus brevis CD2, DSM 11988. 21. Применение по любому из пп.15-20,отличающееся тем, что в качестве источника сфингомиелиназы использованы живые, лиофилизованные или обработанные ультразвуком молочно-кислые бактерии.